KR20200131282A - 표적화된 4-1bb(cd137) 작용제에 의한 조합 치료 - Google Patents

표적화된 4-1bb(cd137) 작용제에 의한 조합 치료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 4-1BB(CD137) 작용제, 특히 항원 결합 분자를 함유하는 4-1BBL 삼량체를 HER-2 표적화제와 조합으로 사용하는 조합 치료, 암의 치료를 위한 상기 조합 치료의 용도, 및 상기 조합 치료를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

표적화된 4-1BB(CD137) 작용제에 의한 조합 치료
본 발명은 4-1BB(CD137) 작용제, 특히 항원 결합 분자를 함유하는 4-1BBL 삼량체를 HER-2 표적화제와 조합으로 사용하는 조합 치료, 암의 치료를 위한 상기 조합 치료의 용도, 및 상기 조합 치료를 사용하는 방법에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 사망의 주 원인 중 하나이다. 치료 선택지의 진보에도 불구하고, 진행된 암을 앓는 환자의 예후는 여전히 저조하다. 결과적으로, 허용불가한 독성을 야기함 없이 암 환자의 생존률을 증가시키는 최적의 치료가 의학적으로 지속적으로 긴히 필요하다. 임상 시험으로부터의 현재 결과들은 면역 치료가 암 환자의 전반적인 생존률을 증가시키고 지속성 있는 반응을 야기할 수 있음을 보여왔다. 이러한 유망한 결과에도 불구하고, 현행의 면역-기반 치료는 일부 환자들에게만 효과적이고, 치료적 유익을 향상시키기 위한 조합 전략이 필요하다.
인간 표피 성장 인자 수용체-2(HER-2; Erb2)는 수용체 티로신 키나제이고, 막통과 수용체 중 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 과의 일원이다. HER-2는 다양한 유형의 종양에서 과발현되고, 질환 개시 및 진행에 관여한다. 이는 저조한 예후와 관련된다. 예컨대, HER-2의 과발현은 인간 유방암의 약 30%에서 관찰되고, 이러한 종양과 관련된 공격적인 성장 및 저조한 임상적 결과에 관여한다(문헌[Slamon et al (1987) Science 235:177-182]).
인간화된 항-HER-2 단클론 항체 트라스투주맙(CAS 180288-69-1, 헤르셉틴(HERCEPTIN: 등록상표), huMAb4D5-8, rhuMAb HER-2, 진엔테크(Genentech))은 HER-2의 세포외 도메인을 표적으로 한다(US 5677171; US 5821337; US 6054297; US 6165464; US 6339142; US 6407213; US 6639055; US 6719971; US 6800738; US 7074404; 문헌[Coussens et al (1985) Science 230:1 132-9]; 문헌[Slamon et al (1989) Science 244:707-12]; 및 문헌[Slamon et al (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792]). 트라스투주맙은 HER-2를 과발현하는 인간 종양 세포의 증식을 억제하고, 항체-의존적 세포독성(ADCC)의 매개체인 것으로 제시되왔다(문헌[Hudziak et al (1989) Mol Cell Biol 9:1 165-72; 문헌[Lewis et al (1993) Cancer Immunol Immunother. 37:255-63]; 문헌[Baselga et al (1998) Cancer Res. 58:2825-2831]; 문헌[Hotaling et al (1996) [abstract]. Proc. Annual Meeting Am Assoc Cancer Res; 37:471]; 문헌[Pegram MD, et al (1997) [abstract]. Proc Am Assoc Cancer Res; 38:602]; 문헌[Sliwkowski et al (1999) Seminars in Oncology 26(4), Suppl 12:60- 70]; 및 문헌[Yarden Y. and Sliwkowski, M. (2001) Nature Reviews: Molecular Cell Biology, Macmillan Magazines, Ltd., Vol. 2:127-137]).
헤르셉틴(등록상표)(트라스투주맙, 진엔테크 인코포레이티드(Genentech Inc.))은 1998년에 HER-2 과발현성 전이성 유방암을 앓는 완자의 치료에 대해 승인되었다(문헌[Baselga et al, (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744]). 2006년, FDA는 헤르셉틴(등록상표)을 HER-2 양성, 절(node)-양성 유방암을 앓는 환자의 보강 치료를 위한 독소루비신, 사이클로포스파미드 및 파클리탁셀을 함유하는 치료법의 일부로서 승인하였다.
HER-2 양성 유방암의 치료를 위한 신규한 항체-약물 접합체(ADC)인 트라스투주맙-MCC-DMl(T-DMl, 트라스투주맙 엠탄신(trastuzumab emtansine), 아도(ado)-트라스투주맙 엠탄신, 카드사이클라(KADCYLA: 등록상표))은 MCC 링커(linker)를 통해 리신 측쇄에서 트라스투주맙에 접합된 세포독성제 DM1(티올-함유 메이탄시노이드 항-미세소관제)로 구성되고, 약 3.5의 평균 약물 부하(약물 대 항체 비)를 갖는다. 종양 세포에서 발현된 HER-2에 결합 후, T-DM1은 수용체-매개되는 내재화를 거쳐 DM1을 함유하는 세포독성 이화대사물질 및 후속의 세포 사멸을 야기한다. FDA는 트라스투주맙 및 탁산에 의한 선행 치료를 받은 HER-2 양성 전이성 유방암 환자의 치료에 대해 2013년 카드실라(KADCYLA: 등록상표)로 시판되는 아도-트라스투주맙 엠탄신을 승인하였다.
페르투주맙(재조합 인간화된 단클론 항체 2C4로도 공지되어 있음, rhuMAb 2C4, 페르제타(PERJETA: 등록상표), 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코의 진엔테크 인코포레이티드)은 HER-2를 표적으로 하는 또다른 항체 치료이다. 페르투주맙은 HER 이량체화 억제제(HDI)이고 다른 HER 수용체(예컨대 EGFR/HERl, HER-2, HER3 및 HER4)와 활성 이종이량체 또는 동종이량체를 형성하는 HER-2의 능력을 억제한다. 예컨대 문헌[Harari and Yarden Oncogene 19:6102-14 (2000)]; 문헌[Yarden and Sliwkowski. Nat Rev Mol Cell Biol 2:127-37 (2001)]; 문헌[Sliwkowski Nat Struct Biol 10:158-9 (2003)]; 문헌[Cho et al. Nature 421:756-60 (2003)]; 문헌[Malik et al. Pro Am Soc Cancer Res 44:176-7 (2003)]; 및 US 7560111을 참고한다. 페르제타(등록상표)는 진행성 또는 후기 (전이성) HER-2 양성 유방암 환자의 치료에 대해 트라스투주맙 및 도세탁셀과의 조합으로 2012년 처음 승인되었다. 트라스투주맙 및 페투주맙을 사용한 조합 치료는 HER-2 양성 국소 진행성 염증성 또는 초기 유방암의 신보강(neoadjuvant)(수술 전) 치료, 및 높은 재발률의 HER-2 양성 초기 유방암(EBC)의 보강(수술 후) 치료에 대해서도 승인받았다. 페르제타 및 헤르셉틴의 작용 기전은 둘다 HER-2 수용체에 결합하되 상이한 위치에 결합하도록 서로 상보적인 것으로 여겨진다. 페르제타와 헤르셉틴의 조합은 HER 신호전달 경로의 보다 포괄적인 이중 폐쇄(blockade)를 제공함으로써, 종양 세포 성장 및 생존을 예방하는 것으로 생각된다.
인간 ErbB2의 도메인 II, III 및 IV에 대해 유도되는 이중특이성 2가 HER-2 항체는 WO 2012/143523에 개시되어 있다. 항체 rhuMab 2C4 및 hu4D5의 최적화된 변형을 포함하는 이중특이성 HER-2 항체는 헤르셉타르크(Herceptarg)로 지칭되고 WO 2015/091738에 기재되어 있다.
트라스투주맙의 유방 암종에서의 치료 효능은 잘 입증되어 있지만, 내성에 기인하여 트라스투주맙으로 효과를 볼 수 없는 환자가 다수 존재한다. 낮은 수준의 HER-2를 발현하는 특정 암에서 효과적인 항-HER-2 치료의 결여, 현행 치료에 대한 내성 및 HER-2 관련 암의 만연에 기인하여, 이러한 암을 치료하기 위해 신규한 치료가 요구된다.
TNF 수용체 상과의 일원인 4-1BB(CD137)는 활성화된 T 세포에 의해 발현된 유도성 분자로서 처음 동정되었다(문헌[Kwon and Weissman, Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86, 1963-1967]). 후속의 연구들은 다수의 다른 면역세포, 예를 들어 NK 세포, B 세포, NKT 세포, 단핵세포, 호중구, 비만세포, 수지상 세포(DC) 및 비-조혈 기원의 세포, 예를 들어 내피세포 및 평활근세포가 또한 4-1BB를 발현함을 입증하였다(문헌[Vinay and Kwon, 2011 Cell Mol Immunol 8, 281-284]). 상이한 세포 유형들에서 4-1BB의 발현은 대개 유도성이며 다양한 자극 신호들, 예를 들어 T 세포 수용체(TCR) 또는 B 세포 수용체 촉발뿐만 아니라 공-자극 분자 또는 염증전 사이토카인의 수용체를 통해 유도된 신호전달에 의해 촉발된다(문헌[Diehl et al., 2992, J Immunol 168, 3755-3762]; 및 문헌[Zhang et al., 2010, Clin Cancer Res 13, 2758-2767]).
4-1BB 리간드(4-1BBL 또는 CD137L)는 1993년에 동정되었다(문헌[Goodwin et al., 1993, Eur J Immunol. 23, 2631-2641]). 4-1BBL의 발현은 전문적인 항원제시세포(APC), 예를 들어 B 세포, DC 및 대식세포상에서 제한되는 것으로 입증되었다. 4-1BBL의 유도성 발현은 αβ 및 γδ T 세포 부분집합 모두 및 내피세포를 포함한 T 세포들의 특징이다(문헌[Shao and Schwarz, 2011, J Leukoc Biol 89, 21-29]).
상기 4-1BB 수용체를 통한(예를 들어 4-1BBL 결찰에 의한) 공-자극은 상기 T 세포(CD4+ 및 CD8+ 부분집합 모두)내의 다수의 신호전달 캐스케이드를 활성화시키며, 이는 T 세포 활성화를 강력하게 증가시킨다(문헌[Bartkowiak and Curran, 2015]). TCR 촉발과 함께, 작용성 4-1BB-특이성 항체는 T 세포의 증식을 증대시키고, 림포킨 분비를 자극하며 활성화-유도된 세포사에 대한 T-림프구의 민감성을 감소시킨다(문헌[Snell et al., 2011, Immunol Rev 244, 197-217]). 상기 기전은 암 면역 치료에서 제1의 개념증명으로서 더욱 진보되었다. 전임상 모델에서, 종양 함유 마우스에서 4-1BB에 대한 작용성 항체의 투여는 효능 있는 종양-억제 효과를 도출하였다(문헌[Melero et al., 1997, Nat Med 3, 682-685]). 이후에, 축적된 증거는 4-1BB가 대개는 오직 다른 면역조절 화합물, 화학 치료제, 종양-특이성 백신화 또는 방사선 치료와 함께 투여되는 경우에만 항-종양제로서 그의 효능을 나타냄을 가리켰다(문헌[Bartkowiak and Curran, 2015, Front Oncol 5, 117]).
상기 TNFR-상과의 신호전달은 수용체와 맞물리기 위해서 삼량체화된 리간드의 가교-결합을 필요로 하며, 야생형 Fc-결합을 요하는 상기 4-1BB 작용성 항체가 이에 해당한다(문헌[Li and Ravetch, 2011, Science 333, 1030-1034]). 그러나, 기능적으로 활성인 Fc 도메인을 갖는 4-1BB-특이성 작용성 항체의 전신 투여는, 마우스에서 기능성 Fc-수용체의 부재하에 감소되거나 또는 현저하게 개선되는 간 독성과 관련된 CD8+ T 세포의 유입을 생성시켰다(문헌[Dubrot et al., 2011, Cancer Immunol Immunother 59, 1223-1233]). 임상에서, Fc-수용성 4-1BB 작용성 Ab(BMS-663513)(NCT00612664)는 4등급 간염을 유발하여 상기 시험을 종료케하였다(문헌[Simeone and Ascierto, 2012, J Immunotoxicol 9, 241-247]). 따라서, 유효하고 보다 안전한 4-1BB 작용제가 필요하다.
4-1BB 리간드의 하나의 세포외 도메인 및 단쇄 항체 단편(문헌[Hornig et al., 2012, J Immunother 35, 418-429]; 문헌[Muller et al., 2008, J Immunother. 31, 714-722]) 또는 중쇄의 C-말단에 융합된 단일 4-1BB 리간드(문헌[Zhang et al., Clin Cancer Res (2007) 13, 2758-2767])로 구성된 융합 단백질들이 제조되었다. WO 2010/010051은 서로 결합되고 항체 부분에 융합된 3개의 TNF 리간드 엑토도메인으로 이루어지는 융합 단백질의 생성을 개시한다. 상기 발명에서, 삼량체 및 따라서 생물학적으로 활성인 4-1BB 리간드 및 종양-관련 항원에 특이적인 항원 결합 도메인, 및 Fc-불활성 도메인으로 구성된 항원 결합 분자가 특별히 안정하고 강력한 것으로 나타났다. 4-1BB(CD137)을 통한 종양 특이적 공동-자극을 위해, 종양-기질의 FAP를 표적화하는 항원 결합 도메인 및 4-1BB 리간드의 삼량체를 포함하는 분자(이후로 FAP-4-1BBL로 명명됨)가 특히 유용한 것으로 나타났다. FAP 항원 결합 도메인은 특히 간에서 Fc-매개 세포독성을 야기하는 비특이성 FcγR-매개 가교연결을 FAP-표적 특이성 가교연결로 대체함으로써, 세포독성의 위험을 감소시킨다.
본 발명자들은 HER-2를 발현하는 종양에 대한 신규한 조합 치료를 본원에 기재하였다.
본 발명은 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 방법에서 4-1BB(CD137) 작용제, 특히 4-1BBL의 3개의 엑토도메인을 포함하는 항원 결합 분자, 및 HER-2 표적화 치료와의 조합에서 이의 용도에 관한 것이다. 본원에 기재된 조합 치료는 종양 성장의 억제 및 종양 세포의 제거에 있어서 4-1BB 작용제 단독 또는 공지된 KER-2 표적화 치료 단독보다 더 효과적인 것으로 밝혀졌다.
일부 양상에서, 본 발명은 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 방법에 사용하기 위한 4-1BB(CD137) 작용제를 제시하는데, 여기서 상기 4-1BB 작용제는 HER-2 표적화제와 조합으로 사용되고, 상기 4-1BB 작용제는 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이다.
일부 양상에서, HER-2 표적화제는 HER-2 항체, 이중특이성 HER-2 항체 및/또는 HER-2 항체 약물 접합체을 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신을 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및 트라스투주맙 엠탄신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신의 조합을 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및 트라스투주맙 엠탄신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HER-2 항체를 포함한다. 하나의 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙 또는 페르투주맙이다. 보다 특히, HER-2 표적화제는 트라스투주맙이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 글리코엔지니어링(glycoengineering)된 HER-2 항체, 예컨대 트라스젝스(TrasGex)이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 이중특이성 HER-2 항체, 예컨대 헤르셉타르크이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 HER-2 항체 약물 접합체, 특히 트라스투주맙 엠탄신(아도-트라스투주맙 엠탄신)이다.
일부 양상에서, 4-1BB 작용제는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함한다. 4-1BB 작용제는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 분자이되, 상기 4-1BBL의 엑토도메인은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열번호 1 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함한다.
추가 양상에서, 4-1BB 작용제는 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이다. 일부 양상에서, 4-1BB 작용제는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이다. 하나의 양상에서, 종양-관련 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 또는 CEA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 양상에서, 4-1BB 작용제는 IgG Fc 도메인, 구체적으로 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이다. 일부 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는 Fc 수용체에의 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이다. 특정 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는 Fcγ 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 변형을 갖는 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이다. 종양-관련 항원에 의한 가교연결은 비특이적 FcγR-매개 가교연결을 회피할 수 있게 하고, 이에 따라 통상적인 4-1BB 항체보다 더 높고 더 효능있는 투여 용량의 4-1BB 작용제가 투여될 수 있다.
일부 양상에서, 4-1BB 작용제는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이다. 일부 양상에서, 4-1BB 작용제는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인은
(a) (i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는
(b) (i) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)
을 포함한다.
또다른 양상에서, 4-1BB 작용제는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하거나, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함한다.
일부 양상에서, 4-1BB 작용제는
(a) FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 양상에서, 4-1BB 작용제는
(a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP) 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 한다.
또다른 양상에서, 4-1BB 작용제는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 항원 결합 분자이다.
일부 양상에서, 4-1BB 작용제는 항-FAP/항-4-1BB 이중특이성 항체이다.
또다른 양상에서, 4-1BB 작용제는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이다. 일부 양상에서, 4-1BB 작용제는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인은 (a) (i) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA), 및 (iv) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함한다.
또다른 양상에서, 4-1BB 작용제는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 CEA에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함한다.
또다른 양상에서, 4-1BB 작용제는
(a) CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 양상에서 4-1BB 작용제는
(a) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함하는 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 한다.
추가 양상에서, 4-1BB 작용제는 항-CEA/항-4-1BB 이중특이성 항체이다.
추가 양상에서, 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제는 단일 조성물로 함께 투여되거나 2개 이상의 상이한 조성물로 개별 투여된다. 추가 양상에서, 4-1BB 작용제는 HER-2 표적화제와 상승효과적으로 작용한다. 다른 양상에서, 4-1BB 작용제는 HER-2 작용제에 동시, 선행 또는 후속으로 투여된다.
추가 양상에서, 4-1BB 작용제 및 HER-2 작용제를 포함하는 조합이 제시된다. 하나의 양상에서, 조합은 약제로서 사용하기 위한 것으로서, 여기서 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제는 동시 투여를 위한 것이다. 다른 양상에서, 조합은 약제로서 사용하기 위한 것으로서, 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제는 순차 투여를 위한 것이다.
또다른 양상에서, 질환, 특히 암의 조합, 순차 또는 동시 치료에 사용하기 위한 (A) 활성 성분으로서 4-1BB 작용제 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제1 조성물; 및 (B) 활성 성분으로서 HER-2 표적화제 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제2 조성물을 포함하는 약학 제품이 제시된다.
추가 양상에서, 4-1BB 작용제 및 HER-2 작용제를 포함하는 약학 조성물이 제시된다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신을 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및 트라스투주맙 엠탄신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신의 조합이다. 추가 양상에서, 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는, 특히 진행성 및/또는 전이성 고형 암의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물이 제시된다.
추가 양상에서, 본 발명은 증식성 질환, 특히 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 약제의 제조에서 4-1BB 작용제와 HER-2 표적화제의 용도에 관한 것이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신을 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및 트라스투주맙 엠탄신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신의 조합이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 효과량의 4-1BB 작용제 및 효과량의 HER-2 표적화제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 대상의 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 방법을 제시한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신을 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및 트라스투주맙 엠탄신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신의 조합이다.
일부 양상에서, 본 발명은 효과량의 4-1BB 작용제 및 효과량의 HER-2 표적화제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 대상의 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 4-1BB 작용제는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 양상에서, 4-1BB 작용제는 본원에 제시되는 임의의 4-1BB 작용제이다. 일부 양상에서, 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제는 단일 조성물로 함께 투여되거나 2개 이상의 상이한 조성물로 개별 투여된다. 일부 양상에서, 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제는 정맥내 또는 피하 투여된다. 일부 양상에서, 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제는 HER-2 표적화제에 동시, 선행 또는 후속으로 투여된다.
추가 양상에서, 본 발명은 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 HER-2 표적화제와 조합된 4-1BB 작용제 또는 약학 조성물, 증식성 질환, 특히 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 4-1BB 작용제와 HER-2 표적화제의 조합의 용도, 또는 대상의 HER-2 양성 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 방법에 관한 것이다. 일부 양상에서, 암은 유방암, 난소암, 위암, 위-관련 암, 식도암, 폐암, 자궁암, 침샘관 암종, 방광암, 자궁내막암, 췌장암, 결장암, 전립선암 및/또는 두경부암이다.
도 1은 특정한 FAP-4-1BBL 항원 결합 분자를 도시한 것이다. 이들 분자를 실시예 1에 보다 상세히 기재한다. 짙은 검은색 점은 놉 인투 홀(knob into hole) 변형을 나타낸다. 1A는 상기 4-1BBL 이량체 및 4-1BBL 단량체에 인접한 CH1 및 CL 도메인 중에 변형을 갖는 1가 FAP-4-1BBL-삼량체 함유 항원 결합 분자를 도시한 것이다. 상기는 FAP 결합제 4B9을 포함하였기 때문에, 본원에서 FAP(4B9)-4-1BBL로 명명한다. 1B는 결합제 FAP(4B9)을 갖는 2가 구축물(2가 FAP(4B9)-4-1BBL로 명명됨)을 도시한 것이다. 1C 및 1D는 비표적화된 대조용 분자를 도시한다(FAP 결합제는 비-결합성 DP47 Fab에 의해 대체됨).
도 2의 2A 및 2B는 부동화된 쥐 4-1BB 및 인간 FAP 또는 쥐 FAP(분석물 2)에 대한 하이브리드 대리 FAP-mu4-1BBL(분석물 1)의 동시적 결합을 도시한 것이다. 2C는 부동화된 쥐 4-1BB 및 쥐 FAP(분석물 2)에 대한 쥐 이중특이성 FAP-4-1BB 항체 muFAP-4-1BB(분석물 1)의 동시적 결합을 도시한 것이다.
도 3은 실시예 4에 기재한 C57BL/6 마우스에서 단일 주사 후 muFAP-4-1BB의 약동학적 프로파일을 도시한 것이다.
도 4의 4A 및 4B는 실시예 5에 기재한 huCD16TgScid 마우스의 처리 일정 및 처리군을 도시한 것이다.
도 5의 5A는 트라스투주맙 단독, 하이브리드 FAP-mu4-1BBL 단독, 또는 둘다의 조합으로 처리한 마우스에서 관찰된 종양 성장 동역학(평균±SEM)을 도시한 것이다. 모든 처리군에 대해 각각의 동물의 개별 종양 성장 동역학을 5B(대조군), 5C(트라스투주맙 단독 처리군), 5D(FAP-mu4-1BBL 단독 처리군) 및 5E(조합 처리군)에 도시하였다. 종양-부재 마우스의 연구 종료시 개체수를 나타냈다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에 일반적으로 사용되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서를 해석하기 위해서, 하기의 정의들을 적용하며 적합한 경우에는 언제나 단수로 사용된 용어가 복수를 또한 포함할 것이며 이와 역도 마찬가지이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "항원 결합 분자"란 용어는 그의 가장 넓은 의미로, 항원 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자의 예는 항체, 항체 단편 및 스캐폴드(scaffold) 항원 결합 단백질이다.
본원에서 "항체"란 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며 다양한 항체 구축물들, 예를 들어 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 단일특이성 및 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체), 및 항체 단편(목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한)을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "단클론 항체"란 용어는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득되는 항체를 지칭한다, 즉 상기 집단을 포함하는 개별적인 항체가, 가능한 변형 항체, 예를 들어 천연 돌연변이를 함유하거나 또는 단클론 항체 제제의 생성 동안 발생하는 항체(상기와 같은 변체는 일반적으로 소량으로 존재함)를 제외하고, 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 항원상의 단일의 결정인자에 대한 것이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "단일특이성" 항체란 용어는 각각의 결합 부위가 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 상기 결합 부위를 갖는 항체를 나타낸다. "이중특이성"이란 용어는 항원 결합 분자가 적어도 2개의 개별의 항원 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 전형적으로, 이중특이성 항원 결합 분자는 2개의 항원 결합 부위를 포함하며, 이들은 각각 상이한 항원 결정인자에 특이적이다. 특정 양태에서 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 2개의 항원 결정인자, 특히 2개의 개별의 세포상에서 발현된 2개의 항원 결정인자에 동시에 결합할 수 있다.
본 출원내에 사용되는 바와 같은 "결합가"란 용어는 항원 결합 분자 중의 명시된 수의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 이와 같이, "2가", "4가" 및 "6가"란 용어들은 항원 결합 분자 중에 각각 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위의 존재를 나타낸다.
"전장 항체", "완전 항체" 및 "전체 항체"란 용어들은 본원에서 본래 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하는데 호환적으로 사용된다. "본래 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어 본래 IgG-부류 항체는 다이설파이드-결합되는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-에서부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 영역(VH)(또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라 칭함)에 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)(또한 중쇄 불변 영역이라 칭함)을 갖는다. 유사하게, N-에서부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 영역(VL)(또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라 칭함)에 이어서 경쇄 불변 도메인(CL)(또한 경쇄 불변 영역이라 칭함)을 갖는다. 항체의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG), 또는 μ(IgM)라 칭하는 5가지 유형 중 하나로 할당될 수 있으며, 이들 중 일부는 하위 유형, 예를 들어 γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 추가로 분류될 수 있다. 항체의 경쇄를 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 근거로, 카파(κ) 및 람다(λ)라 칭하는 2가지 유형 중 하나로 할당할 수 있다.
"항체 단편"은 완전 항체가 결합하는 항원에 결합하는 상기 완전 항체의 일부를 포함하는 상기 완전 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 교차-Fab 단편; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어 scFv); 및 단일 도메인 항체를 포함한다. 몇몇 항체 단편의 리뷰를 위해서, 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 리뷰를 위해서, 예를 들어 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조하고, WO 93/16185; 및 US 5,571,894 및 US 5,587,458도 참조한다. 구조 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의에 대해서, US 5,869,046를 참조한다. 다이아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어 EP 0 404 097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트라이아바디 및 테트라바디가 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9, 129-134(2003)]에 개시되어 있다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부 또는 경쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(문헌[Domantis, Inc., Waltham, MA]; 예를 들어 US 6,248,516 B1 참조). 항체 단편을 본 발명에 개시된 바와 같은 다양한 기법들, 예를 들어 비제한적으로 완전 항체의 단백질분해 절단뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어 에스케리키아 콜라이 또는 파지)에 의한 생산에 의해 제조할 수 있다.
완전 항체의 파파인 절단은, 각각 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 및 또한 상기 경쇄의 불변 도메인 및 상기 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유하는, "Fab" 단편이라 칭하는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성시킨다. 따라서, 본원에 사용되는 바와같이, "Fab 단편"이란 용어는 경쇄의 VL 도메인 및 불변 도메인(CL), 및 중쇄의 VH 도메인 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 경쇄 단편을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. Fab' 단편은 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 소수의 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 갖는 Fab' 단편이다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위(2개의 Fab 단편) 및 Fc 영역의 일부를 갖는 F(ab')2 단편을 제공한다.
"교차-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "교차 Fab 단편"이란 용어는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는 Fab 단편을 지칭한다. 교차 Fab 분자의 2개의 상이한 쇄 조성이 가능하며 이는 본 발명의 이중특이성 항체에 포함된다: 한편으로, 상기 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들이 교환된다, 즉 상기 교차 Fab 분자는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 구성된 펩티드 쇄, 및 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된 펩티드 쇄를 포함한다. 상기 교차 Fab 분자를 또한 교차Fab(VLVH)라 칭한다. 다른 한편으로, 상기 Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역이 교환될 때, 상기 교차 Fab 분자는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된 펩티드 쇄, 및 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 구성된 펩티드 쇄를 포함한다. 상기 교차 Fab 분자를 또한 교차Fab(CLCH1)라 칭한다.
"단쇄 Fab 단편" 또는 "scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 항체 경쇄 불변 도메인(CL) 및 링커로 이루어지는 폴리펩티드이고, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기의 순서 중 하나를 가지며: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL; 여기서 상기 링커는 적어도 30 아미노산, 바람직하게는 32 내지 50 아미노산의 폴리펩티드이다. 상기 단쇄 Fab 단편은 상기 CL 도메인과 CH1 도메인간의 천연 다이설파이드 결합을 통해 안정화된다. 또한, 이들 단쇄 Fab 분자는 시스테인 잔기들의 삽입(예를 들어 카밧 넘버링에 따른 상기 가변 중쇄 중의 44번 위치 및 상기 가변 경쇄 중의 100번 위치)을 통해 쇄간 다이설파이드 결합의 생성에 의해 추가로 안정화될 수도 있다.
"교차 단쇄 Fab 단편" 또는 "x-scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 항체 경쇄 불변 도메인(CL) 및 링커로 이루어지는 폴리펩티드이고, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기의 순서 중 하나를 가지며: a) VH-CL-링커-VL-CH1, 및 b) VL-CH1-링커-VH-CL; 여기서 VH 및 VL은 함께 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 형성하고, 여기서 상기 링커는 적어도 30 아미노산의 폴리펩티드이다. 또한, 이들 x-scFab 분자는 시스테인 잔기들의 삽입(예를 들어 카밧 넘버링에 따른 상기 가변 중쇄 중의 44번 위치 및 상기 가변 경쇄 중의 100번 위치)을 통해 쇄간 다이설파이드 결합의 생성에 의해 추가로 안정화될 수도 있다.
"단쇄 가변 단편(scFv)"은 10 내지 약 25 아미노산의 짧은 링커 펩티드와 연결된, 항체의 중(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 상기 링커는 대개 가요성을 위해 글리신이 풍부할 뿐만 아니라, 용해도를 위해서 세린 또는 트레오닌이 풍부하며, 상기 VH의 N-말단을 상기 VL의 C-말단과 연결시키거나, 또는 이와 역으로 연결시킬 수 있다. 상기 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고, 원래 항체의 특이성을 유지한다. scFv 항체는 예를 들어 문헌[Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96]에 기재되어 있다. 또한, 항체 단편은 기능성 항원 결합 부위에 대해, VH 도메인의 특징을 갖는, 즉 VL 도메인과 함께 조립될 수 있는, 또는 VL 도메인의 특징을 갖는, 즉 VH 도메인과 함께 조립될 수 있는, 이에 의해 전장 항체의 항원 결합 성질을 제공할 수 있는 단쇄 폴리펩티드를 포함한다.
"스캐폴드 항원 결합 단백질"은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 피브로넥틴 및 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin)이 항원-결합 도메인에 대한 대체 스캐폴드로서 사용되었다, 예를 들어 문헌[Gebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009)] 및 문헌[Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)]을 참조한다. 본 발명의 하나의 양상에서, 스캐폴드 항원 결합 단백질은 CTLA-4(에비바디(Evibody)), 리포칼린(안티칼린(Anticalin)), 단백질 A-유래된 분자, 예를 들어 단백질 A의 Z-도메인(애피바디(Affibody)), A-도메인(애비머(Avimer)/맥시바디(Maxibody)), 혈청 트랜스페린(트랜스-바디); 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin), 항체 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인(단일-도메인 항체, sdAb), 항체 중쇄의 가변 도메인(나노바디, VH), VNAR 단편, 피브로넥틴(애드넥틴(AdNectin)), C-유형 렉틴 도메인(테트라넥틴(Tetranectin)); 신규의 항원 수용체 베타-락타마제의 가변 도메인(VNAR 단편), 인간 감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴(애필린(Affilin) 분자); 인간 프로테아제 억제제의 쿠니츠 유형 도메인, 마이크로바디, 예를 들어 크노틴과로부터의 단백질, 펩티드 앱타머 및 피브로넥틴(애드넥틴)으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
리포칼린은 작은 소수성 분자, 예를 들어 스테로이드, 빌린, 레티노이드 및 지질을 수송하는 세포외 단백질의 한 과이다. 상기는 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 원추형 구조의 개방 단부에 다수의 고리를 갖는 강성의 베타-시트 2차 구조를 갖는다. 안티칼린은 160 내지 180 아미노산 크기이며 리포칼린으로부터 유래된다. 추가의 상세한 내용에 대해서 문헌[Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)], US7250297B1 및 US20070224633을 참조한다.
설계된 안키린 반복 단백질(DARPin)은 내재 막 단백질의 세포골격에의 부착을 매개하는 단백질의 한 과인 안키린으로부터 유래된다. 단일 안키린 반복부는 2개의 알파-나선 및 베타-회전으로 이루어지는 33 잔기 동기이다. 상기를 각 반복부의 제1 알파-나선 및 베타-회전 중의 잔기들을 무작위화함으로써 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작할 수 있다. 이들의 결합 접촉면은 모듈의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다(친화도 성숙화 방법). 추가의 상세한 내용에 대해서 문헌[J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)] 및 문헌[J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)] 및 US20040132028A1을 참조한다.
단일-도메인 항체는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 이루어지는 항체 단편이다. 제1 단일 도메인은 카멜리드로부터의 항체 중쇄의 가변 도메인으로부터 유래되었다(나노바디 또는 VHH 단편). 더욱 또한, 단일-도메인 항체란 용어는 자율적인 인간 중쇄 가변 도메인(aVH) 또는 상어로부터 유래된 VNAR 단편을 포함한다.
참조 분자로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 분자"는 경쟁 분석에서 그의 항원에 대한 상기 참조 분자의 결합을 50% 이상까지 차단하는 항원 결합 분자를 지칭한다, 환언하면 상기 참조 분자는 경쟁 분석에서 그의 항원에 대한 상기 항원 결합 분자의 결합을 50% 이상까지 차단한다.
"항원 결합 도메인"이란 용어는 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 상기에 상보성인 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 부분을 지칭한다. 항원이 큰 경우, 항원 결합 분자는 단지 상기 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있으며, 상기 부분을 에피토프라 칭한다. 항원 결합 도메인은 예를 들어 하나 이상의 가변 도메인(또한 가변 영역이라 칭함)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "항원 결정인자"란 용어는 "항원" 및 "에피토프"와 유의어이며, 항원 결합 부분이 결합하여, 항원 결합 부분-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자상의 부위(예를 들어 아미노산의 연속적인 신장부 또는 비-연속적인 아미노산의 상이한 영역들로 구성된 입체형태적 배열)를 지칭한다. 유용한 항원 결정인자는 예를 들어 종양 세포의 표면상에서, 바이러스-감염된 세포의 표면상에서, 다른 병든 세포의 표면상에서, 면역 세포의 표면상에서, 혈청 및/또는 세포외 기질(ECM) 중에서 자유롭게 발견될 수 있다. 본원에서 항원으로서 유용한 단백질은 달리 표시되지 않는 한, 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스(mouse) 및 래트(rat))로부터의 임의의 본래 형태의 단백질일 수 있다. 특정한 양태에서 상기 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특정한 단백질을 참조하는 경우, 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 단백질뿐만 아니라, 세포 중에서의 가공으로부터 생성되는 임의의 형태의 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 상기 단백질의 자연 발생 변체, 예를 들어 스플라이싱 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다.
"특이적 결합"은 상기 결합이 항원에 대해 선택성이며 불필요하거나 비-특이적인 상호작용과 구별될 수 있음을 의미한다. 특정한 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 능력은 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA) 또는 당업자에게 친숙한 다른 기법, 예를 들어 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법(비아코어(Biacore) 장비상에서 분석됨)(문헌[Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)]), 및 전통적인 결합 분석(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)])을 통해 측정될 수 있다. 하나의 양태에서, 관련되지 않은 단백질에 대한 항원 결합 분자의 결합 정도는 예를 들어 SPR에 의해 측정되는 바와 같이 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 양태에서, 상기 항원에 결합하는 분자는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하(예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
"친화도" 또는 "결합 친화도"는 분자(예를 들어 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 짝(예를 들어 항원)간의 비-공유 상호작용의 총 합의 강도를 지칭한다. 달리 표시되지 않는 한, 본원에 사용되는 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들어 항체와 항원)간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 짝 Y에 대한 친화도를 일반적으로 해리 상수(Kd)에 의해 나타낼 수 있으며, 상기 상수는 해리 및 결합속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비이다. 따라서, 균등한 친화도는 상기 속도 상수들의 비가 동일하게 남아있는 한 상이한 속도 상수를 포함할 수도 있다. 친화도를 본원에 기재된 것들을 포함하여 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정할 수 있다. 친화도의 특정한 측정 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR)이다.
"종양-관련 항원"이란 용어는 종양 세포에 의해 또는 종양 기질에서 고도로 발현되는 임의의 항원을 의미한다.
프롤릴 엔도펩티다제 FAP 또는 세프라제(EC 3.4.21)로도 공지되어 있는 "섬유아세포 활성화 단백질(FAP)"이란 용어는 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간), 비-인간 영장류(예를 들어 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유의 FAP를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 FAP뿐만 아니라, 세포 중에서의 가공으로부터 생성되는 임의의 형태의 FAP를 포함한다. 상기 용어는 또한 상기 CD3의 자연 발생 변체, 예를 들어 스플라이싱 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 인간, 마우스 및/또는 시노몰구스 FAP에 특이적으로 결합가능하다. 인간 FAP의 아미노산 서열은 유니프롯(www.uniprot.org) 접근번호 Q12884(버전 149, 서열번호 56), 또는 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq 004451.2에 나타나 있다. His-태깅된 인간 FAP ECD의 아미노산 서열은 81에 나타나 있다. 마우스 FAP의 아미노산 서열은 유니프롯 접근번호 P97321(버전 126, 서열번호 58), 또는 NCBI RefSeq NP_032012.1에 나타나 있다. 마우스 FAP의 세포외 도메인(ECD)는 아미노산 위치 26으로부터 761에 이른다. 서열번호 83은 His-태깅된 마우스 FAP ECD의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호 84는 His-태깅된 시노몰구스 FAP ECD의 아미노산 서열을 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명의 항-FAP 결합 분자는 FAP의 ECD에 결합한다. 예시적인 항-FAP 결합 분자는 국제 특허 출원 WO 2012/020006 A2에 기재되어 있다.
"암배아 항원(CEA)"이란 용어는 암배아 항원-관련 세포 부착 분자 5(CEACAM5)로도 공지되어 있고, 임의의 척추 동물 출처, 예컨대 포유동물, 예를 들어 영장류(예컨대 인간), 비인간 영장류(예컨대 시노몰구스 원숭이) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유의 CEA를 지칭한다. 인간 CEA의 아미노산 서열은 유니프롯 접근번호 P06731(버전 151, 서열번호 61)에 나타나 있다. 오랫동안, CEA는 종양-관련 항원으로서 동정되어 왔다(문헌[Gold and Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965]; 및 문헌[Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002]). 원래는 태아 조직에서만 발혈되는 단백질로서 분류된 CEA는 현재 몇몇 정상적인 성인 조직에서도 발견되었다. 이러한 조직은 1차적으로는 상피, 예컨대 위-소장, 호흡기 및 비뇨-생식 세포, 및 결장, 자궁, 땀샘 및 전립선 세포에서 유래한다(문헌[Nap et al., Tumour Biol., 9(2-3):145-53, 1988]; 및 문헌[Nap et al., Cancer Res., 52(8):2329-23339, 1992]). 상피 유래의 종양 및 이의 전이는 종양-관련 항원으로서 CEA를 함유한다. CEA의 존재 자체는 암성 세포로의 형질전환 지표가 아니고, CEA의 분포가 지표이다. 정상 조직에서, CEA는 일반적으로 세포의 첨단(apical) 표면에 발현됨으로써(문헌[Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)]), 혈류 중 항체에 접근이 불가해 진다. 정상 조직과는 대조적으로, CEA는 암성 세포의 전체 표면에 걸쳐 발현된다(문헌[Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)]). 이러한 발현 패턴의 변화는 CEA가 암성 세포에서의 항체 결합에 접근가능하도록 한다. 또한, CEA 발현은 암성 세포에서 증가한다. 또한, 증가된 CEA 발현은 세포내 부착의 증가를 촉진하고, 이는 전이를 야기할 수 있다(문헌[Marshall J., Semin Oncol., 30(a Suppl. 8):30-6, 2003]). 다양한 종양체에서 CEA 발현의 출현율은 일반적으로 매우 높다. 조직 샘플에서 수행된 자체 분석은 직장-결장 암종(CRC)에서 약 95%, 췌장암에서 약 90%, 위암에서 약 80%, 비소세포 폐암(NSCLC, HER3과 함께 공동-발현됨)에서 60%, 유방암에서 약 40%, 소세포 폐암 및 교모세포종에서는 낮은 발현율이 확인되어 공개된 데이터와 일치하였다.
CEA는 용이하게 세포 표면으로부터 절단되고 종양으로부터 직접 또는 림프를 통해 혈류로 흘러들어간다. 이러한 특성에 기인하여, 혈청 CEA의 수준은 암의 진단 및 암, 특히 직장-결장암의 재발에 대한 선별을 위한 임상적 마커로서 사용된다(문헌[Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992]; 문헌[Chau I., et al., J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004]; 및 문헌[Flamini et al., Clin Cancer Res; 12(23):6985-6988, 2006]).
본원에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 항원"은 T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 표면상에 제공된 항원 결정인자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 활성화 치료제"는 대상에서 T 세포 활성화를 유도할 수 있는 치료제, 특히 대상에서 T 세포 활성화를 유도하도록 설계된 치료제를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "활성화 T 세포 항원"은 T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구(항원 결합 분자와 상호작용시 T 세포 활성화를 유도하거나 증대시킬 수 있다)에 의해 발현되는 항원 결정인자를 지칭한다. 구체적으로, 항원 결합 분자와 활성화 T 세포 항원의 상호작용은 상기 T 세포 수용체 복합체의 신호전달 캐스케이드를 촉발시킴으로써 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. 예시적인 활성화 T 세포 항원은 CD3이다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"이란 용어는 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합에 관련된 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 본래 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조들을 가지며, 이때 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 고가변 영역(HVR)을 포함한다. 예를 들어 문헌[Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91(2007)]을 참조한다. 단일의 VH 또는 VL 도메인이면 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "고가변 영역" 또는 "HVR"이란 용어는 서열이 고가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 고리("고가변 고리")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각 영역들을 지칭한다. 일반적으로, 고유의 4-쇄 항체는 6개의 HVR; VH 중 3개(H1, H2, H3) 및 VL 중 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 상기 고가변 고리로부터 및/또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 최고의 서열 가변성을 갖고/갖거나 항원 인식에 관련된다. 예시적인 고가변 고리는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에 존재한다. (문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)].) 예시적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65, 및 H3의 95-102의 아미노산 잔기들에 존재한다. (문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)].) 고가변 영역(HVR)은 또한 상보성 결정 영역(CDR)을 지칭하며, 이들 용어는 상기 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 부분들을 참조하여 본원에서 호환적으로 사용된다. 상기 특정한 영역은 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)] 및 문헌[Chothia et al., J. Mol . Biol. 196:901-917 (1987)]에 기재되었고, 여기서 정의들은 서로에 대해 비교될 때 아미노산 잔기의 중복 또는 부분집합들을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그의 변체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용되는 용어의 범위내에 있도록 되어있다. 상기 인용된 각각의 참고문헌들에 의해 정의되는 바와 같은 CDR을 포함하는 적합한 아미노산 잔기를 비교로서 하기 표 B에 제시한다. 특정한 CDR을 포함하는 정확한 잔기 숫자는 상기 CDR의 서열 및 크기에 따라 변할 것이다. 당업자들은 어느 잔기가 상기 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 제공한 특정한 CDR을 포함하는지를 통상적으로 결정할 수 있다.
[표 A]
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카밧 등은 또한 임의의 항체에 적용할 수 있는 가변 영역 서열에 대한 넘버링 시스템을 한정한다. 당업자는 상기 "카밧 넘버링" 시스템을 상기 서열 자체에서 벗어난 임의의 실험 데이터에 의존하지 않으면서 임의의 가변 영역 서열에 명확하게 할당할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "카밧 넘버링"은 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 항체 가변 영역 중의 특정한 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 참조는 상기 카밧 넘버링 시스템에 따른다.
VH 중의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 고가변 고리를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원과 접촉하는 잔기들인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 약기된 CDR, 또는 a-CDR이라 칭하는 CDR들의 영역내에 함유된다. 예시적인 a-CDRs(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은 L1의 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58, 및 H3의 95-102 아미노산 잔기에 존재한다. (문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]을 참조한다.) 달리 표시하지 않는 한, 가변 도메인 중의 HVR 잔기 및 다른 잔기(예를 들어 FR 잔기)를 본원에서 상기 카밧 등에 따라 넘버링한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 항원 결합 분자(예를 들어 항체)와 관련하여 "친화도 성숙된"이란 용어는 참조 항원 결합 분자로부터 유래되고, 예를 들어 돌연변이에 의해, 상기 참조 항체와 동일한 항원에 결합하며, 바람직하게는 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 분자를 지칭하며; 상기 참조 항원 결합 분자의 경우보다 더 큰, 상기 항원에 대한 친화도를 갖는다. 친화도 성숙화는 일반적으로 상기 항원 결합 분자의 하나 이상의 CDR 중의 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형을 수반한다. 전형적으로, 상기 친화도 성숙된 항원 결합 분자는 초기 참조 항원 결합 분자와 동일한 에피토프에 결합한다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 고가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 상응하게, 상기 HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기의 순서로 존재한다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
본원의 목적을 위한 "수용체 인간 프레임워크"는 하기에 정의되는 바와 같은, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로 부터 유래된" 수용체 인간 프레임워크는 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 일부 양태에서, 상기 VL 수용체 인간 프레임워크는 상기 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서일이 일치한다.
"키메라 항체"란 용어는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 출처 또는 종으로부터 유래하는 반면 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 출처 또는 종으로부터 유래하는 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 상기 항체의 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5개의 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 다수는 하위부류(아이소타입)들, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 세분될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류들에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 칭한다.
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 양태에서, 인간화된 항체는 하나 이상, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 상기 HVR(예를 들어 CDR)의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 항체의 것들에 상응하며, 상기 FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화된 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다. 본 발명에 의해 포함되는 "인간화된 항체"의 다른 형태는 불변 영역이 원래 항체의 경우로부터 추가로 변형되거나 또는 변화되어, 특히 Clq 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합에 관하여 본 발명에 따른 성질을 생성시키는 것들이다.
"인간" 항체는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특별히 제외시킨다.
본원에서 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"이란 용어는 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 항체 중쇄의 C-말단 영역을 한정하는데 사용된다. 상기 용어는 본래 서열 Fc 영역 및 변형 Fc 영역을 포함한다. IgG Fc 영역은 IgG CH2 및 IgG CH3 도메인을 포함한다. 인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"은 대개 약 231번 위치의 아미노산 잔기로부터 약 340번 위치의 아미노산 잔기까지 연장된다. 하나의 양태에서, 탄수화물 쇄가 상기 CH2 도메인에 부착된다. 본원에서 상기 CH2 도메인은 본래 서열 CH2 도메인 또는 변형 CH2 도메인일 수 있다. 상기 "CH3 도메인"은 Fc 영역 중의 CH2 도메인에 C-말단인 잔기의 신장부(즉 IgG의 약 341번 위치의 아미노산 잔기로부터 약 447번 위치의 아미노산 잔기까지)를 포함한다. 본원에서 상기 CH3 영역은 본래 서열 CH3 도메인 또는 변형 CH3 도메인(예를 들어 그의 하나의 쇄 중에 도입된 "돌기"("놉") 및 그의 다른 쇄 중에 도입된 상응하는 "공동"("홀")을 갖는 CH3 도메인; 명백히 본 발명에 참고로 인용된 US 5,821,333 참조). 상기와 같은 변형 CH3 도메인을 사용하여 본원에 기재된 2개의 일치하지 않는 항체 중쇄의 이종이량체화를 촉진할 수 있다. 하나의 양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 상기 중쇄의 카복시-말단까지 연장된다. 그러나, 상기 Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재할 수도, 존재하지 않을 수도 있다. 본원에 달리 명시되지 않는 한, 상기 Fc 영역 또는 불변 영역 중의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 EU 넘버링 시스템(EU 색인으로도 지칭됨)에 따른다.
상기 "놉 인투 홀" 기술은 예를 들어 US 5,731,168; US 7,695,936; 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 문헌[Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 돌기가 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해하도록 공동내에 위치할 수 있게 상기 돌기("놉")를 제1 폴리펩티드의 접촉면에 도입시키고 상응하는 공동("홀")을 제2 폴리펩티드의 접촉면에 도입시킴을 수반한다. 돌기는 상기 제1 폴리펩티드의 접촉면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들어 타이로신 또는 트립토판)로 교체시킴으로써 구성된다. 상기 돌기와 동일하거나 유사한 크기의 보상 공동이, 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것(예를 들어 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체시킴으로써 상기 제2 폴리펩티드의 접촉면에 생성된다. 상기 돌기 및 공동을, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을, 예를 들어 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 펩티드 합성에 의해 변경시킴으로써 제조할 수 있다. 특정한 양태에서, 놉 변형은 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 하나에 아미노산 치환 T366W를 포함하며, 홀 변형은 상기 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 다른 하나에 아미노산 치환 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다. 추가의 특정한 양태에서, 상기 놉 변형을 포함하는 Fc 도메인의 서브유닛은 아미노산 치환 S354C를 추가로 포함하고, 상기 홀 변형을 포함하는 Fc 도메인의 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C를 추가로 포함한다. 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은 상기 Fc 영역의 2개 서브유닛 사이에 다이설파이드 가교를 형성시키고, 따라서 상기 이량체를 더욱 안정화시킨다(문헌[Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)]).
"면역글로불린의 Fc 영역과 균등한 영역"은 면역글로불린의 Fc 영역의 천연 대립유전자 변체뿐만 아니라, 치환, 부가 또는 결실을 생성시키지만 효과기 기능(예를 들어 항체-의존적인 세포 세포독성)을 매개하는 상기 면역글로불린의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 변경을 갖는 변체를 포함하도록 되어 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산을 생물학적 기능의 실질적인 상실 없이 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단으로부터 결실시킬 수 있다. 상기와 같은 변체를 활성에 대해 최소의 영향을 미치도록 당해 분야에 공지된 일반적인 법칙에 따라 선택할 수 있다(예를 들어 문헌[Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)]을 참조).
"효과기 기능"이란 용어는, 항체 아이소타입에 따라 변하는 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성들을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적인 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC), 항체-의존적인 세포 식작용(ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제공 세포에 의한 면역 복합체-매개된 항원 흡수, 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향조절, 및 B 세포 활성화.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 영역에 의한 관여에 이어서 효과기 기능을 수행하도록 수용체-함유 세포를 자극하는 신호전달 사건을 이끌어 내는 Fc 수용체이다. 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32), 및 FcαRI (CD89)를 포함한다. 특정한 활성화 Fc 수용체는 인간 FcγRIIIa이다 (유니프롯 수납 번호 P08637, 버전 141을 참조).
"엑토도메인"은 세포외 공간(즉 표적 세포 외부의 공간)내로 연장되는 막 단백질의 도메인이다. 엑토도메인은 대개 표면과의 접촉을 개시시켜 신호전달을 유도하는 단백질의 부분이다. 따라서 본원에 정의된 바와 같은 4-1BBL의 엑토도메인은 세포외 공간(세포외 도메인)내로 연장되는 4-1BBL의 부분을 지칭하나, 또한 삼량체화 및 상응하는 수용체 4-1BB에의 결합을 담당하는 그의 보다 짧은 부분 또는 단편을 포함한다. 따라서 "4-1BBL의 엑토도메인 또는 그의 단편"이란 용어는 상기 세포외 도메인을 형성하는 4-1BBL의 세포외 도메인 또는 여전히 상기 수용체(수용체 결합 도메인)에 결합할 수 있는 그의 부분을 지칭한다.
"4-1BBL" 또는 "4-1BB 리간드" 또는 "CD137L"은 공자극성 TNF 리간드과의 일원으로, T 세포의 증식 및 사이토카인 생산을 공자극할 수 있다. 공자극성 TNF과 리간드는 그의 상응하는 TNF 수용체와 상호작용시 TCR 신호를 공자극할 수 있으며 그의 수용체와의 상호작용은 TNFR-관련 인자(TRAF)의 모집을 유도하고, 이는 T 세포 활성화를 생성시키는 신호전달 캐스케이드를 개시시킨다. 4-1BBL은 II형 막관통 단백질이다. 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 완전 또는 전체 길이 4-1BBL은 세포의 표면상에서 삼량체를 형성하는 것으로 기재되었다. 상기 삼량체의 형성은 4-1BBL의 엑토도메인의 특정한 동기에 의해 가능해진다. 상기 동기를 본원에서 "삼량체화 영역"으로서 표시한다. 인간 4-1BBL 서열(서열번호 63)의 아미노산 50-254는 4-1BBL의 세포외 도메인을 형성하나, 심지어 그의 단편은 삼량체를 형성할 수 있다. 본 발명의 구체적인 양태에서, "4-1BBL의 엑토도메인 또는 그의 단편"은 서열번호 4(인간 4-1BBL의 아미노산 52-254), 서열번호 1(인간 4-1BBL의 아미노산 71-254), 서열번호 3(인간 4-1BBL의 아미노산 80-254), 서열번호 2(인간 4-1BBL의 아미노산 85-254), 서열번호 5(인간 4-1BBL의 아미노산 71-248), 서열번호 6(인간 4-1BBL의 아미노산 85-248), 서열번호 7(인간 4-1BBL의 아미노산 80-248), 및 서열번호 8(인간 4-1BBL의 아미노산 52-248) 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭하나, 삼량체화가 가능한 엑토도메인의 다른 단편들도 또한 여기에 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "4-1BB" 또는 "CD137"이란 용어는 달리 나타내지 않는 한 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유의 4-1BB를 지칭한다. 상기 용어는 "완전-길이"의 가공되지 않은 4-1BB뿐만 아니라 세포에서의 가공으로부터 생성되는 임의의 형태의 4-1BB를 포함한다. 상기 용어는 또한 4-1BB의 자연 발생 변체, 예를 들어 스플라이싱 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 4-1BB의 아미노산 서열을 서열번호 88에 나타내고(유니프롯 서열번호 Q07011), 예시적인 쥐 4-1BB의 아미노산 서열을 서열번호 89에 나타내고(유니프롯 서열번호 P20334), 예시적인 시노몰구스 4-1BB(히말라야 원숭이로부터)의 아미노산 서열을 서열번호 66에 나타낸다(유니프롯 서열번호 F6W5G6).
"항-4-1BB 항체", "항-4-1BB", "4-1BB 항체" 및 "4-1BB에 특이적으로 결합하는 항체"란 용어는 상기 항체가 4-1BB 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화도로 4-1BB와 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 하나의 양태에서, 관련되지 않은, 비-4-1BB 단백질에 대한 항-4-1BB 항체의 결합 정도는, 예를 들어 방사성면역분석(RIA) 또는 유식 세포측정(FACS)에 의해 측정시 4-1BB에 대한 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 양태에서, 4-1BB에 결합하는 항체는 1μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하(예를 들어. 10-6 M 이하, 예를 들어 10-68 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-8 M 내지 10-10 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
"HER-2"란 용어는 "ErbB2", "ErbB2 receptor" 또는 "c-Erb-B2"로도 공지되어 있고, 세포에서 HER-2 전구체 단백질의 가공으로부터 생성되는 임의의 고유의 성숙한 HER-2을 지칭한다. 달리 제시가 없는 한, 상기 용어는 임의의 적추 동물 출처, 예컨대 포유동물, 예를 들어 영장류(예컨대 인간 및 시노몰구스) 및 설치류(예컨대 마우스 및 래트)로부터의 HER-2를 포함한다. 또한, 상기 용어는 HER-2의 자연 발생 변체, 예컨대 스플라이싱 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 HER-2 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 95에 제시되어 있다.
"펩티드 링커"란 용어는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20 아미노산을 포함하는 펩티드를 지칭한다. 펩티드 링커는 당해 분야에 공지되어 있거나 또는 본원에 기재되어 있다. 적합한, 비-면역원성 링커 펩티드는 예를 들어 (G4S)n, (SG4)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커이고, 여기서 "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4, 특히 2의 수이다, 즉 상기 펩티드는 GGGGS(서열번호 67), GGGGSGGGGS(서열번호 68), SGGGGSGGGG(서열번호 69) 및 GGGGSGGGGSGGGG(서열번호 70)로 이루어지는 군으로부터 선택되나, 또한 서열 GSPGSSSSGS(서열번호 71), (G4S)3(서열번호 72), (G4S)4(서열번호 73), GSGSGSGS(서열번호 74), GSGSGNGS(서열번호 75), GGSGSGSG(서열번호 76), GGSGSG(서열번호 77), GGSG(서열번호 78), GGSGNGSG(서열번호 79), GGNGSGSG(서열번호 80) 및 GGNGSG(서열번호 81)를 포함한다. 특히 중요한 펩티드 링커는 (G4S)(서열번호 67) 및 (G4S)2(서열번호 68)이다.
본 출원내에 사용된 바와 같은 "아미노산"이란 용어는 알라닌(3문자 코드: ala, 1문자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 아이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 리신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 트레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 타이로신(tyr, Y), 및 발린(val, V)을 포함하는 천연 카복시 α-아미노산의 군을 나타낸다.
"융합된" 또는 "연결된"은 성분들(예를 들어 폴리펩티드 및 4-1BBL의 엑토도메인)이 펩티드 결합에 의해, 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 결합됨을 의미한다.
참조 폴리펩티드(단백질) 서열에 관한 "아미노산 서열 일치성 퍼센트(%)"는, 필요한 경우 최대의 서열 일치성 퍼센트를 성취하기 위해서, 및 상기 서열 일치성의 부분으로서 어떠한 보존적인 치환도 고려하지 않고, 서열과 도입 틈을 정렬시킨 후에, 기준 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기들과 일치하는 후보 서열 중의 아미노산 잔기들의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 일치성 퍼센트를 측정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식들로, 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALGN. SAWI 또는 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 성취될 수 있다. 당업자들은 서열들을 정렬시키기에 적합한 매개변수들, 예를 들어 비교하는 서열들의 전체길이에 대해 최대의 정렬을 성취하기 위해 필요한 임의의 연산을 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해서, 아미노산 서열 일치성%를 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성시킨다. 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 진엔테크 인코포레이티드에 의해 저술되었으며, 소스 암호는 미국 저작권 관청(미국 워싱톤 D.C. 20559 소재)에 사용자 문서와 함께 제출되었다(이때 상기 코드는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다). 상기 ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 진엔테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 입수할 수 있거나, 또는 상기 소스 암호로부터 편집될 수 있다. 상기 ALIGN-2 프로그램을, 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여, UNIX 실행 시스템상에서 사용하기 위해 편집해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수들은 상기 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다. ALIGN-2를 아미노산 서열 비교를 위해 사용하는 경우에, 주어진 아미노산 서열 A의 주어진 아미노산 서열 B에의, 상기 B와의, 또는 상기 B에 대한 아미노산 서열 일치성%(이는 한편으로 주어진 아미노산 서열 B에, 상기 B와, 또는 상기 B에 대해 일정한 아미노산 서열 일치성%를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)를 하기와 같이 계산한다:
100 x X/Y 분수
상기에서, X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 정렬에서 상기 프로그램에 의해 일치성 합치로서 채점되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 중 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 아미노산 서열 일치성%는 B 대 A의 아미노산 서열 일치성%와 동일하지 않음을 알 것이다. 달리 구체적으로 서술되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 아미노산 서열 일치성% 값들은 상기 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 단락에 개시된 바와 같이 획득된다.
특정 양태에서, 본원에 제공된 항원 결합 분자의 아미노산 서열 변체를 고려한다. 예를 들어, 상기 항원 결합 분자의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 성질들을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기 항원 결합 분자의 아미노산 서열 변체를, 상기 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 적합한 변형을 도입시키거나, 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기와 같은 변형은 예를 들어 상기 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기들의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 잔기들의 삽입 및/또는 상기 서열내에서 잔기들의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 최종 구축물에 도달하도록 수행할 수 있으나, 단 최종 구축물은 목적하는 특성, 예를 들어 항원-결합성을 가져야 한다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 프레임워크(FR)를 포함한다. 보존적 치환을 표 B에서 "바람직한 치환"의 제목하에 제공하고 아미노산 측쇄 부류(1) 내지 (6)을 참조하여 하기에 추가로 기재한다. 아미노산 치환을 관심 분자에 도입시키고 생성물을 목적하는 활성, 예를 들어 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별할 수 있다.
[표 B]
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아미노산들을 공통 측쇄 성질에 따라 분류할 수도 있다:(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적인 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또다른 부류에 대해 교환함을 수반할 것이다.
"아미노산 서열 변체"란 용어는 모 항원 결합 분자(예를 들어 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 고가변 영역 잔기 중에 아미노산 치환이 존재하는 실질적인 변체를 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택되는 상기 생성되는 변체(들)는 모 항원 결합 분자에 비해 몇몇 생물학적 성질들(예를 들어 증가된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형(예를 들어 개선)을 갖고/갖거나, 상기 모 항원 결합 분자의 몇몇 생물학적 성질들을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변체는 친화도 성숙된 항체이며, 상기 항체를 편의상, 예를 들어 파지 디스플레이-기재 친화도 성숙 기법, 예를 들어 본 발명에 개시된 것들을 사용하여 생성시킬 수 있다. 간단히, 하나 이상의 CDR 잔기를 돌연변이시키고 변체 항원 결합 분자를 파지상에 표시하고 특정한 생물학적 활성(예를 들어 결합 친화도)에 대해 선별한다. 특정 양태에서, 치환, 삽입 또는 결실이, 상기와 같은 변경이 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 CDR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어 본 발명에 제공되는 바와 같은 보존적 치환)를 CDR에서 수행할 수 있다. 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법을 문헌[Cunningham and Wells(1989) Science 244: 1081-1085]에 기재된 바와 같이 "알라닌 주사 돌연변이유발"이라 칭한다. 상기 방법에서, 표적 잔기들(예를 들어 하전된 잔기, 예를 들어 Arg, Asp, His, Lys 및 Glu)의 잔기 또는 군이 확인되며 이들을, 상기 항원과 항체와의 상호작용이 영향을 받는지를 측정하기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 치환시킨다. 추가의 치환을 상기 아미노산 위치들에 도입시켜 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증할 수 있다. 한편으로, 또는 추가로, 항체와 항원간의 접촉 지점들을 확인하기 위한 상기 항원-항원 결합 분자 복합체의 결정 구조. 상기와 같은 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기들을 치환용 후보로서 표적화하거나 제거할 수 있다. 변체를, 상기 변체가 목적하는 성질을 함유하는지를 측정하기 위해서 선별할 수도 있다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 길이 범위에 이르는 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기들의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항원 결합 분자를 포함한다. 상기 분자의 다른 삽입 변체는 항원 결합 분자의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함한다.
특정 양태에서, 본원에 제공된 항원 결합 분자를 상기 항체가 글리코실화되는 정도가 증가하거나 또는 감소하도록 변경시킨다. 상기 분자의 글리코실화 변체를 편의상, 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 획득할 수 있다. 상기 항원 결합 분자가 Fc 영역을 포함하는 경우, 상기에 부착된 탄수화물을 변경시킬 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 본래 항체는 전형적으로 상기 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 이중촉각 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어 문헌[Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물들, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코스아민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산뿐만 아니라 상기 이중촉각 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 중 GlcNAc에 부착된 퓨코스를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 항원 결합 분자에서 상기 올리고사카라이드의 변형을 몇몇 개선된 성질들을 갖는 변체를 생성시키기 위해 수행할 수도 있다. 하나의 양상에서, Fc 영역에 부착된(직접 또는 간접적으로) 퓨코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항원 결합 분자의 변체를 제공한다. 상기와 같은 퓨코실화 변체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어 미국 특허 공개 US 2003/0157108(Presta, L.) 또는 US 2004/0093621(쿄와 학코 코교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))를 참조한다. 본 발명의 항원 결합 분자의 추가의 변체는 이등분된 올리고사카라이드, 예를 들어 Fc 영역에 부착된 이중촉각 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 것들을 포함한다. 상기와 같은 항체 변체는 감소된 퓨코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다., 예를 들어 WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.); US 6,602,684(Umana et al.); 및 US 2005/0123546(Umana et al.)을 참조한다. 상기 Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 중에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 변체를 또한 제공한다. 상기와 같은 항체 변체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있으며, 예를 들어 WO 1997/30087(Patel et al.)); WO 1998/58964(Raju, S.); 및 WO 1999/22764(Raju, S.)에 개시되어 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 항원 결합 분자의 시스테인 조작된 변체, 예를 들어 상기 분자의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 "티오MAb"를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 양태에서, 상기 치환된 잔기는 상기 분자의 접근 가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 상기 항체의 접근 가능한 부위에 위치되며 이를 사용하여 본 발명에 추가로 개시된 바와 같이 상기 항체를 다른 부분, 예를 들어 약물 부분 또는 링커-약물 부분에 접합시켜 면역접합체를 생성시킬 수 있다. 특정 양태에서, 하기의 잔기들 중 임의의 하나 이상을 시스테인으로 치환시킬 수도 있다: 경쇄의 V205(카밧 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 항원 결합 분자를 예를 들어 US 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성시킬 수 있다.
특정 양상에서, 본원에 제공된 항원 결합 분자를 당해 분야에 공지되고 쉽게 입수할 수 있는 추가적인 비단백질성 부분을 함유하도록 추가로 변형시킬 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 부분은 비제한적으로 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 그의 수 중 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며 분지되거나 분지되지 않을 수도 있다. 상기 항체에 부착된 중합체들의 수는 변할 수 있으며, 하나보다 많은 중합체가 부착되는 경우, 이들 중합체는 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 상기 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형을 비제한적으로, 개선시키고자 하는 상기 항체의 특정한 성질 또는 기능, 상기 이중특이성 항체 유도체를 한정된 조건하에서 치료법에 사용할 것인지의 여부 등을 포함한 고려사항을 기준으로 결정할 수 있다. 또다른 양상에서, 방사선에의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 부분의 접합체를 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 비단백질성 부분은 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 상기 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 비제한적으로 통상적인 세포에는 해롭지 않지만 상기 비단백질성 부분을 상기 항체-비단백질성 부분에 근접한 세포를 죽이는 온도로 가열하는 파장을 포함한다. 또다른 양상에서, 본원에 제공된 4-1BBL-함유 항원 결합 분자의 면역접합체를 수득할 수 있다. "면역접합체"는 비제한적으로 세포독성제를 포함하여, 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
"폴리뉴클레오티드"란 용어는 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예를 들어 전령 RNA(mRNA), 바이러스-유래된 RNA, 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포다이에스터 결합 또는 비-통상적인 결합(예를 들어 아미드 결합, 예를 들어 펩티드 핵산(PNA) 중에서 발견되는 결합을 포함할 수 있다. "핵산 분자"란 용어는 폴리뉴클레오티드 중에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들어 DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다.
"단리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 그의 본래 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 목적을 위해 단리된 벡터 중에 함유된 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드가 고려된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가의 예는 이종 숙주 세포 중에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드 분자를 통상적으로 함유하는 세포 중에 함유된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체외에 존재하거나 또는 그의 자연적인 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사물뿐만 아니라 양성 및 음성 가닥 형태, 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성적으로 생성된 상기와 같은 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결자와 같은 조절 요소이거나 또는 상기를 포함할 수 있다.
본 발명의 참조 뉴클레오티드 서열에 적어도, 예를 들어 95% "일치하는" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는, 상기 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 상기 참조 뉴클레오티드 서열의 각 100 뉴클레오티드당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있음을 제외하고, 상기 참조 서열과 일치함을 의미한다. 즉, 참조 뉴클레오티드 서열에 적어도 95% 일치하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해서, 상기 참조 서열 중 뉴클레오티드의 5% 이하를 결실시키거나 또는 또다른 뉴클레오티드로 치환하거나, 상기 참조 서열 중 전체 뉴클레오티드의 5% 이하의 뉴클레오티드의 수를 상기 참조 서열내에 삽입할 수 있다. 상기 참조 서열의 이러한 변경은 상기 참조 서열 중 잔기들간에 개별적으로 또는 상기 참조 서열내 하나 이상의 연속적인 군 중에 산재된, 상기 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치 또는 상기 말단 위치들 사이의 어디에서나 발생할 수 있다. 실용적인 문제로서, 임의의 특정한 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는지의 여부는 통상적으로 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 폴리펩티드에 대해 상기 논의된 것들(예를 들어 ALIGN-2)을 사용하여 측정할 수 있다.
"발현 카세트"란 용어는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 명시된 핵산 요소와 함께 재조합적으로 또는 합성적으로 생성되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 상기 재조합 발현 카세트를 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 또는 핵산 단편에 통합시킬 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열들 중에서도 전사되는 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
"벡터" 또는 "발현 벡터"란 용어는 "발현 구축물"과 유의어이며 특정한 유전자를 상기가 표적 세포와 작동적으로 관련되도록 도입시키고 그의 발현을 지시하는데 사용되는 DNA 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구축물로서 벡터뿐만 아니라 상기 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈내에 통합된 벡터를 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 다량의 안정한 mRNA의 전사를 허용한다. 일단 상기 발현 벡터가 표적 세포내에 있으면, 상기 유전자에 의해 암호화되는 리보핵산 분자 또는 단백질이 상기 세포 전사 및/또는 번역 기구에 의해 생성된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
"숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"이란 용어는 호환적으로 사용되며 상기와 같은 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이들은 계대의 수와 상관 없이 1차 형질전환된 세포 및 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일할 필요는 없으며, 돌연변이를 함유할 수도 있다. 원래 형질전환된 세포에 대해 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손은 본 발명에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자를 생성시키는데 사용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어 몇가지 언급하자면, 포유동물 배양된 세포, 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포를 포함하나, 또한 유전자삽입 동물, 유전자삽입 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직내에 포함된 세포를 포함한다.
작용제의 "효과량"은 상기 작용제가 투여되는 세포 또는 조직에서 생리학적 변화를 생성시키기에 필요한 양을 지칭한다.
본 발명에 따른 조합 치료는 상승효과를 갖는다. 2개의 화합물의 "상승효과"는 2개의 제제의 조합의 조합의 효과가 이의 개별 효과의 합보다 크고, 대조군 및 단일 약물과는 통계적으로 상이한 것이다. 또다른 양태에서, 본원에 개시된 조합 치료는 부가 효과를 갖는다. 2개의 화합물의 "부가 효과"는 2개의 제제의 조합이 이의 개별 효과의 합이고, 대조군 및/또는 단일 약물과는 통계적으로 상이한 것이다.
작용제, 예를 들어 약학 조성물의 "치료 효과량"은 필요한 투여 용량 및 기간 동안 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 성취하기에 효과적인 양을 지칭한다. 작용제의 치료 효과량은 예를 들어 질환의 부작용을 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화하거나 또는 방지한다.
"개체" 또는 "대상"은 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로 가축(예를 들어 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어 인간 및 비인간 영장류, 예를 들어 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함한다. 특히, 상기 개체 또는 대상은 인간이다.
"약학 조성물"이란 용어는, 함유된 활성 성분의 생물학적 활성을 유효하게 하는 형태이고 제형이 투여되는 대상에게 허용 가능하지 않게 독성인 추가적인 성분은 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 외에, 대상에게 무독성인 약학 조성물 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 부형제는 비제한적으로 완충제, 안정화제 또는 보존제를 포함한다.
"패키지 삽입지"는 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여 용량, 투여, 복합 치료, 금기 및/또는 경고에 관한 정보를 함유하는, 상기와 같인 치료 제품의 상업적인 패키지 중에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하는데 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료" (및 "치료하다" 및 "치료하는"과 같은 그의 문법상 어미변화)는 치료 중인 개체의 자연적인 과정을 변경시키고자 하는 임상적 중재를 지칭하며, 예방을 위해서 또는 임상적 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 분자를 사용하여 질환의 발생을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 늦춘다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장, 즉 고형 종양 또는 흑색종과 같은 증식성 질환을 특징으로하는 포유 동물의 생리 학적 상태를 지칭하거나 설명한다. "종양"은 하나 이상의 암성 세포를 포함한다. 본원에 사용 된용어 "고형 종양"은 일반적으로 낭종 또는 액체 영역을 포함하지 않는 비정상적인 조직 덩어리를 의미한다. 고형 종양은 양성이거나 악성일 수 있다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프성 악성 종양을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 유방암, 편평세포 암(예를 들어, 상피 편평세포 암), 소세포 폐암을 포함한 폐암, 비소세포 폐암(NSCLC), 폐의 선암 및 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포암, 위암 또는 위-관련 암(예컨대 위장-소장암), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 결장암, 직장암, 결장-직장암, 자궁내막 암종 또는 자궁 암종, 침샘암, 신장암 또는 비뇨기암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 두경부암을 포함한다. 바람직한 양태에서, 암은 유방암이다. 또다른 양태에서, 암은 위암이다.
"0 기", "I 기", "II 기", "III 기"또는 "IV 기"와 같은 종양 또는 암 및 이러한 분류 내의 다양한 하위 기에 대한 지칭은 당업계에 공지되어 있는 전체 단계 그룹화 또는 로마 숫자 단계화 방법을 사용한 종양 또는 암의 분류를 나타낸다. 암의 실질적 기는 암의 유형에 따라 다르지만, 일반적으로 0 기 암은 제자리(in situ) 병변, I 기 암은 소형 국소 종양, II 기 및 III 기 암은 국소 림프절의 침범을 나타내는 국소 진행성 종양, IV 기 암은 전이성 암을 나타낸다. 각 유형의 종양에 대한 특정 기는 숙련된 임상의에게 공지되어 있다.
용어 "전이성 유방암"은 암세포가 혈관 또는 림프관에 의해 원래 부위에서 신체의 하나 이상의 부위로 전달되어 유방 외의 더 많은 장기에서 하나 이상의 이차 종양을 형성하는 유방암 상태를 의미한다.
"진행성 암"은 국소 침습 또는 전이에 의해 기원 부위 또는 기관 외부로 퍼진 암이다. 따라서, 용어 "진행성 암"은 국소 진행성 및 전이성 질환을 모두 포함한다. "불응성 암"은 화학요법과 같은 항종양제를 암환자에게 투여하더라도 진행되는 암이다. 불응성 암의 예는 백금 불응성 암이다. "재발성 암"은 수술과 같은 초기 치료에 대한 반응 후 초기 부위 또는 거리가 있는 부위에서 재발한 암이다. "국소 재발성 암"은 이전에 치료한 암과 같은 부위에서 치료 후 재발하는 암이다. "수술가능 암" 또는 "절제가능 암"은 1차 기관에 국한되어 수술(절제)에 적합한 암이다. "비-절제가능 암" 또는 "절제불가능 암"은 수술로 제거(절제) 할 수 없다.
"HER 발현, 증폭 또는 활성화를 나타내는 암 또는 생물학적 샘플"은 진단 시험에서 HER 수용체를 발현(과발현 포함)하고, 증폭된 HER 유전자를 가지고/거나 다르게는 HER 수용체의 활성화 또는 인산화를 나타내는 것이다.
용어 "HER-2- 양성"및 "HER-2 발현"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "HER-2 양성 암"은 정상 수준보다 높은 HER-2 수준을 갖는 암 세포를 포함한다. HER-2 양성 암의 예는 HER-2 양성 유방암 및 HER2 양성 위암을 포함한다. 임의적으로, HER2 양성은 HER-2 과발현 암이고, 특정 양태에서 HER-2 양성 암은 2+ 또는 3+의 면역조직화학(HC) 점수 및/또는 2.0 이상의 ISH(제자리 하이브리드화) 증폭 비율을 갖는다.
ISH는 형광, 발색 또는 은 검출 시스템(즉 FISH, CISH 또는 SISH), 또는 CISH와 SISH 시스템의 조합(브라이트-필드(bright-field) 이중 ISH(BDISH) 또는 이중 헵텐, 이중 색상 ISH(DDISH))에 연결된 DNA 프로브를 사용하여 her2 카피(copy)의 개수를 측정한다. ISH는 단일 프로브를 사용하여 핵당 her2 카피를 열거하거나 염색체 17 동원체 프로브(염색체 열거 프로브 17, CEP17)의 혼성화를 통해 her2:CEP17 비율을 측정할 수 있는 이중 프로브 기술로 수행될 수 있다. 2-프로브 접근법은 동일한 슬라이드에서 두 프로브의 공동-하이브리드화와 함께 이중 색상 기술로 수행되거나 각 프로브가 순차적 슬라이드에서 사용되는 단색 분석으로 수행될 수 있다. her2:CEP17 비율은 평균 her2 카피 수보다 her2 증폭 상태를 종종 더 잘 반영하는 것으로 간주되는데, 후자는 종양의 분열 지수, 단면 두께, 핵 절단 효과 및 비정상 염색체 카피 개수(어뉴소미(aneusomy))와 같은 다른 매개변수에도 의존하기 때문이다. "2.0 이상의 ISH 증폭 비율"이라는 어구는 2.0 이상의 her2:CEP17 비를 의미한다. 더욱 상세한 것은 예컨대 문헌[Sauter G, et al. Guidelines for human epidermal growth factor receptor 2 testing: biologic and methodologic considerations. J Clin Oncol 2009; 27: 1323-1333] 및 리뷰 글 문헌[Hanna et al. Modern Pathology (2014) 27, 4-18]을 참고한다
여기서 "환자"또는 "피험자"는 인간 환자이다. 환자는 "암 환자", 즉 암, 특히 위암 또는 유방암의 하나 이상의 증상을 앓고 있거나 앓을 위험이있는 환자 일 수있다.
"환자 집단"은 암 환자의 군을 의미한다. 이러한 집단은 페르투주맙과 같은 약물의 통계적으로 유의한 효능 및/또는 안전성을 입증하는데 사용될 수 있다. "재발 환자"는 관해 후 암 징후 또는 증상이 있는 환자이다. 임의적으로, 상기 환자는 보강 또는 신보강 치료 후 재발 환자이다.
본원에서 "신보강 치료" 또는 "수술 전 치료"은 수술 전에 제공된 요법을 지칭한다. 신보강 치료의 목표는 즉각적인 전신 치료를 제공하여 전신 요법이 뒤 따르는 표준 수술 순서를 따를 경우 증식할 수 있는 미세 전이를 잠재적으로 근절하는 것이다. 신보강 치료는 또한 종양 크기를 줄여 초기에 절제할 수 없는 종양을 완전히 절제하거나 장기와 그 기능을 보존하는데 도움이 된다. 또한, 신보강 치료는 후속 치료의 선택을 안내할 수 있는 약물 효능의 생체내 평가를 가능하게 한다.
본원에서 "보강 치료"는 질병 재발의 위험을 감소시키기 위해 잔여 질환의 증거가 검출될 수없는 결정적인 수술 후에 제공되는 치료를 지칭한다. 보강 치료의 목표는 암의 재발을 방지하여 암-관련 사망 가능성을 줄이는 것이다. 본원에서 보강 치료는 특히 신보강 요법을 배제한다.
"화학요법"은 암 치료에 유용한 화학요법제의 사용을 지칭한다.
"화학요법제"는 작용 기전에 관계없이 암 치료에 유용한 화합물이다. 화학요법제의 부류는 알킬화제, 항대사산물, 방추 독 식물 알칼로이드, 세포독성/항종양 항생제, 국소이성화 효소 억제제, 항체, 광증감제 및 키나제 억제제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
"CD20"은 B-림프구 항원 CD20(또한 B-림프구 표면 항원 B1 또는 백혈구 표면 항원 Leu-16으로서 공지됨)을 지칭하며, 달리 지시되지 않는 한, 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간), 비-인간 영장류(예를 들어 시노몰구스 원숭이) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 본래의 CD20을 포함한다. 인간 CD20의 아미노산 서열은 유니프롯 접근번호 P11836(버전 149, 서열번호 85)에 나타나 있다. CD20은 전-B 및 성숙한 림프구상에서 발현된 대략 35 kD의 분자량을 갖는 소수성 막관통 단백질이다. 상응하는 인간 유전자는 막에 걸쳐 있는 4-도메인, 아과 A, 구성원 1(또한 MS4A1으로서 공지됨)이다. 상기 유전자는 상기 막에 걸쳐 있는 4A 유전자과의 일원이다. 상기 발생기 단백질과의 구성원들은 공통적인 구조 특징 및 유사한 인트론/엑손 스플라이싱 경계를 특징으로 하며 조혈 세포 및 비림프양 조직 사이에서 특유의 발현 패턴을 나타낸다. 상기 유전자는 B 세포의 원형질세포로의 발달 및 분화에 한 역할을 하는 B-림프구 표면 분자를 암호화한다. 상기 과의 구성원은 과 구성원들의 무리 중에서 11q12에 국소화된다. 상기 유전자의 또다른 스플라이싱는 동일한 단백질을 암호화하는 2개의 전사 변체를 생성시킨다. "CD20"이란 용어는 "완전-길이"의 가공되지 않은 CD20뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 임의의 형태의 CD20을 포함한다. 상기 용어는 또한 CD20의 자연 발생 변체, 예를 들어 스플라이싱 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다.
"항-CD20 항체" 및 "CD20에 결합하는 항체"란 용어는 상기 항체가 CD20 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화도로 CD20과 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 하나의 양태에서, 관련되지 않은, 비-CD20 단백질에 대한 항-CD20 항체의 결합 정도는, 예를 들어 방사성면역분석(RIA)에 의해 측정시 CD20에 대한 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 양태에서, CD20에 결합하는 항체는 1μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하(예를 들어. 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 특정 양태에서, 항-CD20 항체는, 상이한 종들로부터의 CD20 중에서 보존되는 CD20의 에피토프에 결합한다.
"II형 항-CD20 항체"는 문헌[Cragg et al., Blood 103 (2004) 2738-2743], 문헌[Cragg et al., Blood 101 (2003) 1045-1052] 및 문헌[Klein et al., mAbs 5 (2013), 22-33]에 기재된 II형 항-CD20 항체의 결합 성질 및 생물학적 활성을 갖는 항-CD20 항체를 의미한다. II형 항-CD20 항체는 CD20의 II 부류 에피토프에 결합하고, CD20을 지질 뗏목에 국소화하지 않고, ADCC 활성을 나타내지만, IgG1 동형 항체인 경우 낮은 CDC는 I 부류 CD20 에피토프에 대한 항체 결합에 비해 B 세포에 대한 결합 능력이 적고, 동정형 응집 및 강력한 사멸 유도를 나타낸다. II형 항-CD20 항체의 예는 예를 들어 오비누투주맙(GA101), 토시투뮤맙(B1), 인간화된 B-Ly1 항체 IgG1(WO　2005/044859에 개시된 바와 같은 키메라 인간화된 IgG1 항체), 11B8 IgG1(WO 2004/035607에 개시됨) 및 AT80 IgG1을 포함한다. 특정 양상에서, II형 항-CD20 항체는 오비누투주맙이다(문헌[INN, WHO Drug Information, Vol. 26, No. 4, 2012, p. 453]에 권장됨). 본원에 사용되는 오비누투주맙은 GA101의 동의어이다. 상표명은 가지바(GAZYVA: 등록상표) 또는 가지바로(GAZYVARO: 등록상표)이다. 상기는 모든 선행 버전을 대체하며(예를 들어 문헌[Vol. 25, No. 1, 2011, p.75-76]), 이전에는 아푸투주맙(권장된 INN, 문헌[WHO Drug Information, Vol. 23, No. 2, 2009, p. 176; Vol. 22, No. 2, 2008, p. 124])으로서 공지되었다. 하나의 양상에서, 상기 II형 항-CD20 항체는 토시튜모맙이다.
본 발명에 사용하기 위한 예시적인 4-1BB 작용제
본 발명은 4-1BB 작용제 및 이의 HER-2 표적화 치료와 조합으로의 용도, 특히 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 용도에 관한 것이다. 일부 양태에서, 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화 치료와의 조합으로 이의 용도는 고형 종양을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 방법에서의 것이다.
특히, HER-2 표적화 치료와 조합으로 사용되는 4-1BB 작용제는 4-1BBL을 포함하는 분자이다. 특히, 본 발명에 사용되는 4-1BB 작용제는 4-1BBL의 3개의 엑토 도메인 또는 그의 단편을 포함한다.
특정 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 분자이고 상기 4-1BBL의 엑토도메인은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열번호 1 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 4-1BB 작용제는 종양-관련 항원, 특히 암 세포 상 또는 기질 내의 표적에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 경우 특히 유용하다. 따라서, 특정 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 또는 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이다.
추가의 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은
(a) (i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는
(b) (i) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)
을 포함한다.
특정 양상에서, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 (i) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
추가 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하거나, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함한다. 보다 특히, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함한다.
또다른 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 추가로 포함하는 항원 결합 분자이다. 하나의 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는 IgG Fc 도메인, 구체적으로 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이다. 특히, 상기 4-1BB 작용제는 Fc 수용체에의 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이다. 특정 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G를 포함하는 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이다.
하나의 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는
(a) FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함한다.
특정 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는
(a) FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는
(i) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 CH1 또는 CL 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 CL 또는 CH1 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 상기 CH1 및 CL 도메인간의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 상기 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결된 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나,
(ii) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 CH3 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 CH3 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 상기 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나,
(iii) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 VH-CL 또는 VL-CH1 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 VL-CH1 도메인 또는 VH-CL 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 상기 CH1과 CL 도메인간의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 VH 또는 VL에 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 VL 또는 VH에 연결되는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함
을 특징으로 한다.
또다른 양태에서, 상기 4-1BB 작용제는
(a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP) 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 한다.
특정 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는
a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 분자; 및
b) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 분자
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원 결합 분자이다.
특히, 상기 4-1BB 작용제는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 항원 결합 분자이다.
특히, 상기 4-1BB 작용제는
(a) FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이다.
또다른 양상에서, 4-1BB 작용제는
(a) FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인,
(b) 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 임의로 펩티드 링커를 통해 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 하나의 N- 또는 C-말단 아미노산에 융합된다.
특정한 이중특이성 항체는 PCT 공개 WO 2016/075278 A1 또는 PCT 공개 WO 2016/156291 A1에 기재되어 있다.
추가 양상에서, 4-1BB 작용제는 항-FAP/항-4-1BB 이중특이성 항체이다.
또다른 양상에서, 4-1BB 작용제는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자로서, 상기 CEA에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 (i) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA), 및 (iv) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함한다.
추가 양상에서, 4-1BB 작용제는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 CEA에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함한다.
또다른 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 추가로 포함하는 항원 결합 분자이다. 하나의 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는 IgG Fc 도메인, 구체적으로 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이다. 특히, 상기 4-1BB 작용제는 Fc 수용체에의 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이다. 특정 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G를 포함하는 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이다.
하나의 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는
(a) CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함한다.
특정 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는
(a) CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는
(i) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 CH1 또는 CL 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 CL 또는 CH1 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 상기 CH1 및 CL 도메인간의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 상기 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결된 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나,
(ii) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 CH3 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 CH3 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 상기 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나,
(iii) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 VH-CL 또는 VL-CH1 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 VL-CH1 도메인 또는 VH-CL 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 상기 CH1과 CL 도메인간의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 VH 또는 VL에 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 VL 또는 VH에 연결되는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함
을 특징으로 한다.
또다른 양태에서, 상기 4-1BB 작용제는
(a) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함하는 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 한다.
특정 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 항원 결합 분자이다.
또다른 양상에서, 상기 4-1BB 작용제는
(a) CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이다.
또다른 양상에서, 4-1BB 작용제는
(a) CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인,
(b) 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 임의로 펩티드 링커를 통해 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 하나의 N- 또는 C-말단 아미노산에 융합된다.
또다른 양상에서, 4-1BB 작용제는 항-CEA/항-4-1BB 이중특이성 항체이다.
HER-2 표적화제
본 발명의 양상에서, 본원에 기재된 4-1BB 작용제는 HER-2 표적화제와 조합으로 사용된다.
본 발명의 일부 양상에서, 4-1BB 작용제는 HER-2 표적화제와 조합으로 사용된다. 일부 양태에서, 상기 제제는 HER-2와 상화작용한다. 일부 양태에서, 상기 제제는 HER-2 길항제이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 HER-2 항체, 이중특이성 HER-2 항체 및/또는 HER-2 항체 약물 접합체를 포함한다. 일부 양태에서, 제제는 항체 또는 항원 결합 단편, 특히 항-HER-2 항체이다. 일부 양태에서, 제제는 이중특이성 HER-2 항체이다. 일부 양태에서, 제제는 항체-약물 접합체이다.
일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신을 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및 트라스투주맙 엠탄신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신의 조합을 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및 마르게툭시맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HER-2 항체를 포함한다. 하나의 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙 또는 페르투주맙이다. 보다 특히, HER-2 표적화제는 트라스투주맙이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 글리코엔지니어링된 HER-2 항체, 예컨대 트라스젝스이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 이중특이성 HER-2 항체, 예컨대 헤르셉타르크이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 HER-2 항체 약물 접합체, 특히 트라스투주맙 엠탄신(아도-트라스투주맙 엠탄신)이다.
일부 양상에서, HER-2 표적화제는 서열번호 96의 중쇄 가변 도메인(VH) 및 서열번호 97의 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 서열번호 98의 중쇄 가변 도메인(VH) 및 서열번호 99의 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체를 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 임의의 목적에 있어서, 제제는 트라스투주맙(CAS 180288-69-1, 헤르셉틴(등록상표), huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, 진엔테크), 페르투주맙(rhuMAb 2C4, 페르제타(등록상표), 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코의 진엔테크 인코포레이트) 또는 트라스투주맙 엠탄신(트라스투주맙-MCC-DM1, T-DM1, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 카드실라(등록상표))을 포함한다. 일부 양태에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신이다. 일부 양태에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신이다. 일부 양태에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및 트라스투주맙 엠탄신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신의 조합을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 양태에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합을 포함하거나 이로 이루어진다. 보다 특히, 상기 제제는 트라스투주맙이다.
트라스투주맙은 HER-2의 세포외 도메인에 셀-기반 분석에서 높은 친화도(Kd = 5 nM)로 선택적 결합하는 쥐 항-HER-2 항체(4D5)의 인간화된 버전인 재조합 DNA-유래의 IgG1 카파 단클론 항체이다. 트라스투주맙은 쥐 4D5 항체(ATCC CRL 10463, 1990년 5월 24일에 부다페스트 조약하에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(미국 20852 메릴랜드주 락빌 12301 파크론 드라이브)에 의해 기탁됨)의 항원 결합 잔기를 갖거나 이로부터 유래된 항체이다. 예시적인 인간화된 4D5 항체는 US 5,821,337에서와 같이 huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8(헤르셉틴(등록상표))을 포함한다.
페르투주맙은 인간 IgG1(K) 프레임워크를 기반으로 하는 재조합 인간화된 단클론 항체이다(예컨대 US 7,560,111 참고). 페르투주맙은 경쇄(12개 아미노산 차이) 및 중쇄(30개 아미노산 차이)의 에피토프 결합 영역에서 트라스투주맙과 상이하다. 이러한 차이에 기인하여, 인간 표피 세포에서 HER-2 수용체에 대한 페르투주맙의 결합은 페르투주맙이 HER 수용체 과의 다른 일원과 복합체를 형성함을 방지한다(문헌[Agus et al., Cancer Cell 2:127-137 (2002)]). 복합체 형성을 차단함으로써, 페르투주맙은 복합체(예컨대 EGF 및 헤레굴린)에 대한 리간드의 성장-자극 효과를 방지한다.
트라스투주맙 엠탄신은 트라스투주맙이 DM1의 메이탄시노이드 약물 부분에 링커 부분 MCC를 통해 연결된 항체-약물 접합체이다(US 5,208,020 및 US 6,441,163). 약물 대 항체 비 또는 약물 부하는 정수로 1 내지 약 8이다. 트라스투주맙-MCC-DMl은 다양하게 부하되고 부착된 항체-약물 접합체의 모든 혼합물을 포함하고, 여기서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8개의 약물 부분이 항체 트라스투주맙에 공유결합으로 부착된다(US 7,097,840, US 2005/0276812 및 US 2005/0166993). 평균 약물 부하는 약 3.5이다.
트라스투주맙, 페르투주맙 및 트라스투주맙 엠탄신은 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 일부 양태에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙 및 페르투주맙을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "HER-2 표적화 치료", "HER-2 표적화제" 및 "HER-2와 상화작용하는 제제"는 HER-2(ErbB2) 수용체 티로신 키나제를 표적화하는 제제를 지칭한다. 특히, 상기 용어는 HER-2에 특이적으로 결합하는 제제를 지칭한다. 상기 제제는 항체, 특히 단클론 항체일 수 있다. 일부 경우, 상기 제제는 예컨대 nM 또는 pM의 높은 친화도로 HER-2에 선택적으로 결합한다. 일부 경우, 상기 제제는 HER-2 수용체의 세포외 도메인에 결합한다. 제제는 HER-2 수용체 발현의 하향조절, HER-2 단백질을 과발현하는 인간 종양 세포의 증식의 억제, HER-2 단백질을 과발현하는 종양 세포에 대항하는 면역 채용 및 ADCC의 강화, 및/또는 혈관신생 인자의 하향조절을 야기할 수 있다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 글리코엔지니어링된 HER-2 항체, 예컨대 트라스젝스이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 이중특이성 HER-2 항체, 예컨대 헤르셉타르크이다. 용어 "항-HER-2 항체", "인간 HER-2에 결합하는 항체", "인간 HER-2에 특이적으로 결합하는 항체" 또는 "길항성 항-HER-2"는 인간 HER-2에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 상기 항체는 인간 HER-2 항원과 10 nM 미만, 5 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 0.5 nM 미만 또는 그 이하의 Kd 값의 결합 친화도로 결합할 수 있다. 결합 친화도는 표준 결합 분석, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 기법(비아코어(등록상표), 스웨덴의 GE-헬스케어 웁살라(GE-Healthcare Uppsala)).
본 발명에 사용하기 위한 항원 결합 분자의 제조
특정 양상에서, 조합하여 사용되는 치료제들은 다중특이성 항체, 예를 들어 이중특이성 항체를 포함한다. 다중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 단클론 항체이다. 특정 양상에서, 상기 결합 특이성은 상이한 항원들에 대한 것이다. 특정 양상에서, 상기 결합 특이성은 동일한 항원상의 상이한 에피토프에 대한 것이다. 이중특이성 항체를 전장 항체 또는 항체 단편으로부터 제조할 수 있다.
다중특이성 항체의 제조 기법은 비제한적으로 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현(문헌[Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))], WO 93/08829, 및 문헌[Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)]을 참조), 및 "놉 인투 홀" 공학(예를 들어 US 5,731,168를 참조)을 포함한다. 다중특이성 항체를 또한 항체 Fc-이종이량체 분자의 제조를 위한 공학 정전기 스티어링 효과(WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교-결합(예를 들어 US 4,676,980, 및 문헌[Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]을 참조); 이중특이성 항체를 생성시키기 위한 류신 지퍼의 사용(예를 들어 문헌[Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]을 참조); 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 "다이아바디" 기술의 사용(예를 들어 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]을 참조); 및 단쇄 Fv(sFv) 이량체의 사용(예를 들어 문헌[Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조); 및 예를 들어 문헌[Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 3중특이성 항체의 제조에 의해 제조할 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다(예를 들어 US　2006/0025576A1을 참조).
본원에서 항체 또는 단편은 또한 2개의 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 Fab" 또는 "DAF"를 포함한다(예를 들어 US 2008/0069820을 참조). "크로스맙(CrossMab)" 항체가 또한 본원에 포함된다(예를 들어 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO2009/080253, 또는 WO2009/080254를 참조).
이중특이성 항체 단편의 또다른 제조 기법은 "이중특이성 T 세포 관여자" 또는 BiTE(등록상표) 접근법이다(예를 들어 WO2004/106381, WO2005/061547, WO2007/042261, 및 WO2008/119567을 참조). 상기 접근법은 단일 폴리펩티드상에 배열된 2개의 항체 가변 도메인을 사용한다. 예를 들어 단일 폴리펩티드 쇄는 2개의 단쇄 Fv(scFv) 단편을 포함하며, 이들은 각각 2개의 도메인간의 분자내 회합을 허용하기에 충분한 길이의 폴리펩티드 링커에 의해 분리된 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 갖는다. 상기 단일의 폴리펩티드는 상기 2개의 scFv 단편 사이의 폴리펩티드 이격 서열을 추가로 포함한다. 각각의 scFv는 상이한 에피토프를 인식하며, 이들 에피토프는 상이한 세포 유형들에 특이적일 수 있고, 따라서 각각의 scFv가 그의 동족 에피토프와 맞물리는 경우 2개의 상이한 세포 유형의 세포는 가까워지거나 묶인다. 상기 접근법의 하나의 특정한 양태는 표적 세포, 예를 들어 암 또는 종양 세포에 의해 발현된 세포-표면 항원을 인식하는 또다른 scFv에 결합된 면역세포, 예를 들어 T 세포상의 CD3 폴리펩티드에 의해 발현된 세포-표면 항원을 인식하는 scFv를 포함한다.
상기 이중특이성 T 세포 관여자는 단일 폴리펩티드이므로 상기를 당해 분야에 공지된 임의의 원핵생물 또는 진핵생물 세포 발현 시스템, 예를 들어 CHO 세포주를 사용하여 발현시킬 수 있다. 그러나, 다른 다량체 종들(단량체의 목적하는 활성 이외의 생물 활성을 가질 수 있다)로부터 단량체 이중특이성 T 세포 관여자를 분리시키기 위해서 특별한 정제 기법(예를 들어 EP 1691833을 참조)이 필요할 수 있다. 하나의 예시적인 정제 설계에서, 분비된 폴리펩티드를 함유하는 용액에 먼저 금속 친화도 크로마토그래피를 가하고, 폴리펩티드를 이미다졸 농도의 구배로 용출시킨다. 상기 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제시키고, 폴리펩티드를 염화 나트륨 농도의 구배를 사용하여 용출시킨다. 최종적으로, 상기 용출물에 크기 배제 크로마토그래피를 가하여 다량체 종들로부터 단량체를 분리시킨다. 하나의 양상에서, 본 발명에 사용된 이중특이성 이중특이성 항체는 펩티드 링커에 의해 서로에 융합된 2개의 단쇄 FV 단편(scFv)을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄로 구성된다.
Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형
본 발명의 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 이루어진다. 예를 들어, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은 이량체이며, 그의 각각의 서브유닛은 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 서로 안정하게 회합할 수 있다.
상기 Fc 도메인은 표적 조직 중의 양호한 축적 및 유리한 조직-혈액 분배비에 기여하는 긴 혈청 반감기를 포함하여, 본 발명의 항원 결합 분자에 유리한 약동학적 성질을 부여한다. 그러나, 동시에 상기는 본 발명의 이중특이성 항체의, 바람직한 항원-함유 세포에 대해서보다는 Fc 수용체를 발현하는 세포에 대한 바람직하지 못한 표적화를 유도할 수 있다. 상응하게, 특정 양상에서, 본 발명의 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 고유의 IgG Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대해 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 하나의 양상에서, 상기 Fc는 실질적으로 Fc 수용체에 결합하지 않고/않거나 효과기 기능을 유도하지 않는다. 특정 양상에서 상기 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 하나의 양상에서, 상기 Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 특정 양상에서, 상기 Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 하나의 양상에서, 상기 Fc 도메인은 효과기 기능을 유도하지 않는다. 상기 감소된 효과기 기능은 비제한적으로 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 감소된 보체 의존적인 세포독성(CDC), 감소된 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC), 감소된 항체-의존적인 세포 식작용(ADCP), 감소된 사이토카인 분비, 항원-제공 세포에 의한 감소된 면역 복합체-매개된 항원 흡수, NK 세포에 대한 감소된 결합, 대식세포에 대한 감소된 결합, 단핵세포에 대한 감소된 결합, 다형핵세포에 대한 감소된 결합, 감소된 직접적인 신호전달 유도 세포사멸, 감소된 수지상세포 성숙화, 또는 감소된 T 세포 프라이밍.
특정 양상에서, 하나 이상의 아미노산 변형을 본 발명에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입시켜 Fc 영역 변체를 생성시킬 수 있다. 상기 Fc 영역 변체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 양상에서, 본 발명은 항체를 제공하고, 여기서 상기 Fc 도메인은 Fc 수용체, 특히 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명의 항체의 Fc 도메인은 Fc 수용체에의 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 상기 Fc 도메인의 2개의 각각의 서브유닛 중에 존재한다. 특히, 상기 Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329(EU 넘버링)의 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 특히, 상기 Fc 도메인은 IgG 중쇄의 234 및 235(EU 넘버링) 및/또는 329(EU 넘버링)번 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특히, IgG 중쇄에 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA", EU 넘버링)를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 항체를 제공한다. 상기 아미노산 치환 L234A 및 L235A는 소위 LALA 돌연변이를 지칭한다. 상기 아미노산 치환의 "P329G LALA" 조합은 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합을 완전히 없애며 이는 국제 특허 출원 공개 WO 2012/130831 A1에 기재되어 있고, 상기 공보는 또한 상기와 같은 돌연변이 Fc 도메인의 제조 방법 및 Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능과 같은 그의 성질을 측정하는 방법을 기재한다.
감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 갖는 Fc 도메인은 또한 Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(US 6,737,056). 상기와 같은 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체(알라닌으로의 잔기 265 및 297의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함(US 7,332,581))를 포함한다.
또다른 양상에서, 상기 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. IgG4 항체는 IgG1 항체와 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 보다 구체적인 양상에서, 상기 Fc 도메인은 S228 위치에 아미노산 치환(카밧 넘버링), 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 구체적인 양상에서, 상기 Fc 도메인은 아미노산 치환 L235E 및 S228P 및 P329G(EU 넘버링)를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 상기와 같은 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 그의 Fcγ 수용체 결합 성질이 또한 WO 2012/130831에 기재되어 있다.
돌연변이 Fc 도메인을 당해 분야에 주지된 유전학적 또는 화학적 방법을 사용하여 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조할 수 있다. 유전학적 방법은 암호화 DNA 서열의 부위-특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화를 예를 들어 서열분석에 의해 확인할 수 있다.
Fc 수용체에의 결합을 예를 들어 ELISA에 의해서 또는 비아코어 장비(GE 헬스케어(GE Healthcare))와 같은 표준 장비를 사용하는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해서 쉽게 측정할 수 있으며 Fc 수용체 자체를 재조합 발현에 의해 수득할 수 있다. 한편으로, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인 또는 Fc 도메인을 포함하는 세포 활성화 항체의 결합 친화도를 특정한 Fc 수용체, 예를 들어 인간 NK 세포 발현 FcγIIIa 수용체를 발현하는 것으로 공지된 세포주를 사용하여 평가할 수 있다.
Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 항체의 효과기 기능을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석은 본원에 기재되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 다른 예들은 US 5,500,362; 문헌[Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)] 및 문헌[Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)]; US 5,821,337; 문헌[Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)]에 기재되어 있다. 한편으로, 비-방사성 분석 방법이 사용될 수 있다(예를 들어 유식 세포측정을 위한 ACTI(상표) 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.) 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 참조). 상기와 같은 분석에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 관심 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들어 문헌[Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
일부 양상에서, 보체 성분, 구체적으로 C1q에의 상기 Fc 도메인의 결합이 감소된다. 따라서, 상기 Fc 도메인이 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된 일부 양태에서, 상기 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC를 포함한다. C1q 결합 분석을 수행하여 본 발명의 항체가 C1q에 결합할 수 있는지, 따라서 CDC 활성을 갖는지의 여부를 측정할 수 있다(예를 들어 WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조). 보체 활성화를 평가하기 위해서, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들어 문헌[Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996)]; 문헌[Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003)]; 및 문헌[Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)]을 참조).
이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 변형
본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 하나 또는 다른 하나에 융합된 상이한 항원-결합 부위를 포함하며, 따라서, 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 2개의 동일하지 않은 폴리펩티드 쇄 중에 포함될 수 있다. 이들 폴리펩티드의 재조합 공-발현 및 후속 이량체화는 상기 두 폴리펩티드의 다수의 가능한 조합을 도출한다. 따라서, 재조합체 생성에서 본 발명의 이중특이성 항체의 수율 및 순도를 개선시키기 위해서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인에 목적하는 폴리펩티드의 결합을 촉진하는 변형을 도입시키는 것이 유리할 것이다.
상응하게, 특정 양상에서 본 발명은 (a) 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원결합 도메인, (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드(여기서 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 상기 4-1BBL의 단지 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함을 특징으로 함), 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인(여기서 상기 Fc 도메인은 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형을 포함함)을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자에 관한 것이다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개 서브유닛간의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인 중에 있다. 따라서, 하나의 양상에서 상기 변형은 상기 Fc 도메인의 CH3 도메인 중에 있다.
특정 양상에서 상기 변형은 소위 "놉 인투 홀" 변형으로, 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 하나에 "놉" 변형 및 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 다른 하나에 "홀" 변형을 포함한다. 따라서, 본 발명은 (a) 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드(여기서 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 상기 4-1BBL의 단지 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함을 특징으로 함), 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인(여기서 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛은 상기 놉 인투 홀 방법에 따른 놉을 포함하고 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 홀을 포함함)을 포함하는 항원 결합 분자에 관한 것이다. 특정 양상에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 S354C 및 T366W(EU 넘버링)를 포함하고 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C, T366S 및 Y407V(카밧 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다.
상기 놉 인투 홀 기술은 예를 들어 US 5,731,168; US 7,695,936; 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 문헌[Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 돌기가 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해하도록 공동내에 위치할 수 있게 상기 돌기("놉")를 제1 폴리펩티드의 접촉면에 도입시키고 상응하는 공동("홀")을 제2 폴리펩티드의 접촉면에 도입시킴을 수반한다. 돌기는 상기 제1 폴리펩티드의 접촉면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들어 타이로신 또는 트립토판)로 교체시킴으로써 구성된다. 상기 돌기와 동일하거나 유사한 크기의 보상 공동이, 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것(예를 들어 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체시킴으로써 상기 제2 폴리펩티드의 접촉면에 생성된다.
상응하게, 하나의 양상에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기를 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체시키고, 이에 의해 제2 서브유닛의 CH3 도메인내의 공동에 위치할 수 있는 제1 서브유닛의 CH3 도메인내에 돌기를 생성시키고, 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기를 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체시키고, 이에 의해 제1 서브유닛의 CH3 도메인내의 돌기가 위치할 수 있는 제2 서브유닛의 CH3 도메인내에 공동을 생성시킨다. 상기 돌기 및 공동을, 예를 들어 부위-특이적 돌연변이유발에 의해서, 또는 펩티드 합성에 의해서 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 변경시킴으로써 생성시킬 수 있다. 특정 양상에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 366번 위치의 트레오닌 잔기를 트립토판 잔기로 교체시키고(T366W), 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 407번 위치의 타이로신 잔기를 발린 잔기로 교체시킨다(Y407V). 하나의 양상에서, 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛에서, 추가로 366번 위치의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로 교체시키고(T366S) 368번 위치의 류신 잔기를 알라닌 잔기로 교체시킨다(L368A).
더욱 추가 양상에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛에서 추가로 354번 위치의 세린 잔기를 시스테인 잔기로 교체시키고(S354C), 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 추가로 349번 위치의 타이로신 잔기를 시스테인 잔기로 교체시킨다(Y349C). 이들 두 시스테인 잔기의 도입은 상기 Fc 도메인의 2개 서브유닛간에 다이설파이드 가교를 형성시키며, 이는 상기 이량체를 추가로 안정화시킨다(문헌[Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15]). 특정 양상에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 S354C 및 T366S(EU 넘버링)를 포함하고 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C, T366S 및 Y407V(카밧 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다.
또다른 양상에서, 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형은 예를 들어 PCT 공개 WO 2009/089004에 기재된 정전기적 조타 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 상기 방법은 상기 2개의 Fc 도메인 서브유닛의 접촉면에서, 하나 이상의 아미노산 잔기를 동종이량체 형성은 정전기적으로 불리하게 되지만 이종이량체화는 정전기적으로 유리하게 되도록 하전된 아미노산 잔기에 의해 교체시킴을 수반한다.
본원에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체의 중쇄의 C-말단은 아미노산 잔기 PGK로 종결되는 완전한 C-말단일 수 있다. 상기 중쇄의 C-말단은 상기 C 말단 아미노산 잔기 중 하나 또는 2개가 제거된 단축된 C-말단일 수 있다. 하나의 바람직한 양상에서, 상기 중쇄의 C-말단은 PG로 종결되는 단축된 C-말단이다. 본원에 보고된 바와 같은 모든 양상 중 하나의 양상에서, 본원에 명시된 바와 같은 C-말단 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 이중특이성 항체는 C-말단 글리신-리신 다이펩티드(G446 및 K447, 카밧 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 본원에 보고된 바와 같은 모든 양상 중 하나의 양태에서, 본원에 명시된 바와 같은 C-말단 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 이중특이성 항체는 C-말단 글리신 잔기(G446, 카밧 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다.
Fab 도메인의 변형
하나의 양상에서, 본 발명은 (a) 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 Fab 단편, (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드(여기서 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 상기 4-1BBL의 단지 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함을 특징으로 함), 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인(여기서 상기 Fab 단편들 중 하나에서 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 교환된다)을 포함하는 4-1BBL-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다. 상기 이중특이성 항체는 크로스맙 기술에 따라 제조된다.
하나의 결합 가지에 도메인 교체/교환을 갖는 다중특이성 항체(CrossMabVH-VL 또는 CrossMabCH-CL)가 WO2009/080252 및 문헌[Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191]에 상세히 기재되어 있다. 상기는 제1 항원에 대한 경쇄와 제2 항원에 대한 틀린 중쇄와의 오합치에 의해 야기되는 부산물을 명백히 감소시킨다(상기와 같은 도메인 교환이 없는 접근법에 비해).
하나의 양상에서, 본 발명은 (a) 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 제1 Fab 단편, (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드(여기서 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 상기 4-1BBL의 단지 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하며, 이들은 각각 CH1 또는 CL 도메인에 결합됨을 특징으로 함), 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인(여기서 상기 4-1BBL에 인접한 불변 도메인 CL 및 CH1은, 상기 CH1 도메인이 상기 경쇄의 부분이고 상기 CL 도메인이 상기 중쇄의 부분이도록 서로에 의해 교체된다)을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자에 관한 것이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 4-1BB 및 Fc 도메인에 특이적으로 결합가능한 2개의 Fab 단편을 포함하는 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄, 및 (b) 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 2개의 추가적인 Fab 단편(여기서 상기 추가적인 Fab 단편은 각각 (a)의 중쇄의 C-말단에 펩티드 링커를 통해 서로 연결된다)을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자에 관한 것이다. 특정 양상에서, 상기 추가적인 Fab 단편은 가변 도메인 VL 및 VH가, 상기 VH 도메인이 상기 경쇄의 부분이고 상기 VL 도메인이 상기 중쇄의 부분이도록 서로에 의해 교체되는 Fab 단편이다.
또다른 양상에서, 정확한 짝짓기를 추가로 개선시키기 위해서, (a) 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 제1 Fab 단편, (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드(여기서 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 상기 4-1BBL의 단지 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하며, 이들은 각각 CH1 또는 CL 도메인에 결합됨을 특징으로 함), 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자는 상이한 하전된 아미노산 치환을 함유할 수 있다(소위 "하전된 잔기"). 이러한 변형을 교차된 또는 교차되지 않은 CH1 및 CL 도메인에 도입시킨다. 특정 양상에서, 본 발명은 이중특이성 항원 결합 분자에 관한 것이고, 여기서 CL 도메인 중 하나에서 123번 위치(EU 넘버링)의 아미노산은 아르기닌(R)에 의해 교체되었고 124번 위치(EU 넘버링)의 아미노산은 리신(K)으로 치환되었고, 여기서 CH1 도메인 중 하나에서 147번 위치(EU 넘버링) 및 213번 위치(EU 넘버링)의 아미노산들은 글루탐산(E)에 의해 치환되었다.
보다 특히, 본 발명은 Fab를 포함하는 이중특이성 결합 분자에 관한 것이고, 여기서 4-1BBL에 인접한 CL 도메인에서 123번 위치(EU 넘버링)의 아미노산이 아르기닌(R)에 의해 교체되었고 124번 위치(EU 넘버링)의 아미노산이 리신(K)으로 치환되었고, 여기서 상기 4-1BBL에 인접한 CH1 도메인에서 147번 위치(EU 넘버링) 및 213번 위치(EU 넘버링)의 아미노산들이 글루탐산(E)에 의해 치환된 것이다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다.
본 발명의 항체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 전체 항원 결합 분자를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 또는 공-발현되는 다수의(예를 들어 2개 이상의) 폴리뉴클레오티드로서 발현시킬 수 있다. 공-발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드들은 예를 들어 다이설파이드 결합 또는 다른 수단을 통해 회합하여 기능성 항원 결합 분자를 형성시킬 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린의 경쇄 부분은 상기 면역글로불린의 중쇄 부분으로부터 별도의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 공-발현시, 상기 중쇄 폴리펩티드는 상기 경쇄 폴리펩티드와 회합하여 면역글로불린을 형성할 것이다.
일부 양상에서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 본 발명에 따른 전체 항체를 암호화한다. 다른 양태에서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 본 발명에 따른 항체에 포함된 폴리펩티드를 암호화한다.
특정 양태에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA, 예를 들어 메신저 RNA(mRNA)의 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본 발명에 사용되는 바와 같은 이중특이성 항체를 예를 들어 고상 펩티드 합성(예를 들어 메리필드(Merrifield) 고상 합성) 또는 재조합 생성에 의해 수득할 수 있다. 제조합체 생성을 위해서 예를 들어 상술한 바와 같은 항체 또는 그의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 단리하고 숙주 세포에서 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터내에 삽입한다. 상기와 같은 폴리뉴클레오티드는 통상적인 과정을 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다. 본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터를 제공한다. 당업자들에게 주지된 방법을 사용하여 적합한 전사/번역 조절 신호와 함께 상기 항체(단편)의 암호화 서열을 함유하는 발현 벡터를 구성할 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 예를 들어 문헌[Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)]; 및 문헌[Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]에 기재된 기법들을 참조한다. 상기 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 부분이거나 또는 핵산 단편일 수 있다. 상기 발현 벡터는 발현 카세트를 포함하며, 상기 카세트 내로 상기 항체 또는 그의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(즉 암호화 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 함께 작동가능하게 회합되어 클로닝된다. 본원에 사용되는 바와 같이, "암호화 영역"은 아미노산으로 번역된 코돈들로 이루어지는 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않지만, (존재하는 경우) 암호화 영역의 부분인 것으로 간주될 수 있고, 임의의 인접 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론, 5' 및 3' 번역되지 않은 영역 등은 암호화 영역의 부분이 아니다. 2개 이상의 암호화 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 구축물 중에, 예를 들어 단일 벡터상에, 또는 별도의 폴리뉴클레오티드 구축물 중에, 예를 들어 별도의(상이한) 벡터상에 존재할 수 있다. 더욱 또한, 임의의 벡터는 단일 암호화 영역을 함유하거나 또는 2개 이상의 암호화 영역을 포함할 수 있다, 예를 들어 본 발명의 벡터는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화할 수 있으며, 이들은 단백질 분해 절단을 통해 최종 단백질로 번역-후 또는 번역과 함께 분리된다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산은 본 발명의 항체 또는 그의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 변체 또는 유도체에 융합되거나 또는 융합되지 않은 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은 비제한적으로 전문화된 요소 또는 동기, 예를 들어 분비신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함한다. 작동성 회합은 유전자 산물의 암호화 영역, 예를 들어 폴리펩티드가, 상기 유전자 산물의 발현을 조절 서열(들)의 영향 또는 통제하에 두는 방식으로 하나 이상의 조절 서열들과 회합하는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예를 들어 폴리펩티드 암호화 영역 및 상기와 회합된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 목적하는 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 전사를 생성시키고 상기 두 DNA 단편간의 결합의 성질이 상기 유전자 산물의 발현을 지시하는 상기 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 또는 상기 DNA 주형이 전사되는 능력을 방해하지 않는 경우 "작동적으로 회합된다". 따라서, 프로모터 영역은 상기 프로모터가 상기 핵산의 전사를 실행할 수 있는 경우 폴리펩티드를 암호화하는 핵산과 작동적으로 회합될 것이다. 상기 프로모터는 오직 예정된 세포에서만 상기 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포-특이성 프로모터일 수 있다. 프로모터 외에, 다른 전사 조절 요소들, 예를 들어 인헨서, 오퍼레이터, 리프레서, 및 전사 종결 신호가 상기 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 회합되어 세포-특이성 전사를 지시할 수 있다.
적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역들을 본원에 개시한다. 다양한 전사 조절 영역들이 당업자들에게 공지되어 있다. 여기에는 비제한적으로 척추동물 세포에서 기능하는 전사 조절 영역, 예를 들어 비제한적으로 거대세포바이러스로부터의 프로모터 및 인헨서 분절(예를 들어 인트론-A와 함께, 전초기 프로모터), 유인원 바이러스 40(예를 들어 초기 프로모터), 및 레트로바이러스(예를 들어 라우스 육종 바이러스)를 포함한다. 다른 전사 조절 영역은 척추동물 유전자로부터 유래된 것들, 예를 들어 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 a-글로빈뿐만 아니라 진핵생물 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열들을 포함한다. 추가의 적합한 전사 조절 영역은 조직-특이성 프로모터 및 인헨서뿐만 아니라 유도성 프로모터(예를 들어 프로모터 유도성 테트라사이클린)를 포함한다. 유사하게, 다양한 번역 조절 요소들이 당업자들에게 공지되어 있다. 여기에는 비제한적으로 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소들(특히 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES, 또한 CITE 서열로서 지칭됨)이 있다. 상기 발현 카세트는 또한 다른 특징들, 예를 들어 복제 기원, 및/또는 염색체 통합 요소, 예를 들어 레트로바이러스 긴 말단 반복부(LTR), 또는 아데노-회합된 바이러스(AAV) 반전 말단 반복부(ITR)를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 암호화 영역을 분비 또는 신호 펩티드(본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 분비를 지시함)를 암호화하는 추가적인 암호화 영역과 회합시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 또는 그의 폴리펩티드 단편의 분비를 원하는 경우, 신호 서열을 암호화하는 DNA를 상기 핵산 본 발명의 항체 또는 그의 폴리펩티드 단편의 상류에 둘 수 있다. 상기 신호 가설에 따라, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은, 일단 거친 소포체를 가로질러 성장하는 단백질 쇄의 수출이 개시되면, 성숙한 단백질로부터 절단된 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당업자들은 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드가 일반적으로 상기 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드(상기는 번역된 폴리펩티드로부터 절단되어 상기 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙한" 형태를 생성시킨다)를 가짐을 안다. 특정 양태에서, 고유의 신호 펩티드, 예를 들어 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 상기와 작동적으로 회합된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 유지하는 상기 서열의 기능성 유도체가 사용된다. 한편으로, 이종 포유동물 신호 펩티드, 또는 그의 기능성 유도체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 야생형 리더 서열을 인간 조직 플라스미노겐 활성제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환시킬 수 있다.
나중의 정제를 촉진하거나(예를 들어 히스티딘 태그) 또는 융합 단백질의 표지화를 지원하는데 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열을 암호화하는 DNA를, 본 발명의 항체 또는 그의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 내에 또는 상기의 단부에 포함시킬 수 있다.
본 발명의 추가 양상에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 특정 양태에서 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 각각 폴리뉴클레오티드 및 벡터와 관련하여 본원에 기재된 특징들 중 어느 하나를 단독으로 또는 함께 통합할 수 있다. 하나의 양상에서, 숙주 세포는 본 발명의 항체(의 부분)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들어 상기 벡터로 형질전환되거나 형질감염되었다). 본원에 사용되는 바와 같이, "숙주 세포"란 용어는 본 발명의 융합 단백질 또는 그의 단편을 생성시키도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포계를 지칭한다. 항원 결합 분자를 복제하고 그의 발현을 지지하기에 적합한 숙주 세포는 당해 분야에 주지되어 있다. 상기와 같은 세포를 특정한 발현 벡터로 적합하게 형질감염시키거나 형질도입시킬 수 있으며 다량의 벡터 함유 세포를 대규모 발효기의 시딩을 위해 증식시켜 임상용으로 충분한 양의 항원 결합 분자를 수득할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 미생물, 예를 들어 에스케리키아 콜라이, 또는 다양한 진핵생물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등을 포함한다. 예를 들어 폴리펩티드를, 특히 글리코실화가 필요하지 않은 경우, 세균 중에 생성시킬 수 있다. 발현 후에, 상기 폴리펩티드를 용액 분획 중 세균 세포 페이스트로부터 단리하고 추가로 정제할 수 있다. 원핵생물 외에, 진핵 미생물, 예를 들어 섬유상 진균 또는 효모, 예를 들어 글리코실화 경로가 "인간화되어" 부분적인 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드를 생산하는 진균 및 효모 균주가 폴리펩티드-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)], 및 문헌[Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)]을 참조한다.
(글리코실화된) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포이다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되었다. 식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 US 5,959,177, US　6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 및 US　6,417,429(유전자삽입 식물에서 항체를 생성시키기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES: 상표명) 기술을 개시함)를 참조한다. 척추동물 세포를 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 현탁액에서 증식시키기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통; 인간 배아 신장 계통(예를 들어 문헌[Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)]에 기재된 293 또는 293T 세포), 아기 햄스터 신장세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예를 들어 문헌[Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)]에 기재된 TM4 세포), 원숭이 신장세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장세포(VERO-76), 인간 경부암종 세포(HELA), 개 신장세포(MDCK), 버팔로 래트 간세포(BRL 3A), 인간 폐세포(W138), 인간 간세포(Hep G2), 마우스 유방 종양세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들어 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)]에 기재된), MRC 5 세포, 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예를 들어 dhfr- CHO 세포(문헌[Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)]); 및 골수종 세포주, 예를 들어 YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0를 포함한다. 단백질 생산에 적합한 몇몇 포유동물 숙주 세포주의 리뷰를 위해서, 예를 들어 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어 단지 몇 개를 언급하자면, 포유동물 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포뿐만 아니라, 유전자삽입 동물, 유전자삽입 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직내에 포함된 세포들을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 숙주 세포는 진핵생물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배신장(HEK) 세포 또는 림프양 세포(예를 들어 Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 이들 시스템에서 외래 유전자를 발현시키는 표준 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포를, 상기 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄를 모두 갖는 면역글로불린이도록 상기 면역글로불린 쇄의 다른 하나를 또한 발현하도록 조작할 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명의 항체 또는 그의 폴리펩티드 단편의 생성 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은 본 발명의 항체 또는 그의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를, 본 발명의 항체 또는 그의 폴리펩티드 단편의 발현에 적합한 조건하에서 본원에 제공된 바와 같이 배양하고, 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 본 발명의 항체 또는 그의 폴리펩티드 단편을 회수함을 포함한다.
특정 양태에서, 상기 항원 결합 분자의 부분을 형성하는 표적 세포 항원(예를 들어 Fab 단편)에 특이적으로 결합가능한 부분은 적어도 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 가변 영역을 포함한다. 가변 영역은 천연 또는 비천연 항체 및 그의 단편의 부분을 형성하고 상기로부터 유래될 수 있다. 다클론 항체 및 단클론 항체의 생성 방법은 당해 분야에 주지되어 있다(예를 들어 문헌[Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]을 참조). 비천연 항체를 고상 펩티드 합성을 사용하여 구성하거나, 재조합적으로 생성시키거나(예를 들어 US 4,186,567에 기재된 바와 같이), 또는 예를 들어 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합적 라이브러리를 선별함으로써 수득할 수 있다(예를 들어 US 5,969,108(McCafferty)를 참조).
면역글로불린의 임의의 동물 종을 본 발명에 사용할 수 있다. 본 발명에 유용한 비제한적인 면역글로불린은 쥐, 영장류, 또는 인간 기원일 수 있다. 상기 융합 단백질이 인간용인 경우, 면역글로불린의 키메라 형태를 사용할 수 있으고, 여기서 상기 면역글로불린의 불변 영역은 인간으로부터이다. 상기 면역글로불린의 인간화된 형태 또는 완전한 인간 형태를 또한 당해 분야에 주지된 방법에 따라 제조할 수 있다(예를 들어 US 5,565,332(Winter)를 참조). 인간화를 다양한 방법들, 예를 들어 비제한적으로 (a) 비-인간(예를 들어 공여 항체) CDR을 중요한 프레임워크 잔기(예를 들어 양호한 항원 결합 친화도 또는 항체 기능의 유지에 중요한 것들)의 유지와 함께 또는 상기 유지 없이 인간(예를 들어 수용 항체) 프레임워크 및 불변 영역상에 접목시키거나, (b) 오직 비-인간 특이성-결정 영역(SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 중요한 잔기)만을 인간 프레임워크 및 불변 영역상에 접목시키거나, 또는 (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만, 상기를 표면 잔기의 교체에 의해 인간-유사 섹션으로 "은폐"시킴으로써 성취할 수 있다. 인간화된 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌[Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)]에 리뷰되어 있으며, 예를 들어 문헌[Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988)]; 문헌[Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)]; US 5,821,337, US 7,527,791, US 6,982,321 및 US 7,087,409; 문헌[Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986)]; 문헌[Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)]; 문헌[Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988)]; 문헌[Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)]; 문헌[Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994)]; 문헌[Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005)](SDR (a-CDR) 접목을 기재함); 문헌[Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991)]("재표면화"를 기재함); 문헌[Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005)]("FR 셔플링"을 기재함); 및 문헌[Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005)] 및 문헌[Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000)](FR 셔플링에의 "안내된 선택" 접근을 기재함)에 추가로 기재된다. 본 발명에 따른 특정한 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 인간 항체 및 인간 가변 영역을 당해 분야에 공지된 다양한 기법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 인간 항체는 문헌[Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001)] 및 문헌[Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)]에 일반적으로 기재되어 있다. 인간 가변 영역은 하이브리도마 방법(예를 들어 문헌[Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]을 참조)에 의해 제조된 인간 단클론 항체의 부분을 형성하고 상기로부터 유래될 수 있다. 인간 항체 및 인간 가변 영역을 또한, 항원 공격에 반응하여 완전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 완전한 항체를 생산하도록 변형시킨 유전자삽입 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조할 수 있다(예를 들어 문헌[Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)]을 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역을 또한, 인간 유래된 파지 디스플레이 라이브러리들 중에서 선택된 Fv 클론 가변 영역 서열을 단리함으로써 생성시킬 수 있다(예를 들어 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]; 및 문헌[McCafferty et al., Nature 348, 552-554]; 문헌[Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)]을 참조). 파지는 전형적으로 단쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 내보인다.
특정 양상에서, 상기 항체를 예를 들어 PCT 공개 WO 2012/020006(친화도 성숙화에 관한 실시예를 참조) 또는 US 2004/0132066에 개시된 방법들에 따라 증대된 결합 친화도를 갖도록 조작한다. 특정한 항원 결정인자에 결합하는 본 발명의 항원 결합 분자의 능력을 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA) 또는 당업자에게 친숙한 다른 기법들, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 기법(문헌[Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)]), 및 전통적인 결합 분석(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)]을 통해 측정할 수 있다. 경쟁 분석을 사용하여 특정한 항원에 대한 결합에 대해서 참조 항체와 경쟁하는 항원 결합 분자를 식별할 수 있다. 특정 양태에서, 상기와 같은 경쟁 항원 결합 분자는 상기 참조 항원 결합 분자에 의해 결합된 동일한 에피토프(예를 들어 선형 또는 입체형태 에피토프)에 결합한다. 항원 결합 분자가 결합하는 에피토프의 맵핑에 대한 상세한 예시적인 방법들이 문헌[Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다. 예시적인 경쟁 분석에서, 고정화된 항원을 상기 항원에 결합하는 제1 표지된 항원 결합 분자 및 상기 항원에 대한 결합에 대해서 상기 제1 항원 결합 분자와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험하려는 제2의 표지되지 않은 항원 결합 분자를 포함하는 용액 중에서 배양한다. 상기 제2 항원 결합 분자는 하이브리도마 상등액 중에 존재할 수 있다. 대조용으로서, 고정화된 항원을, 상기 제1 표지된 항원 결합 분자를 포함하지만 상기 제2의 표지되지 않은 항원 결합 분자는 포함하지 않는 용액 중에서 배양한다. 상기 항원에 대한 상기 제1 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 배양 후에, 과잉의 결합되지 않은 항체를 제거하고, 고정화된 항원과 회합된 표지의 양을 측정한다. 상기 고정화된 항원과 회합된 표지의 양이 상기 대조용 샘플에 비해 상기 시험 샘플 중에서 실질적으로 감소된 경우, 이는 상기 제2 항원 결합 분자가 상기 항원에의 결합에 대해서 상기 제1 항원 결합 분자와 경쟁함을 가리킨다. 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
본원에 기재된 바와 같이 제조된 본 발명의 항체를 당해 분야에 공지된 기법, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 젤 전기영동, 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제할 수 있다. 특정 단백질의 정제에 사용되는 실제 조건은 부분적으로, 순 전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자에 의존할 것이며, 이는 당업자들에게 자명할 것이다. 친화도 크로마토그래피 정제를 위해서 상기 항원 결합 분자가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원을 사용할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 융합 단백질의 친화도 크로마토그래피 정제를 위해서, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 기질을 사용할 수 있다. 연속적인 단백질 A 또는 G 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 필수적으로 실시예에 기재된 바와 같이 항원 결합 분자를 단리할 수 있다. 상기 항원 결합 분자 또는 그의 단편의 순도를 젤 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함한 임의의 다양한 주지된 분석 방법들에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 상기 실시예들에 기재된 바와 같이 발현된 4-1BBL-함유 항원 결합 분자는 환원 및 비-환원 SDS-PAGE에 의해 입증된 바와 같이 온전하며 적합하게 조립된 것으로 나타났다.
분석
본원에 제공된 항원 결합 분자를 당해 분야에 공지된 다양한 분석에 의해 그의 물리/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인하거나, 선별하거나 특성규명할 수 있다.
1. 친화도 분석
상응하는 수용체에 대한 본원에 제공된 이중특이성 항원 결합 분자의 친화도을 실시예에 제시된 방법들에 따라서 표준 장비, 예를 들어 비아코어 장비(GE 헬스케어), 및 재조합 발현에 의해 수득될 수 있는 바와 같은 수용체 또는 표적 단백질을 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정할 수 있다. 상기 표적 세포 항원에 대한 이중특이성 항원 결합 분자의 친화도를 또한 표준 장비, 예를 들어 비아코어 장비(GE 헬스케어), 및 재조합 발현에 의해 수득될 수 있는 바와 같은 수용체 또는 표적 단백질을 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정할 수 있다. 상기 FAP-4-1BBL 항원 결합 분자의 경우 상기 방법은 국제 특허 출원 공개 WO 2016/075278 A1에 보다 상세히 기재되었다. 하나의 양상에 따라, KD를 25℃에서 비아코어(등록상표) T100 기계(GE 헬스케어)를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정한다.
2. 결합 분석 및 다른 분석
하나의 양상에서, 본원에 보고된 바와 같은 FAP-4-1BBL 항원 결합 분자를 국제 특허 출원 WO 2016/075278 A1에 보다 상세히 기재된 바와 같이 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다.
3. 활성 분석
하나의 양상에서, FAP-4-1BBL 항원 결합 분자의 생물학적 활성을 확인하기 위한 분석을 제공한다.
특정 양태에서, 인간 면역 효과기 세포에 의한 생체외 동반-배양 분석에서, 본원에 보고된 바와 같은 항체를 상기와 같은 생물학적 활성에 대해 시험한다.
약학 조성물, 제형 및 투여 경로
추가 양상에서, 본 발명은 예를 들어 하기의 치료 방법들 중 어느 하나에 사용하기 위한 본원에 제시된 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화 치료 또는 제제를 포함하는 약학 조성물을 제시한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 HER-2 항체, 이중특이성 HER-2 항체 및/또는 HER-2 항체-약물 접합체를 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신을 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및 트라스투주맙 엠탄신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신의 조합을 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및 마르게툭시맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HER-2 항체를 포함한다. 하나의 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙 또는 페르투주맙이다. 보다 특히, HER-2 표적화제는 트라스투주맙이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 글리코엔지니어링된 HER-2 항체, 예컨대 트라스젝스이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 이중특이성 HER-2 항체, 예컨대 헤르셉타르크이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 HER-2 항체 약물 접합체, 특히 트라스투주맙 엠탄신(아도-트라스투주맙 엠탄신)이다.
일부 양상에서, 약학 조성물은 본원에 제시된 4-1BB 작용제 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 다른 양태에서, 약학 조성물은 본원에 제시된 4-1BB 작용제 및 하나 이상의 추가 치료제, 예컨대 하기 기재된 것을 포함한다. 일부 양태에서, HER-2 표적화제 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물이 제시된다.
본 발명의 약학 조성물은 치료 효과량의, 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 보조제 또는 희석제 중에 용해되거나 분산된 본원에 기재된 하나 이상의 항체 또는 제제를 포함한다. "약학적으로 또는 약물학적으로 허용되는"이란 어구는 사용되는 투여 용량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성인, 즉 적합한 대로 동물, 예를 들어 인간에게 투여시 불리하거나, 알러지성이거나 또는 다른 부적합한 반응을 생성시키지 않는 분자 존재 및 조성물을 지칭한다. 하나 이상의 항체 및 임의로 추가적인 활성 성분을 함유하는 약학 조성물의 제제는 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990]에 예시된 바와 같이, 본 명세에 비추어 당업자들에게 공지될 것이다. 특히, 상기 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용되는 부형제"는 당업자에게 공지된 바와 같은 모든 용매, 완충제, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 산화방지제, 보존제(예를 들어 항균제, 항진균제), 등장성제, 염, 안정화제 및 이들의 조합을 포함한다.
비경구 조성물은 주사에 의해, 예를 들어 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내 근육내, 경막내 또는 복강내 주사에 의해 투여하기 위해 설계된 것들을 포함한다. 주사용으로, 본 발명의 항원 결합 분자를 수용액 중에, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충제, 예를 들어 행크 용액, 링거액, 또는 생리식염수 완충제 중에서 제형화할 수 있다. 상기 용액은 제형화제, 예를 들어 현탁, 안정화 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 한편으로, 상기 융합 단백질은 사용전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 발열성 물질 제거수로 조성되는 분말 형태 중에 존재할 수 있다. 멸균 주사액은 본 발명의 융합 단백질을 필요에 따라, 하기에 열거되는 다양한 다른 성분들과 함께 적합한 용매 중에 필요한 양으로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및/또는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 중에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사액, 현탁액 또는 유화액의 제조에 사용하기 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 앞서 멸균-여과된 액체 매질로부터 활성 성분 + 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 제공하는 진공-건조 또는 동결-건조이다. 상기 액체 매질을 필요한 경우 적합하게 완충시켜야 하며 상기 액체 희석제를 주사전에 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성으로 만들어야 한다. 상기 조성물은 제조 및 보관 조건하에서 안정해야 하며, 미생물, 예를 들어 세균 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 내독소 오염을, 예를 들어 0.5 ng/㎎ 단백질 미만의 안전 수준에서 최소로 유지시켜야 함을 알 것이다. 적합한 약학적으로 허용되는 희석제는 비제한적으로 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예를 들어 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 상기 현탁액의 점도를 개선시키는 화합물, 예를 들어 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 임의로, 상기 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 고도로 농축된 용액의 제조를 허용하도록 상기 화합물의 용해도를 증가시키는 작용제를 함유할 수 있다. 추가로, 상기 활성 화합물의 현탁액을 적합한 대로 유성 주사 현탁액으로서 제조할 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스터, 예를 들어 에틸 클리에이트 또는 트라이글리세라이드, 또는 리포솜을 포함한다.
활성 성분을 예를 들어 코아세르베이션 기법에 의해서 또는 계면 중합에 의해서 제조된 미세캡슐, 예를 들어 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어 리포솜, 알부민 미소구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐) 중의 또는 거대유화액 중의 각각의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메트아크릴레이트) 미세캡슐 중에 포집할 수 있다. 상기와 같은 기법들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)]에 개시되어 있다. 서방성 제제를 제조할 수도 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 상기 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질(상기 기질은 성형품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐의 형태이다)을 포함한다. 특정한 양태에서, 주사성 조성물의 연장된 흡수는 상기 조성물 중에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이들의 조합의 사용에 의해 발생될 수 있다.
본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 부형제는 간질성 약물 분산제, 예를 들어 용해성 중성-활성 하이아루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 용해성 PH-20 하이아루로니다제 당단백질, 예를 들어 rHuPH20(하이레넥스(HYLENEX: 등록상표), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International, Inc.)를 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함한 몇몇 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968에 개시되어 있다. 하나의 양상에서, sHASEGP를 하나 이상의 추가적인 글리코스아미노글리카나제, 예를 들어 콘드로이티나제와 조합한다.
예시적인 동결건조된 제형들이 US 6,267,958에 개시되어 있다. 수성 항체 제형은 US 6,171,586 및 WO 2006/044908에 개시된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
앞서 기재된 조성물들 외에, 상기 항원 결합 분자를 또한 데포 제제로서 제형화할 수 있다. 상기와 같은 장기간 작용하는 제형은 이식(예를 들어 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어 상기 융합 단백질을 적합한 중합체 또는 소수성 물질(예를 들어 허용되는 오일 중의 유화액으로서) 또는 이온 교환 수지와, 또는 드물게 용해성인 유도체, 예를 들어 드물게 용해성인 염으로서 제형화할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 통상적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포집 또는 동결건조 공정에 의해 제조할 수 있다. 약학 조성물을 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 또는 상기 단백질의, 약학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 용이하게 하는 보조제를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화할 수 있다. 적합한 제형화는 선택된 투여 경로에 따라 변한다.
본 발명의 항체는 유리산 또는 염기, 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 상기 유리산 또는 염기의 생물학적 활성을 실질적으로 유지시키는 염이다. 상기는 산 부가염, 예를 들어 단백질성 조성물의 유리 아미노기와 형성되거나 무기산, 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타타르산 또는 만델산과 같은 유기산과 형성되는 것들을 포함한다. 유리 카복실기와 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물; 또는 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 유기염기로부터 유도될 수 있다. 약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매 중에서 더 용해성으로 되는 성향이 있다.
본원의 조성물은 또한 치료되는 특정한 적응증에 필요한 바와 같은 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 상기와 같은 활성 성분들은 적합하게는 의도하는 목적에 효과량으로 함께 존재한다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행될 수 있다.
4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화 치료의 투여
4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화 치료/치료제(둘 다 본원에서 물질을 칭함)를 모두 임의의 적합한 수단, 예를 들어 비경구, 폐내 및 비내, 및 국소 치료를 원하는 경우, 병변내 투여에 의해 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법은 비경구, 특히 정맥내, 주입에 의해 투여되는 치료제들과 관련하여 특히 유용하다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 HER-2 항체, 이중특이성 HER-2 항체 및/또는 HER-2 항체-약물 접합체를 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신을 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및 트라스투주맙 엠탄신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신의 조합을 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및 마르게툭시맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HER-2 항체를 포함한다. 하나의 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙 또는 페르투주맙이다. 보다 특히, HER-2 표적화제는 트라스투주맙이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 글리코엔지니어링된 HER-2 항체, 예컨대 트라스젝스이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 이중특이성 HER-2 항체, 예컨대 헤르셉타르크이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 HER-2 항체 약물 접합체, 특히 트라스투주맙 엠탄신(아도-트라스투주맙 엠탄신)이다.
비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 부분적으로 투여가 짧은지 또는 만성적인지에 따라, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 본원에서는 비제한적으로 다양한 시점들에 걸친 단일 또는 수회 투여, 일시 투여, 및 펄스 주입을 포함한 다양한 투여 일정이 고려된다. 하나의 양태에서, 상기 치료제를 비경구, 특히 정맥내로 투여한다. 특정한 양태에서, 상기 치료제를 정맥내 주입에 의해 투여한다.
일부 양상에서, 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제는 단일 조성물로 투여된다. 일부 양태에서, 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제는 2개 이사의 상이한 조성물로 개별 투여된다.
4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화 치료/치료제를 모두 양호한 의학적 실행과 일관되는 방식으로 제형화하고, 복용시키고, 투여할 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 인자들은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 조건, 질환의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 인자들을 포함한다. 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화 치료/치료제는 모두 문제의 질환을 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와, 필요하지는 않지만, 임의로 제형화된다. 상기와 같은 다른 작용제의 효과량은 상기 제형 중에 존재하는 치료제의 양, 질환 또는 치료제의 유형, 및 상기에 논의된 다른 인자들에 따라 변한다. 이들은 본 발명에 개시된 바와 동일한 투여 용량으로 및 투여 경로에 따라, 또는 본 발명에 개시된 투여 용량의 대략 1 내지 99%, 또는 실험적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정된 임의의 투여 용량으로 및 임의의 경로에 의해 일반적으로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해서, 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화 치료/치료제의 적합한 투여 용량(이들의 조합으로 사용되거나 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 함께 사용될 때)은 치료되는 질환의 유형, 4-1BB 작용제의 유형, 상기 질환의 중증도 및 과정, 상기 두 작용제가 모두 예방 또는 치료 목적으로 사용되는지의 여부, 선행 치료법, 환자의 임상 병력 및 상기 치료제에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 변할 것이다. 각각의 물질을 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여한다. 상기 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 ㎎/kg(예를 들어 0.1 ㎎/kg 내지 10 ㎎/kg)의 상기 물질이, 예를 들어 1회 이상의 분리 투여에 의한 것이든 또는 연속 주입에 의한 것이든 간에, 상기 대상에게 투여하기 위한 초기 후보 투여 용량일 수 있다. 임의의 전형적인 1일 투여 용량은 상기 언급한 인자들에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 ㎎/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸쳐 반복된 투여를 위해서, 상기 조건에 따라, 상기 치료를 일반적으로는 질환 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 지속할 수 있다. 각각의 물질의 하나의 예시적인 투여 용량은 약 0.05 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 ㎎/kg, 1.0 ㎎/kg, 2.0 ㎎/kg, 3.0 ㎎/kg, 4.0 ㎎/kg, 5.0 ㎎/kg, 6.0 ㎎/kg, 7.0 ㎎/kg, 8.0 ㎎/kg, 9.0 ㎎/kg 는 10 ㎎/kg(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 용량을 상기 대상에게 투여할 수 있다. 상기와 같은 용량을 간헐적으로, 예를 들어 매주, 2주마다, 또는 3주마다(예를 들어 상기 대상이 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 상기 치료제를 수령하도록) 투여할 수 있다. 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서 하나 이상의 보다 낮은 용량, 또는 초기의 보다 낮은 용량에 이어서 하나 이상의 보다 높은 용량을 투여할 수도 있다. 예시적인 투여 섭생은 상기 치료제의 약 10 ㎎의 초기 용량을 투여한 다음, 약 20 ㎎의 격주 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 그러나, 다른 복용 섭생이 유용할 수도 있다. 상기 치료법의 진행을 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터한다.
하나의 양상에서, 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화 치료/치료제의 투여는 단일 투여이다. 일부 양태에서, HER-2 표적화 치료/치료제는 일제히(simultaneously) 투여된다. 용어 "일제히"는 동일한 시간 또는 단시간내, 통상적으로 1시간 미만을 의미한다. 특정 양상에서, 상기 치료제의 투여는 2회 이상의 투여이다. "하나 이상의 다른 약물과 동시에 투여되는 약물"은 동일한 치료 사이클 동안, 하나 이상의 다른 약물과 동일한 치료일, 및 임의적으로, 하나 이상의 다른 약물과 동일한 시간에 투여된다. 예컨대 3주마다 제공되는 치료의 경우, 동시 투여되는 약물은 3주 사이클 중 1일차에 각각 투여된다. 하나의 특정 양상에서, 상기 물질은 매주, 2주마다, 또는 3주마다, 특히 2주마다 투여된다. 하나의 양상에서, 상기 물질은 치료 효과량으로 투여된다. 하나의 양상에서, 상기 물질은 약 50 ㎍/kg, 약 100 ㎍/kg, 약 200 ㎍/kg, 약 300 ㎍/kg, 약 400 ㎍/kg, 약 500 ㎍/kg, 약 600 ㎍/kg, 약 700 ㎍/kg, 약 800 ㎍/kg, 약 900 ㎍/kg 또는 약 1000 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 하나의 양태에서, HER-2 표적화 치료/치료제는 4-1BB 작용제의 투여가 없는 상응하는 치료법에서의 HER-2 표적화 치료/치료제의 투여 용량보다 높은 투여 용량으로 투여된다. 하나의 양태에서, 4-1BB 작용제는 HER-2 표적화 치료/치료제의 투여가 없는 상응하는 치료법에서의 4-1BB 작용제의 투여 용량보다 높은 투여 용량으로 투여된다. 하나의 양상에서, 4-1BB 작용제의 투여는 4-1BB 작용제의 제1 투여 용량의 초기 투여, 및 4-1BB 작용제의 제2 투여 용량의 하나 이상의 후속 투여를 포함하고, 여기서 상기 제2 투여 용량은 상기 제1 투여 용량보다 높다. 하나의 양상에서, 4-1BB 작용제의 투여는 상기 4-1BB 작용제의 제1 투여 용량의 초기 투여, 및 4-1BB 작용제의 제2 투여 용량의 하나 이상의 후속 투여를 포함하고, 여기서 상기 제1 투여 용량은 상기 제2 투여 용량 이상이다.
치료제 둘다가 순차적으로 동반-투여될 때, 상기 치료제는 "특정 시간"으로 분리되는 2개의 개별 투여로 투여된다. 용어 "특정 시간"은 1시간 내지 15일 중 임의의 시간을 의미한다. 예컨대, 하나의 치료제는 다른 하나의 치료제의 투여로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일, 또는 1 내지 24시간내에 투여될 수 있고, 하나의 양태에서, 상기 특정 시간은 1 내지 3일, 또는 2 내지 8시간이다.
하나의 양상에서, 4-1BB 작용제는 HER-2 표적화 치료/치료제의 투여에 선행 투여된다. 또다른 양상에서, HER-2 표적화 치료/제제는 4-1BB 작용제의 투여에 선행 투여된다.
일부 양상에서, 투여 용량당 투여되는 트라스투주맙 엠탄신의 초기 약학 효과량은 약 0.3 내지 15 mg/kg(환자 체중)/일일 것이다. 시판되는 T-DM1 제형(카드실라(등록상표), 아도-트라스투주맙 엠탄신)은 일회용 바이알에 담긴 멸균성의 보존제-미함유 않은 백색 내지 회백색의 동결건조 분말이다. 각각의 바이알은 100 mg 또는 160 mg의 아도-트라스투주맙 엠탄신을 함유한다. 재구성(reconstitution) 후, 각각의 일회용 바이알은 pH 5.0 및 1.026 g/mL의 밀도로 아도-트라스투주맙 엠탄신(20 mg/mL), 폴리솔베이트 20(0.02%(w/v)), 나트륨 숙시네이트(10 mM) 및 수크로스(6%(w/v) 미만)를 함유한다. 20 mg/mL 아도-트라스투주맙 엠탄신을 함유하는 생성 용액은 희석 후 정맥내 주입에 의해 투여된다.
시판되는 페르투주맙의 제형(페르제타(등록상표))은 정맥내(IV) 주입을 위한 보존제-미함유 용액 형태로 420 mg/mL(30 mg/mL)의 페르투주맙을 함유하고, 약 420 mg(70 kg 대상에 대해 6 mg/kg의 투여 용량에 등가), 약 525 mg, 약 840 mg 및/또는 약 1050 mg의 고정 투여 용량으로 투여된다. 치료는 더 높은 부하의 투여 용량(예컨대 840 mg, 12 mg/kg(체중)에 등가임)으로 시작될 수 있다. 치료 용도에 적합한 페르투주맙 제형은 pH 6.0으로 20 mM 히스티딘 아세테이트, 120 mM 수크로스, 0.02% 폴리솔베이트 20 중 30 mg/mL의 페르투주맙을 포함한다. 대안의 페르투주맙 제형은 pH 6.0으로 25 mg/mL 페르투주맙, 10 mM 히스티딘-HCl 완충액, 240 mM 수크로스, 0.02% 폴리솔베이트 20을 포함한다.
또다른 양상에서, 4-1BB 작용제는 항-CD20 항체와 조합하기 위한 것이고, 여기서 II형 항-CD20 항체, 바람직하게는 오비누투주맙에 의한 사전치료는 상기 조합 치료에 선행하여 수행되고, 여기서 상기 사전치료와 상기 조합 치료 사이의 기간은 상기 II형 항-CD20 항체, 바람직하게는 오비누투주맙에 반응하여 개체에서 B 세포의 감소에 충분하다.
T 세포의 활성화는 중증 사이토카인 방출 증후군(CRS)에 이를 수 있다. 테제네로(TeGenero)에 의해 수행된 1상 연구(문헌[Suntharalingam et al., N Engl J Med (2006) 355,1018-1028])에서, 모두 6명의 건강한 자원자는 부적합하게-투여된, T 세포 자극 초-작용성 항-CD28 단클론 항체의 주입 직후 거의 치명적인 중증 사이토카인 방출 증후군(CRS)을 경험하였다. T 세포 활성화 치료제, 예를 들어 4-1BB 작용제의 대상에의 투여와 관련된 상기 사이토카인 방출은 II형 항-CD20 항체, 예를 들어 오비누투주맙에 의한 상기 대상의 사전치료에 의해 현저하게 감소될 수 있다. 가지바(등록상표) 사전치료(Gpt)의 사용은 말초 혈액 및 2차 림프양 기관 모두에서 B 세포의 급속한 고갈을 도울 것이며, 따라서 종양 세포 제거를 매개하는 투여의 시작부터 충분히 높은 T 세포 활성화 치료제의 노출 수준을 지지하면서 T 세포 활성화 치료제에 의한 강한 전신 T 세포 활성화로부터의 고도로 관련된 부작용(AE)(예를 들어 CRS)의 위험이 감소된다. 지금까지, 오비누투주맙(사이토카인 방출 포함)의 안전성 프로파일이 오비누투주맙 임상 시험을 진행 중인 수 백명의 환자에서 평가되고 관리되어 왔다. 최종적으로, T 세포 활성화 항체의 안전성 프로파일의 지지 외에, Gpt가 또한 상기 독특한 분자에 대한 항-약물 항체(ADA)의 형성을 방지하는 것을 도울 것이다.
본 발명에서, 4-1BB 작용제와 HER-2 표적화 치료/치료제의 조합을 하나의 치료법에서 추가의 작용제들과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 추가적인 치료제를 공-투여할 수 있다. 특정 양상에서, 추가적인 치료제는 면역 치료제이다. 일부 양태에서, 추가 치료제는 화학요법제이다. 적합한 화학요법제는 안트라사이클린 약물, 예컨대 독소루비신 및 에피루비신(파르모루비신(Pharmorubicin: 등록상표); 탁산 약물, 예컨대 파클리탁셀(탁솔(Taxol: 등록상표)) 및 도세탁셀(탁소테레(Taxotere: 등록상표)); 플루오로우라실(5FU); 사이클로포스파미드; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카페시타빈을 포함한다. 다른 추가적인 치료제는 키나제 억제제 라파티닙(타이커브(Tykerb)) 및 네라티닙(네를링스(Nerlynx)) 중 하나 이상을 포함한다.
상기에 나타낸 상기와 같은 조합 치료는 병행 투여(2개 이상의 치료제가 동일한 또는 별도의 제형 중에 포함된다), 및 개별 투여를 포함하며, 어느 경우든, 상기 치료제의 투여는 추가적인 치료제 또는 치료제들의 투여에 앞서, 상기 투여와 동시에, 및/또는 상기 투여에 이어서 발생할 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 치료제의 투여 및 추가적인 치료제의 투여는 서로에 대해 약 1개월 이내, 또는 약 1, 2 또는 3주 이내, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 이내에 발생한다.
치료 방법 및 조성물
하나의 양상에서, 효과량의 본원에 기재된 4-1BB 작용제 및 효과량의 본원에 기재된 HER-2 표적화제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 대상(개체)의 암을 치료하거나 암의 진행을 지연지키는 방법이 제시된다. 다양한 양상에서, HER-2 표적화제는 HER-2 항체, 이중특이성 HER-2 항체 및/또는 HER-2 항체-약물 접합체를 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신을 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및 트라스투주맙 엠탄신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신의 조합을 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및 마르게툭시맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HER-2 항체를 포함한다. 하나의 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙 또는 페르투주맙이다. 보다 특히, HER-2 표적화제는 트라스투주맙이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 글리코엔지니어링된 HER-2 항체, 예컨대 트라스젝스이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 이중특이성 HER-2 항체, 예컨대 헤르셉타르크이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 HER-2 항체 약물 접합체, 특히 트라스투주맙 엠탄신(아도-트라스투주맙 엠탄신)이다.
하나의 이러한 양상에서, 상기 방법은 효과량의 하나 이상의 추가 치료제를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 적합한 화학요법제는 안트라사이클린 약물, 예컨대 독소루비신 및 에피루비신(파르모루비신(등록상표); 탁산 약물, 예컨대 파클리탁셀(탁솔(등록상표)) 및 도세탁셀(탁소테레(등록상표)); 플루오로우라실(5FU); 사이클로포스파미드; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카페시타빈을 포함한다. 다른 추가적인 치료제는 키나제 억제제 라파티닙(타이커브) 및 네라티닙(네를링스)을 포함한다. 추가의 양태에서, 본원에서 대상에게 효과량의 본원에 제시된 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제를 투여하는 단계를 포함하는 종양 축퇴 방법을 제공한다. 상기 양상들 중 어느 하나에 따른 "개체" 또는 "대상"는 바람직하게는 인간이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 방법을 위한 4-1BB 작용제를 제시하되, 상기 4-1BB 작용제는 HER-2 표적화제와 조합으로 사용된다. 또다른 양사에서, 본 발명은 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키기는 방법에 사용하기 위한 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제를 제시한다. 일부 양태에서, 4-1BB 작용제 및/또는 HER-2 표적화제는 추가 치료제와 조합된다.
추가 양상에서, 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제를 포함하는, 암 면역치료에 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 특정 양태에서, 암 면역 치료의 방법에 사용하기 위한 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가 양상에서, 본원에서 약제의 제조 또는 제작에서 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 약제는 암의 치료를 위한 것이다. 일부 양태에서, 상기 약제는 고형 종양의 치료를 위한 것이다. 일부 양태에서, 상기 약제는 고형 종양을 갖는 개체에게 효과량의 상기 약제를 투여하는 단계를 포함하는 종양 축퇴 방법에 사용하기 위한 것이다. 하나의 상기와 같은 양태에서, 상기 방법은 개체에게 효과량의 하나 이상의 추가적인 치료제를 투여함을 또한 포함한다. 일부 양태에서, 상기 약제는 고형 종양을 치료하기 위한 것이다.
특정 양상에서, 개체는 HER-2 양성 암을 갖는다. 일부 양태에서, 암은 HER-2를 과발현하는 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 암은 고형 종양을 포함한다. 일부 양태에서, 고형 종양은 진행성 및/또는 전이성 고형 종양이다. 일부 양상에서, HER-2 양성 암은 유방암, 난소암, 위암, 위암, 식도암, 폐암, 예를 들어 폐의 선암종 또는 비소세포 폐암(NSCLC), 자궁암, 예를 들어 자궁액성 자궁내막 암종, 침샘관 암종, 방광암, 자궁내막암, 췌장암, 결장암, 전립선암 및/또는 두경부암이다. 일부 양상에서, 유방암은 유방 암종 또는 유방암 선암종이다. 일부 양상에서, 유방 암종은 침습성 유관 암종이다. 일부 양상에서, 폐암은 폐 선암종이다. 일부 양태에서, 결장암은 결장-직장 선암종이다. 임의의 상기 양태에 따른 "개인"은 인간 일 수 있다.
일부 양상에서, 암은 HER-2 양성 유방암, 특히 전이성 유방암(IV 기 유방암)이다. 일부 양상에서, 암은 II 또는 III 기 HER-2 양성 유방암이다. 일부 양상에서, 암은 HER-2 양성 초기 유방암이다. 일부 양상에서, 암은 HER-2 양성 위암이다.
치료는 암의 발달 또는 진행의 예방을 목적으로 할 수 있다. 따라서, 대상은 본원에 기재된 4-1BB 작용제 및 HER-2 작용제를 사용하여 병태의 발달에 대항하여 예방 치료될 수 있다. 이는 병태의 징후 개시 전에 수행될 수 있고/거나 암의 발달 또는 진행의 위험이 큰 것으로 여겨지는 대상에게 제공될 수 있다.
일부 양태에서, 4-1BB 작용제는 HER-2 표적화제와 상승효과적으로 작용한다.
상기에 나타낸 조합 치료는 병행 투여(2개 이상의 치료제가 동일한 또는 별도의 제형 중에 포함된다), 및 개별 투여를 포함하며, 어느 경우든, 본원에 보고된 바와 같은 항체의 투여는 추가적인 치료제 또는 치료제들의 투여에 앞서, 상기 투여와 동시에, 및/또는 상기 투여에 이어서 발생할 수 있다. 하나의 양태에서, 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제의 투여 및 임의적으로, 추가적인 치료제의 투여는 서로에 대해 약 1개월 이내, 또는 약 1, 2 또는 3주 이내, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 이내에 발생한다.
본원에 보고된 바와 같은 본원에 기재된 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제 (및 임의의 추가적인 치료제)를 모두 임의의 적합한 수단, 예를 들어 비경구, 폐내 및 비내, 및 국소 치료를 원하는 경우, 병변내 투여에 의해 투여할 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 부분적으로 투여가 짧은지 또는 만성적인지에 따라, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 본원에서는 비제한적으로 다양한 시점들에 걸친 단일 또는 수회 투여, 일시 투여, 및 펄스 주입을 포함한 다양한 투여 일정이 고려된다.
본원에 기재된 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제를 모두 양호한 의학적 실행과 일관되는 방식으로 제형화하고, 복용시키고, 투여할 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 인자들은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 조건, 질환의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 인자들을 포함한다. 상기 항체를 문제의 질환을 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와, 필요하지는 않지만, 임의로 제형화한다. 상기와 같은 다른 작용제의 효과량은 상기 제형 중에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료제의 유형, 및 상기에 논의된 다른 인자들에 따라 변한다. 이들은 본원에 개시된 바와 동일한 투여 용량으로 및 투여 경로에 따라, 또는 본원에 개시된 투여 용량의 대략 1 내지 99%, 또는 실험적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정된 임의의 투여 용량으로 및 임의의 경로에 의해 일반적으로 사용된다.
제조 물품(키트)
본 발명의 또다른 양상에서, 상술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 하나 이상의 용기 및 상기 용기 상의 또는 상기 용기와 결합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질들, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로, 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또다른 조성물과 함께 유지하며 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들어 상기 용기는 정맥내 용액 주머니 또는 피하주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 상기 키트 중의 적어도 2개의 활성제는 본 발명의 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 HER-2 항체, 이중특이성 HER-2 항체 및/또는 HER-2 항체-약물 접합체를 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신을 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및 트라스투주맙 엠탄신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신의 조합을 포함한다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙, 페르투주맙 및 마르게툭시맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HER-2 항체를 포함한다. 하나의 양상에서, HER-2 표적화제는 트라스투주맙 또는 페르투주맙이다. 보다 특히, HER-2 표적화제는 트라스투주맙이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 글리코엔지니어링된 HER-2 항체, 예컨대 트라스젝스이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 이중특이성 HER-2 항체, 예컨대 헤르셉타르크이다. 일부 양상에서, HER-2 표적화제는 HER-2 항체 약물 접합체, 특히 트라스투주맙 엠탄신(아도-트라스투주맙 엠탄신)이다.
특정 양상에서, (A) 활성 성분으로서 4-1BB 작용제 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제1 조성물; (B) 활성 성분으로서 HER-2 표적화제 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제2 조성물; 및 (C) 상기 조성물들을 조합 치료에 사용하기 위한 설명서를 포함하는 패키지를 포함하는, 대상에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키기 위한 키트를 제공한다.
상기 표지 또는 패키지 삽입물은 상기 조성물이 선택 상태의 치료에 어떻게 사용되는지를 가리키며 상기 조성물을 조합 치료에 사용하기 위한 설명을 제공한다. 더욱이, 상기 키트는 (a) 조성물이 함유된 제1 용기(여기서 상기 조성물은 본 발명의 4-1BB 작용제를 포함함); 및 (b) 조성물이 함유된 제2 용기(여기서 상기 조성물은 본 발명의 HER-2 표적화제를 포함함)를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 함께 사용될 수 있는 추가의 활성 성분을 포함하는 하나 이상의 추가의 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 양태에서 제조 물품은 상기 조성물을 사용하여 특정 상태를 치료할 수 있음을 가리키는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
한편으로, 또는 추가로, 상기 키트는 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들어 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 물품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직할 수 있는 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수도 있다.
[표 C]
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
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인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 제공된다. 항체 쇄의 아미노산들은 상기에 정의된 바와 같이 카밧에 따른 넘버링 체계에 따라 넘버링되고 지칭된다(문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]).
발명의 양상
하기에서, 본 발명의 양상들 중 일부를 나열한다.
1. HER-2 표적화제와 조합으로 사용되는, 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 방법에 사용하기 위한 4-1BB 작용제.
2. HER-2 표적화제와 조합으로 사용되고,
종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인,
암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 방법에 사용하기 위한 4-1BB 작용제.
3. 제1양상에 있어서, 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제가 단일 조성물로 함께 투여되거나, 2개 이상의 상이한 조성물로 개별 투여되는, 4-1BB 작용제.
4. 제1양상 또는 제2양상에 있어서, 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 4-1BB 작용제.
5. 제1양상 내지 제4양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 분자이고, 상기 4-1BBL의 엑토도메인은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열번호 1 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, 4-1BB 작용제.
6. 제1양상 내지 제5양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인 4-1BB 작용제.
7. 제1양상 내지 제6양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은
(a) (i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는
(b) (i) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)
을 포함하는, 4-1BB 작용제.
9. 제1양상 내지 제8상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하거나, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는, 4-1BB 작용제.
10. 제1양상 내지 제9양상 중 어느 한 양상에 있어서, IgG Fc 도메인, 구체적으로 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인 4-1BB 작용제.
11. 제1양상 내지 제10양상 중 어느 한 양상에 있어서, Fc 수용체에의 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인 4-1BB 작용제.
12. 제1양상 내지 제11양상 중 어느 한 양상에 있어서,
(a) FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자로서, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는, 4-1BB 작용제.
13. 제1양상 내지 제15양상 중 어느 한 양상에 있어서,
(a) FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는
(i) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 CH1 또는 CL 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 CL 또는 CH1 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 상기 CH1 및 CL 도메인간의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 상기 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결된 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나,
(ii) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 CH3 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 CH3 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 상기 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나,
(iii) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 VH-CL 또는 VL-CH1 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 VL-CH1 도메인 또는 VH-CL 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 상기 CH1과 CL 도메인간의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 VH 또는 VL에 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 VL 또는 VH에 연결되는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함
을 특징으로 하는 4-1BB 작용제.
14. 제1양상 내지 제16양상 중 어느 한 양상에 있어서,
(a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP) 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 4-1BB 작용제.
15. 제1양상 내지 제14양상 중 어느 한 양상에 있어서,
a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 분자; 및
b) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 분자
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원 결합 분자인, 약학 조성물.
16. 제1양상 내지 제15양상 중 어느 한 양상에 있어서,
(a) FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자인 4-1BB 작용제.
17. 제1양상 내지 제16양상 중 어느 한 양상에 있어서,
(a) FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인,
(b) 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 임의로 펩티드 링커를 통해 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 하나의 N- 또는 C-말단 아미노산에 융합되는, 약학 조성물.
18. 제1양상 내지 제17양상 중 어느 한 양상에 있어서, 항-FAP/항-4-1BB 이중특이성 항체인, 4-1BB 작용제.
19. 제1양상 내지 제18양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인 4-1BB 작용제.
20. 제1양상 내지 제19양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인은 (a) (i) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA), 및 (iv) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함하는, 4-1BB 작용제.
21. 제1양상 내지 제20양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 CEA에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함하는, 4-1BB 작용제.
22. 제1양상 내지 제21양상 중 어느 한 양상에 있어서, IgG Fc 도메인, 구체적으로 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인 4-1BB 작용제.
23. 제1양상 내지 제22양상 중 어느 한 양상에 있어서, Fc 수용체에의 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인 4-1BB 작용제.
24. 제1양상 내지 제23양상 중 어느 한 양상에 있어서,
(a) CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는, 4-1BB 작용제.
25. 제1양상 내지 제24양상 중 어느 한 양상에 있어서,
(a) CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는
(i) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 CH1 또는 CL 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 CL 또는 CH1 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 상기 CH1 및 CL 도메인간의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 상기 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결된 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나,
(ii) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 CH3 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 CH3 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 상기 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나,
(iii) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 VH-CL 또는 VL-CH1 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 VL-CH1 도메인 또는 VH-CL 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 상기 CH1과 CL 도메인간의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 VH 또는 VL에 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 VL 또는 VH에 연결되는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함
을 특징으로 하는, 4-1BB 작용제.
26. 제1양상 내지 제25양상 중 어느 한 양상에 있어서,
(a) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함하는 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 4-1BB 작용제.
27. 제1양상 내지 제26양상 중 어느 한 양상에 있어서, 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 항원 결합 분자인 4-1BB 작용제.
28. 제1양상 내지 제27양상 중 어느 한 양상에 있어서,
(a) CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자인 4-1BB 작용제.
29. 제1양상 내지 제28양상 중 어느 한 양상에 있어서,
(a) CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인,
(b) 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 임의로 펩티드 링커를 통해 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 하나의 N- 또는 C-말단 아미노산에 융합되는, 4-1BB 작용제.
30. 제1양상 내지 제29양상 중 어느 한 양상에 있어서, 항-CEA/항-4-1BB 이중특이성 항체인, 4-1BB 작용제.
31. 제1양상 내지 제30양상 중 어느 한 양상에 있어서, HER-2 표적화제와 조합으로 사용되고, 상기 조합이 약 1주 내지 3주의 간격으로 투여되는, 4-1BB 작용제.
32. 질환, 특히 암의 조합, 순차 또는 동시 치료에 사용하기 위한 (A) 활성 성분으로서 4-1BB 작용제 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제1 조성물; 및 (B) 활성 성분으로서 HER-2 표적화제 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제2 조성물을 포함하는 약학 제품.
33. 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제를 포함하는 약학 조성물.
34. 제32항에 있어서, 고형 종양의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는, 약학 조성물.
36. 제32양상 내지 제35양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 분자이고, 상기 4-1BBL의 엑토도메인은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열번호 1 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, 약학 조성물.
37. 제32양상 내지 제36양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 약학 조성물.
38. 제32양상 내지 제37양상 중 어느 한 양상에 있어서, 종양-관련 항원이 FAP인, 약학 조성물.
39. 제32양상 내지 제38양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은
(a) (i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는
(b) (i) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)
을 포함하는, 약학 조성물.
40. 제32양상 내지 제39양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하거나, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는, 약학 조성물.
41. 제32양상 내지 제40양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 안정한 회합이 가능한 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 추가로 포함하는 항원 결합 분자인, 약학 조성물.
42. 제32양상 내지 제41양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 IgG Fc 도메인, 구체적으로 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 약학 조성물.
43. 제32양상 내지 제42양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 Fc 수용체에의 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 약학 조성물.
44. 제32양상 내지 제43양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G를 포함하는 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 약학 조성물.
45. 제32양상 내지 제44양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자로서, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는, 약학 조성물.
46. 제32양상 내지 제45양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는
(i) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 CH1 또는 CL 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 CL 또는 CH1 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 상기 CH1 및 CL 도메인간의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 상기 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결된 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나,
(ii) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 CH3 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 CH3 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 상기 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나,
(iii) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 VH-CL 또는 VL-CH1 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 VL-CH1 도메인 또는 VH-CL 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 상기 CH1과 CL 도메인간의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 VH 또는 VL에 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 VL 또는 VH에 연결되는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함
을 특징으로 하는, 약학 조성물.
47. 제32양상 내지 제46양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP) 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 약학 조성물.
48. 제32양상 내지 제47양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 분자; 및
b) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 분자
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원 결합 분자인, 약학 조성물.
49. 제1양상 내지 제48양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자인, 약학 조성물.
50. 제1양상 내지 제49양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인,
(b) 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 임의로 펩티드 링커를 통해 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 하나의 N- 또는 C-말단 아미노산에 융합되는, 약학 조성물.
51. 제1양상 내지 제50양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 항-FAP/항-4-1BB 이중특이성 항체인, 약학 조성물.
52. 제1양상 내지 제51양상 중 어느 한 양상에 있어서, 종양-관련 항원이 CEA인, 약학 조성물.
53. 제1양상 내지 제52양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인은 (a) (i) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA), 및 (iv) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함하는, 약학 조성물.
54. 제1양상 내지 제53양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 CEA에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함하는, 약학 조성물.
55. 제32양상 내지 제54양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 안정한 회합이 가능한 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 추가로 포함하는 항원 결합 분자인, 약학 조성물.
56. 제32양상 내지 제55양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 IgG Fc 도메인, 구체적으로 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 약학 조성물.
57. 제32양상 내지 제56양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 Fc 수용체에의 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 약학 조성물.
58. 제32양상 내지 제57양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G를 포함하는 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 약학 조성물.
59. 제32양상 내지 제57양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는, 약학 조성물.
60. 제32양상 내지 제59양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는
(i) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 CH1 또는 CL 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 CL 또는 CH1 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 상기 CH1 및 CL 도메인간의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 상기 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결된 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나,
(ii) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 CH3 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 CH3 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 상기 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나,
(iii) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 VH-CL 또는 VL-CH1 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 VL-CH1 도메인 또는 VH-CL 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 상기 CH1과 CL 도메인간의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 VH 또는 VL에 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 VL 또는 VH에 연결되는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함
을 특징으로 하는, 약학 조성물.
61. 제32양상 내지 제60양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함하는 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 약학 조성물.
62. 제32양상 내지 제61양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 항원 결합 분자인, 약학 조성물.
63. 제32양상 내지 제62양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자인, 약학 조성물.
64. 제32양상 내지 제63양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인,
(b) 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드는 임의로 펩티드 링커를 통해 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 하나의 N- 또는 C-말단 아미노산에 융합되는, 약학 조성물.
65. 제32양상 내지 제64양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 항-CEA/항-4-1BB 이중특이성 항체인, 약학 조성물.
66. 제1양상 내지 제65양상 중 어느 한 양상에 있어서, HER-2 표적화제가 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신 중 하나 이상인, 4-1BB 작용제 또는 약학 조성물.
67. 제1양상 내지 제66양상 중 어느 한 양상에 있어서, HER-2 표적화제가 트라스투주맙인, 4-1BB 작용제 또는 약학 조성물.
68. 제32양상 내지 제67양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 HER-2 표적화제와 조합으로 사용되고, 상기 조합이 약 1주 내지 3주의 간격으로 투여되는, 약학 조성물.
69. 제32양상 내지 제68양상 중 어느 한 양상에 있어서, 증식성 질환, 특히 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는데 사용하기 위한 약학 조성물.
70. 제32양상 내지 제69양상 중 어느 한 양상에 있어서, 유방암, 난소암, 위암, 위-관련암, 식도암, 폐암, 자궁암, 침샘관 암종, 방광암, 자궁내막암, 췌장암, 결장암, 전립선암 및/또는 두경부암의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
71. (A) 활성 성분으로서 4-1BB 작용제 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제1 조성물; (B) 활성 성분으로서 HER-2 표적화제 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제2 조성물; 및 (C) 상기 조성물들을 조합 치료에 사용하기 위한 설명서를 포함하는 패키지를 포함하는, 대상에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키기 위한 키트.
72. 증식성 질환, 특히 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키기 위한 약제의 제조에서 4-1BB 작용제와 HER-2 표적화제의 조합의 용도.
73. 고형 종양의 치료를 위한 약제의 제조에서 4-1BB 작용제와 HER-2 표적화제의 조합의 용도.
74. 대상에게 효과량의 4-1BB 작용제 및 효과량의 HER-2 표적화제를 투여하는 단계를 포함하는 상기 대상에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 방법.
75. 대상에게 효과량의 4-1BB 작용제 및 효과량의 HER-2 표적화제를 투여하는 단계를 포함하는 상기 대상에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 방법으로서, 상기 4-1BB 작용제가 항원 결합 분자인, 방법.
76. 제74양상 또는 제75양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 방법.
77. 제74양상 내지 제76양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 Fcγ 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 변형을 갖는 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 방법.
78. 제74양상 내지 제77양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 항원 결합 분자인, 방법.
79. 제74양상 내지 제78양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 항원 결합 분자 및 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 분자를 포함하는, 방법.
80. 제74양상 내지 제79양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 항원 결합 분자를 포함하되, 상기 4-1BBL의 3개의 엑토도메인이 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8, 특히 서열번호 1 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
81. 제74양상 내지 제80양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 부분을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은
(a) (i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는
(b) (i) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)
을 포함하는, 방법.
82. 제74양상 내지 제81양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하거나, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는, 방법.
83. 제74양상 내지 제82양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 추가로 포함하는 항원 결합 분자인, 방법.
84. 제74양상 내지 제83양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 IgG Fc 도메인, 구체적으로 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 방법.
85. 제74양상 내지 제84상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 Fc 수용체에의 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 방법.
86. 제74양상 내지 제85양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는, 방법.
87. 제74양상 내지 제86양상 중 어느 한 양상에 있어서,
4-1BB 작용제는
(a) FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는
(i) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 CH1 또는 CL 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 CL 또는 CH1 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 상기 CH1 및 CL 도메인간의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 상기 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결된 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나,
(ii) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 CH3 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 CH3 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 상기 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나,
(iii) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 VH-CL 또는 VL-CH1 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 VL-CH1 도메인 또는 VH-CL 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 상기 CH1과 CL 도메인간의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 VH 또는 VL에 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 VL 또는 VH에 연결되는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함
을 특징으로 하는, 방법.
88. 제74양상 내지 제87양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP) 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 약학 조성물.
89. 제74양상 내지 제88양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 분자; 및
b) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 분자
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원 결합 분자인, 방법.
90. 제74양상 내지 제89양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자인, 방법.
91. 제74양상 내지 제90양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 항-FAP/항-4-1BB 이중특이성 항체인, 방법.
92. 제74양상 내지 제91양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인은 (a) (i) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA), 및 (iv) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함하는, 방법.
93. 제74양상 내지 제92양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 CEA에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함하는, 방법.
94. 제74양상 내지 제93양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 안정한 회합이 가능한 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 추가로 포함하는 항원 결합 분자인, 방법.
95. 제74양상 내지 제94양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 IgG Fc 도메인, 구체적으로 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 방법.
96. 제74양상 내지 제95양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 Fc 수용체에의 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 방법.
97. 제74양상 내지 제76양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는, 방법.
98. 제74양상 내지 제97양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는
(i) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 CH1 또는 CL 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 CL 또는 CH1 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 상기 CH1 및 CL 도메인간의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 상기 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결된 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나,
(ii) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 CH3 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 CH3 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 상기 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나,
(iii) 각각, 상기 제1 폴리펩티드는 VH-CL 또는 VL-CH1 도메인을 함유하고 상기 제2 폴리펩티드는 VL-CH1 도메인 또는 VH-CL 도메인을 함유하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 상기 CH1과 CL 도메인간의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 VH 또는 VL에 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 VL 또는 VH에 연결되는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함
을 특징으로 하는, 방법.
99. 제74양상 내지 제98양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함하는 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 방법.
100. 제74양상 내지 제99양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 항원 결합 분자인, 방법.
101. 제74양상 내지 제100양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자인, 방법.
102. 제74양상 내지 제101양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
4-1BB 작용제가 항-CEA/항-4-1BB 이중특이성 항체인, 방법.
103. 제74양상 내지 제102양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 HER-2 표적화제와 조합으로 사용되고, 상기 조합이 약 1주 내지 3주의 간격으로 투여되는, 방법.
104. 제74양상 내지 제103양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제가 단일 조성물로 함께 투여되거나, 2개 이상의 상이한 조성물로 개별 투여되는, 방법.
105. 제74양상 내지 제104양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제가 정맥내 또는 피하 투여되는, 방법.
106. 제74양상 내지 제105양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 HER-2 표적화제에 동시, 선행 또는 후속 투여되는, 방법.
107. 제74양상 내지 제106양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 HER-2 표적화제에 동시 투여되는, 방법.
108. 4-1BB 작용제가 HER-2 표적화제와 조합으로 사용되고, 4-1BB 작용제가 HER-2 표적화제와 상승효과적으로 작용하는, 제74양상 내지 제106양상 중 어느 한 양상에 따른 방법에 사용하기 위한 4-1BB 작용제.
109. 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는데 사용하기 위한 4-1BB 작용제로서, 항-CD20 항체와 조합으로 사용되고, 여기서 II형 항-CD20 항체에 의한 사전치료가 상기 조합 치료에 선행하여 수행되고, 상기 사전치료와 상기 조합 치료 사이의 기간은 상기 II형 항-CD20 항체에 대한 반응으로 개체에서 B 세포의 감소에 충분한, 4-1BB 작용제.
110. 제109양상에 있어서, II형 항-CD20 항체가 오비누투주맙인, 4-1BB 작용제.
111. 효과량의 4-1BB 작용제와 효과량의 HER-2 표적화제의 조합을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 대상의 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는데 사용하는 방법으로서, II형 항-CD20 항체에 의한 사전치료가 상기 조합 치료에 선행하여 수행되고, 상기 사전치료와 상기 조합 치료 사이의 기간은 상기 II형 항-CD20 항체에 대한 반응으로 개체에서 B 세포의 감소에 충분한, 방법.
112. 제111양상에 있어서, II형 항-CD20 항체가 오비누투주맙인, 방법.
113. 4-1BB(CD137) 작용제 및 HER-2 표적화제를 포함하는 조합으로서, 상기 4-1BB 작용제가 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 조합.
114. 제113양상에 있어서, HER-2 표적화제가 HER-2 항체, HER-2 이중특이성 항체 및/또는 HER-2 항체-약물 접합체를 포함하는, 조합.
115. 제113양상 또는 제114양상에 있어서, HER-2 표적화제가 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신을 포함하는, 조합.
116. 제113양상 내지 제115양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는, 조합.
117. 제113양상 내지 제116양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 항원 결합 분자를 포함하되, 상기 4-1BBL의 3개의 엑토도메인이 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8, 특히 서열번호 1 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 조합.
118. 제113양상 내지 제117양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 FAP 및 CEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 조합.
119. 제113양상 내지 제118양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 IgG Fc 도메인, 구체적으로 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 조합.
120. 제113양상 내지 제119양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 Fc 수용체에의 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 조합.
121. 제113양상 내지 제120양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 조합.
122. 제113양상 내지 제121양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 부분을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은
(a) (i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는
(b) (i) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)
을 포함하는, 조합.
123. 제113양상 내지 제122양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하거나, 상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는, 조합.
124. 제113양상 내지 제123양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는, 조합.
125. 제113양상 내지 제124양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP) 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 조합.
126. 제113양상 내지 제125양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 항원 결합 분자인, 조합.
127. 제113양상 내지 제126양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 항-CEA/항-4-1BB 이중특이성 항체인, 조합.
128. 제113양상 내지 제127양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 조합.
129. 제113양상 내지 제128양상 중 어느 한 양상에 있어서, 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인이 (a) (i) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA), 및 (iv) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함하는, CEA에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인인, 조합.
130. 제113양상 내지 제129양상 중 어느 한 양상에 있어서, 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인이 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함하는, CEA에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인인, 조합.
131. 제113양상 내지 제130양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는, 조합.
132. 제113양상 내지 제131양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가
(a) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함하는 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 항원 결합 분자이되, 상기 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 조합.
133. 제113양상 내지 제132양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 항-CEA/항-4-1BB 이중특이성 항체인, 조합.
134. 제113양상 내지 제133양상 중 어느 한 양상에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 조합.
135. 제113양상 내지 제134양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제가 단일 조성물로 함께 투여되거나, 2개 이상의 상이한 조성물로 개별 투여되는, 조합.
136. 제113양상 내지 제135양상 중 어느 한 양상에 있어서, 4-1BB 작용제가 HER-2 표적화제에 동시, 선행 또는 후속 투여되는, 조합.
137. 제113양상 내지 제136양상 중 어느 한 양상에 있어서, HER-2 양성 암의 치료에 사용하기 위한 조합.
실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 다양한 다른 실시태양들을 실행하여, 상기에 제공된 일반적인 설명을 제공할 수 있음을 알 것이다.
재조합 DNA 기법
문헌[Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 DNA를 조작하였다. 분자 생물학 시약들은 제조사의 설명서에 따라 사용하였다. 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242]에 제공되어 있다.
DNA 서열분석
DNA 서열을 이중 가닥 서열분석에 의해 측정하였다.
유전자 합성
목적하는 유전자 분절을 적합한 주형을 사용하여 PCR에 의해 생성시키거나 또는 자동화된 유전자 합성에 의해 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 산물로부터 진아트(Geneart) AG(독일 로젠스부르크 소재)에 의해 합성하였다. 정확한 유전자 서열을 입수할 수 없는 경우에, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 가장 가까운 상동체로부터의 서열에 기반하여 설계하고 적합한 조직으로부터 기원하는 RNA로부터 RT-PCR에 의해 유전자를 단리하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위가 측면에 인접한 유전자 분절을 표준 클로닝/서열분석 벡터내에 클로닝하였다. 상기 플라스미드 DNA를 형질전환된 세균으로부터 정제하고 UV 분광학에 의해 농도를 측정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 유전자 분절을 각각의 발현 벡터내로의 서브클로닝을 허용하기에 적합한 제한 부위로 설계하였다. 모든 구축물을 진핵생물 세포에서의 분비를 위해 단백질을 표적화하는 리더 펩티드를 암호화하는 5'-단부 DNA 서열로 설계하였다.
세포 배양 기법
표준 세포 배양 기법을 문헌[Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.]에 기재된 바와 같이 사용하였다.
단백질 정제
단백질을 표준 프로토콜을 참조하여 여과된 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다. 간단히, 항체를 단백질 A 세파로스 컬럼(GE 헬스케어)에 적용시키고 PBS로 세척하였다. 항체의 용출을 pH 2.8에서 성취한 다음 샘플을 즉시 중화시켰다. 응집된 단백질을 PBS 중에서 또는 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl pH 6.0 중에서 크기 배제 크로마토그래피(슈퍼덱스(Superdex) 200, GE 헬스케어)에 의해 단량체 항체로부터 분리시켰다. 단량체 항체 분획들을 모으고, 예를 들어 밀리포어 아미콘 울트라(MILLIPORE Amicon Ultra)(30 MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 농축시키고(필요한 경우), 동결시키고 -20℃ 또는 -80℃에서 보관하였다. 상기 샘플의 부분을 예를 들어 SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 또는 질량 분광분석법에 의한 후속의 단백질 분석 및 분석학적 특성규명을 위해 제공하였다.
SDS-PAGE
NuPAGE(등록상표) Pre-Cast 젤 시스템(인비트로겐(Invitrogen))을 제조사의 설명에 따라 사용하였다. 특히, 10% 또는 4 내지 12% NuPAGE(등록상표) 노벡스(Novex)(등록상표) 비스-트리스 Pre-Cast 젤(pH 6.4) 및 NuPAGE(등록상표) MES(환원된 젤, NuPAGE(등록상표) 산화방지제 실행 완충제 첨가제와 함께) 또는 MOPS(환원되지 않은 젤) 실행 완충제를 사용하였다.
분석학적 크기 배제 크로마토그래피
항체의 응집 및 올리고머성 상태의 측정을 위한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 HPLC 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 간단히, 단백질 A 정제된 항체를 에이질런트 HPLC 1100 시스템상에서 300 mM NaCl, 50 mM KH2PO4/K2HPO4, pH 7.5 중의 토소(Tosoh) TSKgel G3000SW 컬럼에 또는 다이오넥스(Dionex) HPLC-시스템상에서 2xPBS 중의 슈퍼덱스(Superdex) 200 컬럼(GE 헬스케어)에 적용시켰다. 상기 용출된 단백질을 UV 흡광도 및 피크 면적의 적분에 의해 정량분석하였다. 바이오래드(BioRad) 젤 여과 표준 151-1901은 표준으로서 사용하였다.
질량 스펙트럼 분석
본 부분은 VH/VL 교환(VH/VL CrossMab)을 갖는 다중특이성 항체의 특성규명을 이의 정확한 조합을 중점으로 설명한다. 예상되는 1차 구조를 탈당화된 온전한 CrossMab 및 탈당화된/플라스민 소화되거나 다르게는 탈당화된/제한된 LysC 소화된 CrossMab의 전자분무 이온화 질량 스펙트럼 분석(ESI-MS)에 의해 분석하였다.
VH/VL CrossMab을 1 mg/mL의 단백질 농도로 17시간 이하까지 37℃의 온도에서 포스페이트 또는 트리스 완충액 중 N-글리코시다제 F에 의해 탈당화하였다. 플라스민 또는 제한된 LysC(로슈(Roche)) 소화를 각각 실온에서 12시간 동안 및 37℃에서 40분 동안 pH 8의 트리스 완충액 중 100 μg의 탈당화된 VH/VL CrossMab에 의해 수행하였다. 질량 스펙트럼 분석에 앞서, 샘플을 세파덱스 G25(Sephadex G25) 컬럼에서 HPLC를 통해 탈염하였다. 총 질량을 트라이버사 나노메이트 공급원(TriVersa NanoMate source)(아드비온(Advion))이 장착된 맥시스(maXis) 4G UHR-QTOF MS 시스템(브루커 달터닉(Bruker Daltonik))을 통해 측정하였다.
표면 플라스몬 공명(SPR)(비아코어)을 사용하는 각 항원에 대한 다중특이성 항체의 결합 및 결합 친화도의 측정
각 항원에 대해 생성된 항체의 결합을 비아코어 장비(GE 헬스케어 바이오사이언시즈 아베(GE Healthcare Biosciences AB), 스웨덴 웁살라 소재)를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 조사한다. 간단히, 친화도 측정을 위해서 염소-항-인간 IgG, JIR 109-005-098 항체를 각 항원에 대한 항체의 제공을 위해 아민 커플링을 통해 CM5 칩상에 고정화시킨다. 결합을 HBS 완충제(HBS-P(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% 트윈 20, ph 7.4), 25℃(또는 다르게는 37℃)에서 측정한다. 항원(R&D 시스템스 또는 사내 정제된)을 용액 중에서 다양한 농도로 가하였다. 결합을 80초 내지 3분의 항원 주입에 의해 측정하고; 해리를 3 내지 10분 동안 HBS 완충제로 상기 칩 표면을 세척함으로써 측정하고 Kd 값을 1:1 랭뮤어 결합 모델을 사용하여 평가하였따. 음성 대조용 데이터(예를 들어 완충제 곡선)를 시스템 고유 기준선 드리프트의 보정 및 소음 신호 감소를 위해 샘플 곡선으로부터 공제한다. 각각의 비아코어 평가 소프트웨어를 센서그램의 분석 및 친화도 데이터의 계산을 위해 사용한다.
실시예 1
FAP-4-1BBL 항원 결합 분자의 제조, 정제 및 특성규명
FAP-표적화된 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자를 국제 특허 출원 공개 WO 2016/075278 A1에 기재된 바와 같이 제조하였다.
특히, 하기의 분자들을 제조하였다:
a) 1가 FAP-표적화된 및 비표적화된 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자
인간 CL 도메인에 융합된 이량체 4-1BB 리간드를 암호화하는 폴리펩티드를 놉상에 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인과 함께 인프레임 서브클로닝하였다(문헌[Merchant, Zhu et al. 1998, Nature Biotechnol. 16, 677-681]). 상기 4-1BB 리간드의 하나의 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 상기 인간 IgG1-CH1 도메인에 융합시켰다. 구축물 3.4에서, 쇄의 정확한 짝짓기를 개선시키기 위해서 하기의 돌연변이들을 상기 교차된 CH-CL(하전된 변체)에 추가로 도입시켰다: 인간 CL에 융합된 이량체 4-1BB 리간드에서, E123R 및 Q124K, 인간 CH1에 융합된 단량체 4-1BB 리간드에서, K147E 및 K213E.
FAP에 특이적인 결합제, 클론 28H1 또는 클론 4B9를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄와 인프레임 서브클로닝하였다. Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 WO 2012/130831에 기재된 방법에 따라 상기 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입시켜 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 없앴다. S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체 리간드-Fc 놉 쇄, 단량체 CH1 융합, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화된 항-FAP-Fc 홀 쇄 및 항-FAP 경쇄의 조합은 이종이량체의 생성을 허용하고, 상기 이종이량체는 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 FAP 결합 Fab를 포함한다(도 1의 1A). FAP 결합제를 생식세포계열 DP47로 대체함으로써 비표적화된 버전을 제조하였다(도 1의 1C).
1가 구축물들
WO 2016/075278의 실시예 하기의 서열들로 구성됨
1가 FAP(4B9)-4-1BBL
(하전된 변체)		 실시예 2.1.4
(구축물 2.4)		 서열번호 41, 서열번호 42
서열번호 43 및 서열번호 44
1가 FAP(28H1)-4-1BBL 실시예 1.1
(구축물 1.2)		 서열번호 45, 서열번호 46
서열번호 47 및 서열번호 48
1가 비표적화된
DP47-4-1BBL		 실시예 1.4
(구축물 B)		 서열번호 45, 서열번호 46
서열번호 49 및 서열번호 84
a) 2가 FAP-표적화된 및 비표적화된 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자
FAP에 특이적인 결합제, 클론 28H1 또는 클론 4B9를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄와 인프레임 서브클로닝하였다. Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 WO 2012/130831에 기재된 방법에 따라 상기 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입시켜 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 없앴다. 또한, 4-1BB 리간드의 2개의 엑토도메인을 포함하는 폴리펩티드를 인간 IgG1 Fc 홀 쇄의 C-말단에 융합시키고 4-1BB 리간드의 하나의 엑토도메인을 포함하는 폴리펩티드를 인간 IgG1 Fc 놉 쇄의 C-말단에 융합시켰다. S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체 리간드-Fc 놉 쇄, 단량체 CH1 융합, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화된 항-FAP-Fc 홀 쇄 및 항-FAP 경쇄의 조합은 이종이량체의 생성을 허용하고, 상기 이종이량체는 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 2개의 FAP 결합 Fab를 포함한다(도 1의 1B). FAP 결합제를 생식세포계열 DP47로 대체함으로써 비표적화된 버전을 제조하였다(도 1의 1D).
2가 구축물들
WO 2016/075278의 실시예 하기의 서열들로 구성됨
2가 FAP(4B9)-4-1BBL 실시예 2.1.3
(구축물 2.3)		 2 x 서열번호 113,
서열번호 116 및 서열번호 117
2가 FAP(28H1)-4-1BBL 실시예 1.1
(구축물 1.5)		 2 x 서열번호 115
서열번호 118 및 서열번호 119
상기 FAP-표적화된 및 비표적화된 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 생성 및 특성규명은 각각 WO 2016/075278, 실시예 1 내지 6에 상세히 기재되어 있다.
실시예 2
FAP 표적화된 마우스 4-1BBL 항원 결합 분자(하이브리드 대리)의 제조, 정제 및 특성규명
FAP에 1가 결합을 갖는 작용성 마우스 4-1BB 리간드를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자(하이브리드 대리 또는 FAP-mu4-1BBL로도 지칭됨)를 국제 특허 출원 공개 WO 2016/075278 A1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 표적화된 마우스 4-1BBL을 인간 리간드에 대해 기재된 바와 같이 인간 리간드를 마우스 엑토도메인으로 대체함으로써 제조하였다. 마우스 4-1BB 리간드의 엑토도메인의 부분(아미노산 104 내지 309, C160S 돌연번이 포함)을 암호화하는 DNA 서열을 유니프롯 데이터베이스의 Q3U1Z9-1 서열에 따라 합성하였다. 4-1BB 리간드를 표적화하는데 사용된 FAP 결합제는 클론 4B9였다. 하이브리드 대리 FAP-mu4-1BBL의 아미노산 서열은 하기 표 3에서 찾을 수 있다.
성숙 하이브리드 대리 FAP-mu4-1BBL의 아미노산 서열
서열번호 설명 서열
86 2가 mu4-1BBL-CL Fc 놉 쇄 RTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGCPNTTQQGSPVFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQAKPQVDDFDNLALTVELFPCSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPWEGGGGSGGGGSRTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGCPNTTQQGSPVFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQAKPQVDDFDNLALTVELFPCSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPWEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
87 1가 mu4-1BBL-CH1 쇄 RTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGCPNTTQQGSPVFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQAKPQVDDFDNLALTVELFPCSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPWEGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSC
88 VHCH1(4B9) Fc 홀 쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
89 VLCL(4B9) 경쇄 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
에비펙트(eviFect)(에비트리아 아게(Evitria AG))를 사용하여 현탁액 중 성장된 CHO-K1 세포를 포유동물 발현 벡터와 동반-형질감염시킴으로써 하이브리드 대리 FAP-mu4-1BBL을 제조하였다. 상기 세포를 1:1:1:1 비(벡터 Fc-홀 중쇄:벡터 FAP 경쇄:벡터 4-1BBL Fc-놉 중쇄:벡터 mu4-1BBL 경쇄)로 상응하는 발현 벡터에 의해 형질감염시켰다.
형질감염을 위해, CHO-K1 세포를 에비메이크(eviMake)(에비트리아 아게) 배양 배지 중 혈청 미함유 현탁액 중 배양하였다. 5% CO2 대기로 항온배양기에서 37℃로 7일 후, 배양물 상청액을 정제를 위해 원심분리에 의해 채집하고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 mm 필터) 4℃에서 유지하였다.
분비된 단백질을 단백질 A를 사용하여 친화도 크로마토그래피 후 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 친화도 크로마토그래피의 경우, 상청액을 단백질 A 맙셀렉트슈어 컬럼(Protein A MabSelectSure column)(GE 헬스케어)(20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트 pH 7.5로 평형화됨)에 로딩하였다. 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트를 함유하는 완충제(pH 7.5)에 의해 세척함으로써 미결합 단백질을 제거하였다. 20 mM 나트륨 시트레이트, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신, 0.01% 트윈(Tween) 20 pH 3.0 중 나트륨 클로라이드의 선형 pH-구배를 사용하여 결합 단백질을 용리시켰다. 이어서, 컬럼을 20 mM 나트륨 시트레이트, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신, 0.01% 트윈 20 pH 3.0으로 세척하였다. 1/40(v/v)의 2 M 트리스(Tris) pH 8.0을 첨가함으로써 채집 분획의 pH를 조정하였다. 단백질을 농축하고 여과한 후 하이로드 슈퍼덱스(HiLoad Superdex) 컬럼(GE 헬스케어)(20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, 0.01% 트윈 20 pH6.0으로 평형화됨)에 로딩하였다.
아미노산 서열을 기준으로 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서의 OD 측정에 의해 정제된 이중특이성 구축물의 단백질 농도를 측정하였다. 이중특이성 구축물의 순도 및 몰 중량을 랩칩GXII(LabChipGXII)(캘리퍼(Caliper))를 사용하여 환원제(미국의 인비트로겐)의 존재 및 부재하에 CE-SDS에 의해 분석하였다. 25℃에서 TSKgel G3000 SW XL 분석 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(토소(Tosoh))(25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02 %(w/v) NaN3, pH 6.7 중 평형화됨)을 사용하여 이중특이성 구축물의 응집물 함량을 분석하였다.
하이브리드 대리 FAP-mu4-1BBL의 생화학 분석
분자 단량체
[%]		 수율
[mg/L]		 CE-SDS
(비-적색)
FAP-mu4-1BBL 95 3.2 92
2.1: 표면 플라즈몬 공명에 의한 하이브리드 대리 FAP-mu4-1BBL의 기능적 특성규명
WO 2016/075278 A1에 기재된 방법으로 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 동시적으로 결합하는 쥐 4-1BB Fc(kih) 및 인간 또는 쥐 FAP의 능력을 평가하였다. 모든 SPR 실험은 비아코어 T200에서 25℃에서 전개 완충제로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 독일 프레이부르크의 비아코어)를 사용하여 수행하였다. 비오틴일화된 쥐 4-1BB Fc(kih)를 스트렙타비딘(SA) 센서 칩의 유동 세포에 직접 결합시켰다. 600 공명 단위(RU) 이하의 부동화 수준을 사용하였다.
FAP-표적화된 mu4-1BBL 구축물을 90초에 걸쳐 유동 세포를 통해 30 μL/분의 유동으로 200 nM 농도로 통과시키고, 해리를 0초로 설정하였다. 500 nM의 농도에서 90초에 걸쳐 유동 세포를 통해 30 μL/분으로 단량체 인간 또는 쥐 FAP를 제2 분석물로서 주사하였다. 해리를 120초 동안 감시하였다. 벌크 굴절률 차이를 부동화된 단백질이 없는 참조 유동 세포에서 수득된 반응을 제함으로써 보정하였다.
도 2의 2A 및 2B의 그래프에 도시된 바와 같이, 하이브리드 대리 FAP-mu4-1BBL은 쥐 4-1BB 및 쥐/인간 FAP에 동시적으로 결합할 수 있다.
실시예 3
마우스 4-1BB에 대한 2가 결합 및 FAP에 대한 2가 결합을 갖는 이중특이성 항원 결합 분자의 제조, 정제 및 특성규명
4-1BB에 대한 2가 결합 및 FAP에 대한 1가 결합을 갖는 이중특이성(2+1로도 지칭됨) 작용성 마우스 4-1BB 항체를 도 1과 유사하게 제조하였다. 본 실시예에서, 구축물의 제1 중쇄 HC1은 항-4-1BB(클론 MU137-1)의 VHCH1에 이어 돌연변이 Lys392Asp 및 Lys409Asp를 포함하는 Fc(Fc-DD로 지칭됨)(C-말단에서 항-FAP 결합제(클론 28H1)의 VL 또는 VH이 융합됨)로 구성되었다. 제2 중쇄 HC2는 항-4-1BB의 VHCH1(클론 MU137-1)에 이어 돌연변이 Glu356Lys 및 Asp399Lys를 포함하는 Fc(Fc-KK로 지칭됨)(C-말단에서 항-FAP 결합제(클론 28H1)의 VH 또는 VL이 융합됨)으로 구성되었다. 항체 Fc 이종이량체 형성을 강화시키기 위한 DDKK 돌연변이는 특히 문헌[Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 2010,19637-19646]에 기재되어 있다. 표적화된 항-FAP-Fc DD와 항-4-1BB-Fc KK 쇄의 조합은 FAP 결합 부분 및 2 개의 쥐 마우스 4-1BB 결합 Fab를 포함하는 이종이량체가 생성되게 한다. DAPG 돌연변이는 예를 들어 문헌[Baudino et al. J. Immunol. (2008), 181, 6664-6669] 또는 WO 2016/030350 A1에 기재된 방법에 따라 마우스 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 제거하기 위해 중쇄의 불변 영역에 도입하였다. 요약하면, Asp265Ala 및 Pro329Gly 돌연변이를 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 제거하기 위해 Fc-DD 및 Fc-KK 중쇄의 불변 영역에 도입하였다(카밧 EU 색인에 따른 넘버링, 즉 D265A, P329G).
Fc-KK에 융합된 a-FAP (28H1) VH 및 Fc-DD THO에 융합된 VL을 갖는 2+1 항-4-1BB(MU137-1), 항-FAP (28H1) 구축물의 아미노산 서열을 찾을 하기 표 5에서 찾을 수 있다. Fc-KK에 융합된 항-FAP(28H1) VL 및 Fc-DD 쇄에 융합된 VH를 갖는 2+1 항-4-1BB(MU137-1), 항-FAP(28H1) 구축물에 대한 아미노산 서열은 하기 표 6에서 찾을 수 있다.
이중 특이성 2가 항-4-1BB(MU137-1)/항-FAP(28H1) 마우스 IgG1 DAPG 항원 결합 분자의 서열
(FC-DD 쇄에 융합된 FAP VH 및 Fc-KK 쇄에 융합된 VL을 갖는 구축물, Fc-DD-VL로도 하기 지칭됨)
서열
목록		 설명 서열
90 VHCH1(MU137-1)-중쇄 Fc-DD-VL(28H1) DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFIFSYFDMAWVRQAPTKGLEWVASISPSGDIPYYRDSVKGRFTVSRENAKSSLYLQMDSLRSEDTATYYCARRSYGGYSELDYWGQGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYDNTQPIMDTDGSYFVYSDLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIK
91 VHCH1(20H4.9)-중쇄 Fc-KK-VH(28H1) DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFIFSYFDMAWVRQAPTKGLEWVASISPSGDIPYYRDSVKGRFTVSRENAKSSLYLQMDSLRSEDTATYYCARRSYGGYSELDYWGQGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKKQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMKTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSS
92 VLCL-중쇄(MU137-1) DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLAWYHQKPGKSPQLLIYGTSSLADGVPSRFSGSSSGSQYSLKISRLQVEDIGIYYCLQAYGAPWTFGGGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
이중 특이성 2가 항-4-1BB(MU137-1)/항-FAP(28H1) 마우스 IgG1 DAPG 항원 결합 분자의 서열
(FC-DD 쇄에 융합된 FAP VH 및 Fc-KK 쇄에 융합된 VL을 갖는 구축물, Fc-DD-VH로 지칭됨)
서열
목록		 설명 서열
93 VHCH1(MU137-1)-중쇄 Fc-DD-VH(28H1) DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFIFSYFDMAWVRQAPTKGLEWVASISPSGDIPYYRDSVKGRFTVSRENAKSSLYLQMDSLRSEDTATYYCARRSYGGYSELDYWGQGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYDNTQPIMDTDGSYFVYSDLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSS
94 VHCH1(MU137-1)-중쇄 Fc-KK-VL(28H1) DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFIFSYFDMAWVRQAPTKGLEWVASISPSGDIPYYRDSVKGRFTVSRENAKSSLYLQMDSLRSEDTATYYCARRSYGGYSELDYWGQGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKKQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMKTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIK
92 VLCL-경쇄(MU137-1) 표 5
에비펙트(에비트리아 아게)를 사용하여 현탁액 중 성장된 CHO-K1 세포를 포유동물 발현 벡터와 동반-형질감염시킴으로써 이중특이성 2+1 항-4-1BBL 항-FAP muIgG1 DAPG를 제조하였다. 상기 세포를 1:1:1 비(벡터 Fc-DD 중쇄:벡터 경쇄:벡터 Fc-KK 중쇄)로 상응하는 발현 벡터에 의해 형질감염시켰다.
형질감염을 위해, CHO-K1 세포를 에비메이크(에비트리아 아게) 배양 배지 중 혈청 미함유 현탁액 중 배양하였다. 5% CO2 대기로 항온배양기에서 37℃로 7일 후, 배양물 상청액을 정제를 위해 원심분리에 의해 채집하고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 mm 필터) 4℃에서 유지하였다.
분비된 단백질을 단백질 A를 사용하여 친화도 크로마토그래피 후 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 친화도 크로마토그래피의 경우, 상청액을 단백질 A 맙셀렉트슈어 컬럼(GE 헬스케어)(40 mL의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트 pH 7.5로 평형화됨)에 로딩하였다. 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트를 함유하는 완충제(pH 7.5)의 10개 컬럼 이상 부피에 의해 세척함으로써 미결합 단백질을 제거하였다. 20 mM 나트륨 시트레이트, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신, 0.01% 트윈 20 pH 3.0의 15개 컬럼 부피에 생성된 나트륨 클로라이드(20 내지 100 mM)의 선형 pH-구배를 사용하여 결합 단백질을 용리시켰다. 이어서, 컬럼을 20 mM 나트륨 시트레이트, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신, 0.01% 트윈 20 pH 3.0의 10개 컬럼 부피로 세척하였다. 1/40(v/v)의 2 M 트리스 pH 8.0을 첨가함으로써 채집 분획의 pH를 조정하였다. 단백질을 농축하고 여과한 후 하이로드 슈퍼덱스 컬럼(GE 헬스케어)(20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0으로 평형화됨)에 로딩하였다.
아미노산 서열을 기준으로 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서의 OD 측정에 의해 정제된 이중특이성 구축물의 단백질 농도를 측정하였다. 이중특이성 구축물의 순도 및 몰 중량을 랩칩GXII(캘리퍼)를 사용하여 환원제(미국의 인비트로겐)의 존재 및 부재하에 CE-SDS에 의해 분석하였다. 25℃에서 TSKgel G3000 SW XL 분석 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(토소)(25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02 %(w/v) NaN3, pH 6.7 중 평형화됨)을 사용하여 이중특이성 구축물의 응집물 함량을 분석하였다.
4-1BB에 대한 2가 결합 및 FAP에 대한 1가 결합을 갖는 항원 결합 분자
(2+1) 항-4-1BB(MU137-1), 항-FAP(28H1) 마우스 IgG1 DAPG
의 생화학 분석
분자 단량체
[%]		 수율
[mg/L]		 CE-SDS
(비-적색)
4-1BB(MU137-1)/FAP(28H1) DAPG IgG1 2+1(Fc-DD-VL)
(muFAP-4-1BB로도 하기 지칭됨)		 98 3.6 92
3.1: 표면 플라즈몬 공명에 의한 마우스 대리 muFAP-4-1BBL의 기능적 특성규명
WO 2016/075278 A1에 기재된 방법으로 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 동시적으로 결합하는 쥐 4-1BB Fc(kih) 및 인간 또는 쥐 FAP의 능력을 평가하였다. 모든 SPR 실험은 비아코어 T200에서 25℃에서 전개 완충제로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 독일 프레이부르크의 비아코어)를 사용하여 수행하였다. 비오틴일화된 쥐 4-1BB Fc(kih)를 스트렙타비딘(SA) 센서 칩의 유동 세포에 직접 결합시켰다. 600 공명 단위(RU) 이하의 부동화 수준을 사용하였다.
FAP-표적화된 4-1BB 구축물을 90초에 걸쳐 유동 세포를 통해 30 μL/분의 유동으로 200 nM 농도로 통과시키고, 해리를 0초로 설정하였다. 500 nM의 농도에서 90초에 걸쳐 유동 세포를 통해 30 μL/분으로 쥐 FAP를 제2 분석물로서 주사하였다. 해리를 120초 동안 감시하였다. 벌크 굴절률 차이를 부동화된 단백질이 없는 참조 유동 세포에서 수득된 반응을 제함으로써 보정하였다.
도 2의 2C의 그래프에 도시된 바와 같이, 마우스 대리 muFAP-4-1BBL은 쥐 4-1BB 및 쥐 FAP에 동시적으로 결합할 수 있다.
실시예 4
C57BL/6 마우스에서 달일 주사 후 muFAP-4-1BB에 대한 약동학적 프로파일
2.5 mg/kg의 muFAP-4-1BB(실시예 3에 따라 제조됨)의 단일 용량을 C57BL/6 마우스에 주사하였다. 모든 마우스에 200 μL의 적절한 용액으로 정맥내 주사하였다. 200μL 당 적절한 양의 화합물을 수득하기 위해, 원료 용액(muFAP-4-1BB; 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 중 1.81 mg/mL)을 히스티딘 완충액으로 희석하였다. 시점 당 3 마리의 마우스를 10분, 1시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 6일 및 9일에 채혈하였다. 주사된 화합물을 ELISA에 의해 혈청 샘플에서 분석하였다. 비오틴일화된 쥐 4-1BB, 시험 혈청 샘플, HRP로 표지된 검출 항체 항 -msIgG를 96-웰 스트렙타비딘-코팅된 마이크로역가 플레이트에 단계적으로 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 매 단계 후 항온배양하였다. 각 단계 후에 플레이트를 3 회 세척하여 미결합 물질을 제거하였다. 마지막으로, 과산화 효소-결합 복합체는 ABTS 기질 용액을 첨가하여 유색 반응 생성물을 형성함으로써 시각화하였다. 반응 생성물 강도는 405 nm(참조 파장 490 nm)에서 광도 측정으로 측정되었고 혈청 샘플의 분석물 농도에 비례하였다. 결과는 도 3에 도시되어 있다. muFAP-4-1BB는 안정적인 PK-거동을 나타냈고, 이는 효능 연구에 대해 주 1 회 일정을 권장하였다.
실시예 5
트라스투주맙과 조합된 하이브리드 FAP-mu4-1BBL 구축물의 생체내 항-종양 효능
하이브리드 FAP-mu4-1BBL(항-FAP, 마우스 4-1BBL, 인간 IgG 골격)과 트라스투주맙의 조합에 대한 제1의 개념 증명을 종양-보유(N87-보유) huCD16tgScid 마우스에서 수행하였다.
N87 세포(Her2+ 인간 위 암종)은 원래 ATCC로부터 입수한 것이었고, 증식 후 로슈 글리카르트 아게(Roche Glycart AG)의 내부 세포 은행에 저장하였다. 세포를 10% FCS 및 1% 글루타맥스를 함유하는 RPMI에서 배양하였다. 세포를 5% CO2에서 수포화된 대기 중 37℃에서 배양하였다. 동물당 5x106 세포(RMPI 세포 배양 배지(기브코) 및 GFR 마트리겔(1:1, 100 μL의 총 부피), 95.0% 초과의 생존도)로 동물의 우측 옆구리에 피하 주사하였다.
실험 시작시 8 내지 10주령의 인간 FcηRIIIa(CD16) 유전자삽입 SCID 마우스(효과기로서 쥐 FcγRIV-양성 대식세포 및 인간 FcγRIIIa-양성 유전자삽입 쥐 NK 세포 모두를 발현함)를 수락된 가이드라인(GV-Solas; Felasa; TierschG)에 따라 12시간 명/12시간 암의 일주기에 의해 특정-병원균-부재 조건하에 유지하였다. 실험 연구 절차를 검토하고 지역 관할청의 승인을 받았다. 도착 후, 새로운 환경에 적응하도록 하고 관찰을 위해, 동물을 1주 동안 유지하였다. 연속적인 건강 감시를 규칙적으로 수행하였다.
절차에 따라(도 4의 4A), 암컷 huCD16TgScid 마우스에 전술한 바와 같이 종양 세포를 피하 주사하고 종양 크기가 약 220 mm3에 달할 때(283일차) 본 발명의 화합물 또는 PBS(비히클)로 매주 1회 처리하였다. 모든 마우스에 200 μL의 적절한 용액을 매주 1회 정맥내 주사하였다. 200 μL당 적절량의 화합물을 수득하기 위해, 원료 용액(표 1)을 필요에 따라 히스티딘 완충액으로 희석하였다. 트라스투주맙과 FAP-4-1BBL 구축물의 조합 치료(군 D, 도 4의 4B)를 위해, 치료제를 동반 주사하였다. 캘리퍼를 사용하여 종양 성장을 매주 2회 측정하고(도 5의 5A 및 5B), 종양 부피를 하기 수학식 1과 같이 계산하였다:
[수학식 1]
Tv = (W2/2) x L
상기 식에서, W는 너비이고 L은 길이이다.
화합물의 8회 주사 후(종양 세포 주사 후 86일차), 연구를 종결하고 모든 마우스를 희생하고, 종양을 외식하고 칭량하였다. 도 5의 5A 및 5B는 모든 처리군에서 종양 성장 동력학(평균±SEM) 및 모든 군에 대해 각각의 동물의 개별 종양 성장 동역학을 나타낸다. 하이브리드 FAP-mu4-1BBL의 단일 치료는 어떠한 종양 성장 억제도 나타내지 않았다. 트라스투주맙의 단일 치료는 연구 종결시 1개체의 마우스가 종양 부재인 것으로 종양 정체(95의 TGI(종양 성장 억제) 및 0.35 TCR)를 유도하였다. 그러나, 트라스투주맙과 하이브리드 FAP-mu4-1BBL의 조합은 강한 억제(132의 TGI 및 0.09 TCR)를 유도하여 86일차까지 60% 종양 부재를 야기하였다.
JMP 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였다.
Figure pct00013
연구 59일차를 기반으로 한 계산은 하기 표 9에 나타냈다.
생체내 실험에서 사용된 조성
화합물 완충제 제형 농도
(mg/mL)
FAP-mu-4-1BBL 20 mM 히스티딘,
140 mM NaCl,
pH 6.0		 5.33
(= 원료 용액)
트라스투주맙 20 mM 히스티딘,
140 mM NaCl,
pH 6.0		 25
(= 원료 용액)
59일차에서의 TGI 및 TCR
군 TGI TCR
트라스투주맙 95 0.46
FAP-mu4-1BBL -17 0.99
트라스투주맙 + FAP-mu4-1BBL 132 0.23
TGI: 종양 성장 억제 => 100 미만의 TGI는 종양 퇴행을 의미하고, 100의 TGI는 종양 정체를 의미함.
TCR: 처리군 대 대조군 비 => 1의 TCR은 효과 부재를 의미하고, 0의 TCR은 완전한 종양 퇴행을 의미함.
실시예 6
CEA-4-1BBL 항원 결합 분자의 제조, 정제 및 특성규명
CEA-표적화된 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자를 국제 특허 출원 공개 WO 2016/075278 A1에 기재된 바와 같이 제조하였다.
특히, 1가 CEA-표적화된 및 비표적화된 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자를 제조하였다.
인간 CL 도메인에 융합된 이량체 4-1BB 리간드를 암호화하는 폴리펩티드를 놉상에 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인과 함께 인프레임 서브클로닝하였다(문헌[Merchant, Zhu et al. 1998, Nature Biotechnol. 16, 677-681]). 상기 4-1BB 리간드의 하나의 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 상기 인간 IgG1-CH1 도메인에 융합시켰다. 구축물 3.4에서, 쇄의 정확한 짝짓기를 개선시키기 위해서 하기의 돌연변이들을 상기 교차된 CH-CL(하전된 변체)에 추가로 도입시켰다: 인간 CL에 융합된 이량체 4-1BB 리간드에서, E123R 및 Q124K, 인간 CH1에 융합된 단량체 4-1BB 리간드에서, K147E 및 K213E.
CEA에 특이적인 결합제, 클론 T84.66-LCHA(CEACAM5)를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄와 인프레임 서브클로닝하였다. Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 WO 2012/130831에 기재된 방법에 따라 상기 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입시켜 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 없앴다. S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체 리간드-Fc 놉 쇄, 단량체 CH1 융합, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화된 항-CEA-Fc 홀 쇄 및 항-CEA 경쇄의 조합은 이종이량체의 생성을 허용하고, 상기 이종이량체는 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 CEA 결합 Fab를 포함한다(도 1의 1A와 유사, 항-FAP를 항-CEA로 대체).
WO 2016/075278에서의
해당 실시예		 구성 서열
1가 CEA(T84.66-LCHA)-4-1BBL
(하전된 변체)		 실시예 11.2.4
(구축물 5.4)		 서열번호 41, 서열번호 42
서열번호 82 및 서열번호 83
CEA-표적화된 및 비표적화된 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 제조 및 특성 규명은 WO 2016/075278의 실시예 11 내지 13에 상세 기재되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Combination therapy with targeted 4-1BB (CD137) agonists <130> P34719-WO <140> PCT/EP2019/056067 <141> 2019-03-12 <150> EP18161340.7 <151> 2018-03-13 <160> 99 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp 1 5 10 15 Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu 20 25 30 Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val 35 40 45 Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val 50 55 60 Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg 65 70 75 80 Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His 85 90 95 Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr 100 105 110 Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly 115 120 125 Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val 130 135 140 His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln 145 150 155 160 Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala 165 170 175 Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 180 <210> 2 <211> 170 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val 1 5 10 15 Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala 20 25 30 Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu 35 40 45 Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu 50 55 60 Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala 65 70 75 80 Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala 85 90 95 Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala 100 105 110 Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu 115 120 125 Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu 130 135 140 Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile 145 150 155 160 Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 165 170 <210> 3 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu 1 5 10 15 Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser 20 25 30 Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys 35 40 45 Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val 50 55 60 Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly 65 70 75 80 Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly 85 90 95 Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu 100 105 110 Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser 115 120 125 Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg 130 135 140 His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg 145 150 155 160 Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 165 170 175 <210> 4 <211> 203 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser 1 5 10 15 Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly 20 25 30 Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn 35 40 45 Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu 50 55 60 Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys 65 70 75 80 Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu 85 90 95 Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu 100 105 110 Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu 115 120 125 Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser 130 135 140 Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg 145 150 155 160 Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln 165 170 175 Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu 180 185 190 Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 195 200 <210> 5 <211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp 1 5 10 15 Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu 20 25 30 Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val 35 40 45 Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val 50 55 60 Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg 65 70 75 80 Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His 85 90 95 Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr 100 105 110 Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly 115 120 125 Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val 130 135 140 His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln 145 150 155 160 Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala 165 170 175 Gly Leu <210> 6 <211> 164 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val 1 5 10 15 Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala 20 25 30 Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu 35 40 45 Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu 50 55 60 Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala 65 70 75 80 Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala 85 90 95 Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala 100 105 110 Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu 115 120 125 Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu 130 135 140 Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile 145 150 155 160 Pro Ala Gly Leu <210> 7 <211> 169 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu 1 5 10 15 Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser 20 25 30 Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys 35 40 45 Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val 50 55 60 Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly 65 70 75 80 Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly 85 90 95 Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu 100 105 110 Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser 115 120 125 Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg 130 135 140 His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg 145 150 155 160 Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu 165 <210> 8 <211> 197 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser 1 5 10 15 Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly 20 25 30 Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn 35 40 45 Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu 50 55 60 Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys 65 70 75 80 Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu 85 90 95 Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu 100 105 110 Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu 115 120 125 Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser 130 135 140 Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg 145 150 155 160 Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln 165 170 175 Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu 180 185 190 Ile Pro Ala Gly Leu 195 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(28H1) CDR-H1 <400> 9 Ser His Ala Met Ser 1 5 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(28H1) CDR-H2 <400> 10 Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(28H1) CDR-H3 <400> 11 Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr 1 5 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(28H1) CDR-L1 <400> 12 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(28H1) CDR-L2 <400> 13 Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(28H1) CDR-L3 <400> 14 Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro Thr 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(4B9) CDR-H1 <400> 15 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(4B9) CDR-H2 <400> 16 Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(4B9) CDR-H3 <400> 17 Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr 1 5 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(4B9) CDR-L1 <400> 18 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(4B9) CDR-L2 <400> 19 Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(4B9) CDR-L3 <400> 20 Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr 1 5 <210> 21 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(28H1) VH <400> 21 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(28H1) VL <400> 22 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(4B9) VH <400> 23 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(4B9) VL <400> 24 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 25 <211> 378 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dimeric hu 4-1BBL (71-254) connected by (G4S)2 linker <400> 25 Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp 1 5 10 15 Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu 20 25 30 Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val 35 40 45 Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val 50 55 60 Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg 65 70 75 80 Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His 85 90 95 Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr 100 105 110 Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly 115 120 125 Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val 130 135 140 His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln 145 150 155 160 Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala 165 170 175 Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 180 185 190 Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu 195 200 205 Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val 210 215 220 Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala 225 230 235 240 Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu 245 250 255 Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu 260 265 270 Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala 275 280 285 Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala 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Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 500 505 510 Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 515 520 525 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 530 535 540 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro 545 550 555 560 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 565 570 <210> 95 <211> 1245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys 20 25 30 Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His 35 40 45 Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr 50 55 60 Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val 65 70 75 80 Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu 85 90 95 Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr 100 105 110 Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro 115 120 125 Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser 130 135 140 Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln 145 150 155 160 Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn 165 170 175 Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys 180 185 190 His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser 195 200 205 Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys 210 215 220 Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys 225 230 235 240 Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu 245 250 255 His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val 260 265 270 Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg 275 280 285 Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu 290 295 300 Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln 305 310 315 320 Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys 325 330 335 Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu 340 345 350 Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys 355 360 365 Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp 370 375 380 Pro Ala Ser Asn Thr Ala Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu 385 390 395 400 Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln 405 410 415 Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser 420 425 430 Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu 435 440 445 Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu 450 455 460 Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His 465 470 475 480 Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly 485 490 495 Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly 500 505 510 Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln 515 520 525 Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr 530 535 540 Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln 545 550 555 560 Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala 565 570 575 Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser 580 585 590 Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp 595 600 605 Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys 610 615 620 Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro 625 630 635 640 Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val 645 650 655 Leu Gly Val Val Phe Gly Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile 660 665 670 Arg Lys Tyr Thr Met Arg Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu 675 680 685 Pro Leu Thr Pro Ser Gly Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile 690 695 700 Leu Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala 705 710 715 720 Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val 725 730 735 Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys 740 745 750 Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly 755 760 765 Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val 770 775 780 Gln Leu Val Thr Gln Leu Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val 785 790 795 800 Arg Glu Asn Arg Gly Arg Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys 805 810 815 Met Gln Ile Ala Lys Gly Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val 820 825 830 His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His 835 840 845 Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu 850 855 860 Thr Glu Tyr His Ala Asp Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala 865 870 875 880 Leu Glu Ser Ile Leu Arg Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp 885 890 895 Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro 900 905 910 Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly 915 920 925 Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile 930 935 940 Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg 945 950 955 960 Glu Leu Val Ser Glu Phe Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe 965 970 975 Val Val Ile Gln Asn Glu Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser 980 985 990 Thr Phe Tyr Arg Ser Leu Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val 995 1000 1005 Asp Ala Glu Glu Tyr Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro 1010 1015 1020 Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg 1025 1030 1035 Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu 1040 1045 1050 Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser 1055 1060 1065 Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly 1070 1075 1080 Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro 1085 1090 1095 Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu 1100 1105 1110 Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu 1115 1120 1125 Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg 1130 1135 1140 Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu 1145 1150 1155 Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp 1160 1165 1170 Val Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr 1175 1180 1185 Pro Gln Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe 1190 1195 1200 Ser Pro Ala Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro 1205 1210 1215 Glu Arg Gly Ala Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala 1220 1225 1230 Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Gly Leu Asp Val Pro Val 1235 1240 1245 <210> 96 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH trastuzumab <400> 96 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 97 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL trastuzumab <400> 97 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 98 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH pertuzumab <400> 98 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 99 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL pertuzumab <400> 99 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (37)

  1. HER-2 표적화제와 조합으로 사용되고,
    종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인,
    암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 방법에 사용하기 위한 4-1BB(CD137) 작용제.
  2. 제1항에 있어서,
    HER-2 표적화제가 HER-2 항체, HER-2 이중특이성 항체 및/또는 HER-2 항체-약물 접합체를 포함하는, 4-1BB(CD137) 작용제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    HER-2 표적화제가 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신을 포함하는, 4-1BB(CD137) 작용제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 4-1BB(CD137) 작용제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    4-1BB(CD137)L의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 분자이고;
    상기 4-1BB(CD137)L의 엑토도메인은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열번호 1 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는,
    4-1BB(CD137) 작용제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편; 및
    섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 및 CEA(암배아 항원)로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인
    을 포함하는 항원 결합 분자인 4-1BB(CD137) 작용제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    IgG Fc 도메인, 구체적으로 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인 4-1BB(CD137) 작용제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 수용체에의 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인 4-1BB(CD137) 작용제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편; 및
    FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인
    을 포함하는 항원 결합 분자인 4-1BB(CD137) 작용제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인이,
    (a) (i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP); 또는
    (b) (i) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)
    을 포함하는 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인인, 4-1BB(CD137) 작용제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인이 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인이되,
    상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하거나;
    상기 FAP에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는,
    4-1BB(CD137) 작용제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
    (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
    를 포함하는 항원 결합 분자이되,
    상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는, 4-1BB(CD137) 작용제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP) 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는 FAP에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인, 및
    (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
    를 포함하는 항원 결합 분자이되,
    상기 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 4-1BB(CD137) 작용제.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 항원 결합 분자인 4-1BB(CD137) 작용제.
  15. 제1항 내지 제3항 및 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-FAP/항-4-1BB 이중특이성 항체인 4-1BB(CD137) 작용제.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편; 및
    CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인
    을 포함하는 항원 결합 분자인, 4-1BB(CD137) 작용제.
  17. 제1항 내지 제8항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인이 (a) (i) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA), 및 (iv) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함하는, CEA에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인인, 4-1BB(CD137) 작용제.
  18. 제1항 내지 제8항, 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인이 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함하는, CEA에 특이적으로 결합가능한 항원 결합 도메인인, 4-1BB(CD137) 작용제.
  19. 제1항 내지 제8항 및 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인; 및
    (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
    를 포함하는 항원 결합 분자이되,
    상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는, 4-1BB(CD137) 작용제.
  20. 제1항 내지 제8항 및 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCEA) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCEA)을 포함하는 CEA에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 Fab 도메인; 및
    (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드
    를 포함하는 항원 결합 분자이되,
    상기 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 4-1BB(CD137) 작용제.
  21. 제1항 내지 제8항, 제17항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-CEA/항-4-1BB 이중특이성 항체인 4-1BB(CD137) 작용제.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    HER-2 표적화제와 단일 조성물로 함께 투여되거나, 2개 이상의 상이한 조성물로 개별 투여되는 4-1BB(CD137) 작용제.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    HER-2 표적화제와 상승효과적으로 작용하는 4-1BB(CD137) 작용제.
  24. 질환, 특히 암의 조합, 순차 또는 동시 치료에 사용하기 위한,
    (A) 활성 성분으로서 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인 4-1BB 작용제 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제1 조성물; 및
    (B) 활성 성분으로서 HER-2 표적화제 및 약학적으로 허용되는 담체
    를 포함하는 제2 조성물을 포함하는 약학 제품.
  25. 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인 4-1BB 작용제; 및
    HER-2 표적화제
    를 포함하는 약학 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    HER-2 표적화제가 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신을 포함하는, 약학 조성물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    암의 치료 또는 암의 진행의 지연, 특히 진행성 및/또는 전이성 고형 암의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
  28. 증식성 질환, 특히 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키기 위한 약제의 제조에서 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 4-1BB 작용제와 HER-2 표적화제의 조합의 용도.
  29. 제28항에 있어서,
    HER-2 표적화제가 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신을 포함하는, 용도.
  30. 제29항에 있어서,
    대상에게 효과량의 4-1BB 작용제 및 효과량의 HER-2 표적화제를 투여하는 단계를 포함하는 상기 대상에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키는 방법으로서, 상기 4-1BB 작용제가 종양-관련 항원에 특이적으로 결합가능한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인, 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    HER-2 표적화제가 트라스투주맙, 페르투주맙 및/또는 트라스투주맙 엠탄신을 포함하는, 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서,
    4-1BB 작용제가 4-1BBL의 3개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는, 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제가 단일 조성물로 함께 투여되거나, 2개 이상의 상이한 조성물로 개별 투여되는, 방법.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    4-1BB 작용제 및 HER-2 표적화제가 정맥내 또는 피하 투여되는, 방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    4-1BB 작용제가 HER-2 표적화제에 동시, 선행 또는 후속 투여되는, 방법.
  36. 암이 HER-2 양성 암인, 제1항 내지 제23항 및 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 4-1BB 작용제(CD137) 또는 약학 조성물, 제28항 또는 제29항의 4-1BB 작용제와 HER-2 표적화제의 조합, 또는 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 방법.
  37. 암이 유방암, 난소암, 위암, 위-관련암, 식도암, 폐암, 자궁암, 침샘관 암종, 방광암, 자궁내막암, 췌장암, 결장암, 전립선암 및/또는 두경부암인, 제1항 내지 제23항 및 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 4-1BB 작용제(CD137) 또는 약학 조성물, 제28항 또는 제29항의 4-1BB 작용제와 HER-2 표적화제의 조합, 또는 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 방법.
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