MX2007000723A

MX2007000723A - Composicion de anticuerpos her2.

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Publication number: MX2007000723A
Application number: MX2007000723A
Authority: MX
Inventors: Yung-Hsiang Kao; Martin Vanderlaan
Original assignee: Genentch Inc
Priority date: 2004-07-22
Filing date: 2005-07-15
Publication date: 2007-03-12
Also published as: CN101023100A; HRP20141111T1; ECSP077261A; KR20180091967A; JO2984B1; KR20190126461A; PA8639701A1; AR050353A1; AU2005287404B2; KR20160096228A; KR20070038557A; PL1771482T3; EP1771482A2; MY169272A; GT200500199A; WO2006033700A2; CN101023100B; DK1771482T3; JP2016104760A; US20110117097A1

Abstract

Se describe una composicion que comprende un anticuerpo HER2 de especie principal que se une al dominio II de HER2, y una variante de secuencia de aminoacidos del mismo que comprende una extension delantera de la terminal amino. Tambien se describen formulaciones farmaceuticas que comprenden la composicion, y los usos terapeuticos para la composicion.

Description

COMPOSICIÓN DE ANTICUERPOS HER2 Campo de la Invención La presente invención se refiere a una composición que comprende un anticuerpo HER2 de especie principal que se une al dominio II de HER2, y una variante de secuencia de aminoácidos del mismo que comprende una extensión delantera de la terminal amino. La invención se refiere también a formulaciones farmacéuticas que comprenden la composición, y a los usos terapéuticos para la composición. Antecedentes de la Invención Anticuerpos HER2 La familia HER de receptores de tirosina cinasas son mediadores importantes del crecimiento, diferenciación y supervivencia celular. La familia de receptores incluye cuatro miembros distintos incluyendo el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ErbBl o HERÍ) , HER2 (ErbB2 o pl85neu) , HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4 o tyro2) . El EGFR codificado por el gen erbBl, se ha implicado causalmente en malignidades humanas. En particular, se ha observado un aumento en la expresión del EGFR en cáncer de mama, vejiga, pulmón, cuello y estómago así como en glioblastomas . El aumento en la expresión del receptor EGFR se asocia frecuentemente con un aumento en la producción del ligante EGFR, el factor de crecimiento alfa de transformación (TGF-V) , mediante las mismas células de tumor dando como resultado la activación del receptor por medio de una trayectoria estimuladora autócrina. Baselga y Mendelsohn, Pharmac. Ther., 64:127-154 (1994). Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra EGFR o sus ligantes, TGF-V y EGF, se han evaluado como agentes terapéuticos en el tratamiento de tales enfermedades. Ver, e.g., Baselga y Mendelsohn, supra; Masui et al., Cáncer Research 44:1002-1007 (1984); y Wu et al., J. Clin. Invest., 95:1897-1905 (1995) . El segundo miembro de la familia HER, pl85neu, se identificó originalmente como el producto del gen de transformación de neuroblastomas de ratas tratadas químicamente. La forma activada del proto-oncógeno neu resulta de una mutación de punto (valina a ácido glutámico) en la región transmembrana de la proteína codificada. La amplificación del homólogo humano de neu se observa en cánceres de mama y ovario y se correlaciona con un diagnóstico pobre (Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science 244:707-712 (1989); y Patente de E.U. No. 4,968,603). A la fecha, no se ha reportado ningún análogo de mutación de punto en el proto-oncógeno neu para tumores humanos . La sobreexpresión de HER2 (frecuentemente, pero no uniformemente debido a la amplificación del gen) también se ha observado en otros carcinomas incluyendo carcinomas de estómago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñon, colon, tiroides, páncreas y vejiga. Ver, entre otros, King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al., Lancet: 1:765-767 (1986); Fukushige et al., Molí Cell Biol., 6:955-958 (1986); Guerin et al., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohén et al., Oncogene 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cáncer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weiner et al., Cáncer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cáncer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cáncer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3:254-257 (1990); Aasland et al., Br. J. Cáncer 57:358-363 (1988); Williams et al., Pathology 59:46-52 (1991); y McCann et al., Cáncer, 65:88-92 (1990). HER2 puede sobreexpresarse en cáncer de próstata (Gu et al . , Cáncer Lett., 99:185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol., 28:827-33 (1997); Ross et al., Cáncer 79:2162-70 (1997); y Sadasivan et al., J. Urol., 150:126-31(1993)). Se han descrito anticuerpos dirigidos contra el pl85neu de rata y productos de proteína HER2 humana. Drebin y colegas han criado anticuerpos contra el producto del gen neu de rata, pl85neu. Ver, por ejemplo, Drebin et al., Cell 41:695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. , 198:277-290 (1991); y WO 94/22478. Drebin et al., Oncogene, 2:273-277 (1988) reportan que las mezclas de anticuerpos reactivos con dos regiones distintas de pl85neu da como resultado efectos anti-tumor en células NIH-373 neu-transformadas en ratones desnudos. Ver también Patente de E.U. No. 5,824,311 expedida en Octubre 20 de 1998. Hudziak et al., Mol. Cell. Biol., 9 (3) .1165-1172 describen la generación de un panel de anticuerpos HER2 que se caracterizaron utilizando la línea celular de tumor de mama humano SK-BR-3. Se determinó la proliferación celular relativa de las células SK-BR-3 después de la exposición a los anticuerpos mediante coloración con violeta cristal de las monocapas después de 72 horas. Utilizando este análisis, se obtuvo la máxima inhibición con el anticuerpo denominado 4D5 que inhibió la proliferación celular por 56%. Otros anticuerpos en el panel redujeron la proliferación celular a un grado menor en este análisis. Se encontró además que el anticuerpo 4D5 sensibiliza las líneas celulares de tumor de mama que sobreexpresan HER2 a los efectos citotóxicos de TNF-V. Ver también la Patente de E.U. No. 5,677,171 expedida en Octubre 14 de 1997. Los anticuerpos HER2 tratados en Hudziak et al., se caracterizan además en Fendly et al., Cáncer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts et al., In Vitro 26(3) :59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin. Immunol . , 11 (3) : 117-127 (1991); Kumar et al., Mol. Cell Biol., 11 (2) : 979-986 (1991); Lewis et al., Cáncer Immunol . Immunother., 37:255-263 (1993); Pietras et al., Oncogene, 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al., Cáncer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J.

- - Biol. Chem. 269 (20) : 14661-14665 (1994); Scott et al., J. Biol. Chem., 266:14300-5 (1991); D' souza et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 91:7202-7206 (1994); Lewis et al., Cáncer Research 56:1457-1465; y Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997) . Una versión humanizada recombinante del anticuerpo HER2 murino 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2 , Trastuzumab o HERCEPTIN®; Patente de E.U. No. 5,821,337) es clínicamente activa en pacientes con cánceres de mama metastásicos que sobreexpresan HER2 que han recibido extensa terapia anti-cáncer previa (Baselga et al., J. Clin. Oncol., 14:737-744 (1996) ) . Trastuzumab recibió la aprobación comercial de la Food and Drug Administration en Septiembre 25 de 1998, para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico cuyos tumores sobreexpresan la proteína HER2. Otros anticuerpos HER2 con diversas propiedades se han descrito en Tagliabue et al., Int. J. Cáncer 47:933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene 4:543-548 (1989); Maier et al., Cáncer Res., 51:5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (EUA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al., Cáncer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cáncer 53:401-408 (1993); WO 94/00136; Kasprzyk et al., Cáncer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al., Cáncer Res., 51:4575-4580 (1991); Shawver et al., Cáncer Res., 54:1367-1373 - (1994); Arteaga et al., Cáncer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. Chem., 267:15160-15167 (1992); Patente de E.U. No. 5,783,186; y Klapper et al., Oncogene 14:2099-2109 (1997) . La visualización de homología ha dado como resultado la identificación de otros dos miembros de la familia del receptor HER; HER3 (Patentes de E.U. Nos., 5,183m884 y 5,480,968 así como Kraus et al., PNAS (EUA) 86:9193-9197 (1989)) y HER4 (Solicitud de Patente EP No. 599,274; Plowman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:1746-1750 (1993); y Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)). Ambos receptores despliegan un aumento en la expresión en al menos algunas líneas celulares de cáncer de mama. Los receptores HER se encuentran generalmente en diversas combinaciones en células y se cree que la heterodimerización aumenta la diversidad de respuestas celulares para una variedad de ligantes HER (Earp et al., Breast Cáncer Research and Treatment 35:115-132 (1995)). El EGFR se une mediante seis ligantes diferentes; factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento alfa de transformación (TGF-V) , amfiregulina, factor de crecimiento epidérmico unido a heparina (HB-EGF) , betacelulina y epiregulina (Groenen et al., Growth Factors 11:235-257 (1994)). Una familia de proteínas heregulina resultante de la unión alternativa de un solo gen son ligantes para HER3 y - HER4. La familia heregulina incluye heregulinas alfa, beta y gamma (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); Patente de E.U. No. 5,641,869; y Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997) ) ; factores neu de diferenciación (NDFs) , factores de crecimiento glial (GGFs) ; actividad de inducción del receptor de acetilcolina (ARIA) ; y factor derivado de neuronas sensoras y motoras (SMDF) . Para una revisión ver Groenen et al., Growth Factores 11:235-237 (1994); Lemke, G. Molec. Y Cell Neurosci., 7:247-262 (1996) y Lee et al., Pharm. Rev. 47:51-85 (1995). Recientemente, se identificaron tres ligantes HER adicionales; neuregulina-2 (NRG-2) reportada por unirse ya sea a HER3 o HER4 (Chang et al., Nature 387 509-512 (1997); Y Carraway et al., Nature 387:512-516 (1997)); neuregulina-3 que se une a HER4 (Zhang et al., PNAS (EUA) 94 (18) : 9562-7 (1997)); y neuregulina-4 que se une a HER4 (Harari et al., Oncogene 18:2681-89 (1991)) HB-EGF, betacelulina y epiregulina también se unen a HER4. Aunque EGF y TGFV no se unen a HER2 , EGF estimula a EGFR y HER2 a la formación de un heterodímero, que activa a EGFR y da como resultado la transfosforilación de HER2 en el heterodímero. La dimerización y/o transfosforilación parece activar HER2 tirosina cinasa. Ver Earp et al., supra. De manera similar, cuando HER3 se encuentra co-expresado con HER2, se forma un complejo activo de señalización y los anticuerpos dirigidos contra HER2 son capaces de fracturar este complejo (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20:14661-14665 (1994)). Adicionalmente, la afinidad de HER3 para heregulina (HGF) aumenta a un estado de mayor afinidad cuando se co-expresa con HER2. Ver también, Levi et al., Journal of Neuroscience 15:1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 92:1431-1435 (1995); y Lewis et al., Cáncer Res., 56:1457-1465 (1996) con respecto al complejo de proteína HER2-HER3. HER4 , como HER3 , forma un complejo activo de señalización con HER2 (Carraway y Cantley, Cell 78:5-8 (1994) ) . Para dirigirse a la trayectoria de señalización de HER, se desarrolló rhuMAb 2C4 (Pertuzumab, OMNITARG™) como un anticuerpo humanizado que inhibe la dimerización de HER2 con otros receptores HER, inhibiendo así la fosforilación conducida por el ligante y la activación, y la activación en corriente descendente de las trayectorias RAS y AKT. En un juicio de fase I de Pertuzumab como único agente para el tratamiento de tumores sólidos, se trataron 3 sujetos con cáncer ovárico avanzado con pertuzumab. Se obtuvo una respuesta parcial duradera, y un sujeto adicional tuvo una enfermedad estable durante 15 semanas. Agus et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:192, Extracto 771 (2003). Composiciones de Variantes de Anticuerpo La Patente de E.U. No. 6,339.142 describe una composición de anticuerpo HER2 que comprende una mezcla de anticuerpo anti-HER2 y una o más variantes acídicas del mismo, en donde la cantidad de la(s) variante (s) acídica(s) es menor que aproximadamente 25%. Trastuzumab es el anticuerpo HER2 ejemplificado. Reid et al., Poster presentado en Well Characterized Pharmaceuticals Conference (Enero 2003) , "Effects of Cell Culture Process Changes on Humanized Antibody Characteristics" describen una composición de anticuerpo IgGl humanizado no denominada con heterogenicidades de terminación N debidas a combinaciones del péptido de señal VHS, glutamina de terminación N, y ácido piroglutámico en su cadena pesada. Reed et al., "The Ideal Chromatographic Antibody Characterization Method" Poster presentado en IBC Antibody Production Conference (Febrero, 2002) , reportan una extensión VHS en la cadena pesada de E25, un anticuerpo anti-IgE humanizado. Rouse et al . , Poster presentado en WCBP "Top Down" Glycoprotein Characterization by High Resolution Mass Spectrometry and its Application to Biopharmaceutical Development" (Enero 69, 2004) describen una composición de anticuerpo monoclonal con heterogenicidad de terminación N resultante de residuos de péptido de señal "3AHS o "2HS en su cadena ligera. En una presentación en IBC Meeting (Septiembre, 2000) "Strategic Use of Comparability Studies and Assays for Well Characterized Biologicals" , Jill Porter trató una forma de elución tardía de ZENAPAX™ con tres residuos extra de aminoácidos en su cadena pesada . Sumario de la Invención La presente invención se refiere a una composición que comprende anticuerpo de especie principal HER2 que se une al dominio II de HER2 , y una variante de secuencia de aminoácidos del mismo que comprende una extensión delantera de la terminal amino. Adicionalmente, la invención proporciona una composición que comprende una mezcla de especie principal del anticuerpo HER2 que comprende secuencias ligeras variables y pesadas variables en las SEQ ID Nos. 4 y 4, respectivamente, y una variante de secuencia de aminoácidos del anticuerpo de especie principal que comprende una extensión delantera de terminación VHS-amino unida a uno o dos dominios ligeros variables del mismo, en donde aproximadamente 1% a aproximadamente 20% de las moléculas de anticuerpo en la composición comprenden una extensión delantera de terminación VHS-amino. La invención se refiere además a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID No. 23. 0 una variante deamidada y/u oxidada de la misma, así como un anticuerpo que comprende (a) una cadena ligera que comprende - ese polipéptido, y (b) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 24 y una variante deamidada y/u oxidada de la SEQ ID NO. 16 o la SEQ ID NO. 24. La invención se refiere también a una formulación farmacéutica que comprende la composición en un vehículo farmacéuticamente aceptable, y un método para tratar cáncer que expresa HER2 en un paciente, que comprende la administración de la formulación farmacéutica al paciente en una cantidad efectiva para tratar el cáncer. Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 proporciona un esquema de la estructura de proteína HER2 , y secuencias de aminoácidos para los Dominios I-IV (SEQ ID Nos. 19-22, respectivamente) del dominio extracelular de la misma. Las Figuras 2A y 2B ilustran alineaciones de las secuencias de aminoácidos de los dominios ligero variable (VL) (Figura 2A) y pesado variable (VH) (Figura 2B) del anticuerpo monoclonal murino 2C4 (SEQ ID Nos. 1 y 2, respectivamente) ; los dominios VL y VH de la versión 2C4 humanizada 574 (SEQ ID Nos. 3 y 4, respectivamente), y las estructuras de consenso VL y VH humanas (hum 61, subgrupo I kappa ligero; humlll, subgrupo III pesado) (SEQ ID Nos. 5 y 6, respectivamente) . Los asteriscos identifican las diferencias entre la versión 2C4 humanizada 574 y el anticuerpo monoclonal 2C4 murino o entre la versión 2C4 humanizada 574 y la estructura humana. Las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) se encuentran en corchetes. Las Figuras 3A y 3B muestran las secuencias de aminoácidos de cadena ligera de Pertuzumab (SEQ ID No. 15) y de cadena pesada (SEQ ID No. 16) . Las CDRs se muestran en negrita. El residuo de carbohidrato se encuentra unido a Asn 299 de la cadena pesada. Las Figuras 4a y 4B muestran las secuencias de aminoácidos de cadena ligera de Pertuzumab (SEQ ID No. 17) y de cadena pesada, incluyendo cada una, una secuencia intacta de péptidos de señal de terminal amino (SEQ ID No. 18) . La Figura 5 ilustra esquemáticamente, la unión de 2C4 en el sitio heterodimérico de unión de HER2 , evitando así la heterodimerización con EGFR o HER3 activado. La Figura 6 ilustra el acoplamiento de HER2/HER3 a las trayectorias MAPK y Akt . La Figura 7 compara las actividades de Trastuzumab y Pertuzumab. Las Figuras 8A y 8B muestran el espectro de masa reconstruido de la cadena ligera de Pertuzumab reducida (Figura 8A) y la cadena pesada (Figura 8B) . Las Figuras 9A y 9B ilustran análisis de cromatografía de intercambio catiónico de Pertuzumab natural - (Figura 9a) y Pertuzumab CPB-digerido (Figura 9B) . La Figura 10 muestra análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de Pertuzumab. La Figura HA y 11B muestran análisis CE-SDS-LIF de Pertuzumab reducido (Figura HA) y un Pertuzumab intacto (Figura 11B) . Las Figuras 12A y 12B ilustran mapas trípticos de péptido de Pertuzumab (Figura 12A) , y mapas de péptido LYS-C de Pertuzumab (Figura 12B) . La Figura 13 muestra análisis CE de oligosacáridos de unión N liberados de Pertuzumab. La Figura 14 muestra estructuras de oligosacárido comúnmente observadas en anticuerpos IgG. La Figura 15 ilustra el espectro de masa MALDI-TOF en modo positivo de oligosacáridos neutros liberados de Pertuzumab. Las Figuras 16A y 16B muestran las secuencias de aminoácidos de cadena ligera Trastuzumab (SEQ ID No. 13) y de cadena pesada (SEQ ID No. 14) . Las Figuras 17A y 17B ilustran una secuencia variante de cadena ligera de Pertuzumab (SEQ ID No. 23) y una secuencia variante de cadena pesada de Pertuzumab (SEQ ID No. 24) . Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas I. Definiciones El término "anticuerpo de especie principal" en la presente, se refiere a la estructura de secuencia de aminoácidos de anticuerpo en una composición, que es la molécula de anticuerpo cuantitativamente predominante en la composición. Preferentemente el anticuerpo de especie principal es un anticuerpo HER2 , tal como un anticuerpo que se une al Dominio II de HER2 , un anticuerpo que inhibe la dimerización de HER más efectivamente que Trastuzumab, y/o un anticuerpo que se une a un sitio de unión heterodimérico de HER2. La modalidad preferida en la presente del anticuerpo de especie principal es uno que comprende las secuencias de aminoácidos ligeras variables y pesadas variables en las SEQ ID Nos. 3 y 4, y más preferentemente que comprenden las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y de cadena pesada en las SEQ ID Nos. 15 y 16 (Pertuzumab) . Un anticuerpo "variante de secuencia de aminoácidos" en la presente es un anticuerpo con una secuencia de aminoácidos que difiere de un anticuerpo de especie principal. Ordinariamente, las variantes de secuencia de aminoácidos poseerán al menos aproximadamente el 70% de homología con el anticuerpo de especie principal, y preferentemente, serán al menos 80%, y más preferentemente al menos 90% homólogos con el anticuerpo de especie principal. Las variantes de secuencia de aminoácidos poseen sustituciones, supresiones y/o adiciones en ciertas - - posiciones dentro de o adyacentes a la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de especie principal. Ejemplos de variantes de secuencia de aminoácidos en la presente incluyen una variante acídica (e.g., una variante de anticuerpo deamidada) , una variante básica, el anticuerpo con una extensión delantera de la terminal amino (e.g., VHS-) en una o dos de sus cadenas ligeras, anticuerpo con un residuo de lisina de terminación C en una o dos de sus cadena pesadas, anticuerpo con uno o más residuos de metionina oxidados, etc., e incluyen combinaciones o variaciones de las secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas y/o ligeras. La variante de anticuerpo de particular interés en la presente, es el anticuerpo que comprende una extensión delantera de la terminal amino en una o dos de sus cadenas ligeras, opcionalmente, comprendiendo además otra secuencia de aminoácidos y/o diferencias de glicosilación en relación con el anticuerpo de especie principal. Un anticuerpo "variante de glicosilación" en la presente, es un anticuerpo con uno o más residuos carbohidrato unidos al mismo, que difieren del uno o más residuos carbohidrato unidos a un anticuerpo de especie principal. Ejemplos de variantes de glicosilación en la presente incluyen anticuerpos con una estructura de oligosacárido Gl o G2 , en lugar de una estructura de oligosacárido GO, unida a una región Fc del mismo, anticuerpos con uno o más residuos carbohidratos unidos a una o dos de sus cadenas ligeras, anticuerpos sin carbohidrato unido a una o dos de las cadenas pesadas del anticuerpo, etc., así como combinaciones de tales alteraciones de glicosilación. Cuando el anticuerpo tiene una región Fc, puede unirse una estructura de oligosacárido tal como la mostrada en la Figura 14 en la presente, a una o dos cadenas pesadas del anticuerpo, e.g., en el residuo 299. Para Pertuzumab, GO fue la estructura de oligosacárido predominante, con otras estructuras oligosacárido tales como GO-F, G-l, Man5, Man6, Gl-1, Gl(l-6), Gl(l-3) y G2 encontradas en menores cantidades en la composición de Pertuzumab. A menos que se indique de otra manera, una "estructura de oligosacárido Gl" en la presente incluye estructuras Gl(l-6 y Gl(l-3). Una "extensión delantera de la terminal amino" en la presente, se refiere a uno o más residuos aminoácido de la secuencia delantera de terminal amino que se encuentran presentes en la terminal amino de cualquiera o más de las cadenas pesadas o ligeras de un anticuerpo. Una extensión delantera de la terminal amino ejemplar comprende o consiste de tres residuos de aminoácido, VHS, presentes en una o ambas cadenas ligeras de una variante de anticuerpo. Un anticuerpo "deaminado" es uno en el cual uno o - - más de sus residuos asparagina se ha derivatizado, e.g., a un ácido aspártico, una succinimida o a un ácido iso-aspártico. "Homología" se define como el porcentaje de residuos en la variante de secuencia de aminoácidos idénticos después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr la máxima homología porcentual. Son muy conocidos en la técnica los métodos y programas de cómputo para la alineación. Un programa de cómputo tal es "Align 2", perteneciente a Genentech Inc., que se presentó con documentación de usuario en la United States Copyright Office, Washington, DC 20559, en Diciembre 10 de 1991. Para los propósitos en la presente, "análisis de intercambio catiónico" se refiere a cualquier método mediante el cual una composición que comprende dos o más compuestos se separa en base a las diferencias de carga utilizando un permutador de catión. Un permutador de catión comprende generalmente grupos de carga negativa unidos de manera covalente. Preferentemente, el permutador de catión en la presente es un permutador de catión débil y/o comprende un grupo funcional carboxilato. Tal como la columna de intercambio catiónico PROPAC WCX-10™, comercializada por Dionex. Un "receptor HER" es una tirosina cinasa receptora de proteína que pertenece a la familia del receptor HER e incluye receptores EGFR, HER2 , HER3 y HER4 y otros miembros - de esta familia identificados en el futuro. El receptor HER comprenderá generalmente un dominio extracelular, que puede unirse a un ligante HER; un dominio transmembrana lipófilo; un dominio tirosina cinasa intracelular conservado; y un dominio de señalización de terminación carboxilo que alberga diversos residuos tirosina que pueden fosforilarse. Preferentemente, el receptor HER es un receptor HER humano de secuencia natural . El dominio extracelular de HER2 comprende cuatro dominios, Dominio I (residuos aminoácido de aproximadamente 1-195) , Dominio II (residuos aminoácido de aproximadamente 196-319) , Dominio III (residuos aminoácido de aproximadamente 320-488) , y Dominio IV (residuos aminoácido de aproximadamente 489-630) (numeración de residuos sin el péptido de señal). Ver Garrett et al., Mol. Cell., 11:495-505 (2003), Cho et al., Nature 421:756-760 (2003), Franklin et al., Cáncer Cell 5:317-328 (2004), o Plowman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 90:1746-1750 (1993). Ver también, Figura 1 en la presente. Los términos "ErbBl", "HERÍ", "receptor del factor de crecimiento epidérmico" y "EGFR" se utilizan en la presente de manera intercambiable y se refieren al EGFR descrito, por ejemplo, en Carpenter et al., Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987), incluyendo sus formas mutantes de origen natural (e.g., un EGFR mutante de supresión como en - Humphrey et al., PNAS (EUA) 87:4211 (1990). ErbBl se refiere al gen que codifica para el producto de proteína EGFR. Las expresiones "Erb2" y "HER2" se utilizan de manera intercambiable en la presente, y se refieren a la proteína HER2 humana descrita, por ejemplo, en Semba et al., PNAS (EUA) 82:6497-6501 (1985) y Yamamoto et al., Nature 319:230-234 (1986) (número de acceso Genebank X03363) . El término "erbB2" se refiere al gen que codifica para ErbB2 humano, y "neu" se refiere al gen que codifica para pl85neu de rata. HER2 preferido es HER2 humano de secuencia natural. "ErbB3" y "HER3" se refieren al polipéptido receptor como se describe, por ejemplo, en las Patentes de E.U. Nos., 5,183,884 y 5,480,968 así como Kraus et al., PNAS (EUA) 86:9193-9197 (1989). Los términos "ErbB4" y "HER4" en la presente, se refieren al polipéptido receptor como se describe, por ejemplo, en la Solicitud de Patente EP No. 599,274; Plowman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 90:1746-1750 (1993); y Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993), incluyendo sus isoformas, e.g., como se describen en la WO 99/19488 publicada en Abril 22 de 1999. Por "ligante HER" se entiende un polipéptido que se une a y/o activa un receptor HER. El ligante HER de particular interés en la presente es un ligante HER humano de secuencia natural tal como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Savage et al., J. Biochem. 247_7612-7621 (1972)); factor de crecimiento alfa de transformación (TGF-V) (Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)); amfiregulina, también conocida como factor de crecimiento autócrino de schwanoma o queratinocito (Shoyab et al., Science 243:1074-1076; Kimura et al., Nature 348:257-260 (1990); Y Cook et al., Mol. Cell Biol., 11:2547-2557 (1991); betacelulina (Shing et al., Science 259:1604-1607 (1993); y Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)); factor de crecimiento epidérmico unido a heparina (HB-EGF) (Higashima et al., Science 251:936-939 (1991)); epiregulina (Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270:7405-7500 (1995); y Komurasaki et al., Oncogene 15:2841-2848 (1997)); una heregulina (ver abajo); neuregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature 387:512-516 (1997)); neuregulina-3 (Zhang et al., Proc. Nati. Acad. Sci 94:9562-9567 (1997)); neuregulina-4 (NGR-4) (Harari et al., Oncogene 18:2681-89 (1999)) o cripto (CR-1) (Kannan et al., J. Biol. Chem., 272(6) :3330-3335 (1997) ) . Los ligantes HER que se unen a EGFR incluyen EGF, TGF-V, amfiregulina, betacelulina, HB-EGF y epiregulina. Los ligantes HER que se unen a HER3 incluyen heregulinas. Los ligantes HER capaces de unirse a HER4 incluyen betacelulina, epiregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 y heregulinas . "Heregulina" (HRG) cuando se utiliza en la presente, se refiere a un polipéptido codificado por el producto del gen de heregulina como se describe en la Patente de E.U. No. 5,641,869 o Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993) . Ejemplos de heregulinas incluyen heregulina-V, heregulina-3l, heregulina-32 , heregulina-33 (Holmes et al., Science 256:1205-1210 (1992); y la Patente de E.U. No. 5,641,869); factor neu de diferenciación (NDF) (Peles et al., Cell 69:205-216 (1992)); actividad de inducción del receptor acetilcolina (ARIA) (Falls et al., Cell 72:801-815 (1993)); factores de crecimiento glial (GGFs) (Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)); factor derivado de neurona sensorial y motora (SMDF) (Ho et al., J. Biol. Chem., 270:14523-14532 (1995)); (-heregulina (Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997)). El término incluye fragmentos biológicamente activos y/o variantes de secuencia de aminoácidos de un polipéptido HRG de secuencia natural, tal como un fragmento de dominio similar a EGF de los mismos (e.g. , HRG3l177.244) . Un "dímero HER" en la presente es un dímero no covalentemente asociado que comprende al menos dos diferentes receptores HER. Tales complejos pueden formarse cuando una célula que expresa dos o más receptores HER se expone a un ligante HER y puede aislarse mediante inmunoprecipitación y analizarse mediante SDS-PAGE como se describe en Sliwkowsky et al., J. Biol. Chem., 269 (20) : 14661-14665 (1994), por ejemplo. Ejemplos de tales dímeros HER incluyen heterodímeros EGFR-HER2, HER2-HER3 y HER3-HER4. Además, el dímero HER puede comprender dos o más receptores HER2 combinados con un receptor HER diferente, tal como HER3 , HER4 o EGFR. Otras proteínas tales como una subunidad de receptor citosina (e.g., gpl30) pueden encontrarse asociadas con el dímero . Un "sitio de unión heterodimérico" en HER2 , se refiere a una región en el dominio extracelular de HER2 que hace contacto o tiene interfaz con una región en el dominio extracelular de EGFR, HER3 o HER4 al formular un dímero con el mismo. La región se encuentra en el Dominio II de HER2. Franklin et al., Cáncer Cell 5:317-328 (2004). "Activación HER" o "activación HER2" se refiere a la activación, o fosforilación, de cualquiera o más receptores HER, o receptores HER2. Generalmente, la activación HER da como resultando la transducción de señal (e.g., la ocasionada por un dominio cinasa intracelular de un receptor HER fosforilando residuos tirosina en el receptor HER o un polipéptido sustrato) . La activación HER puede mediarse por la unión del ligante HER a un dímero HER que comprende el receptor HER de interés. La unión del ligante HER a un dímero HER puede activar un dominio cinasa de uno o más de los receptores en el dímero y por lo cual da como resultado la fosforilación de residuos tirosina en uno o más de los receptores HER y/o la fosforilación de los residuos tirosina en polipéptido (s) de sustrato adicional (es) , tales como cinasas intracelulares Akt o MAPK. El término "anticuerpo" en la presente se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (e.g., anticuerpos biespecíficos) formados de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo, siempre que exhiban la actividad biológica deseada. El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, i.e., los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítope, excepto por posibles variantes que puedan surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, tales como aquellas variantes descritas en la presente. En contraste con las preparaciones de anticuerpo policlonal que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra una sola determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque no se encuentran contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe entenderse que requiere la producción del anticuerpo por algún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizan de acuerdo con la presente invención, pueden producirse mediante el método hibridoma primeramente descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) , o pueden producirse mediante métodos de ADN recombinante (ver, e.g., Patente de E.U. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpo fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homologa para las secuencias correspondiente en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico a u homólogo para las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Patente de E.U. No. 4,816,567; y Morrison et al., - - Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión de antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (e.g., mono del viejo mundo, simio, etc.) y secuencias de región constante humana. Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, comprendiendo preferentemente su región de unión de antígeno o variable. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diabodies; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmento (s) de anticuerpo. Un "anticuerpo intacto" es uno que comprende una región variable de unión de antígeno así como un dominio constante de cadena ligera (C ) y dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia natural (e.g., dominios constantes de secuencia natural humana) o variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferentemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efector, y comprende una estructura de oligosacárido unida a una o dos de sus cadenas pesadas . Las "funciones efector" del anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc - (una región Fc de secuencia natural o una región Fc variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. Ejemplos de funciones efector del anticuerpo incluyen unión Clq; citotoxicidad dependiente del complemento; unión del receptor Fc; citotoxicidad mediada por las células, dependiente del anticuerpo (ADCC); fagocitosis; sub-regulación de los receptores de superficie celular (e.g., receptor de célula B; BCR) , etc. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden asignarse a diferentes "clases" . Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estos pueden dividirse además en "subclases" (isotipos), e.g., IgGl, IgG2 , IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan V, *, ,, (, y :, respectivamente. Son muy conocidas las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas. "Citotoxicidad mediada por las células, dependiente del anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por la célula en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcRs) (e.g., células destructoras naturales (NK) , neutrófilos, y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula objetivo y - subsecuentemente ocasionan la lisis de la célula objetivo. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan solamente Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Rc(RII y Fc(RIII. La expresión FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol . , 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, puede llevarse a cabo un análisis ADCC in vitro, tal como el descrito en la Patente de E.U. No. 5,500,362 o 5,821,337. Las células efector útiles para tales análisis incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células destructoras naturales (NK) . Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede establecerse in vivo, e.g., en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al., PNAS (EUA) 95:652-656 (1998) . Las "células efector humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y efectúan funciones efector. Preferentemente, las células expresan al menos Fc(RIII y efectúan una función efector ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células destructoras naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; siendo preferidas las PBMCs y células NK. Las células efector pueden aislarse de una fuente natural de las mismas, e.g., de - sangre o PBMCs como se describe en la presente. Los términos "receptor Fc" o "FcR" se utilizan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia natural. Además, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII, incluyendo variantes alélicas y formas unidas alternativamente de estos receptores. Los receptores Fc(RII incluyen Fc(RIIA (un "receptor de activación") y Fc(RIIIB (un "receptor de inhibición) , que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos . El receptor de activación Fc(RIIA contiene un motivo de activación a base de inmunorreceptor tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición Fc(RIIB contiene un motivo de inhibición a base de inmunorreceptor tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico (ver, revisión M. en Daéron, Annu. Rev. Immunol . , 15:203-234 (1997)). Los FcRs se revisan en Ravetch y Kinet Annu. Rev. Immunol . , 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Otros FcRs, incluyendo aquellos identificados en el futuro, se encuentran abarcados en el término "FcR" en la presente. El término incluye también el receptor neonatal, FcRn, responsable de la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al., J.

Immunol . 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol . , 24:249 (1994) ) . "Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula para lisar un objetivo en presencia del complemento. La trayectoria de activación del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema de complemento (Clq) a una molécula (e.g., un anticuerpo) complejada con un antígeno cognado. Para establecer la activación del complemento, puede llevarse a cabo un análisis CDC, e.g., como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods, 202:163 (1996). Los "anticuerpos naturales" son comúnmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se encuentra unida a una cadena pesada mediante una unión disulfuro covalente, aunque el número de uniones disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracatenarios regularmente espaciados.

Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes . Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera se encuentra alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera se encuentra alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos de aminoácido particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en la unión y la especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se encuentra uniformemente distribuida a lo largo de los dominios variables de anticuerpos. Ésta se encuentra concentrada en tres segmentos llamados regiones hipervariables en los dominios variables tanto de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan las regiones de estructura (FRs) . Los dominios variables de cadenas naturales pesada y ligera comprenden cada uno cuatro FRs, adoptando en gran medida una configuración de lámina 3, conectada por tres regiones hipervariables, que forman circuitos que conectan y en algunos casos forman parte de la estructura de lámina 3. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen unidas en cercana proximidad por las FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena contribuyen a la formación del sitio de unión de antígeno de anticuerpos (ver, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991) ) . Los dominios constantes no se encuentran directamente implicados en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diversas funciones efector, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . El término "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente, se refiere a los residuos aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión de antígeno. La región hipervariable comprende generalmente residuos aminoácido de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (e.g., residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) ) y/o los residuos de un "circuito hipervariable" (e.g., residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) ) . Residuos de "región de estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los - residuos de región hipervariable como se define en la presente . La digestión papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión de antígeno idénticos llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio único de unión de antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión de antígeno y aún es capaz de reticular el antígeno. "Fv" es el mínimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento de antígeno y de unión de antígeno. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y una cadena ligera en estrecha asociación no covalente. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión de antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y unir el antígeno, aunque a una menor afinidad que el sitio de unión completo. El fragmento Fab contiene también el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante - (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en la terminación carboxi del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región de articulación del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en la cual el (los) residuo (s) cisteína de los dominios constantes contienen al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de articulación entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de cualquier especie invertebrada pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos llamados kappa (6) y lambda (8) en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenarios" o "scFv" comprenden los dominio VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios se encuentran presentes en una sola cadena polipéptido. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende además una unión polipéptido entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión de antígeno. Para revisión del scFv ver, Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Roseburg y Moore, eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). Los fragmentos scFv de anticuerpo HER2 se describen en la WO 93/16185; Patente de E.U. No. 5,571,894; y Patente de E.U. o. 5,587,458. El término "diabodies" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión de antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio pesado variable (VH) conectado a un dominio ligero variable (V) en la misma cadena polipéptido (VH-VL) . Utilizando una unión demasiado corta para permitir la formación de pares entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza a los dominios a formar pares con los dominios complementarios de otra cadena y a crear dos sitios de unión de antígeno. Los diabodies se describen más completamente, por ejemplo, en la EP 404,097; WO 93/11161 y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:6444-6448 (1993) . Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (e.g., de roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen mínima secuencia derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en las cuales los residuos de una región hipervariable se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunas instancias, los residuos de región de estructura (FR) de inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no - humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo recipiente o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se producen para refinar adicionalmente el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los circuitos hipervariables corresponden a los de inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FRs son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc) , típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) . Los anticuerpos HER2 humanizados incluyen huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 o Trastuzumab (HERCEPTIN®) como se describe en la Tabla 3 de la Patente de E.U. No. 5,821,337 expresamente incorporada en la presente por la referencia; anticuerpos humanizados 520C9 (WO 93/21319) y humanizados 2C4 como se describe en la presente. Para los propósitos en la presente, "Trastuzumab", "HERCEPTIN®" y "huMAb4D5-8" se refieren a un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada en las SEQ ID NOS. 13 y 14, respectivamente. En la presente, "Pertuzumab", "OMNITARG™" y "rhuMAb2C4" se refieren a un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos ligeras variables y pesadas variables en las SEQ ID Nos. 3 y 4, respectivamente, Cuando Pertuzumab es un anticuerpo intacto, comprende preferentemente las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y de cadena pesada en las SEQ ID Nos. 15 y 16, respectivamente . Un "anticuerpo desnudo" es un anticuerpo (como se define en la presente) que no se encuentra conjugado a una molécula heteróloga, tal como un residuo citotóxico o radio marca. Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su ambiente natural . Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solubles proteináceos y no proteináceos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más del 95% por peso del anticuerpo como se determina mediante el método Lowry, y más preferentemente a más del 99% por peso, (2) a un - grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos de terminación N o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) a homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o no reducción utilizando azul Coomassie o, preferentemente, colorante de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes dado que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no se encontrará presente. Sin embargo, ordinariamente, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación. Un anticuerpo HER2 que "inhibe la dimerización de HER más efectivamente que Trastuzumab" es uno que reduce o elimina los dímeros HER más efectivamente (por ejemplo, al menos aproximadamente 2 veces más efectivamente) que Trastuzumab. Preferentemente, tal anticuerpo inhibe la dimerización de HER2 al menos aproximadamente tan efectivamente como un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste del anticuerpo monoclonal murino intacto 2C4, un fragmento Fab de anticuerpo monoclonal murino 2C4, Pertuzumab intacto, y un fragmento Fab de Pertuzumab. Puede evaluarse la inhibición de la dimerización de HER estudiando directamente los dímeros HER, o evaluando la activación de HER, o la señalización en corriente descendente, que resulta de la dimerización de HER, y/o evaluando el sitio de unión de - anticuerpo-HER2, etc. Se describen análisis para visualizar anticuerpos con la capacidad de inhibir la dimerización de HER más efectivamente que Trastuzumab, en Agus et al., Cáncer Cell, 2:127-137 (2002) y WO 01/00245 (Adams et al.). Solo a modo de ejemplo, puede analizarse por la inhibición de la dimerización de HER evaluando, por ejemplo, la inhibición de la formación del dímero HER (ver, e.g., Figura 1A-B de Agus et al., Cáncer Cell, 2:127-137 (2002) y WO 01/00245=; reducción en la activación del ligante HER de células que expresan dímeros HER (WO 01/00245 y Figura 2A-B de Agus et al., Cáncer Cell, 2:127-137 (2002), por ejemplo); bloqueando la unión del ligante HER a células que expresan dímeros HER WO 01/00245 y Figura 2E de Agus et al., Cáncer Cell, 2:127-137 (2002), por ejemplo; inhibición del crecimiento celular de células de cáncer (e.g., células MCF7 , MDA-MD-134, ZR-75-1, MD-MB-175, T-47D) que expresan dímeros HER en presencia (o ausencia) del ligante HER (WO 01/00245 y Figuras 3A-D de Agus et al., Cáncer Cell, 2:127-137 (2002), por ejemplo); inhibición de señalización en corriente descendente (por ejemplo inhibición de la fosforilación AKT dependiente de HRG o inhibición de fosforilación MAPK dependiente de HRG o TGFV) (ver, WO 01/00245 y Figura 2C-D de Agus et al., Cáncer Cell, 2:127-137 (2002), por ejemplo). También puede establecerse si el anticuerpo inhibe la dimerización de HER estudiando el sitio de unión de anticuerpo-HER2, por ejemplo, evaluando una estructura o modelo, tal como una estructura cristalina, del anticuerpo unida a HER2 (Ver, por ejemplo, Franklin et al., Cáncer Cell 5:317-328 (2004)). El anticuerpo HER2 puede "inhibir la fosforilación AKT dependiente de HRG" y/o inhibir la "fosforilación MAPK dependiente de HRG o TGFV" más efectivamente (por ejemplo, al menos 2 veces más efectivamente) que Trastuzumab (ver Agus et al., Cáncer Cell, 2:127-137 (2002), y WO 01/00245, por ejemplo) . El anticuerpo HER2 puede ser uno que "no inhibe la división ectodominio de HER2" (Molina et al., Cáncer Res., 61:4744-4749 (2001) ) . Un anticuerpo HER2 que se "une a un sitio de unión heterodimérico" de HER2 , se une a residuos en el dominio II (y opcionalmente se une también a residuos en otro de los dominios del dominio extracelular de HER2 , tales como los dominios I y III) , y puede obstruir estéricamente, al menos a algún grado, la formación de un heterodímero HER2-EGFR, HER2-HER3, o HER2-HER4. Franklin et al., Cáncer Cell 5:317-328 (2004) caracterizan la estructura cristalina de HER2-Pertuzumab depositada con el RCSB Protein Data Bank (ID Código IS78) , ilustrando un anticuerpo ejemplar que se une al sitio de unión heterodimérico de HER2. Un anticuerpo que "se une al dominio II" de HER2 , se une a residuos en el dominio II y opcionalmente a residuos - en otro(s) dominio (s) de HER2, tales como los dominios I y II. Preferentemente, el anticuerpo que se une al dominio II se une a la unión entre los dominios I, II y III de HER2. Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula de cáncer que expresa HER ya sea in vitro o in vivo. De esta manera, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células que expresan HER en fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean el progreso del ciclo (en una ubicación diferente a la fase S) , tales como agentes que inducen el arresto de Gl y el arresto de fase M. Los bloqueadores clásicos de fase M incluyen los vincas (vincristina y vinblastina), taxanos, e inhibidores topo II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposida y bleomicina. Los agentes que arrestan Gl también se derivan en el arresto de fase S, por ejemplo, los agentes de alquilación de ADN tales como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluoroacil, y ara-C. Puede encontrarse información adicional en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn e Israel, eds. Capítulo 1, titulada "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), - especialmente p. 13. Ejemplos de anticuerpos "inhibidores del crecimiento" son aquellos que se unen a HER2 e inhiben el crecimiento de las células de cáncer que sobreexpresan HER2. Los anticuerpos HER2 inhibidores del crecimiento preferidos inhiben el crecimiento de células de tumor de mama SK-BR-3 en cultivo celular por más del 20%, y preferentemente por más del 50% (e.g., de aproximadamente 50% a aproximadamente 100%) a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 :g/ml, en donde la inhibición del crecimiento se determina seis días después de la exposición de las células SK-BR-3 al anticuerpo (ver Patente de E.U. No. 5,677,171 expedida en Octubre 14 de 1997) . El análisis de inhibición de crecimiento de la célula SK-BR-3 se describe en mayor detalle en esa patente y a continuación. El anticuerpo inhibidor del crecimiento preferido es una variante humanizada del anticuerpo monoclonal murino 4D5 , e.g., Trastuzumab. Un anticuerpo que "induce apoptosis" es uno que induce la muerte celular programada como se determina por la unión de anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (llamadas cuerpos apoptóticos) . La célula es comúnmente una que sobreexpresa el receptor HER2. Preferentemente, la célula es una célula de tumor, e.g., célula de mama, ovario, estómago, - endometrio, glándula salival, riñon, colon, tiroides, páncreas o vejiga. In vitro, la célula puede ser una célula SK-BR-3, BT474, Calu 3, célula MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SK0V3. Se encuentran disponibles diversos métodos para evaluar los eventos celulares asociados con apoptosis. Por ejemplo, la translocación de fosfatidil serina (PS) puede medirse mediante unión anexina; la fragmentación de ADN puede evaluarse a través de escalonado de ADN; y la condensación nuclear/cromatina conjuntamente con la fragmentación de ADN puede evaluarse mediante un incremento en células hipodipliodes . Preferentemente, el anticuerpo que induce apoptosis es uno que da como resultado aproximadamente 2 a 50 veces, preferentemente aproximadamente 5 a 50 veces, y más preferentemente aproximadamente 10 a 50 veces, la inducción de la unión anexina en relación con la célula no trastada en un análisis de unión anexina utilizando células BT474 (ver abajo) . Ejemplos de anticuerpos HER2 que inducen apoptosis son 7C2 y 7F3. El "epítope 2C4" es la región en el dominio extracelular de HER2 al cual se une el anticuerpo 2C4. A fin de visualizar anticuerpos que se unen al epítope 2C4, puede llevarse a cabo un análisis de rutina de bloqueo cruzado tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988) . Alternativamente, puede elaborarse un mapa de epítope para - establecer si el anticuerpo se une al epítope 2C4 de HER2 utilizando métodos conocidos en la técnica y/o puede estudiarse la estructura anticuerpo-HER2 (Franklin et al., Cáncer Cell 5:317-328 (2004)) para observar cuál (es) dominio (s) de HER2 se encuentra (n) unido (s) por el anticuerpo. El epítope 2C4 comprende residuos del dominio II en el dominio extracelular de HER2. 2C4 y Pertuzumab se unen al dominio extracelular de HER2 en la unión de los dominios I, II y III. Franklin et al., Cáncer Cell 5:317-328 (2004). El "epítope 4D5" es la región en el dominio extracelular de HER2 al cual se une el anticuerpo 4D5 (ATCC CRL 10463) y Trastuzumab. Este epítope se encuentra cercano al dominio transmembrana de HER2 , y dentro del Dominio IV de HER2. Para visualizar anticuerpos que se unen al epítope 4D5, puede llevarse a cabo un análisis de rutina de bloqueo cruzado tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y Davis Lañe (1988) . Alternativamente puede efectuarse un mapa de epítope para establecer si el anticuerpo se une al epítope 4D5 de HER2 (e.g., cualquiera o más residuos en la región de aproximadamente el residuo 529 a aproximadamente el residuo 625, inclusive, en la Figura 1) . El "epítope 7C2/7F3 es la región en la terminación N, dentro del Dominio I, del dominio extracelular de HER2 al cual se unen los anticuerpos 7C2 y/o 7F3 (cada uno depositado con la ATCC, ver abajo) . Para visualizar anticuerpos que se unen al epítope 7C2/7F3, puede llevarse a cabo un análisis de rutina de bloqueo cruzado tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y Davis Lañe (1988) . Alternativamente puede efectuarse un mapa de epítope para establecer si el anticuerpo se une al epítope 7C2/7F3 en HER2 (e.g., cualquiera o más de los residuos en la región de aproximadamente el residuo 22 a aproximadamente el residuo 53 de HER2 en la Figura 1) . "Tratamiento" se refiere a tratamiento tanto terapéutico como profiláctico o a medidas preventivas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen la enfermedad así como aquellos en los cuales va a prevenirse la enfermedad. Por tanto, el paciente que va a tratarse en la presente puede haber sido diagnosticado con la enfermedad o puede encontrarse predispuesto o susceptible a la enfermedad. Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma (incluyendo meduloblastoma y retinoblastoma) , sarcoma ) incluyendo liposarcoma y sarcoma de célula sinovial) , tumores neuroendócrinos (incluyendo tumores carcinoides, gastrinoma y cáncer de célula isleta) , - mesotelioma, schwanoma (incluyendo neuroma acústico) , meningioma, adenocarcinoma, melanoma y leucemia o malignidades linfoides. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de célula escamosa (e.g., cáncer de célula escamosa epitelial) , cáncer de pulmón incluyendo cáncer pulmonar de célula pequeña, cáncer pulmonar de célula no pequeña, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o estomacal incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer hepático, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer tiroideo, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, cáncer testicular, cáncer esofagal, tumores del tracto biliar así como cáncer de cabeza y cuello. El término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de una droga efectiva para tratar una enfermedad en el paciente. Cuando la enfermedad es cáncer, la cantidad efectiva de la droga puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (i.e., retardar en algún grado y preferentemente detener) la infiltración de la célula cancerosa en los órganos - - periféricos; inhibir (i.e., retardar en algún grado y preferentemente detener) la metástasis del tumor; inhibir, hasta cierto grado, el crecimiento del tumor; y/o aliviar en algún grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Hasta el grado en que la droga puede prevenir el crecimiento y/o destruir las células de cáncer existentes, ésta puede ser citostática y/o citotóxica. La cantidad efectiva puede extender el progreso libre de supervivencia, dando como resultado una respuesta objetiva (incluyendo una respuesta parcial, PR, o respuesta completa CR) , incrementar el tiempo de supervivencia, y/o mejorar uno o más síntomas del cáncer. Un "cáncer que expresa HER2" es uno que comprende células que tienen proteína HER2 presente en su superficie celular. Un cáncer que "sobreexpresa" un receptor HER es uno que tiene niveles significativamente más altos de un receptor HER, tal como HER2 , en su superficie celular, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Tal sobreexpresión puede ser ocasionada por la amplificación del gen o por el aumento en la transcripción o translación. La sobreexpresión del receptor HER puede determinarse en un análisis diagnóstico o pronóstico evaluando el aumento en los niveles de la proteína HER presente en la superficie de una célula (e.g., a través de un análisis de inmunohistoquímica; IHC) . Alternativamente o adicionalmente, pueden medirse los niveles de ácido nucleico que codifica HER en la célula, e.g., mediante hibridación fluorescente in situ (FISH; ver WO 98/45479 publicada en Octubre, 1998) , inmunoanálisis southern, o técnicas de reacción de cadena polimerasa (PCR) , tales como PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) . También puede estudiarse la sobreexpresión del receptor HER midiendo el antígeno difundido (e.g., dominio extracelular HER) en un fluido biológico tal como suero (e.g., Patente de E.U. No. 4,933,294 expedida en Junio 12 de 1990; WO 91/05264 publicada en Abril 18 de 1991; Patente de E.U. No. 5,401,638 expedida en Marzo 28 de 1995; y Sias et al., J. Immunol Methods 132:73-80 (1990)). Además de los análisis anteriores, se encuentran disponibles diversos análisis in vivo para el médico experto. Por ejemplo, pueden exponerse las células dentro del cuerpo de un paciente a un anticuerpo que opcionalmente se encuentra marcado con una marca detectable, e.g., un isótopo radiactivo, y puede evaluarse la unión del anticuerpo a células en el paciente, e.g., mediante exploración externa por radiactividad o analizando una biopsia tomada del paciente previamente expuesto al anticuerpo. Por el contrario, un cáncer que "no sobreexpresa el receptor HER" es uno que no expresa niveles del receptor HER2 mayores que los normales en comparación con una célula no - - cancerosa del mismo tipo de tipo. Un cáncer que "sobreexpresa" un ligante HER es uno que produce niveles significativamente mayores de este ligante en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Tal sobreexpresión puede ser ocasionada por la amplificación del gen o por el aumento en la transcripción o la translación. La sobreexpresión del ligante HER puede determinarse diagnósticamente evaluando los niveles del ligante (o del ácido nucleico que lo codifica) en el paciente, e.g., en una biopsia del tumor o mediante diversos análisis diagnósticos tales como los análisis IHC, FISH, inmunoanálisis southern, PCR o in vivo, antes descritos. El término "agente citotóxico" como se utiliza en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o ocasiona la destrucción de las células. El término pretende incluir isótopos radiactivos (e.g., At211, I131, I125, Y90, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radiactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacterial, fungal, vegetal o animal , incluyendo sus fragmentos y/o variantes . Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilación tal como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN®) ; alquil sulfonatos - - tal como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tal como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente bullatacin y bullatacinona) ; delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®) ; beta-lapacona; lapacol ; colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo los análogos sintéticos de topotecan (HYCAMTIN®) , CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina, scopolectina, y 9-aminocamptotecina) ; briostatina; callistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; podofilotoxina; ácido podofílinico; tenipósido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1) ; eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mosatazas de nitrógeno tal como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureasa tal como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimustina; antibióticos tal como los antibióticos de enediina (e. g. , calicheamicina, especialmente calicheamicina gammall y calicheamicina omegall (ver, e . g. , Agnew, Chem Intl . Ed . Engl . , 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como neocarzinostatina cromóforo y cromóforos de antibiótico de enediina de cromoproteínas relacionadas) , aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinis, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, morfolin-doxorubicina, cianomorfolin-doxorubicina, 2-pirrolin-doxorubicina, inyección de liposomas de HCl doxorubicina (DOXIL®) , doxorubicina liposomal TLC D-99 (MYOCET®) , doxorubicina liposomal pegilada (CAELYX®) , y deoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tal como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®) , tegafur (UFTORAL®) , capecitabina (XELODA®) , una epotilona, y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tal como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tal como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tal como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; anti-adrenales tal como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tal como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacárido PSK® (Productos Naturales JHS, Eugene, OR) ; razoxana; rizoxin; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2 , 2 ' , 2" -triclorotrietilamina; tricotecanos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); tiotepa; taxoide, e . g. , paclitaxel (TAXOL®), formulación de nanopartícula diseñada de albúmina de paclitaxel (ABRAXANE™) , y docetaxel (TAXOTERE®) ; cloranbucil; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino tal como cisplatino, oxaliplatino, y carboplatino; vincas, que evitan polimerización de tubulina a partir de formar microtúbulos, incluyendo vinblastina (VELBAN®) , vincristina (ONCOVIN®) , vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) , y vinorelbina (NAVELBINE®) ; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; leucovovina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilhilornitina (DMFO) ; retinoides tal como ácido retinoico, incluyendo bexaroteno (TARGRETIN®) ; bisfosfonatos tal como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® o OSTAC®) , etidronato (DIDROCAL®) , NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®) , alendronato (FOSAMAX®) , pamidronato (AREDIA®) , tiludronato (SKELID®) , o risedronato (ACTONEL®) ; troxacitabina (un análogo de citosina de nucleosido 1 , 3-dioxolano) ; oligonucleótidos de antisentido, particularmente los que inhiben la expresión genética en las trayectorias de señalización implicadas en la proliferación de células aberrantes, tal como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; vacunas tal como THERATOPE® vacuna y vacunas de terapia genética, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 (e.g., LURTOTECAN®) ; rmRH { e . g. , ABARELIX®) ; BAY439006 (sorafenib; Bayer) ; SU-11248 (Pfizer) ; perifosina, inhibidor COX-2 ( e . g. celecoxib o etoricoxib) , inhibidor de proteosoma ( e . g. PS341) ; bortezomib (VELCADE®) ; CCI-779; tipifarnib (R11577) ; orafenib, ABT510; inhibidor de Bcl-2 tal como oblimersen sódico (GENASENSE®) ; pixantrona; inhibidores de EGFR (ver definición abajo) ; inhibidores de tirosina cinasa (ver definición abajo) ; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tal como CHOP, una abreviación de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, y prednisolona, y FOLFOX, una abreviación para un régimen de tratamiento con oxaliplatina (ELOXATIN™) combinada con 5-FU y leucovovina. También se incluyen en esta definición agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tal como perfil anti-estrógenos con agonista/antagonista mezclados, incluyendo, tamoxifen (NOLVADEX®) , 4-hidroxitamoxifen, toremifeno (FARESTON®) , idoxifeno, droloxifeno, raloxifeno (EVISTA®) , trioxifeno, keoxifeno, y moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERMs) tal como SERM3 ; anti-estrógenos puros sin propiedades agonistas, tal como fulvestrant (FASLODEX®) , y EM800 (tales agentes que pueden bloquear el receptor de estrógeno (ER) dimerización, inhibición de la unión al ADN, incremento del cambio de ER, y/o niveles de supresión de ER) ; inhibidores de aromatasa, incluyendo aromatasa esteroidal inhibidores tal como formestano y exemestano (AROMASIN®) , e inhibidores de aromatasa no esteroidal tal como anastrazol (ARIMIDEX®) , letrozol (FEMARA®) y aminoglutetimida, y otros inhibidores de aromatasa incluyendo vorozol (RIVISOR®) , acetato de megestrol - (MEGASE®) , fadrozol, imidazol; agonistas hormonales que liberan la hormona lutenizante, incluyendo leuprolida (LUPRON® y ELIGARD®) , goserelin, buserelin, y tripterelin; esteroides sexuales, incluyendo progestinas tal como acetato de megestrol y acetato de medroxiprogesterona, estrógenos tal como dietilestilbestrol y premarin, y androgenos/retinoides tal como fluoximesterona, todos de ácido transretionico y fenretinida; onapristona; anti-progesteronas; sub-reguladores del receptor de estrógeno (ERDs) ; anti-androgenos tal como flutamida, nilutamida y bicalutamida; testolactona; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores. Como se utiliza en la presente, el término "fármaco dirigido a EGFR" se refiere a un agente terapéutico que se une a EGFR y, opcionalmente, inhibe la activación de EGFR. Ejemplos de tales agentes incluyen anticuerpos y pequeñas moléculas que se unen a EGFR. Ejemplos de anticuerpos que se unen a EGFR incluyen MAb 579 (ATCC CRL HB 8506) , MAb 455 (ATCC CRL HB8507) , MAb 225 (ATCC CRL 8508) , MAb 528 (ATCC CRL 8509) (ver, la Patente de E.U. No. 4,943, 533, Mendelsohn et al . ) y variantes de los mismos, tal como quimerizado 225 (C225 o Cetuximab; ERBUTIX®) y 225 humano reconformado (H225) (ver, WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, un anticuerpo dirigido a EGFR, totalmente humano (Imclone) ; - anticuerpos que se unen a EGFR mutante tipo II (Patente de E.U. No. 5,212,290); anticuerpos humanizados y quiméricoa que se unen a EGFR como se describe en la Patente de E.U. No. 5,891,996; y anticuerpos humanos que se unen a EGFR, tal como ABX-EGF o Panitumumab (ver WO98/50433, Abgenix/Amgen) ; EMD 55900 (Stragliotto et al . Eur. J. Cáncer 32A:636-640 (1996)); EMD7200 (matuzumab) un anticuerpo EGFR humanizado dirigido entra EGFR que compite tanto con EGF como con TGF-alfa por la unión a EGFR (EMD/Merck) ; anticuerpo EGFR humano, HuMax-EGFR (GenMab) ; anticuerpos totalmente humanos conocidos como El.l, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.ll, E6.3 y E7.6.3 y se describen en la US 6,235,883; MDX-447 (Medarex Inc) ; y mAb 806 o mAb humanizado 806 (Johns et al . , J. Biol . Chem. 279 (29) : 30375-30384 (2004) ) . El anticuerpo anti-EGFR puede conjugarse con un agente citotóxico, generando así un inmunoconjugado (ver, e . g. , EP659,439A2, Merck Patent GmbH). Los antagonistas EGFR incluyen pequeñas moléculas tal como los compuestos descritos en las Patentes de E.U. Nos: 5,616,582, 5,457,105, 5,475,001, 5,654,307, 5,679,683, 6,084,095, 6,265,410, 6,455,534, 6,521,620, 6,596,726, 6,713,484, 5,770,599, 6,140,332, 5,866,572, 6,399,602, 6,344,459, 6,602,863, 6,391,874, 6,344,455, 5,760,041, 6,002,008, y 5,747,498, así como en las siguientes publicaciones del PCT: W098/14451, WO98/50038, WO99/09016, y WO99/24037. Las moléculas pequeñas particulares antagonistas de EGFR incluyen OSI-774 (CP-358774, erlotinib, TARCEVA® Genentech/OSI Pharmaceuticals); PD 183805 (Cl 1033, dihidrocloruro de 2-propenamida, N- [4-[ (3 -cloro-4-fluorofenil) amino] -7- [3- (4 -morfolinil) propoxi] -6-quinazolinil] , Pfizer Inc.); ZD1839, gefitinib (IRESSAJ) 4-(3 ' -Cloro-4 ' -fluoroanilino) -7-methoxi-6- (3-morfolinopropoxi) quinazolina, AstraZeneca); ZM 105180 ( (6-amino-4- (3-metilfenil-amino) -quinazolina, Zeneca) ,- BIBX-1382 (N8- (3-cloro-4-fluoro-fenil) -N2- (l-metil-piperidin-4-il) -pirimido [5, 4-d] pirimidin-2 , 8-diamina, Boehringer Ingelheim); PKI-166 ( (R) -4- [4- [ (l-feniletil) amino] -lH-pirrol [2,3-d] pirimidin-6-il] -fenol) ; (R) -6- (4-hidroxifenil) -4- [ (1-feniletil) amino] -7H-pirrol [2, 3-d] pirimidina) ; CL-387785 (N- [4- [ (3 -bromofenil) amino] -6-quinazolinil] -2-butinamida) ; EKB- 569 (N- [4- [ (3-cloro-4-fluorofenil) amino] -3-ciano-7-etoxi-6-quinolinil] -4- (dimetilamino) -2 -butenamida) (Wyeth); AG1478 (Sugen) ; AG1571 (SU 5271; Sugen) ; inhibidores de tirosina cinasa dual EGFR/HER2 tal como lapatinib (GW 572016 o N- [3-cloro-4- [ (3 fluorofenil) methoxi] fenil] 6 [5 [ [ [2metilsulfonil) etil] amino] metil] -2-furanil] -4-quinazolinamina; Glaxo-SmithKIine) o derivados de cianoguanidina quinazolina y cianoamidina quinazolamina. Un "inhibidor tirosina cinasa" es una molécula que inhibe la actividad tirosina cinasa de una tirosina cinasa tal como un receptor HER. Ejemplos de tales inhibidores incluyen los fármacos dirigidos a EGFR anotados en el párrafo - precedente; el inhibidor de HER2 tirosina cinasa inhibidor tal como TAK165 disponible de Takeda; CP-724,714, un inhibidor selectivo oral de la tirosina cinasa del receptor ErbB2 (Pfizer y OSI) ; inhibidores dual-HER tal como EKB-569 (disponible de Wyeth) que se une preferentemente a EGFR pero inhibe tanto HER2 como células que expresan EGFR; lapatinib (GW572016; disponible de Glaxo-SmithKline) un inhibidor de tirosina cinasa HER2 y EGFR; PKI-166 (disponible de Novartis); inhibidores pan-HER tal como canertinib (CI-1033; Pharmacia) ; inhibidores Raf-1 tal como agente de antisentido ISIS-5132 disponible de ISIS Pharmaceuticals que inhibe la señalización de Raf-1; inhibidores TK no dirigido a HER tal como Imatinib mesilato (GLEEVACJ) disponible de Glaxo; inhibidor CI-1040 de cinasa I regulatedo por MAPK extracelular (disponible de Pharmacia) ; quinazolinas, tal como PD 153035, 4- (3-cloroanilino) quinazolina; piridopirimidinas; pirimidopirimidinas; pirrolopirimidinas, tal como CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706; pirazolopirimidinas, 4- (fenilamino) -7H-pirrol [2 , 3-d] pirimidinas; curcumin (diferuloil metano, 4, 5-bis (4-fluoroanilino) ftalimida) ; tirfostinas conteniendo residuos de nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lamber) ; moléculas de antisentido (e . g. las que se unen al ácido nucleico que codifica HER); quinoxalinas (Patente de E.U. No. 5,804,396); trifostinas (Patent e de E.U. No. 5,804,396); ZD6474 (Astra - Zeneca) ; PTK-787 (Novartis/Schering AG) ; inhibidores pan-HER tal como CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly) ; mesilato de Imatinib (Gleevac; Novartis); PKI 166 (Novartis) ; GW2016 (Glaxo SmithKIine) ; CI-1033 (Pfizer) ; EKB-569 (Wyeth) ; Semaxinib (Sugen) ; ZD6474 (AstraZeneca) ; PTK-787 (Novartis/Schering AG) ; INC-1C11 (Imclone) ; derivados de quinazolina de cianoguanidina y quinazolamina de cianoamidina; o como se describe en cualquiera de las siguientes publicaciones de patente: Patente de E.U. No. 5,804,396; WO99/09016 (American Cyanamid); WO98/43960 (American Cyanamid) ; W097/38983 (Warner Lambert) ; WO99/06378 (Warner Lambert) ; WO99/06396 (Warner Lambert) ; WO96/30347 (Pfizer, Inc) ; W096/33978 (Zeneca) ; W096/3397 (Zeneca) ; WO96/33980 (Zeneca); y US2005/0101617. Un "agente anti-angiogénico" se refiere a un compuesto que bloquea o interfiere hasta cierto grado con el desarrollo de los vasos sanguíneos. El factor anti-angiogénico, por ejemplo, puede ser una molécula pequeña o anticuerpo que se une aun factor de crecimiento o receptor del factor de crecimiento implicado en la promoción de angiogénesis. El factor anti-angiogénico preferido en la presente es un anticuerpo que se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , tal como Bevacizumab (AVASTIN®) . El término "citosina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúa en otra célula como mediadores celulares. Ejemplos de tales citosinas son las linfocinas, monocinas, y hormonas polipéptido tradicionales. Incluidas entre las citosinas se encuentra la hormona de 1 crecimiento tal como la hormona del crecimiento humana, hormona del crecimiento humana N-metionil, y hormona del crecimiento bovino; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glicoproteína tales como la horma de estimulación de folículo (FSH) , hormona de estimulación de tiroides (TSH) , u hormona luteinizante (LH) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblasto; prolactina; lactógeno de placenta; factor-V y -3 de necrosis de tumor; sustancia de inhibición mulleriana; péptido asociado con gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factores de crecimiento nervioso tales como NGF-3; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento de transformación (TGFs) tales como TGF-V y TGF-3; factor I y II de crecimiento similar a insulina; eritropoyetina (EPO) ; factores osteoinductivos; interferones tales como interferón-V, -3 y (; factores de estimulación de colonia (CFSs) tales como CSF-macrófrago (M-CSF) ; CSF-granulocito-macrófago (GM-CSF) ; y CSF-granulocito (G-CSF) ; interleucinas (lis) tales como IL-1, IL-V, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; un factor - de necrosis de tumor tal como TNF-V o TNF-3; y otros factor polipéptido incluyendo LIF y ligante kit (KL) . Como se utiliza en la presente, el término citosina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citosinas de secuencia natural . II. Composiciones de Variante de Anticuerpo HER2 La presente invención se refiere, al menos en parte, a ciertas composiciones de anticuerpo HER2. Preferentemente, el anticuerpo HER2 (cualquiera o ambos, el anticuerpo HER2 de especie principal y la variante de anticuerpo del mismo) es uno que se une al Dominio II de HER2 , inhibe la dimerización de HER más efectivamente que Trastuzumab y/o se une a un sitio de unión heterodimérico de HER. La modalidad preferida en la presente del anticuerpo de especie principal es una que comprende las secuencias de aminoácidos ligera variable y pesada variable en las SEQ ID Nos. 3 y 4, y más preferentemente comprende las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y de cadena pesada en las SEQ ID Nos. 15 y 16 (Pertuzumab). La composición en la presente comprende una mezcla del anticuerpo HER2 de especie principal y una variante de secuencia de aminoácidos del mismo comprendiendo una extensión delantera de la terminal amino. Preferentemente, la extensión delantera de la terminal amino se encuentra en - una cadena ligera de la variante de anticuerpo (e.g., en una o dos cadenas ligeras de la variante de anticuerpo) . El anticuerpo HER2 de especie principal o la variante de anticuerpo puede ser un anticuerpo intacto o fragmento de anticuerpo (e.g., fragmentos Fab o F(ab')2, pero preferentemente ambos son anticuerpos intactos. La variante de anticuerpo en la presente comprende una extensión delantera de la terminal amino en cualquiera o más de sus cadenas pesadas o ligeras. Preferentemente, la extensión delantera de la terminal amino se encuentra en una o dos cadenas ligeras del anticuerpo. La extensión delantera de la terminal amino comprende o consiste preferentemente de VHS-. La presencia de la extensión delantera de la terminal amino en la composición puede detectarse mediante diversas técnicas analíticas incluyendo, pero sin limitarse a, análisis de secuencia de terminación N, análisis por heterogeneidad de carga (por ejemplo, cromatografía de intercambio catiónico o electroforesis de zona capilar) , espectrometría de masa, etc. La cantidad de la variante de anticuerpo en la composición varía generalmente desde una cantidad que constituye el límite de detección más bajo de cualquier análisis (preferentemente análisis de intercambio catiónico) utilizado para detectar la variante, hasta una cantidad menor que la cantidad del anticuerpo de especie - - principal. Generalmente, aproximadamente 20% o menos (e.g., de aproximadamente 1% hasta aproximadamente 15%, por ejemplo, de 5% hasta aproximadamente 15%, y preferentemente de aproximadamente 8% hasta aproximadamente 12%) de las moléculas de anticuerpo en la composición comprenden una extensión delantera de la terminal amino. Tales cantidades porcentuales se determinan preferentemente utilizando análisis de intercambio catiónico. Además, de la variante de extensión delantera de la terminal amino, se contemplan alteraciones adicionales de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de especie principal y/o variante, incluyendo, pero sin limitarse a un anticuerpo que comprende un residuo de lisina de terminación C en una o ambas cadenas del mismo (tal variante de anticuerpo puede encontrarse presente en una cantidad de aproximadamente 1% hasta aproximadamente 20%) , una variante de anticuerpo deamidada (por ejemplo, en donde Asn-386 y/o Asn-391 en una o dos cadenas pesadas de Pertuzumab se encuentran deamidadas) , anticuerpo con uno o más residuos de metionina (por ejemplo, Pertuzumab comprendiendo met-254 oxidado), etc. Además, el anticuerpo de especie principal o variante puede comprender además variaciones de glicosilación, cuyos ejemplos no limitantes incluyen anticuerpo comprendiendo una estructura de oligosacárido Gl o G2 unida a su región Fc, anticuerpo comprendiendo un residuo de carbohidrato unido a su cadena ligera (e.g., uno o dos residuos carbohidrato, tales como glucosa o galactosa, unidos a una o dos cadenas ligeras del anticuerpo, por ejemplo, unidos a uno o más residuos lisina) , anticuerpo comprendiendo una o más cadenas pesadas no glicosiladas, o anticuerpo comprendiendo un oligosacárido sialidado unido a una o dos de sus cadenas pesadas, etc. La invención también se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO. 23 o una variante deamidada y/u oxidada del misma. Adicionalmente, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una o dos cadenas ligeras, en donde cualquiera o ambas cadenas ligeras comprende la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO. 23. El anticuerpo comprende además una o dos cadenas pesadas, en donde cualquiera o ambas cadenas pesadas comprende la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO. 16 o la SEQ ID NO. 24 (o variantes deamidadas y/o oxidadas del mismo) . La composición puede recuperarse de una línea celular fabricada genéticamente, e.g., línea celular de ovario de hámster Chino (CHO) que expresa anticuerpo HER2 , o puede prepararse mediante síntesis de péptido. III Producción de Anticuerpos HER2 Sigue una descripción en cuanto a técnicas ejemplares para la producción de los anticuerpos utilizados de acuerdo con la presente invención. El antígeno HER2 que se utiliza para la producción de anticuerpos puede ser, e.g., una forma soluble del dominio extracelular de HER2 o una porción del mismo, conteniendo el epítope deseado. Alternativamente, las células que expresan HER2 en su superficie celular (e.g., células NIH-3T3 transformadas para sobreexpresar HER2 ; o una línea celular de carcinoma tal como células SK-BR-2, ver Stancovski et al., PNAS (EUA) 88:8691-8695 (1991)) pueden utilizarse para generar anticuerpos. Otras formas de HER2 útiles para la generación de anticuerpos serán aparentes para los expertos en la técnica. (i) Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos policlonales se cultivan preferentemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteína inmunogénica en la especie que va a inmunizarse, e.g., hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja, utilizando un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo, maleimidobenzoil sulfosuccinimida éster (conjugación a través de residuos cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12 o R1N=C=NR, en donde R y R1 son diferentes grupos alquilo.

- Se inmuniza a los animales contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados combinando e.g., 100 :g o 5 :g de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución de manera intradérmica en múltiples sitios. Un mes después, se refuerza a los animales con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días después, se sangra a los animales y se analiza el suero por titulación de anticuerpo. Se refuerza a los animales hasta estabilizar la titulación. Preferentemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. También pueden producirse conjugados en cultivo celular recombinante como fusiones de proteína. También se utilizan adecuadamente agentes de agregación tales como alum para mejorar la respuesta inmune. (ii) Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, i.e., los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítope, excepto por posibles variantes que puedan surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, tales como las variantes descritas en - - la presente. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por no ser una mezcla de anticuerpos discretos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse utilizando el método hibridoma primeramente descrito por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), o pueden producirse mediante métodos de ADN recombinante (Patente de E.U. No. 4,816,567) . En el método hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped adecuado, tal como un hámster, como se describió anteriormente para emitir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Los linfocitos se fusionan con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietileno glicol, para formar una célula hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986) ) . Las células hibridoma así preparadas se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células mieloma de origen no fusionadas. Por ejemplo, si las células mieloma de origen carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil - transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT. Las células mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la producción a alto nivel del anticuerpo por medio de las células de producción de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas, las líneas celulares mieloma preferidas son líneas mieloma murinas, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EUA, y células SP-2 o X63-Arg8-653 disponibles del American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EUA. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor J. Immunol . , 133:3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). El medio de cultivo en el cual se cultivan las células hibridoma se analiza por la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células hibridoma se determina mediante - inmunoprecipitación o mediante un análisis de unión in vitro, tal como un radioinmunoanálisis (RÍA) o análisis inmunoabsorbentes de unión de enzima (ELISA) . La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal, por ejemplo, puede determinarse mediante el análisis Scatchard descrito en Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980). Después de identificar las células hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones pueden subclonarse limitando los procedimientos de dilución y cultivarse mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986) . El medio de cultivo adecuado para este propósito incluye, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores ascitos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido de ascitos o suero mediante procedimientos de purificación de anticuerpo convencionales tales como, por ejemplo, cromatografía de proteína A-Sepharosa) , cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis, o cromatografía de afinidad. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla y secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (e.g., utilizando sondas de oligonucleótido - capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos) . Las células hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que después se transfectan en células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de Ovario de Hámster Chino (CHO) , o células mieloma que de otra manera no producen proteína de anticuerpo, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en células huésped recombinantes. Los artículos de revisión acerca de la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican para el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol . , 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol . Revs . , 130:151-188 (1992) . En una modalidad adicional, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de bibliotecas fago de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas fago. Publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) mediante arrastre de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como - infección de combinación y recombinación in vivo como una estrategia para construir muy grandes bibliotecas fago (Waterhouse et al., Nuc. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)). De esta manera, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas hibridoma tradicionales de anticuerpo monoclonal para el aislamiento de anticuerpos monoclonales. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificación para dominios constantes humanos de cadena pesada y de cadena ligera en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente de E.U. No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 81:6851 (1984)) o uniendo de manera covalente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no inmunoglobulina. Típicamente tales polipéptidos no inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo quimérico bivalente que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente. (iii) Anticuerpos Humanizados Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos se han descrito en la técnica. Preferentemente, un - anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en el mismo de una fuente no humana. Estos residuos de aminoácido no humanos se refieren frecuentemente como residuos de "importación" , que se toman típicamente desde un dominio variable de "importación" . La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)], sustituyendo secuencias de región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de E.U. No. 4,816,567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. La selección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que van a utilizarse en la preparación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el llamado método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo - - de roedor se visualiza contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humano conocidas. La secuencia humana que se encuentra más cercana a la del roedor se acepta entonces como la región de estructura humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol . , 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987) ) . Otro método utiliza una región de estructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligera o pesada. La misma estructura puede utilizarse para diversos anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA., 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)). Además es importante que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias de origen y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales se encuentran comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Se encuentran disponibles programas de cómputo que ilustran y despliegan probables estructuras de conformación - tridimensionales de secuencias de inmunoglobulina candidato seleccionadas. La inspección de estas imágenes permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, i.e., el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidato para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias recipientes y de importación de manera que se logra la característica del anticuerpo deseada, tal como un incremento en la afinidad para el (los) antígeno (s) objetivo. En general, los residuos de región hipervariable se encuentran directa y más sustancialmente implicados en la influencia en la unión de antígeno. La WO 01/00245 describe la producción de anticuerpos HER2 humanizados ejemplares que se unen a HER2 y bloquean la activación del ligante de un receptor HER. El anticuerpo humanizado de particular interés en la presente bloquea la activación mediada por EGF, TGF-V, y/o HRG de MAPK esencialmente tan efectivamente como el anticuerpo monoclonal murino intacto 2C4 (o su fragmento Fab) y/o se une a HER2 esencialmente tan efectivamente como el anticuerpo monoclonal murino intacto 2C4 (o su fragmento Fab) . El anticuerpo humanizado en la presente puede comprender, por ejemplo, residuos de región hipervariable no humanos incorporados en un dominio pesado variable humano y puede comprender además una sustitución de región de estructura (FR) en una posición seleccionada del grupo que consiste de 69H, 71H, y 73H utilizando el sistema de numeración de dominio variable descrito en Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991) . En una modalidad, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones de FR en dos o todas las posiciones de 69H, 71H y 73H. Un anticuerpo humanizado ejemplar de interés en la presente comprende residuos determinantes de complementariedad pesados variables GFTFTDYTMX, en donde X es preferentemente D o S (SEQ ID NO: 7) ; DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO: 8) ; y/o NLGPSFYFDY (SEQ ID NO: 9) , comprendiendo opcionalmente modificaciones de aminoácido de esos residuos de CDR, e.g., cuando las modificaciones mantienen esencialmente o mejoran la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, la variante de anticuerpo de interés puede tener de aproximadamente una a aproximadamente siete o aproximadamente cinco sustituciones de aminoácido en las secuencias de CDR pesada variable anteriores. Tales variantes de anticuerpo pueden prepararse mediante maduración de afinidad, e.g., como se describe abajo. El anticuerpo humanizado más preferido comprende la secuencia de aminoácidos pesada variable en la SEQ ID NO. 4.

- El anticuerpo humanizado puede comprender residuos determinantes de complementariedad ligeros variables KASQDVSIGVA (SEQ ID NO: 10); SASYX^X3 , en donde X1 es preferentemente R o L, X2 es preferentemente Y o E, y X3 es preferentemente T o S (SEQ ID NO: 11); y/o QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 12), e.g., además de aquellos residuos de CDR de dominio pesado variable en el párrafo precedente. Tales anticuerpos humanizados comprenden opcionalmente modificaciones de aminoácido de los residuos de CDR anteriores, e.g., en donde las modificaciones esencialmente mantienen o mejoran la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, la variante de anticuerpo de interés puede tener de aproximadamente uno a aproximadamente siete o aproximadamente cinco sustituciones de aminoácido en las secuencias de CDR ligeras variables anteriores. Tales variantes de anticuerpo pueden prepararse por maduración de afinidad, e.g., como se describe abajo. El anticuerpo humanizado más preferido comprende la secuencia de aminoácidos ligera variable en la SEQ ID NO: 3. La presente solicitud contempla también anticuerpos madurados por afinidad que se unen a HER2 y bloquean la activación del ligante de un receptor HER. El anticuerpo de origen puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado, e.g., uno que comprende las secuencias ligera variable y/o pesada variable de las SEQ ID Nos. 3 y 4, respectivamente (i.e., variante 574). El anticuerpo madurado - por afinidad preferentemente se une al receptor HER2 con una afinidad superior a la de 2C4 murino intacto o 574 variante intacto (e.g., de aproximadamente dos a aproximadamente cuatro veces, a aproximadamente 100 veces o aproximadamente 1000 veces mejor afinidad, e.g., establecido utilizando un dominio HER2 -extracelular (ECD) ELISA) . Los residuos de CDR pesada variable ejemplares para sustitución incluyen H28,. H30, H34. H35, H64, H96, H99, o combinaciones de dos o más (e.g., dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete de estos residuos) . Ejemplos de residuos de CDR ligera variable para alteración incluyen L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 o combinaciones de dos o más (e.g., dos a tres, cuatro, cinco o hasta aproximadamente diez de estos residuos) . Se contemplan diversas formas de anticuerpo humanizado o madurado por afinidad. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado o anticuerpo madurado por afinidad puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab, que se conjuga opcionalmente con uno o más agentes citotóxicos a fin de generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado o anticuerpo madurado por afinidad puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgGl intacto. (iv) Anticuerpos Humanos Como una alternativa a la humanización, pueden - generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, es posible ahora producir animales transgénicos (e.g., ratones) capaces, al inmunizarse, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homózigua del gen de la región de unión de cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la completa inhibición de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de la disposición del gen de inmunoglobulina de línea germinal humana en tales ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos al reto con antígeno. Ver, e.g., Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA., 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); y Patentes de E.U. Nos. 5,591,669, 5,589,369 y 5,545,807. Alternativamente, la tecnología de imagen fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 [1990]) puede utilizarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de repertorios de gen de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes de dominio V de anticuerpo se clonan en marco a un gen de proteína de cubierta ya sea mayor o menor de un bacteriófago - filamentoso, tal como M13 o fd, y se despliegan como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma fago, las selecciones en base a las propiedades funcionales del anticuerpo dan como resultado también la selección del gen que codifica para el anticuerpo que exhibe esas propiedades. Así, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La imagen fago puede efectuarse en una diversidad de formatos, para revisión ver, e.g., Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J. Current Opinión in Structural Biology, 3:564-571 (1993) . Diversas fuentes de segmentos de gen V pueden utilizarse para la imagen fago. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) aisló una disposición diversa de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados puede construirse y pueden aislarse anticuerpos para una disposición diversa de antígenos (incluyendo auto-antígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver también Patentes de E.U. Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Los anticuerpos humanos también pueden generarse mediante células B activadas in vitro (ver Patentes de E.U.

- Nos. 5,567,610 y 5,229,275). Los anticuerpos HER2 humanos se describen en la Patente de E.U. No. 5,772,997 expedida en Junio 30 de 1998 y la WO 97/00271 publicada en Enero 3 de 1997. (v) Fragmentos de anticuerpo Diversas técnicas se han desarrollado para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, e.g., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse ahora directamente o mediante células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las bibliotecas fago de anticuerpos antes tratadas. alternativamente, los fragmentos Fab' -SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) ) . De acuerdo con otro procedimiento, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente de un cultivo de célula huésped recombinante. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán aparentes para el técnico experto. En otras modalidades, el anticuerpo seleccionado es un fragmento Fv monocatenario (scFv) . Ver WO 93/16185; Patente de E.U. No. 5,571,894; y Patente de E.U. No. - ,587,458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", e.g., como se describe en la Patente de E.U. No. 5,641,870, por ejemplo. Tales fragmentos de anticuerpo lineal pueden ser mono específicos o biespecíficos . (vi) Anticuerpos Biespecíf icos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidad de unión para al menos dos diferentes epítopes. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden unirse a dos diferentes epítopes de la proteína HER2. Otros de tales anticuerpos pueden combinar un sitio de unión HER2 con sitio (s) de unión para EGFR, HER3 y/o HER4. Alternativamente, puede combinarse un brazo de HER2 con un brazo que se une a una molécula de activación en un leucocito tal como una molécula receptor de célula T (e.g., CD2 o CD3), o receptores Fc para IgG (Fc(R), tal como Fc (Rl (CD64), Fc(RII (CD32) y Fc(RIII (CD16) , a fin de enfocar mecanismos de defensa celular para la célula que expresa HER2. Los anticuerpos biespecíficos también pueden utilizarse para localizar agentes citotóxicos en células que expresan HER2. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión de HER2 y un brazo que se une al agente citotóxico (e.g., saporina, anti-interferón-V, vinca alcaloide, cadena A de ricina, metotrexato o hapteno de isótopo radiactivo) . Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud total o fragmentos de anticuerpo (e.g., anticuerpos F(ab')2 biespecíficos) . La WO 96/16673 describe un anticuerpo HER2/Fc(RIII biespecífico y la Patente de E.U. No. 5,837,234 describe un anticuerpo HER2/FC (Rl biespecífico IDM1 (Osidem) . Se muestra un anticuerpo HER2/FcV biespecífico en la WO 98/02463. La Patente de E.U. No. 5,821,337 muestra un anticuerpo MER2/CD3 biespecífico. MDX-210 es un Ab HER2-Fc(RIII biespecífico . Se conocen en la técnica métodos para producir anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud total se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Debido a la selección aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales solo una tiene la correcta estructura biespecífica. La purificación de la molécula correcta, que se efectúa comúnmente mediante etapas de cromatografía de afinidad es algo problemática, y los rendimientos del producto son bajos. Procedimientos similares se describen en la WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991). De acuerdo con un procedimiento diferente, los - dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de antígeno-antígeno) se fusionan a las secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. Preferentemente, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende al menos parte de las regiones CH2 y CH3 de articulación. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican para las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, para la cadena ligera de inmunoglobulina, se encuentran insertados en vectores de expresión separados, y se co-transfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona mayor flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de tres fragmentos polipéptido en modalidades en las que las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan un óptimo rendimiento. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas polipéptido en un solo vector de expresión cuando la expresión de al menos dos de las cadenas polipéptido en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no son particularmente significativas. En una modalidad preferida de este procedimiento, - - los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (proporcionando una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, dado que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo fácil de separación. Este procedimiento se describe en la WO 94/04690. Para detalles adicionales para la generación de anticuerpos biespecíficos, ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986). De acuerdo con otro procedimiento descrito en la Patente de E.U. No. 5,731,168, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo puede fabricarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeñas de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo, se reemplaza con cadenas laterales más grandes (e.g., tirosina o triptofan) . Se crean "cavidades" compensadoras de tamaño idéntico o similar para la(s) - cadena (s) lateral (es) grande (s) en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando grandes cadenas laterales de aminoácido con unas más pequeñas (e.g., alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros . Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas (Patente de E.U. No. 4,676,980), y para el tratamiento de infección VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados pueden producirse utilizando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son muy conocidos en la técnica, y se describen en la Patente de E.U. No. 4,676,980, conjuntamente con un número de técnicas de reticulación. Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse utilizando unión química. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describen un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se dividen proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante ditiol, arsenita de sodio, para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab' -TNB se reconvierte entonces en el Fab' -tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab' -SH a partir de E. coli, que puede acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos . Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizada. Cada fragmento Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de unirse a células que sobreexpresan el receptor HER2 y las células T humanas normales, así como de activar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumor de mama humano . También se han descrito diversas técnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente a partir del cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando zipers de leucina. Kostelny et al., J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos de ziper de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a as porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos mediante fusión de gen. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región de articulación para formar monómeros y después se re-oxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología "diabody" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para producir fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante una unión que es demasiado corta para permitir la formación de pares entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a formar pares con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión de antígeno. También se ha reportado otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante el uso de dímeros Fv monocatenarios (sFv) . Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos . Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991). (vii) Otras modificaciones de secuencia de aminoácidos Se contempla (n) la(s) modificación (es) de secuencia de aminoácidos de anticuerpos HER2 descrita (s) en la presente. Por ejemplo puede ser deseable para mejorar la afinidad de unión y/o otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo HER2 se preparan introduciendo cambios de nucleótido apropiados en el ácido nucleico del anticuerpo HER2, o mediante síntesis de péptido. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo HER2. Se realiza cualquier combinación de supresión, inserción, y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la estructura final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos post-translacionales del anticuerpo HER2, tales como el cambio en el número o posición de sitios de glicosilación. Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo HER2 que son ubicaciones preferidas para mutagénesis, se denomina "mutagénesis de exploración alanina" como se describe por Cunningham y Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de residuos objetivo se identifican (e.g., residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o de carga negativa (más preferentemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con antígeno HER2. Aquellas ubicaciones de aminoácido que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan entonces introduciendo variantes adicionales o diferentes en o para los sitios de sustitución. Por tanto, mientras que el sitio para la introducción de una variación de secuencia de aminoácidos es predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita predeterminarse. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, se conduce mutagénesis de exploración ala o aleatoria en el codón o región objetivo y las variantes de anticuerpo HER2 expresadas se visualizan por la actividad deseada. Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones de terminal amino y/o carboxilo que varían en longitud de un residuo a los polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos únicos o múltiples de aminoácido. Ejemplos de inserciones de terminación incluyen un anticuerpo HER2 con un residuo metionil de terminación N o el anticuerpo fusionado aun polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo HER2 incluyen la fusión de la terminación N o C del anticuerpo HER2 a una enzima (e.g., para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la vida media en suero del anticuerpo. Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un residuo aminoácido en la molécula de anticuerpo HER2 reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables o CDRs, pero también se contemplan alteraciones de región FR o Fc . Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas" . Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe abajo con referencia a las clases de aminoácidos, pueden introducirse y visualizar los productos. Tabla 1 Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura de la estructura de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral . Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con las similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A.L. Lehninger, en Biochemistry, segunda ed. , pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) no polar: Ala (A) , Val (V) , Leu (L) , He (I) , Pro (P) , Phe (F) , Trp (W) , Met (M) (2) polar no cargado: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y) , Asn (N) , Gln (Q) (3) acídico: Asp (D) , Glu (E) (4) básico: Lys (K) , Arg (R) , His (H) Alternativamente, los residuos de origen natural pueden dividirse en grupos en base a propiedades comunes de cadena lateral : (1) hidrófobo: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrófilo neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acídico: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen en la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. También puede sustituirse cualquier residuo cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo HER2, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad de oxidación de la molécula y evitar la reticulación aberrante. Por el contrario, la(s) unión (es) cisteína pueden agregarse al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv) . Un tipo particularmente preferido de variante de sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo de origen (e.g., un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) variante (s) resultante (s) seleccionada (s) para desarrollo adicional, tendrá (n) propiedades biológicas mejoradas en relación al anticuerpo de origen del cual se genera (n) . Una manera conveniente para la generación de tales variantes de sustitución implica la maduración de afinidad utilizando despliegue fago. Brevemente, se mutan diversos sitios de región hipervariable (e.g., 6-7 sitios) para generar todas las sustituciones amino posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se despliegan de una manera monovalente a partir de partículas fago filamentosas - como fusiones al producto del gen III del M13 empacadas dentro de cada partícula. Las variantes de despliegue fago se visualizan entonces por su actividad biológica (e.g., afinidad de unión) como se describe en la presente. A fin de identificar los sitios de región hipervariable candidato para modificación, puede efectuarse mutagénesis de exploración alanina para identificar los residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión de antígeno. Alternativamente o adicionalmente, puede ser benéfico analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y HER2 humano. Tales residuos de contacto y los residuos vecinos son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente. Una vez generadas tales variantes, el panel de variantes se somete a visualización como se describe en la presente y pueden seleccionarse los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más análisis relevantes para desarrollo adicional. Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Por alterar se entiende la supresión de uno o más residuos carbohidrato encontrados en el anticuerpo, y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no se encuentran presentes en el anticuerpo. La glicosilación de anticuerpos es típicamente de unión N o unión 0. Unión N se refiere a la unión del residuo de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del residuo de carbohidrato a la cadena lateral asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. Glicosilación de unión O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede utilizarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias tripéptido antes descritas (para sitios de glicosilación de unión N) . La alteración también puede producirse por la adición de o la sustitución por uno o más de los residuos serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación de unión 0) . Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, puede alterarse cualquier estructura de oligosacárido unida al mismo. Por ejemplo, los anticuerpos con una estructura carbohidrato madura que carecen de fucosa unida a una región Fc del anticuerpo, se describen en la Solicitud de Patente de E.U. No. US 2003/0157108 Al, Presta L. Ver también US 2004/0093621 Al (Kyowa Hakko Kogyo, Co. , Ltd.). Los anticuerpos con una N-acetilglucosamina de bisección en la estructura de oligosacárido unida a una región Fc del anticuerpo se refieren en la WO 03/011878, Jean-Mairet et al., y Patente de E.U. No. 6,602,684, Umana et al. Los anticuerpos con al menos un residuo galactosa en una estructura de oligosacárido unida a una región Fc del anticuerpo, se reportan en la WO 97/30087, Patel et al. Ver también, WO 98/58964 (Raju, S.) y WO 99/22764 (Raju, S.) referentes a anticuerpos con carbohidrato alterado unido a su región Fc. Se contemplan en la presente composiciones de anticuerpo que comprenden anticuerpo de especie principal con tales estructuras carbohidrato unidas a una o dos cadenas pesadas de la región Fc . Las moléculas de ácido nucleico que codifican para variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo HER2 se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos de origen natural) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o sitio-dirigida) , mutagénesis PCR, y mutagénesis de cásete de una variante preparada previamente o una versión no variante del anticuerpo HER2. (viii) Visualización por anticuerpos con las propiedades deseadas Las técnicas para generar anticuerpos se han descrito anteriormente. Pueden seleccionarse anticuerpos adicionales con ciertas características biológicas, según se desee . Para identificar un anticuerpo que bloquea la activación del ligante de un receptor HER, puede determinarse la capacidad del anticuerpo para bloquear la unión del ligante HER a células que expresan el receptor HER (e.g., en conjunción con otro receptor HER con el cual el receptor HER de interés forma un hetero-oligómero HER) . Por ejemplo, las células que expresan naturalmente o se transfectan para expresar receptores HER del hetero-oligómero HER, pueden incubarse con el anticuerpo y después exponerse al ligante HER marcado. La capacidad del anticuerpo HER2 para bloquear la unión del ligante al receptor HER en el hetero-oligómero HER, puede evaluarse entonces. Por ejemplo, puede efectuarse la inhibición de la unión de HRG a líneas celulares de tumor de mama MCF7 por anticuerpos HER2 utilizando cultivos MCF7 de monocapa en hielo en un formato de placa de 24 pozos esencialmente como se describe en la WO 01/00245. Pueden agregarse anticuerpos monoclonales HER2 a cada pozo e incubarse durante 30 minutos. Puede agregarse entonces rHRG3l177-224 (25 pm) marcado con 125I, y la incubación puede continuar durante 4 a 16 horas. Pueden prepararse curvas de respuesta a la dosis y puede calcularse el valor IC50 para el anticuerpo de interés. En una modalidad, el anticuerpo que bloquea la activación del ligante de un receptor HER tendrá un IC50 para inhibir la unión de HRG a células MCF7 en este análisis de aproximadamente 50 nM o menor, más preferentemente 10 nM o menor. Cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como el fragmento Fab, el IC50 para inhibir la unión de HRG a células MCF7 en este análisis puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 100 nM o menor, más preferentemente 50 nM o menor . Alternativamente, o adicionalmente, puede establecerse la capacidad del anticuerpo HER2 para bloquear la fosforilación tirosina estimulada por el ligante HER, de un receptor HER presente en un hetero-oligómero HER. Por ejemplo, las células que expresan de manera endógena los receptores HER o transfectadas para expresarlos pueden incubarse con el anticuerpo y después analizarse por actividad de fosforilación tirosina dependiente del ligante HER utilizando una anti-fosfotirosina monoclonal (que opcionalmente se conjuga con una marca detectable) . El análisis de activación del receptor cinasa descrito en la Patente de E.U. No. 5,766,863 también se encuentra disponible para determinar la activación del receptor HER y el bloqueo de esa actividad por un anticuerpo. En una modalidad puede visualizarse para un 5. anticuerpo que inhibe la estimulación de HRG de la fosforilación de pl80 tirosina en células MCF7 esencialmente como se describe en la WO 01/00245. Por ejemplo, las células MCF7 pueden colocarse en placas de 24 pozos y pueden agregarse anticuerpos monoclonales para HER2 a cada pozo e 0 incubarse durante 30 minutos a temperatura ambiente; después puede agregarse rHRG3l177-244 a cada pozo hasta una concentración final de 0.2 nM, y puede continuar la incubación durante 8 minutos. El medio puede aspirarse de cada pozo, y las reacciones pueden detenerse mediante la 5 adición de 100:1 de amortiguador de muestra SDS (SDS 5%, 25 mM DTT, y 25 mM Tris-HCl, pH 6.8). Cada muestra (25:1) puede electroforarse en un gel de gradiente 4-12% (Novex) y después transferirse electroforéticamente a una membrana de polivinildeno difluoruro. Pueden revelarse inmunomarcas de 0 antifosfotirosina (a 1 :g/ml) , y puede cuantificarse la intensidad de la banda reactiva predominante a Mr-180,000 mediante densitometría de reflectancia. Preferentemente, el anticuerpo seleccionado inhibirá significativamente la estimulación de HRG de la fosforilación de pl80 tirosina a 5 aproximadamente 0-35% del control en este análisis. Puede - prepararse una curva de respuesta a la dosis para la inhibición de la estimulación de HRG de la fosforilación de pl80 tirosina determinada mediante densitometría de reflectancia y puede calcularse un IC50 para el anticuerpo de interés. En una modalidad, el anticuerpo que bloquea la activación de ligante de un receptor HER tendrá un IC50 para inhibir la estimulación de HRG de la fosforilación de pl80 tirosina en este análisis, de aproximadamente 50 nM o menos, más preferentemente 10 nM o menos. Cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fab, el IC50 para inhibir la estimulación de HRG de la fosforilación de pl80 tirosina en este análisis, puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 100 nM o menos, más preferentemente de 50 nM o menos . También pueden establecerse los efectos de inhibición de crecimiento del anticuerpo en células MDA-MB-175, e.g., esencialmente como se describe en Schaefer et al., Oncogene 15:385-1394 (1977). De acuerdo con este análisis, las células MDA-MB-175 pueden tratarse con un anticuerpo monoclonal HER2 (10 :g/ml) durante 4 días y colorearse con violeta cristal. La incubación con un anticuerpo HER2 puede mostrar un efecto de inhibición de crecimiento en esta línea celular similar al que despliega el anticuerpo monoclonal 2C4. En una modalidad adicional, el HRG exógeno so revierte significativamente esta inhibición. Preferentemente, el anticuerpo será capaz de inhibir la proliferación celular de las células MDA-MB-175 a un grado mayor que el anticuerpo monoclonal 4D5 (y opcionalmente a un grado mayor que el anticuerpo monoclonal 7F3) , tanto en presencia como en ausencia de HRG exógeno. En una modalidad, el anticuerpo HER2 de interés puede bloquear la asociación dependiente de heregulina de HER2 con HER3 en células MCF7 y SK-BR-3 como se determina en un experimento de co-inmunoprecipitación tal como el descrito en la WO 01/00245 sustancialmente más efectivamente que el anticuerpo monoclonal 4D5, y preferentemente sustancialmente más efectivamente que el anticuerpo monoclonal 7F3. Para identificar los anticuerpos HER2 de inhibición del crecimiento, pueden visualizarse anticuerpos que inhiben el crecimiento de células cancerosas que sobreexpresan HER2. En una modalidad. El anticuerpo de inhibición de crecimiento seleccionado es capaz de inhibir el crecimiento de células SK-BR-3 en cultivo celular por aproximadamente 20-100% y preferentemente por aproximadamente 50-100% a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 :g/ml. Para identificar tales anticuerpos, puede llevarse a cabo el análisis SK-BR-3 descrito en la Patente de E.U. No. 5,677,171. De acuerdo con este análisis, las células SK-BR-3 se cultivan en una mezcla 1:1 de F12 y medio DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10%, glutamina y - penicilina estreptomicina. Las células SK-BR-3 se colocan en placas a 20,000 células en un plato de cultivo celular de 35 mm (plato de 2 ml/35 mm) . Se agregan 0.5 a 30 :g/ml del anticuerpo HER2 por plato. Después de seis días, el número de células, en comparación con las células no tratadas, se cuenta utilizando un contador celular COULTER™ electrónico. Aquellos anticuerpos que inhiben el crecimiento de las células SK-BR-3 por aproximadamente 20.100% o aproximadamente 50-100% pueden seleccionarse como anticuerpos de inhibición del crecimiento. Ver Patente de E.U. No. 5,677,171 para análisis para visualización de anticuerpos de inhibición del crecimiento, tales como 4D5 y 3E8. A fin de seleccionar anticuerpos que inducen apoptosis, se encuentra disponible un análisis de unión anexina utilizando células BT474. Las células BT474 se cultivan y se siembran en platos como se trató en el párrafo precedente. El medio se retira entonces y se reemplaza con medio fresco solo o conteniendo 10 :g/ml del anticuerpo monoclonal . Después de un período de incubación de tres días, las monocapas se lavan con PBS y se retiran mediante tripsinización. Las células se centrifugan entonces, se resuspenden en amortiguador de unión Ca2+ y se alicuotan en tubos como se trató anteriormente para el análisis de destrucción celular. Los tubos reciben entonces anexina marcada (e.g., anexina V-FTIC) (1 :g/ml) . Las muestras pueden analizarse utilizando un citómetro de flujo FACSCAN® y software FACSCONVERT® CellQuest (Becton Dickinson) . Los anticuerpos, que inducen niveles estadísticamente significativos de unión de anexina en relación con el control se seleccionan como anticuerpos que inducen apoptosis. A fin de efectuar este análisis, las células BT474 que se han tratado con el anticuerpo de interés como se describió en los dos párrafos precedentes se incuban con 9 :g/ml de HOECHST 33342™ durante 2 horas a 37 °C, después se analizan en un citómetro de flujo EPICS ÉLITE™ (Coulter Corporation) utilizando software MODFIT LT™ (Verity Software House) . Los anticuerpos que inducen un cambio en el porcentaje de células apoptóticas que sea de 2 veces o mayor (y preferentemente de 3 veces o mayor) que el de las células no tratadas (hasta 100% de células apoptóticas) pueden seleccionarse como anticuerpos pro-apoptóticos utilizados en este análisis. Ver WO 98/17797 para análisis para visualización de anticuerpos que inducen apoptosis, tales como 7C2 y 7F3. Para visualizar anticuerpos que se unen a un epítope en HER2 unido por un anticuerpo de interés, puede llevarse a cabo un análisis de rutina de bloqueo cruzado tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988) , para establecer si el anticuerpo bloquea de manera cruzada la unión de un anticuerpo tal como 2C4 o Pertuzumab a HER2.

Alternativamente o adicionalmente, puede elaborarse un mapa de epítope mediante métodos conocidos en la técnica y/o puede estudiarse la estructura anticuerpo-HER2 (Franklin et al., Cáncer Cell 5:317-328 (2004)) para observar cual (es) dominio (s) de HER2 se encuentra (n) unido (s) por el anticuerpo. (ix) Inmunoconjugados La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (e.g., una toxina de molécula pequeña o una toxina enzimáticamente activa de origen bacterial, fungal, vegetal o animal, incluyendo sus fragmentos y/o variantes) , o un isótopo radiactivo (i.e., un radioconjugado) . Se han descrito anteriormente los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados. También se contemplan en la presente conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como caliqueamicina, una maitansina (Patente de E.U. No. 5,208,020=, un tricoteno, y CC1065. En una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo se conjuga a una o más moléculas maitansina (e.g., aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas maitansina por molécula de anticuerpo) . La maitansina, por ejemplo, puede convertirse en May-SS-Me que puede reducirse a May-SH3 y reactivarse con anticuerpo modificado (Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992)) para generar un inmunoconjugado de maitansinoide-anticuerpo. Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo HER2 conjugado a una o más moléculas caliqueamicina. La familia caliqueamicina de antibióticos es capaz de producir fracturas de ADN bicatenario a concentraciones sub-picomolares . Los análogos estructurales de caliqueamicina que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a d1, Vs1, Vs1, N-acetil- d1, PSAG y (Hinman et al., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993) y Lode et al., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998)). Ver también Patentes de E.U. Nos. 5,714,586; 5,712,374; 5,264,586; y 5,773,001 expresamente incorporadas en la presente por la referencia. Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden utilizarse incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos no de unión de la toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantin, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcin, crotin, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restrictocin, fenomicin, enomicin, y los tricotecenos. Ver, por ejemplo, WO 93/21232 publicada en Octubre 28 de 1993.

La presente invención contempla además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (e.g., una ribonucleasa o una ADN endonucleasa tal como deoxirribonucleasa; DNasa) . Se encuentra disponible una variedad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos HER2 radioconjugados. Ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radiactivos de Lu. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico pueden producirse utilizando una diversidad de agentes bifuncionales de acoplamiento de proteínas tales como N-succinimidil-3- (2 -piridilditiol) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl) , esteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina) , diisocianatos (tales como tolueno 2 , 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente de quelación ejemplar para la conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Ver WO 94/11026. La unión puede ser una unión divisible, facilitando la liberación de la droga citotóxica en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse una unión lábil al ácido, unión sensible a peptidasa, unión dimetilo o unión conteniendo disulfuro (Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992)). Alternativamente, puede producirse una proteína de fusión que comprende el anticuerpo HER2 y el agente citotóxico, e.g., mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptido. Aún en otra modalidad, el anticuerpo puede conjugarse a un "receptor" (tal como estreptavidina) para su uso en pre-dirección al tumor cuando se administra el conjugado de anticuerpo-receptor al paciente, seguido por el retiro del conjugado no unido de la circulación utilizando un agente de limpieza y después por la administración de un ligante (e.g., avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (e.g., un radionucleótido). (x) Otras modificaciones de anticuerpos Otras modificaciones del anticuerpo se contemplan en la presente. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, e.g., polietileno glicol, polipropileno glicol, polioxialquilenos, o copolímeros de polietileno glicol y polipropileno glicol.

El anticuerpo también puede atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente) , en sistemas de suministro de droga coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed. , (1980). Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efector, e.g., a fin de mejorar la citotoxicidad dependiente del antígeno mediada por la célula (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede lograrse introduciendo una o más sustituciones de aminoácido en una región Fc del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, pueden introducirse residuos cisteína en la región Fc, permitiendo así la formación de la unión disulfuro intercatenaria en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o destrucción celular aumentada mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Ver, Carón et al., J. Exp. Med., 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol . , 148:2918-2922 (1992) . Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumor aumentada también pueden prepararse utilizando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, puede fabricarse un anticuerpo que tiene regiones Fc dobles y en consecuencia puede tener lisis de complemento mejorada y capacidades ADCC. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). La WO 00/42072 (Presta, L.) describe anticuerpos con función ADCC mejorada en presencia de células efector humanas, en donde los anticuerpos comprenden sustituciones aminoácido en su región Fc . Preferentemente, el anticuerpo con ADCC comprende sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc . Preferentemente, la región Fc alterada es una región Fc de IgGl humana que comprende o consiste de sustituciones en una, dos o tres de estas posiciones . Los anticuerpos con unión Clq alterada y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) se describen en la WO 99/51642, Patente de E.U. No. 6,194,551B1, Patente de E.U. No. 6,242, 195B1, Patente de E.U. No. 6,528,624B1 y Patente de E.U. No. 6,538124 (Idusogie et al.). Los anticuerpos comprenden una sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones de aminoácido 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 y/o 334 de su región Fc .

Para incrementar la vida media en suero del anticuerpo, puede incorporarse un epítope de unión de receptor silvestre en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la Patente de E.U. 5,739,277, por ejemplo. Como se utiliza en la presente, el término "epítope de unión de receptor silvestre" se refiere a un epítope de la región Fc de una molécula IgG (e.g., IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4) responsable por el incremento en la vida media en suero de la molécula IgG. Los anticuerpos con sustituciones en una región Fc de los mismos y vida media en suero incrementada se describen también en la WO 00/42072 (Presta, L.). También se contemplan anticuerpos fabricados con tres o más (preferentemente cuatro) sitios de unión de antígeno funcionales (Solicitud de E.U. No. US 2002/0004587 Al, Miller et al . ) . Los anticuerpos HER2 descritos en la presente también pueden formularse como inmunoliposomas . Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77:4030 (1980); Pat. de E.U. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y WO 97/38731 publicadas en Octubre 23 de 1997. Los liposomas con tiempo de circulación aumentado se describen en la Patente de E.U. No. ,013,556. Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación en fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada de PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extruyen a través de filtros de un tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse a los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio disulfuro. Un agente quimioterapéutico se encuentra opcionalmente contenido dentro del liposoma. Ver Gabizon et al., J. National Cáncer Inst., 81 (19) :1484 (1989) . IV. Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas de las composiciones de la presente invención, se preparan para almacenamiento mezclando la composición con vehículos excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables, (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol , A. Ed. (1980) ) , en forma de formulaciones hidrofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; preservativos (tales como octadecildimetilbencil cloruro de amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol, resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menor que aproximadamente 10 residuos; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes de quelación tales como EDTA; azúcares tales como sucrosa; manitol, trehalosa o sorbitol; contra iones formadores de sal tales como sodio; complejos de metal (e.g., complejos de Zn-proteína) ; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS®, o polietileno glicol (PEG) . Las formulaciones de anticuerpo HER2 liofilizadas se describen en la WO 97/04801. Las formulaciones en la presente también pueden contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular tratada, preferentemente, aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar anticuerpos que se unen a EGFR, HER2 (e.g., un anticuerpo que se une a un epítope diferente en HER2) , HER3 , HER4 o factor endotelial vascular (VEGF) en una formulación. Alternativamente o adicionalmente, la composición puede comprender además un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, agente inhibidor de crecimiento, agente antihormonal, droga dirigida a EGFR, agente anti-angiogénico, inhibidor de tirosina cinasa y/o cardioprotector . Tales moléculas se encuentran adecuadamente presentes en combinación en cantidades efectivas para el propósito pretendido. Los ingredientes activos también puede atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de suministro de droga coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed. , (1980). Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semi permeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, con matrices en forma de artículos configurados, e.g., películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , poliláctidos (Pat. de E.U. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y y-etil-L-glutamato, etileno-vinil acetato no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT® (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y leuprolida acetato), y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico. Las formulaciones que van a utilizarse para administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. V. Visualización de Pacientes para Terapia De acuerdo con una modalidad preferida de la invención en la presente, el paciente seleccionado para terapia tiene un tumor u otra célula o tejido, que expresa activación de HER (y preferentemente de HER2) . En una modalidad, el grado de activación de HER (o HER2) en células cancerosas u otras células probadas excede significativamente el nivel de activación de ese receptor en células no cancerosas normales del mismo tipo de tejido. Tal activación excesiva puede ser el resultado de la sobreexpresión del receptor HER y/o de niveles mayores a los normales del - ligante HER disponible para activar al receptor HER en las células cancerosas. Tal activación excesiva puede ocasionar y/o ser ocasionada por el estado maligno de una célula de cáncer. En algunas modalidades, el cáncer se someterá a análisis diagnóstico o pronóstico para determinar si se presenta la amplificación y/o sobreexpresión de un receptor HER que da como resultado tal activación excesiva del receptor HER. Alternativamente o adicionalmente, el cáncer puede someterse a un análisis diagnóstico o pronóstico para determinar si se presenta en el cáncer la amplificación y/o sobreexpresión de un ligante HER que contribuye a la activación excesiva del receptor. En un sub-conjunto de tales cánceres, la activación excesiva del receptor puede ser el resultado de una trayectoria de estimulación autócrina. Se describirán abajo en mayor detalle diversos análisis ejemplares para determinar la activación de HER. (i ) Dímeros HER Pueden analizarse muestras por la presencia de dímeros HER, indicando activación de HER o HER2. Cualquier método conocido en la técnica puede utilizarse para detectar dímeros HER2 , tales como EGFR-HER2 , HER2-HER3. Se describen abajo diversos métodos preferidos. Estos métodos detectan interacciones no covalentes de proteína-proteína o de otra manera indican la proximidad entre las proteínas de interés. Pueden utilizarse métodos en base a inmunoafinidad, tales como inmunoprecipitación o ELISA, para detectar dímeros HER. En una modalidad, los anticuerpos HER2 se utilizan para inmunoprecipitación de complejos que comprenden HER2 de células de tumor, y el inmunoprecipitado resultante se analiza entonces por a presencia de EGFR o HER3 mediante inmuno-manchado. En otra modalidad, los anticuerpos EGFR o HER3 pueden utilizarse para la etapa de inmunoprecipitación y después se analiza el inmunoprecipitado con anticuerpos HER2. En una modalidad adicional, los ligantes HER específicos para complejos EGFR, HER3 , EGFR-HER2 o complejos HER2-HER2 pueden utilizarse para precipitar complejos, que después se analizan por la presencia de HER2. Por ejemplo, los ligantes pueden conjugarse a avidina y los complejos purificarse en una columna biotina. En otras modalidades, tales como análisis ELISA o tipo sandwich de anticuerpo, los anticuerpos para HER2 se inmovilizan en un soporte sólido, se ponen en contacto con células de tumor o lisado de célula de tumor, se lavan, y después se exponen al anticuerpo contra EGFR o HER3. La unión del último anticuerpo, que puede detectarse directamente o mediante un anticuerpo secundario conjugado a una marca detectable, indica la presencia de heterodímeros. En ciertas modalidades, el anticuerpo EGFR o HER3 se inmoviliza, y el anticuerpo HER2 se utiliza para la etapa de detección. En otras modalidades, los ligantes HER pueden utilizarse en lugar de, o en combinación con anticuerpos HER. También puede utilizarse la reticulación química o UV para unir de manera covalente dímeros en la superficie de células vivas. Hunter et al., Biochem. J. , 320:847-53. Ejemplos de reticuladores químicos incluyen ditiobis (succinimidil) ropionato (DSP) y 3,3'-ditiobis (sulfosuccinimidil) propionato (DTSSP) . En una modalidad, se analizan los extractos celulares de células de tumor reticuladas químicamente mediante SDS-PAGE y se inmunomarcan con anticuerpos para EGFR y/o HER3. Una banda super deslizada del peso molecular apropiado representa más probablemente los dímeros EGFR-HER2 o HER2-HER3, dado que HER2 es el socio de dimerización preferido para EGFR y HER3. Este resultado puede confirmarse mediante subsecuente inmuno-manchado con anticuerpos HER2. También puede utilizarse transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) para detectar dímeros EGFR-HER2 o HER2-HER3. FRET detecta los cambios conformacionales de la proteína y las interacciones de proteína-proteína in vivo e in vitro en base a la transferencia de energía de un fluoróforo donante a un fluoróforo receptor. Selvin, Nat. Struct. Biol. 7:730-34 (2000) . La transferencia de energía tiene lugar solo si el fluoróforo donante se encuentra suficientemente próximo al fluoróforo receptor. En un experimento FRET típico, dos proteínas o dos sitios en una sola proteína se marcan con diferentes sondas fluorescentes. Una de las sondas, la sonda donante, se excita a un estado de energía mayor mediante luz incidental de una longitud de onda especificada. La sonda donante transmite entonces su energía a la segunda sonda, la sonda receptor, dando como resultado una reducción en la intensidad de fluorescencia del donante y un incremento en la emisión de fluorescencia del receptor. Para medir la cantidad de transferencia de energía, la intensidad del donante en una muestra marcada con sondas donantes y receptor se compara con su intensidad en una muestra mercada solo con sonda donante. Opcionalmente, la intensidad del receptor se compara con las muestras de donante/receptor y solo receptor. Las sondas adecuadas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, colorantes permeables de membrana, tales como fluorescein y rodamina, colorantes orgánicos, tales como colorantes cianina, y átomos lantánido. También se conocen en la técnica métodos e instrumentos para detectar y medir la transferencia de energía. Selvin, supra. Las técnicas en base a FRET adecuadas para la detección y medición de las interacciones de proteína-proteína en células individuales también se conocen en la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse microscopía de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia por foto blanqueado (pbFRET) y microscopía de visualización de - tiempo de vida de fluorescencia (FLIM) para detectar la dimerización de receptores de superficie celular. Selvin, supra; Gadella & Jovin, J. Cell Biol., 129:1543-58 (1995). En una modalidad, se utiliza pbFRET en células ya sea "en suspensión" o "in situ" para detectar la formación de dímeros EGFR-HER2 o HER2-HER3, como se describe en Nagy et al., Cytometry, 32:120-131 (1998). Estas técnicas miden la reducción en el tiempo de vida de fluorescencia del donante debido a la transferencia de energía. En una modalidad particular, puede utilizarse una técnica FRET de flujo citométrico tipo Foerster (FCET) para investigar la dimerización de EGFR-HER2 y HER2-HER3, como se describe en Nagy et al., supra, y Brockhoff et al., Cytometry, 44:338-48 (2001) . FRET se utiliza preferentemente en conjunción con técnicas estándar de marcado inmunohistoquímico. Kenworthy, Methods 24:289-96 (2001). Por ejemplo, los anticuerpos conjugados a colorantes fluorescentes adecuados pueden utilizarse como sondas para marcar dos proteínas diferentes. Si las proteínas se encuentran próximas entre sí, los colorantes fluorescentes actúan como donantes y receptores para FRET. La transferencia de energía se detecta mediante medios estándar. La transferencia de energía puede detectarse mediante medios citométricos de flujo o mediante sistemas de microscopía digital, tales como microscopía - confocal o microscopía de fluorescencia de amplio espectro acoplada a una cámara de dispositivo acoplado a la carga (CCD) . En una modalidad de la presente invención, los anticuerpos HER2 ya sea los anticuerpos EGFR o HER3 se marcan directamente con dos fluoróforos diferentes, por ejemplo como se describe en Nagy et al., supra. Las células de tumor o lisados de célula de tumor se ponen en contacto con los anticuerpos marcados de manera diferencial, que actúan como donantes y receptores para FRET en presencia de los dímeros EGFR-HER2 o HER2-HER3. Alternativamente, los anticuerpos no marcados contra HER2 y ya sea EGFR o HER3 , se utilizan conjuntamente con los anticuerpos secundarios marcados de manera diferencial que sirven como donantes y receptores. Ver, por ejemplo, Brockhoff et al., supra. La transferencia de energía se detecta y se determina la presencia de dímeros si las marcas se encuentran en cercana proximidad. En otras modalidades los ligantes del receptor HER que son específicos para HER2 y ya sea EGFR o HER3 , se marcan de manera fluorescente y se utilizan para estudios FRET. Aún en otras modalidades de la presente invención, la presencia de dímeros en la superficie de células de tumor se demuestra mediante co-localización de HER2 ya sea con EGFR o HER3 utilizando técnicas de inmunofluorescencia estándar directas o indirectas y microscopía de exploración láser - confocal. Alternativamente, se utiliza visualización de exploración láser (LSI) para detectar la unión de anticuerpo y para la co-localización de HER2 ya sea con EGFR o HER3 en un formato de alto desempeño, tal como una placa de micro pozo, como se describe en Zuck et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 96:11122-27 (1999). En modalidades adicionales, se determina a presencia de los dímeros EGFR-HER2 y/o HER2-HER3 identificando la actividad enzimática dependiente de la proximidad de los componentes dímero. Un anticuerpo HER2 se conjuga con una enzima y un anticuerpo EGFR o HER3 se conjuga con una segunda enzima. Se agrega un primer sustrato para la primera enzima y la reacción produce un segundo sustrato para la segunda enzima. Esto conduce a una reacción con otra molécula para producir un compuesto detectable, tal como un colorante. La presencia de otro químico fractura el segundo sustrato, de manera que la reacción con la segunda enzima se evita a menos que las primera y segunda enzimas, y por tanto los dos anticuerpos, se encuentren en cercana proximidad. En una modalidad particular, las células de tumor o lisados celulares se ponen en contacto con un anticuerpo HER2 que se encuentra conjugado con glucosa oxidasa y un anticuerpo HER3 o HERÍ que se encuentra conjugado con horseradish peroxidasa. Se agrega glucosa a la reacción conjuntamente con un precursor de colorante, tal como DAB y catalase. La - presencia de los dímeros se determina por el desarrollo de color al teñir para DAB. Los dímeros también pueden detectarse utilizando métodos en base al sistema de análisis eTag™ (Aclara Bio Sciences, Mountain View, CA) , como se describe por ejemplo, en la Solicitud de Patente de E.U. 2001/0049105, publicada en Diciembre 6 de 2001, ambas expresamente incorporadas por la referencia en su totalidad. Una eTag™ o "marca electroforética" comprende un residuo informante detectable, tal como un grupo fluorescente. También puede comprender un "modificador de movilidad" que consiste de un residuo que tiene una movilidad electroforética única. Estos residuos permiten la separación y detección de la eTag™ de una mezcla de complejo bajo condiciones electroforéticas definidas, tales como electroforesis capilar (CE) . La porción de la eTag™ que contiene el residuo informante y, opcionalmente, el modificador de movilidad se encuentra unida a un primer residuo de unión objetivo mediante un grupo de unión divisible para producir un primer compuesto de unión. El primer residuo de unión objetivo reconoce específicamente un primer objetivo particular, tal como un ácido nucleico o proteína. El primer residuo de unión objetivo no se limita en modo alguno, y puede ser, por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido. Preferentemente, el primer residuo de unión objetivo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

- - Alternativamente, el primer residuo de unión objetivo puede ser un ligante del receptor HER o fragmento competente de unión del mismo. El grupo de unión comprende preferentemente un residuo divisible, tal como un sustrato de enzima, o cualquier unión química que pueda dividirse bajo condiciones definidas. Cuando el primer residuo de unión objetivo se une a su objetivo, el agente de división se introduce y/o se activa, y el grupo de unión se divide, liberando así la porción de la eTag™ que contiene el residuo informante y el modificador de movilidad. En consecuencia, la presencia de una eTag™ "libre" indica la unión del residuo de unión objetivo a su objetivo. Preferentemente, un segundo compuesto de unión comprende el agente de división y un segundo residuo de unión objetivo que reconoce específicamente a un segundo objetivo. El segundo residuo de unión objetivo tampoco se limita en modo alguno, y puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o un ligante del receptor HER o fragmento de ligante competente de unión. El agente de división es tal que no dividirá al grupo de unión en el primer compuesto de unión si el primer compuesto de unión y el segundo compuesto de unión se encuentran en cercana proximidad. En una modalidad de la presente invención, un - primer compuesto de unión comprende una eTag™ en la cual un anticuerpo para HER2 sirve como el primer residuo de unión objetivo. Un segundo compuesto de unión comprende un anticuerpo para EGFR o HER3 unido a un agente de división capaz de dividir el grupo de unión de la eTag™. Preferentemente, el agente de división debe activarse a fin de ser capaz de dividir el grupo de unión. Células de tumor o lisados de célula de tumor se ponen en contacto con eTag™, que se une a HER2 , y con el anticuerpo EGFR o HER2 modificado, que se une a EGFR o HER3 en la superficie celular. El compuesto de unión no unido se retira preferentemente, y el agente de división se activa, si es necesario. Si se encuentran presentes los dímeros EGFR-HER2 o HER2-HER3, el agente de división dividirá el grupo de unión y liberará la eTag™ debido a la proximidad del agente de división con el grupo de unión. La eTag™ libre puede entonces detectarse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como electroforesis capilar. En una modalidad, el agente de división es una especie química activable que actúa en el grupo de unión. Por ejemplo, el agente de división puede activarse exponiendo la muestra a la luz. En otra modalidad, la eTag™ se construye utilizando un anticuerpo para EGFR o HER3 como el primer residuo de unión objetivo, y el segundo compuesto de unión se construye a partir de un anticuerpo para HER2. Aún en otra modalidad, el dímero HER se detecta utilizando un anticuerpo u otro reactivo que se une específicamente o preferentemente al dímero en comparación con su unión a cualquier receptor HER en el dímero. (i ) Fosforilación de HER2 A la inmunoprecipitación con anticuerpo EGFR, HER2 o HER3 , como se trató en la sección previa, puede seguir un análisis funcional para dímeros, como una alternativa o suplemento al inmuno-manchado. En una modalidad, a la inmunoprecipitación con anticuerpo HER3 sigue un análisis para la actividad del receptor de tirosina cinasa en el inmunoprecipitado. Debido a que HER3 no tiene una actividad de tirosina cinasa intrínseca, la presente de actividad de tirosina cinasa en el inmunoprecipitado indica que HER3 se encuentra más probablemente asociado con HER2. Graus-Porta et al., EMBO J., 16:1647-55 (1997); Klapper et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 96:4995-5000 (1999). Este resultado puede confirmarse mediante inmuno-manchado con anticuerpo HER2. En otra modalidad, a la inmunoprecipitación con anticuerpo HER2 le sigue un análisis para actividad de tirosina cinasa del receptor EGFR. En este análisis, el inmunoprecipitado se pone en contacto con ATP radiactivo y un sustrato péptido que imita el sitio in vivo de transfosforilación de HER2 mediante EGFR. La fosforilación - - del péptido indica co- inmunoprecipitación y por tanto dimerización de EGFR con HER2. Los análisis de actividad del receptor de tirosina cinasa son muy conocidos en la técnica e incluyen análisis que detectan la fosforilación de sustratos objetivo, por ejemplo, mediante anticuerpo fosfotirosina, y la activación de las trayectorias cognado de tansducción de señal, tales como la trayectoria MAPK. La fosforilación del receptor HER puede establecerse mediante inmunoprecipitación de uno o más receptores HER, tales como el receptor HER2 (HER2) , e inmunoanálisis Western. Por ejemplo, la positividad se determina por la presencia de una banda fosfo-HER2 en el gel, utilizando un anticuerpo anti-fosfotirosina para detectar residuo (s) tirosina fosforilado (s) en el (los) receptor (es) HER inmunoprecipitado (s) . los anticuerpos anti-fosfotirosina se encuentran comercialmente disponibles de PanVera (Madison, Wl) , una subsidiaria de Invitrogen, Chemicon International, Inc. (Temecula, CA) , o Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY) . La negatividad se determina por la ausencia de la banda . En otra modalidad, la fosforilación del receptor HER2 (HER2) se establece mediante inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo HER2 fosfo-específico (clon PN2A; Thor et al., J. Clin. Oncol., 18 (18) : 3230-3239 (2000)). Otros métodos para detectar la fosforilación de receptor (es) HER incluyen, pero no se limitan a, KIRA ELISA (Patentes de E.U. Nos. 5,766,863; 5,891,650; 5,914,237; 6,025,145; y 6,287,784), espectrometría de masa (comparando el tamaño de HER2 fosforilado y no fosforilado) , y análisis de proximidad de marca-e tanto con un anticuerpo HER (e.g., HER2) como con anticuerpo fosfo-específico o fosfo-tirosina específico (e.g., utilizando el equipo de análisis de eTag™ disponible de Aclara BioSciences (Mountain View, CA) . Los detalles del análisis eTag™ se describieron anteriormente. También pueden utilizarse anticuerpos fosfo-específicos en disposición celular para detectar el estado de fosforilación en una muestra celular de proteína de transducción de señal (US 2003/0190689) . (iii) Ligantes HER2 Pueden determinarse los niveles de un ligante HER, tal como TGF-V, en o asociado con el tumor, de acuerdo con procedimientos conocidos. Tales análisis pueden detectar proteína y/o ácido nucleico codificándolo en la muestra que va a probarse. En una modalidad, los niveles de ligante HER en el tumor pueden determinarse utilizando inmunohistoquímica (IHC) ; ver, por ejemplo, Scher et al., Clin. Cáncer Research 1:545-550 (1995). Alternativamente o adicionalmente, pueden evaluarse los niveles de ácido nucleico que codifica para ligante HER en la muestra que va a probarse, e.g., a través de técnicas FISH, inmunoanálisis southern o PCR. (iv) Cáncer que no sobreexpresa HER2 Aunque el cáncer puede caracterizarse por la sobreexpresión del receptor HER2, la presente solicitud proporciona además un método para tratar un cáncer que no se considera sobreexpresión de HER2. Para determinar la expresión de HER2 en el cáncer, se encuentran disponibles diversos análisis diagnósticos/pronósticos. En una modalidad, la sobreexpresión de HER2 puede analizarse mediante IHC, e.g., utilizando el HERCEPTEST® (Dako) . Secciones de tejido embebidas en parafina de una biopsia de tumor pueden someterse al análisis IHC de acuerdo con un criterio de intensidad de coloración de proteína HER2 , como sigue: Puntuación 0 no se observa coloración o se observa coloración en membrana en menos que el 10% de las células de tumor . Puntuación 1+ se detecta una coloración en membrana débil/apenas perceptible en más del 10% de las células de tumor. Las células solo se encuentran coloreadas en parte de su membrana. Puntuación 2+ se observa una coloración completa en membrana de débil a moderada en más del 10% de las células de tumor. Puntuación 3+ se observa una coloración completa en membrana de moderada a fuerte en más del 10% de las células de tumor. Los tumores con puntuaciones de 0 o 1+ para establecer la sobreexpresión de HER pueden caracterizarse no sobreexpresando HER2 , mientras que los tumores con puntuaciones 2+ o 3+ pueden caracterizarse sobreexpresando HER2. Los tumores que sobreexpresan HER2 pueden tasarse mediante puntuaciones inmunohistológicas correspondientes al número de copias de moléculas HER2 expresadas por célula, y pueden determinarse bioquímicamente: 0= 0-10,000 copias/célula, 1+= al menos aproximadamente 200,000 copias/célula, 2+= al menos aproximadamente 500,000 copias/célula, 3+= al menos aproximadamente 2,000,000 copias/célula. La sobreexpresión de HER2 en el nivel 3+ , que conduce a la activación independiente del ligante de la tirosina cinasa (Hudziak et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 84:7159-7163 (1987)), se presenta en aproximadamente el 30% de los cánceres de mama, y en estos pacientes, disminuye la supervivencia libre de recaída y la supervivencia general (Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989); Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987)). Alternativamente o adicionalmente, pueden llevarse a cabo análisis FISH tales como el INFORM™ (comercializado por Ventana, Arizona) o PATHVISION™ (Vysis, Illinois) en tejido de tumor fijo en formalina, embebido en parafina para determinar el grado (en su caso ( de sobreexpresión de HER2 en el tumor.

- En una modalidad, el cáncer será uno que expresa (y puede sobreexpresar) EGFR, tal expresión puede evaluarse mediante los métodos de evaluación de expresión de HER2 como se anotó anteriormente . VI. Tratamiento con la Composición de Anticuerpo HER2 Se contempla que de acuerdo con la presente invención, el anticuerpo HER2 puede utilizarse para tratar el cáncer. El cáncer comprenderá generalmente células que expresan HER2 , de manera que el anticuerpo HER2 en la presente es capaz de unirse a las células de cáncer. Diversos cánceres que pueden tratarse con la composición se listan en la sección de definiciones anterior. También se contempla que el anticuerpo HER2 puede utilizarse para tratar diversas enfermedades o trastornos no malignos, tales como enfermedad autoinmune (e.g., psoriasis); endometriosis; escleroderma; restenosis; pólipos tales como pólipos de colon, pólipos nasales o pólipos gastrointestinales; fibroadenoma ; enfermedad respiratoria; colecistitis; neurofibromatosis; enfermedad renal poliquística; enfermedades inflamatorias; trastornos de la piel incluyendo psoriasis y dermatitis; enfermedad vascular; condiciones que implican proliferación anormal de células epiteliales vasculares; úlceras gastrointestinales; enfermedad de Menetrier, secreción de adenomas o síndrome de pérdida de proteína; trastornos renales; trastornos - angiogénicos; enfermedad ocular tal como la degeneración macular relacionada con la edad, presumible síndrome de histoplasmosis ocular, neovascularización retinal de retinopatía diabética proliferativa, vascularización retinal, retinopatía diabética, o degeneración macular relacionada con la edad; patologías asociadas con hueso tales como osteoartritis, raquitismo y osteoporosis; daño posterior a un evento cerebral isquémico; enfermedades fibróticos o edemias tales como cirrosis hepática, fibrosis pulmonar, carcoidosis, tiroiditis, síndrome de hiperviscosidad sistémica, enfermedad Osler Weber-Rendu, enfermedad pulmonar oclusiva crónica, o edema posterior a quemaduras, trauma, radiación, choque, hipoxia o isquemia; reacción de hipersensibilidad de la piel; retinopatía diabética y nefropatía diabética; síndrome Guillain-Barre; enfermedad de injerto contra huésped o rechazo al transplante; enfermedad de Paget; inflamación en hueso o articulación; foto envejecimiento (e.g., ocasionado por radiación UV de la piel humana) ; hipertrofia prostática benigna; ciertas infecciones microbiales incluyendo patógenos microbiales seleccionados de adenovirus, hantavius, Borrelia burgdorferi, Yersinia spp y Bordetella pertusis; trombosis ocasionada por agregación de plaquetas; condiciones reproductoras tales como endometriosis, síndrome de hiperestimulación ovárica, preeclampsia, sangrado uterino disfuncional, o menometrorragia; sinovitis; ateroma; nefropatías agudas y crónicas (incluyendo glomerulonefritis proliferativa y enfermedad renal inducida por diabetes) ; eczema; formación de cicatriz hipertrófica; choque endotóxico e infección por hongos; poliposis de adenomatosis familiar; enfermedades neurodegenerativas (e.g., enfermedad de Alzheimer, demencia relacionada con SIDA, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentosa, atrofia muscular espinal y degeneración cerebral); síndromes mielodisplásicos; anemia aplástica; daño isquémico; fibrosis del pulmón, riñon o hígado; enfermedad de hipersensibilidad mediada por célula T; estenosis pilórica hipertrófica infantil; síndrome obstructivo urinario; artritis psoriática; y tiroiditis de Hashimoto. Las indicaciones no malignas para terapia preferidas en la presente incluyen psoriasis, endometriosis, escleroderma, enfermedad vascular (e.g., restenosis, arteriosclerosis, enfermedad de la arteria coronaria, o hipertensión) , pólipos de colon, fibroadenoma o enfermedad respiratoria (e.g., asma, bronquitis crónica, bronquiectasia o fibrosis quística) . El tratamiento con el anticuerpo HER2 dará como resultado una mejora en los signos o síntomas de enfermedad. Por ejemplo, cuando la enfermedad tratada es cáncer, tal terapia puede dar como resultado una mejora en la supervivencia (supervivencia total y/o supervivencia de libre progreso) y/o puede dar como resultado una respuesta clínica objetiva (parcial o completa) . Preferentemente, el anticuerpo HER2 en la composición administrada es un anticuerpo desnudo. Sin embargo, el anticuerpo HER2 administrado puede encontrarse conjugado con un agente citotóxico. Preferentemente, el inmunoconjugado y/o proteína HER2 al cual se une, se internaliza en la célula, dando como resultado una eficacia terapéutica aumentada del inmunoconjugado para destruir la célula cancerosa a la cual se une. En una modalidad preferida, el agente citotóxico se dirige o interfiere con el ácido nucleico en la célula cancerosa. Ejemplos de tales agentes citotóxicos incluyen maitansinoides, caliqueamicinas, ribonucleasas y endonucleasas de ADN. El anticuerpo HER2 se administra a un paciente humano de acuerdo con método conocidos tales como administración intravenosa, e.g., como infusión única o continua durante un período de tiempo, mediante vías intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o inhalación. Se prefiere la administración intravenosa de la composición de anticuerpo. Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosis apropiada del anticuerpo HER2 dependerá del tipo de enfermedad tratada, como se definió anteriormente, de la severidad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo HER2 se - administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo HER2 , y de la discreción del médico que la trata. El anticuerpo HER2 se administra de manera adecuada al paciente en una sola vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 :g/kg a 50 mg/kg (e.g., 0.1-20 mg/kg) del anticuerpo HER2 es una dosis candidato inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. En una modalidad, el tiempo mínimo de infusión para el anticuerpo HER2 puede ser más largo que los tiempos de infusión subsecuentes, por ejemplo, aproximadamente 90 minutos para la infusión inicial, y aproximadamente 30 minutos para las infusiones subsecuentes (si la infusión inicial es bien tolerada) . La dosis preferida del anticuerpo HER2 se encontrará en el rango de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. De esta manera, puede administrarse al paciente una o más dosis de aproximadamente 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de los mismos) . Tales dosis pueden administrarse intermitentemente, e.g., cada semana o cada tres semanas (e.g., de manera que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, e.g., aproximadamente seis dosis del anticuerpo HER2) . Puede administrarse una dosis mayor de carga inicial seguida por una o más dosis menores. En una modalidad, el anticuerpo HER2 se administra como una dosis de carga de aproximadamente 840 mg seguida por aproximadamente 420 mg aproximadamente cada 3 semanas. En otra modalidad, el anticuerpo HER2 se administra como una dosis de aproximadamente 1050 mg administrados aproximadamente cada 3 semanas. Otros agentes terapéuticos pueden combinarse con el anticuerpo HER2. Tal administración combinada incluye la co-administración o la administración concurrente, utilizando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica, y administración consecutiva en cualquier orden, en donde existe un período de tiempo mientas que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. De esta manera, el otro agente terapéutico puede administrarse previo a, o después de la administración del anticuerpo HER2. En esta modalidad, el tiempo entre al menos una administración del otro agente terapéutico y al menos una administración del anticuerpo HER2 es de aproximadamente 1 mes o menos, y más preferentemente aproximadamente 2 semanas o menos. Alternativamente, el otro agente terapéutico y el anticuerpo HER2 se administran concurrentemente al paciente en una sola formulación o en formulaciones separadas. Ejemplos de otros agentes terapéuticos que pueden combinarse con el anticuerpo HER2 incluyen cualquiera o más - de: un agente quimioterapéutico, tal como un anti-metabolito, e.g., gemcitabina; un segundo anticuerpo HER2 diferente (por ejemplo, un anticuerpo HER2 de inhibición del crecimiento tal como un Trastuzumab, o un anticuerpo HER2 que induce apoptosis de una célula que sobreexpresa HER2 , tal como 7C2, 7F3 o sus variantes humanizadas) ; un segundo anticuerpo dirigido contra otro antígeno asociado a tumor, tal como EGFR, HER3 , HER4 ; compuesto anti-hormonal , e.g., un compuesto anti-estrógeno tal como tamoxifen, o un inhibido aromatasa; un cardioprotector (para evitar o reducir cualquier disfunción del miocardio asociada con la terapia) ; una citosina; una droga marcada con EGFR (tal como TARCEVA®, IRESSA® o Cetuximab) ; un agente anti-angiogénico (especialmente Bevacizumab comercializado por Genentech bajo la marca comercial AVASTIN™) ; un inhibidor de tirosina cinasa; un inhibidor COX (por ejemplo un inhibidor COX-1 o COX-2) ; droga anti-inflamatoria no esteroidal, Celecoxib (CELEBREX®) ; inhibidor de farnesil transferasa (por ejemplo Tipifarnib/ZARNESTRA® R115777 disponible de Johnson & Johnson o Lonafarnib SCH66336 disponible de Schering-Plough) ; anticuerpo que se une a la proteína oncofetal CA 125 tal como regovomab (MoAb B43.13); vacuna HER2 (tal como vacuna HER2 AutoVac de Pharmexia, o vacuna de proteína APC8024 de Dendreon, o vacuna de péptido HER2 de GSK/Corixa) ; otra terapia objetivo de HER (e.g., trastuzumab, cetuximab, - gefitinib, erlotinib, C11033, GW2016, etc.); inhibidor Raf y/o ras (ver, por ejemplo, WO 2003/86467); Doxil; Topetecan; taxano; GW572016; TLK286; EMD-7200; un medicamento que trata náusea tal como un antagonista serotonina, esteroide o benzodiazepina; un medicamento que evita o trata la erupción en la piel o terapias estándar de acné, incluyendo antibiótico tópico u oral; un medicamento que reduce la temperatura corporal tal como acetaminofén, difenilhidramina, o merperidina; factor de crecimiento hematopoyético, etc. Las dosis adecuadas para cualquiera de los agentes co-administrados anteriormente son aquellas utilizadas actualmente y pueden disminuirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente y el anticuerpo HER2. El tratamiento con la combinación de la composición de anticuerpo HER2 y otro agente terapéutico, puede dar como resultado un beneficio terapéutico sinergístico o más que adicional al paciente . Si un agente quimioterapéutico se administra, éste se administra comúnmente en dosis conocidas para el mismo o se disminuye opcionalmente debido a la acción combinada de las drogas o a los efectos secundarios atribuibles a la administración del agente quimioterapéutico. La preparación y programas de dosificación para tales agentes quimioterapéuticos puede utilizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o determinarse empíricamente por - el médico experto. La preparación y programas de dosificación para tal quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed. , M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) . Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede someterse a retiro quirúrgico de las células cancerosas y/o a terapia de radiación. VII. Depósito de Materiales Las siguientes líneas celulares hibridoma se han depositado en el American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, EUA (ATCC) : Designación de Anticuerpo ATCC No. Fecha de Depósito 7C2 ATCC HB-12215 Octubre 17, 1996 7F3 ATCC HB-12216 Octubre 17, 1996 4D5 ATCC CRL 10463 Mayo 24, 1990 2C4 ATCC HB-12697 Abril 8, 1999 Se ilustran detalles adicionales de la invención mediante el siguiente Ejemplo no limitante. Las descripciones de todas las citas en la especificación se incorporan expresamente en la presente por la referencia. EJEMPLO CARACTERIZACIÓN DE COMPOSICIONES DE PERTUZUMAB Pertuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado, generado en base a la estructura de IgGl (ü) humana. Éste comprende dos cadenas pesadas (448 residuos) y dos cadenas ligeras (214 residuos) . Las dos cadenas pesadas se encuentran unidas por dos disulfuros intracatenarios y cada cadena ligera se encuentra unida a una cadena pesada a través de un disulfuro intracatenario. Existe un sitio de glicosilación de unión N en la región Fc de pertuzumab en Asn-299 de las dos cadenas pesadas. Pertuzumab difiere de HERCEPTIN® (Trastuzumab) en las regiones de unión de epítope de la cadena ligera (diferencias de 12 aminoácidos) y la cadena pesada (diferencias de 30 aminoácidos) . Como resultado de estas diferencias, pertuzumab se une a un epítope completamente diferente en el receptor HER2. La unión de pertuzumab al receptor HER2 en células epiteliales humanas evita la formación de complejos con otros miembros de la familia del receptor HER (Agus et al., Cáncer Cell 2:127-137 (2002)) . Al bloquear la formación de complejos, pertuzumab evita los efectos de estimulación del crecimiento de ligantes para los complejos (e.g., EGF y heregulina). Experimentos in vitro demostraron que tanto pertuzumab como pertuzumab-Fab inhiben la unión de heregulina (HRG) a células MCF7, y que la fosforilación estimulada por HRG del complejo HER2-HER3 puede inhibirse tanto mediante pertuzumab como por pertuzumab-Fab (Agus et al., Cáncer Cell 2:127-137 (2002)). Además, la inhibición in vivo del crecimiento del tumor mediante pertuzumab y mediante un Fab de polietileno glicol derivatizado de pertuzumab, se encontraron comparables en un - modelo de xenoinjerto de cáncer de próstata murino (Agus et al., Cáncer Cell 2:127-137 (2002)). Estos datos sugieren que la región Fc del anticuerpo no es necesaria para la inhibición del crecimiento del tumor, y además. Las funciones de bivalencia y de efector mediada por Fc no se requieren para la actividad biológica in vivo o in vitro. Se analizaron las siguientes muestras expresadas por células de ovario de hámster Chino (CHO) fabricadas de manera recombinante : Muestra Proceso de fabricación Escala Material de referencia Fase I 400 L Lote S9802A Fase II 2000 L Materiales de desarrollo Programa de desarrollo 400 L (rondas 1,2,3,5 y6) clínico incluyendo Fase III Nota: 400L ronda 4, no disponible debido a la contaminación en el cultivo inoculo de 100 L en el día 2. ANÁLISIS DE SECUENCIA DE TERMINACIÓN N El análisis de secuencia de terminación N se llevó a cabo utilizando métodos estándar Edman de degradación, y los resultados se muestran en la Tabla 2A, Tabla 2B y Tabla 2C para el Material de Referencia, Lote S9802A, y para el material de desarrollo de proceso de escala de 400 L Ronda I, respectivamente. Las secuencias de terminación N esperadas (Figura 3A y Figura 3B) de las cadenas ligera y pesada se observaron en todas las muestras. También se detectó en las cinco muestras una secuencia menor adicional correspondiente a la cadena ligera con tres aminoácidos adicionales Val-His-Ser (VHS) precediendo la secuencia de terminación N esperada. La secuencia VHS es una porción del péptido de señal que se retira de la proteína mientras se secreta. Una división alternada del péptido de señal da como resultado la extensión VHS en la terminación N de pertuzumab. En los materiales previamente producidos para estudios clínicos de Fase I/II, aproximadamente el 2%-4% de las moléculas de pertuzumab tienen una de las dos cadenas ligeras conteniendo la secuencia VHS de terminación N. Sin embargo, el nivel de las cadenas ligeras con secuencia VHS de terminación N en estos materiales (l%-2% de cada cadena ligera) fue demasiado bajo para detectarse en el análisis de secuencia de terminación N. en las cinco muestras de desarrollo del proceso, el nivel de estas especies de cadena ligera se encuentra ligeramente por arriba del límite de detección del análisis de terminación N en aproximadamente 4%-5%. Los datos de secuencia de terminación N para las cinco muestras de desarrollo del proceso son consistentes con los resultados cromatográficos de intercambio catiónico, que muestran que las cinco muestras de desarrollo del proceso tienen aproximadamente 9% de las moléculas de pertuzumab con una cadena ligera conteniendo la extensión VHS (ver Catión Exchange Chromatography (CEC) abajo) .

No se detectaron otras secuencias (límite de detección estimado a 3%) , indicando la ausencia de sitios de división internos. ANÁLISIS ESPECTROMÉTRICQ DE MASA Las muestras de Pertuzumab se redujeron con ditiotreitol y se analizaron mediante espectrometría de masa de electrorrociado-ionización (ESI-MS) utilizando un espectrómetro de masa PE SCIEX API 3000™ para confirmar que las masas de las cadenas pesada y ligera son consistentes con sus secuencias esperadas. Los espectros de masa reconstruidos para el Material de Referencia, Lote S9802A, y para el material de desarrollo de proceso de escala de 400 L Ronda I, se comparan en la Figura 8A y en la Figura 8B. La masa de cadena ligera observada (23,524 Da) es consistente con el valor predicho de su secuencia para los tres materiales. Se observaron dos picos menores adicionales a 23,685 Da y 23,847 Da (161 y 323 Da más altos que la masa de cadena ligera, respectivamente) . Es probable que el primer pico (23,685 Da) surja del glicatión en la cadena ligera. El segundo pico (23,847 Da) se observa más claramente en los materiales de desarrollo del proceso de escala 400 L. este pico es presumiblemente de la cadena ligera con la extensión Val-His-Ser (ver Análisis de Secuencia de Terminación N, arriba y el Análisis Cromatográfico de Intercambio catiónico) o de la cadena ligera con dos sitios glicatión.

- Se observaron diversas masas correspondientes a diferentes formas de la cadena pesada. La especie predominante de la cadena pesada tiene una masa de 50,532 Da, que surge de la cadena pesada que consiste de los residuos 1-448 con una estructura de oligosacárido GO . Otras formas observadas incluyen la cadena pesada que contiene los residuos 1-448 con una estructura de oligosacárido Gl o G2 (Figura 8B) . HETEROGENEIDAD DE CARGA MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO CATIÓNICO Y ELECTROFORESIS DE ZONA CAPILAR Se utilizó cromatografía de intercambio catiónico (CEC) para establecer la heterogeneidad de carga en Pertuzumab. Las muestras, antes y después del tratamiento con carboxipeptidasa B(CPB), se analizaron con una columna de intercambio catiónico DIONEX™ (PROPAC WCX-10™, 4 mm x 250 mm) utilizando un amortiguador MES 20 mM pH 6.0, y gradiente NaCl superficial. La comparación de los cromatogramas se muestra en la Figura 9A (antes del tratamiento CPB) y en la Figura 9B (después del tratamiento CPB) . Se observaron múltiples picos en los tres lotes. Para propósitos de caracterización, los cromatogramas se dividen en seis regiones (marcadas A a F en las Figuras 9A y 9B) . Las áreas pico relativas para las seis regiones se listan en la Tabla 3A y en la Tabla 3B. La cantidad de variante acídica (en la región A) es más alta en el lote S9802A y en los materiales de desarrollo de proceso de escala 400 L que en el Material de Referencia. Las variantes básicas en la región C y D, que han mostrado contener Pertuzumab con un residuo de lisina de terminación C en una (región C) o ambas (región D) cadenas pesadas, son reducidas en el lote S9802A y en los materiales de desarrollo de proceso de escala 400 L al compararse con el material de referencia. Después del tratamiento CPB, las moléculas de Pertuzumab con una o dos lisinas de terminación C de cadena pesada se convirtieron en especies principales en la región B y no se detectaron más en las regiones C y D. Solo un pequeño pico, cuya identidad no se ha determinado aún, permaneció en la región C después del tratamiento CPB. La variante básica en la región E, mostrada surgiendo de las moléculas de Pertuzumab con una cadena ligera conteniendo la extensión VHS, es mayor en los materiales de desarrollo de proceso de escala 400 L (9%-10%) que en material de referencia y en el lote S9802A (4%) . La variante básica en la región F mostró ser Pertuzumab conteniendo una extensión VHS de terminación N en una cadena ligera y una lisina de terminación C en una cadena pesada. Como resultado de mayores niveles de variantes acídicas y básicas, la especie principal en la región B es menor en los materiales de desarrollo de proceso de escala 400 L que en el material de referencia o en el lote S9802A. Además de la cromatografía de intercambio catiónico, se empleó la electroforesis de zona capilar (CZE) para examinar la heterogeneidad de carga en Pertuzumab. Los picos CZE se identificaron y se correlacionaron con aquellos picos observados en el análisis CEC analizando fracciones CEC colectadas individualmente con CZE. Las cantidades relativas de variantes de carga determinadas mediante CZE y CEC son comparables para todos los materiales analizados. Las actividades biológicas de las variantes de carga de Pertuzumab en diferentes fracciones CEC parecen ser las mismas en base a un análisis de anti-proliferación a base de células. De esta manera, no se espera que la heterogeneidad de carga en Pertuzumab afecte su potencia. Las actividades biológicas de los materiales de desarrollo del proceso de 400 L son comparables con aquellas del material de referencia y del lote S9802A (ver Actividad Biológica y Tabla 4) . CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO Se utilizó cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para determinar el grado de agregación en Pertuzumab. Las muestras se analizaron en una columna TOSOHAAS TSK G3000SWXL™ (7.8 mm x 300 mm) . Se utilizó elución isocrática (100 mM fosfato de potasio, pH 6.8, 0.5 mL/minutos) con absorbencia ultravioleta (UV) monitoreada a 280 nm. Los datos SEC para el material de referencia, Lote S9802A, y para el material de desarrollo del proceso, escala 400 L, ronda 1, - - se despliegan en la Figura 10. El monómero se encuentra consistentemente en 99.6% por área pico, y el agregado se encuentra por debajo de 0.3% en todos los materiales analizados . ANÁLISIS CE-SDS-LIF También se utilizó análisis capilar de electroforesis-sodio dodecil sulfato con fluorescencia inducida por láser (CE-SDS-LIF) para establecer la pureza de las muestras Pertuzumab. Se observaron electroferogramas similares para el material de referencia, el Lote S9802A y el material de desarrollo del proceso, escala 400 L, ronda 1, con y sin reducción (Figuras HA y 11B) . Los niveles de cadena pesada no glicosilada determinados a partir de los electroferogramas de los materiales reducidos, se encuentran entre 2.6% y 4.3% (con respecto a la cadena pesada total). La cantidad de agregados en estas muestras (no reducidas) determinada mediante análisis CE-SDS-LIF son consistentes con los resultados SEC. No se encontró evidencia de fragmentos del producto significativos u otras impurezas en el análisis CE-SDS-LIF de estas muestras. Los datos de CE-SDS-LIF sugieren que el perfil de impurezas de los materiales de desarrollo del proceso, escala 400 L, es similar al del material de referencia y el Lote S9802A. ANÁLISIS SDS-PAGE Se efectuó el análisis de electroforesis de SDS-gel - de poliacrilamida (SDS-PAGE) (4%-20% T gel (Daiichi Puré Chemicals Co., Tokyo, Japón) con coloración SYPRORUBY™) para comparar las muestras reducidas e intactas del material de referencia, el Lote S9802A, y los materiales de desarrollo del proceso, escala 400 L. No se observaron bandas nuevas en los materiales de desarrollo del proceso, escala 400 L, indicando de nuevo que el perfil de impurezas total en los materiales de desarrollo del proceso, escala 400 L es similar al del material de referencia y el Lote S9802A. ANÁLISIS DEL MAPA DE PEPTIDO TRÍPTICO Y LYS-C Se efectuaron análisis del mapa de péptido tríptico y Lys-C para examinar y comparar la estructura primaria de Pertuzumab en el material de referencia, Lote S9802A, y los materiales de desarrollo del proceso, escala 400 L. Se digirieron alícuotas de Pertuzumab reducido y S-carboximetilado con tripsina, y se digirieron alícuotas de Pertuzumab reducido y sulfitolizado con endoproteinasa Lys-C. La digestión de tripsina se separó mediante cromatografía en fase inversa utilizando una columna VYDAC C-18™ (4.6 mm x 250 mm) con un gradiente de acetonitrilo al 0%-60%. La absorbencia se monitoreó a 214 nm, y se determinaron las masas de péptido mediante ESI-MS utilizando un THERMO FINNIGAN LCQ™. La digestión de Lys-C se separó mediante cromatografía en fase inversa utilizando una columna ZORBAX C-8™ (4.6 mm x 150 mm) con un gradiente de alcohol - isopropílico (IPA) al 0%-100%. La absorbencia se monitoreó a 214 nm, y las masas de péptido se determinaron utilizando ESI-MS utilizando un THERMO FINNIGAN LCQ™. Los mapas de tríptico y de péptido Lys-C para el material de referencia, el Lote S9802A y los materiales de desarrollo del proceso, escala 400 L, ronda 1, se comparan en la Figura 12A y la Figura 12B, respectivamente. Los mapas tanto de tríptico como de Lys-C para los tres materiales son esencialmente idénticos. La mayoría de los péptidos se identificaron mediante LC-MS y se emparejaron con una masa de péptido esperada. Los péptidos trípticos observados identificaron 97.1% (436/449) de los residuos de cadena pesada y 95.8% (205/214) de los residuos de cadena ligera. La cubierta de secuencia es 98.4% (442/449) y 70.6% (151/214) para la cadena pesada y ligera respectivamente, en el mapa de Lys-C. Se encontró que el péptido de terminación N conteniendo la extensión VHS se co-eluye con el péptido de terminación N sin la extensión VHS en el mapa de péptido tríptico mediante LC-MS. No se detectaron cantidades significativas de péptidos deaminados u oxidados en los mapas de péptido. ACTIVIDAD BIOLÓGICA La actividad biológica de Pertuzumab se determinó midiendo su capacidad para inhibir la proliferación de una línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-175-VII . Las actividades específicas porcentuales obtenidas para cinco muestras de los materiales de desarrollo del proceso, escala 400 L (Tabla 4) se encuentran en el rango de 90%- 96% y similares a las actividades para el material de referencia (100% por definición) y el Lote S9802A (98% reportado en Certifícate of Analysis) . Como se esperaba, la heterogeneidad de carga no afecta la potencia de Pertuzumab. Todos los materiales tienen actividades anti-proliferación comparables . ANÁLISIS DE OLIGOSACÁRIDO DE UNIÓN N Parte de la heterogeneidad de masa en la cadena pesada surge de la glicosilación en Asn-299. Para establecer la heterogeneidad de los oligosacáridos, se digirieron muestras de Pertuzumab durante la noche con PNGasa F para liberar glicanos unidos a N. Los oligosacáridos liberados se derivatizaron entonces con el fluoróforo 9-amino-l, 4 , 6-trisulfonato (APTS) . Las formas glicano individuales se separaron mediante electroforesis capilar (CE) (Beckman P/ACE 5500 CE equipado con capilares recubiertos Beckman) y se cuantificaron con detección de fluorescencia. Los electroferogramas del análisis CE de los oligosacáridos neutros liberados del material de referencia, el lote S9802A y los materiales de desarrollo del proceso, escala 400 L, ronda 1, se muestran en la Figura 13. Para referencia, las estructuras oligosacárido comúnmente - - encontradas en anticuerpos IgGl, y un resumen de la nomenclatura utilizada se incluyen en la Figura 14. Las cantidades relativas de oligosacáridos en todos los materiales se resumen en la Tabla 5. Los oligosacáridos con estructuras GO y Gl son los glicanos predominantes. Los picos que surgen de otras estructuras de oligosacárido también se observaron en los electroferogramas. Estas estructuras incluyen glicoformas G2, GO-F, G-l, Man5, y Gl-1 (o Man6) . Además, las isoformas se encuentran disueltas. Las distribuciones de los glicanos observados son similares en todos los materiales (Tabla 5) . Sin embargo, en comparación con el material de referencia y los materiales de desarrollo del proceso, escala 400 L, el material de Fase II (Lote S9802A) tiene una cantidad menor de glicanos con una estructura GO y más glicanos con estructura Gl . A pesar de las diferencias en la distribución de glicanos, todos los materiales tienen actividades biológicas similares. Adicionalmente, el cambio en la heterogeneidad del glicano no tuvo un impacto significativo en la afinidad de unión de Pertuzumab para FcRn (Tabla 6) o receptores Fc gamma (Tabla 7) (ver Análisis de Unión del Receptor FcRn y del Receptor Gamma Fc) . También se analizaron los oligosacáridos neutros liberados mediante espectrometría de masa MALDI-TOF (MALDI-TOF/MS) . El espectro MALDI-TOF para los oligosacáridos neutros liberados del material de referencia, el lote S9802A, y el material de desarrollo del proceso, escala 400 L, ronda 1, se comparan en la Figura 15. La estructura glicano y la distribución obtenida del análisis MALDI-TOF/MS son consistentes con los resultados CE. ANÁLISIS DE ENFOQUE CAPILAR ISOELÉCTRICO Se utilizó enfoque capilar isoeléctrico (cIEF) para determinar el pl de Pertuzumab en el material de referencia, el lote S9802A, y el material de desarrollo del proceso, escala 400 L, ronda 1. Aunque las cantidades relativas de las diferentes especies cargadas en estos materiales fueron de algún modo diferentes como se observó en el análisis CEC, se encontró que el pl de la especie principal fue de 8.7 en todas las muestras. ANÁLISIS DE SULFHIDRILO LIBRE El material de referencia, el Lote S9802A, y los materiales de desarrollo del proceso, escala 400 L, se probaron por tiol libre (residuo cisteína no emparejado) utilizando el análisis de Ellman. El nivel de tiol libre se encontró por debajo del límite de detección (aproximadamente 0.05 mol de tiol libre por mol de proteína) en todos los materiales probados. ANÁLISIS DE UNIÓN DEL RECEPTOR FcRn Se compararon las afinidades de unión del receptor FcRn de Pertuzumab del material de referencia, el lote S9802A, y los materiales de desarrollo del proceso, escala 400 L, utilizando un análisis ELISA similar al descrito en Shields et al,. J. Biol. Chem., 276:6591-6604 (2001). El material de referencia se utilizó como un estándar en este análisis. Placas MAXISORP™ de 96 micro pozos (Nunc. Rosklide, Dinamarca) se recubrieron primero con NEUTRAVADIN™ (Pierce, Rockford, IL) a 4°C durante la noche. Se agregó entonces FcRn humano biotinilado a las placas a 2 :g/ml y se incubó durante una hora. Se agregaron once diluciones en serie dos veces de muestras de Pertuzumab (3.1-3200 ng/ml) a las placas y se incubó durante dos horas . El Pertuzumab unido se detectó agregando IgG F(ab')2 anti-humano de F(ab')2 de cabra marcado con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) y utilizando 3 , 3 ', 5, 5' -tetrametil benzidina (TMB) (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) como sustrato. La absorbencia se leyó a 450 nm en un lector TITERTEK MULTISKAN™ (MCC/340) (ICN, Costa Mesa, CA) . También se evaluó la afinidad de unión de FcRn de Pertuzumab en un segundo formato ELISA en el cual HER2-ECD se recubrió en placas. Las muestras de Pertuzumab diluidas en serie se agregaron a las placas y se incubaron durante dos horas . Las placas se lavaron y se agregaron 2 mg/ml de FcRn humano biotinilado. Se detectó FcRn unido utilizando estreptavidina-HRP con TMB como sustrato.

- - Se determinó la absorbencia en el punto medio de la curva de titulación (mid-OD) del estándar (i.e., material de referencia) y las concentraciones correspondientes del estándar y las muestras en este mid-OD. La afinidad de unión relativa se calculó dividiendo la concentración mid-OD del estándar entre el de la muestra. Las afinidades de unión relativas de FcRn obtenidas de ambos formatos ELISA se listan en la Tabla 6. Los datos de los dos diferentes formatos ELISA son comparables. Aunque las distribuciones de glicano en diferentes materiales de Pertuzumab no son idénticas, las afinidades de unión FcRn de estos materiales son comparables, indicando que la heterogeneidad en Pertuzumab no tiene un efecto aparente en su afinidad de unión FcRn. ANÁLISIS DE UNIÓN DEL RECEPTOR Fc GAMMA La unión de Pertuzumab a los receptores Fc gamma humanos (Fc (R) se estableció mediante un análisis ELISA de acuerdo con Shields et al., J. Biol. Chem., 276:6591-6604 (2001) con modificaciones. La IgG monomérica puede unirse al Fc (Ría de alta afinidad (CD64) ; sin embargo, los receptores de baja afinidad (Fc(RIIa (CD32A) , Fc(RIIb (CD32B) , y Fc(RIIIa (CD16) ) requieren IgG multimérica para una unión significativa. En consecuencia, para los análisis de unión de receptor de baja afinidad, se formaron multímeros de Pertuzumab antes del análisis mezclando cada muestra (200 mg/ml) con cadena kappa anti-humano de cabra (400 mg/ml: ICN Biomedical, Irvine, CA) . El Fc (R humano se expresó como proteínas de fusión recombinantes del dominio extracelular de las cadenas alfa del receptor con Gly/His6/GST (glicina (6 histidinas/glutationa-s-transferasa) . Se utilizaron placas de análisis recubiertas con anti-GST, bloqueadas con albúmina de suero bovino (BSA) para capturar el Fc(R. Los receptores (100 ml a 0.25 mg/ml) se agregaron a las placas y se incubaron durante 1 hora. Se agregaron diluciones en serie de Pertuzumab (100 ml) como monómeros para Fc (Ría y como multímeros para el Fc (R de baja afinidad, y las placas se incubaron durante dos horas . El Pertuzumab unido se detectó agregando conjugado de peroxidasa horseradish-F (ab' ) 2 anti-humano de cabra (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) y utilizando TMB como sustrato. Los valores EC50 para la unión de Pertuzumab al Fc (R se determinaron mediante análisis de regresión no lineal con un modelo de cuatro parámetros (KaleidaGraph, Synergy Software, Reading, PA) . Se utilizó RITUXAN® (Lote C2B81298-2) como anticuerpo de control . Los valores EC50 para la unión de Pertuzumab a Fc (R se resumen en la Tabla 7. Los resultados muestran que el material de referencia, el lote S9802A y los materiales de desarrollo del proceso, escala 400 L, tienen afinidades de - unión comparables para Fc(R. Estos resultados sugieren que la heterogeneidad del glicano en Pertuzumab no tiene un efecto significativo en sus afinidades de unión para Fc(R.

Tabla 2A Análisis de Secuencia de Terminal N de Material de Referencia de Pertuzumab (nmol del residuo observado en cada ciclo) Ciclo Residuo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ALA 0.01 0.01 0.02 0.04 0.04 0.05 0.06 0.07 0.09 0.09 0.10 0.11 ARG 0.01 0.01 0.01 0.01 0.03 0.03 0.04 0.04 0.05 0.06 0.05 0.06 ASN 0.00 0.00 0.01 0.01 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.06 0.07 ASP 0.48 0.08 0.03 0.04 0.04 0.04 0.05 0.07 0.07 0.08 0.09 0.10 CYS NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA GLN 0.00 0.01 0.92 0.13 0.04 0.46 0.13 0.07 0.08 0.08 0.08 0.09 GLU 0.49 0.05 0.13 0.03 0.03 0.51 0.12 0.07 0.07 0.07 0.07 0.08 GLY 0.01 0.01 0.03 0.03 0.05 0.05 0.05 0.30 0.35 0.36 0.13 0.09 HIS 0.00 0.00 0.00 0.00 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.02 ILE 0.00 0.48 0.06 0.02 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.04 0.04 0.04 LEU 0.00 0.03 0.04 0.43 0.11 0.08 0.09 0.11 0.12 0.13 0.62 0.26 LYS 0.00 0.00 0.03 0.00 0.05 0.06 0.07 0.08 0.08 0.09 0.00 0.12 MET 0.00 0.00 0.00 0.53 0.07 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 PHE 0.00 0.01 0.02 0.02 0.03 0.04 0.05 0.05 0.06 0.07 0.07 0.08 PRO 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.04 0.05 0.32 0.13 0.09 0.09 0.10 SER 0.01 0.01 0.03 0.04 0.05 0.07 0.56 0.16 0.30 0.33 0.18 0.28 THR 0.00 0.01 0.00 0.04 0.33 0.12 0.07 0.07 0.08 0.09 0.10 0.10 TRP 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.01 0.01 0.01 0.01 0.02 0.02 0.02 TYR 0.01 0.01 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.08 0.09 0.10 0.11 0.13 VAL 0.01 0.51 0.08 0.10 0.53 0.15 0.11 0.12 0.14 0.15 0.16 0.51 Cadena ASP ILE GLN MET THR GLN SER PRO SER SER LEU SER ligera Cadena GLU VAL GLN LEU VAL GLU SER GLY GLY GLY LEU VAL pesada Nota : Se dan los nanomoles de los residuos de aminoácido feniltioidantoina observados en cada ciclo. Los residuos de la cadena pesada se dan en tipo negrillas, y los residuos de la cadena ligera están subrayados. Se cargó aproximadamente 0.5 nmol de proteína, equivalente a 1.0 nmol de cada una de las cadenas ligera y pesada. No se observó cisterna (CYS) en el análisis de secuencia.

- Tabla 2B Análisis de Secuencia de Terminal N de Pertuzumab Lote S9802A (nmol del residuo observado en cada ciclo) Ciclo Residuo 1 2 3 4 5 6 7 8 7 10 11 12 ALA 0.01 0.01 0.03 0.04 0.06 0.06 0.08 0.09 0.11 0.12 0.14 0.14 ARG 0.01 0.01 0.02 0.02 0.03 0.03 0.05 0.05 0.06 0.07 0.07 0.08 ASN 0.00 0.00 0.01 0.02 0.02 0.02 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.07 ASP 0.61 0.12 0.04 0.05 0.05. 0.06 0.07 0.09 0.09 0.10 0.11 0.13 CYS NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA GLN 0.00 0.01 1.11 0.22 0.06 0.55 0.19 0.10 0.11 0.11 0.11 0.12 GLU 0.61 0.09 0.15 0.05 0.04 0.61 0.19 0.10 0.09 0.10 0.10 0.11 GLY 0.01 0.01 0.04 0.04 0.06 0.06 0.07 0.37 0.44 0.46 0.19 0.13 HIS 0.00 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.02 0.02 0.02 ILE 0.00 0.56 0.10 0.02 0.04 0.04 0.03 0.04 0.05 0.05 0.05 0.06 LEU 0.00 0.04 0.05 0.51 0.17 0.11 0.12 0.14 0.15 0.17 0.76 0.37 LYS 0.00 0.00 0.04 0.00 0.06 0.08 0.09 0.10 0.11 0.12 0.00 0.16 MET 0.00 0.00 0.01 0.61 0.12 0.03 0.03 0.03 0.02 0.02 0.02 0.03 PHE 0.00 0.01 0.03 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.09 0.10 PRO 0.00 0.01 0.02 0.03 0.05 0.06 0.06 0.37 0.18 0.12 0.12 0.13 SER 0.01 0.02 0.04 0.05 0.06 0.08 0.63 0.24 0.36 0.41 0.24 0.35 THR 0.00 0.01 0.00 0.05 0.39 0.17 0.10 0.10 0.11 0.12 0.13 0.14 TRP 0.00 0.00 0.00 0.00 0.01 0.01 0.01 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 TYR 0.16 0.07 0.05 0.06 0.07 0.08 0.10 0.10 0.12 0.13 0.14 0.16 VAL 0.02 0.58 0.13 0.12 0.62 0.22 0.15 0.16 0.18 0.20 0.21 0.62 Cadena ASP ILE GLN MET THR GLN SER PRO SER SER LEU SER ligera Cadena GLU VAL GLN LEU VAL GLU SER GLY GLY GLY LEU VAL pesada Nota: Se dan los nanomoles de los residuos de aminoácido feniltioidantoina observados en cada ciclo. Los residuos de la cadena pesada se dan en tipo negrillas, y los residuos de la cadena ligera están subrayados. Se cargó aproximadamente 0.5 nmol de proteína, equivalente a 1.0 nmol de cada una de las cadenas ligera y pesada. No se observó cisterna (CYS) en el análisis de secuencia.

Tabla 2C Análisis de Secuencia de Terminal N de Pertuzumab Ronda 1 Escal a 400 L ( nmol del resi dúo observado en cada ciclo) Cic lo Residuo 1 2 3 4 5 6 7 8 7 10 11 12 ALA 0.01 0.02 0.03 0.05 0.06 0.06 0.08 0.10 0.11 0.13 0.14 0.14 ARG 0.03 0.05 0.07 0.09 0.17 0.15 0.20 0.23 0.24 0.29 0.30 0.33 ASN 0.00 0.00 0.01 0.02 0.02 0.03 0.04 0.06 0.07 0.08 0.09 0.09 ASP 0.89 0.08 0.05 0.11 0.08 0.09 0.11 0.15 0.14 0.16 0.18 0.19 CYS NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA GLN 0.00 0.01 1.17 0.11 0.05 0.60 0.12 0.09 0.14 0.12 0.11 0.12 GLU 0.68 0.05 0.19 0.04 0.04 0.62 0.15 0.10 0.10 0.11 0.11 0.12 GLY 0.01 0.01 0.05 0.04 0.08 0.07 0.07 0.37 0.42 0.44 0.16 0.13 HIS 0.00 0.02 0.01 0.01 0.01 0.01 0.02 0.02 0.02 0.03 0.03 0.03 I LE 0.00 0.56 0.03 0.02 0.07 0.04 0.03 0.04 0.05 0.06 0.05 0.06 LEU 0.00 0.04 0.05 0.51 0.15 0.12 0.13 0.15 0.16 0.18 0.79 0.31 LYS 0.00 0.00 0.04 0.05 0.08 0.09 0.10 0.12 0.14 0.15 0.17 0.19 MET 0.00 0.00 0.01 0.65 0.04 0.02 0.05 0.03 0.02 0.02 0.03 0.03 PHE 0.00 0.01 0.03 0.03 0.05 0.05 0.07 0.08 0.08 0.09 0.10 0.11 PRO 0.00 0.01 0.02 0.04 0.05 0.06 0.07 0.41 0.14 0.11 0.13 0.14 SER 0.01 0.02 0.07 0.06 0.08 0.10 0.76 0.21 0.43 0.48 0.23 0.42 THR 0.00 0.01 0.00 0.06 0.57 0.18 0.12 0.16 0.16 0.17 0.18 0.17 TRP 0.00 0.00 0.00 0.00 0.01 0.01 0.01 0.02 0.02 0.02 0.03 0.03 TYR 0.00 0.02 0.04 0.06 0.07 0.08 0.10 0.11 0.13 0.14 0.15 0.17 VAL 0.04 0.56 0.10 0.13 0.62 0.19 0.15 0.17 0.19 0.21 0.22 0.62 Cadena ASP I LE GLN MET THR GLN SER PRO SER SER LEU SER ligera Cadena GLÜ VAL GLN LEU VAL GLU SER GLY GLY GLY LEU VAL pesada VHS- VAL HIS SER ASP ILE GLN MET THR GLN SER PRO SER Cadena ligera Nota: Se dan los nanomoles de los residuos de aminoácido feniltioidantoina observados en cada ciclo. Los residuos de la cadena pesada se dan en tipo negrillas, y los residuos de la cadena ligera están subrayados. Los residuos de la secuencia de la cadena ligera VHS adicional se muestran en cursivas. Se cargó aproximadamente 0.5 nmol de proteína, equivalente a 1.0 nmol de cada una de las cadenas ligera y pesada. No se observó cisterna (CYS) en el análisis de secuencia.0 - Tabla 3A Análisis Cromatográfico de Intercambio Catiónico de Pertuzumab Nativo (% de área pico) Pico Variante de Intercambio Iónico Muestra A B c D E F Materia; . de 10 73 10 3 3 0.4 Referencia S9802A 20 68 5 2 4 0.2 Ronda 1 Escala 16 65 5 2 10 0.9 400 L Ronda 2 Escala 15 67 5 2 9 0.6 400 L Ronda 3 Escala 15 67 6 2 10 0.6 400 L Ronda 5 Escala 15 67 5 2 9 0.5 400 L Ronda 6 Escala 13 63 9 3 9 0.6 400 L Nota: La Ronda 4 de 400 L no se encuentra disponible debido a la contaminación del cultivo de inoculo de 100 L en el Día 2.

Tabla 3B Análisis Cromatográfico de Intercambio Catiónico de Pertuzumab Digerido con CPB (% de área pico) Pico Variante de Intercambio Iónico Muestra A B c D E F Material de 11 78 4 ND 4 ND Referencia S9802A 20 71 3 ND 4 ND Ronda 1 Escala 17 68 3 ND 10 ND 400 L Ronda 2 Escala 15 71 3 ND 9 ND 400 L Ronda 3 Escala 15 71 3 ND 10 ND 400 L Ronda 5 Escala 17 70 3 ND 9 ND 400 L Ronda 6 Escala 16 71 3 ND 9 ND 400 L Nota: Las fracciones A a F se definen en la Figura 9B. Todos los valores se redondean a dos figuras significativas. Los totales en cualquier hilera no pueden agregarse al 100% debido al redondeo Tabla 4 Actividades Específicas de Pertuzumab mediante un Ensayo de Anti-Proliferación en Base a Células Material Actividad % CV Específica % Material de Referencia 100a S9802A 98b 10 Ronda 1 Escala 400 L 96c 18 Ronda 2 Escala 400 L 90c 11 Ronda 3 Escala 400 L 96c 17 Ronda 5 Escala 400 L 96c 3 Ronda 6 Escala 400 L 95c 3 Nota: La Ronda 4 de 400 L no se encuentra disponible debido a la contaminación del cultivo de inoculo de 100 L en el Día 2. a Por definición, la actividad específica del Material de Referencia es de 100%. b Valor reportado para el Lote S9802A c El valor representa el promedio de tres ensayos Tabla 5 Distribución de Estructuras de Oligonucleótidos en Pertuzumab Determinada por CE Muestra %G0- G-1% %Man5 %G0 %Man6 %Gla %G2 F +%G1-1 Material de Referencia 1 4 1 71 2 19 2 S9802A 1 4 1 62 2 27 3 Ronda 1 Escala 400 L 2 6 1 73 3 15 2 Ronda 2 Escala 400 L 1 6 1 77 2 13 1 Ronda 3 Escala 400 L 2 6 1 74 4 14 1 Ronda 5 Escala 400 L 1 5 1 71 2 18 1 Ronda 6 Escala 400 L 1 5 1 71 3 18 1 Nota: La Ronda 4 de 400 L no se encuentra disponible debido a la contaminación del cultivo de inoculo de 100 L en el Día 2. a Suma de los dos isómeros Gl .

Tabla 6 Afinidades Relativas de Unión de Pertuzumab para FcRn Afinidad Relativa de Unión Formato de Formato de Recubrimi ento Recubrimiento de Muestra de NeutrAvidina Her2ECD Material de Referencia (Estándar) 1.00 1.00 S9802A 1.34 1.30 Ronda 1 Escala 400 L 10.4 1.22 Ronda 2 Escala 400 L 1.09 1.31 Ronda 3 Escala 400 L 1.14 1.42 Ronda 5 Escala 400 L 1.22 1.36 Ronda 6 Escala 400 L 1.06 1.29 Nota: La Ronda 4 de 400 L no se encuentra disponible debido a la contaminación del cultivo de inoculo de 100 L en el Día 2. a Se determinó la absorbencia en el punto medio de la curva de titulación (OD medio) del estándar (i.e., Material de Referencia) y las concentraciones correspondientes del estándar y muestras en el OD media. La afinidad relativa de unión se determinó al dividir la concentración de OD media entre el de la muestra Tabla 7 Valores EC50 para la Unión de Pertuzumab a los Receptores Fc Gamma Fc?R Illa Fc?R Illa Fc?R la Fc?R lia Fc?R IIb (F158) (V158) Muestra Pro . SD Prom. SD Prom. SD Prom. SD Prom. SD Material de Referencia 0.0081 0.0014 5.8 1.8 57 17 14.0 1.4 1.8 0.1 S9802A 0.0078 0.0020 5. 1.9 45 17 7.8 0.3 1.1 0.1 Ronda 1 Escala 400 L 0.0079 0.0013 5.4 1.5 70 25 8.4 0.9 1.2 0.1 Ronda 2 Escala 400 L 0.0074 0.0016 5.8 1.6 5 18 10. ? 0.7 1.4 0.2 Ronda 3 Escala 400 L 0.0075 0.0015 5.5 1.1 5 10 8.2 0.9 1.2 0.1 Ronda 5 Escala 400 L 0.0076 0.0011 6.1 2.7 50 12 10.9 1.5 1.4 0.2 Ronda 6 Escala 400 L 0.0080 0.0005 6.2 1.9 44 1 10.3 0.9 1.4 0.2 Nota: Los Promedios y desviaciones estándar (SD) se obtuvieron de múltiples rondas de los ensayos (N=4) . El receptor Fc?RIIIa tuvo dos versiones: F158 y V158. La Ronda 4 de 400 L no se encuentra disponible debido a la contaminación del cultivo de inoculo de 100 L en el Día 2.

Claims

-
REIVINDICACIONES 1. Una composición que comprende un anticuerpo HER2 de especie principal que se une al dominio II de HER2 , y una variante de secuencia de aminoácidos del mismo que comprende una extensión delantera de la terminal amino. 2. La composición de la reivindicación 1, en donde la extensión delantera de la terminal amino se encuentra en una cadena ligera de la variante de anticuerpo.
3. La composición de la reivindicación 2, en donde la extensión delantera de la terminal amino se encuentra en una o dos cadenas ligeras de la variante de anticuerpo.
4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo HER2 de especie principal y la variante de anticuerpo son ambos anticuerpos intactos.
5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo HER2 de especie principal comprende secuencias de aminoácidos variable ligera y variable pesada en las SEQ ID Nos. 3 y 4, respectivamente .
6. La composición de la reivindicación 5, en donde el anticuerpo HER2 de especie principal comprende secuencias de aminoácidos de cadena ligera y de cadena pesada en las SEQ ID Nos. 15 y 16, respectivamente.
7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde aproximadamente el 20% o menos de las moléculas de anticuerpo en la composición comprende una extensión delantera de la terminal amino.
8. La composición de la reivindicación 7, en donde aproximadamente del 1% a aproximadamente el 15% de las moléculas de anticuerpo en la composición comprenden una extensión delantera de la terminal amino.
9. La composición de la reivindicación 8, en donde del 5% a aproximadamente el 15% de las moléculas de anticuerpo en la composición comprenden una extensión delantera de la terminal amino, cuantificado mediante análisis de intercambio catiónico.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la extensión delantera de la terminal amino comprende VHS- .
11. El método de la reivindicación 10, en donde la extensión delantera de la terminal amino consiste de VHS- .
12. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además una segunda variante de secuencia de aminoácidos del anticuerpo HER2 de especie principal .
13. La composición de la reivindicación 12, en donde la segunda variante de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo que comprende un residuo - de lisina de terminación C en una o ambas de sus cadenas pesadas, una variante de anticuerpo deamidada, y un anticuerpo con uno o más residuos de metionina oxidados.
14. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además una variante de glicosilación del anticuerpo de especie principal .
15. La composición de la reivindicación 14, en donde la variante de glicosilación se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo que comprende una estructura de oligosacárido Gl o G2 unida a una región Fc del mismo, un anticuerpo que comprende un residuo de carbohidrato unido a una cadena ligera del mismo, un anticuerpo que comprende una cadena pesada no glicosilada, y un anticuerpo con una estructura de oligosacárido sialidada unida a una región Fc del mismo.
16. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo de especie principal se une a la unión entre los dominios I, II y III de HER2.
17. Una formulación farmacéutica que comprende la composición de la reivindicación 1 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
18. La formulación farmacéutica de la reivindicación 17 que es estéril. - -
19. Una composición que comprende un anticuerpo HER2 de especie principal que comprende secuencias ligera variable y pesada variable en las SEQ ID Nos. 3 y 4, respectivamente, y una variante de secuencia de aminoácidos del anticuerpo de especie principal que comprende una extensión delantera de la terminal amino VHS unida a uno o dos de sus dominios ligeros variables, en donde de aproximadamente 1% a aproximadamente 20% de las moléculas de anticuerpo en la composición, comprenden una extensión VHS delantera de terminal amino.
20. Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO. 23, o una variante deamidada y/u oxidada del misma.
21. Un anticuerpo que comprende (a) una cadena ligera que comprende el polipéptido de la reivindicación 20, y (b) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 24 y una variante deamidada y/u oxidada de la SEQ ID NO. 16 o la SEQ ID NO. 24.
22. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 21 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
23. Un método para tratar cáncer que expresa HER2 en un paciente, que comprende la administración de la formulación farmacéutica de la reivindicación 17 al paciente en una cantidad efectiva para tratar el cáncer.