JP2011173914A - Ｈｅｒ２抗体組成物 - Google Patents

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Abstract

【課題】上皮成長因子レセプター（ＨＥＲ１）等のＨＥＲファミリーのレセプターチロシンキナーゼ、特にＨＥＲ２の関与する癌の処置に有効な抗体の提供。
【解決手段】ＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する主要種ＨＥＲ２抗体と、アミノ末端リーダー伸長を含むそのアミノ酸配列変異体とを含む組成物。また、該組成物を含む薬学的製剤、及びその治療上の使用。
【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、ＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する主要種ＨＥＲ２抗体と、アミノ末端リーダー伸長を含むそのアミノ酸配列変異体とを含む組成物に関するものである。本発明は、その組成物を含む薬学的製剤およびその組成物についての治療上の使用にも関するものである。
発明の背景
ＨＥＲ抗体
ＨＥＲファミリーのレセプターチロシンキナーゼは、細胞の成長、分化、および生存の重要な仲介物質である。このレセプターファミリーには、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ、ＢｒｂＢ１、またはＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）を含めた四つの異なるメンバーがある。
ｅｒｂＢ１遺伝子によってコードされるＥＧＦＲは、ヒトの悪性腫瘍の原因となると関係づけられている。特に、ＥＧＦＲの発現増加が乳ガン、膀胱ガン、肺ガン、頭部ガン、頚部ガン、および胃ガン、ならびに神経膠芽腫で観察されている。レセプターＥＧＦＲの発現増加は、同じ腫瘍細胞によるＥＧＦＲリガンドであるトランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）の産生増加としばしば関連し、その結果として自己分泌刺激経路によるレセプター活性化が生じる。Baselga and Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994)。ＥＧＦＲまたはそのリガンドであるＴＧＦ−αおよびＥＧＦに対するモノクローナル抗体は、そのような悪性腫瘍の処置における治療薬として評価されてきた。例えば、Baselga and Mendelsohn、上記; Masui et al., Cancer Research 44:1002-1007 (1984);およびWu et al., J. Clin. Invest. 95:1897-1905 (1995)を参照されたい。
ＨＥＲファミリーの第２のメンバーであるｐ１８５ｎｅｕは、化学処置されたラットの神経芽細胞腫由来のトランスフォーミング遺伝子産物としてもともと同定された。ｎｅｕプロトオンコジーンの活性化型は、コードされたタンパク質の膜貫通領域における（バリンからグルタミン酸への）点突然変異に起因する。ｎｅｕのヒトホモログの増幅は、乳ガンおよび卵巣ガンで観察され、予後不良と相関する（Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989); および米国特許第４，９６８，６０３号）。これまで、ｎｅｕプロトオンコジーンにおける点突然変異に類似した点突然変異は、ヒト腫瘍については報告されていない。ＨＥＲ２の過剰発現（遺伝子増幅が原因で頻繁であるが一様ではない）は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓、および膀胱のガン腫を含めたその他のガン腫でも観察されている。数ある中で、King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al, Lancet 1:765-767 (1986); Fukushige et al., Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986); Guerin et al., Oncogene Res., 3:21- 31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38:364(1990); Weiner et al., Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cancer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3:254-257 (1990); Aasland et al., Br. J. Cancer 57:358-363 (1988); Williams et al. Pathobiology 59:46-52 (1991);およびMcCann et al., Cancer, 65:88-92 (1990)を参照されたい。ＨＥＲ２は前立腺ガンで過剰発現していることがある（Gu et al., Cancer Lett. 99:185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol. 28:827-33 (1997); Ross et al., Cancer 79:2162-70 (1997);およびSadasivan et al., J. Urol. 150:126-31 (1993)）。
ラットｐ１８５ｎｅｕおよびヒトＨＥＲ２タンパク質産物に対する抗体が記載されている。Drebinおよび共同研究者らは、ラットｎｅｕ遺伝子産物であるｐ１８５ｎｅｕに対する抗体を産生させた。例えば、Drebin et al., Cell 41:695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198:277-290 (1991);およびＷＯ９４／２２４７８を参照されたい。Drebin et al., Oncogene 2:273-277 (1988)は、ｐ１８５ｎｅｕの二つの異なる領域と反応する抗体の混合物が、ヌードマウスに移植した、ｎｅｕでトランスフォーメーションしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞に相乗的な抗腫瘍効果を招くと報告している。１９９８年１０月２０日に発行された米国特許第５，８２４，３１１号も参照されたい。
Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172 (1989)は、ヒト乳房腫瘍細胞系ＳＫ−ＢＲ−３を用いて特徴付けられたＨＥＲ２抗体の一団の発生を記載している。抗体を曝露した後に、７２時間後に単層をクリスタルバイオレットで染色することによって、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の相対的な細胞増殖を決定した。このアッセイを用いて、細胞増殖を５６%阻害した４Ｄ５と呼ばれる抗体で最大阻害が得られた。この一団のその他の抗体は、このアッセイではより少ない程度に細胞増殖が低減した。この抗体４Ｄ５は、ＨＥＲ２を過剰発現している乳房腫瘍細胞系を、ＴＮＦ−αの細胞毒性作用に対して感作することがさらに見出された。１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７１号も参照されたい。Hudziakらに論じられたＨＥＲ２抗体は、Fendly et al., Cancer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts et al., In Vitro 26(3):59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin. Immunol. 11(3):117-127 (1991); Kumar et al., Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986 (1991); Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al., Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al., Cancer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994); Scott et al., J. Biol. Chem. 266:14300-5 (1991); D'souza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206 (1994); Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465 (1996);およびSchaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997)にさらに特徴付けられている。
組換えヒト化バージョンのマウスＨＥＲ２抗体４Ｄ５（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２、トラスツズマブ、またはHERCEPTIN（登録商標）；米国特許第５，８２１，３３７号）は、以前に大規模な抗ガン治療を受けた、ＨＥＲ２過剰発現転移性乳ガンを有する患者に臨床的に活性である（Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996））。トラスツズマブは、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現する転移性乳ガン患者の処置に、１９９８年９月２５日に食品医薬品局から販売許可を受けた。
種々の特性を有するその他のＨＥＲ２抗体は、Tagliabue et al., Int. J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene 4:543-548 (1989); Maier et al., Cancer Res.51:5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al., Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cancer 53:401-408 (1993);ＷＯ９４／００１３６; Kasprzyk et al., Cancer Research 52:2771-2776 (1992);Hancock et al., Cancer Res.51:4575-4580 (1991); Shawver et al., Cancer Res.54:1367-1373 (1994); Arteaga et al., Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); 米国特許第５，７８３，１８６号;およびKlapper et al., Oncogene 14:2099-2109 (1997)に記載されている。
ホモロジースクリーニングの結果として、レセプターＨＥＲファミリーの２つの他のメンバー、すなわちＨＥＲ３（米国特許第５，１８３，８８４号および第５，４８０，９６８号、ならびにKraus et al., PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)）およびＨＥＲ４（ＥＰ特許出願第５９９，２７４号；Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993);およびPlowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)）を同定した。これらのレセプターの両方は、少なくとも一部の乳ガン細胞系上で増加した発現を示す。
これらのレセプターＨＥＲは、一般に、細胞に様々な組み合わせで見い出され、ヘテロ二量体化は、多様なＨＥＲリガンドに対する細胞応答の多様性を増加させると考えられる（Earp et al., Breast Cancer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)）。ＥＧＦＲは、六つの異なるリガンド、すなわち上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、アンフィレグリン、ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベータセルリン、およびエピレグリンによって結合される（Groenen et al., Growth Factors 11:235-257 (1994)）。単一の遺伝子の選択的スプライシングに起因するヘレグリンタンパク質ファミリーは、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４に対するリガンドである。このヘレグリンファミリーには、アルファヘレグリン、ベータヘレグリン、およびガンマヘレグリン（Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); 米国特許第５，６４１，８６９号;およびSchaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997)）;ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、グリア成長因子（ＧＧＦ）；アセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）；および感覚および運動神経細胞由来因子（ＳＭＤＦ）がある。総説については、Groenen et al., Growth Factors 11:235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262 (1996)、およびLee et al., Pharm. Rev. 47:51-85 (1995)を参照されたい。最近、三つの追加のＨＥＲリガンドが同定された。それらは、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４のいずれかと結合することが報告されているニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）（Chang et al., Nature 387 509-512 (1997);およびCarraway et al., Nature 387:512-516 (1997)）；ＨＥＲ４と結合するニューレグリン−３（Zhang et al., PNAS (USA) 94(18):9562-7 (1997)）；およびＨＥＲ４と結合するニューレグリン−４（Harari et al., Oncogene 18:2681-89 (1999)）である。ＨＢ−ＥＧＦ、ベータセルリン、およびエピレグリンもまたＨＥＲ４に結合する。
ＥＧＦおよびＴＧＦαはＨＥＲ２と結合しないが、ＥＧＦは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２を刺激してヘテロ二量体を形成させ、このヘテロ二量体はＥＧＦＲを活性化して、その結果としてこのヘテロ二量体中のＨＥＲ２のリン酸基転移が生じる。二量体化および／またはリン酸基転移は、ＨＥＲ２チロシンキナーゼを活性化するようである。Earpら、上記を参照されたい。同様に、ＨＥＲ３がＨＥＲ２と同時発現すると、活性なシグナル伝達複合体が形成し、ＨＥＲ２に対する抗体はこの複合体を破壊できる（Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994)）。追加的に、ＨＥＲ２と同時発現すると、ヘレグリン（ＨＲＧ）に対するＨＥＲ３の親和性はより高い親和性状態に増大する。ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体に関しては、Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1431-1435 (1995);およびLewis et al., Cancer Res., 56:1457-1465 (1996)もまた参照されたい。ＨＥＲ４は、ＨＥＲ３と同様に、ＨＥＲ２と共に活性なシグナル伝達複合体を形成する（Carraway and Cantley, Cell 78:5-8 (1994)）。
ＨＥＲシグナル伝達経路をターゲティングするために、ＨＥＲ２とその他のレセプターＨＥＲとの二量体化を阻害することによって、リガンドが駆動するリン酸化および活性化、ならびに下流のＲＡＳおよびＡＫＴ経路の活性化を阻害するヒト化抗体として、ｒｈｕＭＡｂ２Ｃ４（パーツズマブ、OMNITARG(商標)）が開発された。固形腫瘍を処置するための単剤としてのパーツズマブのフェーズＩ試験では、進行卵巣ガンを有する被験者３人がパーツズマブで処置された。１人が持続性の部分反応を有し、もう１人の被験者が１５週間安定した疾患を有した。Agusら、Proc Am Soc Clin Oncol 22: 192, Abstract 771 (2003)。
抗体変異体組成物
米国特許第６，３３９，１４２号は、抗ＨＥＲ２抗体および一つまたは複数のその酸性変異体の混合物を含むＨＥＲ２抗体組成物を記載しており、ここで、その酸性変異体の量は約２５%未満である。トラスツズマブは例示的なＨＥＲ２抗体である。
Well Characterized Biotech Pharmaceuticals Conference（２００３年１月）"Effects of Cell Culture Process Changes on Humanized Antibody Characteristics"で発表されたReidらのポスターは、ＶＨＳシグナルペプチド、Ｎ末端グルタミン、および重鎖上のピログルタミン酸の組み合わせが原因でＮ末端不均一性を有する無名のヒト化ＩｇＧ１抗体組成物を記載している。
IBC Antibody Production Conference（２００２年、２月）でポスター発表されたReedらの"The Ideal Chromatographic Antibody Characterization Method"は、ヒト化抗ＩｇＥ抗体であるＥ２５の重鎖上にあるＶＨＳ伸長を報告している。
WCBP "Top Down' Glycoprotein Characterization by High Resolution Mass Spectrometry and Its Application to Biopharmaceutical Development"（２００４年１月６〜９日）で発表されたRouseらのポスターは、その軽鎖の−３ＡＨＳまたは−２ＨＳシグナルペプチド残基の結果として生じた、Ｎ末端不均一性を有するモノクローナル抗体組成物を記載している。
IBC Meeting（２０００年９月）"Strategic Use of Comparability Studies and Assays for Well Characterized Biologicals"での発表において、Jill Porterは重鎖に三つの余分のアミノ酸残基を有する、ＺＥＮＡＰＡＸ（商標）の遅延溶出形態について論じた。
発明の概要
本発明は、ＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する主要種ＨＥＲ２抗体と、アミノ末端リーダー伸長を含むそのアミノ酸配列変異体とを含む組成物に関するものである。
さらに、本発明は、それぞれ配列番号３および４の可変軽鎖および可変重鎖配列を含む主要種ＨＥＲ２抗体と、一つまたは二つの可変軽鎖ドメインに付着したＶＨＳ−アミノ末端リーダー伸長を含む、主要種抗体のアミノ酸配列変異体との混合物を含む組成物を提供し、ここで、この組成物中の抗体分子の約１%から約２０%はＶＨＳ−アミノ末端リーダー伸長を含む。
本発明は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその脱アミド化変異体および／もしくは酸化変異体のみならず、（ａ）そのポリペプチドを含む軽鎖と、（ｂ）配列番号１６、配列番号２４、ならびに配列番号１６または配列番号２４の脱アミド化変異体および／または酸化変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖とを含む抗体にさらに関するものである。
本発明は、薬学的に許容される担体中に組成物を含む薬学的製剤、ならびにガンを処置するのに有効な量で患者にその薬学的製剤を投与することを含む、その患者におけるＨＥＲ２発現ガンを処置する方法にも関するものである。
ＨＥＲ２のタンパク質構造の概略図およびその細胞外ドメインのドメインＩ〜ＩＶ（それぞれ配列番号19〜22）のアミノ酸配列を提供する図である。 マウスモノクローナル抗体２Ｃ４の可変軽鎖（ＶＬ）（図２Ａ）および可変重鎖（ＶＨ）（図２Ｂ）ドメイン（それぞれ配列番号１および２）；ヒト化２Ｃ４バージョン５７４のＶＬおよびＶＨドメイン（それぞれ配列番号３および４）、ならびにＶＬおよびＶＨコンセンサスフレームワーク（ｈｕｍκ１、軽鎖カッパ亜群Ｉ；ｈｕｍＩＩＩ、重鎖亜群ＩＩＩ）（それおれ配列番号５および６）のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。星印は、ヒト化２Ｃ４バージョン５７４とマウスモノクローナル抗体２Ｃ４との間、またはヒト化２Ｃ４バージョン５７４とヒトフレームワークとの間の相違を同定している。相補性決定部（ＣＤＲ）に括弧をつける。 マウスモノクローナル抗体２Ｃ４の可変軽鎖（ＶＬ）（図２Ａ）および可変重鎖（ＶＨ）（図２Ｂ）ドメイン（それぞれ配列番号１および２）；ヒト化２Ｃ４バージョン５７４のＶＬおよびＶＨドメイン（それぞれ配列番号３および４）、ならびにＶＬおよびＶＨコンセンサスフレームワーク（ｈｕｍκ１、軽鎖カッパ亜群Ｉ；ｈｕｍＩＩＩ、重鎖亜群ＩＩＩ）（それおれ配列番号５および６）のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。星印は、ヒト化２Ｃ４バージョン５７４とマウスモノクローナル抗体２Ｃ４との間、またはヒト化２Ｃ４バージョン５７４とヒトフレームワークとの間の相違を同定している。相補性決定部（ＣＤＲ）に括弧をつける。 パーツズマブ軽鎖（配列番号１５）および重鎖（配列番号１６）のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲを太字で示す。糖質部分は重鎖のＡｓｎ２９９に付着している。 パーツズマブ軽鎖（配列番号１５）および重鎖（配列番号１６）のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲを太字で示す。糖質部分は重鎖のＡｓｎ２９９に付着している。 インタクトなアミノ末端シグナルペプチド配列（配列番号１８）をそれぞれ含むパーツズマブ軽鎖（配列番号１７）および重鎖（配列番号１８）のアミノ酸配列を示す図である。 インタクトなアミノ末端シグナルペプチド配列（配列番号１８）をそれぞれ含むパーツズマブ軽鎖（配列番号１７）および重鎖（配列番号１８）のアミノ酸配列を示す図である。 ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位での２Ｃ４の結合によって、活性化ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３とのヘテロ二量体化を阻止することを概略的に示す図である。 ＭＡＰＫ経路およびＡｋｔ経路とのＨＥＲ２／ＨＥＲ３の共役を示す図である。 トラスツズマブおよびパーツズマブの活性を比較する図である。 還元されたパーツズマブ軽鎖（図８Ａ）および重鎖（図８Ｂ）の再構成された質量スペクトルを示す図である。 還元されたパーツズマブ軽鎖（図８Ａ）および重鎖（図８Ｂ）の再構成された質量スペクトルを示す図である。 還元されたパーツズマブ軽鎖（図８Ａ）および重鎖（図８Ｂ）の再構成された質量スペクトルを示す図である。 還元されたパーツズマブ軽鎖（図８Ａ）および重鎖（図８Ｂ）の再構成された質量スペクトルを示す図である。 還元されたパーツズマブ軽鎖（図８Ａ）および重鎖（図８Ｂ）の再構成された質量スペクトルを示す図である。 還元されたパーツズマブ軽鎖（図８Ａ）および重鎖（図８Ｂ）の再構成された質量スペクトルを示す図である。 天然パーツズマブ（図９Ａ）およびＣＰＢで消化されたパーツズマブ（図９Ｂ）の陽イオン交換クロマトグラフィー分析を示す図である。 天然パーツズマブ（図９Ａ）およびＣＰＢで消化されたパーツズマブ（図９Ｂ）の陽イオン交換クロマトグラフィー分析を示す図である。 パーツズマブのサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す図である。 還元されたパーツズマブ（図１１Ａ）およびインタクトなパーツズマブ（図１１Ｂ）のＣＥ−ＳＤＳ−ＬＩＦ分析を示す図である。 還元されたパーツズマブ（図１１Ａ）およびインタクトなパーツズマブ（図１１Ｂ）のＣＥ−ＳＤＳ−ＬＩＦ分析を示す図である。 パーツズマブのトリプシンペプチドマップ（図１２Ａ）およびパーツズマブのＬＹＳ−Ｃペプチドマップ（図１２Ｂ）を示す図である。 パーツズマブのトリプシンペプチドマップ（図１２Ａ）およびパーツズマブのＬＹＳ−Ｃペプチドマップ（図１２Ｂ）を示す図である。 パーツズマブから放出されたＮ−結合オリゴ糖のＣＥ分析を示す図である。 ＩｇＧ抗体で通常観察されるオリゴ糖構造を示す図である。 ＩｇＧ抗体で通常観察されるオリゴ糖構造を示す図である。 パーツズマブから放出された中性オリゴ糖のポジティブモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す図である。 トラスツズマブの軽鎖（配列番号１３）および重鎖（配列番号１４）のアミノ酸配列を示す図である。 トラスツズマブの軽鎖（配列番号１３）および重鎖（配列番号１４）のアミノ酸配列を示す図である。 変異パーツズマブ軽鎖配列（配列番号２３）および変異パーツズマブ重鎖配列（配列番号２４）を示す図である。 変異パーツズマブ軽鎖配列（配列番号２３）および変異パーツズマブ重鎖配列（配列番号２４）を示す図である。
好ましい態様の詳細な説明
Ｉ． 定義
本明細書における用語「主要種抗体」は、組成物中の量的に主要な抗体分子である、その組成物中の抗体アミノ酸配列構造を指す。好ましくは、主要種抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する抗体、ＨＥＲの二量体化をトラスツズマブよりも効果的に阻害する抗体、および／またはＨＥＲ２のヘテロ二量体性結合部位に結合する抗体などのＨＥＲ２抗体である。主要種抗体の本明細書における好ましい態様は、配列番号３および４の可変軽鎖および可変重鎖アミノ酸配列を含む抗体であり、最も好ましくは配列番号１５および１６の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む抗体（パーツズマブ）である。
本明細書における「アミノ酸配列変異体」抗体は、主要種抗体と異なるアミノ酸配列を有する抗体である。通常、アミノ酸配列変異体は、主要種抗体と少なくとも約７０%の相同性を有するものであり、好ましくは、主要種抗体と少なくとも約８０%、さらに好ましくは少なくとも約９０%相同なものである。このアミノ酸配列変異体は、主要種抗体のアミノ酸配列内の、またはそれに隣接したある位置に置換、欠失、および／または付加を有する。本明細書におけるアミノ酸配列変異体の例には、酸性変異体（例えば、脱アミド化抗体変異体）、塩基性変異体、一つまたは二つの軽鎖にアミノ末端リーダー伸長（例えば ＶＨＳ−）を有する抗体、一つまたは二つの重鎖にＣ末端リシン残基を有する抗体、一つまたは複数の酸化メチオニン残基を有する抗体などがあり、重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列に対する変異の組み合わせが含まれる。本明細書において特に関心対象の抗体変異体は、その一つまたは二つの軽鎖にアミノ末端リーダー伸長を含み、場合により主要種抗体と比較したその他のアミノ酸配列および／またはグリコシル化の相違をさらに含む抗体である。
本明細書における「グリコシル化変異体」抗体は、それに付着した一つまたは複数の糖質部分を有する抗体であり、その部分は、主要種抗体に付着した一つまたは複数の糖質部分とは異なる。本明細書におけるグリコシル化変異体の例には、Ｇ０オリゴ糖構造の代わりにＧ１またはＧ２オリゴ糖構造がＦｃ部に付着した抗体、一つまたは二つの糖質部分が一つまたは二つの軽鎖に付着した抗体、抗体の一つまたは二つの重鎖に糖質が付着していない抗体など、および当該グリコシル化変更の組み合わせがある。
抗体がＦｃ部を有する場合、本明細書の図１４に示されたようなオリゴ糖構造を、その抗体の一つまたは二つの重鎖に、例えば残基２９９に付着させることができる。パーツズマブについては、Ｇ０は主要なオリゴ糖構造であり、Ｇ０−Ｆ、Ｇ−１、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｇ１−１、Ｇ１（１−６）、Ｇ１（１−３）およびＧ２などのその他のオリゴ糖構造は、パーツズマブ組成物中にさらに少量みられた。
特に表示しない限り、本明細書における「Ｇ１オリゴ糖構造」には、Ｇ１（１−６）およびＧ１（１−３）構造が含まれる。
本明細書における「アミノ末端リーダー伸長」は、抗体の任意の一つまたは複数の重鎖または軽鎖のアミノ末端に存在するアミノ末端リーダー配列の一つまたは複数のアミノ酸残基を指す。アミノ末端リーダー伸長の例は、抗体変異体の一方もしくは両方の軽鎖に存在する三つのアミノ酸残基ＶＨＳを含むか、またはそれからなる。
「脱アミド化」抗体は、その抗体の一つまたは複数のアスパラギン残基が、例えばアスパラギン酸、スクシンイミド、またはイソアスパラギン酸に誘導体化された抗体である。
「相同性」は、配列をアライメントして、必要ならばギャップを導入して最大の相同率を実現した後で、同一である、アミノ酸配列変異体における残基の率として定義される。アライメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当技術分野で周知である。当該コンピュータプログラムの一つは、Genentech, Inc.によって著作された「Ａｌｉｇｎ２」であり、このプログラムは１９９１年１２月１０日に米国著作権局、Washington, DC 20559にユーザー文書と共に納付された。
本明細書のために、「陽イオン交換分析」は、二つ以上の化合物を含む組成物が陽イオン交換体を用いて電荷の差に基づき分離される任意の方法を指す。陽イオン交換体は、共有結合した負荷電基を一般に含む。好ましくは、本明細書における陽イオン交換体は、弱陽イオン交換体であり、かつ／またはＤｉｏｎｅｘにより販売されるＰＲＯＰＡＣ ＷＣＸ−１０（商標）陽イオン交換カラムなどの、カルボン酸官能基を含む。
「レセプターＨＥＲ」は、レセプターＨＥＲファミリーに属するレセプタータンパク質チロシンキナーゼであり、レセプターＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４、ならびに将来同定されるべき本ファミリーのその他のメンバーを含む。レセプターＨＥＲは、ＨＥＲリガンドと結合できる細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；およびリン酸化されうるいくつかのチロシン残基を保有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを一般に含むものである。好ましくは、レセプターＨＥＲは天然配列のヒトレセプターＨＥＲである。
ＨＥＲ２の細胞外ドメインは、四つのドメイン、すなわちドメインＩ（約１〜１９５のアミノ酸残基）、ドメインＩＩ（約１９６〜３２０のアミノ酸残基）、ドメインＩＩＩ（約３２１〜４８８のアミノ酸残基）、およびドメインＩＶ（約４８９〜６３２のアミノ酸残基）（シグナルペプチドを除いた残基に番号付け）を含む。Garrett et al., Mol. Cell. 11:495-505 (2003), Cho et al., Nature 421:756-760 (2003), Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)、またはPlowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1746-1750 (1993)を参照されたい。また、本明細書の図１も参照されたい。
用語「ＥｒｂＢ１」、「ＨＥＲ１」、「上皮成長因子レセプター」、および「ΕＧＦＲ」は、本明細書において相互交換可能に使用され、例えばCarpenter et al., Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987)に開示されたようなＥＧＦＲを、その天然突然変異体（例えば、Humphrey et al., PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)におけるような欠失突然変異体ＥＧＦＲ)を含めて指す。ｅｒｂＢ１は、ＥＧＦＲタンパク質産物をコードする遺伝子を指す。
表現「ＥｒｂＢ２」および「ＨＥＲ２」は、本明細書において相互交換可能に使用され、例えばSemba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985)およびYamamoto et al., Nature 319:230-234 (1986)に記載されたヒトＨＥＲ２タンパク質（ＧｅｎｅｂａｎｋアクセッションナンバーＸ０３３６３）を指す。用語「ｅｒｂＢ２」は、ヒトＥｒｂＢ２をコードする遺伝子を指し、「ｎｅｕ」は、ラットｐ１８５ｎｅｕをコードする遺伝子を指す。好ましいＨＥＲ２は天然配列のヒトＨＥＲ２である。
「ＥｒｂＢ３」および「ＨＥＲ３」は、例えば、米国特許第５，１８３，８８４号および第５，４８０，９６８号、ならびにKraus et al., PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)に開示されたようなレセプターポリペプチドを指す。
本明細書における用語「ＥｒｂＢ４」および「ＨＥＲ４」は、例えば、ＥＰ特許出願第５９９，２７４号; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993);およびPlowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)に開示されたようなレセプターポリペプチドを、例えば、１９９９年４月２２日に公表されたＷＯ９９／１９４８８に開示されたようなそのアイソフォームを含めて指す。
「ＨＥＲリガンド」により、レセプターＨＥＲに結合し、かつ／またはそれを活性化するポリペプチドを意味する。本明細書において特に関心対象であるＨＥＲリガンドは、上皮成長因子（ＥＧＦ）（Savage et al., J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972)）；トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）（Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)）；神経鞘腫またはケラチン細胞の自己分泌成長因子としても公知であるアンフィレグリン（Shoyab et al., Science 243: 1074-1076 (1989);Kimura et al., Nature 348:257-260 (1990);およびCook et al., Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557 (1991)）；ベータセルリン（Shing et al., Science 259:1604-1607 (1993);およびSasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)）；ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（Higashiyama et al., Science 251:936-939 (1991)）；エピレグリン（Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270:7495-7500 (1995);およびKomurasaki et al., Oncogene 15:2841-2848 (1997)）；ヘレグリン（下記参照）；ニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）（Carraway et al., Nature 387:512-516 (1997)）；ニューレグリン−３（ＮＲＧ−３）（Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:9562-9567 (1997)）；ニューレグリン−４（ＮＲＧ−４）（Harari et al., Oncogene 18:2681-89 (1999)）またはクリプト（cripto）（ＣＲ−１）（Kannan et al., J. Biol. Chem. 272(6):3330-3335 (1997））などの天然配列のヒトＨＥＲリガンドである。ＥＧＦＲと結合するＨＥＲリガンドには、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ベータセルリン、ＨＢ−ＥＧＦ、およびエピレグリンがある。ＨＥＲ３と結合するＨＥＲリガンドには、ヘレグリンがある。ＨＥＲ４と結合できるＨＥＲリガンドには、ベータセルリン、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３、ＮＲＧ−４、およびヘレグリンがある。
本明細書に使用する場合、「ヘレグリン」（ＨＲＧ）は、米国特許第５，６４１，８６９号またはMarchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)に開示されたようなヘレグリン遺伝子産物にコードされるポリペプチドを指す。ヘレグリンの例には、ヘレグリン−α、ヘレグリン−β１、ヘレグリン−β２、およびヘレグリン−β３（Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992);および米国特許第５，６４１，８６９号）；ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）（Peles et al., Cell 69: 205-216 (1992)）；アセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）（Falls et al., Cell 72:801-815 (1993)）；グリア細胞成長因子（ＧＧＦ）（Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)）；感覚および運動神経細胞由来因子（ＳＭＤＦ）（Ho et al., J. Biol. Chem. 270:14523-14532 (1995)）；γ−ヘレグリン（Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997)）がある。本用語は、天然配列のＨＲＧポリペプチドのＥＧＦ様ドメインフラグメント（ＨＲＧβ１１７７−２４４）などの、そのＨＲＧポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントおよび／またはアミノ酸配列変異体を含む。
本明細書における「ＨＥＲ二量体」は、少なくとも二つの異なるレセプターＨＥＲを含む非共有的に会合した二量体である。二つ以上のレセプターＨＥＲを発現している細胞がＨＥＲリガンドに曝露された場合にそのような複合体が形成することがあり、免疫沈降によりその複合体を単離して、例えばSliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)に記載されているようなＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析することができる。当該ＨＥＲ二量体の例には、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、およびＨＥＲ３−ＨＥＲ４ヘテロ二量体がある。さらに、ＨＥＲ二量体は、二つ以上のレセプターＨＥＲ２を、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、またはＥＧＦＲのような異なるレセプターＨＥＲと組み合わせて含みうる。サイトカインレセプターサブユニット（例えばｇｐ１３０）などのその他のタンパク質がその二量体と会合していることがある。
ＨＥＲ２上の「ヘテロ二量体結合部位」は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４と二量体を形成するときにそれらの細胞外ドメイン中の領域と接触または連結するＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域を指す。その領域はＨＥＲ２のドメインＩＩに見い出される。Franklin et al., Cancer Cell 5:317-328(2004)。
「ＨＥＲ活性化」または「ＨＥＲ２活性化」は、任意の一つもしくは複数のレセプターＨＥＲ、またはレセプターＨＥＲ２の活性化またはリン酸化を指す。一般に、ＨＥＲ活性化は（例えば、レセプターＨＥＲにおけるチロシン残基をリン酸化しているレセプターＨＥＲの細胞内キナーゼドメインまたは基質ポリペプチドによって起こる）シグナル伝達を招く。ＨＥＲ活性化は、関心対象のレセプターＨＥＲを含むＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドによって仲介されうる。ＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドは、二量体における一つまたは複数のレセプターＨＥＲ中のキナーゼドメインを活性化することにより、一つもしくは複数のレセプターＨＥＲ中のチロシン残基のリン酸化および／またはＡｋｔもしくはＭＡＰＫ細胞内キナーゼなどの追加の基質ポリペプチド（類）中のチロシン残基のリン酸化を生じうる。
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示す限りはインタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二つのインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、および抗体フラグメントにわたる。
本明細書に使用されるような用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、本明細書に記載する変異体のように、モノクローナル抗体の産生時に生じる可能性のある変異体を除いて、その集団を構成する個別の抗体は同一であり、かつ／または同一のエピトープと結合する。当該変異体は一般に少量存在する。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンが混入していない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるとしてのその抗体の性質を表し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈してはならない。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法により作製することができるし、また、組換えＤＮＡ法によって作製することもできる（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」は、例えばClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載された技法を用いたファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
本明細書におけるモノクローナル抗体には、所望の生物学的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種由来の抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であるが、その鎖（類）の残りが、別の種由来または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびに当該抗体のフラグメントが具体的には含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）。本明細書において関心対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿など）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常部配列を含む「霊長類化（primatized）」抗体がある。
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の部分を含み、その部分は好ましくはその抗原結合部または可変部を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二特異性抗体（diabody）；線状抗体（linear antibody）；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメント（類）から形成された多重特異性抗体がある。
「インタクトな抗体」は、抗原結合性可変部ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖定常ドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３とを含む抗体である。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えばヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体でありうる。好ましくは、インタクトな抗体は一つまたは二つの機能を有し、そしてその一つまたは二つの重鎖に付着したオリゴ糖構造を含む。
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ部（天然配列Ｆｃ部またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ部）に起因しうる生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑとの結合；補体依存性細胞毒性作用；Ｆｃレセプターとの結合；抗体依存性細胞性細胞毒性作用（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面レセプターのダウンレギュレーション（例えばＢ細胞レセプター；ＢＣＲ）などがある。
重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、インタクトな抗体を異なる「クラス」に割り当てることができる。インタクトな抗体には五つの主要クラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかを「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
「抗体依存性細胞性細胞毒性作用」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞毒性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）がターゲット細胞上に結合した抗体を認識して、その後にターゲット細胞の溶解を起こす細胞介在性反応を指す。ＡＤＣＣを仲介するためのプライマリー細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現を要約したものは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の４６４頁の表３である。関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されているようなｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを行うことができる。当該アッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞がある。または、もしくは追加的に、関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を、例えばClynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されたような動物モデルでｉｎ ｖｉｖｏ評価できる。
「ヒトエフェクター細胞」は、一つまたは複数のＦｃＲを発現してエフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、これらの細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現してＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを仲介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞、および好中球があり、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その天然起源から、例えば本明細書に記載されたように血液またはＰＢＭＣから単離することができる。
用語「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ部に結合するレセプターを記述するために使用される。好ましいＦｃＲは天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体と結合するもの（ガンマレセプター）であり、好ましいＦｃＲには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターが、これらのレセプターのアレル変異体および選択的スプライシングされた形態を含めて挙げられる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）があり、それらは、細胞質ドメインが主に異なる類似したアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにＩＴＡＭ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）を含む。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにＩＴＩＭ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif）を含む（Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15 :203-234 (1997)の総説Ｍを参照されたい）。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994);およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)に総説されている。将来同定されるものを含めたその他のＦｃＲは、本明細書において用語「ＦｃＲ」で包含される。この用語は、胎児への母体IgGの輸送を担う新生児レセプターＦｃＲｎも含む（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)およびKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）。
「補体依存性細胞毒性作用」または「ＣＤＣ」は、分子が補体の存在下でターゲットを溶解する能力を指す。補体活性化経路は、コグネイト抗原と複合体を形成した分子（例えば抗体）への補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）の結合により開始する。補体活性化を評価するために、例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)に記載されているようなＣＤＣアッセイを行うことができる。
「天然抗体」は、通常は２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合する一方で、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で多様である。各重鎖および軽鎖は、規則的に間隔のあいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）と、もう一方の末端に定常ドメインとを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは、重鎖可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられる。
用語「可変」は、可変ドメインのある部分が、抗体間で広範囲に配列が異なり、各特定の抗体の特定の抗原に対する結合および特異性に使用されるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたり均等に分布しているわけではない。可変性は、軽鎖および重鎖の可変ドメイン両方における超可変部と呼ばれる三つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク部（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインそれぞれは、４つのＦＲを含み、それらのＦＲは大部分がβシート立体配置を採り、三つの超可変部により連結され、これらの超可変部は、βシート構造と連結するループを形成して、場合によりこのβシート構造の一部を形成する。各鎖中の超可変部は、ＦＲによって相互に近接して保持されて、もう一方の鎖由来の超可変部と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照されたい）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接には関与しないが、抗体依存性細胞性細胞毒性作用（ＡＤＣＣ）での抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
本明細書に使用する場合、用語「超可変部」は、抗原との結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変部は、一般に「相補性決定部」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、残基５０〜５６（Ｌ２）、および残基８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基３１〜３５（Ｈ１）、残基５０〜６５（Ｈ２）および残基９５〜１０２（Ｈ３）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）ならびに／または「超可変ループ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および残基９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｈ１）、残基５３〜５５（Ｈ２）および残基９６〜１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）を含む。「フレームワーク部」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義するような超可変部残基以外の、可変ドメインの残基である。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる、それぞれ単一の抗原結合部位を有する二つの同一の抗原結合フラグメントと、名前が、容易に結晶化できる能力を反映する残りの「Ｆｃ」フラグメントとを産生する。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位を有するＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じ、このフラグメントは、依然として抗原を架橋できる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む、最小限の抗体フラグメントである。この領域は、密接に非共有的に会合した、一つの重鎖可変ドメインと一つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定するために、各可変ドメインの三つの超可変部が相互作用するのは、この立体配置である。まとめると、六つの超可変部は、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（すなわち抗原に対して特異的な三つの超可変部のみを含む、Ｆｖの半分）でさえも、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
Ｆａｂフラグメントもまた、軽鎖の定常ドメインと、重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体のヒンジ部由来の一つまたは複数のシステインを含めて、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数残基が付加していることが、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書においてＦａｂ’についての呼称であり、Ｆａｂ’−ＳＨでは、定常ドメインのシステイン残基（類）が少なくとも一つの遊離チオール基を有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメント対として本来産生された。抗体フラグメントのその他の化学的カップリングも公知である。
任意の脊椎動物種由来である抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる二つの明らかに別個の型のうちの一つに割り当てることができる。
「一本鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、このＦｖポリペプチドは、このｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)を参照されたい。ＨＥＲ２抗体のｓｃＦｖフラグメントは、ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号に記載されている。
用語「二特異性抗体」は、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中で可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に連結した可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上のこれら二つのドメイン間で対形成できるには短すぎるリンカーを用いることによって、これらのドメインを別の鎖の相補性ドメインと対形成することを強いて、二つの抗原結合部位を生み出す。二特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に、さらに完全に記載されている。
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、通例レシピエントの超可変部由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変部由来の残基に置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。時には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク部（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基に置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見い出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応する超可変ループのうちの全てまたは実質的に全てと、ＦＲの全てまたは実質的に全てとは、ヒト免疫グロブリン配列のものであろう。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常部も場合により含むものである。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照されたい。
ヒト化ＨＥＲ２抗体には、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７、および参照により本明細書に特に組み入れられる米国特許第５，８２１，３３７号の表３に記載されるｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８またはトラスツズマブ（HERCEPTIN（登録商標））；ヒト化５２０Ｃ９（ＷＯ９３／２１３１９）および本明細書に記載されているようなヒト化２Ｃ４抗体がある。
本明細書の目的で、「トラスツズマブ」、「ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）」、および「ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８」は、それぞれ配列番号１３および１４の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む抗体を指す。
本明細書において、「パーツズマブ」、「ＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標）」、および「ｒｈｕＭＡｂ２Ｃ４」は、それぞれ配列番号３および４の可変軽鎖および可変重鎖アミノ酸配列を含む抗体を指す。パーツズマブがインタクトな抗体である場合、パーツズマブはそれぞれ配列番号１５および１６の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を好ましくは含む。
「ネイキッドな抗体」は、（本明細書に定義されるとおり）細胞毒性部分または放射性ラベルなどの異種分子とコンジュゲーションしていない抗体である。
「単離された」抗体は、その天然環境の構成要素から同定されて、分離および／または回収された抗体である。その天然環境の混入構成要素は、その抗体についての診断的用途または治療的用途を妨害するであろう物質であり、それらには、酵素、ホルモン、およびその他のタンパク質様または非タンパク質様の溶質が含まれうる。好ましい態様では、抗体は、（１）ローリー法によって決定したときに、抗体の９５重量%を超えるまで、最も好ましくは９９重量%を超えるまで精製されるか、（２）スピニングカップ（spinning cup）シークエネーターの使用により、少なくとも１５残基のＮ末端アミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度に精製されるか、または（３）クーマシーブルー染色もしくは好ましくは銀染色を用いた、還元条件もしくは非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製されるであろう。抗体の天然環境の少なくとも一つの構成要素は存在しないものであることから、単離された抗体には、組換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕ抗体が含まれる。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも１回の精製段階によって調製されるものである。
「トラスツズマブよりも効果的にＨＥＲの二量体化を阻害する」ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブよりも効果的に（例えば少なくとも約２倍効果的に）ＨＥＲ二量体を低減または除去する抗体である。好ましくは、当該抗体は、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４のＦａｂフラグメント、インタクトなパーツズマブ、およびパーツズマブのＦａｂフラグメントからなる群より選択される抗体と少なくとも同じくらい効果的にＨＥＲ２の二量体化を阻害する。ＨＥＲ二量体を直接研究することにより、またはＨＥＲの二量体化を招くＨＥＲの活性化もしくは下流のシグナル伝達を評価することにより、および／または抗体のＨＥＲ２結合部位を評価することなどにより、ＨＥＲ二量体化の阻害を評価できる。トラスツズマブよりも効果的にＨＥＲ２二量体化を阻害する能力を有する抗体をスクリーニングするためのアッセイは、Agus et al., Cancer Cell 2: 127-137 (2002)ならびにWO01/00245（Adamsら）に記載されている。ほんの一例として、例えばＨＥＲ二量体の形成阻害（例えば、Agus et al., Cancer Cell 2: 127-137 (2002)の図１Ａ〜Ｂ；およびWO01/00245を参照されたい）；ＨＥＲリガンドによるＨＥＲ二量体を発現する細胞の活性化の低減（WO01/00245および例えばAgus et al., Cancer Cell 2: 127-137 (2002)の図２Ａ〜Ｂ）；ＨＥＲ二量体を発現する細胞に対するＨＥＲリガンドの結合の遮断（WO01/00245および例えばAgus et al., Cancer Cell 2:127-137 (2002)の図2E）；ＨＥＲリガンドの存在下（または不在下）でＨＥＲ二量体を発現するガン細胞（例えばＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＤ−１３４、ＺＲ−７５−１、ＭＤ−ＭＢ−１７５、Ｔ−４７Ｄ細胞）の細胞成長阻害（WO01/00245および例えばAgus et al., Cancer Cell 2:127-137 (2002)の図３Ａ〜Ｄ）；下流のシグナル伝達の阻害（例えば、ＨＲＧ依存性ＡＫＴリン酸化の阻害またはＨＲＧもしくはＴＧＦα依存性ＭＡＰＫリン酸化の阻害）（WO01/00245および例えばAgus et al., Cancer Cell 2:127-137 (2002)の図２Ｃ〜Ｄを参照されたい）を評定することによってＨＥＲ二量体化の阻害をアッセイすることができる。抗体−ＨＥＲ２結合部位を研究することによって、例えばＨＥＲ２に結合した抗体の結晶構造などの構造またはモデルを評価することによっても、その抗体がＨＥＲ二量体化を阻害するかどうか評定することができる（例えば、Franklin et al., Cancer Cell 5:317-328 (2004)を参照されたい）。
ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブよりも効果的に（例えば少なくとも２倍効果的に）「ＨＲＧ依存性ＡＫＴリン酸化を阻害」し、かつ／または「ＨＲＧもしくはＴＧＦα依存性のＭＡＰＫリン酸化」を阻害しうる（例としてAgus et al., Cancer Cell 2:127-137 (2002)およびWO01/00245を参照されたい）。
ＨＥＲ２抗体は、「ＨＥＲ２エクトドメインの開裂を阻害しない」抗体でありうる（Molina et al., Cancer Res. 61:4744-4749(2001)）。
ＨＥＲ２の「ヘテロ二量体結合部位に結合する」ＨＥＲ２抗体は、ドメインＩＩ中の残基に結合して（場合によりドメインＩおよびＩＩＩなどのＨＥＲ２細胞外ドメインのドメインのうち他のものにおける残基にも結合して）、ＨＥＲ２−ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、またはＨＥＲ２−ＨＥＲ４ヘテロ二量体の形成を少なくともある程度立体的に妨害することができる。Franklin et al., Cancer Cell 5:317-328 (2004)は、RCSB Protein Data Bank（ＩＤコードＩＳ７８）に寄託されたＨＥＲ２−パーツズマブの結晶構造を特徴づけ、その構造はＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に結合する抗体の例を例示している。
ＨＥＲ２の「ドメインＩＩに結合する」抗体は、ドメインＩＩ中の残基と、場合によりドメインＩおよびドメインＩＩＩなどの、ＨＥＲ２のその他のドメイン（類）中の残基と結合する。好ましくは、ドメインＩＩに結合する抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの間の結合部に結合する。
本明細書に使用する場合の「成長阻害剤」は、細胞、特にＨＥＲ発現性ガン細胞の成長をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで阻害する化合物または組成物を指す。このように、成長阻害剤は、Ｓ期のＨＥＲ発現細胞の率を有意に低減する薬剤でありうる。成長阻害剤の例には、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤などの、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）遮断する薬剤がある。古典的Ｍ期遮断薬には、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、ならびにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなどのトポＩＩ阻害剤がある。Ｇ１で停止させる薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤は、Ｓ期停止にも波及する。さらなる情報は、"Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995)という標題のThe Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds.、第１章、特に１３頁に見い出すことができる。
「成長阻害」抗体の例は、ＨＥＲ２に結合し、そしてＨＥＲ２を過剰発現しているガン細胞の成長を阻害する抗体である。好ましい成長阻害ＨＥＲ２抗体は、約０．５から３０μg/mlの抗体濃度で、細胞培養でのＳＫ−ＢＲ−３乳房腫瘍細胞の成長を、２０%よりも高く、好ましくは５０%よりも高く（例えば、約５０%から約１００%）阻害する。ここで、抗体にＳＫ−ＢＲ−３細胞を曝露した６日間後に、この成長阻害を決定する（１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７１号を参照されたい）。このＳＫ−ＢＲ−３細胞成長阻害アッセイは、その特許および本明細書の下記にさらに詳細に記載されている。好ましい成長阻害抗体は、マウスモノクローナル抗体４Ｄ５のヒト化変異体、例えばトラスツズマブである。
「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡのフラグメント化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞のフラグメント化、および／または膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成によって決定されるようなプログラム細胞死を誘導する抗体である。この細胞は、通常、レセプターＨＥＲ２を過剰発現する細胞である。好ましくは、この細胞は腫瘍細胞、例えば、乳房細胞、卵巣細胞、胃細胞、子宮内膜細胞、唾液腺細胞、肺細胞、腎臓細胞、結腸細胞、甲状腺細胞、膵臓細胞、または膀胱細胞である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、この細胞は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、ＢＴ４７４細胞、Ｃａｌｕ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞、またはＳＫＯＶ３細胞でありうる。アポトーシスに関連する細胞事象を評価するために、様々な方法が利用できる。例えば、アネキシンの結合によって、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の移行を測定でき；ＤＮＡラダー生成によってＤＮＡのフラグメント化を評価でき；低二倍体細胞の任意の増加によってＤＮＡのフラグメント化にともなう核／クロマチンの凝縮を評価できる。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体は、ＢＴ４７４細胞を用いたアネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞と比較して約２から５０倍、好ましくは約５から５０倍、最も好ましくは約１０から５０倍のアネキシン結合の誘導を招く抗体である（以下参照）。アポトーシスを誘導するＨＥＲ２抗体の例は、７Ｃ２および７Ｆ３である。
「エピトープ２Ｃ４」は、抗体２Ｃ４が結合する、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域である。２Ｃ４エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような日常的な交差ブロッキングアッセイを行うことができる。または、エピトープマッピングを行って、当技術分野で公知の方法を用いてその抗体がＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープに結合するかどうかを評価することができ、かつ／または抗体−ＨＥＲ２の構造を研究して（Franklin et al. Cancer Cell 5 :317-328 (2004)）、ＨＥＲ２のどのドメインがその抗体によって結合されるかを知ることができる。エピトープ２Ｃ４は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中のドメインＩＩからの残基を含む。２Ｃ４およびパーツズマブは、ドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの接合部でＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する。Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)。
「エピトープ４Ｄ５」は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の、抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４６３）およびトラスツズマブが結合する領域である。このエピトープはＨＥＲ２の膜貫通ドメインに近接しており、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内に存在する。４Ｄ５エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane(1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを行うことができる。または、エピトープマッピングを行って、その抗体がＨＥＲ２の４Ｄ５エピトープ（例えば、約５２９番残基から約６２５番残基まで、両端の残基を含めた領域における任意の一つまたは複数の残基；図１参照）に結合するかどうかを評定することができる。
「エピトープ７Ｃ２／７Ｆ３」は、７Ｃ２抗体および／または７Ｆ３抗体（それぞれＡＴＣＣに寄託、以下参照）が結合する、ＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩ内のＮ末端の領域である。７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane(1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを行うことができる。または、その抗体がＨＥＲ２の７Ｃ２／７Ｆ３エピトープ(例えば、ＨＥＲ２の約２２番残基から約５３番残基までの領域中の任意の一つまたは複数の残基；図１参照)に結合するかどうかを確認するために、エピトープマッピングを行うことができる。
「処置」は、治療的処置および予防的方策の両方を指す。処置を必要とする者には、すでに疾患を有する者および疾患を予防されるべき者が含まれる。よって、本明細書において処置される患者は、疾患を有すると診断されたおそれもあるし、また、疾患の素因があるか、もしくは疾患に感受性なおそれがある。
用語「ガン」および「ガン性」は、無秩序な細胞成長によって典型的には特徴づけられる、哺乳類における生理的状態を指すか、または記載する。ガンの例には、ガン腫、リンパ腫、芽細胞腫（髄芽腫および網膜芽腫を含む）、肉腫（脂肪肉腫および滑膜細胞肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、ガストリノーマ、および膵島細胞ガンを含む）、中皮腫、神経鞘腫（聴神経腫を含む）、髄膜腫、腺ガン、黒色腫、および白血病またはリンパ系悪性疾患があるが、それに限定されるわけではない。当該ガンのさらに特別な例には、扁平上皮ガン（例えば上皮扁平上皮ガン）；小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、肺腺ガンおよび肺扁平上皮ガンを含む肺ガン；腹膜ガン；肝細胞ガン；消化管ガンを含む胃ガン；膵臓ガン；神経膠芽腫；子宮頚がん；卵巣ガン；肝ガン；膀胱ガン；ヘパトーマ；乳ガン；結腸ガン；直腸ガン；直腸結腸ガン；子宮内膜ガンまたは子宮ガン；唾液腺ガン；腎ガン；前立腺がん；外陰部ガン；甲状腺ガン；肝ガン；肛門ガン；陰茎ガン；精巣ガン；食道ガン；胆道腫瘍；および頭頚部ガンがある。
用語「有効量」は、患者における疾患を処置するのに有効な薬物の量を指す。その疾患がガンの場合、薬物の有効量はガン細胞数を減少させ、腫瘍の大きさを減少させ、末梢器官へのガン細胞の浸潤を阻害し（すなわち、ある程度遅らせ、好ましくは停止させ）、腫瘍の転移を阻害し（すなわち、ある程度遅らせ、好ましくは停止させ）、腫瘍の成長をある程度阻害し、かつ／またはガンに関連する一つもしくは複数の症状をある程度軽減することができる。薬物が成長を阻止し、かつ／または現存するガン細胞を殺滅しうる程度に、その薬物は細胞分裂抑制性および／または細胞毒性でありうる。有効量は、進行のない生存期間を延長し、客観的反応（部分反応（ＰＲ）もしくは完全反応（ＣＲ）を含む）を招き、全生存期間を増大させ、かつ／またはガンの一つもしくは複数の症状を改善することができる。
「ＨＥＲ２発現性ガン」は、細胞表面にＨＥＲ２タンパク質が存在する細胞を含むガンである。
レセプターＨＥＲを「過剰発現する」ガンは、同じ組織型の非ガン細胞に比較して、その細胞表面にＨＥＲ２などのレセプターＨＥＲをかなり高レベル有するガンである。当該過剰発現は、遺伝子増幅によって、または転写もしくは翻訳の増加によって起こることがある。レセプターＨＥＲの過剰発現を、細胞表面に存在する増加したレベルのＨＥＲタンパク質を評価することによって、診断または予後アッセイで（例えば免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）により）決定することができる。または、もしくは追加的に、例えば、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公表されたＷＯ９８／４５４７９参照）、サザンブロット、またはリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）などのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法によって、細胞中のＨＥＲをコードしている核酸のレベルを測定することができる。血清などの生体液に分散した抗原（例えばＨＥＲ細胞外ドメイン）を測定することによって、レセプターＨＥＲの過剰発現を研究することもできる（例えば、１９９０年６月１２日に発行された米国特許第４，９３３，２９４号；１９９１年４月１８日に公表されたＷＯ９１／０５２６４；１９９５年３月２８日に発行された米国特許第５，４０１，６３８号;およびSias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)を参照されたい）。当業者は、上記アッセイの他に様々なｉｎ ｖｉｖｏアッセイを利用できる。例えば検出可能なラベル、例えば放射性同位体で場合によりラベルした抗体に、患者の体内の細胞を曝露して、例えば放射能を外部スキャンすることにより、または抗体に予め曝露された患者から採取した生検を分析することにより、その患者における細胞に対する抗体の結合を評価することができる。
逆に、「レセプターＨＥＲ２を過剰発現しない」ガンは、同じ組織型の非ガン細胞に比較して正常レベルよりも高いレセプターＨＥＲ２を発現しないガンである。
ＨＥＲリガンドを「過剰発現する」ガンは、同じ組織型の非ガン細胞に比較して有意に高いレベルのそのリガンドを産生するガンである。当該過剰発現は、遺伝子増幅によって、または転写もしくは翻訳の増加によって起こることがある。ＨＥＲリガンドの過剰発現は、患者における、例えば腫瘍生検におけるリガンド（もしくはそれをコードする核酸）のレベルを評価することによって、または上記のＩＨＣ、ＦＩＳＨ、サザンブロット、ＰＣＲ、もしくはｉｎ ｖｉｖｏアッセイなどの様々な診断アッセイによって、診断的に決定することができる。
本明細書中において使用されるときの用語「細胞毒性薬」は、細胞の機能を阻害もしくは阻止し、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、および細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素活性な毒素などの毒素を、そのフラグメントおよび／または変異体を含めてを含むことを意味する。
「化学療法剤」は、ガンの処置に有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロホスファミド（CYTOXAN(登録商標)）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）、およびウレドーパ（uredopa）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチロールメラミン（trimethylolomelamine）を含めたエチレンイミンおよびメチルメラミン（methylamelamine）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン（bullatacinone））；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、MARINOL(登録商標)）；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログであるトポテカン（HYCAMTIN(登録商標)）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標)）、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（scopolectin）、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸（podophyllinic acid）；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ズオカルマイシン（合成アナログＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ranimnustine）などのニトロソ尿素；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)参照））；ジネマイシンＡを含めたジネマイシン；エスペラマイシン；ならびに、ネオカルチノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルチノフィリン、クロモマイシン（chromocycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射液（DOXIL(登録商標)）、リポソームドキソルビシンＴＬＣ Ｄ−９９（MYOCET(登録商標)）、ＰＥＧ化リポソームドキソルビシン（CAELYX(登録商標)）、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート、ゲムシタビン（GemZar(登録商標)）、テガフール（UFTORAL(登録商標)）、カペシタビン（XELODA(登録商標)）、エピチロン、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジンなどのピリミジンアナログ；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（anti-adrenal）；フロリニン酸（frolinic acid）などの葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デホファミン（defofamine）；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（mopidanmol）；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（JHS Natural Products, Eugene, OR）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２'，２"−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリン（verracurin）Ａ、ロリジンＡおよびアングイジン（anguidine））；ウレタン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（TAXOL(登録商標)）、パクリタキセルのアルブミン加工ナノ粒子製剤（ABRAXANE(商標)）、およびドセタキセル（TAXOTERE(登録商標)）；クロランブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチンなどのプラチナ剤；ビンブラスチン（VELBAN(登録商標)）、ビンクリスチン（ONCOVIN(登録商標)）、ビンデシン（ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標)）、およびビノレルビン（NAVELBINE(登録商標)）を含めた、チューブリン重合により微小管が形成するのを阻止するビンカ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボビン（leucovovin）；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；ベキサロテン（TARGRETIN(登録商標)）を含めたレチノイン酸などのレチノイド；クロドロネート（例えば、BONEFOS(登録商標)またはOSTAC(登録商標)）、エチドロネート（DIDROCAL(登録商標)）、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ZOMETA(登録商標)）、アレンドロネート（FOSAMAX(登録商標)）、パミドロネート（AREDIA(登録商標)）、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ(登録商標)）、またはリセドロネート（ACTONEL(登録商標)）などのビスホスフォネート；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関係づけられているシグナル伝達経路における遺伝子発現、例えばＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮成長因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）を阻害するもの；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンならびに遺伝子療法ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどのワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、LURTOTECAN(登録商標)）；ｒｍＲＨ（例えば、ABARELIX(登録商標)）；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ;Bayer）；ＳＵ−１１２４８（Pfizer）；ペリホシン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えば、PS341）；ボルテゾミブ（VELCADE(登録商標)）；ＣＣＩ−７７９；チピファルニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ（orafenib）、ＡＢＴ５１０；オブリマーセン（oblimersen）ナトリウム（GENASENSE(登録商標)）などのＢｃｌ−２阻害剤；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（下記定義参照）；チロシンキナーゼ阻害剤（下記定義参照）；ならびに上記いずれかの薬学的に許容しうる塩、酸または誘導体；ならびにＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法についての略語）およびＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵおよびロイコボビンと組み合わせたオキサリプラチン（ELOXATIN(商標)）を用いた処置方式についての略語）などの、上記のうち二つ以上の組み合わせがある。
本定義に同じく含まれるのは、腫瘍に及ぼすホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤であり、抗ホルモン剤の例は、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを有する抗エストロゲン剤（タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)、４−ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（FARESTON(登録商標)）、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン(EVISTA(登録商標))、トリオキシフェン、ケオキシフェン（keoxifene）、およびＳＥＲＭ３などの選択的エストロゲンレセプターモデュレータ（ＳＥＲＭ）を含む）；アゴニスト性を有さない純粋な抗エストロゲン剤（フルベストラント(FASLODEX(登録商標))およびEM800（当該薬剤はエストロゲンレセプター（ＥＲ）の二量体化を遮断し、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲのターンオーバーを増加させ、かつ／またはＥＲレベルを抑制する）など）；アロマターゼ阻害剤（フォルメスタンおよびエキセメスタン（AROMASIN(登録商標)）などのステロイド系アロマターゼ阻害剤、アナストラゾール（ARIMIDEX(登録商標)）、レトロゾール（FEMARA(登録商標)）およびアミノグルテチミドなどの非ステロイド系アロマターゼ阻害剤、ならびにボロゾール(RIVISOR(登録商標))、酢酸メゲストロール(MEGASE(登録商標))、ファドロゾール、イミダゾールを含むその他のアロマターゼ阻害剤を含む）；黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト（ロイプロリド(LUPRON(登録商標)およびELIGARD(登録商標))、ゴセレリン、ブセレリン、およびトリプテレリン（tripterelin）を含む）；性ステロイド剤（酢酸メゲストロールおよび酢酸メドロキシプロゲステロンなどのプロゲスチン、ジエチルスチルベストロールおよびプレマリンなどのエストロゲン、ならびにフルオキシメステロン、オールトランスレチノイン酸およびフェンレチニドなどのアンドロゲン／レチノイドを含む）；オナプリストン；抗プロゲステロン剤；エストロゲンレセプターダウンレギュレータ（ＥＲＤ）；フルタミド、ニルタミドおよびビカルタミドなどの抗アンドロゲン剤；テストラクトン；ならびに上記いずれかの薬学的に許容しうる塩、酸または誘導体；ならびに上記のうち二つ以上の組み合わせである。
本明細書に使用されるように、用語「ＥＧＦＲターゲット薬」は、ＥＧＦＲに結合し、場合によりＥＧＦＲの活性化を阻害する治療剤を指す。当該薬剤の例には、ＥＧＦＲに結合する抗体および小分子がある。ＥＧＦＲに結合する抗体の例には、ＭＡｂ５７９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０６）、ＭＡｂ４５５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ２２５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０８）、ＭＡｂ５２８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０９）（米国特許第４，９４３，５３３号、Mendelsohnら参照）、ならびにキメラ化２２５（Ｃ２２５またはセツキシマブ；ERBUTIX(登録商標)）および再形状化ヒト２２５（Ｈ２２５）（ＷＯ９６／４０２１０、Imclone Systems Inc.参照）などのその変異体；完全にヒトのＥＧＦＲターゲット抗体（Imclone）であるＩＭＣ−１１Ｆ８；ＩＩ型突然変異ＥＧＦＲと結合する抗体（米国特許第５，２１２，２９０号）；米国特許第５，８９１，９９６号に記載されているような、ＥＧＦＲと結合するヒト化抗体およびキメラ抗体；ならびにＡＢＸ−ＥＧＦまたはパニツムマブなどの、ＥＧＦＲと結合するヒト抗体（ＷＯ９８／５０４３３、Abgenix/Amgen参照）；ＥＭＤ５５９００（Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)）；ＥＧＦＲの結合についてＥＧＦおよびＴＧＦ−アルファの両方と競合する、ＥＧＦＲに対するヒト化ＥＧＦＲ抗体であるＥＭＤ７２００（マツズマブ）（EMD/Merck）；ヒトＥＧＦＲ抗体であるＨｕＭａｘ−ＥＧＦＲ（GenMab）；Ｅ１．１、Ｅ２．４、Ｅ２．５、Ｅ６．２、Ｅ６．４、Ｅ２．１１、Ｅ６．３およびＥ７．６．３として公知でありＵＳ６，２３５，８８３に記載されている完全ヒト抗体；ＭＤＸ−４４７（Medarex Inc）；ならびにｍＡｂ８０６またはヒト化ｍＡｂ８０６（Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)）がある。抗ＥＧＦＲ抗体を細胞毒性薬にコンジュゲーションすることによって、免疫コンジュゲートを発生させることができる（例えば、ＥＰ６５９，４３９Ａ２、Merck Patent GmbH参照）。ＥＧＦＲ拮抗薬には、米国特許第５，６１６，５８２号、第５，４５７，１０５号、第５，４７５，００１号、第５，６５４，３０７号、第５，６７９，６８３号、第６，０８４，０９５号、第６，２６５，４１０号、第６，４５５，５３４号、第６，５２１，６２０号、第６，５９６，７２６号、第６，７１３，４８４号、第５，７７０，５９９号、第６，１４０，３３２号、第５，８６６，５７２号、第６，３９９，６０２号、第６，３４４，４５９号、第６，６０２，８６３号、第６，３９１，８７４号、第６，３４４，４５５号、第５，７６０，０４１号、第６，００２，００８号、および第５，７４７，４９８号、ならびに以下のＰＣＴ公報：ＷＯ９８／１４４５１、ＷＯ９８／５００３８、ＷＯ９９／０９０１６、およびＷＯ９９／２４０３７に記載されている化合物などの小分子が含まれる。特定の小分子性ＥＧＦＲ拮抗薬には、ＯＳＩ−７７４（ＣＰ−３５８７７４、エルロチニブ、TARCEVA(登録商標)、Genentech/OSI Pharmaceuticals）；ＰＤ１８３８０５（ＣＩ１０３３、Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］−６−キナゾリニル］−２−プロペンアミド二塩酸、Pfizer Inc.）；ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ（IRESSA(商標)） ４−（３’−クロロ−４’−フルオロアニリノ）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン、AstraZeneca）；ＺＭ１０５１８０（（６−アミノ−４−（３−メチルフェニル−アミノ）−キナゾリン、Zeneca）；ＢＩＢＸ−１３８２（Ｎ８−（３−クロロ−４−フルオロ−フェニル）−Ｎ２−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−ピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン−2,8-ジアミン、Boehringer Ingelheim）；ＰＫＩ−１６６（（Ｒ）−４−［４−［（１−フェニルエチル）アミノ］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］−フェノール）；（Ｒ）−６−（４−ヒドロキシフェニル）−４−［（１−フェニルエチル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン）；ＣＬ−３８７７８５（Ｎ−［４−［（３−ブロモフェニル）アミノ］−６−キナゾリニル］−２−ブチンアミド）；ＥＫＢ−５６９（Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−３−シアノ−７−エトキシ−６−キノリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテンアミド）（Wyeth）；ＡＧ１４７８（Sugen）；ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Sugen）；ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６またはＮ−［３−クロロ−４−［（３フルオロフェニル）メトキシ］フェニル］６［５［［［２メチルスルホニル）エチル］アミノ］メチル］−２−フラニル］−４−キナゾリンアミン；Glaxo-SmithKline）またはシアノグアニジンキナゾリンおよびシアノアミジンキナゾールアミン誘導体などの二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤がある。
「チロシンキナーゼ阻害剤」は、レセプターＨＥＲなどのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性を阻害する分子である。当該阻害剤の例には、前節に言及されているＥＧＦＲターゲット薬；Ｔａｋｅｄａから入手可能なＴＡＫ１６５などの小分子ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤；ＥｒｂＢ２レセプターチロシンキナーゼの経口選択的阻害剤であるＣＰ−７２４，７１４（Pfizer and OSI）；ＥＧＦＲと選好的に結合するが、ＨＥＲを過剰発現している細胞およびＥＧＦＲを過剰発現している細胞の両方を阻害するＥＫＢ−５６９（Wyethから入手可能）などの二重ＨＥＲ阻害剤；経口ＨＥＲ２およびＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であるラパチニブ（ＧＷ５７２０１６；Glaxo-SmithKlineから入手可能）；ＰＫＩ−１６６（Novartisから入手可能）；カネルチニブ（ＣＩ−１０３３；Pharmacia）などの汎ＨＥＲ阻害剤；Ｒａｆ−１シグナル伝達を阻害する、ISIS Pharmaceuticalsから入手可能なアンチセンス剤ＩＳＩＳ−５１３２などのＲａｆ−１阻害剤;Glaxoから入手可能なメシル酸イマチニブ（GLEEVAC(商標)）などの非ＨＥＲターゲットＴＫ阻害剤；ＭＡＰＫ細胞外調節キナーゼＩ阻害剤ＣＩ−１０４０（Pharmaciaから入手可能）；ＰＤ１５３０３５（４−（３−クロロアニリノ）キナゾリン）などのキナゾリン；ピリドピリミジン；ピリミドピリミジン；ＣＧＰ５９３２６、ＣＧＰ６０２６１およびＣＧＰ６２７０６などのピロロピリミジン；ピラゾロピリミジン、４−（フェニルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン；クルクミン（ジフェルロイルメタン、４，５−ビス（４−フルオロアニリノ）フタルイミド）；ニトロチオフェン部分を含むチルホスチン；ＰＤ−０１８３８０５（Warner-Lamber）；アンチセンス分子（例えば、ＨＥＲをコードする核酸に結合するもの）；キノキサリン（米国特許第５，８０４，３９６号）；トリホスチン（tryphostin）（米国特許第５，８０４，３９６号）；ＺＤ６４７４（Astra Zeneca）；ＰＴＫ−７８７（Novartis/Schering AG）；ＣＩ−１０３３（Pfizer）などの汎ＨＥＲ阻害剤；アフィニタク（ＩＳＩＳ３５２１；Isis/Lilly）；メシル酸イマチニブ（Gleevac; Novartis）；ＰＫＩ１６６（Novartis）；ＧＷ２０１６（Glaxo SmithKline）；ＣＩ−１０３３（Pfizer）；ＥＫＢ−５６９（Wyeth）；セマキシニブ（Semaxinib）（Sugen）；ＺＤ６４７４（AstraZeneca）；ＰＴＫ−７８７（Novartis/Schering AG）；ＩＮＣ−１Ｃ１１（Imclone）；シアノグアニジンキナゾリンおよびシアノアミジンキナゾールアミン誘導体；または以下の特許公報のいずれかに記載されているものがある：米国特許第５，８０４，３９６号；ＷＯ９９／０９０１６（American Cyanamid）；ＷＯ９８／４３９６０（American Cyanamid）；ＷＯ９７／３８９８３（Warner Lambert）；ＷＯ９９／０６３７８（Warner Lambert）；ＷＯ９９／０６３９６（Warner Lambert）；ＷＯ９６／３０３４７（Pfizer, Inc）；ＷＯ９６／３３９７８（Zeneca）；ＷＯ９６／３３９７（Zeneca）；ＷＯ９６／３３９８０（Zeneca）；およびＵＳ２００５／０１０１６１７。
「抗血管形成剤」は、血管の発生をある程度遮断または妨害する化合物を指す。抗血管形成因子は、例えば、血管形成の促進に関与する成長因子または成長因子レセプターに結合する、小分子または抗体でありうる。本明細書における好ましい抗血管形成因子は、ベバシズマブ（AVASTIN（登録商標））などの、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体である。
用語「サイトカイン」は、細胞間仲介物質として別の細胞に作用する、ある細胞集団によって放出されるタンパク質についての総称である。当該サイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。これらのサイトカインの中に含まるのは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β；ミュラー管抑制物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉおよびインスリン様増殖因子−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）など）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含めたその他のポリペプチド因子である。本明細書に使用されるときの用語「サイトカイン」には、天然起源由来または組換え細胞培養物由来のタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的活性等価物が含まれる。
ＩＩ． ＨＥＲ２抗体変異体組成物
本発明は、少なくとも部分的には、ある種のＨＥＲ２抗体組成物に関するものである。好ましくは、ＨＥＲ２抗体（主要種ＨＥＲ２抗体およびその抗体変異体の一方または両方）は、ＨＥＲ２のドメインＩＩに結合し、トラスツズマブよりも効果的にＨＥＲ二量体化を阻害し、かつ／またはＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に結合する抗体である。本明細書における主要種抗体の好ましい態様は、配列番号３および４の可変軽鎖および可変重鎖アミノ酸配列を含み、最も好ましくは配列番号１５および１６の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む抗体（パーツズマブ）である。
本明細書における組成物は、主要種ＨＥＲ２抗体と、アミノ末端リーダー伸長を含むそのアミノ酸配列変異体との混合物を含む。好ましくは、アミノ末端リーダー伸長は、抗体変異体の軽鎖（例えば、抗体変異体の一つまたは二つの軽鎖）に存在する。主要種ＨＥＲ２抗体または抗体変異体は、インタクトな抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのＦａｂ）でありうるが、好ましくは両者はインタクトな抗体である。
本明細書における抗体変異体は、その任意の一つまたは複数の重鎖または軽鎖にアミノ末端リーダー伸長を含む。好ましくは、アミノ末端リーダー伸長は、抗体の一つまたは二つの軽鎖に存在する。アミノ末端リーダー伸長は、好ましくはＶＨＳ−を含むか、またはそれからなる。
組成物中のアミノ末端リーダー伸長の存在を、Ｎ末端配列分析、電荷の不均一性についてのアッセイ（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーまたはキャピラリーゾーン電気泳動）、質量分析などを含むが、それに限定されるわけではない様々な分析技法によって検出することができる。組成物中の抗体変異体の量は、その変異体を検出するために使用される任意のアッセイ（好ましくは陽イオン交換分析）の検出下限を構成する量から主要種抗体の量よりも少ない量までに一般に及ぶ。一般に、組成物中の抗体分子の約２０%以下（例えば約１%から約１５%、例えば５%から約１５%、好ましくは約８%から約１２%）が、アミノ末端リーダー伸長を含む。当該量の率は、陽イオン交換分析を用いて好ましくは決定される。
アミノ末端リーダー伸長変異体の他に、主要種抗体および／または変異体のさらなるアミノ酸配列変更が考慮されている。その変更には、一方または両方の重鎖にＣ末端リシン残基を含む抗体（当該抗体変異体は約１%から約２０%の量で存在しうる）、脱アミド化（例えば、パーツズマブの一つまたは二つの重鎖のＡｓｎ−３８６および／またはＡｓｎ−３９１が脱アミドされた）抗体変異体、一つまたは複数の酸化されたメチオニン残基を有する抗体（例えば、酸化されたｍｅｔ−２５４を含むパーツズマブ）などがあるが、それに限定されるわけではない。
さらに、主要種抗体または変異体はグリコシル化変異をさらに含みうる。グリコシル化変異の非限定的な例には、Ｆｃ部に付着したＧ１もしくはＧ２オリゴ糖構造を含む抗体、軽鎖に付着した糖質部分（例えば、抗体の一つもしくは二つの軽鎖に付着した、例えば一つもしくは複数のリシン残基に付着したグルコースもしくはガラクトースなどの一つもしくは二つの糖質部分）を含む抗体、一つもしくは二つの非グリコシル化重鎖を含む抗体、または一つもしくは二つの重鎖に付着したシアリダート化（sialidated）オリゴ糖を含む抗体などがある。
本発明は、配列番号２３のアミノ酸配列またはその脱アミド化変異体および／もしくは酸化変異体を含むポリペプチドにも関するものである。さらに、本発明は、軽鎖の一方または両方が配列番号２３のアミノ酸配列を含む、一方または両方の軽鎖を含む抗体を提供する。この抗体は、一つまたは二つの重鎖をさらに含み、その重鎖の一方または両方は、配列番号１６または配列番号２４のアミノ酸配列（またはその脱アミド化変異体および／もしくは酸化変異体）を含む。
その組成物は、ＨＥＲ２抗体を発現している遺伝子操作された細胞系、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系から回収されることができるし、また、ペプチド合成により調製されることもできる。
ＩＩＩ． ＨＥＲ２抗体の産生
本発明により使用される抗体の産生についての例示的な技法に関して、以下に説明する。抗体の産生に使用されるＨＥＲ２抗原は、例えば、所望のエピトープを含む、ＨＥＲ２の可溶型細胞外ドメインまたはその一部分でありうる。または、細胞表面にＨＥＲ２を発現している細胞（例えば、ＨＥＲ２を過剰発現するようにトランスフォーメーションされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞；またはＳＫ−ＢＲ−３細胞などのガン細胞系、Stancovski et al., PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)参照）を使用して抗体を発生させることができる。抗体の発生に有用な他の形態のＨＥＲ２は、当業者に明らかであろう。
（ｉ） ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物に産生される。二官能剤または誘導化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を使用して、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤などの、免疫処置される種に免疫原性であるタンパク質と関連抗原をコンジュゲーションすることが有用なことがある。
例えば、（それぞれウサギまたはマウスに対して）１００μgまたは５μgのタンパク質もしくはコンジュゲートを３倍量のフロイント完全アジュバントと組み合わせて、複数の部位にその溶液を皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して、動物を免疫処置する。１か月後、フロイント完全アジュバントに入れた初回量の１／５から１／１０のペプチドまたはコンジュゲートを複数の部位で皮下注射することにより、その動物に追加免疫する。７日から１４日後、その動物から採血し、そしてその血清の抗体力価をアッセイする。力価がプラトーになるまで動物に追加免疫する。好ましくは、同抗原のコンジュゲートであるが、異なるタンパク質とコンジュゲーションし、かつ／または異なる架橋試薬によりコンジュゲーションしたものを用いて、その動物を追加免疫する。タンパク質融合体として組換え細胞培養でコンジュゲートを作製することもできる。また、ミョウバンのような凝集剤を適切に使用して、免疫応答を増強させる。
（ｉｉ） モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、その集団を構成している個別の抗体は、本明細書に記載された変異体のようにモノクローナル抗体の産生中に生じうる可能性のある変異体を除いて、同一であり、かつ／または同じエピトープと結合する。このように、修飾語「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物ではない抗体の性質を意味する。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、また、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製できる。
ハイブリドーマ法では、マウス、またはハムスターなどのその他の適切な宿主動物を、本明細書上記のように免疫処置して、免疫処置のために使用されたタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するか、または産生できるリンパ球を誘発させる。または、リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫処置できる。次に、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。
このようにして調製したハイブリドーマ細胞を、未融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する一つまたは複数の物質を好ましくは含有する適切な培地に接種し、成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素であるヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠如しているならば、ハイブリドーマ用の培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むものであり（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する。
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞により抗体の安定な高レベルの産生を支持し、かつＨＡＴ培地などの培地に感受性の細胞である。とりわけ好ましい骨髄腫細胞系は、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来の細胞系、ならびにAmerican Type Culture Collection, Rockville, Maryland USAから入手できるＳＰ−２細胞またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞などのマウス骨髄腫系である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984);およびBrodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
抗原に対するモノクローナル抗体の産生について、ハイブリドーマ細胞が成長している培地をアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）によって決定される。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード解析によって決定できる。
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後で、限界希釈手順によりそのクローンをサブクローニングして、標準的な方法により成長させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。この目的に適切な培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地がある。さらに、このハイブリドーマ細胞を、動物における腹水腫瘍としてｉｎ ｖｉｖｏで成長させることができる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体を、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の抗体精製手順によって培地、腹水、または血清から適切に分離する。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、当該ＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離すると、そのＤＮＡを発現ベクターの中に配置することができ、次にその発現ベクターを、E. coli細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別の状況では抗体タンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクションして、組換え宿主細胞にモノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするＤＮＡを細菌に組換え発現させることに関する総説論文には、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol, 5:256-262 (1993)およびPluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)がある。
さらなる態様では、モノクローナル抗体または抗体フラグメントを、McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)に記載されている技法を使用して発生した抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用した、それぞれマウス抗体およびヒト抗体の単離を記載している。それに続く刊行物は、鎖シャッフリング（Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)）ならびに非常に大規模なファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびｉｎ ｖｉｖｏ組換えによる高親和性（nM範囲）のヒト抗体の産生を記載している（Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)）。このように、これらの技法は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法に対する実行可能な代替法である。
ＤＮＡは、例えば、相同マウス配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインについてのコード配列に置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)）、または免疫グロブリンのコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全てまたは一部を共有結合的に繋ぐことによって改変することもできる。
典型的には、当該非免疫グロブリンポリペプチドを、抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、または、抗体の一抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換して、抗原に対する特異性を有する一つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を生み出す。
（ｉｉｉ） ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野に記載されている。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである起源からその抗体に導入された一つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「輸入（import）」残基と称される。この残基は、典型的には「輸入」可変ドメインから取り入れられる。ヒト化は、ヒト抗体の対応配列の代わりに超可変部配列に置換することによって、Winterおよび共同研究者らの方法（Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)）に従って本質的に行うことができる。従って、当該「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に小さな配列が非ヒト種由来の対応する配列に置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、一部の超可変部残基と、可能性があることには一部のＦＲ残基とが、げっ歯動物抗体の類似部位に由来する残基に置換されているヒト抗体である。
ヒト化抗体を作製する際に使用される、軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法により、げっ歯動物抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に、げっ歯動物の配列に最も類似しているヒト配列を、ヒト化抗体についてのヒトフレームワーク部（ＦＲ）として受け入れる（Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)）。別の方法は、特定亜群の軽鎖または重鎖の全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク部を使用する。同フレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)）。
抗体が抗原に対する高い親和性および他の好都合な生物学的性質を保持してヒト化されることは、さらに重要である。この目標を実現するために、好ましい方法により、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用した、親配列および様々な概念上のヒト化産物の分析プロセスによりヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元コンフォメーション構造を図解して表示するコンピュータプログラムを利用できる。これらの表示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能に、これらの残基が果たしそうな役割を分析すること、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響する残基を分析することが可能になる。このように、ＦＲ残基を、レシピエント配列および輸入配列から選択して、組み合わせることができ、その結果、ターゲット抗原（類）に対する増大した親和性などの所望の抗体特性が実現される。一般に、超可変部残基は、抗原結合に影響することに、直接的かつ最も実質的に関与している。
ＷＯ０１／００２４５は、ＨＥＲ２と結合してリガンドによるレセプターＨＥＲの活性化を遮断する例示的なヒト化ＨＥＲ２抗体の産生を記載している。本明細書において特に関心対象のヒト化抗体は、インタクトなマウスモノクローナル抗体２Ｃ４（またはそのＦａｂフラグメント）と本質的に同様に効果的に、ＥＧＦ、ＴＧＦ−αおよび／もしくはＨＲＧが介在するＭＡＰＫ活性化を遮断し、かつ／またはインタクトなマウスモノクローナル抗体２Ｃ４（もしくはそのＦａｂフラグメント）と本質的に同様に効果的にＨＥＲ２と結合する。本明細書におけるヒト化抗体は、例えば、ヒト可変重鎖ドメインに組み込まれた非ヒト超可変部残基を含むことがあり、さらにKabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に述べられた可変ドメイン付番システムを利用して、６９Ｈ、７１Ｈおよび７３Ｈからなる群より選択される位置にフレームワーク部（ＦＲ）置換を含むことがある。一態様では、ヒト化抗体は、位置６９Ｈ、７１Ｈおよび７３Ｈの二つまたは全てにＦＲ置換を含む。
本明細書において関心対象の例示的なヒト化抗体は、重鎖可変相補性決定部残基ＧＦＴＦＴＤＹＴＭＸ（Ｘは好ましくはＤまたはＳ）（配列番号：７）；ＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧ（配列番号：８）；および／またはＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹ（配列番号：９）を含み、場合により、それらのＣＤＲ残基にアミノ酸改変を含む（例えばその改変がその抗体の親和性を本質的に維持または改善する場合）。例えば、関心対象の抗体変異体は、約１個から約７個または約５個のアミノ酸置換を上記重鎖可変ＣＤＲ配列に有することがある。例えば下記のような親和性成熟によって、当該抗体変異体を調製することができる。最も好ましいヒト化抗体は、配列番号：４の重鎖可変アミノ酸配列を含む。
ヒト化抗体は、例えば前節の重鎖可変ドメインＣＤＲ残基に追加して、軽鎖可変ドメイン相補性決定残基 ＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡ（配列番号：１０）；ＳＡＳＹＸ１Ｘ２Ｘ３（Ｘ１は好ましくはＲもしくはＬ、Ｘ２は好ましくはＹもしくはＥ、そしてＸ３は好ましくはＴもしくはＳ）（配列番号：１１）；および／またはＱＱＹＹＩＹＰＹＴ（配列番号：１２）を含むことができる。当該ヒト化抗体は、場合により、上記ＣＤＲ残基のアミノ酸改変を含む（例えばその改変がその抗体の親和性を本質的に維持または改善する場合）。例えば、関心対象の抗体変異体は、約１個から約７個または約５個のアミノ酸置換を上記軽鎖可変ＣＤＲ配列に有することがある。例えば下記のような親和性成熟によって、当該抗体変異体を調製することができる。最も好ましいヒト化抗体は、配列番号：３の軽鎖可変アミノ酸配列を含む。
本出願は、ＨＥＲ２と結合して、リガンドによるレセプターＨＥＲの活性化を遮断する、親和性成熟した抗体も考えている。親抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体、例えばそれぞれ配列番号３および４の軽鎖可変配列および／または重鎖可変配列をそれぞれ含むヒト化抗体（すなわち変異体５７４）でありうる。親和性成熟した抗体は、マウス２Ｃ４または変異体５７４よりも優れた親和性で（例えば、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ＥＬＩＳＡを用いて評定するとき、例えば約２または約４倍から約１００倍または約１０００倍向上した親和性で）レセプターＨＥＲ２に好ましくは結合する。置換のための例示的な重鎖可変部ＣＤＲ残基には、Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ３４、Ｈ３５、Ｈ６４、Ｈ９６、Ｈ９９、または二つ以上の組み合わせ（例えば、これらの残基の２、３、４、５、６、または７個）がある。変更のための軽鎖可変部ＣＤＲ残基の例には、Ｌ２８、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ５６、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、Ｌ９６、Ｌ９７、または二つ以上の組み合わせ（例えば、これらの残基の２から３、４、５、または約１０個まで）がある。
様々な形態のヒト化抗体または親和性成熟した抗体が考えられている。例えば、ヒト化抗体または親和性成熟した抗体は、Ｆａｂなどの抗体フラグメントでありうるが、このフラグメントは、免疫コンジュゲートを発生させるために、１つまたは複数の細胞毒性薬と場合によりコンジュゲーションしている。または、ヒト化抗体もしくは親和性成熟した抗体は、インタクトなＩｇＧ１抗体などのインタクトな抗体でありうる。
（ｉｖ） ヒト抗体
ヒト化の代替として、ヒト抗体を発生させることができる。例えば、免疫処置した際に、内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の全レパートリーを産生できるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが今や可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系突然変異マウスにおける抗体重鎖結合部（ＪＨ）遺伝子の同型接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を招くことが記載されている。当該生殖細胞系突然変異マウスにヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを導入する結果として、抗原による攻撃の際にヒト抗体の産生が生じるものである。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993);ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５８９，３６９号および第５，５４５，８０７号を参照されたい。
または、ファージディスプレイ技法（McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)）を使用して、免疫処置されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体および抗体フラグメントをｉｎ ｖｉｔｒｏで産生することができる。この技法によると、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄなどの、糸状バクテリオファージの主または副コートタンパク質遺伝子のいずれかにフレーム内にクローニングして、ファージ粒子の表面上に機能的な抗体フラグメントとして提示させる。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むことから、その抗体の機能的性質に基づく選択は、それらの性質を示す抗体をコードする遺伝子の選択も招く。従って、そのファージは、Ｂ細胞の性質の一部を模倣する。ファージディスプレイを、様々な形式で行うことができる；それらの総説については、例えばJohnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)を参照されたい。いくつかの起源のＶ遺伝子セグメントをファージディスプレイのために使用することができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)は、免疫処置したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小規模ランダムコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫処置していないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、（自己抗原を含む）多様なアレイの抗原に対する抗体を、Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)、またはGriffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)によって記載されている技法に本質的に従って単離することができる。米国特許第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号も参照されたい。
ヒト抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によって発生することもできる（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号参照）。
ヒトＨＥＲ２抗体は、１９９８年６月３０日に発行された米国特許第５，７７２，９９７号および１９９７年１月３日に公表されたＷＯ９７／００２７１に記載されている。
(ｖ) 抗体フラグメント
種々の技法が抗体フラグメントの産生のために開発されてきた。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して誘導された（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992);およびBrennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照されたい）。しかし、これらのフラグメントを、今や組換え宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、その抗体フラグメントを、上記の抗体ファージライブラリーから単離することができる。または、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを、E.coliから直接回収して、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成させることができる（Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)）。別のアプローチにより、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体フラグメントの産生のためのその他の技法は、当業者に明白であろう。他の態様では、選択した抗体は一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および第５，５８７，４５８号を参照されたい。この抗体フラグメントは、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に例えば記載される通り「線状抗体」（linear antibody）でもありうる。当該線状抗体フラグメントは、単一特異性または二重特異性でありうる。
（ｖｉ） 二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＨＥＲ２タンパク質の２つの異なるエピトープに結合することができる。その他の当該抗体は、ＨＥＲ２結合部位と、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３および／またはＨＥＲ４に対する結合部位とを組み合わせることができる。または、細胞防御メカニズムをＨＥＲ２発現細胞に集中させるために、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２もしくはＣＤ３）のような、またはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などの、ＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）のような、白血球上のトリガー分子に結合するアームとＨＥＲ２アームを組み合わせることができる。ＨＥＲ２を発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるために、二重特異性抗体を使用することもできる。これらの抗体は、ＨＥＲ２結合アームと、細胞毒性薬（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシン（ricin）Ａ鎖、メトトレキサート、または放射性同位体ハプテン）と結合するアームとを有する。二重特異性抗体を、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
ＷＯ９６／１６６７３は、二重特異性ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ抗体を記載し、米国特許第５，８３７，２３４号は、二重特異性ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩ抗体ＩＤＭ１（Osidem）を開示している。二重特異性ＨＥＲ２／Ｆｃα抗体は、ＷＯ９８／０２４６３に示されている。米国特許第５，８２１，３３７号は、二重特異性ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を教示している。ＭＤＸ−２１０は、二重特異性ＨＥＲ２−ＦｃγＲＩＩＩ Ａｂである。
二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野において公知である。全長二重特異性抗体の従来の産生は、二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づく。ここで、その２本の鎖は異なる特異性を有する（Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな取り合わせが原因で、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、そのうち、一つだけが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、普通はアフィニティークロマトグラフィー段階によってなされるが、その精製はかなり煩雑であり、その産物の収率は低い。類似の手順がＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
異なるアプローチにより、所望の結合特異性（抗体−抗原の結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。この融合体は、好ましくは、ヒンジ部の少なくとも部分、ＣＨ２部およびＣＨ３部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有する。これら融合体の少なくとも一つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含む第一重鎖定常部（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡと、所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡとを、別々の発現ベクターに挿入して、そして適切な宿主生物に同時トランスフェクションする。これは、等しくない比率の三つのポリペプチド鎖の構築に使用されるそれらのポリペプチド鎖が最適な収率を提供する態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互比率の調整に大きな柔軟性を提供する。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖が等しい比で発現することが高収率を招く場合、またはその比が特に重要ではない場合に、二つまたは三つ全てのポリペプチド鎖についてのコード配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチの好ましい態様では、その二重特異性抗体は、一方のアームに第１結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２結合特異性を提供する）とから構成される。この非対称構造は、望まれていない免疫グロブリン鎖の組み合わせから所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出された。それは、二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することが、分離の容易な方法を提供するからである。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を発生させるさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている別のアプローチによると、抗体分子対の間の界面を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の率を最大にすることができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部分を含む。この方法では、第１抗体分子の界面由来の一つまたは複数の小型アミノ酸側鎖を、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に置換する。その大型側鎖（類）に同一または類似の大きさの代償的な「空洞」は、大型アミノ酸側鎖をより小型のアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）に置換することによって、第２抗体分子の界面に生み出される。これは、ホモ二量体などのその他の望まれない最終産物に比べてヘテロ二量体の収率を増加するためのメカニズムを提供する。
二重特異性抗体は、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体のうちの一方をアビジンと、他方をビオチンと結合させることができる。当該抗体は、例えば、望まれていない細胞に免疫系細胞をターゲティングするために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ ９１／００３６０、ＷＯ ９２／２００３７３、およびＥＰ０３０８９）提案された。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合の架橋方法を用いて作製することができる。適切な架橋剤は当技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に、いくつかの架橋技法と共に開示されている。
抗体フラグメントから二重特異性抗体を発生させるための技法は、文献にも記載されている。例えば、化学的結合を用いて二重特異性抗体を調製することができる。Brennan et al., Science, 229:81 (1985)は、インタクトな抗体がタンパク質分解的に開裂されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを発生する手順を記載している。これらのフラグメントを、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化して、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次に、発生したＦａｂ’フラグメントをチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次に、メルカプトエチルアミンを用いた還元により、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つをＦａｂ’−チオールへと再変換し、等モル量のその他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成させる。産生した二重特異性抗体を、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
最近の進歩により、E. coli由来のＦａｂ’−ＳＨフラグメントを直接回収することが容易になった。このＦａｂ’−ＳＨフラグメントを、化学的に結合して、二重特異性抗体を形成させることができる。Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。各々のＦａｂ’フラグメントが、E. coliから別個に分泌され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ定方向化学的結合に供されて、二重特異性抗体を形成した。このように形成した二重特異性抗体は、レセプターＨＥＲ２を過剰発現している細胞および正常なヒトＴ細胞に結合することができ、かつヒト乳房腫瘍ターゲットに対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性をトリガーできた。
組換え細胞培養物から二重特異性抗体フラグメントを直接作製して単離するための様々な技法も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生された。Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合によって二つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。その抗体ホモ二量体は、ヒンジ部で還元されて単量体を形成し、次に、再び酸化されて抗体へテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体産生のためにも利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)によって記載された「二特異性抗体」技法は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための代替メカニズムを提供した。このフラグメントは、同一鎖上の二つのドメイン間で対形成できるには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、一フラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補性ＶＬドメインおよびＶＨドメインと対形成することを強いられ、それによって、二つの抗原結合部位を形成する。二重特異性抗体フラグメントを単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって作製するための別の戦略も報告されている。Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二つを超える結合価を有する抗体が考えられている。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)。
（ｖｉｉ） その他のアミノ酸配列の改変
本明細書に記載されたＨＥＲ２抗体のアミノ酸配列の改変が考えられている。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的性質を改善することが望ましいことがある。適切なヌクレオチド変化をＨＥＲ２抗体の核酸に導入することにより、またはペプチド合成により、ＨＥＲ２抗体のアミノ酸配列変異体を調製する。当該改変には、例えば、ＨＥＲ２抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換がある。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせは、最終構築物に達するように作製されるが、ただし、その最終構築物は所望の性質を有する。そのアミノ酸変化は、グリコシル化部位の数または位置を変化させるように、ＨＥＲ２抗体の翻訳後プロセスを変更することもできる。
突然変異誘発についての好ましい位置である、ＨＥＲ２抗体のある残基または領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)に記載されているような「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。本明細書において、ターゲット残基の残基または基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電した残基）が同定され、中性または陰性に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）に置換されて、アミノ酸とＨＥＲ２抗原との相互作用に影響する。次に、置換に対する機能的感受性を実証しているアミノ酸位置を、置換部位に、または置換部位の代わりに、さらなる変異体またはその他の変異体を導入することによって精密化する。このように、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決定されているものの、その突然変異自体の性質は、予め決定されている必要はない。例えば、所定の部位での突然変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発が、ターゲットコドンまたはターゲット領域に施され、そして発現したＨＥＲ２抗体変異体が、所望の活性についてスクリーニングされる。
アミノ酸配列挿入には、一つの残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合体、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入がある。末端の挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有するＨＥＲ２抗体、または細胞毒性ポリペプチドに融合したＨＥＲ２抗体がある。ＨＥＲ２抗体分子のその他の挿入変異体には、ＨＥＲ２抗体のＮ末端もしくはＣ末端と、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ用）との、または抗体の血清半減期を増大させるポリペプチドとの融合体がある。
別の型の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、ＨＥＲ２抗体分子中の少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基に置換されている。置換突然変異誘発について最も関心対象の部位には、超可変部またはＣＤＲがあるが、ＦＲまたはＦｃ領域の変更も考えられている。保存的置換を、「好ましい置換」の見出しの下に表１に示す。当該置換が生物学的活性の変化を招くならば、表１に「例示的置換」と称するか、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載される、より実質的な変化を導入して、その産物をスクリーニングすることができる。
Figure 2011173914
抗体の生物学的性質における実質的な改変は、（ａ）例えば、シートまたはヘリックスコンフォメーションのような、置換領域におけるポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）ターゲット部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さを維持することに及ぼすそれらの効果が有意に異なる置換を選択することによって実現される。アミノ酸を、側鎖の性質の類似性により以下のような群に分けることができる（A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp.73-75, Worth Publishers, New York (1975)）：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。
または、天然に存在する残基を、共通の側鎖の性質に基づいて以下の群に分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうち、一つのメンバーを別のクラスのものに交換することを必要とするものである。
ＨＥＲ２抗体の適切なコンフォメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基を、一般にセリンに置換して、その分子の酸化に対する安定性を改善して、異常な架橋を阻止することもできる。逆に、システイン結合をその抗体に付加して、（特に、その抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）その安定性を改善することができる。
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の一つまたは複数の超可変部残基を置換することを伴う。一般に、さらなる開発のために選択された、結果として生じた変異体は、それらの発生が由来する親抗体と比較して、改善した生物学的性質を有するものである。当該置換変異体を発生させるための簡便法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を伴う。簡潔には、いくつかの超可変部部位（例えば、６から７個の部位）を突然変異させてすべての可能なアミノ置換を各部位に発生させる。このように発生した抗体変異体は、糸状ファージ粒子から一価の様式で、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として提示される。次に、ファージディスプレイされた変異体を、本明細書に開示されたように、それらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための候補となる超可変部部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を行って、抗原結合に重大に寄与する超可変部残基を同定することができる。または、もしくは追加的に、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体とヒトＨＥＲ２との間の接触点を同定することも有益でありうる。そのような接触残基および隣接する残基は、本明細書に詳細に述べられた技法による置換のための候補である。当該変異体がいったん発生すると、一団の変異体を本明細書に記載されたスクリーニングに供し、一つまたは複数の関連するアッセイで優れた性質を有する抗体を、さらなる開発のために選択することができる。
この抗体の別の型のアミノ酸変異体は、この抗体の本来のグリコシル化パターンを変更したものである。変更によって、抗体に見出される一つもしくは複数の糖質部分を欠失させること、および／またはその抗体には存在しない一つもしくは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ−結合またはＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合は、アスパラギン残基の側鎖に糖質部分が付着していることを指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に糖質部分を酵素的に付着させるための認識配列である。このように、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチドに存在することで、潜在的なグリコシル化部位が生み出される。Ｏ−結合型グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの一つがヒドロキシアミノ酸に付着していることを指し、そのヒドロキシアミノ酸は、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用されうるが、最も一般にはセリンまたはトレオニンである。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、好都合には、アミノ酸配列を変更することにより、そのアミノ酸配列が（Ｎ−結合型グリコシル化部位のための）上記の一つまたは複数のトリペプチド配列を含ませることによって実現される。本来の抗体の配列に（Ｏ−結合型グリコシル化部位のための）一つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基を付加するか、またはこれらに置換することによっても、変更を行うことができる。
その抗体がＦｃ部を含む場合、それに付着した任意のオリゴ糖構造を変更することができる。例えば、抗体のＦｃ部に付着したフコースを欠く、成熟糖質構造を有する抗体は、米国特許出願ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａ１（Presta, L.）に記載されている。ＵＳ２００４／００９３６２１Ａ１（Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd）も参照のこと。抗体のＦｃ部に付着したオリゴ糖構造中に二分するＮ−アセチルグルコサミン（ＧＩｃＮＡｃ）を有する抗体は、ＷＯ０３／０１１８７８（Jean-Mairetら）および米国特許第６，６０２，６８４号（Umanaら）に参照されている。抗体のＦｃ部に付着したオリゴ糖構造に少なくとも一つのガラクトース残基を有する抗体は、ＷＯ９７／３００８７（Patelら）に報告されている。Ｆｃ部に付着した変更された糖質を有する抗体に関するＷＯ９８／５８９６４（Raju, S.）およびＷＯ９９／２２７６４（Raju, S.）も参照されたい。Ｆｃ部の一つまたは二つの重鎖に付着した当該糖質構造を有する主要種抗体を含む抗体組成物が、本明細書において考慮されている。
ＨＥＲ２抗体のアミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は、当技術分野で公知の多様な方法により調製される。これらの方法には、天然起源（天然アミノ酸配列変異体の場合）からの単離、またはＨＥＲ２抗体の以前に調製された変異体もしくは非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド介在性（もしくは部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発による調製があるが、それに限定されるわけではない。
（ｖｉｉｉ） 所望の性質を有する抗体についてのスクリーニング
抗体を発生させる技法は上述されている。所望により、ある生物学的特性を有する抗体をさらに選択することができる。
レセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する抗体を同定するために、その抗体が、（例えば、別のレセプターＨＥＲとコンジュゲーションして、それと共に関心対象のレセプターＨＥＲがＨＥＲヘテロオリゴマーを形成する）レセプターＨＥＲを発現している細胞に対するＨＥＲリガンドの結合を遮断する能力を決定することができる。例えば、ＨＥＲヘテロオリゴマーのレセプターＨＥＲを自然発現しているか、またはそれを発現するようにトランスフェクションされた細胞を、その抗体と共にインキュベーションして、次にラベルしたＨＥＲリガンドに曝露することができる。ＨＥＲ２抗体が、ＨＥＲヘテロオリゴマー中のレセプターＨＥＲに対するリガンドの結合を遮断する能力を、次に評価することができる。
例えば、ＨＥＲ２抗体によるＭＣＦ７乳房腫瘍細胞系へのＨＲＧ結合の阻害を、本質的にＷＯ０１／００２４５に記載したように２４ウェルプレート形式での氷冷単層ＭＣＦ７培養物を用いて行うことができる。ＨＥＲ２モノクローナル抗体を各ウェルに加え、３０分間インキュベーションすることができる。１２５ＩラベルｒＨＲＧβ１１７７−２２４(２５pm)を次に加え、インキュベーションを４から１６時間続けることができる。用量反応曲線を準備することができ、関心対象の抗体についてＩＣ５０値を算出することができる。一態様では、レセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する抗体は、このアッセイで約５０nM以下の、より好ましくは約１０nM以下の、ＭＣＦ７細胞に対するＨＲＧ結合阻害についてのＩＣ５０を有するであろう。抗体が、Ｆａｂフラグメントなどの抗体フラグメントである場合、このアッセイにおけるＭＣＦ７細胞に対するＨＲＧの結合阻害についてのＩＣ５０は、例えば約１００nM以下、より好ましくは５０nM以下でありうる。
または、もしくは追加的に、ＨＥＲ２抗体が、ＨＥＲヘテロオリゴマーに存在するレセプターＨＥＲのＨＥＲリガンド刺激性チロシンリン酸化を遮断する能力を評定することができる。例えば、レセプターＨＥＲを内因性発現しているか、またはそれらを発現するようにトランスフェクションされた細胞を、抗体と共にインキュベーションして、次に、ＨＥＲリガンド依存性チロシンリン酸化活性について抗ホスホチロシンモノクローナル(場合により検出可能なラベルとコンジュゲーションされたもの)を用いてアッセイすることができる。米国特許第５，７６６，８６３号に記載されているキナーゼレセプター活性化アッセイも、レセプターＨＥＲの活性化と抗体によるその活性の遮断とを測定するために利用できる。
一態様では、本質的にＷＯ０１／００２４５に記載されたように、ＨＲＧによるＭＣＦ７細胞でのｐ１８０チロシンリン酸化の刺激を阻害する抗体についてスクリーニングすることができる。例えば、ＭＣＦ７細胞を２４ウェルプレートに蒔き、ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体を各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベーションし、次に最終濃度０．２nMまでｒＨＲＧβ１１７７−２４４を各ウェルに加えることができ、インキュベーションを８分間続けることができる。培地を各ウェルから吸引し、ＳＤＳ試料バッファー(５%ＳＤＳ、２５mM ＤＴＴ、および２５mMトリス-ＨＣｌ、ｐＨ６．８)１００μlを加えることによって反応を停止させることができる。各試料（２５μl）を、４〜１２%の勾配ゲル（Novex）で電気泳動して、次にポリビニリデンジフルオリド膜に電気泳動的に移行させることができる。抗ホスホチロシン（１μg/ml）免疫ブロットを展色させて、Ｍｒ〜１８００００での顕著な反応性バンドの強度を反射率デンシトメトリーにより定量することができる。選択された抗体は、好ましくはこのアッセイの対照の約０〜３５%まで、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化刺激を有意に阻害するであろう。反射率デンシトメトリーによって決定された、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化刺激の阻害についての用量反応曲線を準備することができ、関心対象の抗体についてのＩＣ５０を算出することができる。一態様では、レセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する抗体は、このアッセイにおいて約５０nM以下の、より好ましくは約１０nM以下の、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化刺激の阻害についてのＩＣ５０を有するであろう。抗体が、Ｆａｂフラグメントなどの抗体フラグメントである場合、このアッセイにおける、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化刺激の阻害についてのＩＣ５０は、例えば約１００nM以下、より好ましくは５０nM以下でありうる。
例えば、本質的にSchaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997)に記載されているように、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞に及ぼす抗体の成長阻害効果を評定することもできる。このアッセイによると、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞を、ＨＥＲ２モノクローナル抗体（１０μg/mL）で４日間処理して、クリスタルバイオレットで染色することができる。ＨＥＲ２抗体とのインキュベーションにより、モノクローナル抗体２Ｃ４によって示される効果に類似した、本細胞系に及ぼす成長阻害効果が示されうる。さらなる態様では、外因性ＨＲＧはこの阻害を有意に逆転しないであろう。好ましくは、この抗体は、外因性ＨＲＧの存在下および不在下の両方で、モノクローナル抗体４Ｄ５よりも高い程度（および場合によりモノクローナル抗体７Ｆ３よりも高い程度）、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の細胞増殖を阻害することができるであろう。
一態様では、関心対象のＨＥＲ２抗体は、モノクローナル抗体４Ｄ５よりも実質的に効果的に、好ましくはモノクローナル抗体７Ｆ３よりも実質的に効果的に、ＷＯ０１／００２４５に記載されたような共免疫沈降実験で決定されたように、ＭＣＦ７細胞およびＳＫ-ＢＲ-３細胞の両方においてＨＥＲ２とＨＥＲ３とのヘレグリン依存性会合を遮断することができる。
増殖阻害ＨＥＲ２抗体を同定するために、ＨＥＲ２を過剰発現するガン細胞の成長を阻害する抗体についてスクリーニングすることができる。一態様では、えり抜きの成長阻害抗体は、細胞培養において約０．５から３０μg/mlの抗体濃度で約２０〜１００%だけ、好ましくは約５０〜１００%だけＳＫ−ＢＲ−３細胞の成長を阻害することができる。当該抗体を同定するために、米国特許第５，６７７，１７１号に記載されているＳＫ−ＢＲ−３アッセイを行うことができる。このアッセイによると、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、１０%ウシ胎仔血清、グルタミン、およびペニシリン、ストレプトマイシンを補充したＦ１２とＤＭＥＭ培地との１：１混合物中で成長させる。ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、３５mmの細胞培養皿に細胞２００００個で（２ml／３５mmの皿）で蒔く。皿１枚あたり０．５から３０μg/mlのＨＥＲ２抗体を添加する。６日後に、未処理の細胞と比較した細胞数を、電子ＣＯＵＬＴＥＲ（商標）細胞計数機を用いて計数する。ＳＫ−ＢＲ−３細胞の成長を約２０〜１００%または約５０〜１００%だけ阻害する抗体を、成長阻害抗体として選択することができる。４Ｄ５および３Ｅ８などの成長阻害抗体についてスクリーニングするアッセイに関しては、米国特許第５，６７７，１７１号を参照されたい。
アポトーシスを誘導する抗体を選択するために、ＢＴ４７４細胞を用いたアネキシン結合アッセイを利用できる。ＢＴ４７４細胞を培養して、前項に論じたように皿に接種する。次に、培地を取り除き、新鮮培地培地単独または１０μg/mlのモノクローナル抗体を含有する培地に交換する。３日間のインキュベーション期間の後に、単層をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理により剥離する。次に、細胞を遠心分離して、Ｃａ２＋結合バッファーに再懸濁して、細胞死アッセイについて上に論じたように試験管に分取する。次に、試験管にラベル化アネキシン（例えばアネキシンＶ-ＦＴＩＣ）（１μg/ml）を入れる。ＦＡＣＳＣＡＮ（商標）フローサイトメータおよびＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ（商標）ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Becton Dickinson）を使用して試料を分析できる。対照に比べて統計的に有意なレベルのアネキシン結合を誘導する抗体を、アポトーシス誘導抗体として選択する。アネキシン結合アッセイに追加して、ＢＴ４７４細胞を用いたＤＮＡ染色アッセイを利用できる。このアッセイを行うために、前の二項に記載したように関心対象の抗体で処理したＢＴ４７４細胞を、３７℃で２時間、９μg/mlのＨＯＥＣＨＳＴ３３３４２（商標）と共にインキュベーションし、次に、ＭＯＤＦＩＴＬＴ（商標）ソフトウェア（Verity Software House）を用いたＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ（商標）フローサイトメータ（Coulter Corporation）で分析する。本アッセイを使用して、未処理細胞(１００%までのアポトーシス細胞)よりも２倍以上（好ましくは３倍以上）というアポトーシス細胞率の変化を誘導する抗体を、アポトーシス促進性抗体として選択することができる。７Ｃ２および７Ｆ３などの、アポトーシスを誘導する抗体についてスクリーニングするためのアッセイに関してはＷＯ９８／１７７９７を参照されたい。
関心対象の抗体によって結合されるＨＥＲ２上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを実施して、その抗体が２Ｃ４またはパーツズマブなどの抗体がＨＥＲ２に結合するのを交差遮断するするかどうかを評定することができる。または、もしくは追加的に、当技術分野で公知の方法によって、エピトープマッピングを行うことができ、かつ／または抗体−ＨＥＲ２構造を研究して（Franklin et al., Cancer Cell 5:317-328 (2004)）ＨＥＲ２のどのドメイン（類）がその抗体によって結合されるかを知ることができる。
（ｉｘ）免疫コンジュゲート
本発明は、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素であって、そのフラグメントおよび／または変異体を含む）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）などの細胞毒性薬にコンジュゲーションした抗体を含む免疫コンジュゲートにも関するものである。
当該免疫コンジュゲートの発生に有用な化学療法剤は上に記載されている。抗体と、カリチェアミシン、メイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、およびトリコテン（trichothene）、およびＣＣ１０６５などの一つまたは複数の小分子毒素とのコンジュゲートも本明細書に考えられている。
本発明の好ましい一態様では、抗体は、一つまたは複数のメイタンシン分子（例えば、抗体１分子あたり約１から約１０個のメイタンシン分子）とコンジュゲーションしている。メイタンシンを、例えばＭａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換でき、それをＭａｙ−ＳＨ３に還元して改変抗体と反応させ（Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992)）、メイタンシノイド−抗体免疫コンジュゲートを発生させることができる。
関心対象の別の免疫コンジュゲートは、一つまたは複数のカリチェアミシン分子とコンジュゲーションしているＨＥＲ２抗体を含む。カリチェアミシンファミリーの抗生物質は、サブピコモル濃度で、２本鎖ＤＮＡ切断を産生することができる。使用されうるカリチェアミシンの構造アナログには、γ１ Ｉ、α２ Ｉ、α３ Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１ Ｉ、ＰＳＡＧ、およびθＩ １（Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342(1993)およびLode et al., Cancer Research 58:2925-2928(1998)）があるが、それに限定されるわけではない。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，７１４，５８６号；第５，７１２，３７４号；第５，２６４，５８６号；および第５，７７３，００１号も参照されたい。
使用できる酵素活性毒素およびそのフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Pseudomonas aeruginosa由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（modeccin）Ａ鎖、アルファ−サルシン（sarcin）、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ-Ｓ）、momordica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、およびびトリコテセンがある。例えば、１９９３年１０月２８日に公表されたＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。
本発明は、抗体と核分解活性を有する化合物（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）などのリボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ）との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考えている。
放射性コンジュゲーションしたＨＥＲ２抗体の産生に種々の放射性同位体を利用できる。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体がある。
抗体と細胞毒性薬とのコンジュゲートを、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（ジメチルアジポイミデートＨＣＬなど）、活性エステル類（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド類（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリエン（tolyene）−２，６−ジイソシアネートなど）、および二活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）のような多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製することができる。例えば、Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されているように、リシン免疫毒素を調製することができる。炭素１４ラベル１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲーションするための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞毒性薬物の放出を容易にする「開裂可能なリンカー」でありうる。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Chari et al.，Cancer Research 52:127-131 (1992)）を使用することができる。
または、ＨＥＲ２抗体および細胞毒性薬を含む融合タンパク質を、例えば組換え技法またはペプチド合成によって作成することができる。
なお別の態様では、腫瘍の予備ターゲティングに利用するために、「レセプター」(ストレプトアビジンなど)に抗体をコンジュゲーションすることができ、ここで、抗体 -レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて除去（clearing）剤を使用して循環から未結合のコンジュゲートを除去し、次に、細胞毒性薬（例えば放射性ヌクレオチド）にコンジュゲーションしている「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
（ｘ） その他の抗体改変
抗体のその他の改変が本明細書において考えられている。例えば、多様な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーのうちの一つに抗体を連結することができる。例えばコアセルベーション技法もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリメタクリル酸メチルマイクロカプセル）に、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル)に、またはマクロエマルションに、抗体を捕捉することもできる。このような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に開示されている。
例えば、抗体の抗原依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を高めるように、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することが理想的でありうる。抗体のＦｃ部に一つまたは複数のアミノ酸置換を導入することによって、これを実現することができる。または、もしくは追加的に、Ｆｃ部にシステイン残基を導入することによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。このように発生したホモ二量体抗体は、改善したインターナリゼーション能ならびに／または増加した補体介在性細胞殺滅および抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を有しうる。Caronら、J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)およびShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照されたい。増大した抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体もまた、Wolffら、Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているようにヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することができる。または、二つのＦｃ部を有することによって、増強した補体溶解およびＡＤＣＣ能を有しうる抗体を加工することができる。Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照されたい。
ＷＯ００／４２０７２（Presta, L.）は、ヒトエフェクター細胞の存在下で改善したＡＤＣＣ機能を有する抗体を記載しており、ここで、その抗体はそのＦｃ部にアミノ酸置換を含む。好ましくは、改善したＡＤＣＣを有する抗体は、Ｆｃ部の位置２９８、３３３、および／または３３４に置換を含む。好ましくは、変更されたＦｃ部は、これらの位置の一つ、二つもしくは三つに置換を含むか、または、それからなるヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部である。
変更されたＣ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を有する抗体は、ＷＯ９９／５１６４２、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号、米国特許第６，２４２，１９５Ｂ１号、米国特許第６，５２８，６２４Ｂ１号および米国特許第６，５３８，１２４号（Idusogie et al.）に記載されている。この抗体は、そのＦｃ部のアミノ酸位置２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３１３、３３３および／または３３４のうち一つまたは複数にアミノ酸置換を含む。
抗体の血清中半減期を増加させるために、例えば米国特許第５，７３９，２７７号に記載されたように抗体（特に抗体フラグメント）にサルベージレセプター結合エピトープを組み込むことができる。本明細書に使用されるように、用語「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のｉｎ ｖｉｖｏ血清中半減期を増加させることを担う、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ部のエピトープを指す。そのＦｃ部に置換を有し、増大した血清中半減期を有する抗体は、ＷＯ００／４２０７２（Presta, L.）にも記載されている。
三つ以上（好ましくは四つ）の機能性抗原結合部位を有する加工された抗体もまた考慮されている（米国特許出願ＵＳ２００２／０００４５８７Ａ１、Miller et al.）。
本明細書に開示されたＨＥＲ２抗体を、免疫リポソームとして処方することもできる。抗体を含有するリポソームを、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；ならびに１９９７年１０月２３日に公開されたＷＯ９７／３８７３１に記載されているように、当技術分野において公知の方法により調製する。循環時間が増大したリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって発生させることができる。所定の孔径のフィルターを通過させてリポソームを押し出して、所望の直径を有するリポソームを得る。Martin et al. J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介して、本発明の抗体のＦａｂ'フラグメントをリポソームにコンジュゲーションすることができる。場合により、化学療法剤がリポソーム内に包含される。Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19)1484 (1989)を参照されたい。
ＩＶ． 薬学的製剤
本発明の組成物の治療用製剤は、その組成物を、任意選択の薬学的に許容されうる担体、賦形剤、または安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）と、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で混合することによって、保存用に調製される。許容されうる担体、賦形剤、または安定化剤は、採用される投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒性であり、それらには、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール、もしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖類、二糖類、およびその他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤がある。凍結乾燥ＨＥＲ２抗体製剤はＷＯ９７／０４８０１に記載されている。
本明細書における製剤は、処置される特定の適応に必要な一つを超える活性化合物、好ましくは相互に有害な影響を及ぼさない相補性活性を有する化合物も含有することがある。例えば、一製剤中に、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２（例えば、ＨＥＲ２の異なるエピトープと結合する抗体）、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、または血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体をさらに提供することが望ましいことがある。または、もしくは追加的に、この組成物は、化学療法剤、細胞毒性薬、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、ＥＧＦＲターゲット薬、抗血管形成剤、チロシンキナーゼ阻害剤、および／または心臓保護剤をさらに含むことがある。当該分子は、好適には、意図された目的に有効である量で組み合わせて存在する。
活性成分は、例えばコアセルベーション技法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリメタクリル酸メチルマイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルションに捕捉することもできる。当該技法はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed.,(1980)に開示されている。
持続性放出製剤を調製することができる。持続性放出製剤の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性重合体の半透過性マトリックスがあり、このマトリックスは、造形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続性放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、またはポリビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）などの分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸がある。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通して濾過することにより容易に実現される。
Ｖ． 治療のための患者のスクリーニング
本明細書における発明の好ましい態様によると、治療のために選択された患者は、ＨＥＲ（好ましくはＨＥＲ２）の活性化を示している腫瘍、または他の細胞もしくは組織を有する。一態様では、ガン細胞または他の試験する細胞におけるＨＥＲ（またはＨＥＲ２）活性化の程度は、同組織型の非ガン性細胞または正常細胞におけるレセプターの活性化レベルを有意に上回る。そのような過度の活性化は、レセプターＨＥＲの過剰発現、および／またはガン細胞におけるこのレセプターＨＥＲの活性化に利用できるＨＥＲリガンドのレベルが正常よりも高いことに起因する。そのような過度の活性化は、ガン細胞の悪性状態を引き起こし、かつ／またはそれに引き起こされうる。いくつかの態様では、そのガンは、診断または予後アッセイに供されて、レセプターＨＥＲのそのような過度の活性化を招くレセプターＨＥＲの増幅および／または過剰発現が生じているかどうかが決定されるであろう。または、もしくは追加的に、そのガンは、診断または予後アッセイに供されて、このレセプターの過度の活性化を導くＨＥＲリガンドの増幅および／または過剰発現がそのガンにおいて生じているかどうかが決定されうる。当該ガンのサブセットでは、レセプターの過度の活性化は、自己分泌刺激経路に起因しうる。ＨＥＲ活性化を決定するための様々なアッセイを下にさらに詳細に説明する。
（ｉ） ＨＥＲ二量体
ＨＥＲまたはＨＥＲ２活性化を示しているとして、ＨＥＲ二量体の存在について試料を評定することができる。当技術分野において公知の任意の方法を使用して、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３などのＨＥＲ２二量体を検出することができる。いくつかの好ましい方法を下に説明する。これらの方法は、非共有タンパク質−タンパク質相互作用を検出するか、または、さもなければ関心対象のタンパク質の間で近接していることを指示する。
免疫沈降またはＥＬＩＳＡなどの免疫親和性に基づく方法を使用してＨＥＲ二量体を検出することができる。一態様では、ＨＥＲ２抗体を使用して、ＨＥＲ２を含む複合体を腫瘍細胞から免疫沈降させ、次に、免疫ブロットによりＥＧＦＲまたはＨＥＲ３の存在について、結果として生じた免疫沈殿剤を探査する。別の態様では、免疫沈降段階のためにＥＧＦＲ抗体またはＨＥＲ３抗体を使用することができ、次に、ＨＥＲ２抗体を用いて免疫沈殿剤を探査する。さらなる態様では、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２複合体またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３複合体に特異的なＨＥＲリガンドを使用して、複合体を沈殿させることができ、次に、ＨＥＲ２の存在についてその複合体を探査する。例えば、リガンドをアビジンとコンジュゲーションして、複合体をビオチンカラムで精製することができる。
ＥＬＩＳＡアッセイまたは抗体「サンドイッチ」型アッセイなどの他の態様では、ＨＥＲ２に対する抗体を固体支持体上に固定化して、腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解物と接触させ、洗浄し、次にＥＧＦＲまたはＨＥＲ３に対する抗体に曝露する。後者の抗体の結合は、直接または検出可能なラベルにコンジュゲーションした二次抗体によって検出できるが、ヘテロ二量体の存在を示す。ある態様では、ＥＧＦＲ抗体またはＨＥＲ３抗体を固定化して、ＨＥＲ２抗体を検出段階に使用する。他の態様では、ＨＥＲリガンドをＨＥＲ抗体の代わりに、またはＨＥＲ抗体と組み合わせて使用することができる。
化学架橋またはＵＶ架橋を使用して、生きた細胞の表面に二量体を共有結合的に繋ぐこともできる。Hunter et al., Biochem. J., 320:847-53。化学架橋剤の例には、ジチオビス（スクシンイミジル）プロピオナート（ＤＳＰ）および３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジル）プロピオナート（ＤＴＳＳＰ）がある。一態様では、化学架橋した腫瘍細胞由来の細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ３に対する抗体を用いて免疫ブロットする。適切な分子量のスーパーシフトしたバンドは、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体を最も表していると思われる。それは、ＨＥＲ２がＥＧＦＲおよびＨＥＲ３に好ましい二量体化パートナーだからである。この結果を、ＨＥＲ２抗体を用いたその後の免疫ブロットにより確認することができる。
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体を検出することもできる。ＦＲＥＴは、ドナーフルオロホアからアクセプターフルオロホアへのエネルギー移動に基づいてタンパク質のコンフォメーション変化およびタンパク質−タンパク質相互作用をｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで検出する。Selvin, Nat. Struct. Biol., 7:730-34(2000)。ドナーフルオロホアがアクセプターフルオロホアに十分近接している場合に限り、エネルギー移動が起こる。典型的なＦＲＥＴ実験では、二つのタンパク質または単一タンパク質の二つの部位を異なる蛍光プローブでラベルする。一方のプローブであるドナープローブは、特異的な波長の入射光によって高いエネルギー状態に励起する。次に、ドナープローブはそのエネルギーを第２のプローブであるアクセプタープローブに伝播し、その結果、ドナー蛍光強度の減少とアクセプター蛍光発光の増加とを生じる。エネルギー移動の程度を測定するために、ドナープローブおよびアクセプタープローブでラベルした試料でのドナーの強度を、ドナープローブのみでラベルした試料でのドナーの強度と比較する。場合により、アクセプターの強度をドナー／アクセプターおよびアクセプターのみの試料で比較する。適切なプローブは当技術分野で公知であり、それには、例えば、フルオレセインおよびロダミンなどの膜透過性色素、シアニン色素などの有機色素、ならびにランタニド原子がある。Selvin、上記。エネルギー移動を検出および測定するための方法および計装もまた、当技術分野で公知である。Selvin、上記。
個別の細胞におけるタンパク質−タンパク質相互作用を検出および測定するために適した、ＦＲＥＴに基づく技法も当技術分野で公知である。例えば、ドナー光退色蛍光共鳴エネルギー移動（ｐｂＦＲＥＴ）顕微鏡観察および蛍光寿命イメージング顕微鏡観察（ＦＬＩＭ）を使用して、細胞表面レセプターの二量体化を検出することができる。 Selvin、上記；Gadella & Jovin, J. Cell Biol., 129:1543-58 (1995)。一態様では、Nagy et al., Cytometry, 32:120-131 (1998)に記載されているように「懸濁液中」または「ｉｎ ｓｉｔｕ」のいずれかで細胞に対してｐｂＦＲＥＴを使用して、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体の形成を検出および測定する。これらの技法は、エネルギー移動が原因のドナーの蛍光寿命の減少を測定する。特定の態様では、Nagyら、上記およびBrockhoff et al., Cytometry, 44:338-48 (2001)に記載されているように、フローサイトメトリーＦｏｅｒｓｔｅｒ型ＦＲＥＴ技法（ＦＣＥＴ）を使用してＥＧＦＲ−ＨＥＲ２およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３の二量体化を研究することができる。
ＦＲＥＴは、好ましくは標準的な免疫組織化学ラベル技法と共に使用される。Kenworthy, Methods, 24:289-96 (2001)。例えば、適切な蛍光色素とコンジュゲーションした抗体を、二つの異なるタンパク質をラベルするためのプローブとして使用することができる。タンパク質が相互に近接しているならば、それらの蛍光色素はＦＲＥＴのためのドナーおよびアクセプターとして作用する。標準的な手段によってエネルギー移動を検出する。フローサイトメトリー手段によって、または電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラと接続した共焦点顕微鏡観察もしくは広視野蛍光顕微鏡観察などのデジタル顕微鏡観察システムによってエネルギー移動を検出することができる。
本発明の一態様では、例えば、Nagyら、上記に記載されているように、ＨＥＲ２抗体と、ＥＧＦＲ抗体またはＨＥＲ３抗体のいずれかとを二つの異なるフルオロホアで直接ラベルする。腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解物を、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体の存在下でＦＲＥＴのためのドナーおよびアクセプターとして作用する、ディファレンシャルにラベルした抗体と接触させる。または、ＨＥＲ２に対する未ラベル抗体と、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３のいずれかに対する未ラベル抗体とを、ドナーおよびアクセプターとして働くディファレンシャルにラベルした二次抗体と一緒に使用する。例えば、Brockhoffら、上記を参照されたい。エネルギー移動を検出して、それらラベルが近接していることが見出されたならば、二量体の存在が決定される。
他の態様では、ＨＥＲ２に特異的なレセプターＨＥＲのリガンドと、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３のいずれかに特異的なレセプターＨＥＲのリガンドとを蛍光ラベルして、ＦＲＥＴ研究に使用する。
本発明のなお他の態様では、腫瘍細胞表面上に二量体が存在することを、標準的な直接または間接免疫蛍光技法および共焦点レーザー走査顕微鏡観察を用いて、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３のいずれかとのＨＥＲ２の共局在によって実証する。または、Zuck et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:11122-27(1999)に記載されているように、レーザ走査イメージング（ＬＳＩ）を使用して、マイクロウェルプレートなどの高スループット形式で、抗体結合およびＥＧＦＲまたはＨＥＲ３のいずれかとのＨＥＲ２の共局在を検出する。
さらなる態様では、二量体構成要素の近接に依存した酵素活性を確認することによって、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２および／またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体の存在を決定する。ＨＥＲ２抗体を、ある酵素とコンジュゲーションさせ、ＥＧＦＲ抗体またはＨＥＲ３抗体を第２酵素とコンジュゲーションさせる。第１酵素に対する第１基質を加えると、その反応は、第２酵素に対する第２基質を産生する。これにより、別の分子と反応して色素などの検出可能な化合物の産生がもたらされる。別の化学物質が存在すると、第２基質が分解し、その結果、第１および第２酵素が、よって二つの抗体が近接していない限り、第２酵素との反応は阻止される。特定の態様では、グルコースオキシダーゼとコンジュゲーションしたＨＥＲ２抗体、およびホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲーションしたＨＥＲ３抗体またはＨＥＲ１抗体と、腫瘍細胞または細胞溶解物を接触させる。ＤＡＢおよびカタラーゼなどの色素前駆体と共にグルコースを反応物に加える。ＤＡＢについて染色したときの展色によって、二量体の存在を決定する。
例えば、２００１年１２月６日に公表された、両方共にその全体が参照により特に組み入れられる米国特許出願２００１／００４９１０５に記載されているようなｅＴａｇ（商標）アッセイシステム（Aclara Bio Sciences, MountainView, CA）に基づく方法を用いても、二量体を検出することができる。ｅＴａｇ（商標）または「電気泳動タグ」は、蛍光基などの検出可能なレポーター部分を含む。それは、独特の電気泳動移動度を有する部分から本質的になる「移動度改変物質」も含みうる。これらの部分は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）などの所定の電気泳動条件で複合体混合物からｅＴａｇ（商標）の分離および検出を可能にする。レポーター部分と、場合により移動度改変物質とを含有するｅＴａｇ（商標）の一部を、開裂可能な連結基によって第１ターゲット結合部分に連結させて、第１結合化合物を産生する。この第１ターゲット結合部分は、核酸またはタンパク質などの特定の第１ターゲットを特異的に認識する。第１ターゲット結合部分は、いかなる方法にも限定されず、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドでありうる。好ましくは、第１ターゲット結合部分は、抗体または抗体フラグメントである。または、第１ターゲット結合部分は、レセプターＨＥＲのリガンドまたはその結合構成要素フラグメントでありうる。
連結基は、酵素基質などの開裂可能な部分、または所定の条件で開裂できる任意の化学結合を好ましくは含む。第一ターゲット結合部分がそのターゲットに結合した場合、開裂剤が導入および／または活性化され、連結基が開裂し、それによってレポーター部分および移動度改変物質を含有するｅＴａｇ（商標）の一部が放出される。このように、「遊離の」ｅＴａｇ（商標）の存在は、ターゲットに対するターゲット結合部分の結合を示す。
好ましくは、第２結合化合物は、開裂剤と、第２ターゲットを特異的に認識する第２ターゲット結合部分とを含む。第２ターゲット結合部分も、どのようにも限定されるわけではなく、例えば抗体もしくは抗体フラグメントまたはレセプターＨＥＲのリガンドまたは結合構成要素のリガンドフラグメントでありうる。第１結合化合物および第２結合化合物が近接しているならば、開裂剤は、第１結合化合物の連結基のみを開裂させるであろう開裂剤である。
本発明の態様では、第１結合化合物は、ＨＥＲ２に対する抗体が第１ターゲット結合部分として働くｅＴａｇ（商標）を含む。第２結合化合物は、ｅＴａｇ（商標）の連結基を開裂できる開裂剤と繋がった、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３に対する抗体を含む。好ましくは、開裂剤は、連結基を開裂できるには活性化していなければならない。ＨＥＲ２に結合するｅＴａｇ（商標）、および細胞表面のＥＧＦＲまたはＨＥＲ３に結合する改変ＥＧＦＲ抗体またはＨＥＲ３抗体と、腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解物を接触させる。未結合の結合化合物を好ましくは取り除き、開裂剤を必要に応じて活性化させる。ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体が存在するならば、開裂剤は連結基を開裂して、開裂剤が連結基と近接していることが原因でｅＴａｇ（商標）を放出するであろう。次に、キャピラリー電気泳動などの、当技術分野で公知の任意の方法によって、遊離のｅＴａｇ（商標）を検出できる。
一態様では、開裂剤は、連結基に作用する活性化可能な化学種である。例えば、開裂剤は、試料を露光することにより活性化することができる。
別の態様では、第１ターゲット結合部分としてＥＧＦＲまたはＨＥＲ３に対する抗体を用いてｅＴａｇ（商標）を構築して、第２結合化合物をＨＥＲ２に対する抗体から構築する。
なお別の態様では、二量体におけるいずれかのレセプターＨＥＲに対する結合に比較して、その二量体に特異的または優先的に結合する抗体または他の試薬を使用して、ＨＥＲ二量体を検出する。
（ｉｉ） ＨＥＲ２リン酸化
前項で論じたように、ＥＧＦＲ抗体、ＨＥＲ２抗体、またはＨＥＲ３抗体との免疫沈降の後に、場合により免疫ブロットの代替または補足として、二量体の機能的アッセイを行う。一態様では、ＨＥＲ３抗体を用いた免疫沈降に続いて、免疫沈殿剤でのレセプターチロシンキナーゼ活性についてのアッセイを行う。ＨＥＲ３は内因性チロシンキナーゼ活性を有さないことから、免疫沈殿剤中のチロシンキナーゼ活性の存在は、ＨＥＲ３がＨＥＲ２と最も会合していそうなことを示す。Graus-Porta et al., EMBO J., 16:1647-55 (1997); Klapper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:4995-5000 (1999)。ＨＥＲ２抗体を用いた免疫ブロットにより本結果を確認できる。別の態様では、ＨＥＲ２抗体を用いた免疫沈降に続いて、ＥＧＦＲのレセプターチロシンキナーゼ活性についてのアッセイを行う。本アッセイでは、免疫沈殿剤を放射性ＡＴＰ、およびＥＧＦＲによるＨＥＲ２のリン酸基転移のｉｎ ｖｉｖｏ部位を模倣するペプチド基質と接触させる。ペプチドのリン酸化は、共免疫沈降と、よってＥＧＦＲとＨＥＲ２との二量体化を示す。レセプターチロシンキナーゼ活性アッセイは、当技術分野で周知であり、それには、例えばホスホチロシン抗体によるターゲット基質のリン酸化と、ＭＡＰＫ経路などのコグネイトシグナル伝達経路の活性化とを検出するアッセイが含まれる。
レセプターＨＥＲのリン酸化を、レセプターＨＥＲ２（ＨＥＲ２）などの一つまたは複数のレセプターＨＥＲの免疫沈降およびウエスタンブロット分析によって評価できる。例えば、免疫沈降したレセプターＨＥＲ中のリン酸化したチロシン残基を検出するために抗ホスホチロシン抗体を用いて、ゲル上のホスホ−ＨＥＲ２バンドの存在によって陽性を決定する。抗ホスホチロシン抗体は、Invitrogen, Chemicon International Inc.（Temecula, CA）の子会社であるPan Vera（Madison, WI）、またはUpstate Biotechnology（Lake Placid, NY）から市販されている。バンドの不在により陰性を決定する。
別の態様では、レセプターＨＥＲ２(ＨＥＲ２)のリン酸化を、ホスホ特異的ＨＥＲ２抗体（クローンＰＮ２Ａ;Thor et al., J. Clin. Oncol., 18(18):3230-3239 (2000)）を用いた免疫組織化学検査により評定する。
レセプターＨＥＲのリン酸化を検出するための他の方法には、ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡ （米国特許第５，７６６，８６３号；第５，８９１，６５０号；第５，９１４，２３７号；第６，０２５，１４５号；および第６，２８７，７８４号）、質量分析（リン酸化ＨＥＲ２と非リン酸化ＨＥＲ２とのサイズを比較）、およびＨＥＲ（例えばＨＥＲ２）抗体とホスホ特異的またはホスホチロシン特異的抗体との両方を用いたｅ−ｔａｇ近接アッセイ（例えばAclara BioSciences（Mountain View, CA）から入手できるeTag（商標）アッセイキットを使用）がある。ｅＴａｇアッセイの詳細を本明細書に上記する。
細胞アレイにホスホ特異的抗体を使用して、細胞試料中のシグナル伝達タンパク質のリン酸化状態を検出することもできる（ＵＳ２００３／０１９０６８９）。
（ｉｉｉ） ＨＥＲ２リガンド
腫瘍中または腫瘍と関連したＴＧＦ−αなどのＨＥＲリガンドのレベルを、公知の手順により決定することができる。そのようなアッセイは、検査する試料中のタンパク質および／またはそれをコードする核酸を検出することができる。一態様では、免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて、腫瘍中のＨＥＲリガンドのレベルを決定できる；例えば、Scher et al., Clin. Cancer Research 1:545-550 (1995)を参照されたい。または、もしくは追加的に、検査する試料中の、ＨＥＲリガンドをコードする核酸のレベルを、例えばＦＩＳＨ、サザンブロット、またはＰＣＲ技法により評価することができる。
（ｉｖ） ＨＥＲ２を過剰発現していないガン
レセプターＨＥＲ２の過剰発現によってガンを特徴づけることができるが、本出願は、ＨＥＲ２過剰発現性ではないとみなされるガンを処置するための方法をさらに提供する。
ガンにおけるＨＥＲ２発現を決定するために、様々な診断／予後アッセイを利用できる。一態様では、ＨＥＲ２の過剰発現を、例えばＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（登録商標）（Dako）を使用した、ＩＨＣにより分析できる。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片をＩＨＣアッセイに供して、以下の通りＨＥＲ２タンパク質染色強度基準に適合させることができる：
スコア０ 染色が観察されないか、または腫瘍細胞の１０%未満に膜染色が観察される。
スコア１＋ 腫瘍細胞の１０%超にかすか／わずかに認知できる膜染色が検出される。これらの細胞の膜の一部だけが染色される。
スコア２＋ 腫瘍細胞の１０%超に膜全体の弱から中度の染色が観察される。
スコア３＋ 腫瘍細胞の１０%超に膜全体の中から強度の染色が観察される。
ＨＥＲ２の過剰発現評定についてスコア０または１＋を有する腫瘍を、ＨＥＲ２を過剰発現していないと特徴づけることができ、一方、スコア２＋または３＋を有する腫瘍を、ＨＥＲ２を過剰発現していると特徴づけることができる。
ＨＥＲ２を過剰発現している腫瘍を、細胞１個あたりに発現したＨＥＲ２分子のコピー数に対応する免疫組織化学スコアによって採点することができ、生化学的に決定することができる：
０＝０〜１００００コピー／細胞、
１＋＝少なくとも約２０００００コピー／細胞、
２＋＝少なくとも約５０００００コピー／細胞、
３＋＝少なくとも約２００００００コピー／細胞。
チロシンキナーゼのリガンド非依存性活性化をもたらす３＋レベルでのＨＥＲ２の過剰発現（Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7159-7163 (1987)）は、乳ガンの約３０%で起こり、これらの患者では、無再発生存率および全生存率が減少している（Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989);Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987)）。または、もしくは追加的に、ＩＮＦＯＲＭ（商標）（Ventana, Arizonaが販売）またはＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（商標）（Vysis, Illinois）などのＦＩＳＨアッセイを、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織に対して行って、（もしあれば）腫瘍におけるＨＥＲ２の過剰発現の程度を決定することができる。
一態様では、ガンはＥＧＦＲを発現する（かつ過剰発現しうる）ガンであろうし、当該発現を、上に言及したようなＨＥＲ２の発現を評価するための方法に関して評価することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏ診断アッセイを用いて、例えば検出すべき分子と結合し、検出可能なラベル（例えば放射性同位体）でタグを付けた（抗体などの）分子を投与して、そのラベルの局在について患者を外部からスキャンすることによって、レセプターＨＥＲまたはＨＥＲリガンドの過剰発現または増幅を評価することもできる。
ＶＩ． ＨＥＲ２抗体組成物を用いた処置
本発明によると、ＨＥＲ２抗体を使用してガンを処置できることが考慮されている。そのガンは、一般にＨＥＲ２発現細胞を含み、それにより本明細書におけるＨＥＲ２抗体がガン細胞に結合できるであろう。この組成物を用いて処置できる様々なガンが上の定義の節に挙げられている。
ＨＥＲ２抗体を使用して様々な非悪性疾患または障害を処置できることも考慮されており、その疾患または障害の例は、自己免疫疾患（例えば乾癬）；子宮内膜症；強皮症；再狭窄；結腸ポリープ、鼻ポリープまたは胃腸管ポリープなどのポリープ；線維腺腫；呼吸器疾患；胆嚢炎；神経線維腫症；多発性嚢胞腎；炎症性疾患；乾癬および皮膚炎を含む皮膚障害；血管疾患；血管上皮細胞の異常増殖を伴う状態；胃腸潰瘍；メネトリエー病、分泌性腺腫またはタンパク喪失症候群；腎障害；血管形成障害；加齢黄斑変性、推定眼ヒストプラスマ症、増殖糖尿病網膜症による網膜血管新生、網膜血管形成、糖尿病性網膜症などの眼疾患または加齢黄斑変性；骨関節炎、くる病および骨粗しょう症などの骨関連病態；脳虚血イベント後の損傷；肝硬変、肺線維症、サルコイドーシス、甲状腺炎、全身性過粘稠度症候群、オースラーウェーバー・ランデュ病、慢性閉塞性肺疾患、または熱傷、外傷、放射線、脳卒中、酸素欠乏症もしくは虚血後の浮腫などの線維疾患または浮腫疾患；皮膚過敏反応；糖尿病性網膜症および糖尿病性ネフロパシー；ギラン・バレー症候群；移植片対宿主疾患または移植拒絶反応；ページェット病；骨または関節の炎症；光老化（例えばヒト皮膚のＵＶ照射により起こる）；良性前立腺肥大；アデノウイルス、ハンタウイルス、Borrelia burgdorferi、Yersinia spp.およびBordetella pertussisから選択される微生物病原体を含めた、ある種の微生物感染；血小板凝集により起こる血栓；子宮内膜症、卵巣過剰刺激症候群、子癇前症、機能不全性子宮出血、または機能性子宮出血などの生殖器の状態；滑膜炎；アテローム；急性および慢性ネフロパシー（増殖性糸球体腎炎および糖尿病誘導腎疾患を含む）；湿疹；肥厚性瘢痕形成；内毒素性ショックおよび真菌感染；家族性腺腫ポリポーシス；神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、エイズ関連痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、脊髄性筋萎縮症および小脳変性）；骨髄異形成症候群；再生不良性貧血；虚血傷害；肺、腎臓または肝臓の線維症；Ｔ細胞媒介過敏性疾患；乳児肥大型幽門狭窄症；尿管閉塞症候群；乾癬性関節炎；ならびに橋本甲状腺炎などである。本明細書における治療のための好ましい非悪性適応には、乾癬、子宮内膜症、強皮症、血管疾患（例えば、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、もしくは高血圧症）、結腸ポリープ、線維腺腫、または呼吸器疾患（例えば、喘息、慢性気管支炎、気管支拡張、もしくは嚢胞性線維症）がある。
ＨＥＲ２抗体を用いた処置は、疾患の徴候または症状に改善を招くであろう。例えば、処置される疾患がガンの場合、そのような治療法は生存期間（全生存期間および／もしくは進行のない生存期間）の改善を招くことができ、かつ／または客観的臨床の（部分もしくは完全）反応を招くことができる。
好ましくは、投与される組成物中のＨＥＲ２抗体は、ネイキッドな抗体である。しかし、投与されるＨＥＲ２抗体を細胞毒性薬にコンジュゲーションすることができる。好ましくは、その細胞毒性薬が結合している免疫コンジュゲートおよび／またはＨＥＲ２タンパク質は、細胞によってインターナリゼーションされ、それが結合するガン細胞の殺滅に果たす免疫コンジュゲートの治療有効性の増加を招く。好ましい態様では、細胞毒性薬はガン細胞中の核酸をターゲティングまたは妨害する。当該細胞毒性薬の例には、メイタンシノイド、カリケアミシン、リボヌクレアーゼ、およびＤＮＡエンドヌクレアーゼがある。
ＨＥＲ２抗体は、例えばボーラスとしての、もしくはある時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、動脈内、滑膜内、鞘内、経口、局所、または吸入経路などの公知の方法により、ヒト患者に投与される。抗体組成物の静脈内投与が好ましい。
疾患の予防または処置のための、ＨＥＲ２抗体の適切な投薬量は、上に定義されたような処置される疾患の種類、疾患の重症度および経過、そのＨＥＲ２抗体が予防または治療目的のために投与されるかどうか、以前の治療、患者の臨床歴およびＨＥＲ２抗体に対する反応、ならびに担当の医師の判断力に依存するであろう。ＨＥＲ２抗体は一度にまたは一連の処置にわたり患者に適切に投与される。疾患の種類および重症度に応じて、約１μg/kgから５０mg/kg（例えば０．１〜２０mg/kg）のＨＥＲ２抗体が、患者に対する投与の候補となる初期投薬量であり、それは例えば１回もしくは複数回の個別の投与、または連続注入のいずれかによる。一態様では、ＨＥＲ２抗体についての初回注入時間は、その後の注入時間よりも長いことがあり、例えば初回注入について約９０分間であり、（初回注入が耐容性良好であるならば）その後の注入について約３０分間である。ＨＥＲ２抗体の好ましい投薬量は、約０．０５mg/kgから約１０mg/kgの範囲内であろう。このように、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg、または１０mg/kgの一つまたは複数の用量（またはその任意の組み合わせ）を患者に投与することができる。（患者がＨＥＲ２抗体の約２回から約２０回、例えば約６回の投与を受けるように）間欠的、例えば毎週または３週間毎に当該用量を投与することができる。初回の高いローディング用量の後で、１回または複数回の低用量を投与することができる。一態様では、ＨＥＲ２抗体を約８４０mgのローディング用量として投与し、その後約４２０mgを約３週間毎に投与する。別の態様では、約３週間毎に投与される約１０５０mgの用量として、ＨＥＲ２抗体を投与する。
他の治療剤をＨＥＲ２抗体と組み合わせることができる。そのような組み合わせ投与には、別々の製剤または単一の薬学的製剤を使用した同時投与または併行投与、およびいずれかの順序の連続投与があり、ここで、好ましくは両方の（または全ての）活性薬剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮する期間が存在する。このように、ＨＥＲ２抗体の投与前または投与後にその他の治療剤を投与することができる。本態様では、その他の治療剤の少なくとも１回の投与と、ＨＥＲ２抗体の少なくとも１回の投与との間のタイミングは、好ましくは約１か月以下であり、最も好ましくは約２週間以下である。または、他の治療剤およびＨＥＲ２抗体は、単一の製剤または別々の製剤の形で患者に同時投与される。
ＨＥＲ２抗体と組み合わせることができるその他の治療剤の例には、代謝拮抗剤、例えばゲムシタビンなどの化学療法剤；第２の異なるＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブなどの成長阻害性ＨＥＲ２抗体、またはＨＥＲ２過剰発現細胞のアポトーシスを誘導する、７Ｃ２、７Ｆ３、もしくはそのヒト化変異体などのＨＥＲ２抗体）；ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４などの別の腫瘍関連抗原に対する第２抗体；抗ホルモン化合物、例えばタモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物、またはアロマターゼ阻害剤；（治療に関連する任意の心筋機能不全を予防または低減するための）心臓保護剤；サイトカイン；ＥＧＦＲターゲット薬（TARCEVA（登録商標）、IRESSA（登録商標）、またはセツキシマブなど）；抗血管形成剤(特にAVASTIN（商標）の商標でGenentechによって販売されているベバシズマブ)；チロシンキナーゼ阻害剤；ＣＯＸ阻害剤（例えばＣＯＸ−１阻害剤またはＣＯＸ−２阻害剤）；非ステロイド系抗炎症薬であるセレコキシブ（CELEBREX(登録商標)）；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、Johnson and Johnsonから入手可能なチピファルニブ（Tipifarnib）／ZARNESTRA(登録商標)Ｒ１１５７７７、またはSchering-Ploughから入手可能なロナファルニブ(Lonafarnib)ＳＣＨ６６３３６）；オレゴボマブ（Oregovomab）（ＭｏＡｂ Ｂ４３．１３）などの、ガン胎児タンパク質ＣＡ１２５と結合する抗体；ＨＥＲ２ワクチン（PharmexiaからのHER2 AutoVacワクチン、またはDendreonからのＡＰＣ８０２４タンパク質ワクチン、またはGSK/CorixaからのＨＥＲ２ペプチドワクチンなど）；別のＨＥＲターゲティング療法（例えば、トラスツズマブ、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ＣＩ１０３３、ＧＷ２０１６など）；Ｒａｆおよび／またはｒａｓ阻害剤（例えばＷＯ２００３／８６４６７参照）；ドキシル；トペテカン（Topetecan）；タキサン；ＧＷ５７２０１６；ＴＬＫ２８６；ＥＭＤ−７２００；セロトニン拮抗薬、ステロイド、またはベンゾジアゼピンなどの、悪心を処置する薬；皮疹を予防もしくは処置する薬、または局所もしくは経口抗生物質を含めた標準的なざ瘡治療法；アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン、またはメペリジンなどの解熱薬；造血成長因子などのうち任意の一つまたは複数が含まれる。
上記で同時投与された薬剤のうち任意のものについての適切な投薬量は、現在使用されている投薬量であり、その薬剤およびＨＥＲ２抗体の組み合わせ作用（相乗作用）が原因で減量されることができる。ＨＥＲ２抗体組成物およびその他の治療剤の組み合わせを用いた処置は、患者に相乗的な、または相加的よりも大きい治療上の利益を生じることができる。
化学療法剤が投与される場合、その化学療法剤はそれについて公知の投薬量で通常投与されるか、または薬物の組み合わせ作用もしくはその化学療法剤の投与に原因があるとされる負の副作用が原因で場合により減量される。当該化学療法剤についての調製および投薬スケジュールは、製造業者の説明書に従って、または当業者により経験的に決定されたとおりに使用することができる。当該化学療法についての調製および投薬スケジュールは、Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。
上記の治療方式以外に、ガン細胞の外科的除去および／または放射線療法に患者を供することができる。
ＶＩＩ． 材料の寄託
以下のハイブリドーマ細胞系は、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA（ＡＴＣＣ）に寄託された:
抗体の名称 ＡＴＣＣ番号 寄託日
７Ｃ２ ＡＴＣＣ ＨＢ−１２２１５ １９９６年１０月１７日
７Ｆ３ ＡＴＣＣ ＨＢ−１２２１６ １９９６年１０月１７日
４Ｄ５ ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４６３ １９９０年５月２４日
２Ｃ４ ＡＴＣＣ ＨＢ−１２６９７ １９９９年４月８日
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的な実施例によって例示される。明細書における全ての引用の開示は、参照により特に本明細書に組み入れられる。
実施例
パーツズマブ組成物の特徴づけ
パーツズマブは、ヒトＩｇＧ１（□）フレームワークに基づいて作成された組換えヒト化モノクローナル抗体である。これは、二つの重鎖（４４８残基）および二つの軽鎖（２１４残基）を含む。この二つの重鎖は、二つの鎖間ジスルフィドにより結合し、各軽鎖は一つの鎖間ジスルフィドを介して重鎖に付着している。二つの重鎖のＡｓｎ−２９９にパーツズマブＦｃ部でのＮ−結合グリコシル化部位が存在する。パーツズマブは、軽鎖のエピトープ結合部(アミノ酸１２個が異なる)および重鎖のエピトープ結合部(アミノ酸３０個が異なる)でＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）と相違する。これらの相違の結果として、パーツズマブはレセプターＨＥＲ２上の完全に異なるエピトープに結合する。ヒト上皮細胞上のレセプターＨＥＲ２に対するパーツズマブの結合は、ＨＥＲ２がレセプターＨＥＲファミリーの他のメンバーと複合体を形成するのを阻止する（Agus et al, Cancer Cell 2:127-137 (2002)）。複合体形成を遮断することにより、パーツズマブは、複合体に対するリガンド（例えば、ＥＧＦおよびヘレグリン）の成長刺激作用を阻止する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験から、パーツズマブおよびパーツズマブ−Ｆａｂの両方が、ＭＣＦ７細胞に対するヘレグリン（ＨＲＧ）の結合を阻害すること、ならびにＨＲＧに刺激されるＨＥＲ２−ＨＥＲ３複合体リン酸化がパーツズマブおよびパーツズマブ−Ｆａｂの両方により阻害されうることが実証された（Agus et al., Cancer Cell 2: 127-137 (2002)）。さらに、パーツズマブおよびパーツズマブのポリエチレングリコール誘導体化Ｆａｂによる腫瘍成長のｉｎ ｖｉｖｏ阻害は、マウス前立腺ガン異種移植モデルで互角であることが見い出された（Agus et al., Cancer Cell 2:127-137 (2002)）。これらのデータは、抗体のＦｃ部が腫瘍の成長阻害に必要なく、さらに、二価性およびＦｃ介在性エフェクター機能はｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学的活性に必要とされないことを示唆している。
組換え操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって発現された以下の試料を分析した：
試料 製造工程 規模
参照材料 フェーズＩ ４００L
ロットＳ９８０２Ａ フェーズＩＩ ２０００L
プロセス開発用材料 フェーズＩＩＩを含む
（第１、２、３、５および６回運転） 臨床開発プログラム ４００L
注：２日目に１００Lの種培養が汚染したことが原因で第４回運転の４００Lは利用できなかった。
Ｎ−末端配列分析
標準的なエドマン分解法を用いてＮ−末端配列分析を行い、参照材料、ロットＳ９８０２Ａ、および４００L規模の第１回運転プロセス開発用材料について、それぞれ表2A、表2B、および表2Cに結果を示す。軽鎖および重鎖の予想されたＮ−末端配列（図３Ａおよび図３Ｂ）が全ての試料で観察された。予想されたＮ−末端配列に先行する三つの追加のアミノ酸Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ（ＶＨＳ）を有する軽鎖に対応する追加の少量配列も５個の試料で検出された。このＶＨＳ配列は、分泌されるときにタンパク質から除去されるシグナルペプチドの部分である。このシグナルペプチドのオルタナティブ切断の結果として、パーツズマブのＮ−末端でのＶＨＳ伸長が生じる。フェーズＩ／ＩＩ臨床試験のために以前に産生された材料では、パーツズマブ分子の約２%〜４%は、二つの軽鎖のうち一つがＮ−末端ＶＨＳ配列を含んでいる。 しかし、これらの材料中の、Ｎ−末端ＶＨＳ配列を有する軽鎖のレベル（各軽鎖の１%〜２%）は、Ｎ−末端配列分析で検出するには低すぎた。５個のプロセス開発用試料では、この軽鎖種のレベルは約４%〜５%で、Ｎ−末端分析の検出限界をわずかに上回る。５個のプロセス開発用試料についてのＮ−末端配列決定データは、陽イオン交換クロマトグラフィーの結果と一致し、これは、この５個のプロセス開発用試料が、ＶＨＳ伸長を含む一つの軽鎖を有するパーツズマブ分子を約９%有することを示している（下記陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＣ）参照)。
他の配列は検出されず（検出限界は３%と推定される）、これは、内部切断部位が存在しないことを示している。
質量分析
パーツズマブ試料をジチオスレイトールで還元し、ＰＥ ＳＣＩＥＸ ＡＰＩ３０００（商標）質量分析計を用いたエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって分析して、重鎖および軽鎖の質量が予想される配列と一致することを確認した。参照材料、ロットＳ９８０２Ａ、および４００Ｌ規模の第１回運転プロセス開発用材料についての再構成された質量スペクトルを図８Ａおよび図８Ｂに比較する。観察された軽鎖質量（２３５２４Da）は、三つの材料全てについて配列から予測された値と一致する。２３６８５Daおよび２３８４７Da（軽鎖の質量よりもそれぞれ１６１および３２３Da高い）に二つの追加の副ピークが観察された。最初のピーク（２３６８５Da）は軽鎖のグリコシル化に起因する思われる。二番目のピーク（２３８４７Da）は４００Ｌ規模のプロセス開発用材料でさらにはっきりと観察される。このピークは、Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ伸長を有する軽鎖（上記Ｎ−末端配列分析および陽イオン交換クロマトグラフィー分析参照）または二つのグリコシル化部位を有する軽鎖におそらく由来する。
異なる形態の重鎖に対応するいくつかの質量が観察された。重鎖の主要な種は、Ｇ０オリゴ糖構造を有する残基１〜４４８からなる重鎖に起因する質量５０５３２Daを有する。他に観察された形態には、Ｇ１またはＧ２オリゴ糖構造を有する残基１〜４４８を含む重鎖がある（図８Ｂ）。
陽イオン交換クロマトグラフィーおよびキャピラリーゾーン電気泳動による電荷の不均一性
陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＣ）を使用して、パーツズマブにおける電荷の不均一性を評価した。カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）で処置する前後に、ＤＩＯＮＥＸ（商標）陽イオン交換カラム（PROPAC WCX-10(商標)、４mm×２５０mm）で、ｐＨ６．０の２０mM ＭＥＳバッファーおよび緩いＮａＣｌ勾配を用いて試料を分析した。クロマトグラムの比較を図９Ａ（ＣＰＢ処理前）および図９Ｂ（ＣＰＢ処理後）に示す。三つ全てのロットで多数のピークが観察された。キャラクタリゼーション目的で、クロマトグラムを６つの領域に分割する（図９Ａおよび９ＢにＡからＦと表示）。これら六つの領域についての相対ピーク面積を表３Ａおよび表３Ｂに挙げる。（領域Ａにおける）酸性変異体の量は、参照材料よりもロットＳ９８０２Ａおよび４００L規模のプロセス開発用材料の方が高い。領域ＣおよびＤにおける塩基性変異体は、重鎖の一方（領域Ｃ）または両方（領域Ｄ）にＣ末端リシン残基を有するパーツズマブを含むことが示されたが、参照材料と比較したとき、ロットＳ９８０２Ａおよび４００L規模プロセス開発用材料で低減している。ＣＰＢ処理後に一つまたは二つの重鎖Ｃ末端リシンを有するパーツズマブ分子は、領域Ｂの主要種に変換され、領域ＣおよびＤではもはや検出されなかった。同一性をまだ決定していない小ピークだけが、ＣＰＢ処理後に領域Ｃに残存した。一つの軽鎖がＶＨＳ伸長を含むパーツズマブ分子に起因することが示された領域Ｅの塩基性変異体は、参照材料およびロットＳ９８０２Ａ（４%）よりも４００L規模のプロセス開発用材料で高い（９%〜１０%）。領域Ｆの塩基性変異体は、一つの軽鎖にＮ末端ＶＨＳ伸長および一つの重鎖にＣ末端リシンを含むパーツズマブであることが示された。高レベルの酸性変異体および塩基性変異体の結果として、領域Ｂの主要種は、参照材料またはロットＳ９８０２Ａよりも４００L規模プロセス開発用材料の方が低い。
陽イオン交換クロマトグラフィー以外に、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を採用して、パーツズマブにおける電荷の不均一性を調べた。ＣＺＥのピークを同定した。個別に収集されたＣＥＣ画分をＣＺＥで分析することによって、ＣＺＥのピークをＣＥＣ分析で観察されたピークと関連づけた。ＣＺＥおよびＣＥＣにより決定された電荷変異体の相対量は、分析した全ての材料で互角である。
異なるＣＥＣ画分中のパーツズマブの電荷変異体の生物学的活性は、細胞性抗増殖アッセイに基づき同一と思われる。このように、パーツズマブにおける電荷の不均一性がその効力に影響するとは予想されない。４００Lプロセス開発用材料の生物学的活性は、参照材料およびロットＳ９８０２Ａの生物学的活性と互角である（生物学的活性および表４参照）。
サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、パーツズマブでの凝集度を決定した。ＴＯＳＯＨＡＡＳ ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（商標）カラム（７．８mm×３００mm）で試料を分析した。紫外線（ＵＶ）吸収を２８０nmで監視して均一濃度溶出を使用した（１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．８）、０．５ｍL/分）。参照材料、ロットＳ９８０２Ａ、および４００L規模の第１回運転プロセス開発用材料についてのＳＥＣデータを図１０に示す。単量体は、一貫してピーク面積が９９．６%よりも大きく、凝集体は分析した全ての材料で０．３%未満である。
ＣＥ−ＳＤＳ−ＬＩＦ分析
レーザー誘起蛍光を用いたキャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム分析（ＣＥ−ＳＤＳ−ＬＩＦ）も使用して、パーツズマブ試料の純度を評価した。還元を加えたときおよび加えないときの参照材料、ロットＳ９８０２Ａ、および４００L規模の第１回運転プロセス開発用材料で類似の電気泳動図が観察された（図１１Ａおよび１１Ｂ）。還元された材料の電気泳動図から決定された非グリコシル化重鎖のレベルは、（総重鎖に対して）２．６%から４．３%の間である。ＣＥ−ＳＤＳ−ＬＩＦ分析によって決定されたこれらの試料（非還元）中の凝集体の量は、ＳＥＣの結果と一致する。これらの試料のＣＥ−ＳＤＳ−ＬＩＦ分析で、重大な産物のフラグメントの証拠もその他の不純物の証拠も見いだされなかった。ＣＥ−ＳＤＳ−ＬＩＦのデータは、４００L規模のプロセス開発用材料の不純物プロファイルが参照材料およびロットＳ９８０２Ａのプロファイルと類似していることを示唆している。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析（SYPRORUBY(商標)で染色された４%〜２０%Ｔゲル(Daiichi Pure Chemicals Co., Tokyo, Japan)）を行って、参照材料、ロットＳ９８０２Ａ、および４００L規模のプロセス開発用材料の還元試料およびインタクトな試料を比較した。４００L規模のプロセス開発用材料における新たなバンドは観察されず、これは、４００L規模のプロセス開発用材料における全体的な不純物プロファイルが参照材料およびロットＳ９８０２Ａと類似していることをもう一度示している。
トリプシンペプチド分析およびＬｙｓ−Ｃペプチドマップ分析
トリプシンペプチド分析およびＬｙｓ−Ｃペプチド分析を行って、参照材料、ロットＳ９８０２Ａ、および４００L規模のプロセス開発用材料中のパーツズマブの一次構造を調査および比較した。還元してＳ−カルボキシメチル化した一定分量のパーツズマブをトリプシンで消化して、還元して亜硫酸分解した（sulfitolyzed）一定分量のパーツズマブをエンドプロテイナーゼであるＬｙｓ−Ｃで消化した。ＶＹＤＡＣ Ｃ−１８（商標）カラム（４．６mm×２５０mm）を用いて０%〜６０%アセトニトリル勾配をかけた逆相クロマトグラフィーによってトリプシン消化物を分離した。２１４nmで吸光度を監視して、ペプチドの質量をＴＨＥＲＭＯ ＦＩＮＮＩＧＡＮ ＬＣＱ（商標）を用いたＥＳＩ−ＭＳによって決定した。Ｌｙｓ−Ｃ消化物をＺＯＲＢＡＸ Ｃ−８（商標）カラム （４．６mm×１５０mm）を用いて０%〜１００%イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）勾配をかけた逆相クロマトグラフィーによって分離した。２１４nmで吸光度を監視して、ペプチドの質量をＴＨＥＲＭＯ ＦＩＮＮＩＧＡＮ ＬＣＱ（商標）を用いたＥＳＩ−ＭＳによって決定した。
参照材料、ロットＳ９８０２Ａ、および４００L規模の第１回運転プロセス開発用材料についてのトリプシンペプチドマップおよびＬｙｓ−Ｃペプチドマップを、それぞれ図１２Ａおよび図１２Ｂで比較する。三つの材料全てについてのトリプシンマップおよびＬｙｓ−Ｃマップの両方は、本質的に同一である。大部分のペプチドをＬＣ−ＭＳによって同定し、大部分のペプチドは予想されるペプチド質量にマッチした。観察されたトリプシンペプチドから、重鎖残基の９７．１%（４３６／４４９）および軽鎖残基の９５．８%（２０５／２１４）が同定された。Ｌｙｓ−Ｃマップでは、重鎖および軽鎖についての配列のカバー率は、それぞれ９８．４%（４４２／４４９）および７０．６%（１５１／２１４）である。ＶＨＳ伸長を含むＮ−末端ペプチドは、トリプシンペプチドマップ中のＶＨＳ伸長を有さないＮ−末端ペプチドと同時溶出することがＬＣ−ＭＳから見い出された。ペプチドマップにおいて、重大でない量の脱アミド化ペプチドまたは酸化ペプチドが検出された。
生物学的活性
パーツズマブがヒト乳ガン細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩの増殖を阻害する能力を測定することによって、パーツズマブの生物学的活性を決定した。４００L規模のプロセス開発用試料５個について得られた比活性率（表４）は、９０%〜９６%の範囲であり、参照材料（定義により１００%）およびロットＳ９８０２Ａ（分析証明書に報告された９８%）についての活性と類似している。予想通り、電荷の不均一性はパーツズマブの効力に影響しない。全ての材料は互角の抗増殖活性を有する。
Ｎ−結合オリゴ糖の分析
重鎖における質量不均一性の一部は、Ａｓｎ−２９９でのグリコシル化に起因する。オリゴ糖の不均一性を評価するために、パーツズマブ試料をＰＮＧａｓｅ Ｆで一晩消化してＮ−結合グリカンを放出させた。次に、放出されたオリゴ糖を、フルオロホアである９−アミノ−１，４，６−トリスルホナート（ＡＰＴＳ）で誘導体化した。個別のグリカン形態をキャピラリー電気泳動（ＣＥ）（Beckmanコーティングキャピラリーを備えるBeckman P/ACE 5500 CE）によって分離して、蛍光検出を用いて定量した。
参照材料、ロットＳ９８０２Ａ、および４００Ｌ規模の第１回運転プロセス開発用材料からの放出された中性オリゴ糖のＣＥ分析による電気泳動図を図１３に示す。参照のために、ヒトＩｇＧ１抗体に通例みられるオリゴ糖構造および使用した命名法の概要を図１４に含める。全ての材料におけるオリゴ糖の相対量を表５にまとめる。
Ｇ０およびＧ１構造を有するオリゴ糖が、主要なグリカンである。他のオリゴ糖構造に起因するピークも電気泳動図で観察された。これらの構造には、Ｇ２、Ｇ０−Ｆ、Ｇ−１、Ｍａｎ５、およびＧ１−１（またはＭａｎ６）グリコフォームがある。さらに、アイソフォームが分離する。観察されたグリカンの分布は、全ての材料で同様である（表５）。しかし、参照材料および４００L規模のプロセス開発用材料と比較して、フェーズＩＩ材料（ロットＳ９８０２Ａ）は、Ｇ０構造をもつ少量のグリカンおよびＧ１構造をもつそれよりも多量のグリカンを有する。グリカン分布の相違にかかわらず、全ての材料は類似した生物学的活性を有する。さらに、グリカンの不均一性の変化はＦｃＲｎ（表６）またはＦｃガンマレセプター（表７）に対するパーツズマブの結合親和性に重大な影響を有さなかった（ＦｃＲｎレセプターおよびＦｃガンマレセプター結合アッセイ参照）。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）によって、放出された中性オリゴ糖も分析した。参照材料、ロットＳ９８０２Ａ、および４００L規模の第１回運転プロセス開発用材料からの放出された中性オリゴ糖についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを図１５に比較する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析から得られたグリカン構造および分布はＣＥの結果と一致する。
キャピラリー等電点電気泳動分析
キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）を使用して、参照材料、ロットＳ９８０２Ａ、および４００L規模の第１回運転プロセス開発用材料におけるパーツズマブのｐＩを決定した。これらの材料中の異なる荷電種の相対量はＣＥＣ分析で観察されたものと幾分異なったが、主要種のｐＩは全ての試料で８．７であることが見い出された。
遊離スルフヒドリル分析
エルマン分析を用いて、遊離チオール（不対システイン残基）について参照材料、ロットＳ９８０２Ａ、および４００L規模のプロセス開発用材料を試験した。遊離チオールレベルは、試験した全ての材料で検出限界（タンパク質１モルあたり遊離チオール約０．０５モル）を下回った。
ＦｃＲｎレセプター結合アッセイ
参照材料、ロットＳ９８０２Ａ、および４００L規模のプロセス開発用材料からのパーツズマブのＦｃＲｎレセプター結合親和性を、Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)に記載されたＥＬＩＳＡアッセイに類似したアッセイを用いて比較した。本アッセイにおいて参照材料を標準として使用した。
ＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）９６ウェルマイクロウェルプレート（Nunc, Roskilde, Denmark）を、まずＮＥＵＴＲＡＶＡＤＩＮ（商標）（Pierce, Rockford, IL）を用いて４℃で一晩コーティングした。次に、このプレートに２μｇ／ｍＬのビオチン化ヒトＦｃＲｎを加えて１時間インキュベーションした。パーツズマブ試料の２倍希釈系列１１個（３．１〜３２００ng/mL）をプレートに加えて、２時間インキュベーションした。ペルオキシダーゼでラベルしたヤギＦ（ａｂ’）２である抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）を添加して、基質として３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD）を使用することによって、結合したパーツズマブを検出した。ＴＩＴＥＲＴＥＫ ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ（商標）（ＭＣＣ／３４０）リーダー（ICN, Costa Mesa, CA）で４５０nmの吸光度を読み取った。パーツズマブのＦｃＲｎ結合親和性もまた、ＨＥＲ２−ＥＣＤをプレートにコーティングした第２のＥＬＩＳＡ形式で評価した。系列希釈したパーツズマブ試料をプレートに加え、２時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、２mg/mLビオチン化ヒトＦｃＲｎを加えた。ストレプトアビジン−ＨＲＰを使用して基質としてＴＭＢを用いて、結合したＦｃＲｎを検出した。
標準（すなわち参照材料）の滴定曲線の中点の吸光度（ｍｉｄ−ＯＤ）およびこのｍｉｄ−ＯＤでの標準および試料の対応する濃度を決定した。標準のｍｉｄ−ＯＤ濃度を試料のｍｉｄ−ＯＤ濃度で割ることによって、相対結合親和性を計算した。
両方のＥＬＩＳＡ形式で得られた相対ＦｃＲｎ結合親和性を表６に挙げる。二つの異なるＥＬＩＳＡ形式からのデータは互角である。異なるパーツズマブ材料におけるグリカンの分布は同一ではないが、これらの材料のＦｃＲｎ結合親和性は互角であり、これはパーツズマブにおけるグリカンの不均一性がそれのＦｃＲｎ結合親和性に明らかな作用を有さないことを示している。
Ｆｃガンマレセプター結合アッセイ
ヒトＦｃガンマレセプター（ＦｃγＲ）に対するパーツズマブの結合を、Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)によるＥＬＩＳＡアッセイを修飾したものによって評価した。
単量体ＩｇＧは、高親和性ＦｃγＲＩａ（ＣＤ６４）に結合できる；しかし、低親和性レセプター（ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２Ｂ）、およびＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６））は重大な結合に多量体ＩｇＧを必要とする。したがって、低親和性レセプター結合アッセイに関して、アッセイの前に各試料（２００mg/mL）をヤギ抗ヒトカッパ鎖（４００mg/mL；ICN Biomedical, Irvine, CA）と混合することによって、パーツズマブ多量体を形成させた。レセプターアルファ鎖の細胞外ドメインとＧｌｙ／Ｈｉｓ６／ＧＳＴ（グリシン／ヒスチジン６個／グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）との組換え融合タンパク質としてヒトＦｃγＲを発現させた。抗ＧＳＴでコーティングされ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングされたアッセイプレートを使用してＦｃγＲを捕捉した。レセプター（０．２５mg/mL濃度１００mL）をプレートに加え、１時間インキュベーションした。パーツズマブ試料の系列希釈物（１００mL）をＦｃγＲＩａについては単量体として、低親和性ＦｃγＲについては多量体として加え、プレートを２時間インキュベーションした。ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲーションしたヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２（Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA）を加えることによって、および基質としてＴＭＢを使用することによって、結合したパーツズマブを検出した。４変数モデルを用いた非線形回帰分析（KaleidaGraph, Synergy Software, Reading, PA）によって、ＦｃγＲに対するパーツズマブの結合についてのＥＣ５０値を決定した。ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（ロットＣ２Ｂ８１２９８−２）を対照抗体として使用した。
ＦｃγＲに対するパーツズマブの結合についてのＥＣ５０値を表７にまとめる。結果は、参照材料、ロットＳ９８０２Ａ、および４００L規模のプロセス開発用材料がＦｃγＲに関して互角の結合親和性を有することを示している。これらの結果は、パーツズマブにおけるグリカンの不均一性がパーツズマブのＦｃγＲ結合親和性に有意な作用を有さないことを示唆している。
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Claims (23)

  1. ＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する主要種ＨＥＲ２抗体と、アミノ末端リーダー伸長を含むそのアミノ酸配列変異体とを含む組成物。
  2. アミノ末端リーダー伸長が抗体変異体の軽鎖に存在する、請求項１記載の組成物。
  3. アミノ末端リーダー伸長が抗体変異体の一つまたは二つの軽鎖に存在する、請求項２記載の組成物。
  4. 主要種ＨＥＲ２抗体および抗体変異体が両方共にインタクトな抗体である、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
  5. 主要種ＨＥＲ２抗体が、それぞれ配列番号３および４の可変軽鎖アミノ酸配列および可変重鎖アミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
  6. 主要種ＨＥＲ２抗体が、それぞれ配列番号１５および１６の軽鎖アミノ酸配列および重鎖アミノ酸配列を含む、請求項５記載の組成物。
  7. 組成物中の抗体分子の約２０%以下がアミノ末端リーダー伸長を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
  8. 組成物中の抗体分子の約１%から約１５%がアミノ末端リーダー伸長を含む、請求項７記載の組成物。
  9. 陽イオン交換分析により定量された、組成物中の抗体分子の５%から約１５%がアミノ末端リーダー伸長を含む、請求項８記載の組成物。
  10. アミノ末端リーダー伸長がＶＨＳ−を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
  11. アミノ末端リーダー伸長がＶＨＳ−からなる、請求項１０記載の方法。
  12. 主要種ＨＥＲ２抗体の第２アミノ酸配列変異体をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の組成物。
  13. 第２抗体変異体が、一方または両方の重鎖にＣ末端リシン残基を含む該抗体、脱アミド化抗体変異体、および一つまたは複数の酸化されたメチオニン残基を有する抗体からなる群より選択される、請求項１２記載の組成物。
  14. 主要種抗体のグリコシル化変異体をさらに含む、請求項１〜９および１２〜１３のいずれか１項記載の組成物。
  15. グリコシル化変異体が、Ｆｃ部に付着したＧ１またはＧ２オリゴ糖構造を含む抗体、軽鎖に付着した糖質部分を含む抗体、非グリコシル化重鎖を含む抗体、およびＦｃ部に付着したシアリダート化オリゴ糖構造を有する抗体からなる群より選択される、請求項１４記載の組成物。
  16. 主要種抗体がＨＥＲ２のドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの間の接合部に結合する、請求項１〜９および１２〜１５のいずれか１項記載の組成物。
  17. 薬学的に許容される担体中に請求項１記載の組成物を含む薬学的製剤。
  18. 無菌である、請求項１７記載の薬学的製剤。
  19. それぞれ配列番号３および４の可変軽鎖配列および可変重鎖配列を含む主要種ＨＥＲ２抗体と、一つまたは二つの可変軽鎖ドメインに付着したＶＨＳ−アミノ末端リーダー伸長を含む、主要種抗体のアミノ酸配列変異体とを含む組成物であって、該組成物中の抗体分子の約１%から約２０%がＶＨＳ−アミノ末端リーダー伸長を含む組成物。
  20. 配列番号２３のアミノ酸配列、またはその脱アミド化変異体および／もしくは酸化変異体を含むポリペプチド。
  21. （ａ）請求項２０記載のポリペプチドを含む軽鎖と、（ｂ）配列番号１６、配列番号２４、ならびに配列番号１６または配列番号２４の脱アミド化変異体および／もしくは酸化変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖とを含む抗体。
  22. 薬学的に許容される担体中に請求項２１記載の抗体を含む薬学的製剤。
  23. 患者におけるＨＥＲ２発現ガンを処置する方法であって、該ガンを処置するのに有効な量で請求項１７記載の薬学的製剤を該患者に投与することを含む方法。
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