KR102535900B1 - 항 trop2 항체-약물 컨쥬게이트 - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은, 항 TROP2 항체와 항종양성 약물을 링커 구조 부분을 통해서 결합시킨, 항종양약으로서 유용한 항체-약물 컨쥬게이트에 관한 것이다.
암 세포 표면에 발현하고, 또한 세포에 내재화할 수 있는 항원에 결합하는 항체에, 세포 독성을 갖는 약물을 결합시킨 항체-약물 컨쥬게이트 (Antibody-Drug Conjugate;ADC) 는, 암 세포에 선택적으로 약물을 송달할 수 있음으로써, 암 세포내에 약물을 축적시키고, 암 세포를 사멸시키는 것을 기대할 수 있다 (비특허문헌 1 ∼ 3 참조). ADC 로서 예를 들어, 항 CD33 항체에 칼리키아마이신을 결합시킨 Mylotarg (등록상표;겜투주맙 오조가마이신) 가 급성 골수성 백혈병의 치료약으로서 인가되어 있다. 또, 항 CD30 항체에 오리스타틴 E 를 결합시킨 Adcetris (등록상표;브렌툭시맙 베도틴) 가 호지킨 림프종과 미분화 대세포 림프종의 치료약으로서 최근 인가되었다 (비특허문헌 4 참조). 지금까지 인가된 ADC 에 함유되는 약물은, DNA 또는 튜불린을 표적으로 하고 있다.
항종양성의 저분자 화합물로서 토포이소메라제 I 를 저해하여 항종양 작용을 발현하는 화합물인 캄프토테신 유도체가 알려져 있다. 그 중에서 하기 식
[화학식 1]
로 나타내는 항종양성 화합물 (엑사테칸, 화학명:(1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리디노[1,2-b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온) 은, 수용성의 캄프토테신 유도체이다 (특허문헌 1, 2). 이 화합물은, 현재 임상에서 사용되고 있는 이리노테칸과는 달리, 항종양 효과의 발현에는 효소에 의한 활성화를 필요로 하지 않는다. 또, 이리노테칸의 약효 본체인 SN-38 이나, 동일하게 임상에서 사용되고 있는 토포테칸보다 토포이소메라제 I 저해 활성이 강하고, in vitro 에서 각종 암 세포에 대해, 보다 강한 살세포 활성을 갖고 있다. 특히 P-glycoprotein 의 발현에 의해 SN-38 등에 내성을 나타내는 암 세포에 대해서도 효과를 나타내었다. 또, 마우스의 인간 종양 피하 이식 모델에서도 강한 항종양 효과를 나타내어, 임상 시험이 실시되었기는 하지만 출시에는 이르지 않았다 (비특허문헌 5 ∼ 10 참조). 엑사테칸이 ADC 로서 유효하게 작용할지에 대해서는 분명하지 않았다.
DE-310 은, 생분해성의 카르복시메틸덱스트란폴리알코올 폴리머에 엑사테칸을, GGFG 펩티드 스페이서를 통해서 결합시킨 복합체이다 (특허문헌 3). 엑사테칸을 고분자 프로드러그화함으로써, 높은 혈중 체류성을 유지시키고, 또한 종양 신생 혈관의 투과성의 항진과 종양 조직 체류성을 이용하여, 수동적으로 종양 부위로의 지향성을 높인 것이다. DE-310 은, 효소에 의한 펩티드 스페이서의 절단에 의해, 활성 본체인 엑사테칸, 및 글리신이 아미노기에 결합하고 있는 엑사테칸이 지속적으로 유리되고, 그 결과 약물 동태가 개선된다. 비임상 시험에 있어서의 각종 종양의 평가 모델에 있어서, DE-310 은, 여기에 포함되는 엑사테칸의 총량이 엑사테칸 단제 (單劑) 의 투여시보다 감소하고 있음에도 불구하고, 단제의 투여시보다 보다 높은 유효성을 나타내었다. DE-310 에 관해서는 임상 시험이 실시되어 유효예도 확인되어 있고, 활성 본체가 정상 조직보다 종양에 집적하는 것이 확인되었다는 보고가 있는 한편, 인간에 있어서의 종양으로의 DE-310 및 활성 본체의 집적은 정상 조직으로의 집적과 큰 차 없이, 인간에서는 수동적인 타게팅은 보이지 않았다는 보고도 있다 (비특허문헌 11 ∼ 14 참조). 결과적으로 DE-310 도 출시에는 이르지 않아, 엑사테칸이 이와 같은 타게팅을 지향한 약물로서 유효하게 기능할지에 대해서는 분명하지 않았다.
DE-310 의 관련 화합물로서, -NH-(CH2)4-C(=O)- 로 나타내는 구조 부분을 -GGFG- 스페이서와 엑사테칸의 사이에 삽입하고, -GGFG-NH-(CH2)4-C(=O)- 를 스페이서 구조로 하는 복합체도 알려져 있지만 (특허문헌 4), 동 (同) 복합체의 항종양 효과에 대해서는 전혀 알려져 있지 않았다.
인간 TROP2 (TACSTD2:tumor-associated calcium signal transducer 2, GA733-1, EGP-1, M1S1;이하, hTROP2 라고 표기한다) 는, 323 아미노산 잔기로 이루어지는 1 회 막 관통형의 1 형 세포막 단백질이다. 이전부터, 인간 영양막 세포 (trophoblasts) 와 암 세포에 공통되는, 면역 저항성에 관여하는 세포막 단백질의 존재 (비특허문헌 15) 가 시사되어 있었지만, 인간 융모암 세포주의 세포막 단백질에 대한 모노클로날 항체 (162-25.3, 162-46.2) 에 의해 인식되는 항원 분자가 특정되어, 인간 영양막 세포에 발현하는 분자의 하나로서 TROP2 라고 명명되었다 (비특허문헌 16). 후에 동일한 분자가 다른 연구자에 의해 발견되어, 위암 세포주를 면역하여 얻어진 마우스 모노클로날 항체 GA733 에 의해 인식되는 종양 항원 GA733-1 (비특허문헌 17), 비소세포 폐암 세포 면역에 의해 얻어진 마우스 모노클로날 항체 RS7-3G11 에 의해 인식되는 상피 당 단백질 (EGP-1;비특허문헌 18) 이라고도 불렸지만, 1995년에 TROP2 유전자가 클로닝되어, 이들이 동일한 분자인 것이 확인되었다 (비특허문헌 19). hTROP2 의 DNA 서열 및 아미노산 서열은 공적 데이터베이스 상에 공개되어 있으며, 예를 들어 NM_002353, NP_002344 (NCBI) 등의 액세션 번호에 의해 참조 가능하다.
hTROP2 유전자는 약 50 % 의 상동성을 갖는 인간 Trop-1 (EpCAM, EGP-2, TACSTD1) 과 함께 TACSTD 유전자 패밀리를 구성하고 있다 (비특허문헌 21). hTROP2 단백질은, N 말단 26 아미노산 잔기로 이루어지는 시그널 서열, 248 아미노산 잔기로 이루어지는 세포외 도메인, 23 아미노산 잔기로 이루어지는 세포막 관통 도메인, 26 아미노산 잔기로 이루어지는 세포내 도메인으로 구성되어 있다. 세포외 도메인에는 4 개의 N 결합형 당사슬 부가 부위가 있고, 외관상의 분자량은 이론 계산값 35 킬로달톤으로부터 10 킬로달톤 전후 증가하는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 19).
지금까지 hTROP2 의 생리학적 리간드는 동정 (同定) 되어 있지 않아, 분자 기능은 분명하게 되어 있지 않지만, 종양 세포에 있어서 칼슘 시그널을 전달하는 것이 나타나고 (비특허문헌 20), 또 Ca2+ 의존성 키나아제인 프로테인 키나아제 C 에 의해 세포내 세린 303 잔기가 인산화되는 것 (비특허문헌 18) 이나, 세포내 도메인에 PIP2 결합 서열을 갖기 때문에, 종양 세포에 있어서의 시그널 전달 기능이 시사되어 있다 (비특허문헌 22).
임상 검체를 사용한 면역 조직 화학 해석에 의해, hTROP2 는 각종 상피 세포암종에 있어서 과잉 발현하고 있는 것, 또한, 정상 조직에 있어서는 몇 개의 조직의 상피 세포에서의 발현에 한정되며, 그 발현량도 종양 조직과 비교하여 낮은 것이 나타나 있다 (비특허문헌 23 ∼ 27). 또 hTrop2 의 발현은 대장암 (비특허문헌 23), 위암 (비특허문헌 24), 췌장암 (비특허문헌 25), 구강암 (비특허문헌 26), 글리오마 (비특허문헌 27) 에 있어서 예후 불량과 상관하는 것도 보고되어 있다.
또한 대장암 세포를 사용한 모델로부터, hTROP2 의 발현이 종양 세포의 족장 (足場) 비의존적 세포 증식 및 면역 부전 마우스에서의 종양 형성에 관여하고 있는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 28).
이와 같은 암과의 관련성을 시사하는 정보로부터, 지금까지 복수의 항 hTROP2 항체가 수립되어, 그 항종양 효과가 검토되고 있다. 이 중에는 컨쥬게이트화되어 있지 않은 항체 단독으로 누드 마우스 이종 이식 모델에 있어서의 항종양 활성을 나타내는 것 (특허문헌 5 ∼ 8) 외에, 항체와 항세포 약제의 ADC 로서 항종양 활성을 나타내는 것 (특허문헌 9 ∼ 12) 등이 개시되어 있다. 그러나, 그들의 활성 강도나 적용 범위는 아직 충분하지 않고, hTROP2 를 치료 표적으로 하는 미충족 의료 요구가 존재하고 있다.
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항체에 의한 종양의 치료에 있어서는, 항체가 항원을 인식하여 종양 세포에 결합해도 항종양 효과가 충분하지 않은 경우가 관찰되는 경우도 있어, 보다 효과가 높은 항종양 항체가 필요해지는 경우가 있다. 또, 항종양성의 저분자 화합물에 있어서는, 항종양 효과가 우수해도 부작용이나 독성면 등, 안전성 상의 문제를 갖는 경우가 많아, 안전성을 보다 높여 보다 우수한 치료 효과를 획득하는 것이 과제로 되어 있다. 즉, 본 발명은, 항종양 효과와 안전성면이 우수하고, 우수한 치료 효과를 갖는 항종양약을 획득하여 제공하는 것이 과제이다.
본 발명자들은, 항 TROP2 항체가 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 항체, 즉, 종양 세포를 인식할 수 있는 특성, 종양 세포에 결합할 수 있는 특성, 혹은 종양 세포에 내재화할 수 있는 특성 등을 구비한 항체이기 때문에, 항종양성 화합물인 엑사테칸을, 링커 구조 부분을 통해서 동 (同) 항체에 결합시킨 항체-약물 컨쥬게이트로 변환함으로써, 동 항체를 이용한 세포 장해성을 획득할 수 있는 것, 또한 항종양성 화합물을 종양 세포에 의해 확실하게 이동시켜 당해 화합물의 항종양 효과를 종양 세포에서 특이적으로 발휘시킬 수 있고, 따라서 항종양 효과의 확실한 발휘와 함께 항종양성 화합물의 투여량을 당해 화합물의 단체 투여시보다 감소시킬 수 있는 것, 나아가서는 이들에 의해 통상적으로 세포에 대한 항종양성 화합물의 영향을 완화시킬 수 있는 것, 즉 이들에 의해 보다 높은 안전성을 달성할 수 있는 것이 가능하다고 생각하였다.
이 때문에 본 발명자들은 특정한 구조의 링커를 창출하고, 이 링커를 통해서 항 TROP2 항체와 엑사테칸을 결합시킨 항체-약물 컨쥬게이트를 획득하는 것에 성공하여, 동 컨쥬게이트가 우수한 항종양 효과를 발휘하는 것을 알아내어 본 발명을 완성시켰던 것이다.
즉, 본원 발명은,
[1] 다음 식
[화학식 2]
로 나타내는 항종양성 화합물과 항 TROP2 항체를 다음 식:
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-
로 나타내는 구조의 링커를 통해서, 항 TROP2 항체의 힌지부에 존재하는 디술파이드 결합 부분에 있어서 형성시킨 티오에테르 결합에 의해 결합시킨 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트에 관한 것이다.
여기서, 항 TROP2 항체는 L1 의 말단에 있어서 결합하고, 항종양성 화합물은, 1 위치의 아미노기의 질소 원자를 결합 부위로 하여, -(CH2)n2-C(=O)- 부분의 카르보닐기에 결합한다.
식 중, n1 은, 0 내지 6 의 정수를 나타내고,
n2 는, 0 내지 5 의 정수를 나타내고,
L1 은, -(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)n3-C(=O)- 를 나타내고,
여기서, n3 은, 2 내지 8 의 정수를 나타내고,
L2 는, -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 또는 단결합을 나타내고,
여기서, n4 는, 1 내지 6 의 정수를 나타내고,
LP 는, 2 내지 7 개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 잔기를 나타내고,
La 는, -O- 또는 단결합을 나타내고,
-(숙신이미드-3-일-N)- 는 다음 식:
[화학식 3]
으로 나타내는 구조이며, 이것의 3 위치에서 항 TROP2 항체와 결합하고, 1 위치의 질소 원자 상에서 이것을 포함하는 링커 구조 내의 메틸렌기와 결합한다.
또한 본원 발명은 이하의 각각에 관한 것이기도 하다.
[2] LP 의 펩티드 잔기가, 페닐알라닌, 글리신, 발린, 리신, 시트룰린, 세린, 글루타민산, 아스파르트산에서 선택되는 아미노산으로 이루어지는 펩티드 잔기인 [1] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[3] LP 가, 이하의 군에서 선택되는 펩티드 잔기인 [1] 또는 [2] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트:
여기서 『(D-)D』 는 D-아스파르트산을 나타낸다.
[4] LP 가, 4 개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 잔기인 [1] 또는 [2] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[5] LP 가, 테트라펩티드 잔기의 -GGFG- 인 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[6] n3 이 2 내지 5 의 정수이고, L2 가 단결합인 [1] 내지 [5] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[7] n3 이 2 내지 5 의 정수이고, L2 가 -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 이고, n4 가 2 또는 4 인 [1] 내지 [5] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[8] -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 가, 4 내지 7 원자의 사슬 길이를 갖는 부분 구조인 [1] 내지 [7] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[9] -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 가, 5 또는 6 원자의 사슬 길이를 갖는 부분 구조인 [1] 내지 [7] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[10] -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 가,
인 [1] 내지 [9] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[11] -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 가,
인 [1] 내지 [9] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[12] -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 에 약물을 결합시킨 약물-링커 구조 부분이, 다음의 군에서 선택되는 1 종의 약물-링커 구조인 [1] 내지 [9] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트:
여기서, -(숙신이미드-3-일-N)- 는 다음 식:
[화학식 4]
로 나타내는 구조이며, 이것의 3 위치에서 항 TROP2 항체와 결합하고, 1 위치의 질소 원자 상에서 이것을 포함하는 링커 구조 내의 메틸렌기와 결합한다.
-(NH-DX) 는 다음 식:
[화학식 5]
로 나타내는, 1 위치의 아미노기의 질소 원자가 결합 부위로 되어 있는 기를 나타낸다.
-GGFG- 는, -Gly-Gly-Phe-Gly- 의 테트라펩티드 잔기를 나타낸다.
[13] -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 에 약물을 결합시킨 약물-링커 구조 부분이, 다음의 군에서 선택되는 1 종의 약물-링커 구조인 [1] 내지 [9] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트:
여기서, -(숙신이미드-3-일-N)-, -(NH-DX), 및 -GGFG- 는, 상기한 바와 같다.
[14] 다음 식
[화학식 6]
으로 나타내는 항종양성 화합물과 항 TROP2 항체를 다음 식:
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-
로 나타내는 구조의 링커를 통해서, 항 TROP2 항체의 힌지부에 존재하는 디술파이드 결합 부분에 있어서 형성시킨 티오에테르 결합을 통해서 결합시킨 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트.
여기서, 항 TROP2 항체는 L1 의 말단에 있어서 결합하고, 항종양성 화합물은 -(CH2)n2-C(=O)- 부분의 카르보닐기에 결합한다.
식 중, n1 은, 0 내지 6 의 정수를 나타내고,
n2 는, 0 내지 5 의 정수를 나타내고,
L1 은, -(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)n3-C(=O)- 를 나타내고,
여기서, n3 은, 2 내지 8 의 정수를 나타내고,
L2 는, -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 또는 단결합을 나타내고,
여기서, n4 는, 1 내지 6 의 정수를 나타내고,
LP 는, -GGFG- 의 테트라펩티드 잔기를 나타내고,
La 는, -O- 또는 단결합을 나타내고,
-(숙신이미드-3-일-N)- 는 다음 식:
[화학식 7]
로 나타내는 구조이며, 이것의 3 위치에서 항 TROP2 항체와 결합하고, 1 위치의 질소 원자 상에서 이것을 포함하는 링커 구조 내의 메틸렌기와 결합한다.
[15] n1 이 3 이고, n2 가 0 이고, n3 이 2 이고, L2 가 -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 이고, n4 가 2 이고, La 가 단결합이거나,
n1 이 1 이고, n2 가 1 이고, n3 이 5 이고, L2 가 단결합이고, La 가 -O- 이거나, 또는
n1 이 2 이고, n2 가 1 이고, n3 이 5 이고, L2 가 단결합이고, La 가 -O- 인 [14] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[16] n3 이 2 또는 5 이고, L2 가 단결합인 [14] 또는 [15] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[17] n3 이 2 또는 5 이고, L2 가 -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 이고, n4 가 2 또는 4 인 [14] 또는 [15] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[18] -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 가,
인 [14] 내지 [17] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[19] -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 에 약물을 결합시킨 약물-링커 구조 부분이, 다음의 군에서 선택되는 1 종의 약물-링커 구조인 [14] 내지 [18] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트:
여기서, -(숙신이미드-3-일-N)- 는 다음 식:
[화학식 8]
로 나타내는 구조이며, 이것의 3 위치에서 항 TROP2 항체와 결합하고, 1 위치의 질소 원자 상에서 이것을 포함하는 링커 구조 내의 메틸렌기와 결합한다.
-(NH-DX) 는 다음 식:
[화학식 9]
로 나타내는, 1 위치의 아미노기의 질소 원자가 결합 부위로 되어 있는 기를 나타낸다.
-GGFG- 는, -Gly-Gly-Phe-Gly- 의 테트라펩티드 잔기를 나타낸다.
[20] -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 에 약물을 결합시킨 약물-링커 구조 부분이, 다음의 군에서 선택되는 1 종의 약물-링커 구조인 [14] 내지 [18] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트:
여기서, -(숙신이미드-3-일-N)-, -(NH-DX) 및 -GGFG- 는, 상기한 바와 같다.
[21] 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 1 내지 10 개의 범위인 [1] 내지 [20] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[22] 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 2 내지 8 개의 범위인 [1] 내지 [20] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[23] 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 3 내지 8 개의 범위인 [1] 내지 [20] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[24] [1] 내지 [23] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물을 함유하는 의약.
[25] [1] 내지 [23] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물을 함유하는 항종양약 및/또는 항암약.
[26] 폐암, 신암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경교아종, 난소암, 췌암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 자궁경암, 두경부암, 또는 식도암에 적용하기 위한 [25] 에 기재된 항종양약 및/또는 항암약.
[27] [1] 내지 [23] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물을 활성 성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 제제 성분을 함유하는 의약 조성물.
[28] 폐암, 신암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경교아종, 난소암, 췌암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 자궁경암, 두경부암, 또는 식도암에 적용하기 위한 [27] 에 기재된 의약 조성물.
[29] [1] 내지 [23] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물을 투여하는 것을 특징으로 하는 종양 및/또는 암의 치료 방법.
[30] 다음 식으로 나타내는 화합물:
(말레이미드-N-일)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX) 를 항 TROP2 항체 또는 그 반응성 유도체와 반응시키고, 그 항체의 힌지부에 존재하는 디술파이드 결합 부분에 있어서 티오에테르 결합을 형성시키는 방법에 의해 약물-링커 부분을 그 항체에 결합시키는 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 방법.
식 중, n3 은, 정수 2 내지 8 을 나타내고,
L2 는, -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 또는 단결합을 나타내고,
여기서, n4 는, 1 내지 6 의 정수를 나타내고,
LP 는, 페닐알라닌, 글리신, 발린, 리신, 시트룰린, 세린, 글루타민산, 아스파르트산에서 선택되는 2 내지 7 개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 잔기를 나타내고,
n1 은, 0 내지 6 의 정수를 나타내고,
n2 는, 0 내지 5 의 정수를 나타내고,
La 는, -O- 또는 단결합을 나타내고,
(말레이미드-N-일)- 는, 다음 식
[화학식 10]
으로 나타내는, 질소 원자가 결합 부위로 되어 있는 기이다.
-(NH-DX) 는, 다음 식
[화학식 11]
로 나타내는, 1 위치의 아미노기의 질소 원자가 결합 부위로 되어 있는 기이다.
[31] 약물-링커 부분을 항 TROP2 항체에 결합시키는 방법이, 그 항체를 환원 처리하여 반응성 유도체로 변환하는 방법인 [30] 에 기재된 제조 방법.
[32] 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 1 내지 10 개의 범위인 [30] 또는 [31] 에 기재된 제조 방법.
[33] 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 2 내지 8 개의 범위인 [30] 또는 [31] 에 기재된 제조 방법.
[34] 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 3 내지 8 개의 범위인 [30] 또는 [31] 에 기재된 제조 방법.
[35] [30] 내지 [34] 중 어느 하나의 제조 방법에 의해 얻어지는 항체-약물 컨쥬게이트.
[36] 항 TROP2 항체를 환원 조건으로 처리한 후에 이하의 군에서 선택되는 화합물을 반응시키는 것을 특징으로 하는, 그 항체의 힌지부의 술파이드 결합 부분에 있어서 티오에테르 결합을 형성시켜 얻어지는 항체-약물 컨쥬게이트:
여기서, (말레이미드-N-일)- 는, 다음 식
[화학식 12]
로 나타내는, 질소 원자가 결합 부위로 되어 있는 기이다.
-(NH-DX) 는, 다음 식
[화학식 13]
으로 나타내는, 1 위치의 아미노기의 질소 원자가 결합 부위로 되어 있는 기이다.
-GGFG- 는, -Gly-Gly-Phe-Gly- 의 테트라펩티드 잔기를 나타낸다.
[37] 항 TROP2 항체를 환원 조건으로 처리한 후에 이하의 군에서 선택되는 화합물을 반응시키는 것을 특징으로 하는, 그 항체의 힌지부의 술파이드 결합 부분에 있어서 티오에테르 결합을 형성시켜 얻어지는 항체-약물 컨쥬게이트:
여기서, (말레이미드-N-일)-, -(NH-DX), 및 -GGFG- 는, 상기한 바와 같다.
[38] 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 1 내지 10 개의 범위인 [36] 또는 [37] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[39] 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 2 내지 8 개의 범위인 [36] 또는 [37] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[40] 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 3 내지 8 개의 범위인 [36] 또는 [37] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
특정한 구조의 링커를 통해서 항종양성 화합물 엑사테칸을 결합시킨 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트에 의해, 우수한 항종양 효과 및 안전성을 달성할 수 있다.
도 1 은, cTINA1 항체 중쇄 (重鎖) 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 7) 및 아미노산 서열 (서열 번호 8) 을 나타낸다.
도 2 는, cTINA1 항체 경쇄 (輕鎖) 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 9) 및 아미노산 서열 (서열 번호 10) 을 나타낸다.
도 3 은, hTINA1-H1 중쇄의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 11) 및 아미노산 서열 (서열 번호 12) 을 나타낸다.
도 4 는, hTINA1-H2 중쇄의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 13) 및 아미노산 서열 (서열 번호 14) 을 나타낸다.
도 5 는, hTINA1-H3 중쇄의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 15) 및 아미노산 서열 (서열 번호 16) 을 나타낸다.
도 6 은, hTINA1-L1 경쇄의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 17) 및 아미노산 서열 (서열 번호 18) 을 나타낸다.
도 7 은, hTINA1-L2 경쇄의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 19) 및 아미노산 서열 (서열 번호 20) 을 나타낸다.
도 8 은, hTINA1-L3 경쇄의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 21) 및 아미노산 서열 (서열 번호 22) 을 나타낸다.
도 9 는, TINA1 항체의 CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 23), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 24), CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 25), CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 26), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 27), 및 CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 28) 을 나타낸다.
도 10 은, 항 CD9 항체, 항 CD46 항체, 항 CD55 항체, 항 CD59 항체, 항 CD71 항체, 항 CD73 항체, 항 CD147 항체, 항 CD276 항체, 항 EpCAM 항체, 항 EGFR 항체, 및 항 TROP2 항체 (TINA1 항체) 의 세포 내재화능을 나타낸다.
도 11 은, 항 CD59 항체, 항 CD71 항체, 항 EGFR 항체, 항 EpCAM 항체, 및 항 TROP2 항체 (TINA1 항체) 의 세포 내재화능을 나타낸다.
도 12 는, 각종 항 TROP2 항체의 세포 내재화능을 나타낸다.
도 13 은, 항체-약물 컨쥬게이트 (1), (6), 또는 (12) 가, 인간 대장암 세포주 COLO205 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 14 는, 항체-약물 컨쥬게이트 (1), (6), 또는 (12) 가, 인간 췌장선암 세포주 BxPC-3 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 15 는, 항체-약물 컨쥬게이트 (1), (6), 또는 (12) 가, 인간 췌장선암 세포주 Capan-1 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 16 은, 항체-약물 컨쥬게이트 (2), (5), (7), 또는 (10) 이, 인간 대장암 세포주 COLO205 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 17 은, 항체-약물 컨쥬게이트 (2), (5), (7), 또는 (10) 이, 인간 췌장 암 세포주 BxPC-3 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 18 은, 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), 또는 (9) 가, 인간 대장암 세포주 COLO205 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 19 는, 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), 또는 (9) 가, 인간 췌장 암 세포주 BxPC-3 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 20 은, 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), 또는 (9) 가, 인간 난소암 세포주 NIH:OVCAR-3 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 21 은, 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), 또는 (9) 가, 인간 위암 세포주 NCI-N87 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 22 는, 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), 또는 (9) 가, 인간 폐암 세포주 NCI-H292 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 23 은, 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), 또는 (9) 가, 인간 인두암 세포주 FaDu 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 24 는, 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), 또는 (9) 가, 인간 췌장선암 세포주 CFPAC-1 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 25 는, 항체-약물 컨쥬게이트 (8) 또는 (13) 이, 인간 췌장선암 세포주 CFPAC-1 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 26 은, 항체-약물 컨쥬게이트 (8) 또는 (13) 이, 인간 췌장선암 세포주 HPAC 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 27 은, 항체-약물 컨쥬게이트 (8) 또는 (13) 이, 인간 식도암 조직 피하 이식 NOD-scid 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 2 는, cTINA1 항체 경쇄 (輕鎖) 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 9) 및 아미노산 서열 (서열 번호 10) 을 나타낸다.
도 3 은, hTINA1-H1 중쇄의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 11) 및 아미노산 서열 (서열 번호 12) 을 나타낸다.
도 4 는, hTINA1-H2 중쇄의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 13) 및 아미노산 서열 (서열 번호 14) 을 나타낸다.
도 5 는, hTINA1-H3 중쇄의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 15) 및 아미노산 서열 (서열 번호 16) 을 나타낸다.
도 6 은, hTINA1-L1 경쇄의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 17) 및 아미노산 서열 (서열 번호 18) 을 나타낸다.
도 7 은, hTINA1-L2 경쇄의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 19) 및 아미노산 서열 (서열 번호 20) 을 나타낸다.
도 8 은, hTINA1-L3 경쇄의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 21) 및 아미노산 서열 (서열 번호 22) 을 나타낸다.
도 9 는, TINA1 항체의 CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 23), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 24), CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 25), CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 26), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 27), 및 CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 28) 을 나타낸다.
도 10 은, 항 CD9 항체, 항 CD46 항체, 항 CD55 항체, 항 CD59 항체, 항 CD71 항체, 항 CD73 항체, 항 CD147 항체, 항 CD276 항체, 항 EpCAM 항체, 항 EGFR 항체, 및 항 TROP2 항체 (TINA1 항체) 의 세포 내재화능을 나타낸다.
도 11 은, 항 CD59 항체, 항 CD71 항체, 항 EGFR 항체, 항 EpCAM 항체, 및 항 TROP2 항체 (TINA1 항체) 의 세포 내재화능을 나타낸다.
도 12 는, 각종 항 TROP2 항체의 세포 내재화능을 나타낸다.
도 13 은, 항체-약물 컨쥬게이트 (1), (6), 또는 (12) 가, 인간 대장암 세포주 COLO205 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 14 는, 항체-약물 컨쥬게이트 (1), (6), 또는 (12) 가, 인간 췌장선암 세포주 BxPC-3 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 15 는, 항체-약물 컨쥬게이트 (1), (6), 또는 (12) 가, 인간 췌장선암 세포주 Capan-1 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 16 은, 항체-약물 컨쥬게이트 (2), (5), (7), 또는 (10) 이, 인간 대장암 세포주 COLO205 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 17 은, 항체-약물 컨쥬게이트 (2), (5), (7), 또는 (10) 이, 인간 췌장 암 세포주 BxPC-3 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 18 은, 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), 또는 (9) 가, 인간 대장암 세포주 COLO205 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 19 는, 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), 또는 (9) 가, 인간 췌장 암 세포주 BxPC-3 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 20 은, 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), 또는 (9) 가, 인간 난소암 세포주 NIH:OVCAR-3 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 21 은, 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), 또는 (9) 가, 인간 위암 세포주 NCI-N87 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 22 는, 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), 또는 (9) 가, 인간 폐암 세포주 NCI-H292 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 23 은, 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), 또는 (9) 가, 인간 인두암 세포주 FaDu 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 24 는, 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), 또는 (9) 가, 인간 췌장선암 세포주 CFPAC-1 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 25 는, 항체-약물 컨쥬게이트 (8) 또는 (13) 이, 인간 췌장선암 세포주 CFPAC-1 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 26 은, 항체-약물 컨쥬게이트 (8) 또는 (13) 이, 인간 췌장선암 세포주 HPAC 피하 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
도 27 은, 항체-약물 컨쥬게이트 (8) 또는 (13) 이, 인간 식도암 조직 피하 이식 NOD-scid 마우스에 대해서 나타내는 항종양 효과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 적합한 형태에 대하여 도면을 참조하면서 설명한다. 또한, 이하에 설명하는 실시형태는, 본 발명의 대표적인 실시형태의 일례를 나타낸 것이며, 이에 따라 본 발명의 범위가 좁게 해석되는 경우는 없다.
본 발명의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트는, 항 TROP2 항체에, 링커 구조 부분을 통해서 항종양성 화합물을 결합시킨 항종양성 약물이며, 이하에 상세하게 설명한다.
[항체]
본 발명의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트에 사용되는 항 TROP2 항체는, 어느 종에서 유래해도 되지만, 바람직하게는 인간, 래트, 마우스, 및 토끼를 예시할 수 있다. 인간 이외의 종에서 유래하는 경우에는, 주지의 기술을 이용하여, 키메라화 또는 인간화하는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체는, 폴리클로날 항체여도 되고, 모노클로날 항체여도 되지만, 모노클로날 항체가 바람직하다.
항 TROP2 항체는 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 항체이며, 즉 종양 세포를 인식할 수 있는 특성, 종양 세포에 결합할 수 있는 특성, 그리고 종양 세포내에 도입되어 내재화하는 특성 등을 구비하고 있고, 항종양 활성을 갖는 화합물을, 링커를 통해서 결합시켜 항체-약물 컨쥬게이트로 할 수 있다.
항체의 종양 세포에 대한 결합성은, 플로 사이토메트리를 이용하여 확인할 수 있다. 종양 세포내로의 항체의 도입의 확인 방법으로는, (1) 치료 항체에 결합하는 2 차 항체 (형광 표지) 를 사용하여 세포내에 도입된 항체를 형광 현미경으로 가시화하는 어세이 (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) 치료 항체에 결합하는 2 차 항체 (형광 표지) 를 사용하여 세포내에 도입된 형광량을 측정하는 어세이 (Molecular Biology of the Cell Vol. 15, 5268-5282, December 2004), 또는 (3) 치료 항체에 결합하는 이뮤노톡신을 사용하여, 세포내에 도입되면, 독소가 방출되어 세포 증식이 억제된다고 하는 Mab-ZAP 어세이 (Bio Techniques 28:162-165, January 2000) 등을 들 수 있다. 또한, 이뮤노톡신으로는, 디프테리아 독소의 촉매 영역과 프로테인 G 의 리컴비넌트 복합 단백질도 사용 가능하다.
항체-약물 컨쥬게이트는 항종양 효과를 발휘하는 화합물을 결합시켜 있으므로, 항체 자체가 항종양 효과를 갖는 것은, 바람직하지만, 필수는 아니다. 항종양성 화합물의 세포 장해성을 종양 세포에 있어서 특이적·선택적으로 발휘시키는 목적에서는, 항체가 내재화하여 종양 세포내로 이행하는 성질이 있는 것이 중요하고, 바람직하다.
항 TROP2 항체는, 이 분야에서 통상적으로 실시되는 방법을 이용하여, 항원이 되는 폴리펩티드를 동물에 면역하고, 생체 내에 산생되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있다. 항원의 유래는 인간에 한정되지 않고, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 동물에서 유래하는 항원을 동물에 면역할 수도 있다. 이 경우에는, 취득된 이종 항원에 결합하는 항체와 인간 항원의 교차성을 시험함으로써, 인간의 질환에 적용 가능한 항체를 선별할 수 있다.
또, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497;Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) 에 따라, 항원에 대한 항체를 산생하는 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하고, 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다.
또한, 항원은 항원 단백질을 코드하는 유전자를 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다. 구체적으로는, 항원 유전자를 발현 가능한 벡터를 제조하고, 이것을 숙주 세포에 도입하여 그 유전자를 발현시키고, 발현한 항원을 정제하면 된다. 상기 유전자 조작에 의한 항원 발현 세포, 혹은 항원을 발현하고 있는 세포주를 동물에 면역하는 방법을 이용함으로써도 항체를 취득할 수 있다.
항 TROP2 항체는, 공지된 수단에 의해 취득할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 항 TROP2 항체는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 본원의 서열표에서 나타낸 아미노산 서열로 특정되는 것을 적합하게 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 사용되는 TROP2 항체로는, 이하의 특성을 갖는 것이 바람직하다.
(1) 이하의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체;
(a) TROP2 에 특이적으로 결합한다
(b) TROP2 와 결합함으로써 TROP2 발현 세포에 내재화하는 활성을 갖는다
(2) TROP2 가 인간 TROP2 인 상기 (1) 에 기재된 항체.
(3) 중쇄에 있어서의 상보성 결정 영역으로서 서열 번호 23 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 24 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 25 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 그리고 경쇄에 있어서의 상보성 결정 영역으로서 서열 번호 26 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 27 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 28 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 갖는 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 항체.
(4) 정상 영역이 인간 유래 정상 영역인 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(5) 인간화되어 있는 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(6) (a) 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열, (b) 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열, (c) 서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열, (d) (a) 내지 (c) 의 서열에 대해서 적어도 95 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 (e) (a) 내지 (c) 의 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역, 그리고 (f) 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열, (g) 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열, (h) 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열, (i) (f) 내지 (h) 의 서열에 대해서 적어도 95 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 (j) (f) 내지 (h) 의 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역을 갖는 상기 (5) 에 기재된 항체.
(7) 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역, 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역, 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역, 서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역, 서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역, 그리고 서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역으로 이루어지는 군에서 선택되는 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역을 갖는 상기 (6) 에 기재된 항체.
(8) 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역, 그리고 서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역으로 이루어지는 군에서 선택되는 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역을 갖는 상기 (7) 에 기재된 항체.
(9) 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 그리고 서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 군에서 선택되는 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 상기 (6) 또는 (7) 에 기재된 항체.
(10) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 20 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 22 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 20 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 22 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 20 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 그리고 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 22 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 군에서 선택되는 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 상기 (6) 또는 (7) 에 기재된 항체.
(11) 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 그리고 서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 군에서 선택되는 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 상기 (8) 에 기재된 항체.
(12) 중쇄 카르복실 말단의 리신 잔기가 결실되어 있는 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(13) 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체를 채취하는 공정을 포함하는 당해 항체의 제조 방법에 의해 얻어지는 항체.
이하에, 본 발명에 있어서 사용되는 항 TROP2 항체에 대하여 설명한다.
본 명세서에 있어서, 「암」 과 「종양」 은 동일한 의미로 사용하고 있다.
본 명세서에 있어서, 「유전자」 라고 하는 단어에는, DNA 뿐만 아니라 그 mRNA, cDNA, 및 그 cRNA 도 포함된다.
본 명세서에 있어서, 「폴리뉴클레오티드」 라고 하는 단어는 핵산과 동일한 의미로 사용하고 있으며, DNA, RNA, 프로브, 올리고 뉴클레오티드, 및 프라이머도 포함된다.
본 명세에 있어서는, 「폴리펩티드」 와 「단백질」 은 구별하지 않고 사용하고 있다.
본 명세서에 있어서, 「세포」 에는, 동물 개체 내의 세포, 배양 세포도 포함하고 있다.
본 명세서에 있어서, 「TROP2」 는, TROP2 단백질과 동일한 의미로 사용하고 있다.
본 명세서에 있어서의 「CDR」 이란, 상보성 결정 영역 (CDR:Complemetarity deterring region) 을 의미한다. 항체 분자의 중쇄 및 경쇄에는 각각 3 개 지점의 CDR 이 있는 것이 알려져 있다. CDR 은, 초가변 영역 (hypervariable domain) 이라고도 불리며, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 내에 있어, 1 차 구조의 변이성이 특히 높은 부위이며, 중쇄 및 경쇄의 폴리펩티드 사슬의 1 차 구조 상에 있어서, 각각 3 개 지점으로 분리되어 있다. 본 명세서 중에 있어서는, 항체의 CDR 에 대해, 중쇄의 CDR 을 중쇄 아미노산 서열의 아미노 말단측으로부터 CDRH1, CDRH2, CDRH3 이라고 표기하고, 경쇄의 CDR 을 경쇄 아미노산 서열의 아미노 말단측으로부터 CDRL1, CDRL2, CDRL3 이라고 표기한다. 이들 부위는 입체 구조 상에서 상호 근접하고, 결합하는 항원에 대한 특이성을 결정하고 있다.
본 발명에 있어서, 「스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈한다」 란, 시판되는 하이브리다이제이션 용액 ExpressHyb Hybridization Solution (클론텍사 제조) 중, 68 ℃ 에서 하이브리다이즈하는 것, 또는 DNA 를 고정한 필터를 사용하여 0.7-1.0 M 의 NaCl 존재하, 68 ℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1-2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도 SSC 란, 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨으로 이루어진다) 을 사용하고, 68 ℃ 에서 세정함으로써 동정할 수 있는 조건 또는 그것과 동등한 조건으로 하이브리다이즈하는 것을 말한다.
1. TROP2
TROP2 는, 인간 영양막 세포 (trophoblasts) 에 발현하는 TACSTD 패밀리의 하나이며, 인간 영양막 세포와 암 세포에 공통되는 면역 저항성에 관여하는, 1 회 막 관통형의 1 형 세포막 단백질이다.
본 발명에서 사용하는 TROP2 단백질은, 인간, 비인간 포유 동물 (래트, 마우스 등) 의 TROP2 발현 세포로부터 직접 정제하여 사용하거나, 혹은 당해 세포의 세포막 획분을 조제하여 사용할 수 있으며, 또, TROP2 를 in vitro 에서 합성하거나, 혹은 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다. 유전자 조작으로는, 구체적으로는, TROP2 cDNA 를 발현 가능한 벡터에 삽입한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 포함하는 용액 중에서 합성하거나, 혹은 다른 원핵 생물, 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질 전환시킴으로써 TROP2 를 발현시킴으로써, 그 단백질을 얻을 수 있다. 또, 상기 유전자 조작에 의한 TROP2 발현 세포, 혹은 TROP2 를 발현하고 있는 세포주를 TROP2 단백질로서 사용하는 것도 가능하다.
TROP2 의 DNA 서열 및 아미노산 서열은 공적 데이터베이스 상에 공개되어 있으며, 예를 들어 NM_002353, NP_002344 (NCBI) 등의 액세션 번호에 의해 참조 가능하다.
또, 상기 TROP2 의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 당해 단백질과 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 TROP2 에 포함된다.
인간 TROP2 단백질은, N 말단 26 아미노산 잔기로 이루어지는 시그널 서열, 248 아미노산 잔기로 이루어지는 세포외 도메인, 23 아미노산 잔기로 이루어지는 세포막 관통 도메인, 26 아미노산 잔기로 이루어지는 세포내 도메인으로 구성되어 있다.
2. 항 TROP2 항체의 제조
본 발명의 TROP2 에 대한 항체는, 이 분야에서 통상적으로 실시되는 방법을 이용하여, TROP2 또는 TROP2 의 아미노산 서열에서 선택되는 임의의 폴리펩티드를 동물에 면역하고, 생체 내에 산생되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있다. 항원이 되는 TROP2 의 생물종은 인간에 한정되지 않고, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 동물에서 유래하는 TROP2 를 동물에 면역할 수도 있다. 이 경우에는, 취득된 이종 TROP2 에 결합하는 항체와 인간 TROP2 의 교차성을 시험함으로써, 인간의 질환에 적용 가능한 항체를 선별할 수 있다.
또, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497;Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) 에 따라, TROP2 에 대한 항체를 산생하는 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하고, 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다.
또한, 항원이 되는 TROP2 는 TROP2 유전자를 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 발현시킴으로써 얻을 수 있다.
구체적으로는, TROP2 유전자를 발현 가능한 벡터를 제조하고, 이것을 숙주 세포에 도입하여 그 유전자를 발현시키고, 발현한 TROP2 를 정제하면 된다.
또, 상기 유전자 조작에 의한 TROP2 발현 세포, 혹은 TROP2 를 발현하고 있는 세포주를 TROP2 단백질로서 사용하는 것도 가능하다. 이하, 구체적으로 TROP2 에 대한 항체의 취득 방법을 설명한다.
(1) 항원의 조제
항 TROP2 항체를 제조하기 위한 항원으로는, TROP2 또는 그 적어도 6 개의 연속된 부분 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 혹은 이들에 임의의 아미노산 서열이나 담체가 부가된 유도체를 들 수 있다.
TROP2 는, 인간의 종양 조직 혹은 종양 세포로부터 직접 정제하여 사용할 수 있으며, 또, TROP2 를 in vitro 에서 합성하거나, 혹은 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다.
유전자 조작에서는, 구체적으로는, TROP2 의 cDNA 를 발현 가능한 벡터에 삽입한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 포함하는 용액 중에서 합성하거나, 혹은 다른 원핵 생물 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질 전환하여 TROP2 를 발현시킴으로써, 항원을 얻을 수 있다.
또, 막 단백질인 TROP2 의 세포외 영역과 항체의 정상 영역을 연결한 융합 단백질을 적절한 숙주·벡터계에 있어서 발현시킴으로써, 분비 단백질로서 항원을 얻는 것도 가능하다.
TROP2 의 cDNA 는 예를 들어, TROP2 의 cDNA 를 발현하고 있는 cDNA 라이브러리를 주형 (鑄型) 으로 하여, TROP2 cDNA 를 특이적으로 증폭하는 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응 (이하, 「PCR」 이라고 한다;Saiki, R. K., et al., Science (1988) 239, p. 487-489 참조) 을 실시하는, 이른바 PCR 법에 의해 취득할 수 있다.
폴리펩티드의 in vitro 합성으로는, 예를 들어 로슈·다이어그노스틱스사 제조의 래피드 트랜슬레이션 시스템 (RTS) 을 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.
원핵 세포의 숙주로는, 예를 들어, 대장균 (Escherichia coli) 이나 고초균 (Bacillus subtilis) 등을 들 수 있다. 목적으로 하는 유전자를 이들 숙주 세포내에서 형질 전환시키려면, 숙주과 적합할 수 있는 종 유래의 레플리콘 즉 복제 기점과, 조절 서열을 포함하고 있는 플라스미드 벡터로 숙주 세포를 형질 전환시킨다. 또, 벡터로는, 형질 전환 세포에 표현 형질 (표현형) 의 선택성을 부여할 수 있는 서열을 갖는 것이 바람직하다.
진핵 세포의 숙주 세포에는, 척추 동물, 곤충, 효모 등의 세포가 포함되며, 척추 동물 세포로는, 예를 들어, 원숭이 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650;ATCC:American Type Culture Collection), 마우스 선유아 세포 NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) 이나 차이니즈·햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디하이드로 엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, p. 4126-4220) 등이 자주 사용되고 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
상기와 같이 하여 얻어지는 형질 전환체는, 이 분야에서 통상적으로 실시되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 그 배양에 의해 세포내 또는 세포외에 목적으로 하는 폴리펩티드가 산생된다.
그 배양에 사용되는 배지는, 당업자이면 채용한 숙주 세포에 따라 관용되는 각종의 것을 적절히 선택할 수 있으며, 대장균이면, 예를 들어, LB 배지에 필요에 따라, 암피실린 등의 항생 물질이나 IPMG 를 첨가하여 사용할 수 있다.
상기 배양에 의해, 형질 전환체의 세포내 또는 세포외에 산생되는 재조합 단백질은, 그 단백질의 물리적 성질이나 화학적 성질 등을 이용한 각종 공지된 분리 조작법에 의해 분리·정제할 수 있다.
그 방법으로는, 구체적으로는 예를 들어, 통상적인 단백질 침전제에 의한 처리, 한외 여과, 분자체 크로마토그래피 (겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등의 각종 액체 크로마토그래피, 투석법, 이들의 조합 등을 예시할 수 있다.
또, 발현시키는 재조합 단백질에 6 잔기로 이루어지는 히스티딘 태그를 연결함으로써, 니켈 어피니티 칼럼으로 효율적으로 정제할 수 있다. 혹은, 발현시키는 재조합 단백질에 IgG 의 Fc 영역을 연결함으로써, 프로테인 A 칼럼으로 효율적으로 정제할 수 있다.
상기 방법을 조합함으로써 용이하게 고수율, 고순도로 목적으로 하는 폴리펩티드를 대량으로 제조할 수 있다.
상기에 서술한 형질 전환체 자체를 항원으로서 사용하는 것도 가능하다. 또, TROP2 를 발현하는 세포주를 항원으로서 사용하는 것도 가능하다. 이와 같은 세포주로는, 인간화 폐암주 NCI-H322, PC14, NCIH-H2122, 또는 LCAM1, 인간 전립선암주 PC3, 인간 췌장암주 BxPC-3, Capan-1, 또는 PK-1, 인간 난소암주 SKOV3 그리고 인간 대장암주 COLO205 를 들 수 있지만, TROP2 를 발현하는 한, 이들 세포주에 한정되는 것은 아니다.
(2) 항 TROP2 모노클로날 항체의 제조
TROP2 와 특이적으로 결합하는 항체의 예로서, TROP2 와 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 들 수 있는데, 그 취득 방법은, 이하에 기재하는 바와 같다.
모노클로날 항체의 제조에 있어서는, 일반적으로 하기와 같은 작업 공정이 필요하다.
즉,
(a) 항원으로서 사용하는 생체 고분자의 정제, 또는 항원 발현 세포의 조제,
(b) 항원을 동물에 주사함으로써 면역한 후에 혈액을 채취하고, 그 항체가를 검정하여 비장 적출 시기를 결정하고 나서, 항체 산생 세포를 조제하는 공정,
(c) 골수종 세포 (이하, 「미엘로마」 라고 한다) 의 조제,
(d) 항체 산생 세포와 미엘로마의 세포 융합,
(e) 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마군의 선별,
(f) 단일 세포 클론으로의 분할 (클로닝),
(g) 경우에 따라서는, 모노클로날 항체를 대량으로 제조하기 위한 하이브리도마의 배양, 또는 하이브리도마를 이식한 동물의 사육,
(h) 이와 같이 하여 제조된 모노클로날 항체의 생리 활성, 및 그 결합 특이성의 검토, 혹은 표지 시약으로서의 특성의 검정
등이다.
이하, 모노클로날 항체의 제조법을 상기 공정을 따라 상세히 서술하지만, 그 항체의 제조법은 이것에 제한되지 않고, 예를 들어 비세포 이외의 항체 산생 세포 및 미엘로마를 사용할 수도 있다.
(a) 항원의 정제
항원으로는, 상기한 바와 같은 방법으로 조제한 TROP2 또는 그 일부를 사용할 수 있다.
또, TROP2 발현 재조합체 세포에 의해 조제한 막 획분, 또는 TROP2 발현 재조합체 세포 자신, 또한, 당업자에게 주지인 방법을 이용하여 화학 합성한 본 발명의 단백질의 부분 펩티드를 항원으로서 사용할 수도 있다.
또한, TROP2 발현 세포주를 항원으로서 사용할 수도 있다.
(b) 항체 산생 세포의 조제
공정 (a) 에서 얻어진 항원과, 프로인드의 완전 또는 불완전 애주번트, 혹은 칼륨 명반과 같은 보조제를 혼합하고, 면역원으로서 실험 동물에게 면역한다. 이 외에, 항원 발현 세포를 면역원으로서 실험 동물에게 면역하는 방법도 있다. 실험 동물은 공지된 하이브리도마 제조법에서 이용되는 동물을 지장없이 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 마우스, 래트, 염소, 양, 소, 말 등을 사용할 수 있다. 단, 적출한 항체 산생 세포와 융합시키는 미엘로마 세포의 입수 용이성 등의 관점에서, 마우스 또는 래트를 피면역 동물로 하는 것이 바람직하다.
또, 실제로 사용하는 마우스 및 래트의 계통에는 특별히 제한은 없고, 마우스의 경우에는, 예를 들어 각 계통 A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, 129 등이, 또 래트의 경우에는, 예를 들어, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer 등을 사용할 수 있다.
이들 마우스 및 래트는 예를 들어 닛폰 클레아 주식회사, 닛폰 찰스·리버 주식회사 등의 실험 동물 사육 판매업자로부터 입수할 수 있다.
피면역 동물로는, 후술하는 미엘로마 세포와의 융합 적합성을 감안하면, 마우스에서는 BALB/c 계통이, 래트에서는 Wistar 및 Low 계통이 특히 바람직하다.
또, 항원의 인간과 마우스에서의 상동성을 고려하여, 자기 항체를 제거하는 생체 기구를 저하시킨 마우스, 즉 자기 면역 질환 마우스를 사용하는 것도 바람직하다.
또한, 이들 마우스 또는 래트의 면역시의 주령은, 바람직하게는 5 ∼ 12 주령, 더욱 바람직하게는 6 ∼ 8 주령이다.
TROP2 또는 이 재조합체에 의해 동물을 면역하려면, 예를 들어, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987);Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) 등에 상세하게 기재되어 있는 공지된 방법을 이용할 수 있다.
이들 면역법 중, 본 발명에 있어서 적합한 방법을 구체적으로 나타내면, 예를 들어 이하와 같다.
즉, 먼저, 항원인 막 단백질 획분, 또는 항원을 발현시킨 세포를 동물의 피내 또는 복강내에 투여한다. 단, 면역 효율을 높이기 위해서는 양자의 병용이 바람직하고, 전반은 피내 투여를 실시하고, 후반 또는 최종회만 복강내 투여를 실시하면, 특히 면역 효율을 높일 수 있다.
항원의 투여 스케줄은, 피면역 동물의 종류, 개체차 등에 따라 다르지만, 일반적으로는, 항원 투여 횟수 3 ∼ 6 회, 투여 간격 2 ∼ 6 주간이 바람직하고, 투여 횟수 3 ∼ 4 회, 투여 간격 2 ∼ 4 주간이 더욱 바람직하다.
또, 항원의 투여량은, 동물의 종류, 개체차 등에 따라 다르지만, 일반적으로는 0.05 ∼ 5 ㎎, 바람직하게는 0.1 ∼ 0.5 ㎎ 정도로 한다.
추가 면역은, 이상과 같은 항원 투여의 1 ∼ 6 주일 후, 바람직하게는 1 ∼ 4 주일 후, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 3 주일 후에 실시한다. 면역원이 세포인 경우에는, 1 × 106 내지 1 × 107 개의 세포를 사용한다.
또한, 추가 면역을 실시할 때의 항원 투여량은, 동물의 종류, 크기 등에 따라 다르지만, 일반적으로, 예를 들어 마우스의 경우에는 0.05 ∼ 5 ㎎, 바람직하게는 0.1 ∼ 0.5 ㎎, 더욱 바람직하게는 0.1 ∼ 0.2 ㎎ 정도로 한다. 면역원이 세포인 경우에는, 1 × 106 내지 1 × 107 개의 세포를 사용한다.
상기 추가 면역으로부터 1 ∼ 10 일 후, 바람직하게는 2 ∼ 5 일 후, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 3 일 후에 피면역 동물로부터 항체 산생 세포를 포함하는 비장 세포 또는 림프구를 무균적으로 취출한다. 그 때에 항체가를 측정하고, 항체가가 충분히 높아진 동물을 항체 산생 세포의 공급원으로서 사용하면, 이후의 조작 효율을 높일 수 있다.
여기서 사용되는 항체가의 측정법으로는, 예를 들어, RIA 법 또는 ELISA 법을 들 수 있지만, 이들 방법에 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서의 항체가 측정은, 예를 들어 ELISA 법에 의하면, 이하에 기재하는 바와 같은 순서에 의해 실시할 수 있다.
먼저, 정제 또는 부분 정제한 항원을 ELISA 용 96 구멍 플레이트 등의 고상 표면에 흡착시키고, 또한 항원이 흡착되어 있지 않은 고상 표면을 항원과 무관계인 단백질, 예를 들어 소혈청 알부민 (BSA) 에 의해 덮고, 그 표면을 세정 후, 제 1 항체로서 단계 희석한 시료 (예를 들어, 마우스 혈청) 에 접촉시키고, 상기 항원에 시료 중의 항체를 결합시킨다.
또한 제 2 항체로서 효소 표지된 마우스 항체에 대한 항체를 첨가하여 마우스 항체에 결합시키고, 세정 후 그 효소의 기질을 첨가하고, 기질 분해에 기초하는 발색에 의한 흡광도의 변화 등을 측정함으로써, 항체가를 산출한다.
피면역 동물의 비장 세포 또는 림프구로부터의 항체 산생 세포의 분리는, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler et al., Nature (1975) 256, p. 495;Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977) 6, p. 511;Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550;Walsh, Nature, (1977) 266, p. 495) 에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, 비장 세포의 경우에는, 비장을 가늘게 잘라 세포를 스테인리스 메시로 여과한 후, 이글 최소 필수 배지 (MEM) 에 부유시켜 항체 산생 세포를 분리하는 일반적 방법을 채용할 수 있다.
(c) 골수종 세포 (이하, 「미엘로마」 라고 한다) 의 조제
세포 융합에 사용하는 미엘로마 세포에는 특별한 제한은 없고, 공지된 세포주로부터 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 단, 융합 세포로부터 하이브리도마를 선택할 때의 편리성을 고려하여, 그 선택 절차가 확립되어 있는 HGPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) 결손주를 사용하는 것이 바람직하다.
즉, 마우스 유래의 X63-Ag8 (X63), NS1-ANS/1 (NS1), P3X63-Ag8.U1 (P3U1), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Ag14 (SP2/0), MPC11-45.6 TG1.7 (45.6TG), FO, S149/5XXO, BU.1 등, 래트 유래의 210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3) 등, 인간 유래의 U266AR (SKO-007), GM1500·GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2), 8226AR/NIP4-1 (NP41) 등이다. 이들 HGPRT 결손주는 예를 들어, ATCC 등으로부터 입수할 수 있다.
이들 세포주는, 적당한 배지, 예를 들어 8-아자구아닌 배지 (RPMI-1640 배지에 글루타민, 2-메르캅토에탄올, 겐타마이신 및 우태아 혈청 (이하, 「FBS」 라고 한다) 을 첨가한 배지에 8-아자구아닌을 첨가한 배지), 이스코브 개변 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium;IMDM), 또는 둘베코 개변 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium;DMEM) 에서 계대 배양하지만, 세포 융합의 3 내지 4 일 전에 정상 배지 (예를 들어, 10 % FCS 를 포함하는 ASF104 배지 (아지노모토 주식회사 제조)) 에서 계대 배양하고, 융합 당일에 2 × 107 이상의 세포수를 확보해 둔다.
(d) 세포 융합
항체 산생 세포와 미엘로마 세포의 융합은, 공지된 방법 (Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987);Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) 등) 에 따라, 세포의 생존률을 극도로 저하시키지 않을 정도의 조건하에서 적절히 실시할 수 있다.
그와 같은 방법으로서, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 등의 고농도 폴리머 용액 중에서 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 혼합하는 화학적 방법, 전기적 자극을 이용하는 물리적 방법 등을 사용할 수 있다. 이 중, 상기 화학적 방법의 구체예를 나타내면 이하와 같다.
즉, 고농도 폴리머 용액으로서 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 경우에는, 분자량 1500 ∼ 6000, 바람직하게는 2000 ∼ 4000 의 폴리에틸렌글리콜 용액 중에서, 30 ∼ 40 ℃, 바람직하게는 35 ∼ 38 ℃ 의 온도에서 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 1 ∼ 10 분간, 바람직하게는 5 ∼ 8 분간 혼합한다.
(e) 하이브리도마군의 선택
상기 세포 융합에 의해 얻어지는 하이브리도마의 선택 방법은 특별히 제한은 없지만, 통상적으로 HAT (하이포잔틴·아미노프테린·티미딘) 선택법 (Kohler et al., Nature (1975) 256, p. 495;Milstein et al., Nature (1977) 266, p. 550) 이 이용된다.
이 방법은, 아미노프테린으로 생존할 수 없는 HGPRT 결손주의 미엘로마 세포를 사용하여 하이브리도마를 얻는 경우에 유효하다. 즉, 미융합 세포 및 하이브리도마를 HAT 배지에서 배양함으로써, 아미노프테린에 대한 내성을 갖고 있는 하이브리도마만을 선택적으로 잔존시키고, 또한 증식시킬 수 있다.
(f) 단일 세포 클론으로의 분할 (클로닝)
하이브리도마의 클로닝법으로는, 예를 들어 메틸셀룰로오스법, 연 (軟) 아가로스법, 한계 희석법 등의 공지된 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, Barbara, B. M. and Stanley, M. S.:Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980) 참조). 이들 방법 중, 특히 메틸셀룰로오스법 등의 3 차원 배양법이 적합하다. 예를 들어, 세포 융합에 의해 형성된 하이브리도마군을 ClonaCell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies 사 제조 #03804) 등의 메틸셀룰로오스 배지에 현탁하여 배양하고, 형성된 하이브리도마 콜로니를 회수함으로써 모노 클론 하이브리도마의 취득이 가능하다. 회수된 각 하이브리도마 콜로니를 배양하고, 얻어진 하이브리도마 배양 상청액 중에 안정적으로 항체가가 확인된 것을 TROP2 모노클로날 항체 산생 하이브리도마주로서 선택한다.
이와 같이 하여 수립된 하이브리도마주의 예로는, TROP2 하이브리도마 TINA1 을 들 수 있다. 또한, 본 명세서 중에 있어서는, TROP2 하이브리도마 TINA1 이 산생하는 항체를, 「TINA1 항체」 또는 간단히 「TINA1」 이라고 기재한다.
TINA1 항체의 중쇄 가변 영역은, 서열표의 서열 번호 2 에 나타내는 아미노산 서열을 갖는다. 또, TINA1 항체의 경쇄 가변 영역은, 서열표의 서열 번호 4 에 나타내는 아미노산 서열을 갖는다.
(g) 하이브리도마의 배양에 의한 모노클로날 항체의 조제
이와 같이 하여 선택된 하이브리도마는, 이것을 배양함으로써, 모노클로날 항체를 효율적으로 얻을 수 있지만, 배양에 앞서, 목적으로 하는 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를 스크리닝하는 것이 바람직하다.
이 스크리닝에는 그 자체 이미 알려진 방법을 채용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 항체가의 측정은, 예를 들어 상기 (b) 의 항목에서 설명한 ELISA 법에 의해 실시할 수 있다.
이상의 방법에 의해 얻은 하이브리도마는, 액체 질소 중 또는 -80 ℃ 이하의 냉동고 중에 동결 상태로 보존할 수 있다.
클로닝을 완료한 하이브리도마는, 배지를 HT 배지로부터 정상 배지로 바꾸어 배양된다.
대량 배양은, 대형 배양병을 사용한 회전 배양, 혹은 스피너 배양으로 실시된다. 이 대량 배양에 있어서의 상청액으로부터, 겔 여과 등, 당업자에게 주지인 방법을 이용하여 정제함으로써, 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 얻을 수 있다.
또, 동 계통의 마우스 (예를 들어, 상기 BALB/c), 혹은 Nu/Nu 마우스의 복강내에 하이브리도마를 주사하고, 그 하이브리도마를 증식시킴으로써, 본 발명의 모노클로날 항체를 대량으로 포함하는 복수 (腹水) 를 얻을 수 있다.
복강내에 투여하는 경우에는, 사전 (3 ∼ 7 일 전) 에 2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸 (2,6,10,14-tetramethylpentadecane;프리스탄) 등의 광물유를 투여하면, 보다 다량의 복수가 얻어진다.
예를 들어, 하이브리도마와 동 계통의 마우스의 복강내에 미리 면역 억제제를 주사하고, T 세포를 불활성화한 후, 20 일 후에 106 ∼ 107 개의 하이브리도마·클론 세포를, 혈청을 포함하지 않는 배지 중에 부유 (0.5 ㎖) 시켜 복강내에 투여하여, 통상적으로 복부가 팽만하고, 복수가 고인 마우스로부터 복수를 채취한다. 이 방법에 의해, 배양액 중에 비해 약 100 배 이상 농도의 모노클로날 항체가 얻어진다.
상기 방법에 의해 얻은 모노클로날 항체는, 예를 들어 Weir, D. M.:Handbook of Experimental Immunology, Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978) 에 기재되어 있는 방법으로 정제할 수 있다.
이렇게 하여 얻어지는 모노클로날 항체는, TROP2 에 대해 높은 항원 특이성을 갖는다.
(h) 모노클로날 항체의 검정
이렇게 하여 얻어진 모노클로날 항체의 이소타입 및 서브 클래스의 결정은 이하와 같이 실시할 수 있다.
먼저, 동정법으로는 오우크테를로니 (Ouchterlony) 법, ELISA 법, 또는 RIA 법을 들 수 있다.
오우크테를로니법은 간편하기는 하지만, 모노클로날 항체의 농도가 낮은 경우에는 농축 조작이 필요하다.
한편, ELISA 법 또는 RIA 법을 이용한 경우에는, 배양 상청액을 그대로 항원 흡착 고상과 반응시키고, 또한 제 2 차 항체로서 각종 이뮤노글로불린 이소타입, 서브 클래스에 대응하는 항체를 사용함으로써, 모노클로날 항체의 이소타입, 서브 클래스를 동정하는 것이 가능하다.
또, 더욱 간편한 방법으로서, 시판되는 동정용 키트 (예를 들어, 마우스 타이퍼 키트;바이오라드사 제조) 등을 이용할 수도 있다.
또한, 단백질의 정량은, 폴린 로리법 및 280 ㎚ 에 있어서의 흡광도 (1.4 (OD280) = 이뮤노글로불린 1 ㎎/㎖) 로부터 산출하는 방법에 의해 실시할 수 있다.
또한, (2) 의 (a) 내지 (h) 의 공정을 재차 실시하여 별도로 독립적으로 모노클로날 항체를 취득한 경우에 있어서도, TINA1 항체와 동등한 세포 상해 활성을 갖는 항체를 취득하는 것이 가능하다. 이와 같은 항체의 일례로서, TINA1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 들 수 있다. 새롭게 제조된 모노클로날 항체가, TINA1 항체가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 결합하면, 그 모노클로날 항체가 TINA1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 판정할 수 있다. 또, TINA1 항체의 TROP2 에 대한 결합에 대해 그 모노클로날 항체가 경합하는 (즉, 그 모노클로날 항체가 TINA1 항체와 TROP2 의 결합을 방해한다) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 서열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 그 모노클로날 항체가 항 TROP2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 판정할 수 있다. 에피토프가 동일한 것이 확인된 경우, 그 모노클로날 항체가 TINA1 항체와 동등한 항원 결합능 또는 생물 활성을 갖고 있는 것이 강하게 기대된다.
(3) 그 밖의 항체
본 발명의 항체에는, 상기 TROP2 에 대한 모노클로날 항체에 더하여, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들어, 키메라 (Chimeric) 항체, 인간화 (Humanized) 항체, 인간 항체 등도 포함된다. 이들 항체는, 이미 알려진 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
키메라 항체로는, 항체의 가변 영역과 정상 영역이 서로 이종인 항체, 예를 들어 마우스 또는 래트 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 접합한 키메라 항체를 들 수 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984) 참조).
인간화 항체로는, 상보성 결정 영역 (CDR) 만을 인간 유래의 항체에 삽입한 항체 (Nature (1986) 321, p. 522-525 참조), CDR 이식법에 의해, CDR 의 서열에 더하여 일부의 프레임 워크의 아미노산 잔기도 인간 항체에 이식한 항체 (국제 공개 제90/07861호) 를 들 수 있다.
단, TINA1 항체 유래의 인간화 항체로는, TINA1 항체의 6 종 전부의 CDR 서열을 유지하는 한, 특정한 인간화 항체에 한정되는 경우는 없다. 또한, TINA1 항체의 중쇄 가변 영역은, 서열표의 서열 번호 23 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1 (TAGMQ), 서열 번호 24 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 (WINTHSGVPKYAEDFKG), 및 서열 번호 25 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 (SGFGSSYWYFDV) 를 보유하고 있다. 또, TINA1 항체의 경쇄 가변 영역은, 서열표의 서열 번호 26 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1 (KASQDVSTAVA), 서열 번호 27 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 (SASYRYT), 및 서열 번호 28 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 (QQHYITPLT) 를 보유하고 있다.
마우스 항체 TINA1 의 인간화 항체의 실례로는, (1) 서열표의 서열 번호 12, 14, 또는 16 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열, (2) 상기 (1) 의 아미노산 서열에 대해서 적어도 95 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 (3) 상기 (1) 의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄, 그리고 (4) 서열 번호 18, 20, 또는 22 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열, (5) 상기 (4) 의 아미노산 서열에 대해서 적어도 95 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 (6) 상기 (4) 의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄의 임의의 조합을 들 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서의 「수 개」 란, 1 내지 10 개, 1 내지 9 개, 1 내지 8 개, 1 내지 7 개, 1 내지 6 개, 1 내지 5 개, 1 내지 4 개, 1 내지 3 개, 또는 1 혹은 2 개를 의미한다.
또, 본 명세서에 있어서의 아미노산의 치환으로는 보존적 아미노산 치환이 바람직하다. 보존적 아미노산 치환이란, 아미노산 측사슬에 관련이 있는 아미노산 그룹 내에서 발생하는 치환이다. 적합한 아미노산 그룹은, 이하와 같다:산성 그룹 = 아스파르트산, 글루타민산;염기성 그룹 = 리신, 아르기닌, 히스티딘;비극성 그룹 = 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판;비대전극성 (非帶電極性) 패밀리 = 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 다른 적합한 아미노산 그룹은 다음과 같다:지방족 하이드록시 그룹 = 세린 및 트레오닌;아미드 함유 그룹 = 아스파라긴 및 글루타민;지방족 그룹 = 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신;그리고 방향족 그룹 = 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신. 이러한 아미노산 치환은 원래의 아미노산 서열을 갖는 물질의 특성을 저하시키지 않는 범위에서 실시하는 것이 바람직하다.
상기의 중쇄 및 경쇄의 적합한 조합의 항체로는, 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 중쇄 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 중쇄 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 중쇄 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 중쇄 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 중쇄 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 그리고 서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 중쇄 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
또한 적합한 조합의 항체로는, 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 그리고 서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
우수한 적합한 조합으로는, 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 중쇄 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 그리고 서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 중쇄 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
또, 다른 적합한 조합으로는, 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 20 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 22 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 20 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 22 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 20 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 그리고 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 22 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
우수한 적합한 조합으로는, 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 그리고 서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
더 우수한 적합한 조합으로는, 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 469 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 469 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 469 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체, 그리고 서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 469 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
상기의 중쇄 아미노산 서열 및 경쇄 아미노산 서열과 높은 상동성을 나타내는 서열을 조합함으로써, 상기의 각 항체와 동등한 생물 활성을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다. 이와 같은 상동성은, 일반적으로는 80 % 이상의 상동성이고, 바람직하게는 90 % 이상의 상동성이고, 보다 바람직하게는 95 % 이상의 상동성이며, 가장 바람직하게는 99 % 이상의 상동성이다. 또, 중쇄 또는 경쇄의 아미노산 서열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 조합함으로써도, 상기의 각 항체와 동등한 생물 활성을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다.
2 종류의 아미노산 서열간의 상동성은, Blast algorithm version 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), 「Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs」, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) 의 디폴트 패러미터를 사용함으로써 결정할 수 있다. Blast algorithm 은, 인터넷으로 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast 에 액세스함으로써도 사용할 수 있다.
또한, 서열표의 서열 번호 12, 14, 또는 16 에 나타내는 중쇄 아미노산 서열 중에서, 1 내지 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이며, 141 내지 470 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다. 서열 번호 12 의 서열은 도 3 에, 서열 번호 14 의 서열은 도 4 에, 서열 번호 16 의 서열은 도 5 에 각각 기재되어 있다.
또, 서열표의 서열 번호 18, 20, 또는 22 에 나타내는 경쇄 아미노산 서열 중에서, 1 내지 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이며, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다. 서열 번호 18 의 서열은 도 6 에, 서열 번호 20 의 서열은 도 7 에, 서열 번호 22 의 서열은 도 8 에 각각 기재되어 있다.
본 발명의 항체로는, 또한, TROP2 에 결합하는, 인간 항체를 들 수 있다. 항 TROP2 인간 항체란, 인간 염색체 유래의 항체의 유전자 서열만을 갖는 인간 항체를 의미한다. 항 TROP2 인간 항체는, 인간 항체의 중쇄와 경쇄의 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체 산생 마우스를 사용한 방법 (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p. 133-143;Kuroiwa, Y. et. al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p. 3447-3448;Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects vol. 10, p. 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999.;Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p. 722-727 등을 참조.) 에 의해 취득할 수 있다.
이와 같은 인간 항체 산생 마우스는, 구체적으로는, 내재성 면역 글로블린 중쇄 및 경쇄의 유전자좌가 파괴되고, 대신에 효모 인공 염색체 (Yeast artificial chromosome, YAC) 벡터 등을 통해서 인간 면역 글로블린 중쇄 및 경쇄의 유전자좌가 도입된 유전자 재조합 동물로서, 녹아웃 동물 및 트랜스제닉 동물의 제조 및 이들 동물끼리를 교배함으로써 만들어 낼 수 있다.
또, 유전자 재조합 기술에 의해, 그와 같은 인간 항체의 중쇄 및 경쇄의 각각을 코드하는 cDNA, 바람직하게는 그 cDNA 를 포함하는 벡터에 의해 진핵 세포를 형질 전환하고, 유전자 재조합 인간 모노클로날 항체를 산생하는 형질 전환 세포를 배양함으로써, 이 항체를 배양 상청액 중으로부터 얻을 수도 있다.
여기서, 숙주로는 예를 들어 진핵 세포, 바람직하게는 CHO 세포, 림프구나 미엘로마 등의 포유 동물 세포를 사용할 수 있다.
또, 인간 항체 라이브러리로부터 선별한 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 취득하는 방법 (Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p. 2301-2308;Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p. 189-203;Siriwardena, D. et. al., Ophthalmology (2002) 109 (3), p. 427-431 등 참조.) 도 알려져 있다.
예를 들어, 인간 항체의 가변 영역을 단일사슬 항체 (scFv) 로서 파지 표면에 발현시켜, 항원에 결합하는 파지를 선택하는 파지 디스플레이법 (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105-1116) 을 이용할 수 있다.
항원에 결합함으로써 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다.
항원에 결합하는 scFv 의 DNA 서열이 분명해지면, 당해 서열을 갖는 발현 벡터를 제조하고, 적당한 숙주에 도입하여 발현시킴으로써 인간 항체를 취득할 수 있다 (국제 공개 제92/01047호, 국제 공개 제92/20791호, 국제 공개 제93/06213호, 국제 공개 제93/11236호, 국제 공개 제93/19172호, 국제 공개 제95/01438호, 국제 공개 제95/15388호;Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p. 433-455;Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p. 1105-1116).
새롭게 제조된 인간 항체가, TINA1 항체가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 결합하면, 그 인간 항체가 TINA1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 판정할 수 있다. 또, TINA1 항체의 TROP2 에 대한 결합에 대해 그 인간 항체가 경합하는 (즉, 그 인간 항체가, TINA1 항체와 TROP2 의 결합을 방해한다) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 서열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 그 인간 항체가 TINA1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 판정할 수 있다. 에피토프가 동일한 것이 확인된 경우, 그 인간 항체가 TINA1 항체와 동등한 생물 활성을 갖고 있는 것이 강하게 기대된다.
이상의 방법에 의해 얻어진 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체는, 공지된 방법 등에 의해 항원에 대한 결합성을 평가하고, 적합한 항체를 선발할 수 있다.
항체의 성질을 비교할 때의 다른 지표의 일례로는, 항체의 안정성을 들 수 있다. 시차 주사 칼로리메트리 (DSC) 는, 단백의 상대적 구조 안정성이 좋은 지표가 되는 열 변성 중점 (Tm) 을 재빠르게, 또 정확하게 측정할 수 있는 장치이다. DSC 를 이용하여 Tm 값을 측정하고, 그 값을 비교함으로써, 열 안정성의 차이를 비교할 수 있다. 항체의 보존 안정성은, 항체의 열 안정성과 어느 정도의 상관을 나타내는 것이 알려져 있어 (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p. 265-273), 열 안정성을 지표로 적합한 항체를 선발할 수 있다. 항체를 선발하기 위한 다른 지표로는, 적절한 숙주 세포에 있어서의 수량 (收量) 이 높은 것, 및 수용액 중에서의 응집성이 낮은 것을 들 수 있다. 예를 들어 수량이 가장 높은 항체가 가장 높은 열 안정성을 나타낸다고는 할 수 없기 때문에, 이상에 서술한 지표에 기초하여 종합적으로 판단하여, 인간으로의 투여에 가장 적합한 항체를 선발할 필요가 있다.
본 발명의 항체에는 항체의 수식체도 포함된다. 당해 수식체란, 본 발명의 항체에 화학적 또는 생물학적인 수식이 실시되어 이루어지는 것을 의미한다. 화학적인 수식체에는, 아미노산 골격으로의 화학 부분의 결합, N- 결합 또는 O- 결합 탄수화물 사슬의 화학 수식체 등이 포함된다. 생물학적인 수식체에는, 번역 후 수식 (예를 들어, N- 결합 또는 O- 결합으로의 당사슬 부가, N 말 (末) 또는 C 말의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화) 된 것, 원핵 생물 숙주 세포를 사용하여 발현시킴으로써 N 말에 메티오닌 잔기가 부가한 것 등이 포함된다. 또, 본 발명의 항체 또는 항원의 검출 또는 단리를 가능하게 하기 위해서 표지된 것, 예를 들어, 효소 표지체, 형광 표지체, 어피니티 표지체도 이러한 수식물의 의미에 포함된다. 이와 같은 본 발명의 항체의 수식물은, 항체의 안정성 및 혈중 체류성의 개선, 항원성의 저감, 항체 또는 항원의 검출 또는 단리 등에 유용하다.
또, 본 발명의 항체에 결합하고 있는 당 사슬 수식을 조절하는 것 (글리코실화, 탈푸코오스화 등) 에 의해, 항체 의존성 세포 상해 활성을 증강하는 것이 가능하다. 항체의 당 사슬 수식의 조절 기술로는, 국제 공개 제1999/54342호, 국제 공개 제2000/61739호, 국제 공개 제2002/31140호 등이 알려져 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항체에는 당해 당 사슬 수식이 조절된 항체도 포함된다.
항체 유전자를 일단 단리한 후, 적당한 숙주에 도입하여 항체를 제조하는 경우에는, 적당한 숙주과 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다. 항체 유전자의 구체예로는, 본 명세서에 기재된 항체의 중쇄 서열을 코드하는 유전자, 및 경쇄 서열을 코드하는 유전자를 조합한 것을 들 수 있다. 숙주 세포를 형질 전환할 때에는, 중쇄 서열 유전자와 경쇄 서열 유전자는, 동일한 발현 벡터에 삽입되어 있는 것이 가능하고, 또 별개의 발현 벡터에 삽입되어 있는 것도 가능하다.
진핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포나, 진핵 미생물을 사용할 수 있다. 특히 동물 세포로는, 포유류 세포, 예를 들어, 원숭이 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 선유아 세포 NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) 나 차이니즈·햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디하이드로 엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p. 4126-4220) 를 들 수 있다.
원핵 세포를 사용하는 경우에는, 예를 들어, 대장균, 고초균을 들 수 있다.
이들 세포에 목적으로 하는 항체 유전자를 형질 전환에 의해 도입하고, 형질 전환된 세포를 in vitro 에서 배양함으로써 항체가 얻어진다. 당해 배양에 있어서는 항체의 서열에 따라 수량이 상이한 경우가 있고, 동등한 결합 활성을 갖는 항체 중에서 수량을 지표로 의약으로서의 생산이 용이한 것을 선별하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 항체에는, 상기 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 당해 항체의 제조 방법에 의해 얻어지는 항체도 포함된다.
또한, 포유류 배양 세포에서 생산되는 항체의 중쇄의 카르복실 말단의 리신 잔기가 결실되는 것이 알려져 있고 (Journal of Chromatography A, 705:129-134 (1995)), 또, 동일하게 중쇄 카르복실 말단의 글리신, 리신의 2아미노산 잔기가 결실되고, 새롭게 카르복실 말단에 위치하는 프롤린 잔기가 아미드화되는 것이 알려져 있다 (Analytical Biochemistry, 360:75-83 (2007)). 그러나, 이들 중쇄 서열의 결실 및 수식은, 항체의 항원 결합능 및 이펙터 기능 (보체의 활성화나 항체 의존성 세포 장해 작용 등) 에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명에 관련된 항체에는, 당해 수식을 받은 항체 및 당해 항체의 기능성 단편도 포함되고, 중쇄 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 의 아미노산이 결실된 결실체, 및 아미드화된 당해 결실체 (예를 들어, 카르복실 말단 부위의 프롤린 잔기가 아미드화된 중쇄) 등도 포함된다. 단, 항원 결합능 및 이펙터 기능이 유지되고 있는 한, 본 발명에 관련된 항체의 중쇄의 카르복실 말단의 결실체는 상기의 종류에 한정되지 않는다. 본 발명에 관련된 항체를 구성하는 2 개의 중쇄은, 완전 길이 및 상기의 결실체로 이루어지는 군에서 선택되는 중쇄 중 어느 1 종이어도 되고, 어느 2 종을 조합한 것이어도 된다. 각 결실체의 양 비는 본 발명에 관련된 항체를 산생하는 포유류 배양 세포의 종류 및 배양 조건에 영향을 받을 수 있지만, 본 발명에 관련된 항체의 주성분으로는 2 개의 중쇄의 쌍방에서 카르복실 말단의 하나의 아미노산 잔기가 결실되어 있는 경우를 들 수 있다.
본 발명의 항체의 이소타입으로는, 예를 들어 IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 를 들 수 있다.
항체의 생물 활성으로는, 일반적으로는 항원 결합 활성, 항원과 결합함으로써 그 항원을 발현하는 세포에 내재화하는 활성, 항원의 활성을 중화하는 활성, 항원의 활성을 증강하는 활성, 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성, 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성 및 항체 의존성 세포 매개 식작용 (ADCP) 을 들 수 있지만, 본 발명에 관련된 항체가 갖는 기능은, TROP2 에 대한 결합 활성이며, 바람직하게는 TROP2 와 결합함으로써 TROP2 발현 세포에 내재화하는 활성이다. 또한, 본 발명의 항체는, 세포 내재화 활성에 더하여, ADCC 활성, CDC 활성 및/또는 ADCP 활성을 겸비하고 있어도 된다.
얻어진 항체는, 균일하게까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상적인 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 된다. 예를 들어 칼럼 크로마토그래피, 필터 여과, 한외 여과, 염석 (鹽析), 투석, 조제용 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 적절히 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있지만 (Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996);Antibodies:A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이들에 한정되는 것은 아니다.
크로마토그래피로는, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다.
이들 크로마토그래피는, HPLC 나 FPLC 등의 액체 크로마토그래피를 사용하여 실시할 수 있다.
어피니티 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들어 프로테인 A 칼럼을 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (파르마시아) 등을 들 수 있다.
또 항원을 고정화한 담체를 사용하여, 항원에 대한 결합성을 이용하여 항체를 정제하는 것도 가능하다.
[항종양성 화합물]
본 발명의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트에 결합되는 항종양성 화합물에 대하여 서술한다. 본 발명에서 사용되는 항종양성 화합물로는, 항종양 효과를 갖는 화합물로서, 링커 구조에 결합할 수 있는 치환기, 부분 구조를 갖는 것이면 특별히 제한은 없다. 항종양성 화합물은, 링커의 일부 또는 전부가 종양 세포내에서 절단되어 항종양성 화합물 부분이 유리하여 항종양 효과가 발현된다. 링커가 약물과의 결합 부분에서 절단되면, 항종양성 화합물이 미수식의 구조로 유리되고, 그 본래의 항종양 효과가 발휘된다.
본 발명에서 사용되는 항종양성 화합물로서, 캄프토테신 유도체인 엑사테칸 ((1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리디노[1,2-b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온;다음 식:)
[화학식 14]
를 적합하게 사용할 수 있다. 이 엑사테칸은, 우수한 항종양 활성을 갖고 있기는 하지만, 항종양약으로서 시판되는 데에는 이르지 않았다. 동 화합물은, 공지된 방법으로 용이하게 취득할 수 있으며, 1 위치의 아미노기를 링커 구조로의 결합 부위로서 적합하게 사용할 수 있다. 또, 엑사테칸은 링커의 일부가 결합한 상태에서 종양 세포내에서 유리되는 경우도 있지만, 이와 같은 구조이더라도 우수한 항종양 효과가 발휘되는 우수한 화합물이다.
엑사테칸은 캄프토테신 구조를 가지므로, 산성 수성 매체 중 (예를 들어, pH 3 정도) 에서는 락톤 고리가 형성된 구조 (폐환체 (閉環體)) 로 평형이 치우치고, 한편, 염기성 수성 매체 중 (예를 들어, pH 10 정도) 에서는 락톤 고리가 개환한 구조 (개환체 (開環體)) 로 평형이 치우치는 것이 알려져 있다. 이와 같은 폐환 구조 및 개환 구조에 대응하는 엑사테칸 잔기를 도입한 약물 컨쥬게이트이더라도 동등한 항종양 효과가 기대되며, 어느 상태의 것도 본 발명의 범위에 포함되는 것은 말할 필요도 없다.
다른 항종양성 화합물로서 예를 들어, 독소루비신, 다우노루비신, 마이토마이신 C, 블레오마이신, 시클로시티딘, 빈크리스틴, 빈브라스틴, 메토트렉세이트, 백금계 항종양제 (시스플라틴 또는 그 유도체), 택솔 또는 그 유도체, 그 밖의 캄프토테신 또는 그 유도체 (일본 공개특허공보 평6-87746호에 기재된 항종양제) 등을 들 수 있다.
항체-약물 컨쥬게이트에 있어서, 항체 1 분자에 대한 약물의 결합수는, 그 유효성, 안전성에 영향을 미치는 중요 인자이다. 항체-약물 컨쥬게이트의 제조는, 약물의 결합수가 일정한 수가 되도록, 반응시키는 원료·시약의 사용량 등의 반응 조건을 규정하여 실시되지만, 저분자 화합물의 화학 반응과는 달리, 항체-약물 컨쥬게이트는 상이한 수의 약물이 결합한 혼합물로서 얻어지는 것이 통상적이다. 항체 1 분자에 대한 약물의 결합수는 평균값, 즉, 평균 약물 결합수로서 특정되고, 표기된다. 본 발명에서도 원칙적으로 언급이 없는 한, 즉, 상이한 약물 결합수를 갖는 항체-약물 컨쥬게이트 혼합물에 포함되는 특정한 약물 결합수를 갖는 항체-약물 컨쥬게이트를 나타내는 경우를 제외하고, 약물의 결합수는 평균값을 의미한다. 항체 분자에 대한 엑사테칸의 결합수는 컨트롤 가능하고, 1 항체당 약물 평균 결합수로서, 1 내지 10 개 정도의 엑사테칸을 결합시킬 수 있지만, 바람직하게는 2 내지 8 개이고, 보다 바람직하게는 3 내지 8 개이다. 또한, 당업자이면 본원의 실시예의 기재로부터 항체에 필요한 수의 약물을 결합시키는 반응을 설계할 수 있고, 엑사테칸의 결합수를 컨트롤한 항체-약물 컨쥬게이트를 취득할 수 있다.
[링커 구조]
본 발명의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트에 있어서 항종양성 화합물을 항 TROP2 항체에 결합시키는 링커 구조에 대하여 서술한다. 당해 링커는, 다음 식:
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-
의 구조를 갖고 있으며, 항체는 L1 의 말단 (L2 가 결합하는 것과는 반대측의 말단) 에서 결합하고, 항종양성 화합물은 -La-(CH2)n2-C(=O)- 부분의 카르보닐기로 결합한다.
n1 은, 0 내지 6 의 정수를 나타내지만, 바람직하게는 1 내지 5 의 정수이며, 보다 바람직하게는 1 내지 3 이다.
1. L1
L1 은,
-(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)n3-C(=O)-
의 구조로 나타낸다.
여기서, n3 은, 2 내지 8 의 정수이며, 『-(숙신이미드-3-일-N)-』 는, 다음 식
[화학식 15]
로 나타내는 구조를 갖는다. 이 부분 구조에 있어서의 3 위치가 항 TROP2 항체에 대한 결합 부위이다. 이 3 위치에서의 그 항체와의 결합은, 티오에테르를 형성하여 결합하는 것이 특징이다. 이 구조 부분의 1 위치의 질소 원자는, 이 구조가 포함되는 링커 내에 존재하는 메틸렌의 탄소 원자와 결합한다. 즉, -(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)n3-C(=O)-L2- 는 다음 식으로 나타내는 구조이다 (여기서, 「항체-S-」 는 항체 유래이다.).
[화학식 16]
식 중, n3 은, 2 내지 8 의 정수이지만, 바람직하게는 2 내지 5 이다.
L1 의 구체예로는,
등을 들 수 있다.
2. L2
L2 는,
-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-
로 나타내는 구조이지만, L2 는 존재하지 않아도 되고, 이 경우 L2 는 단결합이 된다. 또, n4 는, 1 내지 6 의 정수이고, 바람직하게는 2 내지 4 이다. L2 는 말단의 아미노기에서 L1 에 결합하고, 반대 말단의 카르보닐기에서 LP 와 결합한다.
L2 의 구체예로는,
등을 들 수 있다.
3. LP
LP 는, 2 내지 7 개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 잔기이다. 즉, 2 내지 7 개의 아미노산이 펩티드 결합한 올리고 펩티드의 잔기에 의해 구성된다. LP 는, N 말단에 있어서 L2 에 결합하고, C 말단에 있어서 링커의 -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 부분의 아미노기에 결합한다.
LP 를 구성하는 아미노산은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, L- 또는 D-아미노산이며, 바람직하게는 L-아미노산이다. 또, α-아미노산 외에, β-알라닌, ε-아미노카프로산, γ-아미노부티르산 등의 구조의 아미노산이어도 되고, 나아가서는 예를 들어 N-메틸화된 아미노산 등의 비천연형의 아미노산이어도 된다.
LP 의 아미노산 서열은, 특별히 한정되지 않지만, 구성하는 아미노산으로서, 페닐알라닌 (Phe;F), 티로신 (Tyr;Y), 류신 (Leu;L), 글리신 (Gly;G), 알라닌 (Ala;A), 발린 (Val;V), 리신 (Lys;K), 시트룰린 (Cit), 세린 (Ser;S), 글루타민산 (Glu;E), 아스파르트산 (Asp;D) 등을 들 수 있다.
이들 중에서 바람직하게는, 페닐알라닌, 글리신, 발린, 리신, 시트룰린, 세린, 글루타민산, 아스파르트산을 들 수 있다. 아미노산의 종류에 따라, 약물 유리의 패턴을 컨트롤 할 수 있다. 아미노산의 수는, 2 내지 7 개여도 된다.
LP 의 구체예로서,
를 들 수 있다. 상기의 『(D-)D』 는 D-아스파르트산을 의미한다. 본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트의 특히 바람직한 LP 로서, -GGFG- 의 테트라펩티드 잔기를 들 수 있다.
4. La-(CH2)n2-C(=O)-
La-(CH2)n2-C(=O)- 에 있어서의 La 는, -O- 의 구조이거나, 또는 단결합이다. n2 는, 0 내지 5 의 정수이지만, 바람직하게는 0 내지 3 이며, 보다 바람직하게는 0 또는 1 이다.
La-(CH2)n2-C(=O)- 로는 이하의 구조의 것을 들 수 있다.
이들 중에서는,
-O-CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2-C(=O)-
인 경우이거나, La 가 단결합이고 n2 가 0 인 경우가 바람직하다.
링커의 -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 로 나타내는 구조의 구체예로서,
등을 들 수 있다.
보다 바람직하게는,
이다.
링커의 -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 는, 사슬 길이로서 4 내지 7 원자의 사슬 길이인 것이 바람직하지만, 더욱 바람직하게는 5 또는 6 원자의 사슬 길이를 갖는 것이다.
본 발명의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트는, 종양 세포내로 이동한 후에는 링커 부분이 절단되고, NH2-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX) 로 나타내는 구조의 약물 유도체가 유리하여 항종양 작용을 발현하는 것으로 생각된다. 본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트로부터 유리되어 항종양 효과를 발현하는 항종양성 유도체로는, 앞서 예시한 링커의 -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 로 나타내는 구조의 말단이 아미노기가 된 구조 부분을 갖는 항종양성 유도체를 들 수 있지만, 특히 바람직한 것은 다음의 것이다.
또한, NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) 의 경우에는 동 분자 내에 있는 아미나르 구조가 불안정하기 때문에, 더욱 자기 분해하여
HO-CH2-C(=O)-(NH-DX)
가 유리되는 것이 확인되었다. 이들 화합물은 본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 중간체로서도 적합하게 사용할 수 있다.
약물을 엑사테칸으로 하는 본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트에 있어서는, 하기 구조의 약물-링커 구조 부분 [-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX)] 를 항체에 결합시킨 것이 바람직하다. 이들 약물-링커 구조 부분은, 1 항체당 평균 결합수로서, 1 내지 10 을 결합시키면 되지만, 바람직하게는 2 내지 8 이고, 보다 바람직하게는 3 내지 8 이다.
이들 중에서 보다 바람직하게는, 다음의 것이다.
더욱 바람직하게는, 다음의 것이다.
본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트에 있어서, 항 TROP2 항체와 약물을 결합하는 링커 구조는, 지금까지 서술한 링커 각 부에 있어서 나타낸 바람직한 구조의 것을 결합함으로써 바람직한 링커를 구축할 수 있다. 이와 같은 링커 구조로서 이하의 구조의 것을 적합하게 사용할 수 있다. 또한 구조의 좌단이 항체와의 결합 부위이고, 우단이 약물과의 결합 부위이다.
이들 중에서 보다 바람직하게는, 다음의 것이다.
더욱 바람직하게는, 다음의 것을 들 수 있다.
[제조 방법]
다음으로, 본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트 혹은 그 제조 중간체의 대표적인 제조 방법에 대하여 설명한다. 또한, 이하에 있어서, 화합물을 나타내기 위해서, 각 반응 식 중에 나타내는 화합물의 번호를 사용한다. 즉, 『식 (1) 의 화합물』, 『화합물 (1)』 등이라고 칭한다. 또 이 이외의 번호의 화합물에 대해서도 동일하게 기재한다.
1. 제조 방법 1
식 (1) 로 나타내는, 티오에테르를 통해서 항체와 약물-링커 구조가 결합되어 있는 항체-약물 컨쥬게이트는, 예를 들어 하기 방법에 의해 제조할 수 있다.
[화학식 17]
[식 중, AB 는, 술프하이드릴기를 갖는 항체를 나타내고, L1' 는, L1 로 나타내는 링커 구조에 있어서, 링커 말단이 말레이미딜기 (다음 식)
[화학식 18]
가 된 구조 (여기서, 질소 원자가 결합 부위로 되어 있다) 를 나타내지만, 구체적으로는, L1 중 -(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)n3-C(=O)- 에 있어서 -(숙신이미드-3-일-N)- 부분이 말레이미딜기가 된 기를 나타낸다. 또, -(NH-DX) 는 다음 식:
[화학식 19]
로 나타내는 구조이며, 엑사테칸의 1 위치의 아미노기의 수소 원자 1 개가 제거되어 생성하는 기를 나타낸다.]
또한, 상기 반응식에 있어서, 식 (1) 의 화합물에서는, 약물로부터 링커 말단까지의 구조 부분 1 개가 1 개의 항체에 대해 결합한 구조로서 해석될 수 있지만, 이것은 설명을 위한 편의적인 기재로서, 실제로는 당해 구조 부분이 항체 분자 1 개에 대해 복수 개가 결합하고 있는 경우가 많다. 이 상황은 이하의 제조 방법의 설명에 있어서도 동일하다.
후술하는 방법에 의해 입수할 수 있는 화합물 (2) 와, 술프하이드릴기를 갖는 항체 (3a) 를 반응시킴으로써, 항체-약물 컨쥬게이트 (1) 을 제조할 수 있다.
술프하이드릴기를 갖는 항체 (3a) 는, 당업자 주지의 방법으로 얻을 수 있다 (Hermanson, G. T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). 예를 들어, Traut's 시약을 항체의 아미노기에 작용시키거나;N-숙신이미딜 S-아세틸티오알카노에이트류를 항체의 아미노기에 작용시킨 후, 하이드록실아민을 작용시키거나;N-숙신이미딜 3-(피리딜디티오)프로피오네이트를 작용시킨 후, 환원제를 작용시키거나;디티오트레이톨, 2-메르캅토에탄올, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀염산염 (TCEP) 등의 환원제를 항체에 작용시켜 항체 내 힌지부의 디술파이드 결합을 환원하여 술프하이드릴기를 생성시키는;등의 방법을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로는, 환원제로서 TCEP 를, 항체 내 힌지부 디술파이드 1 개당에 대해 0.3 내지 3 몰 당량 사용하고, 킬레이트제를 포함하는 완충액 중에서, 항체와 반응시킴으로써, 항체 내 힌지부 디술파이드가 부분적 또는 완전히 환원된 항체를 얻을 수 있다. 킬레이트제로는, 예를 들어 에틸렌디아민4아세트산 (EDTA) 이나 디에틸렌트리아민5아세트산 (DTPA) 등을 들 수 있다. 이들을 1 mM 내지 20 mM 의 농도로 사용하면 된다. 완충액으로는, 인산나트륨이나 붕산나트륨, 아세트산나트륨 용액 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 항체는 4 ℃ 내지 37 ℃ 에서 1 내지 4 시간 TCEP 와 반응시킴으로써 부분적 또는 완전히 환원된 술프하이드릴기를 갖는 항체 (3a) 를 얻을 수 있다.
여기서 술프하이드릴기를 약물-링커 부분에 부가시키는 반응을 실시함으로써 티오에테르 결합에 의해 약물-링커 부분을 결합시킬 수 있다.
술프하이드릴기를 갖는 항체 (3a) 1 개당, 2 내지 20 몰 당량의 화합물 (2) 를 사용하여, 항체 1 개당 2 개 내지 8 개의 약물이 결합한 항체-약물 컨쥬게이트 (1) 을 제조할 수 있다. 구체적으로는, 술프하이드릴기를 갖는 항체 (3a) 를 포함하는 완충액에, 화합물 (2) 를 용해시킨 용액을 첨가하여 반응시키면 된다. 여기서, 완충액으로는, 아세트산나트륨 용액, 인산나트륨이나 붕산나트륨 등을 사용하면 된다. 반응시의 pH 는 5 내지 9 이고, 보다 적합하게는 pH 7 부근에서 반응시키면 된다. 화합물 (2) 를 용해시키는 용매로는, 디메틸술폭시드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸아세트아미드 (DMA), N-메틸-2-피리돈 (NMP) 등의 유기 용매를 사용할 수 있다.
화합물 (2) 를 용해시킨 유기 용매 용액을, 술프하이드릴기를 갖는 항체 (3a) 를 포함하는 완충액에 1 내지 20 % v/v 를 첨가하여 반응시키면 된다. 반응 온도는, 0 내지 37 ℃, 보다 적합하게는 10 내지 25 ℃ 이며, 반응 시간은, 0.5 내지 2 시간이다. 반응은, 미반응의 화합물 (2) 의 반응성을 티올 함유 시약에 의해 실활시킴으로써 종료할 수 있다. 티올 함유 시약은 예를 들어, 시스테인 또는 N-아세틸-L-시스테인 (NAC) 이다. 보다 구체적으로는, NAC 를, 사용한 화합물 (2) 에 대해 1 내지 2 몰 당량 첨가하고, 실온에서 10 내지 30 분 인큐베이트함으로써 반응을 종료할 수 있다.
제조한 항체-약물 컨쥬게이트 (1) 은, 이하의 공통 조작에 의해 농축, 버퍼 교환, 정제, 항체 농도 및 항체 1 분자당 약물 평균 결합수의 측정을 실시하고, 항체-약물 컨쥬게이트 (1) 의 동정을 실시할 수 있다.
공통 조작 A:항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트 수용액의 농축
Amicon Ultra (50,000 MWCO, Millipore Corporation) 의 용기 내에 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트 용액을 넣고, 원심기 (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.) 를 사용한 원심 조작 (2000 G 내지 3800 G 로 5 내지 20 분간 원심) 으로, 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트 용액을 농축하였다.
공통 조작 B:항체의 농도 측정
UV 측정기 (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.) 를 사용하여, 메이커 규정의 방법에 따라, 항체 농도의 측정을 실시하였다. 그 때에, 항체마다 상이한 280 ㎚ 흡광 계수 (1.3 mLmg-1cm-1 내지 1.8 mLmg-1cm-1) 를 사용하였다.
공통 조작 C-1:항체의 버퍼 교환
Sephadex G-25 담체를 사용한 NAP-25 칼럼 (Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) 을, 메이커 규정의 방법에 따라, 염화나트륨 (137 mM) 및 에틸렌디아민4아세트산 (EDTA, 5 mM) 을 포함하는 인산 완충액 (10 mM, pH 6.0;본 명세서에서 PBS 6.0/EDTA 라고 칭한다) 으로 평형화시켰다. 이 NAP-25 칼럼 1 개당, 항체 수용액 2.5 ㎖ 를 얹은 후, PBS 6.0/EDTA 3.5 ㎖ 로 용출시킨 획분 (3.5 ㎖) 을 분취하였다. 이 획분을 공통 조작 A 에 의해 농축하고, 공통 조작 B 를 사용하여 항체 농도의 측정을 실시한 후에, PBS 6.0/EDTA 를 사용하여 10 ㎎/㎖ 로 항체 농도를 조정하였다.
공통 조작 C-2:항체의 버퍼 교환
Sephadex G-25 담체를 사용한 NAP-25 칼럼 (Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) 을, 메이커 규정의 방법에 따라, 염화나트륨 (50 mM) 및 EDTA (2 mM) 를 포함하는 인산 완충액 (50 mM, pH 6.5;본 명세서에서 PBS 6.5/EDTA 라고 칭한다) 으로 평형화시켰다. 이 NAP-25 칼럼 1 개당, 항체 수용액 2.5 ㎖ 를 얹은 후, PBS 6.5/EDTA 3.5 ㎖ 로 용출시킨 획분 (3.5 ㎖) 을 분취하였다. 이 획분을 공통 조작 A 에 의해 농축하고, 공통 조작 B 를 사용하여 항체 농도의 측정을 실시한 후에, PBS 6.5/EDTA 를 사용하여 20 ㎎/㎖ 로 항체 농도를 조정하였다.
공통 조작 D:항체-약물 컨쥬게이트의 정제
시판되는 인산 완충액 (PBS 7.4, Cat. No. 10010-023, Invitrogen), 염화나트륨 (137 mM) 을 포함하는 인산나트륨 완충액 (10 mM, pH 6.0;본 명세서에서 PBS 6.0 이라고 칭한다) 또는 Sorbitol (5 %) 을 포함하는 아세트산 완충액 (10 mM, pH 5.5;본 명세서에서 ABS 라고 칭한다) 중 어느 것의 완충액으로 NAP-25 칼럼을 평형화시켰다. 이 NAP-25 칼럼에, 항체-약물 컨쥬게이트 반응 수용액 (약 1.5 ㎖) 을 얹고, 메이커 규정의 양의 완충액으로 용출시킴으로써, 항체 획분을 분취하였다. 이 분취 획분을 다시 NAP-25 칼럼에 얹고, 완충액으로 용출시키는 겔 여과 정제 조작을 합계 2 내지 3 회 반복함으로써, 미결합의 약물 링커나 저분자 화합물 (트리스(2-카르복시에틸)포스핀염산염 (TCEP), N-아세틸-L-시스테인 (NAC), 디메틸술폭시드) 을 제거한 항체-약물 컨쥬게이트를 얻었다.
공통 조작 E:항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 농도 및 항체 1 분자당 약물 평균 결합수의 측정 (1)
항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 결합 약물 농도는, 항체-약물 컨쥬게이트 수용액의 280 ㎚ 및 370 ㎚ 의 2 파장에 있어서의 UV 흡광도를 측정한 후에 하기의 계산을 실시함으로써, 산출할 수 있다.
어느 파장에 있어서의 전체 흡광도는 계내에 존재하는 모든 흡수 화학종의 흡광도의 합에 동등하기 (흡광도의 가성성) 때문에, 항체와 약물의 컨쥬게이션 전후에 있어서, 항체 및 약물의 몰 흡광 계수에 변화가 없는 것으로 가정하면, 항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 농도 및 약물 농도는, 하기의 관계식으로 나타내어진다.
A280 = AD,280 + AA,280 = εD,280CD +εA,280CA 식 (I)
A370 = AD,370 + AA,370 = εD,370CD +εA,370CA 식 (II)
여기서, A280 은 280 ㎚ 에 있어서의 항체-약물 컨쥬게이트 수용액의 흡광도를 나타내고, A370 은 370 ㎚ 에 있어서의 항체-약물 컨쥬게이트 수용액의 흡광도를 나타내고, AA,280 은 280 ㎚ 에 있어서의 항체의 흡광도를 나타내고, AA,370 은 370 ㎚ 에 있어서의 항체의 흡광도를 나타내고, AD,280 은 280 ㎚ 에 있어서의 컨쥬게이트 전구체의 흡광도를 나타내고, AD,370 은 370 ㎚ 에 있어서의 컨쥬게이트 전구체의 흡광도를 나타내고, εA,280 은 280 ㎚ 에 있어서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εA,370 은 370 ㎚ 에 있어서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD,280 은 280 ㎚ 에 있어서의 컨쥬게이트 전구체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD,370 은 370 ㎚ 에 있어서의 컨쥬게이트 전구체의 몰 흡광 계수를 나타내고, CA 는 항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 농도를 나타내고, CD 는 항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 약물 농도를 나타낸다.
여기서, εA,280, εA,370, εD,280, εD,370 은, 사전에 준비한 값 (계산 추정값 또는 화합물의 UV 측정으로부터 얻어진 실측값) 이 사용된다. 예를 들어, εA,280 은, 항체의 아미노산 서열로부터, 이미 알려진 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423) 에 의해 추정할 수 있다. εA,370 은, 통상적으로 제로이다. εD,280 및 εD,370 은, 사용하는 컨쥬게이트 전구체를 어느 몰 농도로 용해시킨 용액의 흡광도를 측정함으로써, 람베르트-베르의 법칙 (흡광도 = 몰 농도 × 몰 흡광 계수 × 셀 광로 길이) 에 의해 얻을 수 있다. 항체-약물 컨쥬게이트 수용액의 A280 및 A370 을 측정하고, 이들 값을 식 (I) 및 (II) 에 대입하여 연립 방정식을 풀음으로써, CA 및 CD 를 구할 수 있다. 또한 CD 를 CA 로 나눔으로써 1 항체당 약물 평균 결합수를 구할 수 있다.
공통 조작 F:항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당 약물 평균 결합수의 측정 (2)
항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당 약물 평균 결합수는, 전술한 공통 조작 E 에 더하여, 이하의 방법을 이용하는 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석에 의해서도 구할 수 있다.
[F-1. HPLC 분석용 샘플의 조제 (항체-약물 컨쥬게이트의 환원)]
항체-약물 컨쥬게이트 용액 (약 1 ㎎/㎖, 60 ㎕) 을 디티오트레이톨 (DTT) 수용액 (100 mM, 15 ㎕) 과 혼합한다. 혼합물을 37 ℃ 에서 30 분 인큐베이트함으로써, 항체-약물 컨쥬게이트의 L 사슬 및 H 사슬 사이의 디술파이드 결합을 절단한 샘플을, HPLC 분석에 사용한다.
[F-2. HPLC 분석]
HPLC 분석을, 하기의 측정 조건으로 실시한다.
HPLC 시스템:Agilent 1290 HPLC 시스템 (Agilent Technologies)
검출기:자외 흡광도계 (측정 파장:280 ㎚)
칼럼:PLRP-S (2.1 × 50 ㎜, 8 ㎛, 1000 Å;Agilent Technologies, P/N PL1912-1802)
칼럼 온도:80 ℃
이동상 A:0.04 % 트리플루오로아세트산 (TFA) 수용액
이동상 B:0.04 % TFA 를 포함하는 아세토니트릴 용액
그래디언트 프로그램:29 %-36 % (0 분-12.5 분), 36 %-42 % (12.5-15 분), 42 %-29 % (15 분-15.1 분), 29 %-29 % (15.1 분-25 분)
샘플 주입량:15 ㎕
[F-3. 데이터 해석]
[F-3-1] 약물이 결합하고 있지 않은 항체의 L 사슬 (L0) 및 H 사슬 (H0) 에 대해, 약물이 결합한 L 사슬 (약물이 1 개 결합한 L 사슬:L1) 및 H 사슬 (약물이 1 개 결합한 H 사슬:H1, 약물이 2 개 결합한 H 사슬:H2, 약물이 3 개 결합한 H 사슬:H3) 은, 결합한 약물의 수에 비례하여 소수성이 증가하여 유지 시간이 커지기 때문에, L0, L1, H0, H1, H2, H3 의 순서로 용출된다. L0 및 H0 의 유지 시간 비교에 의해 검출 피크를 L0, L1, H0, H1, H2, H3 중 어느 것에 할당할 수 있다.
[F-3-2] 약물 링커에 UV 흡수가 있기 때문에, 약물 링커의 결합수에 따라, L 사슬, H 사슬 및 약물 링커의 몰 흡광 계수를 사용하여 하기 식에 따라 피크 면적값의 보정을 실시한다.
여기서, 각 항체에 있어서의 L 사슬 및 H 사슬의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 는, 이미 알려진 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423) 에 의해, 각 항체의 L 사슬 및 H 사슬의 아미노산 서열로부터 추정되는 값을 사용할 수 있다. hTINA 의 경우, 그 아미노산 서열에 따라, L 사슬의 몰 흡광 계수로서 34690 을, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 95000 을 추정값으로서 사용하였다. 또, 약물 링커의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 는, 각 약물 링커를 메르캅토에탄올 또는 N-아세틸시스테인으로 반응시키고, 말레이미드기를 숙신이미드티오에테르로 변환한 화합물의 실측의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 를 사용하였다.
[F-3-3] 피크 면적 보정값 합계에 대한 각 사슬 피크 면적비 (%) 를 하기 식에 따라 계산한다.
[F-3-4] 항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당 약물 평균 결합수를 하기 식에 따라 계산한다.
약물 평균 결합수 = (L0 피크 면적비 × 0 + L0 피크 면적비 × 1 + H0 피크 면적비 × 0 + H1 피크 면적비 × 1 + H2 피크 면적비 × 2 + H3 피크 면적비 × 3) / 100 × 2
제조 방법 1 에 있어서의 식 (2) 로 나타내는 화합물은 다음 식:
로 나타내는 화합물이다.
식 중,
n3 은, 정수 2 내지 8 을 나타내고,
L2 는, -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 또는 단결합을 나타내고,
여기서, n4 는, 1 내지 6 의 정수를 나타내고,
LP 는, 페닐알라닌, 글리신, 발린, 리신, 시트룰린, 세린, 글루타민산, 아스파르트산에서 선택되는 2 내지 7 개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 잔기를 나타내고,
n1 은, 0 내지 6 의 정수를 나타내고,
n2 는, 0 내지 5 의 정수를 나타내고,
La 는, -O- 또는 단결합을 나타내고,
(말레이미드-N-일)- 는, 다음 식
[화학식 20]
으로 나타내는, 말레이미딜기 (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-일 기) 로서, 질소 원자가 결합 부위로 되어 있는 기이며,
-(NH-DX) 는, 다음 식
[화학식 21]
로 나타내는, 1 위치의 아미노기의 질소 원자가 결합 부위로 되어 있는 기이다.
L2 는, 단결합이거나, -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 인 경우에는 n4 가 정수 2 내지 4 인 것이 제조 중간체로서 바람직하다.
LP 의 펩티드 잔기로는, 페닐알라닌, 글리신, 발린, 리신, 시트룰린, 세린, 글루타민산, 아스파르트산에서 선택되는 아미노산으로 이루어지는 펩티드 잔기인 화합물이 제조 중간체로서 바람직하다. 이와 같은 펩티드 잔기 중, LP 가 4 개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 잔기인 화합물이 제조 중간체로서 바람직하다. 보다 구체적으로는, LP 가 -GGFG- 의 테트라펩티드 잔기인 화합물이 제조 중간체로서 바람직하다.
또, -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- 로는, -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, 또는 -NH-CH2CH2-O-CH2- 인 화합물이 제조 중간체로서 바람직하고, 보다 바람직하게는 -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, 또는 -NH-CH2CH2-O-CH2 인 화합물이다.
또한, 식 (2) 로 나타내는 화합물은, n3 이 정수 2 내지 5 이고, L2 가 단결합이며, -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- 가, -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, 또는 -NH-CH2CH2-O-CH2- 인 화합물이 제조 중간체로서 바람직하다. 보다 바람직하게는, -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- 가, -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, 또는 -NH-CH2CH2-O-CH2- 인 화합물이다. 또한, n3 이, 정수 2 또는 5 인 화합물이 바람직하다.
또, 식 (2) 로 나타내는 화합물은, n3 이 정수 2 내지 5 이고, L2 가 -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 이고, n4 가 정수 2 내지 4 이며, -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- 가, -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, 또는 -NH-CH2CH2-O-CH2- 인 화합물이 제조 중간체로서 바람직하다. 보다 바람직하게는, n4 가 정수 2 또는 4 인 화합물이다. 또한, -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- 가, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, 또는 -NH-CH2CH2-O-CH2- 인 화합물이 바람직하다.
이와 같은 본 발명 화합물의 제조에 유용한 중간체로서 바람직한 것으로는 이하의 것을 예시할 수 있다.
상기의 제조 중간체 화합물의 군에서 선택되는 약물-링커 화합물을, 항 TROP2 항체 또는 그 반응성 유도체와 반응시킴으로써 항 TROP2 항체의 힌지부에 존재하는 디술파이드 결합 부분에 있어서 티오에테르 결합을 형성시켜 본 발명의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트를 제조할 수 있다. 이 경우, 항 TROP2 항체의 반응성 유도체를 사용하는 것이 바람직하고, 특히 항 TROP2 항체를 환원 처리하여 얻어지는 반응성 유도체가 바람직하다.
이하의 것이 제조 중간체로서 보다 바람직한 화합물이다.
또, 상기의 중간체 화합물군 중에서는 다음 식:
으로 나타내는 화합물이 더욱 바람직한 화합물이다.
또한, 컨쥬게이트의 양을 확보하기 위해서, 동일한 조건으로 제조하여 얻어진 평균 약물수가 동일한 정도의 복수의 컨쥬게이트 (예를 들어, ±1 정도) 를 혼합하여 새로운 로트로 할 수 있다. 그 경우, 평균 약물수는 혼합 전의 평균 약물 수의 사이에 들어간다.
2. 제조 방법 2
앞의 제조 방법에서 사용한 중간체인 식 (2) 로 나타내는 화합물 및 그들의 약리상 허용되는 염은 예를 들어 하기 방법에 의해 제조할 수 있다.
[화학식 22]
[식 중, L1' 는 말단 말레이미딜기를 나타내고, P1, P2 및 P3 은 보호기를 나타낸다.]
카르복실산 (5) 를 활성 에스테르, 혼합 산 무수물, 또는 산 할로겐화물 등으로 유도하고, 염기 존재하, NH2-DX (4) 또는 그 약리상 허용되는 염과 반응시킴으로써 화합물 (6) 을 제조할 수 있다. NH2-DX (4) 는, 엑사테칸 (화학명: (1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리디노[1,2-b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온) 을 나타낸다.
이 반응은, 펩티드 합성에 통상적으로 사용하는 반응 시약이나 조건을 준용하면 된다. 활성 에스테르에는 각종의 것이 있지만, 예를 들어 p-니트로페놀 등의 페놀류, N-하이드록시벤조트리아졸 혹은 N-하이드록시숙신이미드 등과 카르복실산 (5) 를 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 혹은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드·염산염 등의 축합제를 사용하여 반응시키면 제조할 수 있다. 또, 활성 에스테르는, 카르복실산 (5) 와 펜타플루오로페닐트리플루오로아세테이트 등의 반응;카르복실산 (5) 와 1-벤조트리아졸릴옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스파이트의 반응;카르복실산 (5) 와 시아노포스폰산디에틸의 반응 (염입법 (鹽入法));카르복실산 (5) 와 트리페닐포스핀 및 2,2'-디피리딜디술파이드의 반응 (무카이야마법);카르복실산 (5) 와 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드 (DMTMM) 등의 트리아진 유도체의 반응;등에 의해서도 제조할 수 있다. 또, 카르복실산 (5) 를 염기 존재하에 염화티오닐, 옥살릴클로라이드 등의 산 할로겐화물로 처리함으로써 제조할 수 있는 산 할라이드법 등에 의해 반응을 실시할 수도 있다.
상기와 같이 얻은 카르복실산 (5) 의 활성 에스테르, 혼합 산 무수물, 또는 산 할로겐화물을 화합물 (4) 와 적당한 염기 존재하에 불활성인 용매 중에서 -78 ℃ ∼ 150 ℃ 의 반응 온도에서 반응시킴으로써 화합물 (6) 을 제조할 수 있다. 또한, 「불활성인 용매」 란, 그 용매가 채용된 반응에 있어서 실시되는 목적이 된 반응을 저해하지 않는 용매를 의미한다.
상기의 각 공정에 사용하는 구체적인 염기로는, 예를 들어, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 나트륨에톡시드, 칼륨부톡시드, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수소화나트륨, 수소화칼륨 등의, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 탄산염, 알콕시드, 수산화물, 또는 수소화물;n-부틸리튬 등의 알킬리튬, 또는 리튬디이소프로필아미드와 같은 디알킬아미노리튬으로 대표되는 유기 금속 염기;리튬비스(트리메틸실릴)아미드 등의 비스실릴아민의 유기 금속 염기;나아가서는 피리딘, 2,6-루티딘, 콜리딘, 4-디메틸아미노피리딘, 트리에틸아민, N-메틸모르폴린, 디이소프로필에틸아민, 디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔 (DBU) 등의 3 급 아민 혹은 함질소 복소 고리 화합물 등의 유기 염기 등을 들 수 있다.
본 반응에 사용하는 불활성인 용매로는, 디클로로메탄, 클로로포름, 4염화탄소 등의 할로겐화 탄화수소계 용매;테트라하이드로푸란, 1,2-디메톡시에탄, 디옥산 등의 에테르계 용매;벤젠, 톨루엔 등의 방향족 탄화수소계 용매;N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리딘-2-온 등의 아미드계 용매;를 들 수 있으며, 이들에 더하여 경우에 따라서는 디메틸술폭시드, 술포란 등의 술폭시드계 용매;아세톤, 메틸에틸케톤 등의 케톤계 용매;메탄올, 에탄올 등의 알코올계의 용매 등을 사용하는 것도 가능하다. 나아가서는 이들을 혼합하여 사용할 수도 있다.
화합물 (6) 의 말단 아미노기의 보호기 P1 로는, tert-부틸옥시카르보닐기나 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기, 벤질옥시카르보닐기 등, 펩티드 합성에 통상적으로 이용되고 있는 아미노기의 보호기를 사용할 수 있다. 다른 아미노기의 보호기로는, 아세틸기 등의 알카노일기;메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기 등의 알콕시카르보닐기;파라메톡시벤질옥시카르보닐기, 파라 (또는 오르토) 니트로벤질옥시카르보닐기 등의 아릴메톡시카르보닐기;벤질기, 트리페닐메틸기 등의 아릴메틸기;벤조일기 등의 아로일기;2,4-디니트로벤젠술포닐기, 오르토니트로벤젠술포닐기 등의 아릴술포닐기;를 들 수 있다. 보호기 P1 은, 아미노기를 보호하는 화합물의 성질 등에 따라 선택하면 된다.
얻어진 화합물 (6) 의 말단 아미노기의 보호기 P1 을 탈보호시킴으로써 화합물 (7) 을 제조할 수 있다. 이 탈보호는, 그 보호기에 따른 시약이나 조건을 선택하면 된다.
N 말단을 P2 로 보호한 펩티드 카르복실산 (8) 을 활성 에스테르, 혼합 산 무수물 등으로 유도하고, 얻어진 화합물 (7) 에 반응시킴으로써, 화합물 (9) 를 제조할 수 있다. 펩티드 카르복실산 (8) 과 화합물 (7) 의 펩티드 결합을 형성하는 반응 조건이나 시약, 염기, 및 불활성인 용매는, 화합물 (6) 의 합성에서 서술한 것에서 적절히 선택하여 사용하면 된다. 보호기 P2 는, 화합물 (6) 의 보호기에서 서술한 것에서 적절히 선택하여 사용하면 되고, 아미노기를 보호하는 화합물의 성질 등에 따라 선택하면 된다. 또, 펩티드 합성에 통상적으로 사용되고 있는 바와 같이, 펩티드 카르복실산 (8) 을 구성하는 아미노산 또는 펩티드를 순차 반응과 탈보호를 반복하고, 신장시켜 화합물 (9) 를 제조할 수도 있다.
얻어진 화합물 (9) 의 아미노기의 보호기 P2 를 탈보호시킴으로써 화합물 (10) 을 제조할 수 있다. 이 탈보호는, 그 보호기에 따른 시약이나 조건을 선택하면 된다.
카르복실산 (11) 을 활성 에스테르, 혼합 산 무수물, 또는 산 할로겐화물 등으로 유도하고, 얻어진 화합물 (10) 에 반응시킴으로써, 화합물 (2) 을 제조할 수 있다. 카르복실산 (11) 과 화합물 (10) 의 펩티드 결합을 형성하는 반응 조건이나 시약, 염기, 및 불활성 용매는, 화합물 (6) 의 합성에서 서술한 것에서 적절히 선택하여 사용하면 된다.
화합물 (9) 는 예를 들어 하기 방법으로도 제조할 수 있다.
N 말단을 P2 로 보호한 펩티드 카르복실산 (8) 을 활성 에스테르, 혼합 산 무수물 등으로 유도하고, 염기 존재하, 카르복실기를 P3 으로 보호한 아민 화합물 (12) 와 반응시킴으로써 화합물 (13) 을 제조할 수 있다. 펩티드 카르복실산 (8) 과 화합물 (12) 의 펩티드 결합을 형성하는 반응 조건이나 시약, 염기, 및 불활성인 용매는, 화합물 (6) 의 합성에서 서술한 것에서 적절히 선택하여 사용하면 된다.
화합물 (13) 의 아미노기의 보호기 P2 는, 통상적으로 사용되는 보호기로 보호되고 있어도 된다.
구체적으로는 수산기의 보호기로는, 메톡시메틸기 등의 알콕시메틸기;벤질기, 4-메톡시벤질기, 트리페닐메틸기 등의 아릴메틸기;아세틸기 등의 알카노일기;벤조일기 등의 아로일기;tert-부틸디페닐실릴기 등의 실릴기;등을 들 수 있다. 카르복실기는, 메틸기, 에틸기, tert-부틸기 등의 알킬기, 알릴기, 또는 벤질기 등의 아릴메틸기와의 에스테르 등으로서 보호할 수 있다. 아미노기는, tert-부틸옥시카르보닐기, 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기 등의 알킬옥시카르보닐기;알릴옥시카르보닐기, 또는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기, 벤질옥시카르보닐기, 파라메톡시벤질옥시카르보닐기, 파라 (또는 오르토) 니트로벤질옥시카르보닐기 등의 아릴메톡시카르보닐기;외에, 아세틸기 등의 알카노일기;벤질기, 트리페닐메틸기 등의 아릴메틸기;벤조일기 등의 아로일기;2,4-디니트로벤젠술포닐기, 오르토니트로벤젠술포닐기 등의 아릴술포닐기;등을 들 수 있다.
카르복실기의 보호기 P3 으로는, 유기 합성 화학, 그 중에서도 펩티드 합성에 있어서 카르복실기의 보호기로서 통상적으로 이용되고 있는 보호기를 사용하면 되고, 구체적으로는 메틸기, 에틸기, tert-부틸 등의 알킬에스테르, 알릴에스테르, 벤질에스테르 등이며, 상기의 보호기로부터 적절히 선택하여 사용하면 된다. 이 경우에, 아미노기의 보호기와 카르복실기의 보호기를 상이한 방법 또는 조건으로 제거할 수 있는 것이 바람직하다. 예를 들어 P2 가 tert-부틸옥시카르보닐기이고, P3 이 벤질기인 조합 등을 대표적인 것으로서 들 수 있다. 그들 보호기는 아미노기와 카르복실기를 보호하는 화합물의 성질 등에 따라 상기 서술한 것에서 선택하면 되고, 그들 보호기의 절단시에도 그 보호기에 따른 시약이나 조건을 선택하면 된다.
얻어진 화합물 (13) 의 카르복실기의 보호기 P3 을 탈보호시킴으로써 화합물 (14) 를 제조할 수 있다. 이 탈보호는, 그 보호기에 따른 시약이나 조건을 선택하면 된다.
얻어진 화합물 (14) 를 활성 에스테르, 혼합 산 무수물, 또는 산 할로겐화물 등으로 유도하고, 염기 존재하, 화합물 (4) 와 반응시킴으로써 화합물 (9) 를 제조할 수 있다. 이 반응은 펩티드 합성에 통상적으로 사용하는 반응 시약이나 조건을 준용하면 되고, 반응 조건이나 시약, 염기, 및 불활성인 용매는 화합물 (6) 의 합성에서 서술한 것에서 적절히 선택하여 사용하면 된다.
화합물 (2) 는, 예를 들어 하기 방법으로도 제조할 수 있다.
화합물 (13) 의 아미노기의 보호기 P2 를 탈보호시킴으로써 화합물 (15) 를 제조할 수 있다. 이 탈보호는, 그 보호기에 따른 시약이나 조건을 선택하면 된다.
카르복실산 유도체 (11) 을 활성 에스테르, 혼합 산 무수물, 또는 산 할로겐화물 등으로 유도하고, 염기 존재하, 얻어진 화합물 (15) 와 반응시킴으로써 화합물 (16) 을 제조할 수 있다. 펩티드 카르복실산 (11) 과 화합물 (15) 의 아미드 결합을 형성하는 반응 조건이나 시약, 염기, 및 불활성인 용매는, 화합물 (6) 의 합성에서 서술한 것에서 적절히 선택하여 사용하면 된다.
얻어진 화합물 (16) 의 카르복실기의 보호기를 탈보호시킴으로써 화합물 (17) 을 제조할 수 있다. 이 탈보호는, 화합물 (14) 의 제조에 있어서의 카르복실기의 탈보호와 동일하게 실시할 수 있다.
화합물 (17) 을 활성 에스테르, 혼합 산 무수물, 또는 산 할로겐화물 등으로 유도하고, 염기 존재하, 화합물 (4) 와 반응시킴으로써 화합물 (2) 를 제조할 수 있다. 이 반응은 펩티드 합성에 통상적으로 사용하는 반응 시약이나 조건을 준용하면 되고, 반응 조건이나 시약, 염기, 및 불활성인 용매는 화합물 (6) 의 합성에서 서술한 것에서 적절히 선택하여 사용하면 된다.
3. 제조 방법 3
중간체의 식 (2) 로 나타내는 화합물은 하기 방법에 의해서도 제조할 수도 있다.
[화학식 23]
[식 중, L1' 는 말단이 말레이미딜기로 변환된 구조의 L1 이며, P4 는 보호기를 나타낸다.]
화합물 (11) 을 활성 에스테르, 혼합 산 무수물 등으로 유도하고, 염기 존재하, C 말단을 P4 로 보호한 펩티드 카르복실산 (18) 과 반응시킴으로써 화합물 (19) 를 제조할 수 있다. 펩티드 카르복실산 (18) 과 화합물 (11) 의 펩티드 결합을 형성하는 반응 조건이나 시약, 염기, 및 불활성인 용매는, 화합물 (6) 의 합성에서 서술한 것에서 적절히 선택하여 사용하면 된다. 화합물 (18) 의 카르복실기의 보호기 P4 는 앞서 서술한 보호기에서 적절히 선택하여 사용하면 된다.
얻어진 화합물 (19) 의 카르복실기의 보호기를 탈보호시킴으로써 화합물 (20) 을 제조할 수 있다. 이 탈보호는, 화합물 (14) 의 제조에 있어서의 카르복실기의 탈보호와 동일하게 실시할 수 있다.
얻어진 화합물 (20) 을 활성 에스테르 또는 혼합 산 무수물 등으로 유도하고, 화합물 (7) 에 반응시킴으로써, 화합물 (2) 를 제조할 수 있다. 이 반응은 펩티드 합성에 통상적으로 사용하는 반응 시약이나 조건을 준용하면 되고, 반응 조건이나 시약, 염기, 및 불활성인 용매는 화합물 (6) 의 합성에서 서술한 것에서 적절히 선택하여 사용하면 된다.
4. 제조 방법 4
이하에, 제조 방법 2 에 기재된 제조 중간체 (10) 중, n1 = 1, La = O 의 화합물 (10b) 의 제조 방법에 대하여 상세히 서술한다. 식 (10b) 로 나타내는 화합물, 그 염 또는 그들의 용매화물은, 예를 들어 하기 방법으로 제조할 수 있다.
[화학식 24]
[식 중, LP 는 상기와 동일한 것을 나타내고, L 은 아실기로서, 아세틸기 등의 알카노일기 혹은 벤조일기 등의 아로일기이거나, 또는 수소 원자 등을 나타내고, X 및 Y 는 1 내지 3 개의 아미노산으로 이루어지는 올리고 펩티드를, P5 및 P7 은 아미노기의 보호기를, P6 은 카르복실기의 보호기를 나타낸다.]
식 (21) 로 나타내는 화합물은, 일본 공개특허공보 2002-60351호에 기재되는 수법이나 문헌 (J. Org. Chem., 51 권, 3196 페이지, 1986년) 기재의 방법, 또는 그 방법을 응용하여, 필요에 따라 보호기의 제거나 관능기 변환을 실시함으로써 제조할 수 있다. 이 외에, 말단 아미노기가 보호된 아미노산 또는 아미노기가 보호된 올리고 펩티드의 산 아미드를 알데히드 또는 케톤과 처리함으로써 얻을 수 있다.
화합물 (21) 을, 불활성인 용매 중, 산 또는 염기 존재하에서 냉각하로부터 실온의 온도 조건으로 수산기를 갖는 화합물 (22) 와 반응시킴으로써, 화합물 (23) 을 제조할 수 있다.
여기서 사용할 수 있는 산으로는 예를 들어, 불화수소산, 염산, 황산, 질산, 인산, 붕산 등의 무기산;아세트산, 시트르산, 파라톨루엔술폰산, 메탄술폰산 등의 유기산;테트라플루오로보레이트, 염화아연, 염화주석, 염화알루미늄, 염화철 등의 루이스산;등을 들 수 있다. 이들 중에서는 술폰산류, 특히 파라톨루엔술폰산이 바람직하다. 또한 염기로는, 이미 서술된 염기 중에서 적절히 선택하여 사용하면 되고, 특히 칼륨 tert-부톡시드 등의 알칼리 금속 알콕시드;수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리 금속 수산화물;수소화나트륨, 수소화칼륨 등의 알칼리 금속 수소화물;리튬디이소프로필아미드 등의 디알킬아미노리튬으로 대표되는 유기 금속 염기;리튬 비스(트리메틸실릴)아미드 등의 비스실릴아민의 유기 금속 염기;등이 바람직하다. 반응에 사용하는 용매로는, 테트라하이드로푸란, 1,4-디옥산 등의 에테르계 용매;벤젠, 톨루엔 등의 방향족 탄화수소계 용매;등이 사용된다. 상기 용매는 물과의 혼합물로 해도 된다. 또, P5 에 예시되는 아미노기의 보호기로는, 통상적으로 아미노기의 보호에 사용되는 기이면 특별히 제한은 없다. 대표적인 것으로서 제조 방법 2 에서 기재한 아미노기의 보호기를 들 수 있지만, 본 반응 중에 있어서 P5 에 예시되는 아미노기의 보호기가 절단되는 경우가 있다. 그 경우에는, 필요에 따라 적당한 아미노기의 보호 시약과 적절히 반응시켜 재차 보호기를 도입하면 된다.
화합물 (24) 는, 화합물 (23) 의 보호기 P6 을 제거함으로써 제조할 수 있다. 여기서, P6 으로서 예시되는 카르복실기의 보호기로는, 제조 방법 2 에 대표적인 것이 기재되어 있으며, 여기에서 적절히 선택할 수 있다. 화합물 (23) 에 있어서는, 아미노기의 보호기 P5 와 카르복실기의 보호기 P6 을 상이한 방법 또는 조건으로 제거할 수 있는 보호기인 것이 바람직하다. 예를 들어, P5 가 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기이고, P6 이 벤질기인 조합 등을 대표적인 것으로서 들 수 있다. 그들 보호기는, 아미노기 및 카르복실기를 보호하는 화합물의 성질 등에 따라 선택하면 되고, 그들 보호기의 제거시에도 그 보호기에 따른 시약이나 조건을 선택하면 된다.
카르복실산 (24) 를 활성 에스테르, 혼합 산 무수물, 또는 산 할로겐화물 등으로 유도하고, 염기 존재하, 화합물 (4) 또는 그 약리상 허용되는 염과 반응시킴으로써 화합물 (25) 를 제조하고, 얻어진 화합물 (25) 의 보호기 P5 를 제거함으로써 화합물 (26) 을 제조할 수 있다. 화합물 (4) 와 카르복실산 (24) 의 반응 및 보호기 P6 을 제거하는 반응에서는, 제조 방법 2 에서 서술한 시약이나 반응 조건과 동일한 것을 사용하면 된다.
화합물 (26) 과 말단 아미노기가 보호된 아미노산 또는 아미노기가 보호된 올리고 펩티드 (27) 을 반응시킴으로써 화합물 (9b) 를 제조하고, 얻어진 화합물 (9b) 의 보호기 P7 을 제거함으로써 화합물 (10b) 를 제조할 수 있다. P7 로서 나타내는 아미노기의 보호기로는, 통상적으로, 아미노기의 보호에 사용되는 기이면 특별히 제한은 없고, 대표적인 것으로서 제조 방법 2 에서 기재한 아미노기의 보호기를 들 수 있으며, 그 제거시에도 보호기에 따른 시약이나 조건을 선택하면 된다. 화합물 (26) 과 화합물 (27) 의 반응에서는, 펩티드 합성에 통상적으로 사용되는 반응 시약이나 조건을 준용하면 된다. 상기 방법으로 제조한 화합물 (10b) 는, 상기 서술한 제조 방법에 따라 본 발명 화합물 (1) 로 유도할 수 있다.
본 발명의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트는, 대기 중에 방치하거나, 또는 재결정하는 등 하여 정제함으로써, 수분을 흡수하여, 흡착수가 부착되거나, 수화물이 되는 경우가 있으며, 그와 같은 물을 포함하는 화합물 및 염도 본 발명에 포함된다.
또, 본 발명에는, 각종 방사성 또는 비방사성 동위체로 라벨된 화합물도 포함된다. 본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트를 구성하는 원자 1 이상에, 원자 동위체의 비천연 비율도 함유할 수 있다. 원자 동위체로는, 예를 들어, 중수소 (2H), 트리튬 (3H), 요오드-125 (125I) 또는 탄소-14 (14C) 등을 들 수 있다. 또, 본 발명 화합물은, 예를 들어, 트리튬 (3H), 요오드-125 (125I) 또는 탄소-14 (14C) 등의 방사성 동위체로 방사성 표지될 수 있다. 방사성 표지된 화합물은, 치료 또는 예방제, 연구 시약, 예를 들어, 어세이 시약, 및 진단제, 예를 들어, 인비보 화상 진단제로서 유용하다. 본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트의 모든 동위체 변이종은, 방사성인지 여부를 묻지 않고, 본 발명의 범위에 포함된다.
[의약]
본 발명의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트는, 암 세포에 대해 세포 상해 활성을 나타내기 때문에, 의약으로서, 특히 암에 대한 치료제 및/또는 예방제로서 사용할 수 있다.
즉 본 발명의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트는, 암 치료의 주요한 치료법인 화학 요법을 위한 약제로서 선택하여 사용할 수 있으며, 그 결과적으로, 암 세포의 성장을 늦추고, 증식을 억제하고, 나아가서는 암 세포를 파괴할 수 있다. 이들에 의해, 암 환자에 있어서, 암에 의한 증상으로부터의 해방이나, QOL 의 개선을 달성할 수 있으며, 암 환자의 생명을 유지하여 치료 효과가 달성된다. 암 세포의 파괴에는 이르지 않는 경우이더라도, 암 세포의 증식의 억제나 컨트롤에 의해 암 환자에 있어서 보다 높은 QOL 을 달성하면서 보다 장기의 생존을 달성시킬 수 있다.
본 발명의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트는, 약물 단독으로의 사용 외에, 애주번트 요법에 있어서 다른 요법과 조합하는 약제로서도 사용할 수 있으며, 외과 수술이나, 방사선 요법, 호르몬 요법 등과 조합할 수 있다. 나아가서는 네오애주번트 요법에 있어서의 약물 요법의 약제로서 사용할 수도 있다.
이상과 같은 치료적 사용 외에, 항체의 항원에 대한 결합성에 의해 미세한 전이 암 세포에 결합하여 암 세포의 증식을 억제하고, 나아가서는 파괴하는 효과도 기대할 수 있다. 즉, 특히 원발성 암 세포에 있어서 TROP2 의 발현이 확인되었을 때에 본 발명의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트를 투여함으로써 암 전이의 억제나, 예방 효과를 기대할 수 있다. 예를 들어, 전이 과정에서 체액 중에 있는 암 세포를 억제, 파괴하는 효과나, 어느 조직에 착상한 직후의 미세한 암 세포에 대한 억제, 파괴 등의 효과를 기대할 수 있다. 또, 특히 외과적인 암의 제거 후에 있어서의 암 전이의 억제, 예방 효과를 기대할 수 있으며, 이들에 의해 암의 전이 억제 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트는, 환자에 대해서는 전신 요법으로서 전신적으로 투여하는 것 외에, 암 조직에 국소적으로 투여하여 치료 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트가 적용되는 암의 종류로는, 폐암, 신암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경교아종, 난소암, 췌암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 자궁경암, 두경부암, 식도암 등을 들 수 있지만, 치료 대상이 되는 암 세포에 있어서 항체-약물 컨쥬게이트 중의 항체를 인식할 수 있는 단백을 발현하고 있는 암 세포이면 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트는, 포유 동물에 대해서 적합하게 투여할 수 있지만, 보다 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트가 포함되는 의약 조성물에 있어서 사용되는 물질로는, 투여량이나 투여 농도에 있어서, 이 분야에 있어서 통상적으로 사용되는 제제 첨가물 그 외로부터 적절히 선택하여 적용할 수 있다.
본 발명의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트는, 1 종 이상의 약학적으로 적합성의 성분을 포함하는 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물은, 대표적으로는, 1 종 이상의 약학적 캐리어 (예를 들어, 멸균한 액체) 를 포함한다. 여기서 액체에는, 예를 들어, 물 및 기름 (석유, 동물 기원, 식물 기원 또는 합성 기원의 기름) 이 포함된다. 기름은, 예를 들어, 낙화생유, 대두유, 광유 (鑛油), 호마유 (胡麻油) 등이어도 된다. 물은, 상기 약학적 조성물이 정맥내 투여되는 경우에, 보다 대표적인 캐리어이다. 식염수 용액, 그리고 덱스트로스 수용액 및 글리세롤 수용액도 또한, 액체 캐리어로서, 특히 주사용 용액을 위해서 사용될 수 있다. 적절한 약학적 부형제는, 당해 분야에서 공지이다. 상기 조성물은 또한, 원한다면, 미량의 습윤제 또는 유화제, 혹은 pH 완충화제를 포함할 수 있다. 적절한 약학적 캐리어의 예는, E. W. Martin 에 의한 「Remington's Pharmaceutical Sciences」 에 기재된다. 그 처방은, 투여의 양태에 대응한다.
각종 송달 시스템이 공지이며, 본 발명의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트를 투여하기 위해서 사용될 수 있다. 도입 방법으로는, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 및 피하의 경로를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 투여는, 예를 들어, 주입 또는 볼러스 주사에 의한 것일 수 있다. 특정한 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 리간드 약물 결합체의 투여는, 주입에 의한 것이다. 비경구적 투여는, 바람직한 투여 경로이다.
대표적 실시형태에 있어서, 상기 약학적 조성물은, 인간에 대한 정맥내 투여에 적합한 약학적 조성물로서, 상습적 순서에 따라 처방된다. 대표적으로는, 정맥내 투여를 위한 조성물은, 멸균의 등장성의 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 상기 의약은 또한, 가용화제 및 주사 부위에서의 동통을 완화시키기 위한 국소 마취제 (예를 들어, 리그노카인) 를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분은, 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰 등에 밀봉하여 시일된 용기 중의 건조 동결 건조 분말 또는 무수의 농축물로서, 별개로, 또는 단위 제형 중에서 함께 혼합하는 것 중 어느 것 하나로 공급된다. 상기 의약이 주입에 의해 투여되는 형태인 경우, 그것은, 예를 들어, 멸균의 제약 그레이드의 물 또는 식염수를 포함하는 주입 보틀로 투약될 수 있다. 상기 의약이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플은, 예를 들어, 상기 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 본원의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트만을 포함하는 의약 조성물이어도 되고, 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트 및 적어도 하나의 이 이외의 암 치료제를 포함하는 의약 조성물이어도 된다. 본 발명의 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트는, 다른 암 치료제와 함께 투여할 수도 있으며, 이에 따라 항암 효과를 증강시킬 수 있다. 이와 같은 목적으로 사용되는 다른 항암제는, 항체-약물 컨쥬게이트와 동시에, 따로따로, 혹은 연속하여 개체에 투여되어도 되며, 각각의 투여 간격을 바꾸어 투여해도 된다. 이와 같은 암 치료제로서, abraxane, paclitaxel, cisplatin, gemcitabine, irinotecan (CPT-11), paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, vinblastin 또는 국제 공개 제2003/038043호에 기재된 약제, 또한 LH-RH 아날로그 (류프로렐린, 고세렐린 등), 에스트라무스틴·포스페이트, 에스트로겐 대항약 (타목시펜, 랄록시펜 등), 아로마타제 저해제 (아나스트로졸, 레트로졸, 액세메스탄 등) 등을 들 수 있지만, 항종양 활성을 갖는 약제이면 한정되는 것은 아니다.
이와 같은 의약 조성물은, 선택된 조성과 필요한 순도를 갖는 제제로서, 동결 건조 제제 혹은 액상 제제로서 제제화하면 된다. 동결 건조 제제로서 제제화할 때에는, 이 분야에 있어서 사용되는 적당한 제제 첨가물이 포함되는 제제여도 된다. 또 액제에 있어서도 동일하게 하여, 이 분야에 있어서 사용되는 각종 제제 첨가물을 포함하는 액상 제제로서 제제화할 수 있다.
의약 조성물의 조성 및 농도는 투여 방법에 따라서도 변화하지만, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항 TROP2 항체-약물 컨쥬게이트는, 항체-약물 컨쥬게이트의 항원에 대한 친화성, 즉, 항원에 대한 해리 상수 (Kd 값) 의 점에 있어서, 친화성이 높을 (Kd 값이 낮을) 수록 소량의 투여량으로도 약효를 발휘시킬 수 있다. 따라서, 항체-약물 컨쥬게이트의 투여량의 결정에 있어서는, 항체-약물 컨쥬게이트와 항원의 친화성의 상황에 기초하여 투여량을 설정할 수도 있다. 본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트를 인간에 대해 투여할 때에는, 예를 들어, 약 0.001 ∼ 100 ㎎/㎏ 을 1 회 혹은 1 ∼ 180 일간에 1 회의 간격으로 복수 회 투여하면 된다.
실시예
이하에 나타내는 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 또, 이들은 어떠한 의미에 있어서도 한정적으로 해석되는 것은 아니다. 또, 본 명세서에 있어서, 특별히 기재가 없는 시약, 용매 및 출발 재료는, 시판되는 공급원으로부터 용이하게 입수 가능하다.
[실시예 1:마우스의 면역과 하이브리도마의 취득]
1-1) 마우스 면역에 사용하는 세포의 준비
5 × 106 개의 NCI-H322 세포 (인간 비소세포 폐암 세포주, ATCC CRL-5806;ATCC:American Type Culture Collection) 를 RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute-1640) 배지 (10 ㎖) 에서 5 일간 배양 후에 회수하고, PBS (인산 완충 생리 식염수) 로 2 회 세정하고, PBS (500 ㎕) 중에 재현탁하였다.
1-2) 마우스에 대한 면역
BALB/c 마우스 (6 주령) 에 대해, 1 회째 면역은 NCI-H322 세포 (1 × 107 개) 를 복강내에 면역하였다. 2 ∼ 5 회째는 1 주간 간격으로 1 × 106 개의 NCI-H322 세포를 복강내에 면역하였다. 6 회째 최종 면역에서는, NCI-H322 세포를 1 × 106 세포/200 ㎕ PBS 로 미정맥 (尾靜脈) 그리고 복강내에 각각 면역하였다. 비장 세포는 최종 면역으로부터 3 일 후에 적출하였다.
1-3) 면역한 마우스의 비장 세포의 준비
면역이 끝난 마우스의 비장을 적출하고, 갈아서 으깨어 RPMI 1640 10 % FBS (우태아 혈청) (+) 배지에 현탁하였다. 세포 현탁액을 셀 스트레이너 (100 ㎛, BD Falcon 사) 에 통과시킨 후, 1500 rpm 으로 5 분간, 실온에서 원심하여 상청액을 폐기하였다. Tris-NH4Cl 용액 (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.83 % NH4Cl;10 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 5 분간 처리하였다. 세포 현탁액에 RPMI 1640 FBS (+) 배지 (10 ㎖) 를 첨가하고, 셀 스트레이너에 통과시킨 후, 1500 rpm 으로 5 분간, 실온에서 원심하였다. 상청액을 폐기하고, 비장 세포를 RPMI 1640 FBS (-) 배지 (10 ㎖) 에서 재현탁하였다.
1-4) 미엘로마 세포의 준비
P3U1 세포 (마우스 미엘로마 세포주) 를 회수하고, 1500 rpm 으로 5 분간, 실온에서 원심하였다. P3U1 세포에 EDTA (0.02 %) 용액 (10 ㎖) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간 처리하였다. P3U1 세포 현탁액을 1500 rpm 으로 5 분간, 실온에서 원심하였다. 상청액을 폐기하고, RPMI 1640 FBS (-) 배지 (10 ㎖) 에서 재현탁하였다.
1-5) 세포 융합
비장 세포와 미엘로마 세포를 5:1 이 되도록 혼합하고, 원심 분리 (1200 rpm, 5 분간) 하였다. 얻어진 침전 획분의 세포군을 잘 푼 후, 교반하면서, 폴리에틸렌글리콜-4000 (PEG-4000;1 ㎖) 을 약 1 분 걸쳐 서서히 첨가하였다. 그 후 그 세포액에 1 분마다 RPMI 배지 (1 ㎖) 를 수 회 첨가한 후, RPMI 배지를 첨가하여 전체량을 50 ㎖ 로 하였다. 그 세포 현탁액을 원심 분리 (900 rpm, 5 분간) 하고, 얻어진 침전 획분의 세포를 천천히 푼 후, HAT 배지 (10 % 우태아 혈청 및 HAT Media Supplement 를 첨가한 MI1640 배지;100 ㎖) 중에 천천히 현탁하였다. 그 현탁액을 96 웰 배양용 플레이트에 200 ㎕/웰씩 분주하고, 37 ℃, 5 % CO2 의 인큐베이터 중에서, 50 % 컨플루언트가 될 때까지 배양하였다.
1-6) 변이형 아데노바이러스 바이러스 FZ33 에서의 하이브리도마의 스크리닝
NCI-H322 세포를, 96 웰 플레이트에 5 × 103 세포/웰로 파종하고, 37 ℃ 에서 48 시간 배양하였다. 세포를 150 ㎕/웰의 PBS 로 2 회 세정하고, 각 웰에 대해, 각 하이브리도마 배양 상청액 (50 ㎕) 을 첨가하고 4 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 150 ㎕/웰의 PBS 로 2 회 세정하고, 아데노바이러스 Ax3CAZ3-FZ33 (항체에 결합하도록 Z33 파이버가 개변된 β-갈락토시다제 발현 아데노바이러스 (미국 특허출원공개 제2012/0237518호 명세서를 참조)) 을 3 × 106 vp/100 ㎕ (1 × 103 vp/세포) 의 농도가 되도록 RPMI 1640 (-) 배지로 희석하고, 이 희석 용액을 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 4 ℃ 에서 1 시간 반응 후, 150 ㎕/웰의 PBS 로 2 회 세정하였다. RPMI 1640 FBS (+) 배지를 100 ㎕/웰로 첨가하여 37 ℃ 에서 24 시간 배양하였다. Galacto-Light Plus Reporter Gene Assay System (Applied Biosystems 사) 을 사용한 β-Gal 리포터 유전자 어세이로 처리한 NCI-H322 세포를 200 ㎕/웰의 PBS 로 세정하고, Lysis Solution 을 50 ㎕/웰로 첨가하여 실온에서 10 분간 정치하였다. 이 세포 용해액 (10 ㎕) 을 Galacton-Plus Galacto Reaction Buffer Diluent 로 100 배로 희석하고, White microwell SH 96 well plate (Nunc 사) 에 첨가하여 실온에서 1 시간 반응시켰다. Accelerator II 를 150 ㎕/웰로 첨가하고, 멀티 라벨 카운터 Wallac 1420ARVOsx (Perkin Elmer 사) 를 사용하여 화학 발광을 5 초간 측정하고, 1 초당 평균값을 RLU (발광량) 로 하여, NCI-H322 세포에 대한 바이러스 감염량을 나타내었다. 이와 같이 실시한 하이브리도마군의 스크리닝에 있어서, 측정값 (RLU) 이 군 전체 (최소값 1383 RLU, 평균값 10914 RLU, 최대값 78746 RLU) 중에서, 5000 RLU 이상인 클론을 선발하였다. 먼저, 1 차 스크리닝으로서, 1 회의 세포 융합으로 얻어진 960 웰의 하이브리도마 웰 중 81 웰의 양성 웰을 선발하였다. 또한, 확인 스크리닝으로서, 1 차 스크리닝과 동일한 수법에 의해, 듀플리케이트 (duplicate) 로 어세이를 실시하여, 양방의 측정값이 5000 RLU 이상인 웰을 양성으로 하고, 1 차 스크리닝으로 얻어진 81 웰로부터 52 웰의 양성 웰을 선발하였다. 선발한 클론은 2 ∼ 4 회 서브 클로닝을 실시하고, 모노클로날 하이브리도마 세포주 44 주를 수립하였다.
[실시예 2:하이브리도마로부터의 항체의 정제]
프리스탄 (Pristane;2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸;0.5 ㎖) 을 복강내 투여하여 미리 2 주간 사육한 8 ∼ 10 주령의 마우스 또는 누드 마우스에, 실시예 1 에서 얻어진 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를 복강내에 주사하였다. 또한, 10 ∼ 21 일 후, 하이브리도마를 복수암화시킨 후에 복수를 채취하였다. 얻어진 복수를 원심 분리하여 고형분을 제거 후, 40 ∼ 50 % 황산암모늄으로 염석하고, 카프릴산 침전법, DEAE-세파로오스 칼럼, 프로테인 G-칼럼에 의한 정제를 실시하고, IgG 또는 IgM 획분을 모아, 정제 모노클로날 항체로 하였다.
[실시예 3:하이브리도마가 산생하는 항체가 결합하는 항원의 동정]
실시예 2 에 있어서 조제된 하이브리도마가 산생하는 항체의 하나인 TINA1 에 대해 항원의 동정을 실시하였다.
3-1) 비오틴 라벨한 세포 표면 단백질의 TINA1 항체를 사용한 면역 침강
5 × 106 개의 NCI-H322 세포를 회수하고, PBS 로 3 회 세정하였다. EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin (PIERCE 사) 을 0.1 ㎎/㎖ 의 농도로 PBS 에 현탁하였다. NCI-H322 세포를 Biotin/PBS 용액 중, 실온에서 30 분간 로테이트한 후에 100 mM 글리신/PBS 용액 (25 ㎖) 으로 2 회 세정하고, 그 후, PBS (25 ㎖) 로 3 회 세정하였다. 세정 후의 세포를 용해 버퍼 (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 1 % NP-40 + Protease inhibitor, Complete EDTA free (Roche 사) 1 립 (粒)/50 ㎖;2 ㎖) 중에 재현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분간 처리하였다. Protein G Sepharose (Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare 사)) 의 버퍼를 용해 버퍼로 치환하여 얻어진 Protein G Sepharose/용해 버퍼 (50 % 슬러리;30 ㎕) 를 세포 용해액에 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 로테이트한 후에 4 ℃ 에서 5 분간 원심하고, 상청액을 회수하였다. 이 상청액에 TINA1 항체 (3 ㎍) 를 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 로테이트한 후에 Protein G Sepharose/용해 버퍼 (50 % 슬러리;60 ㎕) 를 첨가하고, 4 ℃ 에서 2 시간 로테이트하였다. 용해 버퍼 (1 ㎖) 로 Protein G Sepharose 를 6 회 세정한 후에 1 × SDS 샘플 버퍼/5 % 2-ME (2-메르캅토에탄올) buffer (62.5 mM Tris-HCl (25 ℃ 에서 pH 6.8), 2 % (w/v) SDS, 10 % glycerol 및 0.01 % (w/v) phenol red) 에 재현탁하였다. 100 ℃ 에서 5 분간 현탁액을 처리한 후, 용액을 회수하고, SDS-PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기 영동) 를 위한 샘플로 하였다.
3-2) SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅
3-1) 에서 조제한 SDS-PAGE 샘플을 Ready Gels J 5-20 % (BioRad 사) 를 사용하여 20 ㎃ 로 영동한 후, 겔로부터 멤브레인으로 0.1 ㎃/㎠ 로 블로팅하였다. 멤브레인을 PBS-T (PBS(-)-0.05 % Tween20) 로 5 분간 세정한 후, 1 시간 블로킹을 실시하였다. 멤브레인을 PBS-T 로 5 분간 3 회 세정한 후에 Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (Amersham 사;PBS-T 로 2000 배로 희석하여 사용) 와 1 시간 반응시켰다. 멤브레인을 PBS-T 로 10 분간 4 회 세정한 후에, ECL western blotting detection reagents (Amersham 사) 및 Hyperfilm ECL (Amersham 사) 을 사용하여 목적으로 하는 밴드를 검출하였다. 실시예 3-1) 의 순서에 의해 비오틴 라벨한 NCI-H322 세포를, 이미 질량 분석에 의해 항원이 TROP2 인 것이 확정되어 있는 KCI7A3 항체 및 TINA1 항체로 면역 침강하여 얻어진 면역 침강물을, 각각 DTT 비첨가 혹은 DTT 첨가로 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅에 의해 해석하였다. KCI7A3 항체와 TINA1 항체를 사용한 어느 경우에 있어서도, DTT 비첨가에서는 분자량 46 kDa 의 밴드가, DTT 를 첨가한 샘플에서는 분자량 37 kDa 의 밴드가 검출되었다.
3-3) FACS 해석
밴드 패턴으로부터 TINA1 항체의 항원이 TROP2 인 것을 예측할 수 있었기 때문에, 질량 분석을 실시하지 않고 cDNA 의 유전자 도입에 의한 강제 발현 해석을 실시하였다. FACS 해석의 결과, 인간 TROP2 발현 CHOK1 세포에서는 TINA1 항체는 강양성 반응을 나타냈기 때문에, TINA1 항체의 항원은 TROP2 인 것이 나타났다. 또, 폐암 세포주 PC14, 폐암 세포주 NCI-H322, 폐암 세포주 NCI-H2122, 폐암 세포주 LCAM1, 폐암 세포주 LC2/ad, 췌암 세포주 MIAPaCa2, 췌암 세포주 PK-1, 전립선암 세포주 PC3, 대장암 세포주 HCT116, 멜라노마 세포주 A375, 난소암 세포주 SKOV3, 조혈계 종양 세포주 RPMI8226, 조혈계 종양 세포주 K562, PBMC (인간 말초혈 단핵 세포) 및 인간 혈소판을 사용하여 동일한 FACS 해석을 실시하였다. 조사한 폐암 세포주는 모두 TROP2 양성이며, 폐암 이외의 세포주에서는 PC3, PK1, SKOV3 이 양성이었다. 한편, 정상 혈액 세포는 모두 음성이었다.
[실시예 4:항체 내재화 활성의 측정]
4-1) 항체 내재화 활성 평가계
항체의 내재화 및 이뮤노톡신 활성의 측정을 목적으로 리컴비넌트 복합 단백질인 DT3C 를 제조하였다. 이 DT3C 는, 디프테리아 독소 (DT) 의 촉매 영역과 프로테인 G 의 항체 결합 영역을 3 개 겸비한 단백질이다. DT3C 는 항체의 Fc 부분에 특이적으로 결합하여 안정적이고, 세포내에 도입되면, 단백질 합성 저해에 의해 세포사를 유도한다. 이 계 (系) 를 사용함으로써 항체의 내재화와 이뮤노톡신에 의한 살세포 효과를 동시에 관찰할 수 있다 (Yamaguchi, M., Hamada, H., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 454 (2014) 600-603).
4-2) DT3C 에 의한 내재화 그리고 이뮤노톡신 활성의 평가
96 well Plate 에 4 ㎍/㎖ 의 DT3C (25 ㎕) 를 첨가하고, 또한 실시예 1 또는 이것에 준한 방법으로 취득된 11 종의 하이브리도마의 배양 상청액 (25 ㎕) 을 첨가하고, 실온에서 30 분 인큐베이션하였다. 또한, TINA1 항체 산생 하이브리도마 이외의 하이브리도마가 산생하는 항체가 인식하는 항원은, CD9, CD46, CD55, CD59, CD71, CD73, CD147, CD276, EpCAM, 또는 EGFR 인 것을 미리 확인하였다. 2 × 104 개/㎖ (20 % Low IgG FBS 첨가 RPMI 1640 배지) 의 NCI-H322 세포 (50 ㎕) 를 파종하고, 실온에서 30 분 인큐베이션한 후, 37 ℃ CO2 인큐베이터로 3 일간 배양하였다. 배양 후에 상청액을 제거하고, 10 % WST-10 % FBS-RPMI 1640 (100 ㎕) 을 첨가하고, 37 ℃ CO2 인큐베이터 내에서 1 시간 인큐베이션하고, 생세포수를 마이크로 플레이트 리더 (OD450 ∼ OD640, infinite200, 테칸 재팬 주식회사) 로 측정하였다. 평가한 하이브리도마 세포의 배양 상청액 중에서, CD59, CD71, EGFR, EpCAM, 및 TROP2 에 대한 항체에서 강한 내재화 그리고 이뮤노톡신 활성이 확인되었다 (도 10).
4-3) CD59, CD71, EGFR, EpCAM, 및 TROP2 에 대한 항체에서의 내재화 그리고 이뮤노톡신 활성의 차이
96 well plate 에 DT3C (0, 0.004, 0.04, 0.4, 4, 40 ㎍/㎖) 희석 용액 (25 ㎕) 을 첨가하고, 각 항체 (40 ㎍/㎖;25 ㎕) 를 첨가하고, 실온에서 30 분 인큐베이션하였다. 또한, 2 × 104 개/㎖ (20 % Low IgG FBS 첨가 RPMI 1640 배지) 의 NCI-H322 세포 (50 ㎕) 를 파종하고, 실온에서 30 분 인큐베이션한 후, 37 ℃ CO2 인큐베이터로 3 일간 배양하였다. 배양 후에 상청액을 제거하고, 10 % WST-1 첨가 10 % FBS-RPMI 1640 (100 ㎕) 을 첨가하고, 37 ℃ CO2 인큐베이터 내에서 1 시간 인큐베이션하고, 생세포수를 플레이트 리더 (OD450 ∼ OD640) 로 측정하였다. 평가한 항체 중에서, TROP2 에 대한 항체인 TINA1 의 내재화 그리고 이뮤노톡신 활성이 가장 강하였다 (도 11).
4-4) 항 TROP2 항체의 각 클론에 있어서의 내재화 그리고 이뮤노톡신 활성의 차이
실시예 1 또는 이것에 준하여 취득된 TINA1 (면역원:폐암주 NCI-H322), KCL7A3, 및 KCL2D6 (면역원:췌장암주 KCL-MOH1), Pr1E11 및 Pr8H10 (면역원:전립선암주 Pc-1), NY16 및 NY17 (면역원:췌장암주 PK-1) 그리고 시판되는 77220 (R & D System) 의 각 항 TROP2 항체의 내재화 그리고 이뮤노톡신 활성에 대해 실시예 4-3) 과 동일하게 평가하였다. 그 결과, 8 종의 항 TROP2 항체 중에서 TINA1 항체가 가장 강한 활성을 갖고 있었다 (도 12).
[실시예 5:TINA1 항체 유전자의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 결정과 키메라 TINA1 (이하, cTINA1) 항체의 제조]
5-1) TINA1 항체 유전자의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 결정
5-1-1) TINA1 항체 산생 하이브리도마로부터의 mRNA 의 조제
TINA1 항체의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 증폭하기 위해서, TINA1 항체 산생 하이브리도마로부터 mRNA Isolation kit (Roche applied science 사) 를 사용하여 mRNA 를 조제하였다.
5-1-2) cDNA (5'-RACE-Ready cDNA) 의 합성
cDNA (5'-RACE-Ready cDNA) 의 합성은 실시예 5-1-1) 에서 조제한 mRNA (100 ng) 와 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH 사) 를 사용하여 실시하였다.
5-1-3) 5'-RACE PCR 에 의한 TINA1 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 증폭과 서열의 결정
중쇄 유전자의 가변 영역의 cDNA 를 PCR 로 증폭하기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix:SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속), 및 5'-AGAGTTCCAGGTCAAGGTCACTGGCTCAGG-3' (서열 번호 33:프라이머 mG2aVR2) 의 서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드를 사용하였다. UPM 은 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH 사) 에 부속된 것을 사용하고, mG2aVR2 는 데이터베이스의 마우스 중쇄 (IgG2a) 의 정상 영역의 서열로부터 설계하였다.
이 프라이머의 조합과, 실시예 5-1-2) 에서 합성한 cDNA (5'-RACE-Ready cDNA) 를 주형으로 한 5'-RACE PCR 에 의해 TINA1 항체의 중쇄의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 증폭하였다. PCR 은, Polymerase 로서 KOD-plus (TOYOBO 사) 를 사용하고, SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH 사) 의 매뉴얼에 따라, 터치다운 PCR 프로그램으로 실시하였다.
5'-RACE PCR 로 증폭한 중쇄의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN 사) 를 사용하여 정제 후, Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen 사) 를 사용하여 클로닝하고, 클로닝한 중쇄의 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 시퀀스 해석을 실시하였다. 시퀀스 프라이머로서, 데이터베이스의 마우스 중쇄의 정상 영역의 서열로부터 설계한 상기 프라이머 mG2aVR2, 및 NUP (Nested Universal Primer A:SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속) 를 사용하였다.
시퀀스 해석은 유전자 서열 해석 장치 (「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer」 혹은 「Applied Biosystems 3730xl Analyzer」, Applied Biosystems 사) 를 사용하여 실시하고, 시퀀스 반응은, Gene Amp 9700 (Applied Biosystems 사) 을 사용하였다.
결정된 TINA1 항체의 중쇄의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열표의 서열 번호 1 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 2 에 나타내었다.
5-1-4) 5'-RACE PCR 에 의한 TINA1 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 증폭과 서열의 결정
TINA1 항체의 경쇄 유전자의 가변 영역의 cDNA 를 PCR 로 증폭하기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix:SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속) 및 5'-AGTCCAACTGTTCAGGACGCCATTTTGTCG-3' (서열 번호 34:프라이머 mKVR2) 의 서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드를 사용하였다. UPM 은 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH 사) 에 부속된 것을 사용하고, mKVR2 는 데이터베이스의 마우스 경쇄의 정상 영역의 서열로부터 설계하였다.
이 프라이머의 조합과, 실시예 5-1-2) 에서 합성한 cDNA (5'-RACE-Ready cDNA) 를 주형으로 한 5'-RACE PCR 에 의해 TINA1 항체의 경쇄의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 증폭하였다. PCR 은, Polymerase 로서 KOD-Plus- (TOYOBO 사) 를 사용하고, SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH 사) 의 매뉴얼에 따라, 터치다운 PCR 프로그램으로 실시하였다.
5'-RACE PCR 로 증폭한 경쇄의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 MinElute PCR Purification Kit (QIAGEn 사) 를 사용하여 정제 후, Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen 사) 를 사용하여 클로닝하고, 클로닝한 경쇄의 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 시퀀스 해석을 실시하였다.
시퀀스 프라이머로서, 데이터베이스의 마우스 경쇄의 정상 영역의 서열로부터 설계한 상기 프라이머 mKVR2 및 NUP 를 사용하였다.
시퀀스 해석 및 시퀀스 반응에는, 상기 서술한 장치를 사용하였다.
결정된 TINA1 항체의 경쇄의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열표의 서열 번호 3 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 4 에 나타내었다.
5-2) cTINA1 항체의 제조
5-2-1) 키메라 및 인간화 항체 경쇄 발현 벡터 pCMA-LK 의 구축
플라스미드 pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen 사) 를 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 얻어지는 약 5.4 kb 의 프래그먼트와, 서열 번호 5 에 나타내는 인간 κ 사슬 분비 시그널 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을, In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (CLONTECH 사) 를 사용하여 결합하여, pcDNA3.3/LK 를 제조하였다.
pcDNA3.3/LK 를 주형으로 하여, 하기 프라이머 세트로 PCR 을 실시하고, 얻어진 약 3.8 kb 의 프래그먼트를 인산화 후 셀프 라이게이션함으로써 CMV 프로모터의 하류에 시그널 서열, 클로닝 사이트, 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 갖는, 키메라 및 인간화 항체 경쇄 발현 벡터 pCMA-LK 를 구축하였다.
프라이머 세트
5'-tataccgtcgacctctagctagagcttggc-3' (서열 번호 35:프라이머 3.3-F1)
5'-gctatggcagggcctgccgccccgacgttg-3' (서열 번호 36:프라이머 3.3-R1)
5-2-2) 키메라 및 인간화 항체 IgG1 타입 중쇄 발현 벡터 pCMA-G1 의 구축
pCMA-LK 를 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 κ 사슬 분비 시그널 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 DNA 단편과, 서열 번호 6 에 나타내는 인간 중쇄 시그널 서열 및 인간 IgG1 정상 영역의 아미노산을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을, In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (CLONTECH 사) 를 사용하여 결합하여, CMV 프로모터의 하류에 시그널 서열, 클로닝 사이트, 인간 IgG1 중쇄 정상 영역을 갖는 키메라 및 인간화 항체 IgG1 타입 중쇄 발현 벡터 pCMA-G1 을 구축하였다.
5-2-3) cTINA1 항체 중쇄 발현 벡터의 구축
실시예 5-1-3) 에서 얻어진 TINA1 항체의 중쇄의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 템플릿으로 하여, KOD-Plus- (TOYOBO 사) 와 하기의 프라이머 세트로 중쇄의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 포함하는 DNA 단편을 증폭하고, 키메라 및 인간화 IgG1 타입 중쇄 발현 벡터 pCMA-G1 을 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (CLONTECH 사) 를 사용하여 삽입함으로써, cTINA1 항체 중쇄 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1/cTINA1」 이라고 명명하였다. cTINA1 항체 중쇄의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 7 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 8 에 나타내었다. 서열 번호 7 의 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 8 의 아미노산 서열은, 도 1 에도 기재되어 있다.
cTINA1 항체 중쇄용 프라이머 세트
5'-CCAGATGGGTGCTGAGCCAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAG-3' (서열 번호 37:프라이머 TINA1H-F)
5'-CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACGGTGACCGCGGTCCCTGCGCCCCAGAC-3' (서열 번호 38:프라이머 TINA1H-R)
5-2-4) cTINA1 항체 경쇄 발현 벡터의 구축
실시예 5-1-4) 에서 얻어진 TINA1 항체의 경쇄의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 템플릿으로 하여, KOD-Plus- (TOYOBO 사) 와 하기의 프라이머 세트로 경쇄의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 포함하는 DAN 단편을 증폭하고, 키메라 및 인간화 항체 경쇄 발현 범용 벡터 pCMA-LK 를 제한 효소 BsiWI 로 절단한 지점에 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (CLONTECH 사) 를 사용하여 삽입함으로써, cTINA1 항체의 경쇄 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-LK/cTINA1」 이라고 명명하였다. cTINA1 항체의 경쇄의 뉴클레오티드 서열을 서열표의 서열 번호 9 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 10 에 나타내었다. 서열 번호 9 의 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 10 의 아미노산 서열은, 도 2 에도 기재되어 있다.
cTINA1 항체 경쇄용 프라이머 세트
5'-ATCTCCGGCGCGTACGGCGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTC-3' (서열 번호 39:프라이머 TINA1L-F)
5'-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGC-3' (서열 번호 40:프라이머 TINA1L-R)
5-2-5) cTINA1 항체의 소 (小) 스케일 생산
FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 는 매뉴얼에 따라, 계대, 배양을 실시하였다.
대수 (對數) 증식기의 1 × 107 개의 FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 를 FreeStyle293 expression medium (Invitrogen 사) 로 9.6 ㎖ 로 희석한 후에, 30 ㎖ Square Storage Bottle (Nalgene 사) 에 파종하고, 37 ℃, 8 % CO2 인큐베이터 내에서 90 rpm 으로 1 시간 진탕 배양하였다. Polyethyleneimine (Polyscience #24765;30 ㎍) 을 Opti-Pro SFM (Invitrogen 사;200 ㎕) 에 용해하고, 다음으로 PureLink HiPure Plasmid 키트 (Invitrogen 사) 를 사용하여 조제한 경쇄 발현 벡터 (6 ㎍) 및 중쇄 발현 벡터 (4 ㎍) 를 Opti-Pro SFM (Invitrogen 사;200 ㎕) 에 첨가하였다. Polyethyleneimine/Opti-Pro SFM 혼합액 (200 ㎕) 에, 발현 벡터/Opti-Pro SFM 혼합액 (200 ㎕) 을 첨가하여 부드럽게 교반하고, 또한, 5 분간 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 37 ℃, 8 % CO2 인큐베이터로 7 일간, 90 rpm 으로 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청액을 Minisart-Plus filter (Sartorius 사) 로 여과하여 평가용 샘플로 하였다.
pCMA-G1/cTINA1 과 pCMA-LK/cTINA1 의 조합에 의해 취득된 인간 키메라 TINA1 항체를 「cTINA1 항체」 라고 명명하였다.
[실시예 6:마우스 항 TROP2 모노클로날 항체의 인간화 항체의 설계]
6-1) TINA1 의 인간화 버전의 설계
6-1-1) TINA1 의 가변 영역의 분자 모델링
TINA1 의 가변 영역의 분자 모델링은, 상동성 모델링으로서 공지된 방법 (Methods in Enzymology, 203, 121-153 (1991)) 에 의해 실행되었다. Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) 에 등록되는 인간 면역 글로블린의 가변 영역의 1 차 서열 (X 선 결정 구조로부터 유도되는 3 차원 구조가 입수 가능) 을, 앞서 결정된 TINA1 의 가변 영역과 비교하였다. 결과적으로, 1ZEA 가, TINA1 의 중쇄의 가변 영역에 대해 동일하게 프레임 워크 중에 결손이 있는 항체 중에서, 가장 높은 서열 상동성을 갖는다고 해서 선택되었다. 또, 3IU4 가, TINA1 의 경쇄의 가변 영역에 대해 가장 높은 서열 상동성을 갖는다고 해서 선택되었다. 프레임 워크 영역의 3 차원 구조는, TINA1 의 중쇄 및 경쇄에 대응하는 1ZEA 및 3IU4 의 좌표를 조합하여, 「프레임 워크 모델」 을 얻음으로써 제조되었다. 이어서, 각각의 CDR 에 대한 대표적인 컴포메이션이 프레임 워크 모델에 삽입되었다.
마지막으로, 에너지의 점에서 TINA1 의 가변 영역의 가능성이 있는 분자 모델을 얻기 위해서, 불리한 원자간 접촉을 제외하기 위한 에너지 계산을 실시하였다. 상기 순서를, 시판되는 단백질 입체 구조 해석 프로그램 Discovery Studio (Accelrys, Inc.) 을 이용하여 실시하였다.
6-1-2) 인간화 TINA1 에 대한 아미노산 서열의 설계
인간화 TINA1 항체의 구축을, CDR 그래프팅 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 으로서 공지된 방법에 의해 실시하였다. 억셉터 항체는, 프레임 워크 영역 내의 아미노산 상동성에 기초하여 선택되었다. TINA1 의 프레임 워크 영역의 서열을, 항체의 아미노산 서열의 Kabat 데이터베이스 (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001)) 의 모든 인간 프레임 워크와 비교하고, 결과적으로, HuPR1A3 항체가 프레임 워크 영역에 대한 74 % 의 서열 상동성에 기인하여, 억셉터로서 선택되었다. HuPR1A3 에 대한 프레임 워크 영역의 아미노산 잔기를, TINA1 에 대한 아미노산 잔기와 정렬시키고, 상이한 아미노산이 사용되는 위치를 동정하였다. 이들 잔기의 위치는, 위에서 구축된 TINA1 의 3 차원 모델을 사용하여 분석되고, 그리고 억셉터 상에 그래프팅되어야 할 도너 잔기가, Queen et. al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해 부여되는 기준에 의해 선택되었다. 선택된 몇 개의 도너 잔기를 억셉터 항체에 이입함으로써, 인간화 TINA1 서열을 이하의 실시예에 기재되는 바와 같이 구축하였다.
6-2) TINA1 중쇄의 인간화
6-2-1) hTINA1-H1 타입 중쇄:
서열표의 서열 번호 8 에 나타내는 TINA1 중쇄의 아미노산 번호 21 (이소류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 28 (프롤린) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 30 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 35 (글루타민산) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 36 (트레오닌) 을 세린으로, 아미노산 번호 38 (아르기닌) 을 리신으로, 아미노산 번호 39 (이소류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 57 (글루타민) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 58 (리신) 을 글루타민으로, 아미노산 번호 59 (메티오닌) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 62 (리신) 를 글루타민으로, 아미노산 번호 65 (리신) 를 글루타민산으로, 아미노산 번호 67 (이소류신) 을 메티오닌으로, 아미노산 번호 87 (페닐알라닌) 을 발린으로, 아미노산 번호 88 (알라닌) 을 트레오닌으로, 아미노산 번호 89 (페닐알라닌) 를 이소류신으로, 아미노산 번호 91 (류신) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 92 (글루타민산) 를 아스파르트산으로, 아미노산 번호 95 (알라닌) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 102 (이소류신) 를 류신으로, 아미노산 번호 104 (아스파라긴) 를 세린으로, 아미노산 번호 107 (아스파라긴) 을 세린으로, 아미노산 번호 111 (트레오닌) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 112 (트레오닌) 를 발린으로, 아미노산 번호 114 (페닐알라닌) 를 티로신으로, 아미노산 번호 132 (알라닌) 를 글루타민으로, 아미노산 번호 135 (알라닌) 를 류신으로, 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 TINA1 중쇄를 「hTINA1-H1 타입 중쇄」 라고 명명하였다.
hTINA1-H1 타입 중쇄의 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 12 에 기재되어 있다. 서열 번호 12 의 아미노산 서열의 1 내지 19 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 서열, 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 141 내지 470 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 중쇄 가변 영역, 중쇄 정상 영역에 상당한다. 서열 번호 12 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열표의 서열 번호 11 에 기재되어 있다. 서열 번호 11 의 뉴클레오티드 서열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 421 내지 1410 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 중쇄 가변 영역 서열, 중쇄 정상 영역 서열을 코드하고 있다. 서열 번호 11 의 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 12 의 아미노산 서열은, 도 3 에도 기재되어 있다.
6-2-2) hTINA1-H2 타입 중쇄:
서열표의 서열 번호 8 에 나타내는 TINA1 중쇄의 아미노산 번호 21 (이소류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 28 (프롤린) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 30 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 35 (글루타민산) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 36 (트레오닌) 을 세린으로, 아미노산 번호 38 (아르기닌) 을 리신으로, 아미노산 번호 39 (이소류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 57 (글루타민) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 58 (리신) 을 글루타민으로, 아미노산 번호 59 (메티오닌) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 62 (리신) 를 글루타민으로, 아미노산 번호 65 (리신) 를 글루타민산으로, 아미노산 번호 67 (이소류신) 을 메티오닌으로, 아미노산 번호 87 (페닐알라닌) 을 발린으로, 아미노산 번호 88 (알라닌) 을 트레오닌으로, 아미노산 번호 89 (페닐알라닌) 를 이소류신으로, 아미노산 번호 92 (글루타민산) 를 아스파르트산으로, 아미노산 번호 95 (알라닌) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 102 (이소류신) 를 류신으로, 아미노산 번호 104 (아스파라긴) 를 세린으로, 아미노산 번호 107 (아스파라긴) 을 세린으로, 아미노산 번호 111 (트레오닌) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 112 (트레오닌) 를 발린으로, 아미노산 번호 114 (페닐알라닌) 를 티로신으로, 아미노산 번호 132 (알라닌) 를 글루타민으로, 아미노산 번호 135 (알라닌) 를 류신으로, 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 TINA1 중쇄를 「hTINA1-H2 타입 중쇄」 라고 명명하였다.
hTINA1-H2 타입 중쇄의 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 14 에 기재되어 있다. 서열 번호 14 의 아미노산 서열의 1 내지 19 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 서열, 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 141 내지 470 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 중쇄 가변 영역, 중쇄 정상 영역에 상당한다. 서열 번호 14 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열표의 서열 번호 13 에 기재되어 있다. 서열 번호 13 의 뉴클레오티드 서열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 421 내지 1410 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 중쇄 가변 영역 서열, 중쇄 정상 영역 서열을 코드하고 있다. 서열 번호 13 의 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 14 의 아미노산 서열은, 도 4 에도 기재되어 있다.
6-2-3) hTINA1-H3 타입 중쇄:
서열표의 서열 번호 8 에 나타내는 TINA1 중쇄의 아미노산 번호 28 (프롤린) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 30 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 36 (트레오닌) 을 세린으로, 아미노산 번호 38 (아르기닌) 을 리신으로, 아미노산 번호 39 (이소류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 58 (리신) 을 글루타민으로, 아미노산 번호 65 (리신) 를 글루타민산으로, 아미노산 번호 67 (이소류신) 을 메티오닌으로, 아미노산 번호 87 (페닐알라닌) 을 발린으로, 아미노산 번호 88 (알라닌) 을 트레오닌으로, 아미노산 번호 92 (글루타민산) 를 아스파르트산으로, 아미노산 번호 95 (알라닌) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 102 (이소류신) 를 류신으로, 아미노산 번호 104 (아스파라긴) 를 세린으로, 아미노산 번호 107 (아스파라긴) 을 세린으로, 아미노산 번호 111 (트레오닌) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 112 (트레오닌) 를 발린으로, 아미노산 번호 114 (페닐알라닌) 를 티로신으로, 아미노산 번호 132 (알라닌) 를 글루타민으로, 아미노산 번호 135 (알라닌) 를 류신으로, 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 TINA1 중쇄를 「hTINA1-H3 타입 중쇄」 라고 명명하였다.
hTINA1-H3 타입 중쇄의 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 16 에 기재되어 있다. 서열 번호 16 의 아미노산 서열의 1 내지 19 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 서열, 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 141 내지 470 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 중쇄 가변 영역, 중쇄 정상 영역에 상당한다. 서열 번호 16 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열표의 서열 번호 15 에 기재되어 있다. 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 421 내지 1410 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 중쇄 가변 영역 서열, 중쇄 정상 영역 서열을 코드하고 있다. 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 16 의 아미노산 서열은, 도 5 에도 기재되어 있다.
6-3) TINA1 경쇄의 인간화
6-3-1) hTINA1-L1 타입 경쇄:
서열표의 서열 번호 10 에 나타내는 TINA1 경쇄의 아미노산 번호 23 (발린) 을 글루타민으로, 아미노산 번호 28 (히스티딘) 을 프롤린으로, 아미노산 번호 29 (리신) 를 세린으로, 아미노산 번호 30 (페닐알라닌) 을 세린으로, 아미노산 번호 31 (메티오닌) 을 류신으로, 아미노산 번호 33 (트레오닌) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 40 (세린) 을 트레오닌으로, 아미노산 번호 62 (글루타민) 를 리신으로, 아미노산 번호 63 (세린) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 80 (아스파르트산) 을 세린으로, 아미노산 번호 83 (트레오닌) 을 세린으로, 아미노산 번호 90 (알라닌) 을 아스파르트산으로, 아미노산 번호 93 (페닐알라닌) 을 류신으로, 아미노산 번호 98 (발린) 을 류신으로, 아미노산 번호 100 (알라닌) 을 프롤린으로, 아미노산 번호 103 (류신) 을 페닐알라닌으로, 아미노산 번호 120 (알라닌) 을 글루타민으로, 아미노산 번호 126 (류신) 을 이소류신으로, 아미노산 번호 129 (알라닌) 를 트레오닌으로, 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 TINA1 경쇄을 「hTINA1-L1 타입 경쇄」 라고 명명하였다.
hTINA1-L1 타입 경쇄의 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 18 에 기재되어 있다. 서열 번호 18 의 아미노산 서열의 1 내지 20 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 서열, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 서열 번호 18 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열표의 서열 번호 17 에 기재되어 있다. 서열 번호 17 의 뉴클레오티드 서열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 경쇄 가변 영역 서열, 경쇄 정상 영역 서열을 코드하고 있다. 서열 번호 17 의 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 18 의 아미노산 서열은, 도 6 에도 기재되어 있다.
6-3-2) hTINA1-L2 타입 경쇄:
서열표의 서열 번호 10 에 나타내는 TINA1 경쇄의 아미노산 번호 28 (히스티딘) 을 프롤린으로, 아미노산 번호 29 (리신) 를 세린으로, 아미노산 번호 30 (페닐알라닌) 을 세린으로, 아미노산 번호 31 (메티오닌) 을 류신으로, 아미노산 번호 33 (트레오닌) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 40 (세린) 을 트레오닌으로, 아미노산 번호 62 (글루타민) 를 리신으로, 아미노산 번호 63 (세린) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 80 (아스파르트산) 을 세린으로, 아미노산 번호 83 (트레오닌) 을 세린으로, 아미노산 번호 90 (알라닌) 을 아스파르트산으로, 아미노산 번호 93 (페닐알라닌) 을 류신으로, 아미노산 번호 98 (발린) 을 류신으로, 아미노산 번호 100 (알라닌) 을 프롤린으로, 아미노산 번호 103 (류신) 을 페닐알라닌으로, 아미노산 번호 120 (알라닌) 을 글루타민으로, 아미노산 번호 126 (류신) 을 이소류신으로, 아미노산 번호 129 (알라닌) 를 트레오닌으로, 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 TINA1 경쇄을 「hTINA1-L2 타입 경쇄」 라고 명명하였다.
hTINA1-L2 타입 경쇄의 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 20 에 기재되어 있다. 서열 번호 20 의 아미노산 서열의 1 내지 20 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 서열, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 서열 번호 20 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열표의 서열 번호 19 에 기재되어 있다. 서열 번호 19 의 뉴클레오티드 서열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 경쇄 가변 영역 서열, 경쇄 정상 영역 서열을 코드하고 있다. 서열 번호 19 의 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 20 의 아미노산 서열은, 도 7 에도 기재되어 있다.
6-3-3) hTINA1-L3 타입 경쇄:
서열표의 서열 번호 10 에 나타내는 TINA1 경쇄의 아미노산 번호 28 (히스티딘) 을 프롤린으로, 아미노산 번호 29 (리신) 를 세린으로, 아미노산 번호 30 (페닐알라닌) 을 세린으로, 아미노산 번호 31 (메티오닌) 을 류신으로, 아미노산 번호 33 (트레오닌) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 40 (세린) 을 트레오닌으로, 아미노산 번호 62 (글루타민) 를 리신으로, 아미노산 번호 63 (세린) 을 글루타민으로, 아미노산 번호 80 (아스파르트산) 을 세린으로, 아미노산 번호 83 (트레오닌) 을 세린으로, 아미노산 번호 90 (알라닌) 을 아스파르트산으로, 아미노산 번호 93 (페닐알라닌) 을 류신으로, 아미노산 번호 98 (발린) 을 류신으로, 아미노산 번호 100 (알라닌) 을 프롤린으로, 아미노산 번호 103 (류신) 을 페닐알라닌으로, 아미노산 번호 120 (알라닌) 을 글루타민으로, 아미노산 번호 126 (류신) 을 이소류신으로, 아미노산 번호 129 (알라닌) 를 트레오닌으로, 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 TINA1 경쇄을 「hTINA1-L3 타입 경쇄」 라고 명명하였다.
hTINA1-L3 타입 경쇄의 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 22 에 기재되어 있다. 서열 번호 22 의 아미노산 서열의 1 내지 20 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 서열, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 서열 번호 22 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열표의 서열 번호 21 에 기재되어 있다. 서열 번호 21 의 뉴클레오티드 서열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이, 각각 시그널 서열, 경쇄 가변 영역 서열, 경쇄 정상 영역 서열을 코드하고 있다. 서열 번호 21 의 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 22 의 아미노산 서열은, 도 8 에도 기재되어 있다.
[실시예 7:hTINA1 항체 발현 벡터의 구축과 항체의 생산]
7-1) hTINA1 의 중쇄 발현 벡터의 구축
7-1-1) hTINA1-H1 발현 벡터의 구축
서열표의 서열 번호 11 에 나타내는 hTINA1-H1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 437 에 나타내는 hTINA1-H1 의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 합성한 DNA 단편을 템플릿으로 하여, KOD-Plus- (TOYOBO 사) 와 하기의 프라이머 세트로 hTINA1-H1 의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 증폭하고, 키메라 및 인간화 항체 IgG1 타입 중쇄 발현 벡터 pCMA-G1 을 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (CLONTECH 사) 를 사용하여 삽입함으로써 hTINA1-H1 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1/hTINA1-H1」 이라고 명명하였다.
프라이머 세트
5'-agctcccagatgggtgctgagc-3' (서열 번호 41:프라이머 EG-Inf-F)
5'-gggcccttggtggaggctgagc-3' (서열 번호 42:프라이머 EG1-Inf-R)
7-1-2) hTINA1-H2 발현 벡터의 구축
서열표의 서열 번호 13 에 나타내는 hTINA1-H2 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 437 에 나타내는 hTINA1-H2 의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하고 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스), 실시예 7-1-1) 과 동일한 방법으로 hTINA1-H2 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1/hTINA1-H2」 라고 명명하였다.
7-1-3) hTINA1-H3 발현 벡터의 구축
서열표의 서열 번호 15 에 나타내는 hTINA1-H3 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 437 에 나타내는 hTINA1-H3 의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하고 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스), 실시예 7-1-1) 과 동일한 방법으로 hTINA1-H3 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1/hTINA1-H3」 이라고 명명하였다.
7-2) hTINA1 의 경쇄 발현 벡터의 구축
7-2-1) hTINA1-L1 발현 벡터의 구축
서열표의 서열 번호 17 에 나타내는 hTINA1-L1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 38 내지 402 에 나타내는 hTINA1-L1 의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 합성한 DNA 단편을 템플릿으로 하여, KOD-Plus- (TOYOBO 사) 와 하기의 프라이머 세트로 hTINA1-L1 의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 증폭하고, 키메라 및 인간화 항체 경쇄 발현 벡터 pCMA-LK 를 제한 효소 BsiWI 로 절단한 지점에 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (CLONTECH 사) 를 사용하여 삽입함으로써 hTINA1-L1 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-LK/hTINA1-L1」 이라고 명명하였다.
프라이머 세트
5'-ctgtggatctccggcgcgtacggc-3' (서열 번호 43:프라이머 CM-LKF)
5'-ggagggggcggccaccgtacg-3' (서열 번호 44:프라이머 KCL-Inf-R)
7-2-2) hTINA1-L2 발현 벡터의 구축
서열표의 서열 번호 19 에 나타내는 hTINA1-L2 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 38 내지 402 에 나타내는 hTINA1-L2 의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하고 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스), 실시예 7-2-1) 과 동일한 방법으로 hTINA1-L2 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-LK/hTINA1-L2」 라고 명명하였다.
7-2-3) hTINA1-L3 발현 벡터의 구축
서열표의 서열 번호 21 에 나타내는 hTINA1-L3 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 38 내지 402 에 나타내는 hTINA1-L3 의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하고 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스), 실시예 7-2-1) 과 동일한 방법으로 hTINA1-L3 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-LK/hTINA1-L3」 이라고 명명하였다.
7-3) hTINA1 항체의 생산과 정제
7-3-1) hTINA1 항체의 소 스케일 생산
실시예 5-2-5) 와 동일한 방법으로 생산하였다.
pCMA-G1/hTINA1-H1 과 pCMA-LK/hTINA1-L1 의 조합에 의해 취득된 hTINA1 항체를 「hTINA1-H1L1」, pCMA-G1/hTINA1-H2 와 pCMA-LK/hTINA1-L1 의 조합에 의해 취득된 hTINA1 항체를 「hTINA1-H2L1」, pCMA-G1/hTINA1-H2 와 pCMA-LK/hTINA1-L2 의 조합에 의해 취득된 hTINA1 항체를 「hTINA1-H2L2」, 및 pCMA-G1/hTINA1-H3 과 pCMA-LK/hTINA1-L3 의 조합에 의해 취득된 hTINA1 항체를 「hTINA1-H3L3」 이라고 명명하였다.
7-3-2) hTINA1 항체의 생산
hTINA1-H1L1, hTINA1-H2L1, hTINA1-H2L2, 및 hTINA1-H3L3 을 이하의 방법으로 생산하였다.
FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 는 매뉴얼에 따라, 계대, 배양을 실시하였다. 대수 증식기의 1.2 × 109 개의 FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 를 3L Fernbach Erlenmeyer Flask (CORNING 사) 에 파종하고, FreeStyle 293 expression medium (Invitrogen 사) 로 희석하여 1.0 × 106 세포/㎖ 로 조제한 후에, 37 ℃, 8 % CO2 인큐베이터 내에서 90 rpm 으로 1 시간 진탕 배양하였다. Polyethyleneimine (Polyscience #24765;3.6 ㎎) 을 Opti-Pro SFM (Invitrogen 사;20 ㎖) 에 용해하고, 다음으로 PureLink HiPure Plasmid 키트 (Invitrogen 사) 를 사용하여 조제한 경쇄 발현 벡터 (0.8 ㎎) 및 중쇄 발현 벡터 (0.4 ㎎) 를 Opti-Pro SFM (Invitrogen 사;20 ㎖) 에 첨가하였다. Polyethyleneimine/Opti-Pro SFM 혼합액 (20 ㎖) 에, 발현 벡터/Opti-Pro SFM 혼합액 (20 ㎖) 을 첨가하여 부드럽게 교반하고, 또한 5 분간 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 37 ℃, 8 % CO2 인큐베이터로 7 일간, 90 rpm 으로 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청액을 Disposable Capsule Filter (ADVANTE #CCS-045-E1H) 로 여과하였다.
7-3-3) hTINA1 항체의 정제
상기 7-3-2) 에서 얻어진 배양 상청액으로부터 항체를, rProteinA 어피니티 크로마토그래피 (4-6 ℃) 와 세라믹 하이드록시아파타이트 (실온) 의 2 단계 공정으로 정제하였다. rProteinA 어피니티 크로마토그래피 정제 후와 세라믹 하이드록시아파타이트 정제 후의 버퍼 치환 공정은 4-6 ℃ 에서 실시하였다. 처음에, 배양 상청액을, PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap 칼럼) 에 어플라이하였다. 배양 상청액이 칼럼에 모두 들어간 후, 칼럼 용량 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 용출하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 PBS 로 치환한 후, 5 mM 인산나트륨/50 mM MES/pH 7.0 의 버퍼로 5 배 희석한 항체 용액을, 5 mM NaPi/50 mM MES/30 mM NaCl/pH 7.0 의 버퍼로 평형화된 세라믹 하이드록시아파타이트 칼럼 (닛폰 바이오라드, Bio-Scale CHTType-I Hydroxyapatite Column) 에 어플라이하였다. 염화나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출을 실시하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 HBSor (25 mM 히스티딘/5 % 소르비톨, pH 6.0) 로의 액 치환을 실시하였다. 마지막으로 Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사, 4 ℃) 으로 농축하고, IgG 농도를 20 ㎎/㎖ 이상으로 조제하고 정제 샘플로 하였다.
[참고예 1:hRS7 항체 발현 벡터의 제조과 항체의 생산]
hRS7 항체는, 국제 공개 제2003/074566호에 기재되어 있는 경쇄, 및 중쇄의 아미노산 서열을 기초로 제조하였다.
1-1) hRS7 항체 중쇄 발현 벡터의 구축
서열표의 서열 번호 29 에 나타내는 hRS7 항체 중쇄의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 437 에 나타내는 hRS7 항체 중쇄의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하고 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스), 실시예 7-1-1) 과 동일한 방법으로 hRS7 항체 중쇄 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1/hRS7」 이라고 명명하였다. hRS7 항체 중쇄의 아미노산 서열을 서열표의 서열 번호 30 에 나타내었다.
1-2) hRS7 항체 경쇄 발현 벡터의 구축
서열표의 서열 번호 31 에 나타내는 hRS7 항체 경쇄의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 38 내지 402 에 나타내는 hRS7 항체 경쇄의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하고 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스), 실시예 7-2-1) 과 동일한 방법으로 hRS7 항체 경쇄 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-LK/hRS7」 이라고 명명하였다. hRS7 항체 중쇄의 아미노산 서열을 서열표의 서열 번호 32 에 나타내었다.
1-3) hRS7 항체의 생산과 정제
1-3-1) hRS7 항체의 생산
hRS7 항체는 pCMA-G1/hRS7 과 pCMA-LK/hRS7 의 조합에 의해 실시예 7-3-2) 와 동일한 방법으로 생산하였다.
1-3-2) hRS7 항체의 정제
상기 1-3-1) 에서 얻어진 배양 상청액으로부터 실시예 7-3-3) 과 동일한 방법으로 정제하였다.
[실시예 8:hTINA1 항체 및 hRS7 항체의 항원 결합능의 측정]
8-1) 소 스케일 생산의 항체 (배양 상청액) 를 사용한 항원 결합능의 측정
항체와 항원 (Recombinant Human TROP-2 Fcchimera) 의 해리 상수 측정은, Biacore 3000 (GE 헬스케어 바이오사이언스 (주)) 을 사용하고, 고정화한 항인간 IgG (Fab) 항체에 항체를 리간드로서 포착 (캡처) 하고, 항원을 아날라이트로서 측정하는 캡처법으로 실시하였다. 항인간 IgG (Fab) 항체 (Human Fab capture kit, GE 헬스케어 바이오사이언스 (주)) 는, 센서 칩 CM5 (BIAcore, Inc.) 에 아민 커플링법으로 약 2000 RU 공유 결합시켰다. 레퍼런스 셀에도 동일하게 고정화하였다. 러닝 버퍼로서 HBS-EP+ (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05 % Surfactant P20) 를 사용하였다. 항인간 IgG (Fab) 항체를 고정화한 칩 상에, 항체를 포함하는 배양 상청액을 약 80 초간 첨가한 후, 항원의 희석 계열 용액 (1-1000 nM) 을 유속 30 ㎕/분으로 300 초간 첨가하고, 계속해서 600 초간의 해리상을 모니터하였다. 재생 용액으로서, 20 % DMSO 를 포함하는 10 mM Gly-HCl pH 1.5 를 유속 10 ㎕/분으로 60 초간 첨가하였다. 데이터 해석에는, 분석 소프트웨어 (BIAevaluation software, version 4.1) 의 Bivalent 결합 모델을 사용하여, 결합 속도 상수 kon, 해리 속도 상수 koff 및 해리 상수 (KD;KD = koff/kon) 를 산출하였다.
8-2) 정제 항체를 사용한 항원 결합능의 측정
항체와 항원 (Recombinant Human TROP-2 Fcchimera) 의 해리 상수 측정은, Biacore 3000 (GE 헬스케어 바이오사이언스 (주)) 을 사용하고, 고정화한 항인간 IgG (Fab) 항체에 항체를 리간드로서 포착 (캡처) 하고, 항원을 아날라이트로서 측정하는 캡처법으로 실시하였다. 항인간 IgG (Fab) 항체 (Human Fab capture kit, GE 헬스케어 바이오사이언스 (주)) 는, 센서 칩 CM5 (BIAcore, Inc.) 에 아민 커플링법으로 약 2000 RU 공유 결합시켰다. 레퍼런스 셀에도 동일하게 고정화하였다. 러닝 버퍼로서 HBS-EP+ (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05 % Surfactant P20) 를 사용하였다. 항인간 IgG (Fab) 항체를 고정화한 칩 상에, 항체를 약 1 분간 첨가한 후, 항원의 희석 계열 용액 (1-1000 nM) 을 유속 30 ㎕/분으로 300 초간 첨가하고, 계속해서 600 초간의 해리상을 모니터하였다. 재생 용액으로서, 러닝 버퍼로 희석한 25 mM NaOH 를 유속 100 ㎕/분으로 3 초간, 2 회 첨가하였다. 데이터 해석은, 상기 방법에 의해 실시하였다.
[실시예 9:hTINA1-H1L1 ADC 의 제조 (1)]
[화학식 25]
공정 1:tert-부틸 (4-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리디노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-4-옥소부틸)카바메이트
4-(tert-부톡시카르보닐아미노)부탄산 (0.237 g, 1.13 m㏖) 을 디클로로메탄 (10 ㎖) 에 용해하고, N-하이드록시숙신이미드 (0.130 g, 1.13 m㏖), 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 (0.216 g, 1.13 m㏖) 을 첨가하여 1 시간 교반하였다. 엑사테칸의 메실산염 (0.500 g, 0.94 m㏖), 및 트리에틸아민 (0.157 ㎖, 1.13 m㏖) 을 첨가한 N,N-디메틸포름아미드 용액 (10 ㎖) 에 적하하고, 실온에서 1 일간 교반하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 ∼ 클로로포름:메탄올 = 8:2 (v/v)] 로 정제하고, 표기 화합물 (0.595 g, 정량적) 을 얻었다.
공정 2:4-아미노-N-[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리디노[1,2-b]퀴놀린-1-일]부탄아미드트리플루오로아세트산염
상기 공정 1 에서 얻은 화합물 (0.388 g, 0.61 m㏖) 을 디클로로메탄 (9 ㎖) 에 용해하였다. 트리플루오로아세트산 (9 ㎖) 을 첨가하여 4 시간 교반하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 ∼ 클로로포름:메탄올:물 = 7:3:1 (v/v/v) 의 분배 유기층] 로 정제하고, 표기 화합물 (0.343 g, 정량적) 을 얻었다.
공정 3:N-(tert-부톡시카르보닐)글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(4-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리디노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-4-옥소부틸)글리신아미드
N-(tert-부톡시카르보닐)글리실글리실-L-페닐알라닐글리신 (0.081 g, 0.19 m㏖) 을 디클로로메탄 (3 ㎖) 에 용해하고, N-하이드록시숙신이미드 (0.021 g, 0.19 ㏖) 및, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 (0.036 g, 0.19 m㏖) 을 첨가하여 3.5 시간 교반하였다. 그 반응 용액을 상기 공정 2 에서 얻은 화합물 (0.080 g, 0.15 m㏖) 을 첨가한 N,N-디메틸포름아미드 용액 (1.5 ㎖) 에 적하하고, 실온에서 4 시간 교반하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 ∼ 클로로포름:메탄올 = 8:2 (v/v)] 로 정제하고, 표기 화합물 (0.106 g, 73 %) 을 얻었다.
공정 4:글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(4-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리디노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-4-옥소부틸)글리신아미드트리플루오로아세트산염
상기 공정 3 에서 얻은 화합물 (1.97 g, 2.10 m㏖) 을 디클로로메탄 (7 ㎖) 에 용해하였다. 트리플루오로아세트산 (7 ㎖) 을 첨가하여 1 시간 교반하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 톨루엔을 첨가하여 공비하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 ∼ 클로로포름:메탄올:물 = 7:3:1 (v/v/v) 의 분배 유기층] 로 정제하고, 표기 화합물 (1.97 g, 99 %) 을 얻었다.
공정 5:N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)프로판오일]아미노}에톡시)에톡시]프로판오일}글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(4-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리디노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-4-옥소부틸)글리신아미드
상기 공정 4 에서 얻은 화합물 (100 ㎎, 0.119 m㏖) 의 N,N-디메틸포름아미드 (1.20 ㎖) 용액에, 디이소프로필에틸아민 (20.8 ㎕, 0.119 m㏖), 3-(2-(2-(3-말레인이미드프로판아미드)에톡시)에톡시)프로판산N-숙신이미딜 (50.7 ㎎, 0.119 m㏖) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 ∼ 클로로포름:메탄올 = 5:1 (v/v)] 로 정제하고, 표기 화합물 (66.5 ㎎, 48 %) 을 담황색 고체로서 얻었다.
공정 6:항체-약물 컨쥬게이트 (1)
항체의 환원:실시예 7 에서 제조한 hTINA1-H1L1 을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.54 를 사용) 및 C 를 사용하여, PBS 6.0/EDTA 로 10 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 본 용액 (10.0 ㎖) 을 50 ㎖ 튜브에 채취하고, 10 mM TCEP (토쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.317 ㎖;항체 1 분자에 대해 4.6 당량) 및 1 M 인산수소2칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc.;0.500 ㎖) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.4±0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 힌지부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 컨쥬게이션:상기 용액을 상온 수욕에서 10 분간 인큐베이트한 후에 디메틸술폭시드 (0.567 ㎖) 를 첨가하였다. 이어서 상기 공정 5 에서 얻은 화합물의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.635 ㎖;항체 1 분자에 대해 9.2 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 40 분간 교반하고, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.127 ㎖;항체 1 분자에 대해 18.4 당량) 을 첨가하고, 추가로 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제:상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하고, 표기 항체-약물 컨쥬게이트를 함유하는 용액을 35.0 ㎖ 얻었다.
특성 평가:제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εD,280 = 4964 (실측값), εD,370 = 18982 (실측값) 를 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도:2.70 ㎎/㎖, 항체 수량:94.5 ㎎ (95 %), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):6.6.
[실시예 10:hTINA1-H1L1 ADC 의 제조 (2)]
[화학식 26]
공정 1:항체-약물 컨쥬게이트 (2)
항체의 환원:실시예 7 에서 제조한 hTINA1-H1L1 을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.54 를 사용) 및 C 를 사용하여, PBS 6.0/EDTA 로 10 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 본 용액 (2.00 ㎖) 을 4 ㎖ 튜브에 채취하고, 10 mM TCEP (토쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.0690 ㎖;항체 1 분자에 대해 5.0 당량) 및 1 M 인산수소2칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc.;0.100 ㎖) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.4±0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 힌지부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 컨쥬게이션:상기 용액을 15 ℃ 수욕에서 10 분간 인큐베이트한 후에 실시예 9 공정 5 에서 얻은 화합물의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.127 ㎖;항체 1 분자에 대해 9.2 당량) 을 첨가하고, 15 ℃ 수욕에서 1 시간 인큐베이트하고, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.0190 ㎖;항체 1 분자에 대해 13.8 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터를 사용하여 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제:상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하고, 표기 항체-약물 컨쥬게이트를 함유하는 용액을 9.00 ㎖ 얻었다.
특성 평가:제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εD,280 = 4964 (실측값), εD,370 = 18982 (실측값) 를 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도:2.08 ㎎/㎖, 항체 수량:18.7 ㎎ (94 %), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):6.1.
[실시예 11:hTINA1-H1L1 ADC 의 제조 (3)]
[화학식 27]
공정 1:항체-약물 컨쥬게이트 (3)
항체의 환원:실시예 7 에서 제조한 hTINA1-H1L1 을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.54 를 사용) 및 C 를 사용하여, PBS 6.0/EDTA 로 10 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 본 용액 (5.0 ㎖) 을 15 ㎖ 용기에 채취하고, 교반하 1 M 인산수소2칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc.;0.0813 ㎖) 을 첨가한 후, 37 ℃ 에서 10 분간 교반하였다. 교반하 10 mM TCEP (토쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.0745 ㎖;항체 1 분자에 대해 2.3 당량) 을 첨가한 후, 본 용액의 pH 가 7.0±0.1 내인 것을 확인하고, 37 ℃ 에서 1 시간 교반함으로써, 항체 내 힌지부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 컨쥬게이션:상기 용액을 15 ℃ 수욕에서 10 분간 교반한 후에 실시예 9 공정 5 에서 얻은 화합물의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.162 ㎖;항체 1 분자에 대해 5.0 당량) 을 천천히 적하하면서 첨가하고, 15 ℃ 수욕에서 1 시간 교반하고, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.0418 ㎖;항체 1 분자에 대해 12.9 당량) 을 첨가하고, 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제:상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하고, 표기 항체-약물 컨쥬게이트를 함유하는 용액을 21.0 ㎖ 얻었다.
특성 평가:제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E 및 F (εD,280 = 4964 (실측값), εD,370 = 18982 (실측값) 를 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도:2.19 ㎎/㎖, 항체 수량:46.0 ㎎ (92 %), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):3.6;공통 조작 F 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):3.6.
[실시예 12:hTINA1-H1L1 ADC 의 제조 (4)]
[화학식 28]
공정 1:항체-약물 컨쥬게이트 (4)
항체의 환원:실시예 7 에서 제조한 hTINA1-H1L1 을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.54 를 사용) 및 C 를 사용하여, PBS 6.0/EDTA 로 10.0 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 본 용액 (5.00 ㎖) 을 15 ㎖ 용기에 채취하고, 교반하 1 M 인산수소2칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc.;0.0813 ㎖) 을 첨가한 후, 37 ℃ 에서 10 분간 교반하였다. 교반하 10 mM TCEP (토쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.162 ㎖;항체 1 분자에 대해 5.0 당량) 을 첨가한 후, 본 용액의 pH 가 7.0±0.1 내인 것을 확인하고, 37 ℃ 에서 1 시간 교반함으로써, 항체 내 힌지부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 컨쥬게이션:상기 용액을 15 ℃ 수욕에서 10 분간 교반한 후에 실시예 9 공정 5 에서 얻은 화합물의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.389 ㎖;항체 1 분자에 대해 12.0 당량) 을 천천히 적하하면서 첨가하고, 15 ℃ 수욕에서 1 시간 교반하고, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.0418 ㎖;항체 1 분자에 대해 12.9 당량) 을 첨가하고, 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제:상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하고, 표기 항체-약물 컨쥬게이트를 함유하는 용액을 21.0 ㎖ 얻었다.
특성 평가:제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E 및 F (εD,280 = 4964 (실측값), εD,370 = 18982 (실측값) 를 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도:2.19 ㎎/㎖, 항체 수량:46.0 ㎎ (92 %), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):7.0;공통 조작 F 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):7.0.
[참고예 13:hRS7 ADC 의 제조 (5)]
[화학식 29]
공정 1:항체-약물 컨쥬게이트 (5)
항체의 환원:참고예 1 에서 제조한 hRS7 을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.56 을 사용) 및 C 를 사용하여, PBS 6.0/EDTA 로 10 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 본 용액 (2.0 ㎖) 을 4 ㎖ 튜브에 채취하고, 10 mM TCEP (토쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.0690 ㎖;항체 1 분자에 대해 5.0 당량) 및 1 M 인산수소2칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc.;0.100 ㎖) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.4±0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 힌지부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 컨쥬게이션:상기 용액을 15 ℃ 수욕에서 10 분간 인큐베이트한 후에 실시예 9 공정 5 에서 얻은 화합물의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.127 ㎖;항체 1 분자에 대해 9.2 당량) 을 첨가하고, 15 ℃ 수욕에서 1 시간 인큐베이트하고, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.0190 ㎖;항체 1 분자에 대해 13.8 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터를 사용하여 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제:상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하고, 표기 항체-약물 컨쥬게이트를 함유하는 용액을 9.00 ㎖ 얻었다.
특성 평가:제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εD,280 = 4964 (실측값), εD,370 = 18982 (실측값) 를 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도:2.04 ㎎/㎖, 항체 수량:18.4 ㎎ (92 %), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):6.2.
[실시예 14:hTINA1-H1L1 ADC 의 제조 (6)]
[화학식 30]
공정 1:({N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실}아미노)메틸아세테이트
N-9-플루오레닐메톡시카르보닐글리실글리신 (4.33 g, 12.2 m㏖), 테트라하이드로푸란 (120 ㎖), 및 톨루엔 (40.0 ㎖) 으로 이루어지는 혼합물에, 피리딘 (1.16 ㎖, 14.7 m㏖ 및 4아세트산납 (6.84 g, 14.7 m㏖) 을 첨가하고, 5 시간 가열 환류하였다. 반응액을 실온까지 냉각시킨 후, 불용물을 셀라이트 여과에 의해 제거하고, 감압하 농축하였다. 얻어진 잔류물을 아세트산에틸에 용해하고, 물 및 포화 식염수로 세정 후, 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압하에서 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산:아세트산에틸 = 9:1 (v/v) ∼ 아세트산에틸] 로 정제하고, 표기 화합물 (3.00 g, 67 %) 을 무색 고체로서 얻었다.
공정 2:벤질 [({N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실}아미노)메톡시]아세테이트
상기 공정 1 에서 얻은 화합물 (3.68 g, 10.0 m㏖) 및 벤질글리콜레이트 (4.99 g, 30.0 m㏖) 의 테트라하이드로푸란 (40.0 ㎖) 용액에, 칼륨 tert-부톡시드 (2.24 g, 20.0 m㏖) 를 0 ℃ 에서 첨가하고, 실온에서 15 분간 교반하였다. 반응 용액에 아세트산에틸, 물을 0 ℃ 에서 첨가하고, 아세트산에틸, 클로로포름으로 추출하고, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 디옥산 (40.0 ㎖), 물 (10.0 ㎖) 에 용해하고, 탄산수소나트륨 (1.01 g, 12.0 m㏖), 클로로포름산9-플루오레닐메틸 (2.59 g, 10.0 m㏖) 을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응 용액에 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하고, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산:아세트산에틸 = 100:0 (v/v) ∼ 0:100] 로 정제하고, 무색 유상의 표기 화합물 (1.88 g, 40 %) 을 얻었다.
공정 3:[({N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실}아미노)메톡시]아세트산
상기 공정 2 에서 얻은 화합물 (1.88 g, 3.96 m㏖) 을 에탄올 (40.0 ㎖), 아세트산에틸 (20.0 ㎖) 에 용해하였다. 팔라듐탄소 촉매 (376 ㎎) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 실온에서 2 시간 교반하였다. 불용물을 셀라이트 여과에 의해 제거하고, 용매를 감압 증류 제거하고, 표기 화합물 (1.52 g, 정량적) 을 무색 고체로서 얻었다.
공정 4:9H-플루오렌-9-일메틸(2-{[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리디노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]아미노}-2-옥소에틸)카바메이트
빙랭하, 엑사테칸의 메실산염 (0.283 g, 0.533 m㏖), N-하이드록시숙신이미드 (61.4 ㎎, 0.533 m㏖), 및 상기 공정 3 에서 얻은 화합물 (0.205 g, 0.533 m㏖) 의 N,N-디메틸포름아미드 (10.0 ㎖) 용액에, N,N-디이소프로필에틸아민 (92.9 ㎕, 0.533 m㏖) 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (0.143 g, 0.693 m㏖) 를 첨가하고, 실온에서 3 일간 교반하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 ∼ 클로로포름:메탄올:물 = 7:3:1 (v/v/v) 의 분배 유기층] 로 정제하고, 표기 화합물 (0.352 g, 82 %) 을 담갈색 고체로서 얻었다.
공정 5:N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리디노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드
상기 공정 4 에서 얻은 화합물 (0.881 g, 1.10 m㏖) 의 N,N-디메틸포름아미드 (11.0 ㎖) 용액에 피페리딘 (1.1 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 표기 화합물을 포함하는 혼합물을 얻었다. 본 혼합물은, 더 이상의 정제는 실시하지 않고 다음의 반응에 사용하였다.
공정 6:N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리디노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드
빙랭하, 상기 공정 5 에서 얻은 혼합물 (0.439 m㏖), N-하이드록시숙신이미드 (0.101 g, 0.878 m㏖), 및 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실글리실-L-페닐알라닌 (일본 공개특허공보 2002-60351호;0.440 g, 0.878 m㏖) 의 N,N-디메틸포름아미드 (50.0 ㎖) 용액에, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (0.181 g, 0.878 m㏖) 를 첨가하고, 실온에서 4 일간 교반하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 ∼ 클로로포름:메탄올 = 9:1 (v/v)] 로 정제하고, 표기 화합물 (0.269 g, 58 %) 을 담등색 고체로서 얻었다.
MS(ESI)m/z:1063(M+H)+.
공정 7:글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리디노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드
상기 공정 6 에서 얻은 화합물 (0.269 g, 0.253 m㏖) 의 N,N-디메틸포름아미드 (4.00 ㎖) 용액에, 피페리딘 (0.251 ㎖, 2.53 m㏖) 을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 표기 화합물을 포함하는 혼합물을 얻었다. 본 혼합물은, 더 이상의 정제는 실시하지 않고 다음의 반응에 사용하였다.
공정 8:N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리디노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드
상기 공정 7 에서 얻은 화합물 (0.253 m㏖) 의 N,N-디메틸포름아미드 (10.0 ㎖) 용액에, 6-말레이미드헥산산N-숙신이미딜 (0.156 g, 0.506 m㏖) 을 첨가하고, 실온에서 3 일간 교반하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 ∼ 클로로포름:메탄올 = 9:1 (v/v)] 로 정제하고, 표기 화합물 (0.100 g, 38 %) 을 담황색 고체로서 얻었다.
MS (ESI) m/z: 1034 (M+H)+.
공정 9:항체-약물 컨쥬게이트 (6)
항체의 환원:실시예 7 에서 제조한 hTINA1-H1L1 을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.54 를 사용) 및 C 를 사용하여, PBS 6.0/EDTA 로 10 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 본 용액 (10.0 ㎖) 을 50 ㎖ 튜브에 채취하고, 10 mM TCEP (토쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.317 ㎖;항체 1 분자에 대해 4.6 당량) 및 1 M 인산수소2칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc.;0.500 ㎖) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.4±0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 힌지부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 컨쥬게이션:상기 용액을 상온 수욕에서 10 분간 인큐베이트한 후에 디메틸술폭시드 (0.567 ㎖) 를 첨가하였다. 이어서 상기 공정 8 에서 얻은 화합물의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.635 ㎖;항체 1 분자에 대해 9.2 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터를 사용하여 실온에서 40 분간 교반하고, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.127 ㎖;항체 1 분자에 대해 18.4 당량) 을 첨가하고, 추가로 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제:상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하고, 표기 항체-약물 컨쥬게이트를 함유하는 용액을 35.0 ㎖ 얻었다.
특성 평가:제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εD,280 = 5178 (실측값), εD,370 = 20217 (실측값) 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도:2.70 ㎎/㎖, 항체 수량:94.5 ㎎ (95 %), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):6.4.
[실시예 15:hTINA1-H1L1 ADC 의 제조 (7)]
[화학식 31]
공정 1:항체-약물 컨쥬게이트 (7)
항체의 환원:실시예 7 에서 제조한 hTINA1-H1L1 을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.54 를 사용) 및 C 를 사용하여, PBS 6.0/EDTA 로 10 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 본 용액 (2.0 ㎖) 을 4 ㎖ 튜브에 채취하고, 10 mM TCEP (토쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.0690 ㎖;항체 1 분자에 대해 5.0 당량) 및 1 M 인산수소2칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc.;0.0299 ㎖) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.0±0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 힌지부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 컨쥬게이션:상기 용액을 15 ℃ 수욕에서 10 분간 인큐베이트한 후에 실시예 14 공정 8 에서 얻은 화합물의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.127 ㎖;항체 1 분자에 대해 9.2 당량) 을 첨가하고, 15 ℃ 수욕에서 1 시간 인큐베이트하고, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.0190 ㎖;항체 1 분자에 대해 13.8 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터를 사용하여 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제:상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하고, 표기 항체-약물 컨쥬게이트를 함유하는 용액을 9.00 ㎖ 얻었다.
특성 평가:제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εD,280 = 5178 (실측값), εD,370 = 20217 (실측값) 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도:2.04 ㎎/㎖, 항체 수량:18.4 ㎎ (92 %), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):5.7.
[실시예 16:hTINA1-H1L1 ADC 의 제조 (8)]
[화학식 32]
공정 1:항체-약물 컨쥬게이트 (8)
항체의 환원:실시예 7 에서 제조한 hTINA1-H1L1 을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.54 를 사용) 및 C 를 사용하여, PBS 6.0/EDTA 로 10 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 본 용액 (30.0 ㎖) 을 100 ㎖ 용기에 채취하고, 교반하 1 M 인산수소2칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc.;0.4875 ㎖) 을 첨가한 후, 37 ℃ 에서 10 분간 교반하였다. 교반하 10 mM TCEP (토쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.9721 ㎖;항체 1 분자에 대해 5.0 당량) 을 첨가한 후, 본 용액의 pH 가 7.0±0.1 내인 것을 확인하고, 37 ℃ 에서 1 시간 교반함으로써, 항체 내 힌지부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 컨쥬게이션:상기 용액을 15 ℃ 수욕에서 10 분간 교반한 후에 실시예 14 공정 8 에서 얻은 화합물의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (2.33 ㎖;항체 1 분자에 대해 12.0 당량) 을 천천히 적하하면서 첨가하고, 15 ℃ 수욕에서 1 시간 교반하고, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.251 ㎖;항체 1 분자에 대해 12.9 당량) 을 첨가하고, 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제:상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하고, 표기 항체-약물 컨쥬게이트를 함유하는 용액을 98.0 ㎖ 얻었다. 그 후, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 A 에 의한 농축 조작을 실시하고, 표기 항체-약물 컨쥬게이트를 함유하는 용액을 17.5 ㎖ 얻었다.
특성 평가:제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E 및 F (εD,280 = 5178 (실측값), εD,370 = 20217 (실측값) 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도:14.6 ㎎/㎖, 항체 수량:256 ㎎ (85 %), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):6.7;공통 조작 F 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):7.0.
[실시예 17:hTINA1-H1L1 ADC 의 제조 (9)]
[화학식 33]
공정 1:항체-약물 컨쥬게이트 (9)
항체의 환원:실시예 7 에서 제조한 hTINA1-H1L1 을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.54 를 사용) 및 C 를 사용하여, PBS 6.0/EDTA 로 10 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 본 용액 (5.0 ㎖) 을 15 ㎖ 용기에 채취하고, 교반하 1 M 인산수소2칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc.;0.0813 ㎖) 을 첨가한 후, 37 ℃ 에서 10 분간 교반하였다. 교반하 10 mM TCEP (토쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.0778 ㎖;항체 1 분자에 대해 2.4 당량) 을 첨가한 후, 본 용액의 pH 가 7.0±0.1 내인 것을 확인하고, 37 ℃ 에서 1 시간 교반함으로써, 항체 내 힌지부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 컨쥬게이션:상기 용액을 15 ℃ 수욕에서 10 분간 교반한 후에 실시예 14 공정 8 에서 얻은 화합물의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.162 ㎖;항체 1 분자에 대해 5.0 당량) 을 천천히 적하하면서 첨가하고, 15 ℃ 수욕에서 1 시간 교반하고, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.0418 ㎖;항체 1 분자에 대해 12.9 당량) 을 첨가하고, 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제:상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하고, 표기 항체-약물 컨쥬게이트를 함유하는 용액을 21.0 ㎖ 얻었다.
특성 평가:제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E 및 F (εD,280 = 5178 (실측값), εD,370 = 20217 (실측값) 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도:2.26 ㎎/㎖, 항체 수량:47.5 ㎎ (95 %), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):3.5;공통 조작 F 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):3.6.
[참고예 18:hRS7 ADC 의 제조 (10)]
[화학식 34]
공정 1:항체-약물 컨쥬게이트 (10)
항체의 환원:참고예 1 에서 제조한 hRS7 을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.56 을 사용) 및 C 를 사용하여, PBS 6.0/EDTA 로 10 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 본 용액 (2.0 ㎖) 을 4 ㎖ 튜브에 채취하고, 10 mM TCEP (토쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.0690 ㎖;항체 1 분자에 대해 5.0 당량) 및 1 M 인산수소2칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc.;0.0299 ㎖) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.0±0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 힌지부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 컨쥬게이션:상기 용액을 15 ℃ 수욕에서 10 분간 인큐베이트한 후에 실시예 14 공정 8 에서 얻은 화합물의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.1269 ㎖;항체 1 분자에 대해 9.2 당량) 을 첨가하고, 15 ℃ 수욕에서 1 시간 인큐베이트하고, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.0190 ㎖;항체 1 분자에 대해 13.8 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터를 사용하여 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제:상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하고, 표기 항체-약물 컨쥬게이트를 함유하는 용액을 9.00 ㎖ 얻었다.
특성 평가:제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εD,280 = 5178 (실측값), εD,370 = 20217 (실측값) 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도:2.07 ㎎/㎖, 항체 수량:18.6 ㎎ (93 %), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):5.6.
[실시예 19:hTINA1-H1L1 ADC 의 제조 (11)]
[화학식 35]
공정 1:tert-부틸 [2-(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리디노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)에틸]카바메이트
엑사테칸의 메실산염 (3.10 g, 5.47 ㏖) 을, 4-(tert-부톡시카르보닐아미노)부탄산 대신에 {2-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]에톡시}아세트산 (J. Med. Chem., 1992년, 35 권, 2928 페이지;1.55 g, 6.01 m㏖) 을 사용하여, 실시예 1 의 공정 1 과 동일하게 반응시켜, 표기 화합물 (2.56 g, 73 %) 을 담황색 고체로서 얻었다.
공정 2:2-(2-아미노에톡시)-N-[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리디노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아세트아미드트리플루오로아세트산염
상기 공정 1 에서 얻은 화합물 (1.50 g, 2.36 ㏖) 을, 실시예 1 의 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 표기 화합물 (1.50 g, 정량적) 을 담황색 고체로서 얻었다.
공정 3:N-(tert-부톡시카르보닐)글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리디노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)에틸]글리신아미드
상기 공정 2 에서 얻은 화합물 (554 ㎎, 0.85 m㏖) 을, 실시예 1 의 공정 3 과 동일하게 반응시켜, 표기 화합물 (775 ㎎, 95 %) 을 얻었다.
공정 4:글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리디노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)에틸]글리신아미드트리플루오로아세트산염
상기 공정 3 에서 얻은 화합물 (630 ㎎, 0.659 m㏖) 을, 실시예 1 의 공정 4 와 동일하게 반응시켜, 표기 화합물 (588 ㎎, 92 %) 을 얻었다.
공정 5:N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리디노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)에틸]글리신아미드
상기 공정 4 에서 얻은 화합물 (240 ㎎, 0.247 m㏖) 을, 디이소프로필에틸아민 대신에 트리에틸아민 (31.4 ㎕, 0.22 m㏖) 을, 3-(2-(2-(3-말레인이미드프로판아미드)에톡시)에톡시)프로판산N-숙신이미딜 대신에 6-말레이미드헥산산N-숙신이미딜 (95.3 ㎎, 0.31 m㏖) 을 사용하여, 실시예 1 의 공정 5 와 동일하게 반응시켜, 표기 화합물 (162 ㎎, 62 %) 을 얻었다.
공정 6:항체-약물 컨쥬게이트 (11)
항체의 환원:실시예 7 에서 제조한 hTINA1-H1L1 을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.54 를 사용) 및 C 를 사용하여, PBS 6.0/EDTA 로 10 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 본 용액 (3.0 ㎖) 을 15 ㎖ 용기에 채취하고, 교반하 1 M 인산수소2칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc.;0.0488 ㎖) 을 첨가한 후, 37 ℃ 에서 10 분간 교반하였다. 교반하 10 mM TCEP (토쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.0972 ㎖;항체 1 분자에 대해 5.0 당량) 을 첨가한 후, 본 용액의 pH 가 7.0±0.1 내인 것을 확인하고, 37 ℃ 에서 1 시간 교반함으로써, 항체 내 힌지부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 컨쥬게이션:상기 용액을 15 ℃ 수욕에서 10 분간 교반한 후에 실시예 11a 공정 8 에서 얻은 화합물의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.2333 ㎖;항체 1 분자에 대해 12.0 당량) 을 천천히 적하하면서 첨가하고, 15 ℃ 수욕에서 1 시간 교반하고, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.0251 ㎖;항체 1 분자에 대해 12.9 당량) 을 첨가하고, 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제:상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하고, 표기 항체-약물 컨쥬게이트를 함유하는 용액을 14 ㎖ 얻었다.
특성 평가:제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E 및 F (εD,280 = 5193 (실측값), εD,370 = 20347 (실측값) 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도:1.93 ㎎/㎖, 항체 수량:27.0 ㎎ (90 %), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):7.1;공통 조작 F 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):7.0.
[참고예 2:hRS7-CL2A-SN38 의 제조 (12)]
[화학식 36]
공정 1:항체-약물 컨쥬게이트 (12)
항체의 환원:참고예 1 에서 제조한 hRS7 을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.54 를 사용) 및 C 를 사용하여, PBS 6.0/EDTA 로 10 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 본 용액 (10.0 ㎖) 을 50 ㎖ 튜브에 채취하고, 10 mM TCEP (토쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.317 ㎖;항체 1 분자에 대해 4.6 당량) 및 1 M 인산수소2칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc.;0.500 ㎖) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.4±0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 힌지부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 컨쥬게이션:상기 용액을 상온 수욕에서 10 분간 인큐베이트한 후에 디메틸술폭시드 (0.567 ㎖) 를 첨가하였다. 이어서, 미국 특허 공개 제2011/0293513호 명세서에 따라 합성한 CL2A-SN38 의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.635 ㎖;항체 1 분자에 대해 9.2 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터를 사용하여 실온에서 40 분간 교반하고, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.127 ㎖;항체 1 분자에 대해 18.4 당량) 을 첨가하고, 추가로 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제:상기 반응 용액에 대해, 제조 방법 1-공통 조작 D 에 기재한 겔 여과 정제 조작을 2 회 반복하고, 이어서 폴리소르베이트 80 (0.01 %) 을 함유하는 25 mM 트레할로스 용액으로 동일하게 NAP-25 칼럼에 의한 겔 여과 정제 조작을 1 회 실시한 후에 얻어지는 용출액 (35 ㎖) 을 동결 건조시켰다.
특성 평가:동결 건조 전의 용출액에 대해 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도:2.78 ㎎/㎖, 항체 수량:97.3 ㎎ (97 %), 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):5.6
[실시예 20:hTINA1-H1L1 ADC 의 제조 (13)]
[화학식 37]
공정 1:항체-약물 컨쥬게이트 (13)
항체의 환원:실시예 7 에서 제조한 hTINA1-H1L1 을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.54 를 사용) 및 C 를 사용하여, 매체를 PBS 6.0/EDTA 로 치환하고, 10 ㎎/㎖ 의 항체 농도로 조제하였다. 본 용액 (100 ㎖) 을 폴리카보네이트제 250 ㎖ 삼각 플라스크 용기에 넣고, 마그네틱 스터러 교반하, 실온에서 1 M 인산수소2칼륨 수용액 (1.4 ㎖) 을 첨가한 후, 10 mM TCEP 수용액 (1.62 ㎖;항체 1 분자에 대해 2.5 당량) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.0±0.1 내인 것을 확인한 후에, 교반을 정지하고, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 힌지부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 컨쥬게이션:상기 용액을 15 ℃ 로 냉각 후, 교반하, DMSO (3.24 ㎖) 를 천천히 적하하여 첨가하였다. 이어서, 실시예 14 공정 8 의 화합물을 10 mM 포함하는 DMSO 용액 (1.76 ㎖;항체 1 분자에 대해 5.0 당량) 을 천천히 적하하여 첨가하였다. 이 용액을 15 ℃ 에서, 1 시간 교반하고, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 교반하, 100 mM NAC 수용액 (0.324 ㎖;항체 1 분자에 대해 5.0 당량) 을 첨가하고, 추가로 실온에서 20 분간 인큐베이트하고, 미반응의 약물 링커의 반응성을 정지시켰다.
정제:교반하, 상기 용액에 20 % 아세트산수 (약 0.52 ㎖) 와 ABS (100 ㎖) 를 천천히 첨가하고, 본 용액의 pH 를 5.5±0.1 로 하였다. 이 용액을 정밀 여과 (0.45 ㎛, PVDF 막) 함으로써 백탁물을 제거하여, 여과액을 약 200 ㎖ 얻었다. 이 여과액에 대해, 한외 여과막 (머크 주식회사, Pellicon XL Cassette, Ultracell 30KDa), 튜브 펌프 (미국 콜파머사 마스터 플렉스 펌프 model 77521-40, 펌프 헤드 model 7518-00) 및 튜브 (미국 콜파머사 마스터 플렉스 튜브 L/S16) 로 구성된 한외 여과 장치를 사용하여, 한외 여과 정제를 실시하였다. 즉, 반응액에 정제 완충액으로서 ABS (합계 1600 ㎖) 를 적하하면서, 한외 여과 정제를 실시함으로써, 미결합의 약물 링커 및 다른 저분자량 시약을 제거함과 함께 완충액을 ABS 로 치환하고, 또한 농축까지 실시하였다. 얻어진 정제 용액에 대해, 정밀 여과 (0.22 ㎛, PVDF 막) 를 실시하고, 표기 항체-약물 컨쥬게이트를 함유하는 용액을 88 ㎖ 얻었다.
특성 평가:공통 조작 E 와 공통 조작 F (εD,280 = 5178, εD,370 = 20217 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도:9.96 ㎎/㎖, 항체 수량:876 ㎎ (88 %), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):3.8;공통 조작 F 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n):3.8.
[실시예 21:ADC 의 항종양 효과의 평가]
21-a) ADC 의 항종양 효과 (1)
마우스:5-6 주령의 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스 (닛폰 찰스·리버 주식회사) 를 실험 사용 전에 SPF 조건하에서 4-7 일간 순화하였다. 마우스에는 멸균한 고형 사료 (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) 를 주고, 멸균한 수돗물 (5-15 ppm 차아염소산나트륨 용액을 첨가하여 조제) 을 주었다.
측정, 계산식:모든 연구에 있어서, 종양의 장경 및 단경을 전자식 디지털 캘리퍼 (CD-15C, Mitutoyo Corp.) 로 1 주간에 2 회 측정하고, 종양 체적 (㎣) 을 계산하였다. 계산식은 이하에 나타내는 바와 같음.
종양 체적 (㎣) = 1/2 × 장경 (㎜) × [단경 (㎜)]2
항체-약물 컨쥬게이트는 모두 생리 식염수 (주식회사 오츠카 제약 공장) 로 희석하고, 10 ㎖/㎏ 의 액량을 미정맥내 투여하였다. ATCC 로부터 구입한 인간 대장암 세포주 COLO205 를 생리 식염수에 현탁한 2 × 106 cells 를 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스의 우측 복부에 피하 이식하고 (Day 0), Day 7 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (1), (6), (12) 를 Day 7, 14, 21 에 모두 10 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 음성 대조로서 약물을 결합하고 있지 않은 hTINA1-H1L1 항체 및 hRS7 항체를 25 ㎎/㎏ 의 용량으로 동일하게 투여하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (1), (6) 의 투여에 의해 종양 체적이 항체-약물 컨쥬게이트 (12) 의 투여에 비해 현저하게 감소하고, 모두 종양 증식 억제 효과를 발휘하였다 (도 13). 또한, 도 중, 가로축은 일수 (日數), 세로축은 종양 체적을 나타낸다.
21-b) ADC 의 항종양 효과 (2)
ATCC 로부터 구입한 인간 췌장선암 세포주 Bx-PC3 을 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스에 이식하고, 또한 고형 계대한 종양편을 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스 우측 복부에 피하 이식하여 (Day 0), Day 16 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (1), (6), (12) 를 Day 16, 23, 30 에 모두 10 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 음성 대조로서 약물을 결합하고 있지 않은 hTINA1-H1L1 항체 및 hRS7 항체를 25 ㎎/㎏ 의 용량으로 동일하게 투여하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (1), (6) 의 투여에 의해 종양 체적이 항체-약물 컨쥬게이트 (12) 의 투여에 비해 현저하게 감소하고, 모두 종양 증식 억제 효과를 발휘하였다 (도 14).
21-c) ADC 의 항종양 효과 (3)
ATCC 로부터 구입한 인간 췌장선암 세포주 Capan-1 을 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스에 이식하고, 또한 고형 계대한 종양편을 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스 우측 복부에 피하 이식하여 (Day 0), Day 18 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (1), (6), (12) 를 Day 18, 25, 32 에 모두 10 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 음성 대조로서 약물을 결합하고 있지 않은 hTINA1-H1L1 항체 및 hRS7 항체를 25 ㎎/㎏ 의 용량으로 동일하게 투여하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (1), (6) 의 투여에 의해 종양 체적이 항체-약물 컨쥬게이트 (12) 의 투여에 비해 현저하게 감소하고, 모두 종양 증식 억제 효과를 발휘하였다 (도 15).
21-d) ADC 의 항종양 효과 (4)
실시예 21-a) 와 동일하게 COLO205 를 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스에 피하 이식하고 (Day 0), Day 11 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. Day 11, 18, 25 에 항체-약물 컨쥬게이트 (2), (5) 를 모두 10 ㎎/㎏, 항체-약물 컨쥬게이트 (7), (10) 을 모두 3 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (2), (5), (7), (10) 의 투여에 의해 모두 종양 증식 억제 효과를 발휘하였다 (도 16).
21-e) ADC 의 항종양 효과 (5)
실시예 21-b) 와 동일하게 Bx-PC3 을 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스에 피하 이식하고 (Day 0), Day 25 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (2), (5), (7), (10) 을 Day 25, 32 에 모두 3 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (2), (5), (7), (10) 의 투여에 의해 모두 종양 증식 억제 효과를 발휘하였다 (도 17).
21-f) ADC 의 항종양 효과 (6)
실시예 21-a) 와 동일하게 COLO205 를 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스에 피하 이식하고 (Day 0), Day 9 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. Day 9, 16 에 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), (9) 를 모두 10 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), (9) 의 투여에 의해 모두 종양 증식 억제 효과를 발휘하였다 (도 18).
21-g) ADC 의 항종양 효과 (7)
실시예 21-b) 와 동일하게 Bx-PC3 을 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스에 피하 이식하고 (Day 0), Day 21 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. Day 21, 28 에 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), (9) 를 모두 3 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), (9) 의 투여에 의해 모두 종양 증식 억제 효과를 발휘하였다 (도 19).
21-h) ADC 의 항종양 효과 (8)
ATCC 로부터 구입한 인간 난소암 세포주 NIH:OVCAR-3 8 × 106 cells 를 Matrigel (Becton, Dickinson and Company) 에 현탁하고, 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스에 피하 이식하고 (Day 0), Day 25 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. Day 25 에 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), (9) 를 모두 3 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), (9) 의 투여에 의해 모두 종양 증식 억제 효과를 발휘하였다 (도 20).
21-i) ADC 의 항종양 효과 (9)
ATCC 로부터 구입한 인간 위암 세포주 NCI-N87 1 × 107 cells 를 생리 식염수에 현탁하고, 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스에 피하 이식하고 (Day 0), Day 6 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. Day 6 에 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), (9) 를 모두 3 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), (9) 의 투여에 의해 모두 종양 증식 억제 효과를 발휘하였다 (도 21).
21-j) ADC 의 항종양 효과 (10)
ATCC 로부터 구입한 인간 폐암 세포주 NCI-H292 5 × 106 cells 를 생리 식염수에 현탁하고, 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스에 피하 이식하고 (Day 0), Day 9 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. Day 9 에 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), (9) 를 모두 3 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), (9) 의 투여에 의해 모두 종양 증식 억제 효과를 발휘하였다 (도 22).
21-k) ADC 의 항종양 효과 (11)
ATCC 로부터 구입한 인간 인두암 세포주 FaDu 3 × 106 cells 를 생리 식염수에 현탁하고, 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스에 피하 이식하고 (Day 0), Day 11 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. Day 11 에 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), (9) 를 모두 3 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), (9) 의 투여에 의해 모두 종양 증식 억제 효과를 발휘하였다 (도 23).
21-l) ADC 의 항종양 효과 (12)
ATCC 로부터 구입한 인간 췌장선암 세포주 CFPAC-1 4 × 106 cells 를 생리 식염수에 현탁하고, 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스에 피하 이식하고 (Day 0), Day 14 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. Day 14 에 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), (9) 를 모두 3 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (3), (4), (8), (9) 의 투여에 의해 모두 종양 증식 억제 효과를 발휘하였다 (도 24).
21-m) ADC 의 항종양 효과 (13)
실시예 21-l 과 동일하게, CFPAC-1 을 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스에 피하 이식하고 (Day 0), Day 14 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. Day 14 에 항체-약물 컨쥬게이트 (8), (13) 을 모두 1 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (8), (13) 의 투여에 의해 모두 종양 증식 억제 효과를 발휘하였다 (도 25).
21-n) ADC 의 항종양 효과 (14)
ATCC 로부터 구입한 인간 췌장선암 세포주 HPAC 3 × 106 cells 를 생리 식염수에 현탁하여 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스에 피하 이식하고 (Day 0), Day 12 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. Day 12 에 항체-약물 컨쥬게이트 (8), (13) 을 모두 3 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (8), (13) 의 투여에 의해 모두 종양 증식 억제 효과를 발휘하였다 (도 26).
21-o) ADC 의 항종양 효과 (15)
공익 재단 법인 휴먼 사이언스 진흥 재단으로부터 입수한 인간 식도암 조직을 NOG 마우스 (공익 재단 법인 실험 동물 중앙 연구소) 의 피하에 이식하고 증식시켜 얻은 종양편을, 또한 암컷 NOD-scid 마우스 (닛폰 찰스·리버 주식회사) 에 피하 이식하고 (Day 0), Day 27 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. Day 27 에 항체-약물 컨쥬게이트 (8), (13) 을 모두 3 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 (8), (13) 의 투여에 의해 모두 종양 증식 억제 효과를 발휘하였다 (도 27).
[실시예 22:ADC 의 항세포 효과의 평가]
TROP2 항원 양성 세포주인 BxPC3, NCI-H292, NIH:OVCAR-3, CFPAC-1, FaDu, 인간 폐선암 세포주 Calu-3 (ATCC), 인간 난소암 세포주 CaOV3 (ATCC), 및 TROP2 항원 음성 세포주인 인간 폐암 세포주 Calu-6 (ATCC), 인간 피부 흑색종 세포주 A375 (ATCC) 를 각 ADC 의 항세포 효과의 평가에 사용하였다. BxPC3 및 NCI-H292 는 10 % 우태아 혈청 (Moregate) 을 포함하는 RPMI 1640 Medium (Gibco) 에서, NIH:OVCAR-3 은 20 % 우태아 혈청 및 0.01 ㎎/㎖ Insulin (Invitrogen) 을 포함하는 RPMI 1640 Medium 에서, CFPAC-1 은 10 % 우태아 혈청을 포함하는 Iscove‘s Modified Dulbecco's Medium (Gibco) 에서, FaDu, Calu-3 및 Calu-6 은 10 % 우태아 혈청을 포함하는 Eagle's Minimum Essential Medium (ATCC) 에서, CaOV3 및 A375 는 10 % 우태아 혈청을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium (Gibco) 에서, 각각 2.2 × 106 cells/㎖ 로 조제하고, 96 구멍 세포 배양용 마이크로 플레이트에 90 ㎕ 씩 파종하였다. 또한 RPMI 1640 Medium 에서 100 nM 20 nM, 4 nM, 0.8 nM, 0.16 nM, 0.032 nM, 0.0064 nM 으로 희석한 항체-약물 컨쥬게이트 (4), (8) 혹은 비교를 위해 RPMI 1640 Medium 을 10 ㎕ 씩 첨가하여, 37 ℃, 5 % CO2 하에서 6 일간 배양하였다. 배양 후, 마이크로 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고, 실온에서 30 분간 정치하였다. 배양액과 등량의 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 를 첨가하고, 플레이트 믹서로 10 분간 교반하여 세포를 용해 후에 플레이트 리더로 발광량을 계측하였다. 6 일간 배양 후의 세포 증식 저해율은 다음 식으로 산출하였다.
세포 증식 저해율 (%) = a ÷ b × 100
a:6 일간 배양 후의 검체 첨가 웰의 평균값 - 배양 개시시의 검체 미첨가 웰의 평균값
b:6 일간 배양 후의 배지 첨가 웰의 평균값 - 배양 개시시의 검체 미첨가 웰의 평균값
또 GI50 값은 다음 식으로 산출하였다.
GI50 (nM) = antilog ((50 - f) × (LOG10 (d) - LOG10 (c)) ÷ (f - e) + LOG10 (d))
c:검체 농도 c
d:검체 농도 d
e:검체 농도 c 에 있어서의 세포 증식 저해율
f:검체 농도 d 에 있어서의 세포 증식 저해율
c, d 는 세포 증식 저해율 50 % 를 사이에 두는 2 점으로 c > d.
항체-약물 컨쥬게이트 (4) 및 (8) 은, TROP2 항원 양성 세포주인 BxPC3, NCI-H292, NIH:OVCAR-3, CFPAC-1, FaDu, Calu-3, CaOV3 에 대해, GI50 < 1 (nM) 의 항세포 효과를 나타내었다. 한편, TROP2 항원 음성 세포주인 Calu-6, A375 에 대해서는 항세포 효과를 나타내지 않았다 (> 100 (nM)).
서열표 프리텍스트
서열 번호 1:TINA1 항체의 중쇄의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 2:TINA1 항체의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 3:TINA1 항체의 경쇄의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 4:TINA1 항체의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 5:인간 κ 사슬 분비 시그널 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 6:인간 중쇄 분비 시그널 및 인간 IgG1 정상 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 7:cTINA1 항체 중쇄의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 8:cTINA1 항체 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 9:cTINA1 항체 경쇄의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 10:cTINA1 항체 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 11:hTINA1-H1 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 12:hTINA1-H1 의 아미노산 서열
서열 번호 13:hTINA1-H2 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 14:hTINA1-H2 의 아미노산 서열
서열 번호 15:hTINA1-H3 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 16:hTINA1-H3 의 아미노산 서열
서열 번호 17:hTINA1-L1 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 18:hTINA1-L1 의 아미노산 서열
서열 번호 19:hTINA1-L2 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 20:hTINA1-L2 의 아미노산 서열
서열 번호 21:hTINA1-L3 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 22:hTINA1-L3 의 아미노산 서열
서열 번호 23:TINA1 항체의 CDRH1 의 아미노산 서열
서열 번호 24:TINA1 항체의 CDRH2 의 아미노산 서열
서열 번호 25:TINA1 항체의 CDRH3 의 아미노산 서열
서열 번호 26:TINA1 항체의 CDRL1 의 아미노산 서열
서열 번호 27:TINA1 항체의 CDRL2 의 아미노산 서열
서열 번호 28:TINA1 항체의 CDRL3 의 아미노산 서열
서열 번호 29:hRS7 항체 중쇄의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 30:hRS7 항체 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 31:hRS7 항체 경쇄의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 32:hRS7 항체 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 33:프라이머 mG2aVR2
서열 번호 34:프라이머 mKVR2
서열 번호 35:프라이머 3.3-F1
서열 번호 36:프라이머 3.3-R1
서열 번호 37:프라이머 TINA1H-F
서열 번호 38:프라이머 TINA1H-R
서열 번호 39:프라이머 TINA1L-F
서열 번호 40:프라이머 TINA1L-R
서열 번호 41:프라이머 EG-Inf-F
서열 번호 42:프라이머 EG1-Inf-R
서열 번호 43:프라이머 CM-LKF
서열 번호 44:프라이머 KCL-Inf-R
SEQUENCE LISTING
<110> Daiichi Sankyo Company, Limited
<120> ANTI-TROP2 ANTIBODY-DRUG CONJUGATE
<130> PD20-9007WO
<150> JP2013-267548
<151> 2013-12-25
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 363
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaggatc 60
tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca actgctggaa tgcagtgggt gcaaaagatg 120
ccaggaaagg gtttgaagtg gattggctgg ataaacaccc actctggagt gccaaaatat 180
gcagaagact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcatat 240
ttacagataa gcaacctcaa aaatgaggac acgactacgt atttctgtgc gagatcgggg 300
ttcggtagta gctactggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccgcggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 2
<211> 121
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala
20 25 30
Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Met Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Thr Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 327
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 3
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaactgct gatttactcg gcatcctacc gctacactgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggatc tgggacggct ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatatta ctccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa acgggct 327
<210> 4
<211> 109
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala
100 105
<210> 5
<211> 449
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
gcctccggac tctagagcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct 60
gtggatctcc ggcgcgtacg gcgatatcgt gatgattaaa cgtacggtgg ccgccccctc 120
cgtgttcatc ttccccccct ccgacgagca gctgaagtcc ggcaccgcct ccgtggtgtg 180
cctgctgaat aacttctacc ccagagaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct 240
gcagtccggg aactcccagg agagcgtgac cgagcaggac agcaaggaca gcacctacag 300
cctgagcagc accctgaccc tgagcaaagc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg 360
cgaggtgacc caccagggcc tgagctcccc cgtcaccaag agcttcaaca ggggggagtg 420
ttaggggccc gtttaaacgg gggaggcta 449
<210> 6
<211> 1132
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
gcctccggac tctagagcca ccatgaaaca cctgtggttc ttcctcctgc tggtggcagc 60
tcccagatgg gtgctgagcc aggtgcaatt gtgcaggcgg ttagctcagc ctccaccaag 120
ggcccaagcg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggcgg cacagccgcc 180
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacccgtga ccgtgagctg gaactcaggc 240
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gctgtcctgc agtcctcagg actctactcc 300
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 360
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 420
aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc ctcagtcttc 480
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 540
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 600
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccc cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 660
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 720
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggc 780
cagccccggg aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 840
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 900
gagagcaatg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcccgtgct ggactccgac 960
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1020
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagagcctc 1080
tccctgtctc ccggcaaatg agatatcggg cccgtttaaa cgggggaggc ta 1132
<210> 7
<211> 1410
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of heavy chain of chimeric murine-human TINA1
antibody
<400> 7
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacagt caggatctcc 120
tgcaaggctt ctgggtatac cttcacaact gctggaatgc agtgggtgca aaagatgcca 180
ggaaagggtt tgaagtggat tggctggata aacacccact ctggagtgcc aaaatatgca 240
gaagacttca agggacggtt tgccttctct ttggaaacct ctgccagcac tgcatattta 300
cagataagca acctcaaaaa tgaggacacg actacgtatt tctgtgcgag atcggggttc 360
ggtagtagct actggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccgcggtcac cgtcagctca 420
gcctccacca agggcccaag cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggc 480
ggcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacccgt gaccgtgagc 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgctgtcct gcagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccctgcccag cacctgaact cctgggggga 780
ccctcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cccgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gggtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag gccagccccg ggaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tggccagccc gagaacaact acaagaccac ccctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggca acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacc 1380
cagaagagcc tctccctgtc tcccggcaaa 1410
<210> 8
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of heavy chain of chimeric murine-human TINA1
antibody
<400> 8
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Thr Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Thr Ala Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Met Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Lys Trp Ile Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Thr Thr
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Ala Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 9
<211> 702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of light chain of chimeric murine-human TINA1
antibody
<400> 9
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 120
atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 180
ggacaatctc ctaaactgct gatttactcg gcatcctacc gctacactgg agtccctgat 240
cgcttcactg gcagtggatc tgggacggct ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 300
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatatta ctccgctcac gttcggtgct 360
gggaccaagc tggagctgaa acgggctgtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480
cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600
ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660
ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702
<210> 10
<211> 234
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of light chain of chimeric murine-human TINA1
antibody
<400> 10
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser
20 25 30
Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Phe Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Ile Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
115 120 125
Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 11
<211> 1410
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of heavy chain of humanized TINA1 antibody,
type H1
<400> 11
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcca gcggctacac ctttaccacc gccggcatgc agtgggtgcg ccaggctcct 180
ggacagggcc tggaatggat gggctggatc aacacccaca gcggcgtgcc caaatacgcc 240
gaggacttca agggcagagt gaccatcagc gccgacacca gcacctccac agcctacctg 300
cagctgagca gcctgaagtc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag aagcggcttc 360
ggcagcagct actggtactt cgacgtgtgg ggccagggca ccctcgtgac cgtcagctca 420
gcctccacca agggcccaag cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggc 480
ggcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacccgt gaccgtgagc 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgctgtcct gcagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccctgcccag cacctgaact cctgggggga 780
ccctcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cccgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gggtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag gccagccccg ggaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tggccagccc gagaacaact acaagaccac ccctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggca acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacc 1380
cagaagagcc tctccctgtc tcccggcaaa 1410
<210> 12
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of heavy chain of humanized TINA1 antibody,
type H1
<400> 12
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Thr Ala Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 13
<211> 1410
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of heavy chain of humanized TINA1 antibody,
type H2
<400> 13
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcca gcggctacac ctttaccacc gccggcatgc agtgggtgcg ccaggctcct 180
ggacagggcc tggaatggat gggctggatc aacacccaca gcggcgtgcc caaatacgcc 240
gaggacttca agggcagagt gaccatcagc ctggacacca gcacctccac cgcctacctg 300
cagctgagca gcctgaagtc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag aagcggcttc 360
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ggcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacccgt gaccgtgagc 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgctgtcct gcagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
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aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccctgcccag cacctgaact cctgggggga 780
ccctcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cccgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gggtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag gccagccccg ggaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tggccagccc gagaacaact acaagaccac ccctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
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cagaagagcc tctccctgtc tcccggcaaa 1410
<210> 14
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of heavy chain of humanized TINA1 antibody,
type H2
<400> 14
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
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Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
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Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
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Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
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Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 15
<211> 1410
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of heavy chain of humanized TINA1 antibody,
type H3
<400> 15
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
atccagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacccg gcgagagcgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcca gcggctacac ctttaccacc gccggcatgc agtgggtgca gcagatgcct 180
ggcaagggcc tggaatggat gggctggatc aacacccaca gcggcgtgcc caaatacgcc 240
gaggacttca agggcagagt gaccttcagc ctggacacca gcacctccac cgcctacctg 300
cagctgagca gcctgaagtc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag aagcggcttc 360
ggcagcagct actggtactt cgacgtgtgg ggccagggca ccctcgtgac cgtcagctca 420
gcctccacca agggcccaag cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggc 480
ggcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacccgt gaccgtgagc 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgctgtcct gcagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccctgcccag cacctgaact cctgggggga 780
ccctcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cccgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gggtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag gccagccccg ggaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tggccagccc gagaacaact acaagaccac ccctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggca acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacc 1380
cagaagagcc tctccctgtc tcccggcaaa 1410
<210> 16
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of heavy chain of humanized TINA1 antibody,
type H3
<400> 16
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
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Pro Gly Glu Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
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Glu Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
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465 470
<210> 17
<211> 702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of light chain of humanized TINA1 antibody,
type L1
<400> 17
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
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<211> 234
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of light chain of humanized TINA1 antibody,
type L1
<400> 18
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
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Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
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Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
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<210> 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of light chain of humanized TINA1 antibody,
type L2
<400> 19
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<210> 20
<211> 234
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of light chain of humanized TINA1 antibody,
type L2
<400> 20
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1 5 10 15
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225 230
<210> 21
<211> 702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of light chain of humanized TINA1 antibody,
type L3
<400> 21
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
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ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702
<210> 22
<211> 234
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of light chain of humanized TINA1 antibody,
type L3
<400> 22
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
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Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gln Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Ile Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 23
Thr Ala Gly Met Gln
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 24
Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 25
Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 26
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
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<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 27
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
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<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 28
Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 29
<211> 1410
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
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gcctccacca agggcccaag cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggc 480
ggcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacccgt gaccgtgagc 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgctgtcct gcagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccctgcccag cacctgaact cctgggggga 780
ccctcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cccgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gggtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag gccagccccg ggaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tggccagccc gagaacaact acaagaccac ccctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggca acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacc 1380
cagaagagcc tctccctgtc tcccggcaaa 1410
<210> 30
<211> 470
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 31
<211> 702
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 31
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
gatatccagc tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgtcc 120
atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc attgccgtgg cctggtatca gcagaagccc 180
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacaccgg cgtgcccgac 240
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 300
gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag cactacatca cccccctgac cttcggagcc 360
ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480
cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600
ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660
ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702
<210> 32
<211> 234
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Ser Ile Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Ile Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
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Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer mG2aVR2
<400> 33
agagttccag gtcaaggtca ctggctcagg 30
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer mKVR2
<400> 34
agtccaactg ttcaggacgc cattttgtcg 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer 3.3-F1
<400> 35
tataccgtcg acctctagct agagcttggc 30
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer 3.3-R1
<400> 36
gctatggcag ggcctgccgc cccgacgttg 30
<210> 37
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer TINA1H-F
<400> 37
ccagatgggt gctgagccag atccagttgg tgcagtctgg acctgag 47
<210> 38
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer TINA1H-R
<400> 38
cttggtggag gctgagctga cggtgaccgc ggtccctgcg ccccagac 48
<210> 39
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer TINA1L-F
<400> 39
atctccggcg cgtacggcga cattgtgatg acccagtctc acaaattc 48
<210> 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer TINA1L-R
<400> 40
ggagggggcg gccacagccc gtttcagctc cagcttggtc ccagc 45
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer EG-Inf-F
<400> 41
agctcccaga tgggtgctga gc 22
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer EG1-Inf-R
<400> 42
gggcccttgg tggaggctga gc 22
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer CM-LKF
<400> 43
ctgtggatct ccggcgcgta cggc 24
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer KCL-Inf-R
<400> 44
ggagggggcg gccaccgtac g 21
Claims (10)
- 항 TROP2 항체를 환원 조건으로 처리하고, 그 후에
상기 항체와 다음의 화합물 :
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
을 반응시키는 단계를 포함하는,
다음의 약물-링커 구조 :
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
를 티오에테르 결합을 통해서 항 TROP2 항체에 결합시킨 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 방법.
(식 중, (말레이미드-N-일)- 는, 다음 식 :
으로 나타내는, 질소 원자가 결합 부위인 기이고,
-(숙신이미드-3-일-N)- 는, 다음 식 :
으로 나타내는 구조이며, 이것의 3 위치에서 항체와 결합하고, 1 위치의 질소 원자 상에서 이것을 포함하는 링커 구조 내의 메틸렌기와 결합하고,
-(NH-DX) 는, 다음 식 :
으로 나타내는, 1 위치의 아미노기의 질소 원자가 결합 부위로 되어 있는 기이고, -GGFG- 는, -Gly-Gly-Phe-Gly- 의 테트라펩티드 잔기를 나타낸다.) - 제 1 항에 있어서,
약물-링커 구조의 1 항체당의 평균 결합수가 2 내지 8 개의 범위인 제조 방법. - 제 1 항에 있어서,
약물-링커 구조의 1 항체당의 평균 결합수가 3 내지 8 개의 범위인 제조 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
항 TROP2 항체가, 서열 번호 23 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 24 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 25 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중쇄의 가변 영역, 그리고, 서열 번호 26 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 27 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 28 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 항체인, 제조 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
항 TROP2 항체가,
서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역,
서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역,
서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역, 그리고,
서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역으로 이루어지는 군에서 선택되는 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역을 포함하는 항체인, 제조 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
항 TROP2 항체가,
서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄,
서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄,
서열 번호 14 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 20 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄, 그리고,
서열 번호 16 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 22 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 군에서 선택되는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체인, 제조 방법. - 제 5 항에 있어서,
항 TROP2 항체가, 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 항체인, 제조 방법. - 제 6 항에 있어서,
항 TROP2 항체가, 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 18 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항체인, 제조 방법. - 제 6 항에 있어서,
항 TROP2 항체의 중쇄 카르복실 말단의 리신 잔기가 결실되어 있는, 제조 방법. - 제 8 항에 있어서,
항 TROP2 항체의 중쇄 카르복실 말단의 리신 잔기가 결실되어 있는, 제조 방법.
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