JP2023510905A

JP2023510905A - 抗ｔｒｏｐ－２抗体－エキサテカン類似体複合体及びその医薬用途

Info

Publication number: JP2023510905A
Application number: JP2022543188A
Authority: JP
Inventors: 陽楊; 斉悦胡; 維康陶
Original assignee: Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-01-22
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2023-03-15
Also published as: EP4095148A1; CA3168260A1; TW202140077A; WO2021147993A1; EP4095148A4; US20230101735A1; AU2021210074A1; KR20220130717A; CN114846021A; BR112022014189A2; MX2022008474A

Abstract

【課題】本発明は抗TROP-2抗体-エキサテカン類似体複合体及びその医薬用途を提供する。具体的に、本発明は、一般式（Pc-L-Y-D）で表される抗TROP-2抗体-エキサテカン類似体複合体を提供し、そのうち、Pcは抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片である。JPEG2023510905000066.jpg7182

Description

本願は、2020年1月22日に提出された中国特許出願（出願番号CN 202010073438.8）の優先権を主張する。

本開示は抗TROP-2抗体、抗TROP-2抗体-エキサテカン類似体複合体、その調製方法、それを含む医薬組成物、及びそのTROP-2により仲介される疾患又は病状を治療する薬剤の調製における使用に関し、特に抗がん剤の調製における使用に関する。

ここでの記載は、必ずしも従来技術を構成するものではなく、本開示に関連する背景情報のみを提供する。

TROP-2はヒト栄養膜細胞表面糖タンパク質抗原2であり、又の名は腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー2（TACSTD2）、上皮糖タンパク質1（EGP-1）、胃腸腫瘍関連抗原（GA733-1）、表面マーカー1（M1S1）であり、染色体1p32領域のTacstd2遺伝によりコードされ、発現される細胞表面糖タンパク質である。TROP-2はGA733タンパク質ファミリーに属し、上皮細胞接着分子（EpCAM、Trop1、TACSTD1とも称される）と比較的高い構造配列類似性を有し、相同性が49%に達した。

TROP-2タンパク質の一次構造は約323個のアミノ酸からなる約36 kDのポリペプチドであり、一次構造はN末端グリコシル化により翻訳後に修飾され、EpCAMと異なるI型細胞膜糖タンパク質、即ち、TROP-2タンパク質を形成する。TROP-2タンパク質は細胞膜を貫通し、N末端が細胞外領域（Trop2EC）であり、当該細胞外領域は1つの単一方向膜貫通ヘリックス（TM）により26個のアミノ酸残基からなる疎水性ポリペプチドの細胞内ショートテール（Trop2IC）に接続されることで、細胞膜に固定される。

現在、TROP-2が胎発育及び腫瘍細胞増殖転移の過程において重要な意義を持っていることが発見された。TROP-2は最初に栄養膜細胞で発見され、その表面マーカーとする。栄養細胞は胚外栄養膜に由来し、TROP-2は胚着床及び胎盤組織の形成に寄与し、且つ胚性幹細胞の増殖特性の維持及び器官の形成進展の過程において重要な役割を果している。その他に、TROP-2は重要な腫瘍進展関連因子でもあり、例えば、膵臓がん、乳がん、結腸がん、胃がん、口腔扁平上皮がん、卵巣がんなどの様々な腫瘍に高発現され、腫瘍細胞の増殖、侵襲、転移拡散などの過程を促進でき、その高発現は腫瘍被験者の生存期間の短縮及び予後不良に緊密に関わるため、TROP-2を標的とする抗腫瘍剤の研究は重要な意義を持っている。

抗体-薬物複合体（antibody drug conjugate，ADC）は、モノクローナル抗体又は抗体断片をリンカー化合物により生物活性を有する細胞毒素に接続し、抗体の正常細胞及び腫瘍細胞表面抗原に対する結合特異性及び細胞毒性物質の高効率が活用されると共に、抗体の治療効果が比較的に小さいこと、及び毒性物質の毒性や副作用が大きすぎることといった欠陥が回避される。これは、従来の化学療法薬と比べて、抗体-薬物複合体は腫瘍細胞をより正確に殺し、正常細胞への影響を低減させることができることを意味する。

本開示は、抗TROP-2抗体、そのADC及びその使用に関し、抗TROP-2抗体又は抗原結合断片及び細胞毒性物質であるエキサテカン類似体に複合されたADC薬剤を提供する。

本開示は、一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩を提供し、

そのうち、
Yは、-O-（CR^aR^b）_m-CR¹R²-C（O）-、-O-CR¹R²-（CR^aR^b）_m-、-O-CR¹R²-、-NH-（CR^aR^b）_m-CR¹R²-C（O）-及び-S-（CR^aR^b）_m-CR¹R²-C（O）-から選ばれ、
R^aとR^bは、相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、重水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基及びヘテロシクリル基から選ばれ、或いは、R^aとR^bは、それらに接続された炭素原子とともにシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
R¹は、ハロゲン、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、R²は、水素原子、ハロゲン、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、或いは、R¹とR²は、それらに接続された炭素原子とともにシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
或いは、R^aとR²は、それらに接続された炭素原子とともにシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
mは0～4の整数であり、非限定的な実施例において、例えば、mは0、1、2、3及び4から選ばれ、
nは1～10であり、nは小数又は整数であり、
Lは、リンカーユニットであり、
Pcは、抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片である。

幾つかの実施形態において、前記一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、前記抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、前記重鎖可変領域は配列番号3で表される重鎖可変領域と同じ配列であるHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号4で表される軽鎖可変領域と同じ配列であるLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、前記抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、、そのうち、前記重鎖可変領域はそれぞれ配列番号5、配列番号6及び配列番号7で表されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、前記軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号8、配列番号9及び配列番号10で表されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、前記抗TROP-2抗体はマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、前記抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号3で表され、又はそれと少なくとも90%～100%の同一性を有し、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は少なくとも100%の同一性を含むが、これらに限定されず、及び前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号4で表され、又はそれと少なくとも90%～100%の同一性を有し、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は少なくとも100%の同一性を含むが、これらに限定されない。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、前記抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片は配列が配列番号3で表される重鎖可変領域と配列が配列番号4で表される軽鎖可変領域を含む。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、前記抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片は重鎖定常領域と軽鎖定常領域を含み、好ましくは、前記重鎖定常領域はヒトIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4の定常領域から選ばれ、前記軽鎖定常領域はヒト抗体κ及びλ鎖の定常領域から選ばれ、より好ましくは、前記抗体は配列が配列番号11で表される重鎖定常領域と配列が配列番号12で表される軽鎖定常領域を含む。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、前記抗TROP-2抗体は配列番号13で表される重鎖と配列番号14で表される軽鎖を含む。

幾つかの実施形態において、前記一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、前記抗TROP-2抗体は配列が配列番号15で表される重鎖と配列が配列番号16で表される軽鎖を含み、或いは、配列が配列番号17で表される重鎖と配列が配列番号18で表される軽鎖を含む。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、nは2～10であり、好ましくは4～8であり、nは小数又は整数である。幾つかの実施形態において、nは0～10であり、好ましくは1～10であり、より好ましくは1～8、又は2～8、又は2～7、又は2～4、又は3～8、又は3～7、又は3～6、又は4～7、又は4～6、又は4～5の平均値である。幾つかの実施形態において、nは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10の平均値である。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、
そのうち、
Yは、-O-（CR^aR^b）_m-CR¹R²-C（O）-であり、
R^aとR^bは、相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、重水素原子、ハロゲン及びアルキル基から選ばれ、
R¹は、ハロゲン化アルキル基又はC_3-6シクロアルキル基であり、
R²は、水素原子、ハロゲン化アルキル基及びC_3-6シクロアルキル基から選ばれ、
或いは、R¹とR²は、それらに接続された炭素原子とともにC_3-6シクロアルキル基を形成し、
mは、0又は1である。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、Yは

から選ばれ、
そのうち、YのO端は、リンカーユニットLに接続される。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、リンカーユニット-L-は-L¹-L²-L³-L⁴-であり、
L¹は、-（スクシンイミド-3-イル-N）-W-C（O）-、-CH₂-C（O）-NR³-W-C（O）-及び-C（O）-W-C（O）-から選ばれ、そのうち、Wは、C_1-8アルキル基、C_1-8アルキル基-シクロアルキル基及び1～8個の原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、前記ヘテロアルキル基は、N、O及びSから選ばれる1～3個のヘテロ原子を含み、前記C_1-8アルキル基、シクロアルキル基及び直鎖ヘテロアルキル基は、それぞれ独立的に、任意にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる1つ又は複数の置換基で更に置換され、
L²は、-NR⁴（CH₂CH₂O）pCH₂CH₂C（O）-、-NR⁴（CH₂CH₂O）pCH₂C（O）-、-S（CH₂）pC（O）-又は化学結合から選ばれ、そのうち、pは1～20の整数であり、
L³は、2～7個のアミノ酸残基からなるペプチド残基であり、そのうち、前記アミノ酸残基はフェニルアラニン、グリシン、バリン、リジン、シトルリン、セリン、グルタミン酸及びアスパラギン酸のうちのアミノ酸により形成されるアミノ酸残基から選ばれ、且つ任意にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる1つ又は複数の置換基で更に置換され、
L⁴は、-NR⁵（CR⁶R⁷）_t-、-C（O）NR⁵-、-C（O）NR⁵（CH₂）_t-及び化学結合から選ばれ、そのうち、tは1～6の整数であり、
R³、R⁴及びR⁵は、相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれ、
R⁶とR⁷は、相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれる。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、リンカーユニット-L-は-L¹-L²-L³-L⁴-であり、
L¹は、-（スクシンイミド-3-イル-N）-W-C（O）-、-CH₂-C（O）-NR³-W-C（O）-及び-C（O）-W-C（O）-から選ばれ、そのうち、Wは、C_1-8アルキル基、C_1-8アルキル基-シクロアルキル基及び1～8個の鎖原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、前記ヘテロアルキル基は、N、O及びSから選ばれる1～3個のヘテロ原子を含み、前記C_1-8アルキル基、シクロアルキル基及び直鎖ヘテロアルキル基は、それぞれ独立的に、任意にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる1つ又は複数の置換基で更に置換され、
L²は、-NR⁴（CH₂CH₂O）pCH₂CH₂C（O）-、-NR⁴（CH₂CH₂O）pCH₂C（O）-、-S（CH₂）pC（O）-又は化学結合から選ばれ、そのうち、pは1～20の整数であり、
L³は、2～7個のアミノ酸残基からなるペプチド残基であり、そのうち、前記アミノ酸残基はフェニルアラニン（F）、グリシン（G）、バリン（V）、リジン（K）、シトルリン、セリン（S）、グルタミン酸（Q）及びアスパラギン酸（D）のうちのアミノ酸により形成されるアミノ酸残基から選ばれ、且つ任意にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる1つ又は複数の置換基で更に置換され、
L⁴は、-NR⁵（CR⁶R⁷）_t-、-C（O）NR⁵-、-C（O）NR⁵（CH₂）_t-及び化学結合から選ばれ、tは1～6の整数であり、非限定的な実施例において、1、2、3、4、5及び6であり、
R³、R⁴及びR⁵は、相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれ、
R⁶とR⁷は、相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれる。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、リンカーユニット-L-は-L¹-L²-L³-L⁴-であり、
L¹は

であり、s¹は2～8の整数であり、非限定的な実施例において、2、3、4、5、6、7及び8であり、
L²は、化学結合であり、
L³は、テトラペプチド残基であり、好ましくは、L³はGGFGのテトラペプチド残基であり、
L⁴は、-NR⁵（CR⁶R⁷）_t-であり、R⁵、R⁶又はR⁷は、相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子又はアルキル基であり、tは1又は2であり、
そのうち、前記L¹端は、Pcに接続され、L⁴端は、Yに接続される。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、-L-は、

である。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、-L-Y-は、任意に、

から選ばる。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、一般式（Pc-L_a-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であり、

そのうち、
W、L²、L³、R⁵、R⁶、R⁷は、前記リンカーユニット-L-に定義される通りであり、
Pc、n、R¹、R²、mは、一般式（Pc-L-Y-D）に定義される通りである。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、一般式（Pc-L_b-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であり、

そのうち、
s¹は、2～8の整数であり、
Pc、R¹、R²、R⁵、R⁶、R⁷、m及びnは一般式（Pc-L_a-Y-D）に定義される通りである。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、前記リガンド-薬物複合体は、

から選ばれ、
そのうち、Pcとnは、一般式（Pc-L-Y-D）に定義される通りである。

から選ばれ、
そのうち、
nは4～8であり、nは小数又は整数であり、
Pcは抗TROP-2抗体であり、それは配列番号13で表される重鎖と配列番号14で表される軽鎖を含む。

幾つかの実施形態において、前記一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、前記リガンド-薬物複合体は、

であり、
そのうち、
nは1～8であり、nは小数又は整数であり、好ましくは2～4又は4～8の整数又は小数であり、より好ましくは4～6の整数又は小数であり、
Pcは抗TROP-2抗体であり、それは配列番号13で表される重鎖と配列番号14で表される軽鎖を含み、
或いは、配列番号15で表される重鎖と配列番号16で表される軽鎖を含み、
或いは、配列番号17で表される重鎖と配列番号18で表される軽鎖を含む。

から選ばれ、
そのうち、
nは1～8の小数又は整数であり、好ましくは2～4又は4～8の整数又は小数であり、より好ましくは4～6の整数又は小数であり、
PD3は抗TROP-2抗体であり、それは配列番号13で表される重鎖と配列番号14で表される軽鎖を含み、
hRS7は抗TROP-2抗体であり、或いは、配列番号15で表される重鎖と配列番号16で表される軽鎖を含み、
TINAは抗TROP-2抗体であり、或いは、配列番号17で表される重鎖と配列番号18で表される軽鎖を含む。

本開示は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、前記重鎖可変領域は配列番号3で表される配列の重鎖可変領域と同じ配列であるHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号4で表される軽鎖可変領域と同じ配列であるLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む、抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片を更に提供する。

幾つかの実施形態において、前記抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片であって、それは重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、前記重鎖可変領域はそれぞれ配列番号5、配列番号6及び配列番号7で表されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、前記軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号8、配列番号9及び配列番号10で表されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗TROP-2抗体はマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片であって、それは重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号3で表され、又はそれと少なくとも90%～100%の同一性を有し、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は少なくとも100%の同一性を含むが、これらに限定されず、及び前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号4で示され、又はそれと少なくとも90%～100%の同一性を有し、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%，少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は少なくとも100%の同一性を含むが、これらに限定されない。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片は抗体重鎖定常領域と軽鎖定常領域を含み、好ましくは、前記重鎖定常領域はヒトIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4の定常領域及びその通常の変異体から選ばれ、前記軽鎖定常領域はヒト抗体κ及びλの鎖定常領域及びその通常の変異体から選ばれ、より好ましくは、前記抗体は配列番号11で表される重鎖定常領域と配列番号12で表される軽鎖定常領域を含む。

幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗TROP-2抗体は配列番号13で表される重鎖と配列番号14で表される軽鎖を含む。

別の態様において、本開示は、前記抗TROP-2抗体をコードする核酸分子を提供する。別の態様において、本開示は、前記抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸分子を提供する。

別の態様において、本開示は、前記核酸分子を含む宿主細胞を提供する。

本開示は、下記ステップ、即ち、

Pcを還元した後、一般式（L_a-Y-D）で表される化合物とカップリング反応し、一般式（Pc-L_a-Y-D）で表される化合物を得るステップを含み、
そのうち、
Pcは、抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片であり、
n、m、W、L²、L³、R¹、R²、R⁵、R⁶及びR⁷は前述一般式（Pc-L_a-Y-D）に定義される通りである、一般式（Pc-L_a-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩を調製する方法を更に提供する。

本開示は、下記ステップ、即ち、

Pcを還元した後、式（L’-D）で表される化合物とカップリング反応し、一般式（Pc-L’-D）で表される化合物を得るステップを含み、そのうち、
Pcは、前記抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片であり、
nは、一般式（Pc-L-Y-D）に定義される通りである、一般式（Pc-L’-D）で表されるリガンド-薬物複合体を調製する方法を更に提供する。

別の態様において、本開示は、前記何れか1項に記載のリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、又は前記何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片と、1種又は複数種の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又はベクターと、を含む医薬組成物を提供する。幾つかの実施形態において、前記単位用量の医薬組成物は、0.1～3000 mg又は1～1000 mgの前記抗TROP-2抗体又は前記抗体-薬物複合体を含む。

別の態様において、本開示は、前記何れか1項に記載のリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、或いは前記何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片又はそれを含む医薬組成物の薬剤としての使用を提供する。

別の態様において、本開示は、TROP-2により仲介される疾患又は病状又は腫瘍を治療するための薬剤の調製における、前記何れか1項に記載のリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、或いは前記何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片又はそれを含む医薬組成物の使用を提供し、前記TROP-2により仲介される疾患又は病状はTROP-2高発現がん、中発現がん又は低発現がんである。

別の態様において、本開示は、腫瘍を治療又は予防するための薬剤の調製における、前記何れか1項に記載のリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、或いは前記何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片又はそれを含む医薬組成物の使用を提供し、前記腫瘍及びがんは、好ましくは、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、咽頭扁平上皮がん、口腔扁平上皮がん、鼻咽頭がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝がん、肝胆がん、膵臓がん、胃がん、消化管がん、腸がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎がん、明細胞腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、クルッケンベルグ腫瘍、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、尿路上皮がん及びメルケル細胞がんであり、より好ましくは、前記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、縦隔原発大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、T細胞／組織球に富む大細胞型B細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫から選ばれ、前記肺がんは、非小細胞肺がん及び小細胞肺がんから選ばれ、前記白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄細胞白血病から選ばれる。

別の態様において、本開示は更に、腫瘍を治療及び／又は予防するための方法に関し、当該方法は、それを必要とする被験者に治療有効量の前記何れか1項に記載のリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、或いは前記何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片又はその薬学的に許容される塩又はそれを含む医薬組成物を投与することを含み、好ましくは、前記腫瘍は、TROP-2高発現、中発現又は低発現に関連するがんである。

別の態様において、本開示は更に、腫瘍又はがんを治療又は予防するための方法に関し、当該方法は、それを必要とする被験者に治療有効量の前記何れか1項に記載のリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、或いは前記何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片又はそれを含む医薬組成物を投与することを含み、前記腫瘍及びがんは、好ましくは、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、咽頭扁平上皮がん、口腔扁平上皮がん、鼻咽頭がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝がん、肝胆がん、膵臓がん、胃がん、消化管がん、腸がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎がん、明細胞腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、クルッケンベルグ腫瘍、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、尿路上皮がん及びメルケル細胞がんであり、より好ましくは、前記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、縦隔原発大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、T細胞／組織球に富む大細胞型B細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫から選ばれ、前記肺がんは、非小細胞肺がん及び小細胞肺がんから選ばれ、前記白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄細胞白血病から選ばれる。

別の態様において、本開示は、前述抗TROP-2抗体又はその抗体-薬物複合体を薬剤として、好ましくは、がん又は腫瘍を治療する薬剤として、より好ましくは、TROP-2により仲介されるがんを治療する薬剤として、更に提供する。

活性化合物（例えば、本開示に記載のリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩）を、任意の適切な経路による投与に適する形態に調製することができ、活性化合物は、単位用量の形態、又は被験者が単位用量で自己投与できるような形態を採用するであることが好ましい。本開示に記載の活性化合物又は組成物の単位用量の形態は錠剤、カプセル、カシェ剤、瓶詰めの薬液、ドラッグパウダー、顆粒剤、トローチ、坐剤、再生粉末又は液体製剤であってもよい。

本開示に係る治療法に使用される活性化合物又は組成物の投与量は、一般的に、疾患の重症度、被験者の体重及び活性化合物の効能によって変化する。一般的な目安として、好適な単位用量は0.1 mg～1000 mgであってもよい。

本開示に係る医薬組成物は、活性化合物の他に、1種又は複数種の添加物を含んでもよく、前記添加物は充填剤、希釈剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤又は賦形剤などの成分から選ばれる。投与の方法によって、組成物は0.1～99重量%の活性化合物を含んでもよい。

本開示により提供されるTROP-2抗体及び抗体-薬物複合体は、細胞表面抗原と良好な親和力、良好な細胞エンドサイトーシス効率及び強い腫瘍阻害効率を有するとともに、より広い薬物薬剤応用用途を有し、臨床的な薬剤応用に適する。

抗TROP-2抗体とTROP-2を発現する細胞との結合実験結果を示す。 ADCのBxPC3細胞及びMiaPaCa2混合細胞に対するバイスタンダー殺傷活性結果を示す。異なるADCのマウス体内FaDu移植腫瘍に対する阻害活性を示す。異なる用量のADCのマウス体内SKOV3移植腫瘍に対する阻害活性を示す。異なる用量のADCのマウス体内Colo205移植腫瘍に対する阻害活性を示す。

一、用語
別途に制限のない限り、本願に使用される技術と科学用語の全ては、当業者により一般的に理解されているものと一致している。本願中の記載と類似又は同等の任意の方法と材料により本開示を実施又は試験することができるが、本願には、好ましい方法と材料が記載されている。本開示を記載及び特許請求する時には、以下の定義に従って下記の用語を使用する。

本開示において商品名が使用される時には、当該商品名の製品の製剤、当該商品名の製品の薬剤及び活性薬剤部分を含むことが意図されている。

逆の説明の無い限り、明細書及び特許請求の範囲に使用される用語は、下記の意味を有する。

用語「薬剤」は細胞毒性薬剤であり、腫瘍細胞内にその正常増殖を比較的強く破壊する化学分子を有することができる。細胞毒性薬剤は、原則的に、十分に高い濃度で細胞を死滅させることができるが、特異性が欠けているため、腫瘍細胞を殺傷すると同時に、正常な細胞のアポトーシスも招き、重篤な副作用を引き起こす。当該用語は、細菌、真菌、植物や動物由来の小分子毒素又は酵素活性毒素などの毒素、放射性同位体（例えば、At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²及びLuの放射性同位体）、化学療法薬、抗生物質及び核酸分解酵素を含む。

用語「リンカーユニット」、「リンカー」、「接続ユニット」又は「接続断片」は、一端がリガンドに接続され、他端が薬剤に接続される化学構造断片又は結合であり、その他のリンカーに接続された後、更にリガンド又は薬剤に接続されてもよい。

リンカーは、1種又は複数種のリンカー要素を含んでもよい。例示的なリンカー要素は、6-マレイミドカプロイル（「MC」）、マレイミドプロピオニル（「MP」）、バリン-シトルリン（「val-cit」又は「vc」）、アラニン-フェニルアラニン（「ala-phe」）、p-アミノベンジルオキシカルボニル（「PAB」）、N-スクシンイミジル4-（2-ピリジルチオ）ペンタノエート（「SPP」）、N-スクシンイミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1カルボキシレート（「SMCC」、本願には、「MCC」とも称する）及びN-スクシンイミジル（4-ヨード-アセチル）アミノベンゾエート（「SIAB」）を含む。リンカーは、下記要素、即ち、伸長体、スペーサー及びアミノ酸単位又はこれらの組合せから選ばれてもよい。例えば、US2005-0238649A1に記載された本分野で知られている方法によりリンカーを合成することができる。リンカーは、細胞で薬剤を放出しやすくする「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン）、プロテアーゼ感受性（例えば、ペプチダーゼ感受性）リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Chariら, Cancer Research 52：127-131（1992）、米国特許No. 5, 208, 020）を使用してもよい。

リンカー要素は、下記のもの、即ち、
下記の構造であるMC＝6-マレイミドカプロイル、即ち、

Val-Cit又は「vc」＝バリン-シトルリン（プロテアーゼ切断可能リンカーにおける例示的なジペプチド）、
シトルリン＝2-アミノ-5-ウレイドペンタン酸、
PAB＝p-アミノベンジルオキシカルボニル（「自己犠牲」リンカー要素の例）、
Me-Val-Cit＝N-メチル-バリン-シトルリン（そのうち、カテプシンBにより切断されないように、リンカーペプチド結合は修飾されている）、
MC（PEG）6-OH＝マレイミドカプロイル-ポリエチレングリコール（抗体システインに付着可能）、
SPP＝N-スクシンイミジル4-（2-ピリジルチオ）ペンタノエート、
SPDP＝N-スクシンイミジル3-（2-ピリジルジチオ）プロピオネート、
SMCC＝スクシンイミジル-4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート、及び
IT＝イミノチオラン、を含むが、これらに限定されない。

用語「リガンド-薬物複合体」は、リガンドが接続ユニットにより生物活性を有する薬剤に接続されたものであり、好ましくは「抗体-薬物複合体」である。本開示における「抗体-薬物複合体」（antibody drug conjugate，ADC）は、モノクローナル抗体又は抗体断片を接続ユニットにより生物活性を有する毒性薬剤に接続したものである。抗体は、直接的に、又はリンカーを介して薬剤に複合されてもよい。nは各抗体の平均薬剤モジュール数であり、整数又は小数であってもよい。その範囲として、例えば、各抗体に対して約0～約20個の薬剤モジュールである。幾つかの実施形態において、各抗体に対して1～約10個の薬剤モジュールである。幾つかの実施形態において、各抗体に対して1～約8個の薬剤モジュールであり、例えば、2、3、4、5、6、7、8個の薬剤モジュールである。本開示の抗体-薬物複合体の混合物の組成物において、各抗体の平均薬剤荷重は約1～約10個であり、約3～約7個、約3～約6個、約3～約5個、約1～約9個、約7個又は約4個を含むが、これらに限定されない。

本開示に使用されるアミノ酸の3文字コードと1文字コードは、J. biol. chem, 243, p3558(1968)に記載される通りである。

用語「抗体」は、免疫グロブリンであり、2つの重鎖と2つの軽鎖が鎖間ジスルフィド結合により接続されてなるテトラペプチド鎖構造である。免疫グロブリンは、免疫グロブリン重鎖定常領域のアミノ酸組成と配列順序によって、5種類に分けられ、又はIgM、IgD、IgG、IgA及びIgEという免疫グロブリンのアイソタイプと称されてもよく、その対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。同一種類のIgは、そのヒンジ領域のアミノ酸組成及び重鎖ジスルフィド結合の数と位置の差によって、異なるサブクラスにさらに分けることができ、例えば、IgGは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4に分けられてもよい。軽鎖は、定常領域によって、κ鎖又はλ鎖に分けられる。5種類のIgのそれぞれは、κ鎖又はλ鎖を有してもよい。

全長抗体重鎖及び軽鎖は、N末端に近い約110個のアミノ酸の配列の変化が大きくて、可変領域（Fv領域）となり、C末端に近い残りのアミノ酸配列が比較的に安定的で、定常領域となる。可変領域は、3つの超可変領域（HVR）と、4つの配列が比較的に保存的なフレームワーク領域（FR）とを含む。3つの超可変領域は、抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（CDR）とも称される。それぞれの軽鎖可変領域（LCVR）及び重鎖可変領域（HCVR）は、3つのCDR領域と、4つのFR領域とからなり、アミノ基末端からカルボキシ基末端へ、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配列されている。軽鎖の3つのCDR領域は、LCDR1、LCDR2及びLCDR3であり、重鎖の3つのCDR領域は、HCDR1、HCDR2及びHCDR3である。

用語「完全ヒト化抗体」、「完全ヒト抗体」、「ヒト抗体」又は「全ヒト抗体」は、「全ヒトモノクローナル抗体」とも称され、その抗体の可変領域と定常領域は何れも免疫原性及び毒性や副作用が除去されたヒト由来のものである。全ヒト抗体の調製に関連する技術は、主に、ヒトハイブリドーマ技術、EBV形質転換Bリンパ球技術、ファージディスプレイ技術（phage display）、トランスジェニックマウス抗体調製技術（transgenic mouse）及び単一B細胞抗体調製技術などがある。

用語「抗原結合断片」は、抗原と特異的に結合する能力を保つ抗体の1つ又は複数の断片である。全長抗体の断片により抗体の抗原結合機能を果たすことができる。「抗原結合断片」に含まれる結合断片は、Fab、Fab'、F（ab'）2、単鎖抗体（scFv）、二量化のV領域（二重抗体）、ジスルフィド結合安定化のV領域（dsFv）及びCDRを含むペプチドの抗原結合断片から選ばれ、例としては、（i）VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる1価断片であるFab断片、（ii）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により接続された2つのFab断片を含む2価断片であるF（ab'）₂断片、（iii）VHとCH1ドメインからなるFd断片、（iv）抗体の単アームのVHとVLドメインからなるFv断片、（v）VHドメインからなる単一ドメイン又はdAb断片（Wardら, （1989）Nature341：544-546）、及び（vi）分離した相補性決定領域（CDR）又は（vii）合成されたリンカーにより任意に接続された2つ以上の分離したCDRの組合せ、を含む。また、Fv断片の2つのドメインであるVL及びVHは、分離した遺伝子でコードされるが、組換え法で、合成されたリンカーでそれらを接続することにより、その中のVL及びVH領域がペアリングして1価分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Fv（scFv）と称され、例えば、Birdら（1988）Science242：423-426、及びHustonら（1988）Proc. Natl. Acad. Sci USA85：5879-5883を参照）を生成することができる。このような単鎖抗体も、用語である抗体の「抗原結合断片」に含まれようとしている。当業者に知られている通常の技術により、このような抗体断片が得られ、また、完全な抗体と同様に、機能性によって断片が選別される。抗原結合部分は、組換えDNA技術により、又は、完全な免疫グロブリンを酵素的又は化学的に切断することで生成することができる。抗体は、例えば、IgG（例えば、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4サブタイプ）、IgA1、IgA2、IgD、IgE又はIgM抗体のような異なるアイソタイプの抗体であってもよい。

通常、Fabは、プロテアーゼであるパパイン（例えば、H鎖を切断する224位のアミノ酸残基）でIgG抗体分子を処理することにより得られた断片における、約50, 000の分子量を有して抗原結合活性を有する抗体断片であり、そのうち、H鎖のN末端側の部分とL鎖は、ジスルフィド結合により一緒に結合される。

通常、F（ab'）2は、酵素であるペプシンでIgGヒンジ領域におけるジスルフィド結合の下方部分を消化することにより得られた、分子量が約100, 000で、抗原結合活性を有し、ヒンジにて接続された2つのFab領域を含む抗体断片である。

通常、Fab'は、上記F（ab'）2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することにより得られた、分子量が約50, 000で抗原結合活性を有する抗体断片である。

また、Fab'断片をコードするDNAを、原核生物発現ベクター又は真核生物発現ベクターに挿入し、ベクターを原核生物又は真核生物に導入することにより、Fab'を発現して前記Fab'を産生することができる。

用語「単鎖抗体」、「単鎖Fv」又は「scFv」は、リンカーにより接続された抗体重鎖可変ドメイン（又はVH）と抗体軽鎖可変ドメイン（又はVL）を含む分子である。このようなscFv分子は、NH₂-VL-リンカー-VH-COOH又はNH₂-VH-リンカー-VL-COOHという一般的な構造を有してもよい。好適な従来技術のリンカーは、反復のGGGGSアミノ酸配列又はその変異体からなり、例えば、1～4個の反復変異体（Holligerら（1993）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA90：6444-6448）が用いられる。本開示に使用されるその他のリンカーは、Alfthanら, （1995）, Protein Eng. 8：725-731、Choiら, （2001）, Eur. J. Immuno l. 31：94-106、Huら, （1996）, Cancer Res. 56：3055-3061、Kipriyanovら, （1999）, J. Mol. Biol. 293：41-56及びRooversら, （2001）, Cancer Immunol. に記載されている。

用語「CDR」は、抗体の可変ドメインにおいて主に抗原結合を促進する6つの超可変領域の一つである。通常、各重鎖可変領域には、3つのCDR（HCDR1、HCDR2、HCDR3）があり、各軽鎖可変領域には、3つのCDR（LCDR1、LCDR2、LCDR3）がある。「Kabat」番号付け規則（Kabatら（1991）, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MDを参照）、「Chothia」番号付け規則（Al-Lazikaniら, （1997）JMB 273：927-948を参照）及びImMunoGenTics（IMGT）番号付け規則（Lefranc M. P. , Immunologist, 7, 132-136（1999）、Lefranc、M. P.ら, Dev. Comp. Immunol. , 27, 55-77（2003）などを含む種々の公知方法の何れか1つによって、CDRのアミノ酸配列境界を決定することができる。例えば、典型的な書式では、Kabat規則によれば、前記重鎖可変領域（VH）中のCDRアミノ酸残基の番号は31-35（HCDR1）、50-65（HCDR2）及び95-102（HCDR3）で、軽鎖可変領域（VL）中のCDRアミノ酸残基の番号は24-34（LCDR1）、50-56（LCDR2）及び89-97（LCDR3）である。Chothia規則によれば、VH中のCDRアミノ酸の番号は26-32（HCDR1）、52-56（HCDR2）及び95-102（HCDR3）で、VL中のアミノ酸残基の番号は26-32（LCDR1）、50-52（LCDR2）及び91-96（LCDR3）である。KabatとChothiaの両方を組み合わせたCDR定義によって、CDRはヒトVH中のアミノ酸残基26-35（HCDR1）、50-65（HCDR2）及び95-102（HCDR3）及びヒトVL中のアミノ酸残基24-34（LCDR1）、50-56（LCDR2）及び89-97（LCDR3）により構成される。IMGT規則によれば、VH中のCDRアミノ酸残基の番号は大体、26-35（CDR1）、51-57（CDR2）及び93-102（CDR3）で、VL中のCDRアミノ酸残基の番号は大体、27-32（CDR1）、50-52（CDR2）及び89-97（CDR3）である。IMGT規則によれば、抗体のCDR領域は、プログラムIMGT/DomainGap Alignによって決定することができる。

用語「フレームワーク領域」は、可変ドメインVL又はVHの一部であり、当該可変ドメインの抗原結合ループ（CDR）の足場として用いられる。実質的に、それは、CDRを有しない可変ドメインである。

用語「エピトープ」又は「抗原決定基」は、抗原上の免疫グロブリン又は抗体によって結合された部位である。エピトープは、通常、独特な空間配座で少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個の連続又は非連続のアミノ酸を含む。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology, 第66巻, G. E. Morris, Ed. （1996）を参照する。

用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合」及び「特異的に結合」は、抗体又はその断片の、予め決定された抗原におけるエピトープに対する結合である。通常、抗体又はその断片は、約10^-7 M未満、例えば、約10^-8 M、10^-9 M若しくは10^-10 M未満又はそれ以下の親和力（KD）で結合される。

用語「KD」は、抗体ー抗原が互いに作用する解離平衡定数である。通常、本開示の抗体又は抗原結合断片は、約10^-7 M未満、例えば、約10^-8 M又は10^-9 M未満の解離平衡定数（KD）でTROP-2又はそのエピトープと結合し、例えば、本開示において、抗体と細胞表面抗原との親和力は、FACS法でKD値を測定する。

用語「核酸分子」は、DNA分子又はRNA分子である。核酸分子は、単鎖又は二本鎖であってもよいが、二本鎖DNAが好ましい。核酸を別の核酸配列と共に機能的関係に置く場合に、核酸は「効果的に接続」である。例えば、プロモーター又はエンハンサーがコード配列の転写に影響を与えると、プロモーター又はエンハンサーは、前記コード配列に効果的に接続される。

アミノ酸配列の「同一性」は、アミノ酸配列のアラインメント過程において、最も大きい配列同一性のパーセンテージが達成されるように、必要な時にギャップを導入し、且つ、任意の保存的置換も配列同一性の一部とは見なされずに、第1配列における第2配列中のアミノ酸残基と同様のアミノ酸残基のパーセンテージである。アミノ酸の配列同一性のパーセンテージを測定するために、アラインメントは、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの公的に取得可能なコンピュータソフトウェアなどの、本分野の技術的範囲における複数の方式により実現することができる。当業者は、比較される配列の全長で最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントの測定に適用されるパラメータを決定することができる。

用語「発現ベクター」は、それに接続された別の核酸を輸送可能な核酸分子である。一実施形態において、ベクターは「プラスミド」であり、他のDNAセグメントをそれに接続可能な環状二本鎖DNA環を指す。別の実施形態において、ベクターは、他のDNAセグメントをウイルスゲノムに接続可能なウイルスベクターである。本願に開示されるベクターは、それらを導入した宿主細胞において自己複製することができ（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター）、又は、宿主細胞に導入された後、宿主細胞のゲノムに整合されることで、宿主ゲノムと共に複製することができる（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）。

従来の技術においてよく知られている抗体及び抗原結合断片を産生・精製する方法は、例えば、コールド・スプリング・ハーバーの抗体実験技術マニュアルの5～8章及び15章の通りである。発明に記載の抗体又は抗原結合断片は、遺伝子工学的方法により、非ヒトのCDR領域に1つ又は複数のヒトFR領域が加えられる。ヒトFR生殖細胞系配列は、IMGTヒト抗体可変領域生殖細胞系遺伝子データベースとMOEソフトウェアをアラインメントすることにより、ImMunoGeneTics（IMGT）のホームページから取得し、又は免疫グロブリン雑誌、Lefranc, G. , The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, 2001ISBN012441351から取得することができる。

用語「宿主細胞」は、発現ベクターが既に導入された細胞である。宿主細胞は、微生物（例えば、細菌）、植物又は動物細胞を含んでもよい。形質転換しやすい細菌は、大腸菌（Escherichia coli）やサルモネラ菌（Salmonella）の菌株などの腸内細菌科（enterobacteriaceae）のメンバー、枯草菌（Bacillus subtilis）などのバシラス科（Bacillaceae）、肺炎球菌（Pneumococcus）、連鎖球菌（Streptococcus）及びインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）を含む。好適な微生物は、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）及びピキア酵母（Pichia pastoris）を含む。好適な動物宿主細胞系は、CHO（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）及びNS0細胞を含む。

本開示の工学的な抗体又は抗原結合断片は、通常の方法により、調製と精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするcDNA配列は、クローンして発現ベクターに組換えることができる。組換えた免疫グロブリン発現ベクターは、宿主細胞を安定してトランスフェクションすることができる。さらに好ましい従来技術の一つとして、哺乳動物発現系は、特にFc領域のN末端部位において、抗体のグリコシル化を引き起こすことになる。陽性クローンは、バイオリアクターの培地において培養を拡大することで、抗体を産生する。抗体を分泌した培養液は、通常の技術により精製することができる。例えば、A又はG Sepharose FFカラムで精製する。非特異的に結合した成分を洗い流す。そして、pH勾配法により結合した抗体を溶離し、SDS-PAGEで抗体断片を検出し、収集する。抗体は、通常の方法により濾過濃縮することができる。可溶性の混合物及び多量体は、分子ふるい、イオン交換などの通常の方法により除去されてもよい。得られた生成物は、直ちに例えば、-70℃で冷凍し、又は凍結乾燥しなければならない。

用語「ペプチド」は、2個以上のアミノ酸分子がペプチド結合により互いに接続されてなる分子であり、タンパク質の構造及び機能的断片である。

用語「アルキル基」は、飽和脂肪族炭化水素基であり、1～20個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖基であり、1～12個（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12個）の炭素原子を含むアルキル基が好ましく、1～10個の炭素原子を含むアルキル基がより好ましく、1～6個の炭素原子を含む（1個、2個、3個、4個、5個又は6個の炭素原子を含む）アルキル基が最も好ましい。非限定的な例は、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、sec-ブチル基、n-ペンチル基、1,1-ジメチルプロピル基、1,2-ジメチルプロピル基、2,2-ジメチルプロピル基、1-エチルプロピル基、2-メチルブチル基、3-メチルブチル基、n-ヘキシル基、1-エチル-2-メチルプロピル基、1,1,2-トリメチルプロピル基、1,1-ジメチルブチル基、1,2-ジメチルブチル基、2,2-ジメチルブチル基、1,3-ジメチルブチル基、2-エチルブチル基、2-メチルペンチル基、3-メチルペンチル基、4-メチルペンチル基、2,3-ジメチルブチル基、n-ヘプチル基、2-メチルヘキシル基、3-メチルヘキシル基、4-メチルヘキシル基、5-メチルヘキシル基、2,3-ジメチルペンチル基、2,4-ジメチルペンチル基、2,2-ジメチルペンチル基、3,3-ジメチルペンチル基、2-エチルペンチル基、3-エチルペンチル基、n-オクチル基、2,3-ジメチルヘキシル基、2,4-ジメチルヘキシル基、2,5-ジメチルヘキシル基、2,2-ジメチルヘキシル基、3,3-ジメチルヘキシル基、4,4-ジメチルヘキシル基、2-エチルヘキシル基、3-エチルヘキシル基、4-エチルヘキシル基、2-メチル-2-エチルペンチル基、2-メチル-3-エチルペンチル基、n-ノニル基、2-メチル-2-エチルヘキシル基、2-メチル-3-エチルヘキシル基、2,2-ジエチルペンチル基、n-デシル基、3,3-ジエチルヘキシル基、2,2-ジエチルヘキシル基、及びその様々な分岐鎖異性体などを含む。より好ましくは、1～6個の炭素原子を含む低級アルキル基であり、その非限定的な実施例は、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、sec-ブチル基、n-ペンチル基、1,1-ジメチルプロピル基、1,2-ジメチルプロピル基、2,2-ジメチルプロピル基、1-エチルプロピル基、2-メチルブチル基、3-メチルブチル基、n-ヘキシル基、1-エチル-2-メチルプロピル基、1,1,2-トリメチルプロピル基、1,1-ジメチルブチル基、1,2-ジメチルブチル基、2,2-ジメチルブチル基、1,3-ジメチルブチル基、2-エチルブチル基、2-メチルペンチル基、3-メチルペンチル基、4-メチルペンチル基、2,3-ジメチルブチル基などを含む。アルキル基は、置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合に、置換基は任意の利用可能な接続部位で置換されてもよく、前記置換基は、独立的に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクロアルキルチオ基、オキソ基から選ばれる1つ又は複数の基であることが好ましい。

用語「ヘテロアルキル基」は、N、O又はSから選ばれる1つ又は複数のヘテロ原子を含むアルキル基であり、そのうち、アルキル基は、上記に定義される通りである。

用語「アルキレン基」は、アルカン母体の同じ炭素原子又は2個の異なる炭素原子から2個の水素原子を除去して誘導される残基を有する飽和の直鎖又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基であり、1～20個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖基であり、好ましくは1～12個（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12個）の炭素原子を含み、より好ましくは1～6個の炭素原子を含む（1個、2個、3個、4個、5個又は6個の炭素原子を含む）アルキレン基である。アルキレン基の非限定的な例は、メチレン（-CH₂-）、1,1-エチリデン（-CH（CH₃）-）、1,2-エチリデン（-CH₂CH₂）-、1,1-プロピリデン（-CH（CH₂CH₃）-）、1,2-プロピリデン（-CH₂CH（CH₃）-）、1,3-プロピリデン（-CH₂CH₂CH₂-）、1,4-ブチリデン（-CH₂CH₂CH₂CH₂-）及び1,5-ブチリデン（-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-）などを含むが、これらに限定されない。アルキレン基は、置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合に、置換基は任意の利用可能な接続部位で置換されてもよく、前記置換基は、独立的に、任意にアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクロアルキルチオ基及びオキソ基から選ばれる1つ又は複数の基であることが好ましい。

用語「アルコキシ基」は、-O-（アルキル基）及び-O-（非置換のシクロアルキル基）であり、そのうち、アルキル基又はシクロアルキル基の定義は、上記の通りである。アルコキシ基の非限定的な例は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、シクロプロポキシ基、シクロブトキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基を含む。アルコキシ基は、任意に置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合に、置換基は、独立的に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクロアルキルチオ基から選ばれる1つ又は複数の基であることが好ましい。

用語「ハロゲン化アルキル基」は、アルキル基上の水素が1つ又は複数のハロゲンで置換されたものであり、そのうち、アルキル基は、上記に定義される通りである。

用語「重水素化アルキル基」は、アルキル基上の水素が1つ又は複数の重水素原子で置換されたものであり、そのうち、アルキル基は、上記に定義される通りである。

用語「ヒドロキシアルキル基」は、アルキル基上の水素が1つ又は複数のヒドロキシ基で置換されたものであり、そのうち、アルキル基は、上記に定義される通りである。

用語「ヒドロキシ基」は、-OH基である。

用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素である。

用語「アミノ基」は、-NH₂である。

用語「ニトロ基」は、-NO₂である。

用語「シアノ基」は、-CNである。

本開示は、各種の重水素化形態の式（Pc-L-Y-D）の化合物を更に含む。炭素原子に接続される各利用可能な水素原子は、独立的に重水素原子で置換可能である。当業者は、関連文献を参照して重水素化形態の式（Pc-L-Y-D）の化合物を合成することができる。重水素化形態の式（Pc-L-Y-D）の化合物を調製する場合に、市販の重水素化出発物質を使用してもよく、又は、従来技術により重水素化試薬を使用して合成してもよく、重水素化試薬は、重水素化ボラン、三重水素化ボランテトラヒドロフラン溶液、重水素化リチウムアルミニウム、重水素化ヨードエタンや重水素化ヨードメタンなどを含むが、これらに限定されない。

「任意」又は「任意に」は、その後に説明される事象又は状況が発生されてもよいが、必ずしもそうは限らないことを意味し、当該表現は、この事象又は状況が発生される場合と発生されない場合とを含む。例えば、「任意にアルキル基で置換されるヘテロシクリル基」は、アルキル基が存在してもよいが、必ずしもそうは限らないことを意味し、当該表現は、ヘテロシクリル基がアルキル基で置換される場合と、ヘテロシクリル基がアルキル基で置換されない場合とを含む。

「置換される」は、基における1つ又は複数の水素原子、好ましくは多くとも5個、より好ましくは1個、2個又は3個の水素原子が、互いに独立的に置換基で置換される。置換基は、それらの化学的に可能な位置にしか位置せず、当業者は、過度の努力をしなくても（実験又は理論により）可能又は不可能な置換を決定することができる。例えば、遊離水素を有するアミノ基又はヒドロキシ基が不飽和（例えば、オレフィン）結合を有する炭素原子と結合する場合は、不安定になる可能性がある。

用語「医薬組成物」は、1種又は複数種の本願に記載の化合物又はその生理学的/薬学的に利用可能な塩若しくはプロドラッグと他の化学成分の混合物、及び生理学的/薬学的に利用可能なベクターと賦形剤などの他の成分を含むことを示す。医薬組成物は、生体への投与を促進し、活性成分の吸収に寄与してさらに生物活性を発揮するためのものである。

用語「薬学的に許容される塩」又は「薬学的に利用可能な塩」は、本開示に係る抗体-薬物複合体の塩であり、このような塩は、被験者に用いられる場合、安全性と有效性を有するとともに、所望の生物活性を有し、本開示に係るリガンド-薬物複合体は、少なくとも1つのアミノ基を含むため、酸と一緒に塩を形成することができ、薬学的に利用可能な塩の非限定的な例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、アスコルビン酸塩、シュウ酸塩、硝酸塩、ソルビン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、サリチル酸塩、クエン酸水素塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩及びp-トルエンスルホン酸塩を含む。

用語「薬剤負荷量」又は「平均薬剤荷重」は、リガンド-薬物複合体における各リガンドに負荷された細胞毒性薬剤の平均数量であり、薬剤量と抗体量との比率で表されてもよく、薬剤負荷量の範囲として、各リガンド（Pc）が0～12つ、好ましくは1～10つの細胞毒性薬剤に接続されてもよい。本開示の実施形態において、薬剤負荷量はnで表され、DAR（Drug-antibody Ratio）値とも称され、例示的に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10の平均値である。UV／可視分光法、質量分析、ELISA試験及びHPLCのような通常の方法で、カップリング反応後の各ADC分子の薬剤平均数量を特徴付けることができる。

本開示の一実施形態において、細胞毒性薬剤は、接続ユニットにより抗体のメルカプト基に複合されている。

下記非限定的な方法、即ち、
（1）接続試薬とモノクローナル抗体とのモル比を制御することと、
（2）反応時間と温度を制御することと、
（3）異なる反応試薬を選択することと、
を含む非限定的な方法でリガンド-薬物複合体の負荷量を制御することができる。

一般的な医薬組成物の調製は、中国薬典に示されている。

用語「ベクター」は、本開示の薬剤に利用されるものとして、薬剤の人体への入り方と体内での分布を変更し、薬剤の放出速度を制御し、薬剤を標的器官に輸送することができる系である。薬剤ベクターの放出と標的系により、薬剤の分解と損失を低減し、副作用を低下させ、生体利用率を向上させることができる。例えば、ベクターとしての高分子界面活性剤は、その独特な両親媒性構造のため、自己集合して様々な形態の凝集体を形成することができ、好ましい例は、例えば、ミセル、マイクロエマルジョン、ゲル、液晶、ベシクルなどである。これらの凝集体は、薬剤分子を封入する能力を有するとともに、膜に対して良好な透過性を有し、良い薬剤ベクターとすることができる。

用語「賦形剤」は、薬剤製剤における主剤以外の添加物であり、補助材料と称されてもよい。例えば、錠剤中の結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、半固体製剤軟膏剤やクリーム剤中の基質部分、液体製剤中の防腐剤、酸化防止剤、矯味薬、芳香剤、共溶媒、乳化剤、溶解補助剤、浸透圧調整剤、着色剤などは、いずれも賦形剤と称されてもよい。

用語「希釈剤」は、充填剤とも称され、その主な用途は、錠剤の重量と体積を増加させることである。希釈剤を加えることにより、一定の体積の大きさが確保されるだけでなく、主成分の用量偏差が低減され、薬剤の圧縮成形性などが改善される。錠剤の薬剤が油性成分を含む場合、「乾燥」状態を保持し、錠剤の作成に寄与するために、吸収剤を加入して油性物を吸収する必要がある。例えば、澱粉、乳糖、カルシウムの無機塩、微結晶セルロースなどである。

医薬組成物は、滅菌注射用水溶液の形態であってもよい。使用される許容可能な溶媒と溶剤には、水、リンゲル液及び等張塩化ナトリウム溶液があってもよい。滅菌注射用製剤は、その活性成分が油相に溶解された滅菌注射用水中油型マイクロエマルジョンであってもよい。例えば、活性成分を大豆油とレシチンとの混合物に溶解する。次に、油溶液を水とグリセリンとの混合物に加入し、処理してマイクロエマルジョンを形成する。局所で大量に注射することにより、注射液又はマイクロエマルジョンを被験者の血流に注入することができる。又は、本開示に係る化合物の一定のサイクル濃度を維持可能な方式で、溶液及びマイクロエマルジョンを投与することが好ましい。このような一定の濃度を維持するために、連続静脈投与装置を使用することができる。このような装置の例は、Deltec CADD-PLUS. TM. 5400型の静脈注射ポンプである。

医薬組成物は、筋肉内及び皮下投与に使用される滅菌注射水又は油懸濁液の形態であってもよい。当該懸濁液は、既知の技術に従って、上記の適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて調製することができる。滅菌注射用製剤は、無毒の胃腸外に許容可能な希釈剤又は溶剤において調製された滅菌注射溶液又は懸濁液、例えば、1,3-ブタンジオールにおいて調製された溶液であってもよい。また、滅菌固定油を溶剤又は懸濁媒体として便利に用いることができる。このために、合成されたモノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の配合用固定油を用いることができる。また、油酸などの脂肪酸は、注射剤を調製することができる。

二、合成方法
合成の目的を達成するために、以下の合成技術案を採用する。

一般式（Pc-L_a-Y-D）で表される化合物の調製方法であって、それは、

Pcを還元した後、一般式（L_a-Y-D）とカップリング反応し、一般式（Pc-L_a-Y-D）で表される化合物を得るステップを含み、還元剤としては、TCEPが好ましく、特に、還元抗体上のジスルフィド結合が好ましく、
そのうち、
Pc、W、L²、L³、R¹、R²、R⁵、R⁶、R⁷、m及びnは前述一般式（Pc-L_a-Y-D）に定義される通りである。

上記の明細書には、本開示の1つ又は複数種の実施形態の詳細が提出されている。本願中の記載と類似又は同様の任意の方法と材料により本開示を実施又は試験することができるが、以下、好ましい方法と材料を説明する。明細書と特許請求の範囲により、本開示の他の特徴、目的及び利点は明らかになる。明細書と特許請求の範囲において、文脈で特に明記しない限り、単数形は複数の指示対象を含む。特に定義しない限り、本願に使用される技術と科学用語の全ては、当業者により理解されている一般的な意味をもっている。明細書に引用される特許と出版物の全ては、引用により組み込まれている。下記の実施例は、本開示の好ましい実施形態を更に全面的に説明するために提出される。これらの実施例は、何れかの方式で、本開示の範囲を限定するものと考えるべきではなく、本開示の範囲は、特許請求の範囲により限定される。

本発明の実施例又は試験例における具体的な条件が明記されていない実験方法は、通常、一般的な条件に従うか、又は原料や商品の製造メーカーにより推奨される条件に従う。Sambrookら、分子クローン、研究室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー研究所、及び当代分子生物学方法、Ausubelら著作、Greene出版協会、Wiley Interscience、NYを参照する。具体的な供給源が明記されていない試薬は、市販の一般的な試薬である。

一、抗体の調製
実施例1-1：TROP-2高発現細胞株の構築
pCDH-hTROP-2レンチウイルス発現ベクタープラスミド及びpVSV-G，pCMV-dR8.91レンチウイルス系パッケージングベクター用Lipofectamine 3000トランスフェクション試薬を、ウィルスパッケージング細胞293Tにトランスフェクションし、ウィルスを含む培地上清を収集し、濾過して超高速で遠心分離し、濃縮されたウィルスでチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO-K1を感染させ、ピューロマイシン（puromycin）で2～3週間選別してから、FACSシングルセルソーティングを行った。

FACSによりレンチウイルスに感染したCHO-K1細胞表面のTROP-2発現量を検出し、TROP-2発現量が高いCHO-K1/hTROP-2モノクローナル細胞株を選び出した。

TROP-2アミノ酸配列（Genbank: NP_002344.2）は下記の通りであり、即ち、

配列番号1、
Trop2-Hisアミノ酸配列は下記の通りであり、即ち、

配列番号2。

実施例1-2：抗ヒトTROP-2モノクローナル抗体の調製
本願における抗ヒトTROP-2モノクローナル抗体はWO03074566特許に開示された方法で調製され、hRS7の抗体可変領域遺伝子をテンプレートとして、コンピュータソフトウェアによりCDRに対して点変異改造設計を行った。分子クローンによりタンパク質発現ベクターPhr-IgG（シグナルペプチド及び定常領域遺伝子（CH1-Fc/CL）断片付き））に挿入し、HEK293及びExpi-CHO-S細胞において発現した。通常の方法で抗体を精製した。huTROP-2タンパク質を過剰発現したCHO-K1細胞及びhuTROP-2タンパク質（His27-Thr274 登録番号# NP_002344.2）で活性を検証して、標的結合活性が比較的良好である抗体を選び出し、そのうち、PD3可変領域配列は下記の通りであり、即ち、
PD3重鎖可変領域：

配列番号3、
PD3軽鎖可変領域：

配列番号4、
注記：下線部分はKabat番号付け規則によって決定されたCDR領域である。

抗体の重鎖定常領域はヒトIgG1、IgG2、IgG4及びその変異体の定常領域から選ばれてもよく、軽鎖定常領域はヒトκ、λ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域から選ばれてもよい。例示的に、抗体重鎖定常領域は配列が配列番号11で表されるヒトIgG1から選ばれ、軽鎖定常領域は配列が配列番号12で表されるヒトκ鎖の定常領域から選ばれる。

ヒトIgG1の重鎖定常領域：

配列番号11、
ヒトκ軽鎖定常領域：

配列番号12、

例示的に、上記軽鎖／重鎖定常領域を前述PD3抗体の可変領域と組合せて、完全な抗体を形成し、その軽鎖／重鎖配列は下記の通りであり、即ち、
PD3重鎖：

配列番号13、
PD3軽鎖：

配列番号14、

本開示に使用される対照分子hRS7は特許WO03074566を参照して構築され、TINA抗体は特許WO2015098099A1を参照して構築され、その配列はそれぞれ下記の通りであり、即ち、
hRS7重鎖：

配列番号15、
hRS7軽鎖：

配列番号16、
TINA重鎖：

配列番号17、
TINA軽鎖：

配列番号18。

二、化合物の調製
本開示の実施例における具体的な条件が明記されていない実験方法は、通常、一般的な条件に従うか、又は原料や商品の製造メーカにより推奨される条件に従う。具体的な供給源が明記されていない試薬は、市販の一般的な試薬である。

化合物の構造は、核磁気共鳴（NMR）又は質量分析（MS）によって決定された。NMRの測定は、Bruker AVANCE-400核磁気装置が利用され、測定溶剤が重水素化ジメチルスルホキシド（DMSO-d6）、重水素化クロロホルム（CDCl₃）、重水素化メタノール（CD₃OD）であり、内部標準がテトラメチルシラン（TMS）であり、化学シフトが10^-6（ppm）単位で示された。

MSの測定は、FINNIGAN LCQAd（ESI）質量分析計（メーカ：Thermo、型番：Finnigan LCQ advantage MAX）が利用された。

UPLCの測定は、Waters Acquity UPLC SQD液体クロマトグラフ質量分析計が利用された。

HPLCの測定は、アジレント1200DAD高速液体クロマトグラフ（Sunfire C18 150×4.6 mmカラム）及びWaters 2695-2996高速液体クロマトグラフ（Gimini C18 150×4.6 mmカラム）が利用された。

UV-HPLCの測定は、Thermo nanodrop 2000紫外線分光光度計が利用された。

増殖阻害率及びIC₅₀値の測定は、PHERA starFSマイクロプレートリーダー（独BMG社）が利用された。

薄層クロマトグラフィー用シリカゲルプレートとしては、煙台黄海HSGF254又は青島GF254シリカゲルプレートが利用され、薄層クロマトグラフィー（TLC）に使用されるシリカゲルプレートの仕様は、0.15 mm～0.2 mmであり、薄層クロマトグラフィーによる生成物の分離精製に使用されるシリカゲルプレートの仕様は、0.4 mm～0.5 mmである。

カラムクロマトグラフィーは、一般的に、煙台黄海200～300メッシュのシリカゲルをベクターとして利用した。

本開示に係る既知の出発原料は、本分野の既知の方法を採用して又はそれに従って合成してもよく、又はABCR GmbH & Co.KG、Acros Organnics、Aldrich Chemical Company、韶遠化学科技（Accela ChemBio Inc）、達瑞化学品などの会社から購入してもよい。

実施例では、特に断りのない限り、反応は、いずれもアルゴン雰囲気又は窒素雰囲気において行われた。

アルゴン雰囲気又は窒素雰囲気は、反応フラスコに容量が約1 Lのアルゴン又は窒素バルーンが接続されることを指す。

水素雰囲気は、反応フラスコに容量が約1 Lの水素バルーンが接続されることを指す。

加圧水素化反応は、Parr 3916EKX型水素化装置及び清藍QL-500型水素発生器又はHC2-SS型水素化装置が利用された。

水素化反応は、通常、真空排気して水素を充填する操作を3回繰り返す。

マイクロ波反応は、CEM Discover-S 908860型マイクロ波反応器が利用された。

実施例では特に断りのない限り、反応中の溶液は、水溶液を指す。

実施例では特に断りのない限り、反応の温度は、室温である。

室温は、最適の反応温度であり、温度範囲が20℃～30℃である。
実施例中のpH＝6.5のPBS緩衝液の調製：8.5 gのKH₂PO₄、8.56 gのK₂HPO₄.3H₂O、5.85 gのNaCl、1.5 gのEDTAを取ってフラスコに入れ、2 Lに定容し、超音波でそれを完全に溶解させ、振り混ぜた後に得た。

化合物の精製に利用されたカラムクロマトグラフィーの溶離剤の系及び薄層クロマトグラフィーの展開溶媒の系は、A：ジクロロメタンとイソプロピルアルコール系、B：ジクロロメタンとメタノール系、及びC：石油エーテルと酢酸エチル系を含み、溶剤の体積比は、化合物の極性によって調整してもよく、少量のトリエチルアミンと酸性又は塩基性試薬などを加えて調整してもよい。

本開示の化合物の一部は、Q-TOF LC/MSによって特徴付けられている。Q-TOF LC/MSは、アジレント6530精密質量数四重極-飛行時間型質量分析計及びアジレント1290-Infinity超高速液体クロマトグラフ（アジレント Poroshell 300SB-C8 5 μm、2.1×75 mmカラム）が利用された。

本開示の抗体-薬物複合体のY-D薬剤部分については、PCT/CN2019/107873が参照され、関連する化合物の合成及び試験は本特許に引用されている。その中の非限定的な実施例の合成は、以下のように引用されている。

実施例2-1
N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）-1-ヒドロキシシクロプロパン-1-カルボキサミド 1

メシル酸エキサテカン1b（2.0 mg、3.76 μmol、特許出願「EP0737686A1」に開示された方法で調製された）に1 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で0～5℃に冷却し、1滴のトリエチルアミンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に1-ヒドロキシシクロプロピルギ酸1a（1.4 mg、3.7 μmol、「Tetrahedron Letters, 25（12）, 1269-72, 1984」に開示された公知の方法で調製された）及び4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（3.8 mg、13.7 μmol）を順に加え、加入終了後、0～5℃で2時間攪拌反応させた。反応液に水5 mLを加えて反応をクエンチし、反応液を酢酸エチル（8 mL×3）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（5 mL×2）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Bで精製し、表題生成物1（1.6 mg、収率：82.1%）を得た。

MS m/z (ESI): 520.2 [M+1]。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.90-7.84 (m, 1H), 7.80-7.68(m, 1H), 5.80-5.70 (m, 1H), 5.62-5.54(m, 2H), 5.44-5.32 (m, 2H), 5.28-5.10(m, 2H), 3.40-3.15 (m, 3H), 2.44 (s, 3H), 2.23(t, 1H), 2.06-1.75 (m, 2H), 1.68-1.56 (m, 1H), 1.22-1.18 (m, 2H), 1.04-0.98 (m, 2H), 0.89 (t, 3H)。

実施例2-2
（S）-2-シクロプロピル-N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）-2-ヒドロキシアセトアミド 2-A
（R）-2-シクロプロピル-N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）-2-ヒドロキシアセトアミド 2-B

1b（4 mg、7.53 μmol）に2 mLのエタノール及び0.4 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンで3回置換し、氷水浴で0～5℃に冷却し、0.3 mLのN-メチルモルホリンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に2-シクロプロピル-2-ヒドロキシ酢酸2a（2.3 mg、19.8 μmol、特許出願「WO2013106717」に開示された方法で調製された）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（3 mg、22.4 μmol）及び1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（4.3 mg、22.4 μmol）を順に加え、加入終了後、0～5℃で1時間攪拌反応させた。氷水浴を撤去し、30℃に加熱し、2時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた粗製品である化合物2を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：XBridge Prep C18 OBD 5 um 19×250 mm、移動相：A-水（10 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル、勾配溶離、流速：18 mL/min）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して、表題生成物（2-A：1.5 mg、2-B：1.5 mg）を得た。

MS m/z (ESI): 534.0 [M+1]。
単一配置の化合物2-B（比較的短い保持時間）
UPLC分析：保持時間：1.06分間、純度：88%（カラム：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 um 2.1×50 mm、移動相：A-水（5 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル）。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8.37 (d, 1H), 7.76 (d, 1H), 7.30 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 5.58-5.56 (m, 1H), 5.48 (d, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.32-5.29 (m, 2H), 3.60 (t, 1H), 3.19-3.13 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 2.20-2.14 (m, 1H), 1.98 (q, 2H), 1.87-1.83 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 1.34-1.28 (m, 1H), 0.86 (t, 3H), 0.50-0.39 (m, 4H)。

単一配置の化合物2-A（比較的長い保持時間）
UPLC分析：保持時間：1.10分間、純度：86%（カラム：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 um 2.1×50 mm、移動相：A-水（5 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル）。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8.35 (d, 1H), 7.78 (d, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 5.58-5.53 (m, 1H), 5.42 (s, 2H), 5.37 (d, 1H), 5.32 (t, 1H), 3.62 (t, 1H), 3.20-3.15 (m, 2H), 2.40 (s, 3H), 2.25-2.16 (m, 1H), 1.98 (q, 2H), 1.87-1.82 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 1.21-1.14 (m, 1H), 0.87 (t, 3H), 0.47-0.35 (m, 4H)。

実施例2-3
（S）-N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）-3,3,3-トリフルオロ-2-ヒドロキシプロパンアミド 3-A
（R）-N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）-3,3,3-トリフルオロ-2-ヒドロキシプロパンアミド 3-B

1b（5.0 mg、9.41 μmol）に2 mLのエタノール及び0.4 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で0～5℃に冷却し、0.3 mLのN-メチルモルホリンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に3,3,3-トリフルオロ-2-ヒドロキシプロピオン酸3a（4.1 mg、28.4 μmol、供給元：Alfa）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（3.8 mg、28.1 μmol）及び1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（5.4 mg、28.2 μmol）を順に加え、加入終了後、0～5℃で10分間攪拌反応させた。氷水浴を撤去し、30℃に加熱し、8時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた粗製品である化合物3を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：XBridge Prep C18 OBD 5 um 19×250 mm、移動相：A-水（10 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル、勾配溶離、流速：18 mL/min）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して、表題生成物（1.5 mg、1.5 mg）を得た。

MS m/z (ESI): 561.9 [M+1]。
単一配置の化合物（比較的短い保持時間）
UPLC分析：保持時間：1.11分間、純度：88%（カラム：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 um 2.1×50 mm、移動相：A-水（5 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル）。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8.94 (d, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.32 (s, 1H), 7.20 (d, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.61-5.55 (m, 1H), 5.45-5.23 (m, 3H), 5.15-5.06 (m, 1H), 4.66-4.57 (m, 1H), 3.18-3.12 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.26-2.20 (m, 1H), 2.16-2.08 (m, 1H), 2.02-1.94 (m, 1H), 1.89-1.82 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 0.87 (t, 3H)。

単一配置の化合物（比較的長い保持時間）
UPLC分析：保持時間：1.19分間、純度：90%（カラム：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 um 2.1×50 mm、移動相：A-水（5 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル）。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8.97 (d, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.16 (d, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.63-5.55 (m, 1H), 5.45-5.20 (m, 3H), 5.16-5.07 (m, 1H), 4.66-4.57 (m, 1H), 3.18-3.12 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.22-2.14 (m, 1H), 2.04-1.95 (m, 2H), 1.89-1.82 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 0.87 (t, 3H)。

実施例2-4
N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）-1-ヒドロキシシクロペンタン-1-カルボキサミド 4

1b（3.0 mg、5.64 μmol）に1 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で0～5℃に冷却し、1滴のトリエチルアミンを滴下し、反応液が清澄になるまで攪拌した。反応液に1-ヒドロキシ-シクロペンタンギ酸4a（2.2 mg、16.9 μmol、特許出願「WO2013106717」に開示された方法で調製された）及び4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（4.7 mg、16.9 μmol）を順に加え、加入終了後、0～5℃で1時間攪拌反応させた。反応液に水5 mLを加えて反応をクエンチし、反応液を酢酸エチル（10 mL×3）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（5 mL×2）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Bで精製し、表題生成物4（2.5 mg、収率：80.9%）を得た。

MS m/z (ESI): 548.0 [M+1]。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.73-7.62 (m, 2H), 5.75-5.62 (m, 1H), 5.46-5.32 (m, 2H), 5.26-5.10 (m, 1H), 3.30-3.10 (m, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.28-2.20 (m, 2H), 2.08-1.84 (m, 8H), 1.69-1.58 (m, 2H), 1.04-1.00 (m, 2H), 0.89 (t, 3H)。

実施例2-5
N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）-1-（ヒドロキシメチル）シクロプロパン-1-カルボキサミド 5

1b（2.0 mg、3.76 μmol）に1 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で0～5℃に冷却し、1滴のトリエチルアミンを滴下し、反応液が清澄になるまで攪拌した。反応液に1-（ヒドロキシメチル）-シクロプロパンカルボン酸5a（0.87 mg、7.5 μmol、特許出願「WO201396771」に開示された方法で調製された）及び4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（2 mg、7.24 μmol）を順に加え、加入終了後、0～5℃で2時間攪拌反応させた。反応液に水5 mLを加えて反応をクエンチし、反応液を酢酸エチル（8 mL×3）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（5 mL×2）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Bで精製し、表題生成物5（1.0 mg、収率：50%）を得た。

MS m/z (ESI): 533.9 [M+1]。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.07 (s, 1H), 7.23-7.18 (m, 2H), 6.71-6.64 (m, 1H), 6.55-6.51 (m, 1H), 5.36-5.27 (m, 2H), 4.67-4.61 (m, 2H), 3.53-3.48 (m, 1H), 3.30-3.22 (m, 2H), 3.18-3.13 (m, 1H), 2.71-2.61 (m, 2H), 2.35-2.28 (m, 1H), 2.04-1.91 (m, 4H), 1.53-1.40 (m, 3H), 0.91-0.75 (m, 4H)。

実施例2-6
N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）-1-（ヒドロキシメチル）シクロブタン-1-カルボキサミド 6

1b（3.0 mg、5.64 μmol）に1 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で0～5℃に冷却し、1滴のトリエチルアミンを滴下し、反応液が清澄になるまで攪拌した。反応液に1-（ヒドロキシメチル）シクロブタン-1-ギ酸6a（2.2 mg、16.9 μmol、「Journal of the American Chemical Society, 2014, vol.136, #22, p.8138-8142」という文献に開示された方法で調製された）及び4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（4.7 mg、16.9 μmol）を順に加え、加入終了後、0～5℃で1時間攪拌反応させた。反応液に水5 mLを加えて反応をクエンチし、反応液を酢酸エチル（10 mL×3）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（5 mL×2）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Bで精製し、表題生成物6（2.1 mg、収率：67.9%）を得た。

MS m/z (ESI): 548.0 [M+1]。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 7.85-7.62 (m, 1H), 6.88 (br，1H), 5.87-5.48 (m，2H), 5.47-5.33 (m，1H), 5.31-5.06 (m，1H), 4.25-3.91 (m, 2H), 3.25 (br, 1H), 2.60-2.32 (m, 3H), 2.23 (t, 1H), 2.15-1.95 (m, 3H), 1.70-1.56 (m, 2H), 1.41-1.17 (m, 9H), 1.03 (s, 1H), 0.95-0.80 (m, 2H)。

実施例2-7
N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）-1-ヒドロキシシクロブタン-1-カルボキサミド 7

1b（3.0 mg、5.64 μmol）に2 mLのエタノール及び0.4 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で0～5℃に冷却し、0.3 mLのN-メチルモルホリンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に1-ヒドロキシシクロブタンギ酸7a（2.0 mg、17.22 μmol、供給元：薬石）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（2.3 mg、17.0 μmol）及び1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（3.2 mg、16.7 μmol）を順に加え、加入終了後、0～5℃で10分間攪拌反応させた。氷水浴を撤去し、室温で2時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Bで精製し、表題生成物7（2.5 mg、収率：83.1%）を得た。

MS m/z (ESI): 534.0 [M+1]。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8.28 (d, 1H), 7.75 (d, 1H), 7.29 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 6.12 (s, 1H), 5.59-5.51 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.20-5.01 (m, 2H), 3.27-3.17 (m, 1H), 3.15-3.05 (m, 1H), 2.71-2.63 (m, 1H), 2.37 (s, 3H), 2.12-2.05 (m, 1H), 2.03-1.94 (m, 2H), 1.92-1.78 (m, 4H), 1.50-1.42 (m, 1H), 0.90-0.83 (m, 4H)。

実施例2-8
1-（（（S）-7-ベンジル-20-（2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル）-3,6,9,12,15-ペンタオキソ-2,5,8,11,14-ペンタアザイコシル）オキシ）-N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）シクロプロパン-1-カルボキサミド 8

ステップ1
1-（（2-（（（（9H-フルオレン-9-イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）メトキシ）シクロプロパン-1-カルボン酸ベンジル 8c
1-ヒドロキシシクロプロパン-1-カルボン酸ベンジル8a（104 mg、0.54 mmol、特許出願「US2005/20645」に開示された方法で調製された）及び（2-（（（（9H-フルオレン-9-イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）メチル酢酸エステル8b（100 mg、0.27 mmol、特許出願「CN105829346A」に開示された方法で調製された）を反応フラスコに加え、5 mLのテトラヒドロフランを加え、アルゴンで3回置換し、氷水浴で0～5℃に降温し、カリウムtert-ブトキシド（61 mg、0.54 mmol）を加え、氷水浴を撤去し、室温まで昇温して10分間撹拌し、氷水20 mLを加え、酢酸エチル（5 mL×2）及びクロロホルム（5 mL×5）で抽出し、有機相を合わせて濃縮した。得られた残留物を3 mLの1,4-ジオキサンに溶解し、水0.6 mLを加え、炭酸水素ナトリウム（27 mg、0.32 mmol）及びクロロギ酸-9-フルオレニルメチル（70 mg、0.27 mmol）を加え、室温で1時間撹拌した。水20 mLを加え、酢酸エチル（8 mL×3）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（20 mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Bで精製し、表題生成物8c（100 mg、収率：73.6%）を得た。
MS m/z (ESI): 501.0 [M+1]。

ステップ2
1-（（2-（（（（9H-フルオレン-9-イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）メトキシ）シクロプロパン-1-カルボン酸 8d
8c（50 mg、0.10 mmol）をテトラヒドロフランと酢酸エチルの混合溶媒（V：V＝2：1）3 mLに溶解し、パラジウム炭素（25 mg、含有量10%）を加え、水素で3回置換し、室温で1時間撹拌反応させた。反応液を珪藻土で濾過し、濾過ケーキをテトラヒドロフランですすぎ、濾液を濃縮して、表題生成物8d（41 mg、収率：100%）を得た。
MS m/z (ESI): 411.0 [M+1]。

ステップ3
（9H-フルオレン-9-イル）メチル（2-（（（1-（（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）カルバモイル）シクロプロポキシ）メチル）アミノ）-2-オキソエチル）カルバメート 8e
1b（7 mg、0.013 mmol）を反応フラスコに加え、1 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンで3回置換し、氷水浴で0～5℃に降温し、1滴のトリエチルアミンを滴下し、8d（7 mg、0.017 mmol）の0.5 mLのN,N-ジメチルホルムアミド溶液を加え、4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（7 mg、0.026 mmol）を加え、氷浴で35分間撹拌反応させた。水10 mLを加え、酢酸エチル（5 mL×3）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（10 mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Bで精製し、表題生成物8e（8.5 mg、収率：78.0%）を得た。
MS m/z (ESI): 828.0 [M+1]。

ステップ4
1-（（2-アミノアセトアミド）メトキシ）-N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）シクロプロパン-1-カルボキサミド 8f
8e（4 mg、4.84 μmol）を0.2 mLのジクロロメタンに溶解し、0.1 mLのジエチルアミンを加え、室温で2時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、2 mLのトルエンを加えて減圧濃縮し、この操作を2回繰り返し、3 mLのn-ヘキサンを加えてパルプ化し、上層のn-ヘキサンを注ぎ出し、この操作を3回繰り返し、減圧濃縮して、粗製品である表題生成物8f（2.9 mg）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。
MS m/z (ESI): 606.0 [M+1]。

ステップ5
1-（（（S）-7-ベンジル-20-（2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル）-3,6,9,12,15-ペンタオキソ-2,5,8,11,14-ペンタアザイコシル）オキシ）-N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）シクロプロパン-1-カルボキサミド 8
粗製品8f（2.9 mg、4.84 μmol）を0.5 mLのN,N-ジメチルホルムアミドに溶解し、アルゴンで3回置換し、氷水浴で0～5℃に降温し、（S）-2-（-2-（-2-（6-（-2,5-ジオキソ-1H-ピロール-1-イル）ヘキサンアミノ）アセトアミノ）アセトアミノ）-3-フェニルプロピオン酸8g（2.7 mg、5.80 μmol、特許出願「EP2907824」に開示された方法で調製された）の0.3 mLのN,N-ジメチルホルムアミド溶液を加え、4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（2.7 mg、9.67 μmol）を加え、氷浴で30分間撹拌反応させ、氷浴を撤去し、室温まで昇温し、15分間撹拌した。反応液を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：XBridge Prep C18 OBD 5 um 19×250 mm、移動相：A-水（10 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル、勾配溶離、流速：18 mL/min）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して、表題生成物8（2 mg、収率39.0%）を得た。

MS m/z (ESI): 1060.0 [M+1]。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 9.01 (d, 1H), 8.77 (t, 1H), 8.21 (t, 1H), 8.08-7.92 (m, 2H), 7.73 (d, 1H), 7.28 (s, 1H), 7.24-7.07 (m, 4H), 6.98 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 5.61 (q, 1H), 5.40 (s, 2H), 5.32 (t, 1H), 5.12 (q, 2H), 4.62 (t, 1H), 4.52 (t, 1H), 4.40-4.32 (m, 1H), 3.73-3.47 (m, 8H), 3.16-3.04 (m, 2H), 2.89 (dd, 1H), 2.69-2.55 (m, 2H), 2.37-2.23 (m, 4H), 2.12-1.93 (m, 4H), 1.90-1.74 (m, 2H), 1.52-1.38 (m, 4H), 1.33-1.11 (m, 5H), 0.91-0.81 (m, 4H)。

実施例2-9
N-（（2R,10S）-10-ベンジル-2-シクロプロピル-1-（（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）アミノ）-1,6,9,12,15-ペンタオキソ-3-オキサ-5,8,11,14-テトラアザヘキサデカン-16-イル）-6-（2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル）ヘキサンアミド 9-A
N-（（2S,10S）-10-ベンジル-2-シクロプロピル-1-（（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）アミノ）-1,6,9,12,15-ペンタオキソ-3-オキサ-5,8,11,14-テトラアザヘキサデカン-16-イル）-6-（2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル）ヘキサンアミド 9-B

ステップ1
2-シクロプロピル-2-ヒドロキシ酢酸ベンジル 9a
2a（1.3 g、11.2 mmol、特許出願「WO2013/106717」に開示された方法で調製された）を50 mLのアセトニトリルに溶解し、炭酸カリウム（6.18 g、44.8 mmol）、臭化ベンジル（1.33 mL、11.2 mmol）及びテトラブチルヨウ化アンモニウム（413 mg、1.1 mmol）を順に加えた。反応液を室温で48時間撹拌し、珪藻土で濾過し、濾過ケーキを酢酸エチル（10 mL）ですすぎ、濾液を合わせ、減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Cで精製し、表題生成物9a（2 g、収率：86.9%）を得た。

ステップ2
10-シクロプロピル-1-（9H-フルオレン-9-イル）-3,6-ジオキソ-2,9-ジオキサ-4,7-ジアザウンデカン-11-酸ベンジル 9b
9a（120.9 mg、0.586 mmol）及び8b（180 mg、0.489 mmol）を反応フラスコに加え、4 mLのテトラヒドロフランを加え、アルゴンで3回置換し、氷水浴で0～5℃に降温し、カリウムtert-ブトキシド（109 mg、0.98 mmol）を加え、氷水浴を撤去し、室温まで昇温し、40分間撹拌し、氷水10 mLを加え、酢酸エチル（20 mL×2）及びクロロホルム（10 mL×5）で抽出し、有機相を合わせて濃縮した。得られた残留物を4 mLのジオキサンに溶解し、水2 mLを加え、炭酸水素ナトリウム（49.2 mg、0.586 mmol）及びクロロギ酸-9-フルオレニルメチル（126 mg、0.49 mmol）を加え、室温で2時間撹拌した。水20 mLを加え、酢酸エチル（10 mL×3）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（20 mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Cで精製し、表題生成物9b（48 mg、収率：19%）を得た。
MS m/z (ESI): 515.0 [M+1]。

ステップ3
10-シクロプロピル-1-（9H-フルオレン-9-イル）-3,6-ジオキソ-2,9-ジオキサ-4,7-ジアザウンデカン-11-酸 9c
9b（20 mg、0.038 mmol）をテトラヒドロフランと酢酸エチルの混合溶媒（V：V＝2：1）4.5 mLに溶解し、パラジウム炭素（12 mg、含有量10%、乾燥型）を加え、水素で3回置換し、室温で1時間撹拌反応させた。反応液を珪藻土で濾過し、濾過ケーキを酢酸エチルですすぎ、濾液を濃縮して、粗製品である表題生成物9c（13 mg）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応を行った。
MS m/z (ESI): 424.9 [M+1]。

ステップ4
（9H-フルオレン-9-イル）メチル（2-（（1-シクロプロピル-2-（（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）アミノ）-2-オキソエトキシ）メチル）アミノ）-2-オキソエチル）カルバメート 9d
1b（10 mg、18.8 μmol）を反応フラスコに加え、1 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンで3回置換し、氷水浴で0～5℃に降温し、1滴のトリエチルアミンを滴下し、粗製品9c（13 mg、30.6 μmol）を加え、4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（16.9 mg、61.2 μmol）を加え、氷浴で40分間撹拌反応させた。水10 mLを加え、酢酸エチル（10 mL×3）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（10 mL×2）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮した。得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Bで精製し、表題生成物9d（19 mg、収率：73.6%）を得た。
MS m/z (ESI): 842.1 [M+1]。

ステップ5
2-（（2-アミノアセトアミド）メトキシ）-2-シクロプロピル-N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）アセトアミド 9e
9d（19 mg、22.6 μmol）を2 mLのジクロロメタンに溶解し、1 mLのジエチルアミンを加え、室温で2時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、1 mLのトルエンを加えて減圧濃縮し、この操作を2回繰り返した。残留物に3 mLのn-ヘキサンを加えてパルプ化し、放置後に上清液を注ぎ出し、固体を保留した。固体残留物を減圧濃縮し、オイルポンプにより乾燥させて粗製品である表題生成物9e（17 mg）を得て、生成物を精製せずにそのまま次のステップの反応に使用した。
MS m/z (ESI): 638.0 [M+18]。

ステップ6
N-（（2R,10S）-10-ベンジル-2-シクロプロピル-1-（（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）アミノ）-1,6,9,12,15-ペンタオキソ-3-オキサ-5,8,11,14-テトラアザヘキサデカン-16-イル）-6-（2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル）ヘキサンアミド 9-A
N-（（2S,10S）-10-ベンジル-2-シクロプロピル-1-（（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）アミノ）-1,6,9,12,15-ペンタオキソ-3-オキサ-5,8,11,14-テトラアザヘキサデカン-16-イル）-6-（2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル）ヘキサンアミド 9-B
粗製品9e（13.9 mg、22.4 μmol）を0.6 mLのN,N-ジメチルホルムアミドに溶解し、アルゴンで3回置換し、氷水浴で0～5℃に降温し、8g（21.2 mg、44.8 μmol）の0.3 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（18.5 mg、67.3 μmol）を加え、氷浴で10分間撹拌反応させ、氷浴を撤去し、室温まで昇温し、1時間撹拌して反応させて化合物9を生成した。反応液を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：XBridge Prep C18 OBD 5 um 19×250 mm、移動相：A-水（10 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル、勾配溶離、流速：18 mL/min）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して、表題生成物（9-A：2.4 mg、9-B：1.7 mg）を得た。
MS m/z (ESI): 1074.4 [M+1]。

単一配置の化合物9-A（比較的短い保持時間）：
UPLC分析：保持時間：1.14分間、純度：85%（カラム：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 um 2.1×50 mm、移動相：A-水（5 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル）。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8.60 (t, 1H), 8.51-8.49 (d, 1H), 8.32-8.24 (m, 1H), 8.13-8.02 (m, 2H), 8.02-7.96 (m, 1H), 7.82-7.75 (m, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.26-7.15 (m, 4H), 6.99 (s, 1H), 6.55-6.48 (m, 1H), 5.65-5.54 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.35-5.15 (m, 3H), 4.74-4.62 (m, 1H), 4.54-4.40 (m, 2H), 3.76-3.64 (m，4H), 3.62-3.48 (m, 2H), 3.20-3.07 (m, 2H), 3.04-2.94 (m, 1H), 2.80-2.62 (m, 1H), 2.45-2.30 (m, 3H), 2.25-2.15 (m, 2H), 2.15-2.04 (m, 2H), 1.93-1.78 (m, 2H), 1.52-1.39 (m, 3H), 1.34-1.12 (m, 5H), 0.87 (t, 3H), 0.64-0.38 (m, 4H)。

単一配置の化合物9-B（比較的長い保持時間）：
UPLC分析：保持時間：1.16分間、純度：89%（カラム：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 um 2.1×50 mm、移動相：A-水（5 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル）。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8.68-8.60 (m, 1H), 8.58-8.50 (m, 1H), 8.32-8.24 (m, 1H), 8.13-8.02 (m, 2H), 8.02-7.94 (m, 1H), 7.82-7.75 (m, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.26-7.13 (m, 3H), 6.99 (s, 1H), 6.55-6.48 (m, 1H), 5.60-5.50 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.35-5.15 (m, 2H), 4.78-4.68 (m, 1H), 4.60-4.40 (m, 2H), 3.76-3.58 (m, 4H), 3.58-3.48 (m, 1H), 3.20-3.10 (m, 2H), 3.08-2.97 (m, 2H), 2.80-2.72 (m, 2H), 2.45-2.30 (m, 3H), 2.25-2.13 (m, 2H), 2.13-2.04 (m, 2H), 2.03-1.94 (m, 2H), 1.91-1.78 (m, 2H), 1.52-1.39 (m, 3H), 1.34-1.12 (m, 4H), 0.91-0.79 (m, 3H), 0.53-0.34 (m, 4H)。

三、ADCの調製
実施例3-1 ADC-1

37℃の条件で、抗体PD3のPBS緩衝水溶液（pH=6.5の0.05 MのPBS緩衝水溶液、10.0 mg/mL、4.0 mL、270 nmol）に、調製されたトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の水溶液（10 mM、67.5 μL、675 nmol）を加え、水浴発振器に置き、37℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液を水浴で25℃に降温した。
化合物9-A（2.9 mg、2700 nmol）を180 μLのDMSOに溶解し、上記反応液に加え、水浴発振器に置き、25℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液をSephadex G25ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：pHが6.5である0.05 MのPBS緩衝水溶液、0.001 MのEDTAを含有）、式PD3-9-Aで表される例示的な生成物ADC-1のPBS緩衝液（1.93 mg/mL、18.4 mL）を得て、4℃で貯蔵した。
UV-Visにより平均値を算出する：n=3.77である。

実施例3-2 ADC-2
37℃の条件で、抗体PD3のPBS緩衝水溶液（pH=6.5の0.05 MのPBS緩衝水溶液、10.0 mg/mL、4.0 mL、270 nmol）に、調製されたトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の水溶液（10 mM、143.1 μL、1431 nmol）を加え、水浴発振器に置き、37℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液を水浴で25℃に降温した。

化合物9-A（4.35 mg、4050 nmol）を270 μLのDMSOに溶解し、上記反応液に加え、水浴発振器に置き、25℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液をSephadex G25ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：pHが6.5である0.05 MのPBS緩衝水溶液、0.001 MのEDTAを含有）、式PD3-9-Aで表される例示的な生成物ADC-2のPBS緩衝液（1.69 mg/mL、17.8 mL）を得て、4℃で貯蔵した。

UV-Visにより平均値を算出する：n=6.59である。

実施例3-3 ADC-3

37℃の条件で、抗体PD3のPBS緩衝水溶液（pH=6.5の0.05 MのPBS緩衝水溶液、10.0 mg/mL、0.3 mL、20.3 nmol）に、調製されたトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の水溶液（10 mM、5.1 μL、51 nmol）を加え、水浴発振器に置き、37℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液を水浴で25℃に降温した。
化合物12h（0.194 mg、203 nmol、化合物の調製はWO2017063509を参照）を20 μLのアセトニトリルに溶解し、上記反応液に加え、水浴発振器に置き、25℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液をSephadex G25ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：pHが6.5である0.05 MのPBS緩衝水溶液、0.001 MのEDTAを含有）、表題生成物ADC-3を含むPBS緩衝液（4.3 mg/mL、0.6 mL）を得て、4℃で貯蔵した。
UV-Visにより平均値を算出する：n=4.14である。

実施例3-4 ADC-4

その合成過程はWO2015098099の実施例19を参照する。
37℃の条件で、抗体TINAのPBS緩衝水溶液（pH=6.5の0.05 MのPBS緩衝水溶液、10.0 mg/mL、2.0 mL、135.4 nmol）に、調製されたトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の水溶液（10 mM、33.8 μL、338 nmol）を加え、水浴発振器に置き、37℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液を水浴で25℃に降温した。
化合物58（1.4 mg、1354 nmol）を70 μLのDMSOに溶解し、上記反応液に加え、水浴発振器に置き、25℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液をSephadex G25ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：pHが6.5である0.05 MのPBS緩衝水溶液、0.001 MのEDTAを含有）、式TINA-58で表される例示的な表題生成物ADC-4のPBS緩衝液（1.13 mg/mL、15.1 mL）を得て、4℃で貯蔵した。
UV-Visにより平均値を算出する：n=3.99である。

実施例3-5 ADC-5

37℃の条件で、抗体PD3のPBS緩衝水溶液（pH=6.5の0.05 MのPBS緩衝水溶液、10.0 mg/mL、1.5 mL、101.4 nmol）に、調製されたトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の水溶液（10 mM、25.3 μL、253 nmol）を加え、水浴発振器に置き、37℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液を水浴で25℃に降温した。
化合物58（1.05 mg、1014 nmol、特許「CN104755494A」の163ページの実施例58を参照）を60 μLのDMSOに溶解し、上記反応液に加え、水浴発振器に置き、25℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液をSephadex G25ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：pHが6.5である0.05 MのPBS緩衝水溶液）、式PD3-58で表される例示的な表題生成物ADC-5のPBS緩衝液（0.82 mg/mL、13.5 mL）を得て、4℃で貯蔵した。
UV-Visにより平均値を算出する：n=3.88である。

実施例3-6 ADC-6

37℃の条件で、抗体hRS7のPBS緩衝水溶液（pH=6.5の0.05 MのPBS緩衝水溶液、10.0 mg/mL、1.4 mL、94.60 nmol）に、調製されたトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の水溶液（10 mM、50.1 μL、501 nmol）を加え、水浴発振器に置き、37℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液を水浴で25℃に降温した。
化合物SN38（特許CN105407891Aの59ページの実施例1を参照して合成する、2.1 mg、1419 nmol）を50 μLのDMSOに溶解し、上記反応液に加え、水浴発振器に置き、25℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液をSephadex G25ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：pHが6.5である0.05 MのPBS緩衝水溶液）、式hRS7-SN38で表される例示的な表題生成物ADC-6のPBS緩衝液（1.03 mg/mL、11.5 mL）を得て、4℃で貯蔵した。
CE-SDSにより平均値を算出する：n=7.56である。

実施例3-7 ADC-7

37℃の条件で、抗体hRS7のPBS緩衝水溶液（pH=6.5の0.05 MのPBS緩衝水溶液、10.0 mg/mL、2.18 mL、147.3 nmol）に、調製されたトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の水溶液（10 mM、36.8 μL、368 nmol）を加え、水浴発振器に置き、37℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液を水浴で25℃に降温した。
化合物9-A（1.58 mg、1471 nmol）を100 μLのDMSOに溶解し、上記反応液に加え、水浴発振器に置き、25℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液をSephadex G25ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：pHが6.5である0.05 MのPBS緩衝水溶液）、式hRS7-9-Aで表される例示的な表題生成物ADC-7のPBS緩衝液（1.10 mg/mL、16.4 mL）を得て、4℃で貯蔵した。
UV-Visにより平均値を算出する：n=3.72である。

実施例3-8 ADC-8

37℃の条件で、抗体hRS7のPBS緩衝水溶液（pH=6.5の0.05 MのPBS緩衝水溶液、10.0 mg/mL、2.18 mL、147.3 nmol）に、調製されたトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の水溶液（10 mM、36.8 μL、368 nmol）を加え、水浴発振器に置き、37℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液を水浴で25℃に降温した。
化合物58（1.52 mg、1473 nmol、特許「CN104755494A」の163ページの実施例58を参照）を100 μLのDMSOに溶解し、上記反応液に加え、水浴発振器に置き、25℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液をSephadex G25ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：pHが6.5である0.05 MのPBS緩衝水溶液）、式hRS7-58で表される例示的な表題生成物ADC-8のPBS緩衝液（1.02 mg/mL、16.8 mL）を得て、4℃で貯蔵した。
UV-Visにより平均値を算出する：n=3.93である。

実施例3-9 ADC-9

37℃の条件で、抗体TINAのPBS緩衝水溶液（pH=6.5の0.05 MのPBS緩衝水溶液、10.0 mg/mL、0.95 mL、64.2 nmol）に、調製されたトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の水溶液（10 mM、16.0 μL、160 nmol）を加え、水浴発振器に置き、37℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液を水浴で25℃に降温した。
化合物9-A（0.69 mg、642 nmol）を30 μLのDMSOに溶解し、上記反応液に加え、水浴発振器に置き、25℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液をSephadex G25ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：pHが6.5である0.05 MのPBS緩衝水溶液）、式TINA-9-Aで表される例示的な表題生成物ADC-9のPBS緩衝液（0.99 mg/mL、7.0 mL）を得て、4℃で貯蔵した。
UV-Visにより平均値を算出する：n=3.99である。

ADC原液の薬剤負荷量の分析
ADCは抗体架橋物類薬剤であり、その疾患を治療するメカニズムは、抗体の標的指向性により毒素分子を細胞に輸送することで、細胞を死滅させることである。薬剤の負荷量は、薬効に決定的な役割を果たしている。

一、UV-Visによる算出方法
紫外線法によりADC原液の薬剤負荷量を測定した。

実験方法
コハク酸ナトリウム緩衝液が入ったキュベットを、参照吸収セル及び試料測定吸収セルにそれぞれ置き、溶媒ブランクを差し引いた後、供試品溶液が入ったキュベットを試料測定吸収セルに置き、280 nm及び370 nmでの吸光度を測定した。

結果算出
紫外線分光光度法（使用機器：Thermo nanodrop 2000紫外線分光光度計）により、ADC原液負荷量を測定し、その原理は、ある波長でのADC原液の全吸光値が、細胞毒性薬剤とモノクローナル抗体の当該波長での吸光値の累積に等しいことであり、即ち、
（1）A₂₈₀ _nm＝ε_mab-280bC_mab+ε_Drug-280bC_Drug
ε_Drug-280：薬剤の280 nmでの平均モル吸光係数は5100であり、
C_Drug：薬剤の濃度、
ε_mab-280：モノクローナル抗体原液の280 nmでの平均モル吸光係数は214600であり、
C_mab：モノクローナル抗体原液の濃度、
b：光路長は1 cmである。

同様に、試料の370 nmでの全吸光値方程式を得ることができ、即ち、
（2）A₃₇₀ _nm＝ε_mab-370bC_mab+ε_Drug-370bC_Drug
ε_Drug-370：薬剤の370 nmでの平均モル吸光係数は19000であり、
C_Drug：薬剤の濃度、
ε_mab-370：モノクローナル抗体原液の370 nmでの吸光係数は0であり、
C_mab：モノクローナル抗体原液の濃度、
b：光路長は1 cmである。

（1）と（2）の方程式により、モノクローナル抗体及び薬剤の2つの検出波長での吸光係数と濃度データと合わせて、薬剤の負荷量を算出することができる。
薬剤負荷量＝C_Drug/C_mab。

二、CE-SDSによる算出方法
試薬及び機器
SDS-Mw Analysis Kit：Beckman製造、製品番号390953。当該試薬キットは、SDS-MW分離ゲル用緩衝液、SDS-MWサンプル緩衝液、酸性洗浄液（0.1 mol/Lの塩酸溶液）、塩基性洗浄液（0.1 molの水酸化ナトリウム溶液）、内部標準物質（10 kDa）を含む。北京博思雅生化技術研究院製のSDS試薬キット（製品番号BSYK018）を採用してもよい。当該試薬キットは、CE-SDSゲル緩衝液、CE-SDSサンプル緩衝液を含む。
アルキル化溶液（0.25 molのヨードアセトアミド溶液）：約0.046 gのヨードアセトアミドを秤量し、1 mLの超純水を加えて溶解し、均一に混合し、2～8℃、遮光で7日間保存できる。
キャピラリー電気泳動装置：SCIEX社PA800plus。
キャピラリー：コーティング無し溶融石英キャピラリー（内径50 μm）を全長が30.2 cmとなるように切断し、高分解能方法の有効分離長さが20 cmである。

供試品溶液の調製
SDSサンプル緩衝液で供試品を1 mg/mLまで希釈した。供試品溶液（1 mg/mL）95 μLを取り、0.8 mol/Lのヨードアセトアミド水溶液5 μLを加え、旋回により均一に混合させた。ブランク対照95 μLを取り、0.8 mol/Lのヨードアセトアミド水溶液5 μLを加え、旋回により均一に混合させてから、それぞれサンプル管から75 μL取り出して、サンプル瓶に入れ、すぐに分析を行った。

測定方法
1）キャピラリーの前処理：0.1 mol/Lの水酸化ナトリウム溶液で60 psi圧力で3分間洗浄してから、0.1 mol/Lの塩酸溶液で60 psi圧力で2分間洗浄し、最後に純水で70 psi圧力で1分間洗浄した。毎回稼動する前に実施すべきである。
2）キャピラリーのプレ充填：SDS分離ゲル用緩衝液で50 psi圧力で15分間洗浄した。毎回稼動する前に実施すべきである。
サンプル注入：10 kV逆相極性電動注入、サンプルを還元して、20秒注入した。
分離：15 kVで40分間稼動、逆相極性。
サンプル室温度：18～25℃。
キャピラリー温度：18～25℃。

結果分析
抗体における解放されたジスルフィド結合から遊離されたメルカプト基が全て対応する薬剤に複合したことから、Beckmanソフトウェアによりデータを分析し、重鎖、非グリコシル化重鎖及び軽鎖などの校正ピーク面積のそれぞれの、全校正ピーク面積に占める比率から算出した。計算式：DAR=[4×重鎖（H）ピーク面積+2×ハプテン（H-L）ピーク面積+4×二重鎖（H-H）ピーク面積+2×重重軽鎖（H-H-L）ピーク面積]／[重鎖（H）ピーク面積／2+ハプテン（H-L）ピーク面積／2+二重鎖（H-H）ピーク面積+重重軽鎖（H-H-L）ピーク面積+完全抗体ピーク面積]により、最終的に当該ADCの加重平均値を算出した。

以下、生化学試験方法により本開示の抗体の活性を検証する

試験例1：抗体タンパク質レベル結合実験
pH7.4のPBS（源培生物、B320）緩衝液でhTROP-2タンパク質を1 μg/mLまで希釈し、100 μL/ウェルの体積で96ウェルマイクロプレートに加え、4℃で一晩インキュベートした。液体を捨ててから、各ウェルにPBSで希釈された5%の脱脂乳（BD、232100）300 μLを加えてブロックし、37℃で2時間インキュベートした。ブロック終了後、ブロック液を捨て、PBST緩衝液（PH7.4 PBSが0.1%のtween-20を含有）でプレートを3回洗った後、各ウェルに勾配希釈された抗体溶液100 μLを加え、37℃で1時間インキュベートした。インキュベート終了後、PBSTでプレートを3回洗って、各ウェルに100 μLのマウス抗-ヒトIgG（H+L）（Jackson ImmunoResearch、209-035-088、1：8000で希釈）を加え、37℃で1時間インキュベートした。PBSTでプレートを3回洗っ後、各ウェルに100 μLのTMB顕色基質（KPL、5120-0077）を加え、室温で10～15分間インキュベートして、各ウェルに50 μLの1 MのH₂SO₄を加えて反応を終了させ、マイクロプレートリーダーで450 nmでの吸収値を読み取り、ソフトウェアで抗体と抗原との結合曲線をフィッティングして、EC₅₀値を算出した。抗体とタンパク質との結合活性は表2を参照する。

結果によれば、本願におけるPD3抗体はhTROP-2タンパク質と比較的高い結合活性を有する。

試験例2：抗体細胞レベル結合実験
TROP-2を安定トランスフェクションしたCHOK1細胞をFACS緩衝液（2%のウシ胎児血清（Gibco、10099141）pH7.4 PBS（Sigma、P4417-100TAB））で1×10⁶/mLの細胞懸濁液に調製し、100 μL/ウェルで96ウェル円底プレートに加えた。上清を遠心分離して除去した後、50 μL/ウェルでFACS緩衝液で希釈された異なる濃度の検出待ち抗体を加え、4℃の冷蔵庫に置いて遮光で1時間インキュベートした。FACS緩衝液300 gで3回遠心分離して洗浄した後、作業濃度のAlexa Fluor 488ヒツジ抗-ヒトIgG（H+L）（invitrogen、A-11013）を加え、4℃の冷蔵庫に置いて遮光で40分間インキュベートした。FACS緩衝液300 gで3回遠心分離して洗浄した後、BD FACSCantoIIフローサイトメーターで幾何平均蛍光強度（MFI）を検出し、抗体のTROP-2を安定トランスフェクションして発現した細胞に対する結合EC₅₀値を算出した。抗体と細胞との結合活性は図1及び表3を参照する。

結果によれば、本願におけるPD3抗体はTROP-2タンパク質を発現した細胞と比較的高い結合活性を有する。

試験例3：抗体エンドサイトーシス実験
本実験の目的は、DT3Cタンパク質が細胞に侵入した場合、活性化されたDTの細胞に対する殺傷に基づいて、抗TROP-2抗体のエンドサイトーシス状況を間接的に反映することである。EC₅₀及びE_maxによって抗体の体外エンドサイトーシス活性を評価した。

DT3Cは組換え発現の融合タンパク質であり、ジフテリア毒素の断片A（毒素部分のみ）とG群連鎖球菌の3C断片（IgG結合部分）が融合してなるものである。当該タンパク質は、抗体のIgG部分と高度的に親和でき、抗体においてエンドサイトーシスが発生した場合に一緒に細胞に侵入し、細胞内フーリンの効果を受けて、毒性を有するDTを放出した。DTはEF2-ADPリボース化の活性を抑制することができ、タンパク質の翻訳過程を遮断して、最終的に細胞の死亡を引き起こす。細胞に侵入していないDT3Cは細胞を殺傷する活性を有していない。細胞殺傷の状況によって抗体のエンドサイトーシス活性を評価した。

20%の低IgG FBSを含む新鮮な細胞培地で細胞懸濁液を調製し、細胞密度が2×10⁴細胞/mLであり、50 μL/ウェルで細胞培養プレートに加え、5%の二酸化炭素及び37℃で16時間培養した。無血清培地で4×濃度のDT3Cを調製し、0.22 μmの小型フィルターで滅菌溶液となるように濾過した。無血清培地で4×濃度の抗体を調製し、80 μLのDT3C及び80 μLの抗体を1：1の体積で均一に混合し、室温で静置して、30分間インキュベートした。50 μLの希釈された抗体-DT3C混合物を取り、50 μLの細胞に加え、インキュベーターで3日間インキュベートした。各ウェルに50 μLのCTGを加え、室温で遮光で10分間インキュベートし、Victor3で化学発光を読み取った。抗体のエンドサイトーシス活性は表4を参照する。

結果によれば、本願におけるPD3抗体は比較的高いエンドサイトーシス効率を有する。

試験例4：抗体親和力の測定
抗体のTROP-2に対する親和力はキャプチャー抗体の形態で検出した。抗-ヒトIgG抗体（Cat.#BR-1008-39、Lot. # 10260416、GE）が複合されたProtein A（Cat. # 29127556、Ge）バイオセンサチップでキャプチャー抗体と親和させてから、チップの表面で抗原hTROP-2を流し、Biacore T200機器によりリアルタイムで反応シグナルを検出することにより、結合と解離曲線を得た。各実験のサイクル解離が完了した後、再生緩衝液Glycine1.5（Cat# BR100354、GE）又は3 MのMgCl₂（Human antibody capture kit、Cat.#BR100839、GEに由来）でチップを洗浄して再生した。実験終了後、GE Biacore T200 Evaluation version 3.0ソフトウェアにより（1：1）Langmuirモデルでデータをフィッティングし、親和力の数値を得た。抗体とタンパク質との親和力は表5を参照する。

結果によれば、本願におけるPD3抗体とhTROP-2との親和力は比較的高い。

試験例5：ADC分子細胞活性実験
当該実験に使用される細胞は下記の通りである。FaDu（++++）はATCCより購入し、製品番号：HTB-43^TMである。HCC827（+++）はATCCより購入し、製品番号：CRL-2868である。Colo205（++）は中科院細胞バンクより購入し、製品番号：TCHu102である。DMS53（++）はATCCより購入し、製品番号：CRL-2062^TMである。SK-OV-3（+）はATCCより購入し、製品番号：HTB-77である。CHO-K1（-）はATCCより購入し、製品番号：CCL-61^TMである。そのうち、「+」は細胞におけるTROP-2の発現量を示し、「+」が大きいほど、TROP-2の発現量が高い。「-」はTROP-2未発現を示す。

10%のFBSを含む新鮮な細胞培地で細胞懸濁液を調製し、密度が3703細胞/mLであり、135 μL/ウェルで96ウェル細胞培養プレートに加え、5%の二酸化炭素及び37℃で16時間培養した。PBSでADCサンプルが5 μMとなるように調製した。これを初期濃度として、PBSで5倍希釈して、計8つの濃度となるように希釈した。各ウェルに15 μLの上記ADC溶液を加えた。5%の二酸化炭素及び37℃で6日間培養した。各ウェルに70 μLのCTGを加え、室温で遮光で10分間インキュベートし、Victor3で化学発光を読み取って、GraphPad Prismソフトウェアによりデータの分析を行った。

結果によれば、ADC-1は比較的強い細胞殺傷効果を有し、且つ殺傷効果が腫瘍細胞表面のTROP-2発現レベルと正相関を有する。

上記方法により2回目の並行比較実験を行って、下記の結果を得た。

試験例6：バイスタンダー殺傷活性実験
BxPC3（ヒト膵臓がん細胞、ATCC、CRL-1687）及びMiaPaCa2細胞（ヒト膵臓がん細胞、biocytogen、B-HCL-014）をそれぞれRPMI1640+10%のFBS及びDMEM/高グルコース+10%のFBSで培養し、細胞をパンクレアチンで消化し、新鮮な培地で中和し、1000 rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てて、細胞をRPMI1640+10%のFBSで再懸濁した。細胞を計数してから、BxPC3の細胞密度を6×10⁴個/mLに調整し、MiaPaCa2-lucの細胞密度を1.5×10⁴個/mLに調整した。12ウェルプレートのプレート1における各ウェルに500 μLのBxPC3細胞及び500 μLのMiaPaCa2-luc細胞を加えた。12ウェルプレートのプレート2に500 μLのMiaPaCa2-luc細胞及び500 μLの10%のFBS血清を含むRPMI1640培養液を加えた。5%の二酸化炭素及び37℃で24時間培養した。

ADCサンプルを40×濃度の中間溶液（0.2 μM）に調製した。それぞれ25 μLの上記サンプルを取り、12ウェルプレートの対応するウェルに加えた。溶剤対照群を設けた。5%の二酸化炭素及び37℃で6日間培養した。12ウェルプレートにおける細胞をパンクレアチンで消化し、新鮮な培地で中和し、1000 rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てて、1 mLのFACS緩衝液（PBS+2.5%のFBS）で再懸濁し、20 μLの細胞を取り、20 μLのトリパンブルーを加えて、計数した。プレート1の細胞を1000 rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てて、100 μLのFACS Bufferで再懸濁し、2 μLのTROP-2（EGP-1）モノクローナル抗体（MR54）を加え、氷上で30分間インキュベートした。4℃、2000 rpmで1分間遠心分離し、上清を捨てて、150 μLのFACS緩衝液を加え、細胞を再懸濁した。BD FACSVerseにより検出した。Flowjo 7.6によりデータを分析した。バイスタンダー殺傷活性実験結果は図2を参照する。

結果によれば、本開示におけるADC-1は明確なバイスタンダー殺傷効果を有する。ADCはTROP-2陰性のMiaPaCa2細胞を殺傷しないが、TROP-2を発現したBxPC3細胞と陰性細胞MiaPaCa2とを混合した後、ADC-1はTROP-2陰性の細胞に対しても殺傷効果を有する。

体内活性の生物学的評価
試験例7：Fadu細胞CDXマウスモデル体内薬効評価
Fadu細胞（3×10⁶個）をBalb/cヌードマウスの右肋部皮下に接種し、接種10日後、腫瘍体積が～245 mm³に達した後に、体重、腫瘍が過大又は過小であるものを除去し、腫瘍体積によってマウスをランダムで5群に分け、1群に8匹である。
ADCを腹腔内に注射し、0日目及び8日目に計2回投与し、体重に応じて10 g/0.1 mLでそれぞれに注射し、投与量が1 mg/kgである。腫瘍の体積と体重を週2回計測し、データを計21日記録した。

Excel統計ソフトウェアでデータを記録した。平均値はavgで算出し、SD値はSTDEVで算出し、SEM値はSTDEV/SQRT（各群の動物数）で算出した。GraphPad Prismソフトウェアでプロットし、Two-way ANOVA又はOne-way ANOVAでデータの統計的分析を行った。
腫瘍体積（V）の計算式：V＝1/2×L_長×L_短 ²
相対腫瘍増殖率T/C（%）=（T-T₀）/（C-C₀）×100において、T、Cは実験終了時の治療群及び対照群の腫瘍体積であり、T₀、C₀は実験開始時の腫瘍体積である。
腫瘍阻害率TGI（%）=1- T/C（%）。

結果は表7及び図3を参照する。1 mpkの用量では、ADC-1はFaDu移植腫瘍に対して比較的強い腫瘍阻害効果を有する。

試験例8：SKOV3細胞CDXマウスモデル体内薬効評価
SKOV3細胞（5×10⁶個）をBalb/cヌードマウスの右肋部皮下に接種し、接種23日後、腫瘍体積が約180 mm³に達した後に、体重、腫瘍が過大又は過小であるものを除去し、腫瘍体積によってマウスをランダムで5群に分け、1群に8匹である。
ADCを腹腔内に注射し、計2回投与し、体重に応じて10 g/0.1 mLでそれぞれに注射し、投与量が下表を参照する。腫瘍の体積と体重を週2回計測し、データを記録した。Excel統計ソフトウェアでデータを記録した。平均値はavgで算出し、SD値はSTDEVで算出し、SEM値はSTDEV/SQRT（各群の動物数）で算出した。GraphPad Prismソフトウェアでプロットし、2因子ANOVA又は1因子ANOVAでデータの統計的分析を行った。
腫瘍体積（V）の計算式：V＝1/2×L_長×L_短 ²
相対腫瘍増殖率T/C（%）=（T-T₀）/（C-C₀）×100において、T、Cは実験終了時の治療群及び対照群の腫瘍体積であり、T₀、C₀は実験開始時の腫瘍体積である。
腫瘍阻害率TGI（%）=1- T/C（%）。

結果は表8及び図4を参照する。異なる用量では、ADC-1はSKOV3移植腫瘍に対して比較的強い腫瘍阻害効果を有すると共に、腫瘍阻害効果は用量依存効果を有する。
効果は用量依存効果を有する。

試験例9：Colo205細胞CDXマウスモデル体内薬効評価
Colo205細胞（5×10⁶個）をBalb/cヌードマウスの右肋部皮下に接種し、接種10日後、腫瘍体積が～245 mm³に達した後に、体重、腫瘍が過大又は過小であるものを除去し、腫瘍体積によってマウスをランダムで6群に分け、1群に8匹である。
ADCを腹腔内に注射し、0日目（D0）及び10日目に計2回投与し、体重に応じて10 g/0.1 mLでそれぞれに注射し、投与量が10 mg/kgである。腫瘍の体積と体重を週2回計測し、データを計28日（D28）記録した。

Excel統計ソフトウェアでデータを記録した。平均値はavgで算出し、SD値はSTDEVで算出し、SEM値はSTDEV/SQRT（各群の動物数）で算出した。GraphPad Prismソフトウェアでプロットし、2因子ANOVA又は1因子ANOVAでデータの統計的分析を行った。
腫瘍体積（V）の計算式：V＝1/2×L_長×L_短 ²
相対腫瘍増殖率T/C（%）=（T-T₀）/（C-C₀）×100において、T、Cは実験終了時の治療群及び対照群の腫瘍体積であり、T₀、C₀は実験開始時の腫瘍体積である。
腫瘍阻害率TGI（%）=1- T/C（%）。

結果は表9及び図5を参照する。1 mpkの用量では、化合物9-Aが複合されたADC-9及びADC-7はColo205移植腫瘍に対して比較的強い腫瘍阻害効果を有する。

Claims

一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、

そのうち、
Yは、-O-（CR^aR^b）_m-CR¹R²-C（O）-、-O-CR¹R²-（CR^aR^b）_m-、-O-CR¹R²-、-NH-（CR^aR^b）_m-CR¹R²-C（O）-及び-S-（CR^aR^b）_m-CR¹R²-C（O）-から選ばれ、
R^aとR^bは、相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、重水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基及びヘテロシクリル基から選ばれ、或いは、R^aとR^bは、それらに接続された炭素原子とともにシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
R¹は、ハロゲン、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、R²は、水素原子、ハロゲン、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、或いは、R¹とR²は、それらに接続された炭素原子とともにシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
或いは、R^aとR²は、それらに接続された炭素原子とともにシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
mは、0～4の整数であり、
nは1～10であり、nは小数又は整数であり、
Lは、リンカーユニットであり、
Pcは、抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片である、
一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、前記重鎖可変領域は配列番号3で表される重鎖可変領域と同じ配列であるHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号4で表される軽鎖可変領域と同じ配列であるLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む、請求項1に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、前記重鎖可変領域はそれぞれ配列番号5、配列番号6及び配列番号7で表されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、前記軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号8、配列番号9及び配列番号10で表されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む、請求項1又は2に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記抗TROP-2抗体はマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項1～3の何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号3で表され、又はそれと少なくとも90%の同一性を有し、及び／又は前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号4で表され、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する、請求項1～4の何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片は配列番号3で表される重鎖可変領域と配列番号4で表される軽鎖可変領域を含む、請求項1～5の何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片は抗体重鎖定常領域と軽鎖定常領域を含み、好ましくは、前記重鎖定常領域はヒトIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4の定常領域から選ばれ、前記軽鎖定常領域はヒト抗体κ及びλ鎖の定常領域から選ばれ、より好ましくは、前記抗TROP-2抗体は配列番号11で表される重鎖定常領域と配列番号12で表される軽鎖定常領域を含む、請求項1～6の何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記抗TROP-2抗体は配列番号13で表される重鎖と配列番号14で表される軽鎖を含む、請求項1～7の何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
nは2～10であり、好ましくは4～8であり、nは小数又は整数である、請求項1～8の何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
Yは、-O-（CR^aR^b）_m-CR¹R²-C（O）-であり、
R^aとR^bは、相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、重水素原子、ハロゲン及びアルキル基から選ばれ、
R¹は、ハロゲン化アルキル基又はC_3-6シクロアルキル基であり、
R²は、水素原子、ハロゲン化アルキル基及びC_3-6シクロアルキル基から選ばれ、
或いは、R¹とR²は、それらに接続された炭素原子とともにC_3-6シクロアルキル基を形成し、
mは、0又は1である、
請求項1～9の何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
Yは、

から選ばれ、
そのうち、YのO端は、リンカーユニット-L-に接続される、
請求項1～10の何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
リンカーユニット-L-は、-L¹-L²-L³-L⁴-であり、
L¹は、-（スクシンイミド-3-イル-N）-W-C（O）-、-CH₂-C（O）-NR³-W-C（O）-及び-C（O）-W-C（O）-から選ばれ、そのうち、Wは、C_1-8アルキル基、C_1-8アルキル基-シクロアルキル基及び1～8個の鎖原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、前記ヘテロアルキル基は、N、O及びSから選ばれる1～3個のヘテロ原子を含み、前記C_1-8アルキル基、シクロアルキル基及び直鎖ヘテロアルキル基は、それぞれ独立的に、任意にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる1つ又は複数の置換基で更に置換され、
L²は、-NR⁴（CH₂CH₂O）pCH₂CH₂C（O）-、-NR⁴（CH₂CH₂O）pCH₂C（O）-、-S（CH₂）pC（O）-及び化学結合から選ばれ、そのうち、pは1～20の整数であり、
L³は、2～7個のアミノ酸残基からなるペプチド残基であり、そのうち、前記アミノ酸残基はフェニルアラニン、グリシン、バリン、リジン、シトルリン、セリン、グルタミン酸及びアスパラギン酸のうちのアミノ酸により形成されるアミノ酸残基から選ばれ、且つ任意にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる1つ又は複数の置換基で更に置換され、
L⁴は、-NR⁵（CR⁶R⁷）_t-、-C（O）NR⁵-、-C（O）NR⁵（CH₂）_t-及び化学結合から選ばれ、そのうち、tは1～6の整数であり、
R³、R⁴及びR⁵は、相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれ、
R⁶とR⁷は、相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれる、
請求項1～11の何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
リンカーユニット-L-は、-L¹-L²-L³-L⁴-であり、
L¹は

であり、s¹は2～8の整数であり、
L²は、化学結合であり、
L³は、テトラペプチド残基であり、好ましくは、L³はGGFGのテトラペプチド残基であり、
L⁴は、-NR⁵（CR⁶R⁷）_t-であり、R⁵、R⁶又はR⁷は、相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子又はアルキル基であり、tは1又は2であり、
そのうち、前記L¹端は、Pcに接続され、L⁴端は、Yに接続される、
請求項1～12の何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
-L-は、

である、
請求項1～13の何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
-L-Y-は、任意に

から選ばれる、
請求項1～14の何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
一般式（Pc-L_a-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であり、

そのうち、Pc、n、m、W、L²、L³、R¹、R²、R⁵、R⁶及びR⁷は請求項1～12の何れか1項に定義される通りである、
請求項1～12の何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
一般式（Pc-L_b-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であり、

そのうち、
s¹は、2～8の整数であり、
Pc、R¹、R²、R⁵～R⁷、m及びnは請求項1～13の何れか1項に定義される通りである、
請求項1～13、16の何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記リガンド-薬物複合体は、

から選ばれ、
そのうち、Pc及びnは請求項1～17の何れか1項に定義される通りである、
請求項1～17の何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記リガンド-薬物複合体は、

であり、
そのうち、
nは1～8であり、nは小数又は整数であり、好ましくは4～8の整数又は小数であり、より好ましくは4～6の整数又は小数であり、
Pcは抗TROP-2抗体であり、それは配列番号13で表される重鎖と配列番号14で表される軽鎖を含む、
請求項1～18の何れか1項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、前記重鎖可変領域は配列番号3で表される重鎖可変領域と同じ配列であるHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号4で表される軽鎖可変領域と同じ配列であるLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む、抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片。
重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、前記重鎖可変領域はそれぞれ配列番号5、配列番号6及び配列番号7で表されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、前記軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号8、配列番号9及び配列番号10で表されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む、請求項20に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片。
前記抗TROP-2抗体はマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項20又は21に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片。
重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号3で表され、又はそれと少なくとも90%の同一性を有し、及び前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号4で表され、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する、請求項20～22の何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片。
前記抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片は抗体重鎖定常領域と軽鎖定常領域を含み、好ましくは、前記重鎖定常領域はヒトIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4の定常領域から選ばれ、前記軽鎖定常領域はヒト抗体κ及びλ鎖の定常領域から選ばれ、
より好ましくは、前記抗TROP-2抗体は配列番号11で表される重鎖定常領域と配列番号12で表される軽鎖定常領域を含む、
請求項20～23の何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片。
前記抗TROP-2抗体は配列番号13で表される重鎖と配列番号14で表される軽鎖を含む、請求項20～24の何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片。
請求項20～25の何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片をコードする、核酸分子。
請求項26に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
一般式（Pc-L_a-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩を調製する方法であって、下記ステップ、即ち、

Pcを還元した後、一般式（L_a-Y-D）で表される化合物とカップリング反応し、一般式（Pc-L_a-Y-D）で表される化合物を得るステップを含み、
そのうち、
Pcは、抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片であり、好ましくは、Pcは請求項20～25の何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片であり、
n、m、W、L²、L³、R¹、R²、R⁵、R⁶及びR⁷は請求項16に定義される通りである、
方法。
請求項1～19の何れか1項に記載の抗体-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、或いは請求項20～25の何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片と、
1種又は複数種の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又はベクターと、を含む、
医薬組成物。
TROP-2により仲介される疾患又は病状を治療するための薬剤の調製における、請求項1～19の何れか1項に記載の抗体-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、請求項20～25の何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片、或いは請求項29に記載の医薬組成物の使用。
腫瘍を治療するための薬剤の調製における、請求項1～19の何れか1項に記載の抗体-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、請求項20～25の何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片、或いは請求項29に記載の医薬組成物の使用。
腫瘍及びがんを治療及び／又は予防する薬剤の調製における、請求項1～19の何れか1項に記載の抗体-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、請求項20～25の何れか1項に記載の抗TROP-2抗体又はその抗原結合断片、或いは請求項29に記載の医薬組成物の使用であって、前記腫瘍及びがんは、好ましくは、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、咽頭扁平上皮がん、口腔扁平上皮がん、鼻咽頭がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝がん、肝胆がん、膵臓がん、胃がん、消化管がん、腸がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎がん、明細胞腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、クルッケンベルグ腫瘍、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、尿路上皮がん及びメルケル細胞がんであり、より好ましくは、前記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、縦隔原発大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、T細胞/組織球に富む大細胞型B細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫から選ばれ、前記肺がんは、非小細胞肺がん及び小細胞肺がんから選ばれ、前記白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄細胞白血病から選ばれる、使用。