KR20220130717A - 항-trop-2 항체-엑사테칸 유사체 접합체 및 이의 의학적 용도 - Google Patents

항-trop-2 항체-엑사테칸 유사체 접합체 및 이의 의학적 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-TROP-2 항체-엑사테칸 유사체 접합체 및 이의 의학적 용도를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 화학식 (Pc-L-Y-D)로 표시되는 항-TROP-2 항체-엑사테칸 유사체 접합체를 제공하며, 여기서 Pc는 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.

Description

항-TROP-2 항체-엑사테칸 유사체 접합체 및 이의 의학적 용도
본 출원은 2020년 1월 22일에 출원된 중국 특허 출원(특허 출원 번호 CN202010073438.8)의 우선권을 주장한다.
기술분야
본 개시는 항-TROP-2 항체 및 항-TROP-2 항체-엑사테칸 유사체 접합체, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 약학적 조성물, 및 TROP-2-매개 질환 또는 상태의 치료용 의약의 제조에 있어서 이의 용도, 특히 항암 의약 제조에서 이의 용도에 관한 것이다.
배경
본원에서의 진술은 단지 본 개시와 관련된 배경 정보를 제공할 뿐이며 반드시 선행 기술을 구성하는 것은 아닐 수 있다.
인간 영양막 세포 표면 당단백질 항원 2(TROP-2)는 종양 관련 칼슘 신호 변환기 2(TACSTD2), 표피 당단백질 1(EGP-1), 위장 종양 관련 항원(GA733-1) 및 표면 마커 1(M1S1)이라고도 알려져 있으며, 염색체의 1p32 영역에서 Tacstd2 유전자에 의해 암호화되고 발현되는 세포 표면 당단백질이다. TROP-2는 GA733 단백질 패밀리의 구성원이며, 상피 세포 접착 분자(EpCAM, Trop1 및 TACSTD1이라고도 함)와 49%의 상동성으로 더 높은 구조적 서열 유사성을 가지고 있다.
TROP-2 단백질의 1차 구조는 약 323개의 아미노산으로 구성된 약 36kD 폴리펩타이드이며, 그 1차 구조는 N-말단 글리코실화에 의해 번역 후 변형되어 EpCAM과 다른 유형 I 세포막 당단백질, 즉 TROP-2 단백질을 형성한다. TROP-2 단백질은 세포막에 걸쳐 있으며 N-말단 세포외 도메인(Trop2EC)을 가지며, 그 세포외 도메인은 26개의 아미노산 잔기로 구성된 소수성 폴리펩타이드의 짧은 세포내 꼬리(Trop2IC)에 연결된 단방향 막횡단 나선(TM)에 의해 세포막에 고정되어 있다.
현재 TROP-2는 배아 발달 및 종양 세포 증식 및 전이 과정에서 중요한 의미가 있는 것으로 확인되었다. TROP-2는 원래 영양막 세포에서 발견되어 그 표면 표지자 역할을 하고, 영양막 세포는 배아외 영양막에서 유래하며, TROP-2는 배아 착상 및 태반 조직 형성에 기여하며 배아줄기세포의 증식 특성의 유지 및 장기의 형성 및 발달에 중요한 역할을 한다. 또한, TROP-2는 중요한 종양 발달 관련 인자이기도 하며, 췌장암, 유방암, 결장암, 위암, 구강편평암 및 난소암과 같은 다양한 종양에서 높게 발현되어 종양 세포 증식, 침윤, 전이, 확산 등의 진행을 촉진할 수 있고, 종양 개체(subject)의 짧은 생존기간 및 불량한 예후와 밀접한 관련이 있으므로, TROP-2를 표적으로 하는 항종양 약물에 대한 연구는 큰 의의를 갖는다.
항체-약물 접합체(ADC)는 단일 클론 항체 또는 항체 단편을 링커 화합물을 통해 생물학적 활성 세포독소에 연결하여, 정상 세포 및 종양 세포의 표면 항원에 대한 항체의 결합 특이성과 세포독성 물질의 고효율성을 최대한 활용하고, 또한 항체의 불충분한 치료 효과 및 독성 물질의 심각한 독성 부작용의 결함을 회피한다. 이는 항체-약물 접합체가 기존의 기존 화학요법제에 비해 종양 세포를 보다 정확하게 사멸시킬 수 있고 정상 세포에는 감소된 영향을 미친다는 것을 의미한다.
요약
본 개시는 항-TROP-2 항체, 이의 ADC 및 이의 용도에 관한 것으로, 항-TROP-2 항체 또는 항원 결합 단편이 세포독성 물질인 엑사테칸 유사체(exatecan analog)와 접합되어 있는 ADC 약물을 제공한다. 본 개시는 하기 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:
Figure pct00001
상기 식에서
Y는-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-, -O-CR1R2-(CRaRb)m-, -O-CR1R2-, -NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)- 및 -S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Ra 및 Rb는 동일 또는 상이하고 수소, 중수소, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 중수소화 알킬, 알콕시, 히드록시, 아미노, 시아노, 니트로, 히드록시알킬, 시클로알킬 및 헤테로시클릴로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나; 또는 Ra 및 Rb는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클릴을 형성하고;
R1은 할로겐, 할로알킬, 중수소화 알킬, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 알콕시알킬, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는수소, 할로겐, 할로알킬, 중수소화 알킬, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 알콕시알킬, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 R1 및 R2는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클릴을 형성하고;
m은 0 내지 4의 정수이고; m의 비제한적인 예는, 예를 들어 m이 0, 1, 2, 3 및 4로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n은 소수(decimal) 또는 1 내지 10의 정수이고;
L은 링커 유닛이고;
Pc는 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
몇몇 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서, 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변영역은 서열번호 3에 기재된 중쇄 가변영역의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 서열과 동일한 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변영역은 서열번호 4에 기재된 경쇄 가변영역의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 서열과 동일한 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서, 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7에 각각 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변영역은 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 각각 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서, 항-TROP-2 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체이다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서, 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖거나 이에 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100%를 포함하나 이에 제한되지 않는 적어도 90% 내지 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖거나 이에 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100%를 포함하나 이에 제한되지 않는 적어도 90% 내지 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서, 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 3에 기재된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4에 기재된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서, 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함하고; 바람직하게는, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 경쇄 불변 영역은 인간 항체 κ 및 λ 쇄 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 보다 바람직하게는, 항체는 서열 번호 11에 기재된 서열을 갖는 중쇄 불변 영역 및 서열 번호 12에 기재된 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서, 항-TROP-2 항체는 서열번호 13에 기재된 중쇄 및 서열번호 14에 기재된 경쇄를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 전술한 바와 같은 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서, 항-TROP-2 항체는 서열번호 15에 기재된 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 16에 기재된 서열을 갖는 경쇄를 포함하거나, 또는 서열번호 17에 기재된 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 18에 기재된 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서, n은 소수 또는 2 내지 10, 바람직하게는 4 내지 8의 정수이다. 몇몇 구현예에서, n은 0 내지 10, 바람직하게는 1 내지 10, 더욱 바람직하게는 1 내지 8, 또는 2 내지 8, 또는 2 내지 7, 또는 2 내지 4, 또는 3 내지 8, 또는 3 내지 7, 또는 3 내지 6, 또는 4 내지 7, 또는 4 내지 6, 또는 4 내지 5의 평균값이다. 몇몇 구현예에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 평균이다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서,
Y는 -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-이고;
Ra 및 Rb는 동일하거나 상이하고, 수소, 중수소, 할로겐 및 알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
R1은 할로알킬 또는 C3-6 시클로알킬이고;
R2는 수소, 할로알킬 및 C3-6 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 R1 및 R2는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 C3-6 시클로알킬을 형성하고;
m은 0 또는 1이다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서,
Y는
Figure pct00002
및
Figure pct00003
로 이루어진 군으로부터 선택되고,
여기서 Y의 O-말단은 링커 유닛 L에 연결되어 있다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서, 링커 유닛 -L-은 -L1-L2-L3-L4- 이고, 여기서 L1은 -(숙신이미딜-3-일-N)-W-C(O)-, -CH2-C(O)-NR3-W-C(O)- 및 -C(O)-W-C(O)- 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 W은 C1-8 알킬, C1-8 알킬-시클로알킬 및 원자수 1 내지 8 의 선형 헤테로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 헤테로알킬은 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하고, 여기서의 C1-8 알킬, 시클로알킬 및 선형 헤테로알킬은 각각 독립적으로, 할로겐, 히드록시, 시아노, 아미노, 알킬, 클로로알킬, 중수소화 알킬, 알콕시 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 추가로 치환되고;
L2은 -NR4(CH2CH2O)pCH2CH2C(O)-, -NR4(CH2CH2O)pCH2C(O)-, -S(CH2)pC(O)- 및 화학적 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서의 p는 1 내지 20의 정수이고;
L3은 2 내지 7개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 잔기이고, 여기서의 아미노산 잔기는 페닐알라닌, 글리신, 발린, 라이신, 시트룰린, 세린, 글루탐산 및 아스파르트산으로부터의 아미노산으로부터 형성된 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 할로겐, 히드록시, 시아노, 아미노, 알킬, 클로로알킬, 중수소화 알킬, 알콕시 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 추가로 치환되고;
L4는 -NR5(CR6R7)t-, -C(O)NR5, -C(O)NR5(CH2)t- 및 화학적 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서의 t는 1 내지 6의 정수이고;
R3, R4 및 R5 동일하거나 상이하고 수소, 알킬, 할로알킬, 중수소화 알킬 및 히드록시알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
R6 및 R7 동일하거나 상이하고 수소, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 중수소화 알킬 및 히드록시알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서, 링커 유닛 -L-은 -L1-L2-L3-L4- 이고, 여기서
L1은 -(숙신이미딜-3-일-N)-W-C(O)-, -CH2-C(O)-NR3-W-C(O)- 및 -C(O)-W-C(O)- 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서의 W은 C1-8 알킬, C1-8 알킬-시클로알킬 및 사슬 원자수 1 내지 8의 선형 헤테로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 헤테로알킬은 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하고, 여기서의 C1-8 알킬, 시클로알킬 및 선형 시클로알킬은 각각 독립적으로, 할로겐, 히드록시, 시아노, 아미노, 알킬, 클로로알킬, 중수소화 알킬, 알콕시 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 추가로 치환되고;
L2는 -NR4(CH2CH2O)pCH2CH2C(O)-, -NR4(CH2CH2O)pCH2C(O)-, -S(CH2)pC(O)- 및 화학적 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서의 p는 1 내지 20의 정수이고;
L3는 2 내지 7개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드 잔기이고, 여기서의 아미노산 잔기는 페닐알라닌(F), 글리신(G), 발린(V), 라이신(K), 시트룰린, 세린(S), 글루탐산(Q) 및 아스파르트산(D)으로부터의 아미노산으로부터 형성된 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 할로겐, 히드록시, 시아노, 아미노, 알킬, 클로로알킬, 중수소화 알킬, 알콕시 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 추가로 치환되고;
L4는 -NR5(CR6R7)t-, -C(O)NR5-, -C(O)NR5(CH2)t- 및 화학적 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서의 t는 1 내지 6의 정수이고, t의 비제한적인 예는 1, 2, 3, 4, 5 및 6이고;
R3, R4 및 R5는 동일하거나 상이하고 수소, 알킬, 할로알킬, 중수소화 알킬 및 히드록시알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
R6 및 R7은 동일하거나 상이하고 수소, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 중수소화 알킬 및 히드록시알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서, 링커 유닛 -L-은 -L1-L2-L3-L4- 이고, 여기서
L1은
Figure pct00004
이고, s1은 2 내지 8의 정수이고, s1의 비제한적인 예는 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8이고;
L2는 화학적 결합이고;
L3은 테트라펩티드 잔기, 바람직하게는 GGFG의 테트라펩티드 잔기이고;
L4는 -NR5(CR6R7)t-이고, 여기서의 R5, R6 및 R7은 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소 또는 알킬이고, t는 1 또는 2이고;
여기서의 L1 말단은 Pc에 연결되고 L4 말단은 Y에 연결되어 있다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서, -L-은
Figure pct00005
이다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서, -L-Y- 는 하기의 것들로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00006
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 하기 화학식 (Pc-La-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다:
Figure pct00007
상기 식에서,
W, L2, L3, R5, R6 및 R7은 전술한 링커 유닛 -L-에서 정의한 바와 같고,
Pc, n, R1, R2 및 and m은 화학식 (Pc-L-Y-D)에서 정의한 바와 같다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 하기 화학식 (Pc-Lb-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다:
Figure pct00008
상기 식에서,
s1은 2 내지 8의 정수이고;
Pc, R1, R2, R5, R6, R7, m 및 n은 화학식 (Pc-L-Y-D)에서 정의한 바와 같다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서, 리간드-약물 접합체는 하기의 것들로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00009
상기 식에서, Pc 및 n은 화학식 (Pc-L-Y-D)에서 정의한 바와 같다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서, 리간드-약물 접합체는 하기의 것들로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00010
상기 식에서,
n은 소수 또는 4 내지 8의 정수이고;
Pc는 서열번호 13에 기재된 중쇄 및 서열번호 14에 기재된 경쇄를 포함하는 항-TROP-2 항체이다.
몇몇 구현예에서, 전술한 바와 같은 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서, 리간드-약물 접합체는 하기의 것이다:
Figure pct00011
상기 식에서,
n은 소수 또는 1 내지 8, 바람직하게는 2 내지 4 또는 4 내지 8, 더욱 바람직하게는 4 내지 6의 정수이고;
Pc는 서열번호 13에 기재된 중쇄 및 서열번호 14에 기재된 경쇄를 포함하거나, 서열번호 15에 기재된 중쇄 및 서열번호 16에 기재된 경쇄를 포함하거나, 또는 서열번호 17에 기재된 중쇄 및 서열번호 18에 기재된 경쇄를 포함하는 항-TROP-2 항체이다.
몇몇 구현예에서, 전술한 바와 같은 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에서, 리간드-약물 접합체는 하기의 것들로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00012
상기 식에서.
n은 소수 또는 1 내지 8, 바람직하게는 2 내지 4 또는 4 내지 8, 더욱 바람직하게는 4 내지 6의 정수이고;
PD3은 서열번호 13에 기재된 중쇄 및 서열번호 14에 기재된 경쇄를 포함하는 항-TROP-2 항체이고;
hRS7은 서열번호 15에 기재된 중쇄 및 서열번호 16에 기재된 경쇄를 포함하는 항-TROP-2 항체이고;
TINA는 서열번호 17에 기재된 중쇄 및 서열번호 18에 기재된 경쇄를 포함하는 항-TROP-2 항체이다.
또한, 본 발명은 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 중쇄 가변영역의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 서열과 동일한 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변영역은 서열번호 4에 기재된 경쇄 가변 영역의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 서열과 동일한 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는. 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
몇몇 구현예에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 전술한 바와 같은 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7에 각각 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 각각 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 항-TROP-2 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체이다.
몇몇 구현예에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 이와 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100%를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적어도 90% 내지 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 이와 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100%를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적어도 90% 내지 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함하고; 바람직하게는, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변 영역 및 이들의 통상적인 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 경쇄 불변 영역은 인간 항체 κ 및 λ 쇄 불변 영역 및 이의 통상적인 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되고; 더욱 바람직하게는 항체는 서열번호 11에 기재된 중쇄 불변 영역 및 서열번호 12에 기재된 경쇄 불변 영역을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 언급한 구현예 중 어느 하나에 따른 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 항-TROP-2 항체는 서열번호 13에 기재된 중쇄 및 서열번호 14에 기재된 경쇄를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 상기 기재된 바와 같은 항-TROP-2 항체를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시는 상기 기재된 바와 같은 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 상기 기재된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 개시는 환원된 Pc' 및 화학식 (La-Y-D)의 화합물을 커플링 반응시켜서 화학식 (Pc-La-Y-D)의 화합물을 얻는 단계를 포함하는, 화학식 (Pc-La-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 제조 방법을 제공한다:
Figure pct00013
상기 식에서,
Pc는 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
n, m, W, L2, L3, R1, R2, R5, R6 및 R7는 상기 언급한 화학식 (Pc-La-Y-D)에서 정의한 바와 같다.
또한, 본 개시는 환원된 Pc 및 화학식 (L'-D)의 화합물을 커플링 반응시켜서 화학식 (Pc-L'-D)의 화합물을 얻는 단계를 포함하는, 화학식 (Pc-L'-D)의 리간드 약물 접합체의 제조 방법을 제공한다:
Figure pct00014
상기 식에서,
Pc는 상기 기재된 바와 같은 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고;
n은 화학식 (Pc-L-Y-D)에서 정의된 바와 같다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 상기 언급된 구현예 중 어느 하나에 따른 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 또는 상기 언급된 구현예 중 어느 하나에 따른 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 약학적 조성물의 단위 용량은 상기 기재된 바와 같은 항-TROP-2 항체 또는 상기 기재된 바와 같은 항체-약물 접합체 0.1 내지 3000 mg 또는 1 내지 1000 mg을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 또는 상기 언급된 구현예 중 어느 하나에 따른 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 이를 의약으로서 포함하는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 TROP-2-매개 질환 또는 상태의 치료를 위한 의약의 제조에서 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 또는 상기 언급된 구현예 중 어느 하나에 따른 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 이를 의약으로서 포함하는 약학적 조성물을 제공하고, 여기서 TROP-2-매개 질환 또는 상태는 높은 TROP-2 발현, 중간 TROP-2 발현 또는 낮은 TROP-2 발현을 갖는 암이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 종양 및/또는 암의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조에서 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 또는 상기 언급된 구현예 중 어느 하나에 따른 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 이를 의약으로서 포함하는 약학적 조성물을 제공하고, 여기서 종양 및 암은 바람직하게는 두경부 편평 세포 암종, 두경부암, 뇌암, 신경교종, 다형성 교모세포종, 신경모세포종, 중추신경계 암종, 신경내분비 종양, 인후암, 인두 편평 세포 암종, 구강 편평 세포 암종, 비인두암, 식도암, 갑상선암, 악성 흉막중피종, 폐암, 유방암, 간암, 간담도암, 췌장암, 위암, 위장관암, 장암, 결장암, 대장암, 신장암, 투명세포신세포암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 전립선암, 고환암, 피부암, 흑색종, 백혈병, 림프종, 골암, 연골육종, 골수종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 크루켄버그(Krukenberg) 종양, 골수증식성 종양, 편평 세포 암종, 유잉(Ewing's) 육종, 요로상피 암종 또는 메르켈(Merkel) 세포 암종이고; 더욱 바람직하게는, 림프종은 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, 외투 세포 림프종, 소림프구성 림프종, T 세포/조직구가 풍부한 거대 B 세포 림프종, 및 림프형질구성 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 폐암은 비소세포폐암 및 소세포폐암으로 이루어진 군에서 선택되고, 백혈병은 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 골수 세포 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 종양을 예방 및/또는 치료하는 방법으로서, 상기 언급된 구현예 중 어느 하나에 따른 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 또는 상기 언급된 구현예 중 어느 하나에 따른 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 이를 의약으로서 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 치료적 유효 용량(therapeutically effective dose)으로 투여하는 것을 포함하고, 종양은 높은 TROP-2 발현, 중간 TROP-2 발현 또는 낮은 TROP-2 발현을 갖는 암인, 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 종양 또는 암을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 언급된 구현예 중 어느 하나에 따른 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 또는 상기 언급된 구현예 중 어느 하나에 따른 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 이를 의약으로서 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 치료적 유효 용량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하고, 여기서 종양 및 암은 바람직하게는 두경부 편평 세포 암종, 두경부암, 뇌암, 신경교종, 다형성 교모세포종, 신경모세포종, 중추신경계 암종, 신경내분비 종양, 인후암, 인두 편평 세포 암종, 구강 편평 세포 암종, 비인두암, 식도암, 갑상선암, 악성 흉막중피종, 폐암, 유방암, 간암, 간담도암, 췌장암, 위암, 위장관암, 장암, 결장암, 대장암, 신장암, 투명세포신세포암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 전립선암, 고환암, 피부암, 흑색종, 백혈병, 림프종, 골암, 연골육종, 골수종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 크루켄버그(Krukenberg) 종양, 골수증식성 종양, 편평 세포 암종, 유잉(Ewing's) 육종, 요로상피 암종 또는 메르켈(Merkel) 세포 암종이고; 더욱 바람직하게는, 림프종은 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, 외투 세포 림프종, 소림프구성 림프종, T 세포/조직구가 풍부한 거대 B 세포 림프종, 및 림프형질구성 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 폐암은 비소세포폐암 및 소세포폐암으로 이루어진 군에서 선택되고, 백혈병은 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 골수 세포 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 의약, 바람직하게는 암 또는 종양의 치료를 위한 의약, 더욱 바람직하게는 TROP-2 매개 암의 치료를 위한 의약으로서 사용하기 위한 상기 언급된 항-TROP-2 항체 또는 이의 항체-약물 접합체를 추가로 제공한다.
활성 화합물(예를 들어, 본 개시에 따른 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염)은 임의의 적합한 경로에 의한 투여에 적합한 형태, 바람직하게는 단위 용량의 형태, 또는 대상체가 자가 투여할 수 있는 단위 용량의 형태로 제형화될 수 있다. 본원에 개시된 활성 화합물 또는 조성물의 단위 용량은 정제, 캡슐, 카셰, 바이알, 분말, 과립, 로젠지, 좌제, 재구성용 분말 또는 액체 제제일 수 있다.
본 개시의 치료 방법에 사용되는 활성 화합물 또는 조성물의 투여 용량은 일반적으로 질환의 중증도, 대상체의 체중, 및 활성 화합물의 효능에 따라 달라질 것이다. 일반적인 지침으로, 적절한 단위 용량은 0.1 mg 내지 1000 mg일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 활성 화합물 이외에 충전제, 희석제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 부형제 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 투여 방법에 따라, 조성물은 0.1 내지 99 중량%의 활성 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 TROP-2 항체 및 항체-약물 접합체는 세포 표면 항원에 대한 친화도가 양호하고, 세포내이입 효율이 양호하고 종양 억제 효율이 높을 뿐만 아니라 약물 적용 범위가 넓어 임상 약물 적용을 위해 적합하다.
도 1은 TROP-2를 발현하는 세포에의 항-TROP-2 항체의 결합에 대한 실험 결과를 나타낸다.
도 2는 BxPC3 세포 및 MiaPaCa2 혼합 세포에 대한 ADC의 방관자(bystander) 사멸 활성의 결과를 나타낸다.
도 3은 마우스에서 FaDu 이종이식 종양에 대한 상이한 ADC의 억제 활성을 나타낸다.
도 4는 마우스에서 SKOV3 이종이식 종양에 대한 상이한 용량의 ADC의 억제 활성을 나타낸다.
도 5는 마우스에서 Colo205 이종이식 종양에 대한 상이한 용량의 ADC의 억제 활성을 나타낸다.
상세한 설명
1. 용어
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 또한 본 개시를 구현하거나 시험하는데 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 본원에 기재되어 있다. 본 개시를 설명하고 청구함에 있어서, 하기 용어는 하기의 정의에 따라 사용된다.
본 개시에서 상품명을 사용하는 경우, 이는 상품명 하에서 시판되는 제품의 제형 및 상품명 하에 시판되는 제품의 약물 및 활성 약물 성분을 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 용어는 달리 명시되지 않는 한 하기의 의미를 갖는다.
"약물"이라는 용어는 종양 세포 내에서 정상적인 성장을 방해할 만큼 충분히 강한 화학 분자를 가질 수 있는 세포독성 약물을 의미한다. 세포 독성 약물은 원칙적으로 충분히 높은 농도에서 세포를 죽일 수 있다. 그러나, 특이성 결여로 인해, 세포 독성 약물은 정상 세포의 사멸을 유발하면서 종양 세포를 죽이는 심각한 부작용을 초래할 수 있다. 용어 "세포독성 약물"은 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소와 같은 독소, 방사성 동위원소(예: At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위 원소), 화학 요법 약물, 항생제 및 핵산 분해 효소를 포함한다.
"링커 유닛", "링커", "연결 유닛" 또는 "연결 단편"이라는 용어는 한 말단에서 리간드에 연결되고 다른 말단에서 약물에 연결되고 또한 다른 링커에 연결된 다음 리간드 또는 약물에 연결될 수 있는 화학적 구조적 단편 또는 결합을 의미한다. 링커는 하나 이상의 링커 성분을 포함할 수 있다. 예시적인 링커 성분으로는 6-말레이미도카프로일("MC"), 말레이미도프로피오닐("MP"), 발린-시트룰린("val-cit" 또는 "vc"), 알라닌-페닐알라닌("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐( "PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1 카르복실레이트("SMCC", 본원에서는 "MCC"로도 지칭됨), 및 N-숙신이미딜(4-아이오도-아세틸)아미노벤조에이트("SIAB")가 있다. 링커는 하기의 요소 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다: 익스텐더, 스페이서 및 아미노산 단위. 링커는 US2005-0238649A1호에 기재된 것과 같은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 링커는 세포에서 약물의 방출을 선호하는 "절단 가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커(예를 들어, 히드라존), 프로테아제-민감성(예를 들어, 펩티다제-민감성) 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 이황화물-함유 링커가 사용될 수 있다(Chari 등, Cancer Research 52: 127-131(1992); U.S. Patent No. 5,208,020).
링커 요소로는 하기의 것들이 있으나 이에 제한되지 않는다:
MC = 6-말레이미도카프로일,
Figure pct00015
의 구조를 가짐.
Val-Cit 또는 "vc" = 발린-시트룰린(프로테아제 절단 가능한 링커에서 예시적인 디펩티드),
시트룰린 = 2-아미노-5-우레이도펜탄산,
PAB = p-아미노벤질옥시카르보닐("자기 희생" 링커 요소의 예),
Me-Val-Cit = N-메틸-발린-시트룰린(여기서 링커 펩티드 결합은 카텝신 B에 의해 절단되는 것을 방지하도록 변형됨),
MC(PEG)6-OH = 말레이미도카프로일-폴리에틸렌 글리콜(항체 시스테인에 부착 가능함),
SPP = N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)발레레이트,
SPDP = N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트,
SMCC = 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트,
IT = 이미노티올란.
용어 "리간드-약물 접합체"는 리간드가 연결 유닛에 의해 생물학적 활성 약물에 연결되는 것을 의미하며, "리간드-약물 접합체"는 바람직하게는 "항체-약물 접합체"이다. 본 개시에서 "항체-약물 접합체"(ADC)는 단일클론 항체 또는 항체 단편이 생물학적 활성인 독성 약물에 연결 유닛에 의해 연결되어 있는 것을 의미한다. 항체는 직접적으로 또는 링커를 통해 약물에 접합될 수 있다. n은 각 항체에 접합된 약물 모듈의 평균 수이고, 정수 또는 소수일 수 있으며, 예를 들어 약 0 내지 약 20개의 약물 모듈 범위일 수 있고; 특정 구현예에서는, 1 내지 약 10개의 약물 모듈 범위이고; 및 특정 구현예에서는, 1 내지 약 8개의 약물 모듈 범위, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 약물 모듈 범위일 수 있다. 본 개시의 항체-약물 접합체의 혼합물의 조성물에서, 각 항체의 평균 약물 로딩량은 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 5, 약 1 내지 약 9, 약 7 또는 약 4를 포함하나 이에 제한되지 않는 약 1 내지 약 10이다.
본 개시에서 사용된 아미노산에 대한 3문자 및 1문자 코드는 문헌[ J. biol. chem, 243, p3558 (1968)]에 기재된 바와 같다.
"항체"라는 용어는 사슬간 이황화 결합에 의해 2개의 중쇄와 2개의 경쇄가 연결되어 형성된 테트라펩티드 사슬 구조의 면역글로불린을 의미한다. 면역글로불린의 아미노산 조성 및 중쇄 불변영역의 배열 순서의 차이에 따라 면역글로불린은 면역글로불린의 동형으로 불리우는 5가지 부류, 즉 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 분류할 수 있고, 이들의 중쇄는 각각 μ쇄, δ쇄, γ쇄, α쇄 및 ε쇄이다. 동일한 부류의 Ig는 힌지 영역의 아미노산 조성과 중쇄의 이황화 결합의 수 및 위치의 차이에 따라 상이한 하위 부류로 나눌 수 있으며; 예를 들어, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 나눌 수 있다. 경쇄는 불변 영역의 차이에 따라 κ 또는 λ 쇄로 분류된다. Ig의 5가지 부류 각각은 κ 쇄 또는 λ 쇄를 가질 수 있다.
전장 항체의 중쇄 및 경쇄에서, N-말단 근처의 약 110개 아미노산의 서열은 상당히 다양하므로 가변 영역(Fv 영역)이라고 하며, C-말단 근처의 나머지 아미노산 서열은 상대적으로 안정하므로 불변 영역이라고 한다. 가변 영역은 3개의 초가변 영역(HVR) 및 비교적 보존적인 서열을 갖는 4개의 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 3개의 초가변 영역은 항체의 특이성을 결정하므로 상보성 결정 영역(CDR)으로도 알려져 있다. 각각의 경쇄 가변 영역(LCVR) 또는 중쇄 가변 영역(HCVR)은 아미노 말단에서 카복시 말단까지 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 경쇄의 3개의 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 나타내고, 중쇄의 3개의 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 나타낸다.
"완전 인간화 항체", "완전 인간 항체", "인간 항체" 또는 "완전 인간 항체"라는 용어는 "완전 인간화 모노클로날 항체"로도 알려져 있으며 면역원성과 독성 부작용을 제거하기 위해 인간화 가변 영역 및 불변 영역을 모두 가지고 있다. 완전한 인간 항체 제조를 위한 주요 관련 기술로는 인간 하이브리도마 기술, EBV 형질전환 B 림프구 기술, 파지 디스플레이 기술, 형질전환 마우스 항체 제조 기술, 단일 B 세포 항체 제조 기술 등이 있다.
용어 "항원-결합 단편"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 전장 항체의 단편을 사용하여 항체의 항원 결합 기능을 수행할 수 있다. "항원 결합 단편"에 포함된 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 항체(scFv), 이량체화 V 영역(디아바디), 이황화-안정화된 V 영역(dsFv), 및 CDR을 포함하는 펩티드의 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VH 및 VL 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 단일 도메인 또는 dAb 단편(Ward 등, (1989) Nature 341: 544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR), 또는 (vii) 합성 링커에 의해 선택적으로 연결될 수 있는 2개 이상의 분리된 CDR의 조합이 있다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합을 통해 합성 링커에 의해 연결될 수 있으므로, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일쇄 Fv(scFv)로 지칭됨)를 형성하고 있는 단일 단백질 사슬을 생성할 수 있다(예를 들어 Bird 등.(1988) Science 242:423-426; 및 Huston 등. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883 참조). 이러한 단일쇄 항체는 또한 항체의 "항원 결합 단편"이라는 용어에 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기법을 사용하여 얻어지고, 온전한 항체에 대해 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기술을 사용하거나 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 항체는 상이한 이소타입의 항체, 예를 들어, IgG(예를 들어, 서브타입 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체일 수 있다.
일반적으로 Fab는 IgG 항체 분자에 프로테아제 파피인을 처리(예를 들어, H쇄의 224번 위치의 아미노산 잔기를 절단)하여 얻은 단편 중, 분자량 약 50,000의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 여기서, H 사슬의 N 말단 측에 있는 부분은 이황화 결합에 의해 L 사슬과 결합된다.
일반적으로 F(ab')2는 IgG 힌지 영역의 이황화 결합 아래 부분을 효소 펩신으로 분해하여 얻은 항체 단편이다. 이는 약 100,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 가지며, 힌지 위치에 연결된 2개의 Fab 영역을 포함한다.
일반적으로 Fab'는 전술한 F(ab')2의 힌지 영역에서 이황화 결합을 절단하여 얻어지는 분자량 약 50,000 및 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
또한, Fab' 단편을 암호화하는 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 Fab'를 발현시킴으로써 Fab'를 생산할 수 있다.
용어 "단일쇄 항체", "단일쇄 Fv" 또는 "scFv"는 링커에 의해 연결된 항체 중쇄 가변 도메인(또는 VH) 및 항체 경쇄 가변 도메인(또는 VL)을 포함하는 분자를 의미한다. 이러한 scFv 분자는 NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH의 일반 구조를 가질 수 있다. 선행 기술에서 적합한 링커는 반복된 GGGGS 아미노산 서열 또는 이의 변이체, 예를 들어 1 내지 4개의 반복된 변이체로 구성된다(Holliger 등. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). 본 개시에서 사용될 수 있는 다른 링커는 문헌[Alfthan 등. (1995), Protein Eng. 8:725-731; Choi 등. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106; Hu 등. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56; 및 Roovers 등. (2001), Cancer Immunol.]에 기재되어 있다.
용어 "CDR"은 항원 결합에 주로 기여하는 항체의 가변 도메인 내의 6개의 초가변 영역 중 하나를 의미한다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에는 3개의 CDR(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3)이 있고 각각의 경쇄 가변 영역에는 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)이 있다. CDR의 아미노산 서열 경계는 "Kabat" 넘버링 방식(참조 Kabat 등. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD), "Chothia" 넘버링 방식(참조 Al-Lazikani 등. (1997) JMB 273: 927-948) 및 ImMunoGenTics (IMGT) 넘버링 방식(참조 Lefranc M.P., Immunologist, 7, 132-136(1999); Lefranc, M.P. 등, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77(2003), 등)을 비롯한 다양한 잘 알려진 방식을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 고전적인 형식의 경우, Kabat 방식에 따르면, 중쇄 가변 도메인(VH)의 CDR 아미노산 잔기는 31-35(HCDR1), 50-65(HCDR2) 및 95-102(HCDR3)로 넘버링되고; 경쇄 가변 도메인(VL)의 CDR 아미노산 잔기는 24-34(LCDR1), 50-56(LCDR2) 및 89-97(LCDR 3)로 넘버링된다. Chothia 방식에 따르면, VH의 CDR 아미노산은 26-32(HCDR1), 52-56(HCDR2) 및 95-102(HCDR3)로 넘버링되고, VL의 아미노산 잔기는 26-32(LCDR1), 50-52(LCDR2) 및 91-96(LCDR3)으로 넘버링된다. Kabat 방식과 Chothia 방식을 모두 결합하여 CDR 정의에 따르면, CDR은 인간 VH 및 아미노산 잔기 26-35(HCDR1), 50-65(HCDR2) 및 95-102(HCDR3) 및 인간 VL에서 아미노산 잔기 24-34(LCDR1), 50-56(LCDR2) 및 89-97(LCDR3)로 구성된다. IMGT 방식에 따르면, VH의 CDR 아미노산 잔기는 26-35(CDR1), 51-57(CDR2) 및 93-102(CDR3)로 대략적으로 넘버링되고, VL의 CDR 아미노산 잔기는 27-32(CDR1), 50-52(CDR2) 및 89-97(CDR3)로 대략적으로 넘버링된다. IMGT 방식에 따르면, 항체의 CDR은 IMGT/DomainGap Align 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다.
"프레임워크 영역"이라는 용어는 가변 도메인의 항원 결합 루프(CDR)에 대한 프레임워크 역할을 하는 가변 도메인 VL 또는 VH의 일부를 의미한다. 이는 본질적으로 CDR이 없는 가변 도메인이다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 면역글로불린 또는 항체가 결합하는 항원 상의 부위를 의미한다. 에피토프는 일반적으로 독특한 공간 구조에서 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 연속 또는 비연속 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology, volume 66, G.E.Morris, Ed. (1996)]을 참조한다.
용어 "특이적 결합", "선택적 결합", "선택적으로 결합하는" 및 "특이적으로 결합하는"은 미리 결정된 항원 상의 에피토프에 대한 항체 또는 이의 단편의 결합을 의미한다. 일반적으로, 항체 또는 이의 단편은 약 10-7 M 미만, 예를 들어, 약 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 또는 10-10 M 이하의 친화도(KD)로 결합한다.
용어 "KD"는 항체-항원 상호작용에 대한 해리 평형 상수를 의미한다. 일반적으로, 본 개시의 항체 또는 항원-결합 단편은 약 10-7 M 미만, 예를 들어, 약 10-8 M 미만 또는 10-9 M 미만의 해리 평형 상수(KD)로 TROP-2 또는 이의 에피토프에 결합한다. 예를 들어, KD 값은 세포 표면 항원에 대한 본 개시의 항체의 친화도에 대해 FACS 방법을 사용하여 결정된다.
용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 또는 RNA 분자를 의미한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다. 핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동 가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
아미노산 서열 "동일성"은 제1 서열 및 제2 서열이 공유하는 아미노산 잔기의 백분율을 말하며, 여기서 아미노산 서열을 정렬할 때 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 필요한 경우 갭이 도입되고, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위해, 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 정렬된 서열의 전체 길이의 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기에 적합한 매개변수를 결정할 수 있다.
용어 "발현 벡터"는 이것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 일 구현예에서, 벡터는 추가 DNA 단편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 다른 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있다. 본원에 개시된 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있거나(예를 들어, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터) 또는 숙주 세포에 도입된 후 숙주 세포의 게놈과 통합됨으로써 숙주 게놈(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)을 이용하여 복제할 수 있다.
항체 및 항원 결합 단편을 생산하고 정제하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press]의 5 내지 8 및 15장(chapter)에 설명되어 있다. 본 발명에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 비-인간 CDR에서 하나 이상의 추가의 인간 FR을 함유하도록 유전적으로 조작된다. 인간 FR 생식계열 서열은 ImMunoGeneTics(IMGT)의 웹사이트 또는 면역글로불린 저널인 문헌[Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, 2001ISBN012441351]로부터, MOE 소프트웨어와 IMGT 인간 항체 가변 영역 생식계열 유전자 데이터베이스를 비교하여 얻을 수 있다.
용어 "숙주 세포"는 발현 벡터가 도입된 세포를 의미한다. 숙주 세포는 미생물(예를 들어, 박테리아), 식물 또는 동물 세포를 포함할 수 있다. 형질전환에 민감한 박테리아로는 대장균 또는 살모넬라 균주와 같은 장내세균과의 구성원; 바실러스 서브틸리스와 같은 바실러스과의 구성원; 폐렴구균; 연쇄상 구균 및 헤모필루스 인플루엔자가 있다. 적합한 미생물로는 사카로마이세스 세레비지애 및 피치아 파스토리스가 있다. 적합한 동물 숙주 세포주로는 CHO(중국 햄스터 난소 세포주) 및 NS0 세포가 있다.
본 개시의 조작된 항체 또는 항원-결합 단편은 통상적인 방법을 사용하여 제조 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA 서열은 발현 벡터로 클로닝 및 재조합될 수 있다. 재조합 면역글로불린 발현 벡터는 숙주 세포 내로 안정적으로 형질감염될 수 있다. 보다 권장되는 선행 기술로서, 포유동물 발현 시스템은 특히 Fc 영역의 N-말단 부위에서 항체의 글리코실화를 초래할 것이다. 양성 클론은 항체를 생산하기 위해 생물 반응기의 배지에서 증식된다. 분비된 항체가 있는 배양물은 예를 들어 A 또는 G 세파로스 FF 컬럼을 사용하여 통상적인 기법을 사용하여 정제될 수 있다. 비특이적으로 결합된 분획은 세척 제거된다. 결합된 항체는 pH 구배법을 사용하여 용출되고, 항체 단편은 SDS-PAGE를 사용하여 검출되고 수집된다. 항체는 통상적인 방법을 사용하여 여과 및 농축될 수 있다. 가용성 혼합물과 중합체는 분자체 및 이온 교환과 같은 기존 방법을 사용하여 제거할 수도 있다. 얻어지는 생성물은 예를 들어 -70℃에서 즉시 동결되거나 동결 건조될 필요가 있다.
용어 "펩티드"는 2개 이상의 아미노산 분자가 펩티드 결합으로 연결되어 형성된 분자를 말하며, 단백질의 구조적 및 기능적 단편이다.
용어 "알킬"은 1 내지 20개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 기, 바람직하게는 1 내지 12개(예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12) 탄소 원자, 보다 바람직하게는 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 알킬, 가장 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유(1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자 함유)하는 알킬을 의미한다. 비제한적인 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, sec-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 2,2-디메틸프로필, 1-에틸프로필, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, n-헥실, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2-에틸부틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 2,3-디메틸부틸, n-헵틸, 2-메틸헥실, 3-메틸헥실, 4-메틸헥실, 5-메틸헥실, 2,3-디메틸펜틸, 2,4-디메틸펜틸, 2,2-디메틸펜틸, 3,3-디메틸펜틸, 2-에틸펜틸, 3-에틸펜틸, n-옥틸, 2,3-디메틸헥실, 2,4-디메틸헥실, 2,5-디메틸헥실, 2,2-디메틸헥실, 3,3-디메틸헥실, 4,4-디메틸헥실, 2-에틸헥실, 3- 에틸헥실, 4-에틸헥실, 2-메틸-2-에틸펜틸, 2-메틸-3-에틸펜틸, n-노닐, 2-메틸-2-에틸헥실, 2-메틸-3-에틸헥실, 2,2-디에틸펜틸, n-데실, 3,3-디에틸헥실, 2,2-디에틸헥실, 및 이들의 다양한 측쇄 이성질체 등이 있다. 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알킬이 보다 바람직하고, 비제한적인 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, sec-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 2,2-디메틸프로필, 1-에틸프로필, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, n-헥실, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2-에틸부틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 2,3-디메틸부틸 등이 있다. 알킬은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 치환되는 경우, 치환기는 임의의 이용 가능한 연결 부위에서 치환될 수 있으며, 여기서 치환기는 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 할로겐, 머캅토, 히드록시, 니트로, 시아노, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알콕시, 헤테로시클로알콕시, 시클로알킬티오, 헤테로시클로알킬티오 및 옥소로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 기 중 하나 이상이다.
용어 "헤테로알킬"은 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 알킬을 의미하며, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같다.
용어 "알킬렌"은 동일한 탄소 원자 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자를 제거함으로써 모 알칸으로부터 유도된 2개의 잔기를 갖는 포화 선형 또는 분지형 지방족 탄화수소 기를 지칭한다. 이는 1 내지 20개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 기, 바람직하게는 1 내지 12개(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)의 탄소 원자를 함유하는 알킬렌, 보다 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유(1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자를 함유)를 함유하는 알킬렌이다. 알킬렌의 비제한적 예로는 메틸렌(-CH2-), 1,1-에틸리덴(-CH(CH3)-), 1,2-에틸리덴(-CH2CH2)-, 1,1-프로필리덴(-CH(CH2CH3)-), 1,2-프로필리덴(-CH2CH(CH3)-), 1,3-프로필리덴(-CH2CH2CH2-), 1,4-부틸리덴(-CH2CH2CH2CH2-), 1,5- 부틸리덴(-CH2CH2CH2CH2CH2-)등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 알킬렌은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 치환되는 경우, 치환기는 임의의 이용 가능한 연결 부위에서 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 할로겐, 메르캅토, 히드록시, 니트로, 시아노, 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알콕시, 헤테로시클로알콕시, 시클로알킬티오, 헤테로시클로알킬티오 및 옥소로 이루어진 군으로부터 바람직하게는 독립적으로 선택적으로 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다.
용어 "알콕시"는 -O-(알킬) 및 -O-(비치환된 시클로알킬)을 의미내며, 여기서 알킬 또는 시클로알킬은 상기 정의된 바와 같다. 알콕시의 비제한적인 예로는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 시클로프로필옥시, 시클로부톡시, 시클로펜틸옥시 및 시클로헥실옥시가 있다. 알콕시는 선택적으로 치환되거나 비치환될 수 있고, 치환되는 경우, 치환기는 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 할로겐, 메르캅토, 히드록시, 니트로, 시아노, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알콕시, 헤테로시클로알콕시, 시클로알킬티오 및 헤테로시클로알킬티오로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 기 중 하나 이상이다.
용어 "할로알킬"은 수소가 하나 이상의 할로겐으로 치환되어 있는 알킬 기를 의미하며, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같다.
용어 "중수소화 알킬"은 수소가 하나 이상의 중수소 원자로 치환되어 있는 알킬 기를 의미하며, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같다.
용어 "히드록시알킬"은 수소가 하나 이상의 히드록시기로 치환되어 있는 알킬 기를 의미하며, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같다.
용어 "히드록시"는 -OH 기를 의미한다.
용어 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 의미한다.
용어 "아미노"는 -NH2를 의미한다.
용어 "니트로"는-NO2를 의미한다.
용어 "시아노"는 -CN를 의미한다.
또한, 본 개시는 화학식 (Pc-L-Y-D)의 화합물의 다양한 중수소화된 형태를 포함한다. 탄소 원자에 연결된 각각의 이용 가능한 수소 원자는 독립적으로 중수소 원자로 치환될 수 있다. 당업자는 관련 문헌을 참조하여 화학식 (Pc-L-Y-D)의 화합물의 중수소화 형태를 합성할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 중수소화 출발 물질은 화학식 (Pc-L-Y-D)의 중수소화 형태를 제조하는 데 사용될 수 있거나, 또는 이들은 중수소화 보란, 테트라히드로푸란 중 삼중수소화 보란, 중수소화 리튬 알루미늄 하이드라이드, 중수소화 요오도에탄, 중수소화 요오도메탄 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 중수소화 시약과 함께 통상적인 기법을 사용하여 합성될 수 있다.
용어 "선택적" 또는 "선택적으로"는 이후에 설명되는 이벤트 또는 상황이 발생할 수 있지만 반드시 그런 것은 아닌 것을 의미하고 그 설명이 이벤트 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않는 경우를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, "알킬로 선택적으로 치환된 헤테로시클릴기"는 알킬이 존재할 수 있지만 반드시 그런 것은 아니며, 그 설명은 헤테로시클릴기가 알킬로 치환되거나 치환되지 않은 경우를 포함함을 의미한다.
용어 "치환된"은 기 내의 1개 이상, 바람직하게는 5개 이하, 더욱 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 수소 원자가 치환기로 독립적으로 치환됨을 의미한다. 치환기는 그의 가능한 화학적 위치에만 있고, 당업자는 과도한 노력 없이 가능한 또는 불가능한 치환을 (실험적으로 또는 이론적으로) 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 자유 수소를 갖는 아미노 또는 히드록시가 불포화(예를 들어, 올레핀) 결합을 갖는 탄소 원자에 결합되는 경우 불안정할 수 있다.
용어 "약학적 조성물"은 본원에 기재된 하나 이상의 화합물 또는 이의 생리학적/약학적으로 허용되는 염 또는 전구약물, 및 기타 화학 성분, 예를 들어 생리학적/약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 함유하는 혼합물을 의미한다. 약학 조성물의 목적은 유기체에의 투여를 촉진하여 활성 성분의 흡수를 촉진함으로써 생물학적 활성을 발휘하는 것이다.
용어 "약학적으로 허용되는 염"은 본 개시의 항체-약물 접합체의 염을 의미한다. 이러한 염은 대상체에서 사용될 때 안전하고 효과적이며 필요한 생물학적 활성을 갖는다. 본 발명의 리간드 약물 접합체는 적어도 하나의 아미노기를 포함하고 산에 의해 염을 형성할 수 있다. 약학적으로 허용되는 염의 비제한적인 예로는 염산염, 브롬화수소산염, 수소요오드산염, 황산염, 중황산염, 시트르산염, 아세트산염, 숙신산염, 아스코르브산염, 옥살산염, 질산염, 소르베이트, 인산수소산염, 인산이수소산염, 살리실산염, 시트르산염, 타르트레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 포르메이트를 포함합니다. 벤조에이트, 메실레이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트 및 p-톨루엔설포네이트가 있다.
용어 "약물 로딩량" 또는 "평균 약물 로딩량"은 리간드-약물 접합체에서 리간드당 로딩된 세포독성 약물의 평균 수를 의미하며, 약물 대 항체 비율로도 나타낼 수 있다. 약물 로딩량은 리간드(Pc)당 세포독성 약물 0 내지 12 개, 바람직하게는 1 내지 10 개의 범위일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약물 로딩량은 n으로 표시되며, 이는 DAR(drug-antibody ratio) 값이라고도 하며, 예시적인 값은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 평균일 수 있다. 커플링 반응 후 ADC 분자당 평균 약물 수는 UV/가시광선 분광법, 질량 분광법, ELISA 분석 및 HPLC와 같은 통상의 방법으로 특성화할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 세포독성 약물은 링커 유닛에 의해 항체의 머캅토기에 접합된다.
리간드-약물 접합체의 로딩은 하기를 포함하는 비제한적인 방법에 의해 조절될 수 있다:
(1) 모노클로날 항체에 대한 연결 시약의 몰비를 조절,
(2) 반응 시간 및 온도를 조절, 및
(3) 상이한 시약을 선택.
통상적인 약학 조성물의 제조에 대해서는 중국 약전을 참조한다.
본 개시의 약물에 대한 "담체"라는 용어는 약물이 인체에 들어가는 방식 및 인체 내 약물의 분포를 변경하고, 약물의 방출 속도를 조절하고, 표적 기관에 약물을 전달하는 시스템을 의미한다. 약물 담체 방출 및 표적 시스템은 약물 분해 및 손실을 줄이고 부작용을 줄이며 생체 이용률을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 담체로 사용할 수 있는 고분자 계면활성제는 고유한 양친매성 구조로 인해 자가 조립되어, 바람직한 예로서 미셀, 마이크로에멀젼, 겔, 액정 및 소포와 같은 다양한 형태의 응집체를 형성할 수 있다. 응집체는 약물 분자를 캡슐화하는 능력이 있고 막에 대한 투과성이 우수하여 우수한 약물 담체로 사용될 수 있다.
용어 "부형제"라는 용어는 약학 조성물에 주약(main drug) 외에 첨가되는 것을 말한다. 보조제라고도 할 수 있다. 예를 들어, 결합제, 충전제, 붕해제, 정제의 윤활제; 반고체 연고 및 크림 제제의 기재(base) 부분; 방부제, 항산화제, 교미제, 방향제, 공용매, 유화제, 가용화제, 등장성 조절제, 착색제 등은 모두 부형제로 지칭될 수 있다.
충전제라고도 하는 "희석제"라는 용어는 주로 정제의 중량과 부피를 증가시키는 데 사용된다. 희석제의 첨가는 일정한 부피를 확보할 뿐만 아니라 주성분의 투여량 편차를 감소시키고 약물의 압축 성형성 등을 향상시킨다. 정제 형태의 약물이 유성 성분을 포함하는 경우, "건조" 상태를 유지하여 정제의 제조를 용이하게 하도록 유성 성분을 흡수하기 위해 반드시 흡수제를 첨가해야 한다. 예로는 전분, 락토스, 칼슘의 무기 염, 미정질 셀룰로오스 등이 있다.
약학적 조성물은 멸균 주사 가능한 수용액의 형태일 수 있다. 사용 가능하고 허용되는 비히클 또는 용매로는 물, 링커 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 멸균 주사용 제형은 활성 성분이 오일 상에 용해되어 있는 멸균 주사용 수중유형 마이크로에멀젼일 수 있다. 예를 들어, 유효 성분은 대두유와 레시틴의 혼합물에 용해된다. 그런 다음 오일 용액을 물과 글리세롤의 혼합물에 첨가하고 처리하여 마이크로에멀젼을 형성한다. 주사제 또는 마이크로에멀젼은 대상체의 혈류에 대량으로 국부적으로 주사될 수 있다. 대안적으로, 본원에 개시된 화합물의 일정한 순환 농도를 유지하는 방식으로 용액 및 마이크로에멀젼을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 일정한 농도를 유지하기 위해 연속 정맥 전달 장치를 사용할 수 있다. 이러한 장치의 일 예는 Deltec CADD-PLUS. TM. 5400 정맥내 주사 펌프이다.
약학적 조성물은 근육내 및 피하 투여를 위한 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있다. 현탁액은 상기 언급된 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 선행 기술에 따라 제조될 수 있다. 또한, 멸균 주사용 제제는 비경구적으로 허용되는 무독성 희석제 또는 용매, 예를 들어 1,3-부탄디올에서 제조된 용액에서 제조된 멸균 주사액 또는 현탁액일 수 있다. 또한, 멸균 고정 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로 사용될 수 있다. 이를 위해, 합성 모노글리세리드 또는 디글리세리드를 포함한 모든 혼합 고정 오일을 사용할 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산도 주사제 제조에 사용될 수 있다.
2. 합성 방법
합성 목적을 위해, 다음과 같은 합성 기술 체계가 채택된다.
화학식 (Pc-La-Y-D)의 화합물의 제조 방법은 환원된 Pc 및 화학식 (La-Y-D)를 커플링 반응시켜서 화학식 (Pc-La-Y-D)의 화합물을 얻는 단계를 포함하고, 여기서 환원제는 TCEP인 것이 바람직하고; 특히 항체 내의 이황화물 결합이 환원되는 것이 바람직하다:
Figure pct00016
상기 식에서, Pc, W, L2, L3, R1, R2, R5, R6, R7, m 및 n은 상기 언급된 화학식 (Pc-La-Y-D)에서 정의된 바와 같다.
본 개시의 하나 이상의 구현예는 상기 명세서에 상세히 설명되어 있다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 재료가 또한 본 개시를 구현하거나 시험하는데 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료는 하기에 기재되어 있다. 본 개시의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다. 본 명세서 및 청구범위에서, 문맥상 명백하게 달리 명시되지 않는 한 단수형은 복수형을 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 명세서에 인용된 모든 특허 및 간행물은 참조로 포함된다. 하기 실시예는 본 개시의 바람직한 구현예를 보다 완전하게 예시하기 위해 제시된다. 이들 실시예는 청구범위에 의해 정의된 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 어떤 식으로든 해석되어서는 안된다.
실시예
하기 실시예 및 시험예에서 제시하는 특정 조건이 없는 실험 절차는 일반적으로 통상적인 조건에 따라 수행되거나, 출발 물질 또는 시판 제품의 제조사에서 권장하는 조건에 따라 수행된다. 문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; CurrentProtocols in Molecular Biology, Ausubel 등, Greene Publishing Association, Wiley Interscience, NY]을 참조한다. 특정 출처가 표시되지 않은 시약은 시중에서 구입할 수 있는 통상의 시약이다.
1. 항체의 제조
실시예 1-1. TROP-2 발현이 높은 세포 균주의 구축
pCDH-hTROP-2 렌티바이러스 발현 벡터 플라스미드, pVSV-G 및 pCMV-dR8.91 렌티바이러스 시스템 패키징 벡터를 Lipofectamine 3000 형질감염 시약을 사용하여 바이러스 패키징 세포 293T 내로 형질감염시켰다. 바이러스를 포함하는 배지 상층액을 수집하고, 여과하고, 초고속으로 원심분리하였다. 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO-K1을 농축된 바이러스로 감염시킨 후, 2 내지 3주 동안 퓨로마이신을 사용하여 스크리닝한 후, FACS 단일 세포 분류를 수행하였다.
FACS로 측정한 렌티바이러스에 감염된 CHO-K1 세포 표면의 TROP-2 발현 수준에 따라, TROP-2 발현이 높은 CHO-K1/hTROP-2 단일클론 세포주를 선별하였다.
TROP-2(Genbank: NP_002344.2)의 아미노산 서열은 다음과 같다.
MARGPGLAPPPLRLPLLLLVLAAVTGHTAAQDNCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSKCLLLKARMSAPKNARTLVRPSEHALVDNDGLYDPDCDPEGRFKARQCNQTSVCWCVNSVGVRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILIDLRHRPTAGAFNHSDLDAELRRLFRERYRLHPKFVAAVHYEQPTIQIELRQNTSQKAAGDVDIGDAAYYFERDIKGESLFQGRGGLDLRVRGEPLQVERTLIYYLDEIPPKFSMKRLTAGLIAVIVVVVVALVAGMAVLVITNRRKSGKYKKVEIKELGELRKEPSL(서열 번호 1)
Trop2-His의 아미노산 서열:
MARGPGLAPPPLRLPLLLLVLAAVTGHTAAQDNCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSKCLLLKARMSAPKNARTLVRPSEHALVDNDGLYDPDCDPEGRFKARQCNQTSVCWCVNSVGVRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILIDLRHRPTAGAFNHSDLDAELRRLFRERYRLHPKFVAAVHYEQPTIQIELRQNTSQKAAGDVDIGDAAYYFERDIKGESLFQGRGGLDLRVRGEPLQVERTLIYYLDEIPPKFSMKRLTAGLIAVIVVVVVALVAGMAVLVITNRRKSGKYKKVEIKELGELRKEPSLHHHHHH(서열번호 2)
실시예 1-2. 항인간 TROP-2 단클론항체의 제조
본 출원에서 항인간 TROP-2 단일클론항체는 WO03074566호에 기재된 방법에 따라 제조하였으며, 컴퓨터 소프트웨어를 이용하고 hRS7의 항체 가변영역 유전자를 주형으로 하여 CDR에 대한 부위 돌연변이 변형 설계를 수행하였다. 항체 가변영역 유전자를 분자 클로닝을 통해 단백질 발현 벡터 Phr-IgG(시그날 펩티드 및 불변영역 유전자(CH1-Fc/CL) 단편 포함)에 삽입한 후, HEK293 및 Expi-CHO-S 세포에서 발현시켰다. 항체 정제는 통상적인 방법에 따라 수행하였다. 활성 검증은 huTROP-2 단백질을 과발현하는 CHO-K1 세포 및 huTROP-2 단백질(His27-Thr274 기탁 번호: NP_002344.2)을 이용하여 수행하였으며, 보다 우수한 표적 결합 활성을 갖는 항체를 선별하였다. 이때, PD3의 가변 영역 서열은 다음과 같다:
PD3의 중쇄 가변 영역:
EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTQDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGGFGSSYWYFDVWGQGTLVTVSS(서열 번호 3)
PD3의 경쇄 가변 영역:
DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIK(서열 번호 4)
주: 밑줄 친 부분은 Kabat 넘버링 방식에 따라 결정된 CDR이다.
Figure pct00017
항체의 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG4 및 이들의 변이체의 불변 영역으로부터 선택될 수 있고, 항체의 경쇄 불변 영역은 인간 κ 및 λ 쇄 및 이들의 변이체의 경쇄 불변 영역으로부터 선택될 수 있다. 예시적으로, 항체의 중쇄 불변 영역은 서열 번호 11에 기재된 서열을 갖는 인간 IgG1의 불변 영역으로부터 선택되고, 항체의 경쇄 불변 영역은 서열 번호 12에 기재된 서열을 갖는 인간 κ 쇄의 불변 영역으로부터 선택된다.
인간 IgG1의 중쇄 불변 영역:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 11)
인간화 κ 경쇄 불변 영역:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 12)
예시적으로, 상기 기재된 경쇄/중쇄 불변 영역은 상기 언급된 PD3 항체의 가변 영역과 조합되어 하기와 같은 경쇄/중쇄 서열을 갖는 완전한 항체를 형성한다:
PD3의 중쇄:
EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTQDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGGFGSSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 13)
PD3의 경쇄:
DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 14)
본 개시에서 사용된 대조 분자 hRS7은 특허 WO03074566호를 참조하여 구축되고 TINA 항체는 특허 WO2015098099a1호를 참조하여 구축되며, 이의 서열은 다음과 같다:
hRS7의 중쇄:
QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 15)
hRS7의 경쇄:
DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 16)
TINA의 중쇄:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVRQAPGQGLEWMGWINTHSGVPKYAEDFKGRVTISADTSTSTAYLQLSSLKSEDTAVYYCARSGFGSSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 17)
TINA의 경쇄:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 18)
2. 화합물의 제조
본 발명의 실시예에 명시된 조건이 없는 실험 절차는 일반적으로 통상적인 조건에 따라 수행되거나, 출발 물질 또는 시판 제품의 제조사에서 권장하는 조건에 따라 수행된다. 특정 출처가 표시되지 않은 시약은 시중에서 구입할 수 있는 통상의 시약이다.
화합물의 구조는 핵 자기 공명(NMR) 또는 질량 분석(MS)에 의해 결정되었다. NMR 스펙트럼은 중수소화 디메틸 설폭사이드(DMSO-d6), 중수소화 클로로포름(CDCl3) 및 중수소화 메탄올(CD3OD)을 측정 용매로 사용하고 테트라메틸실란(TMS)을 내부 표준으로 사용하여 Bruker AVANCE-400 핵 자기 공명 기기를 사용하여 측정하였다. 화학적 이동은 10-6(ppm) 단위로 표시된다.
MS 분석은 FINNIGAN LCQAd(ESI) 질량분석기(제조사: Thermo사, 모델: Finnigan LCQ Advantage MAX)를 이용하여 수행하였다.
UPLC 분석은 Waters Acquity UPLC SQD 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템을 사용하여 수행하였다.
HPLC 분석은 Agilent 1200DAD 고압 액체 크로마토그래피(Sunfire C18 150 A 4.6 mm 크로마토그래피 컬럼) 및 Waters 2695-2996 고압 액체 크로마토그래피(Gimini C18 150 A 4.6 mm 크로마토그래피 컬럼)를 사용하여 수행하였다.
UV-HPLC 분석은 Thermo nanodrop2000 자외선 분광 광도계를 사용하여 수행하였다.
증식 억제율 및 IC50 값은 PHERA starFS 마이크로플레이트 리더(BMG사, 독일)를 사용하여 측정하였다.
0.15mm 내지 0.2mm 사양의 Huanghai HSGF254 또는 Qingdao GF254 실리카 겔 플레이트는 박막 크로마토그래피(TLC) 분석에 사용하였고 0.4mm 내지 0.5mm는 TLC 분리 및 정제에 사용하였다.
200 내지 300 메쉬의 Yantai Yellow Sea 실리카겔은 일반적으로 컬럼 크로마토그래피에서 담체로 사용된다.
본 개시의 공지된 출발 물질은 당업계에 공지된 방법을 사용하거나 그에 따라 합성될 수 있거나, ABCR GmbH & Co.KG사, Acros Organnics사, Aldrich Chemical Company시, Accela ChemBio Inc시, Chembee Chemicals사 등에서 구입할 수 있다.
실시예에서, 반응은 특별한 언급이 없는 한 아르곤 분위기 또는 질소 분위기에서 수행하였다.
아르곤 분위기 또는 질소 분위기는 반응 플라스크가 약 1L의 아르곤 또는 질소를 포함하는 풍선에 연결되어 있음을 의미한다.
수소 분위기는 반응 플라스크가 약 1L의 수소를 포함하는 풍선에 연결되어 있음을 의미한다.
Parr 3916EKX 수소화 장치, Qinglan QL-500 수소화 장치 또는 HC2-SS 수소화 장치를 가압 수소화 반응에 사용하였다.
수소화 반응은 일반적으로 진공화 및 수소 퍼지의 3 사이클을 포함한다.
마이크로파 반응에는 CEM Discover-S 908860 마이크로파 반응기를 사용하였다.
실시예에서, 반응 용액은 특별한 언급이 없는 한 수용액을 의미한다.
실시예에서, 반응 온도는 특별한 언급이 없는 한 실온이다.
실온은 최적의 반응 온도로 20℃ 내지 30℃의 범위이다.
실시예에서 pH 6.5의 PBS 완충액의 제조: 8.5g의 KH2PO4, 8.56g의 K2HPO4.3H2O, 5.85g의 NaCl 및 1.5g의 EDTA를 플라스크에 첨가하고, 부피를 2L로 만들었다. 첨가물은 모두 초음파로 녹이고 용액을 흔들어서 잘 섞어 원하는 완충액을 얻었다.
화합물 정제에 사용되는 컬럼 크로마토그래피의 용리액계(eluent system) 및 박층 크로마토그래피용 전개 용매계는 A: 디클로로메탄 및 이소프로판올계, B: 디클로로메탄 및 메탄올계, C: 석유 에테르 및 에틸 아세테이트계를 포함한다. 용매의 부피비는 화합물의 극성에 따라 조절하거나 소량의 트리에틸아민 및 산성 또는 염기성 시약을 첨가하여 조절하였다.
본 개시의 몇몇 화합물은 Q-TOF LC/MS에 의해 특성 분석된다. Q-TOF LC/MS 분석은 Agilent 6530 정확-질량 사중극자 비행 시간 질량 분석기 및 Agilent 1290-Infinity 초고성능 액체 크로마토그래피(Agilent Poroshell 300SB-C8 5 μm, 2.1 x 75 mm 크로마토그래피 컬럼)를 사용하여 수행했다.
본 개시의 항체-약물 접합체의 Y-D 약물 부분은 PCT/CN2019/107873호에서 확인되며, 관련 화합물의 합성 및 시험은 본원에 참조로 포함된다. 합성의 비제한적인 예는 다음과 같이 참조로 포함된다:
실시예 2-1
N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-1-히드록시시클로프로판-1-카르복사미드 1
Figure pct00018
Figure pct00019
엑사테칸 메실레이트 1b(2.0 mg, 3.76 μmol, 특허 출원 "EP0737686A1"호에 개시된 바와 같이 제조됨)에 1 mL의 N,N-디메틸포름아미드를 첨가하였다. 혼합물을 빙수욕에서 0 내지 5℃로 냉각시키고, 트리에틸아민 한 방울을 첨가하였다. 혼합물을 빙수욕에서 0 내지 5℃로 냉각시키고, 트리에틸아민 한 방울을 첨가하였다. 반응물을 투명해질 때까지 교반하였다. 반응 혼합물에 1-히드록시시클로프로필카르복실산 1a(1.4 mg, 3.7 μmol, 공지된 방법 "Tetrahedron Letters, 25(12), 1269-72; 1984"를 사용하여 제조됨) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드 (3.8 mg, 13.7 μmol)를 연속적으로 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 0 내지 5℃에서 2시간 동안 교반하고, 5mL의 물로 켄칭하고, 에틸 아세테이트(8mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 합하고, 포화 염화나트륨 용액(5 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 얻어지는 잔류물을 전개 용매계 B를 이용한 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 1(1.6 mg, 82.1% 수율)을 얻었다.
MS m/z (ESI): 520.2 [M+1].
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.90-7.84 (m, 1H), 7.80-7.68(m, 1H), 5.80-5.70 (m, 1H), 5.62-5.54(m, 2H), 5.44-5.32 (m, 2H), 5.28-5.10(m, 2H), 3.40-3.15 (m, 3H), 2.44 (s, 3H), 2.23(t, 1H), 2.06-1.75 (m, 2H), 1.68-1.56 (m, 1H), 1.22-1.18 (m, 2H), 1.04-0.98 (m, 2H), 0.89 (t, 3H).
실시예 2-2
(S)-2-시클로프로필-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-2-히드록시아세트아미드 2-A
(R)-2-시클로프로필-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-2-히드록시아세트아미드 2-B
Figure pct00020
Figure pct00021
1b(4 mg, 7.53 μmol)에 2 mL의 에탄올 및 0.4 mL의 N,N-디메틸포름아미드를 첨가하였다. 그 계를 아르곤으로 3회 퍼징하고, 혼합물을 빙수욕에서 0 내지 5℃로 냉각시킨 다음, 0.3mL의 N-메틸모르폴린을 적가하였다. 반응 혼합물을 투명해질 때까지 교반하였다. 반응 혼합물에 2-시클로프로필-2-하이드록시아세트산 2a(2.3 mg, 19.8 μmol, 특허 출원 "WO2013106717"호에 개시된 바와 같이 제조됨), 1-하이드록시벤조트리아졸(3 mg, 22.4 μmol) 및 1-(3- 디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(4.3 mg, 22.4 μmol)을 연속적으로 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 0 내지 5℃에서 1시간 동안 교반하였다. 빙수욕을 제거하고, 반응 혼합물을 30℃로 가열하고, 2시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축시켰다. 얻어지는 미정제 화합물 2를 고성능 액체 크로마토그래피(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: XBridge Prep C18 OBD 5 μm 19 × 250 mm; 이동상: A-물(NH4OAc 10 mmol), B-아세토니트릴, 구배 용리, 유속: 18 mL/분)에 의해 정제하고, 상응하는 분획을 수집하고 감압 하에 농축하여 표제 생성물(2-A: 1.5 mg, 2-B: 1.5 mg)을 얻었다.
MS m/z (ESI): 534.0 [M+1].
단일 구조(single-configuration) 화합물 2-B(더 짧은 머무름 시간)
UPLC 분석: 머무름 시간: 1.06분; 순도: 88%(크로마트그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1 Х 50 mm; 이동상: A-물(5 mmol의 NH4OAc), B-아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.37 (d, 1H), 7.76 (d, 1H), 7.30 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 5.58-5.56 (m, 1H), 5.48 (d, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.32-5.29 (m, 2H), 3.60 (t, 1H), 3.19-3.13 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 2.20-2.14 (m, 1H), 1.98 (q, 2H), 1.87-1.83 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 1.34-1.28 (m, 1H), 0.86 (t, 3H), 0.50-0.39 (m, 4H).
단일 구조 화합물 2-A (더 긴 머무름 시간)
UPLC 분석: 머무름 시간: 1.10 분; 순도: 86%(크로마트그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1 Х 50 mm; 이동상: A-물(5 mmol의 NH4OAc), B-아세토니트릴).
\1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.35 (d, 1H), 7.78 (d, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 5.58-5.53 (m, 1H), 5.42 (s, 2H), 5.37 (d, 1H), 5.32 (t, 1H), 3.62 (t, 1H), 3.20-3.15 (m, 2H), 2.40 (s, 3H), 2.25-2.16 (m, 1H), 1.98 (q, 2H), 1.87-1.82 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 1.21-1.14 (m, 1H), 0.87 (t, 3H), 0.47-0.35 (m, 4H).
실시예 2-3
(S)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-3,3,3-트리플루오로-2-히드록시프로피온아미드 3-A
(R)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-3,3,3-트리플루오로-2-히드록시프로피온아미드 3-B
Figure pct00022
Figure pct00023
1b(5.0 mg, 9.41 μmol)에 에탄올 2 mL 및 N,N-디메틸포름아미드 0.4 mL를 첨가하고, 혼합물을 빙수욕에서 0 내지 5℃로 냉각시킨 후, N-메틸모르폴린 0.3 mL를 적가하였다. 반응 혼합물을 투명해질 때까지 교반하였다. 반응 혼합물에 3,3,3-트리플루오로-2-히드록시프로피온산 3a(4.1 mg, 28.4 μmol, Alfa에서 공급), 1-히드록시벤조트리아졸(3.8 mg, 28.1 μmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(5.4mg, 28.2μmol)을 연속적으로 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 0 내지 5℃에서 10분 동안 교반하였다. 빙수욕을 제거하고, 반응 혼합물을 30℃로 가열하고, 8시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축시켰다. 얻어지는 미정제 화합물 3을 고성능 액체 크로마토그래피(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: XBridge Prep C18 OBD 5 μm 19 × 250 mm; 이동상: A-물 (NH4OAc 10 mmol), B-아세토니트릴, 구배 용리, 유속: 18 mL/min)에 의해 정제하고, 상응하는 분획을 수집하고 감압 하에 농축하여 표제 생성물(1.5 mg, 1.5 mg)을 얻었다.
MS m/z (ESI): 561.9 [M+1].
단일 구조 화합물(더 짧은 머무름 시간)
UPLC 분석: 머무름 시간: 1.11분; 순도: 88%(크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1 Х 50 mm; 이동상: A-물(5 mmol의 NH4OAc), B-아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.94 (d, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.32 (s, 1H), 7.20 (d, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.61-5.55 (m, 1H), 5.45-5.23 (m, 3H), 5.15-5.06 (m, 1H), 4.66-4.57 (m, 1H), 3.18-3.12 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.26-2.20 (m, 1H), 2.16-2.08 (m, 1H), 2.02-1.94 (m, 1H), 1.89-1.82 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 0.87 (t, 3H).
단일 구조 화합물(더 긴 머무름 시간)
UPLC 분석: 머무름 시간: 1.19분; 순도: 90% (크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1 Х 50 mm; 이동상: A-물(5 mmol의 NH4OAc), B-아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.97 (d, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.16 (d, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.63-5.55 (m, 1H), 5.45-5.20 (m, 3H), 5.16-5.07 (m, 1H), 4.66-4.57 (m, 1H), 3.18-3.12 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.22-2.14 (m, 1H), 2.04-1.95 (m, 2H), 1.89-1.82 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 0.87 (t, 3H).
실시예 2-4
N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-1-히드록시시클로펜탄-1-카르복사미드 4
Figure pct00024
Figure pct00025
1b(3.0 mg, 5.64 μmol)에 1 mL의 N,N-디메틸포름아미드를 첨가하였다. 혼합물을 빙수욕에서 0 내지 5℃로 냉각시키고, 트리에틸아민 한 방울을 첨가하였다. 반응 혼합물을 투명해질 때까지 교반하였다. 반응 혼합물에 1-히드록시-시클로펜탄카르복실산 4a(2.2 mg, 16.9 μmol, 특허 출원 "WO2013106717"호에 개시된 바와 같이 제조됨) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(4.7 mg, 16.9 μmol))를 연속적으로 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 0 내지 5℃에서 1시간 동안 교반하고, 5mL의 물로 켄칭하고, 에틸 아세테이트(10mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 합하고, 포화 염화나트륨 용액(5 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 얻어지는 잔류물을 전개 용매계 B를 이용한 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 4(2.5 mg, 80.9% 수율)를 얻었다.
MS m/z (ESI): 548.0 [M+1].
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.73-7.62 (m, 2H), 5.75-5.62 (m, 1H), 5.46-5.32 (m, 2H), 5.26-5.10 (m, 1H), 3.30-3.10 (m, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.28-2.20 (m, 2H), 2.08-1.84 (m, 8H), 1.69-1.58 (m, 2H), 1.04-1.00 (m, 2H), 0.89 (t, 3H).
실시예 2-5
N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-1-(히드록시메틸)시클로프로판-1-카르복사미드 5
Figure pct00026
Figure pct00027
1b(2.0mg, 3.76μmol)에 N,N-디메틸포름아미드 1mL를 첨가하였다. 혼합물을 빙수욕에서 0 내지 5℃로 냉각시키고, 트리에틸아민 한 방울을 첨가하였다. 반응 혼합물을 투명해질 때까지 교반하였다. 반응 혼합물에 1-(히드록시메틸)-시클로펜탄카르복실산 5a(0.87 mg, 7.5 μmol, 특허 출원 "WO201396771"호에 개시된 바와 같이 제조됨) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(2 mg, 7.24 μmol)를 연속적으로 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 0 내지 5℃에서 2시간 동안 교반하고, 5mL의 물로 켄칭하고, 에틸 아세테이트(8mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 합하고, 포화 염화나트륨 용액(5 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 얻어지는 잔류물을 전개 용매계 B를 이용한 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 5(1.0 mg, 50% 수율)를 얻었다.
MS m/z (ESI): 533.9 [M+1].
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.07 (s, 1H), 7.23-7.18 (m, 2H), 6.71-6.64 (m, 1H), 6.55-6.51 (m, 1H), 5.36-5.27 (m, 2H), 4.67-4.61 (m, 2H), 3.53-3.48 (m, 1H), 3.30-3.22 (m, 2H), 3.18-3.13 (m, 1H), 2.71-2.61 (m, 2H), 2.35-2.28 (m, 1H), 2.04-1.91 (m, 4H), 1.53-1.40 (m, 3H), 0.91-0.75 (m, 4H).
실시예 2-6
N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-1-(히드록시메틸)시클로부탄-1-카르복사미드 6
Figure pct00028
Figure pct00029
1b(3.0 mg, 5.64 μmol)에 1 mL의 N,N-디메틸포름아미드를 첨가하였다. 혼합물을 빙수욕에서 0 내지 5℃로 냉각시키고, 트리에틸아민 한 방울을 첨가하였다. 반응 혼합물을 투명해질 때까지 교반하였다. 반응 혼합물에 1-(히드록시메틸)시클로부탄-1-카르복실산 6a(2.2 mg, 16.9 μmol, "Journal of the American Chemical Society, 2014, vol.136, #22, p.8138-8142"에 기재된 바와 같이 제조됨) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(4.7 mg, 16.9 μmol)를 연속적으로 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 0 내지 5℃에서 1시간 동안 교반하고, 5mL의 물로 켄칭하고, 에틸 아세테이트(10mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 합하고, 포화 염화나트륨 용액(5 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 얻어지는 잔류물을 전개 용매계 B를 이용한 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 6(2.1 mg, 67.9% 수율)을 얻었다.
MS m/z (ESI): 548.0 [M+1].
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 7.85-7.62 (m, 1H), 6.88 (br, 1H), 5.87-5.48 (m, 2H), 5.47-5.33 (m, 1H), 5.31-5.06 (m, 1H), 4.25-3.91 (m, 2H), 3.25 (br, 1H), 2.60-2.32 (m, 3H), 2.23 (t, 1H), 2.15-1.95 (m, 3H), 1.70-1.56 (m, 2H), 1.41-1.17 (m, 9H), 1.03 (s, 1H), 0.95-0.80 (m, 2H).
실시예 2-7
N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-1-히드록시시클로부탄-1-카르복사미드 7
Figure pct00030
Figure pct00031
1b(3.0mg, 5.64μmol)에 에탄올 2mL 및 N,N-디메틸포름아미드 0.4mL를 첨가하고, 혼합물을 빙수욕에서 0 내지 5℃로 냉각시킨 후, 0.3mL N-메틸모르폴린를 적가하였다. 반응 혼합물을 투명해질 때까지 교반하였다. 반응 혼합물에 1-히드록시시클로부탄카르복실산 7a(2.0 mg, 17.22 μmol, PharmaBlock사에서 공급), 1-히드록시벤조트리아졸 (2.3 mg, 17.0 μmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (3.2 mg, 16.7 μmol))를 연속적으로 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 0 내지 5℃에서 10분 동안 교반하였다. 빙수욕을 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고 감압 하에서 농축하였다. 얻어지는 잔류물을 전개 용매계 B를 이용한 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 7(2.5 mg, 83.1% 수율)을 얻었다.
MS m/z (ESI): 534.0 [M+1].
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.28 (d, 1H), 7.75 (d, 1H), 7.29 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 6.12 (s, 1H), 5.59-5.51 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.20-5.01 (m, 2H), 3.27-3.17 (m, 1H), 3.15-3.05 (m, 1H), 2.71-2.63 (m, 1H), 2.37 (s, 3H), 2.12-2.05 (m, 1H), 2.03-1.94 (m, 2H), 1.92-1.78 (m, 4H), 1.50-1.42 (m, 1H), 0.90-0.83 (m, 4H).
실시예 2-8
1-(((S)-7-벤질-20-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-3,6,9,12,15-펜타옥소-2,5,8,11,14-펜타아자에이코실)옥시)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)시클로프로판-1-카르복사미드 8
Figure pct00032
Figure pct00033
단계 1
벤질 1-((2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)아세트아미도)메톡시)시클로프로판-1-카르복실레이트 8c
벤질 1-히드록시시클로프로판-1-카르복실레이트 8a(104 mg, 0.54 mmol; 특허 출원 "US2005/20645"호에 개시된 바와 같이 제조됨) 및 2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)아세트아미도)메틸 아세테이트 8b(100mg, 0.27mmol; 특허 출원 "CN105829346A"호에 개시된 바와 같이 제조됨)를 반응 플라스크에 첨가하고, 5mL의 테트라히드로푸란을 첨가하였다. 그 계를 아르곤으로 3회 퍼징하고, 혼합물을 빙수욕에서 0 내지 5℃로 냉각시킨 다음, 칼륨 tert-부톡사이드(61 mg, 0.54 mmol)를 첨가하였다. 빙수욕을 제거하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 10분 동안 교반한 다음, 20 mL의 얼음물을 첨가하고 에틸 아세테이트(5 mL×2) 및 클로로포름(5 mL×5)으로 추출하였다. 유기상을 합하고 농축하였다. 얻어지는 잔류물을 3mL의 1,4-디옥산에 용해시킨 다음, 0.6mL의 물, 중탄산나트륨(27mg, 0.32mmol) 및 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트(70mg, 0.27mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 물 20mL를 가한 후 에틸아세테이트(8mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 용액(20 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 얻어지는 잔류물을 전개 용매계 B를 이용한 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 8c(100 mg, 73.6% 수율)를 얻었다.
MS m/z (ESI): 501.0 [M+1].
단계 2
1-((2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)아세트아미도)메톡시)시클로프로판-1-카르복실산 8d
8c(50mg, 0.10mmol)를 테트라하이드로퓨란과 에틸 아세테이트(V:V = 2:1)의 용매 혼합물 3mL에 용해시키고 탄소상의 팔라듐(25mg, 10% 로딩)을 첨가했다. 그 계를 수소로 3회 퍼징하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 여과 케이크를 테트라히드로푸란으로 헹구었다. 여액을 농축하여 표제 생성물 8d(41 mg, 100% 수율)를 얻었다.
MS m/z (ESI): 411.0 [M+1]
단계 3
(9H-플루오렌-9-일)메틸(2-(((1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노카르보닐)시클로프로폭시)메틸)아미노)-2-옥소에틸)카바메이트 8e
반응 플라스크에 1b(7mg, 0.013mmol)를 넣고, N,N-디메틸포름아미드 1mL를 첨가하였다. 그 계를 아르곤으로 3회 퍼징하고, 혼합물을 빙수욕에서 0 내지 5℃로 냉각시킨 다음, 트리에틸아민 한 방울, 0.5mL N,N-디메틸포름아미드에 용해된 8d(7mg, 0.017mmol)의 용액, 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(7 mg, 0.026 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 빙욕에서 35분 동안 교반하였다. 물 10mL를 넣고 에틸 아세테이트(5mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 용액(10 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 얻어지는 잔류물을 전개 용매계 B를 이용한 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 8e(8.5 mg, 78.0% 수율)를 얻었다.
MS m/z (ESI): 828.0 [M+1].
단계 4
1-((2-아미노아세틸아미노)메톡시)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)시클로프로판-1-카르복사미드 8f
8e(4 mg, 4.84 μmol)를 0.2 mL의 디클로로메탄에 용해시키고 0.1 mL의 디에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고 감압 하에 농축하였다. 2mL의 톨루엔을 첨가한 후 감압 농축하였고, 이 절차를 두 번 반복하였다. 잔류물을 3 mL의 n-헥산으로 슬러리화하고, 상부 n-헥산 층을 제거하였고, 이 절차를 세 번 반복하였다. 슬러리를 감압 하에 농축하여 미정제 표제 생성물 8f(2.9 mg)를 얻었고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
MS m/z (ESI): 606.0 [M+1].
단계 5
1-(((S)-7-벤질-20-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-3,6,9,12,15-펜타옥소-2,5,8,11,14-펜타아자에이코실)옥시)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)시클로프로판-1-카르복사미드 8
미정제 8f(2.9mg, 4.84μmol)를 N,N-디메틸포름아미드 0.5mL에 용해시켰다. 그 계를 아르곤으로 3회 퍼지하고 용액을 빙수욕에서 0 내지 5℃로 냉각시켰다. 0.3 mL의 N,N-디메틸포름아미드에 용해된 (S)-2(-2-(-2-(6-(2,5-디옥소-1H-피롤-1-일)헥사아미도)아세틸아미노)아세틸아미노)-3-페닐프로피온산 8g(2.7mg, 5.80 μmol, 특허 출원 "EP2907824"호에 개시된 바와 같이 제조됨)을 첨가한 후, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(2.7 mg, 9.67 μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 빙욕에서 30분 동안 교반하였다. 이후, 빙욕을 제거하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 15분 동안 교반한 후 고성능 액체 크로마토그래피(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: XBridge Prep C18 OBD 5 μm 19 ± 250 mm; 이동상; A-물(NH4OAc 10mmol), B-아세토니트릴, 구배 용리, 유속: 18mL/분)로 정제하였다. 상응하는 분획을 수집하고 감압 하에 농축하여 표제 생성물 8(2 mg, 39.0% 수율)을 얻었다.
MS m/z (ESI): 1060.0 [M+1].
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 9.01 (d, 1H), 8.77 (t, 1H), 8.21 (t, 1H), 8.08-7.92 (m, 2H), 7.73 (d, 1H), 7.28 (s, 1H), 7.24-7.07 (m, 4H), 6.98 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 5.61 (q, 1H), 5.40 (s, 2H), 5.32 (t, 1H), 5.12 (q, 2H), 4.62 (t, 1H), 4.52 (t, 1H), 4.40-4.32 (m, 1H), 3.73-3.47 (m, 8H), 3.16-3.04 (m, 2H), 2.89 (dd, 1H), 2.69-2.55 (m, 2H), 2.37-2.23 (m, 4H), 2.12-1.93 (m, 4H), 1.90-1.74 (m, 2H), 1.52-1.38 (m, 4H), 1.33-1.11 (m, 5H), 0.91-0.81 (m, 4H).
실시예 2-9
N-((2R,10S)-10-벤질-2-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15-펜타옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사데칸-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 9-A
N-((2S,10S)-10-벤질-2-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15-펜타옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사데칸-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 9-B
Figure pct00034
Figure pct00035
단계 1
벤질 2-시클로프로필-2-히드록시아세테이트 9a
2a(1.3g, 11.2mmol; 특허 출원 "WO2013/106717"호에 개시된 바와 같이 제조됨)를 50mL의 아세토니트릴에 녹이고, 탄산칼륨(6.18g, 44.8mmol), 벤질 브로마이드(1.33mL, 11.2mmol) 및 테트라부틸암모늄 요오드화물(413 mg, 1.1 mmol)을 연속적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하고 셀라이트를 통해 여과하고, 여과 케이크를 에틸 아세테이트(10mL)로 헹구었다. 여액을 합하고 감압하에 농축하고, 얻어지는 잔류물을 전개 용매계 C를 이용한 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 9a(2 g, 86.9% 수율)를 얻었다.
단계 2
벤질 10-시클로프로필-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6-디옥소-2,9-디옥사-4,7-디아잔데칸-11-오에이트 9b
반응 플라스크에 9a(120.9mg, 0.586mmol) 및 8b(180mg, 0.489mmol)를 첨가하고, 테트라히드로푸란 4mL를 첨가하였다. 그 계를 아르곤으로 3회 퍼징하고, 반응 혼합물을 빙수욕에서 0 내지 5℃로 냉각시킨 다음, 칼륨 tert-부톡사이드(109mg, 0.98mmol)를 첨가하였다. 빙욕을 제거하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 40분 동안 교반한 후, 10mL의 얼음물을 첨가하고 에틸 아세테이트(20mL×2) 및 클로로포름(10mL×5)으로 추출하였다. 유기상을 합하고 농축하였다. 얻어지는 잔류물을 디옥산 4mL에 용해시키고, 물 2mL, 중탄산나트륨(49.2mg, 0.586mmol) 및 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트(126mg, 0.49mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 물 20mL를 가한 후 에틸아세테이트(10mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 용액(20 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압하에 농축하였다. 얻어지는 잔류물을 전개 용매계 C를 이용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 9b(48 mg, 19% 수율)를 얻었다.
MS m/z (ESI): 515.0 [M+1].
단계 3
10-시클로프로필-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6-디옥소-2,9-디옥사-4,7-디아자운데칸-11-오산 9c
9b(20mg, 0.038mmol)를 테트라하이드로퓨란과 에틸 아세테이트(V:V = 2:1)의 용매 혼합물 4.5mL에 용해시키고 탄소상의 팔라듐(12mg, 10% 로딩, 건조 기준)을 첨가했다. 그 계를 수소로 3회 퍼징하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 여과 케이크를 에틸 아세테이트로 헹구었다. 여액을 농축하여 미정제 표제 생성물 9c(13 mg)를 얻었고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
MS m/z (ESI): 424.9 [M+1].
단계 4
(9H-플루오렌-9-일)메틸(2-(((1-사이클로프로필-2-(((1S,9S))-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-2-옥소에톡시)메틸)아미노)-2-옥소에틸)카바메이트 9d
1b(10 mg, 18.8 μmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, N,N-디메틸포름아미드 1 mL를 첨가하였다. 그 계를 아르곤으로 3회 퍼징하고 혼합물을 빙수욕에서 0 내지 5℃로 냉각시킨 다음 트리에틸아민 한 방울, 미정제 9c(13mg, 30.6μmol) 및 4-( 4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(16.9 mg, 61.2 μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 빙욕에서 40분 동안 교반하였다. 물 10mL를 가한 후 에틸아세테이트(10mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 합하고, 포화 염화나트륨 용액(10 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압하에 농축하였다. 얻어지는 잔류물을 전개 용매계 B를 이용한 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 9d(19 mg, 73.6% 수율)를 얻었다.
MS m/z (ESI): 842.1 [M+1].
단계 5
2-((2-아미노아세트아미도)메톡시)-2-시클로프로필-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아세트아미드 9e
9d(19mg, 22.6μmol)를 2mL의 디클로로메탄에 용해시키고 1mL의 디에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고 감압하에 농축하였다. 1mL의 톨루엔을 첨가한 후, 감압하에 농축하고, 이 절차를 두 번 반복하였다. 잔류물을 3mL의 n-헥산으로 슬러리화하고 방치하였다. 그런 다음, 상층액을 제거하고 고체를 유지하였다. 고체 잔류물을 감압하에 농축하고 오일 펌프를 사용하여 건조하여 미정제 표제 생성물 9e(17 mg)를 얻었고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
MS m/z (ESI): 638.0 [M+18].
단계 6
N-((2R,10S)-10-벤질-2-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15-펜타옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사데칸-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 9-A
N-((2S,10S)-10-벤질-2-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15-펜타옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사데칸-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 9-B
미정제 9e(13.9mg, 22.4μmol)를 N,N-디메틸포름아미드 0.6mL에 용해시켰다. 그 계를 아르곤으로 3회 퍼지하고 용액을 빙수욕에서 0 내지 5℃로 냉각시켰다. N,N-디메틸포름아미드 0.3mL에 용해된 8g(21.2mg, 44.8μmol)의 용액을 첨가한 다음, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(18.5mg, 67.3μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 빙욕에서 10분 동안 교반하였다. 이후, 빙욕을 제거하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 1시간 동안 교반하여 화합물 9를 생성하였다. 반응 혼합물을 고성능 액체 크로마토그래피(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: XBridge Prep C18 OBD 5 μm 19A 250mm, 이동상: A-물(NH4OAc 10mmol), B-아세토니트릴, 구배 용리, 유속: 18mL/분)로 정제하였다. 상응하는 분획을 수집하고 감압하에 농축하여 표제 생성물(9-A: 2.4 mg, 9-B: 1.7 mg)을 얻었다.
MS m/z (ESI): 1074.4 [M+1].
단일 구조 화합물 9-A(더 짧은 머무름 시간):
UPLC 분석: 마무름 시간: 1.14분; 순도: 85% (크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1 Х 50 mm; 이동상: A-물(5 mmol의 NH4OAc), B-아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.60 (t, 1H), 8.51-8.49 (d, 1H), 8.32-8.24 (m, 1H), 8.13-8.02 (m, 2H), 8.02-7.96 (m, 1H), 7.82-7.75 (m, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.26-7.15 (m, 4H), 6.99 (s, 1H), 6.55-6.48 (m, 1H), 5.65-5.54 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.35-5.15 (m, 3H), 4.74-4.62 (m, 1H), 4.54-4.40 (m, 2H), 3.76-3.64 (m, 4H), 3.62-3.48 (m, 2H), 3.20-3.07 (m, 2H), 3.04-2.94 (m, 1H), 2.80-2.62 (m, 1H), 2.45-2.30 (m, 3H), 2.25-2.15 (m, 2H), 2.15-2.04 (m, 2H), 1.93-1.78 (m, 2H), 1.52-1.39 (m, 3H), 1.34-1.12 (m, 5H), 0.87 (t, 3H), 0.64-0.38 (m, 4H).
단일 구조 화합물 9-B(더 긴 머무름 시간):
UPLC 분석: 머무름 시간: 1.16분; 순도: 89%(크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1 Х 50 mm; 이동상: A-물(5 mmol의 NH4OAc), B-아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.68-8.60 (m, 1H), 8.58-8.50 (m, 1H), 8.32-8.24 (m, 1H), 8.13-8.02 (m, 2H), 8.02-7.94 (m, 1H), 7.82-7.75 (m, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.26-7.13 (m, 3H), 6.99 (s, 1H), 6.55-6.48 (m, 1H), 5.60-5.50 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.35-5.15 (m, 2H), 4.78-4.68 (m, 1H), 4.60-4.40 (m, 2H), 3.76-3.58 (m, 4H), 3.58-3.48 (m, 1H), 3.20-3.10 (m, 2H), 3.08-2.97 (m, 2H), 2.80-2.72 (m, 2H), 2.45-2.30 (m, 3H), 2.25-2.13 (m, 2H), 2.13-2.04 (m, 2H), 2.03-1.94 (m, 2H), 1.91-1.78 (m, 2H), 1.52-1.39 (m, 3H), 1.34-1.12 (m, 4H), 0.91-0.79 (m, 3H), 0.53-0.34 (m, 4H).
3. ADC의 제조
실시예 3-1 ADC-1
Figure pct00036
항체 PD3의 수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05M 수성 PBS 완충액; 10.0 mg/mL, 4.0 mL, 270 nmol)에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)의 제조된 수용액(10 mM, 67.5 μL, 675 nmol)을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기(water bath shaker)에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각시켰다.
화합물 9-A(2.9 mg, 2700 nmol)를 180 μL의 DMSO에 녹이고 얻어지는 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가한 다음 25℃에서 3시간 동안 수조 진탕기에서 진탕한 후 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 탈염하고 Sephadex G25 겔 컬럼(용리상: pH 6.5의 0.05M PBS 완충액, 0.001M EDTA 함유)을 통해 정제하여 PBS 완충액 중의 PD3-9-A의 예시적인 생성물 ADC-1(1.93mg/ mL, 18.4 mL)을 얻은 다음 4℃에서 보관했다.
UV-Vis에 의해 계산된 평균: n = 3.77.
실시예 3-2 ADC-2
항체 PD3의 수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05M 수성 PBS 완충액; 10.0 mg/mL, 4.0 mL, 270 nmol)에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)의 제조된 수용액(10 mM, 143.1 μL, 1431 nmol)을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각시켰다.
화합물 9-A(4.35 mg, 4050 nmol)를 270 μL의 DMSO에 녹이고, 얻어지는 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가한 다음 25℃에서 3시간 동안 수욕 진탕기에서 진탕한 다음, 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 탈염하고 Sephadex G25 겔 컬럼(용리상: pH 6.5에서 0.05M PBS 완충제, 0.001M EDTA 함유)을 통해 정제하여 PBS 완충액 중의 PD3-9-A의 예시적인 생성물(1.69mg/ mL, 17.8 mL)을 얻은 다음 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis에 의해 계산된 평균: n = 6.59.
실시예 3-3 ADC-3
Figure pct00037
항체 PD3의 수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05M 수성 PBS 완충액; 10.0 mg/mL, 0.3 mL, 20.3 nmol)에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)의 제조된 수용액(10 mM, 5.1 μL, 51 nmol)을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각시켰다.
화합물 12h(0.194 mg, 203 nmol, WO2017063509호 참조를 참조하여 제조)를 20 μL의 아세토니트릴에 용해시키고, 얻어지는 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가하고, 이를 25℃에서 3시간 동안 수조 진탕기에서 진탕시킨 후 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 탈염하고 Sephadex G25 겔 컬럼(용리상: pH 6.5의 0.05M PBS 완충액, 0.001M EDTA 함유)을 통해 정제하여 PBS 완충액(4.3mg/mL, 0.6mL)에 용해된 표제 생성물 ADC-3(4.3 mg/mL, 0.6 mL)을 얻어서 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis에 의해 계산된 평균: n = 4.14.
실시예 3-4 ADC-4
Figure pct00038
WO2015098099호의 실시예 19를 참조하여 합성하였다.
항체 TINA의 수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05M 수성 PBS 완충액; 10.0mg/mL, 2.0mL, 135.4nmol)에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)의 제조된 수용액(10 mM, 33.8 μL, 338 nmol)을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각시켰다.
화합물 58(1.4 mg, 1354 nmol)을 70 μL의 DMSO에 녹이고, 얻어지는 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가한 후 25℃의 수조 진탕기에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 탈염하고 Sephadex G25 겔 컬럼(용리상: pH 6.5의 0.05M PBS 완충액, 0.001M EDTA 함유)을 통해 정제하여 PBS 완충액(1.13mg/mL)에 용해된 TINA-58의 예시적인 표제 생성물 ADC-4(1.13 mg/mL, 15.1 mL)를 얻어서 이를 4℃에서 보관했다.
UV-Vis에 의해 계산된 평균: n = 3.99.
실시예 3-5 ADC-5
Figure pct00039
항체 PD3의 수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05M 수성 PBS 완충액; 10.0mg/mL, 1.5mL, 101.4nmol)에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)의 제조된 수용액(10 mM, 25.3 μL, 253 nmol)을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각시켰다.
화합물 58(1.05 mg, 1014 nmol, 특허 CN104755494A의 페이지 163의 실시예 58 참조)을 60 μL의 DMSO에 용해시키고, 얻어지는 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가한 다음, 25℃의 수조 진탕기에서 3시간동안 진탕한 후 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 탈염하고 Sephadex G25 겔 컬럼(용리상: pH 6.5의 0.05M PBS 완충액)을 통해 정제하여 PBS 완충액에 용해된 PD3-58의 예시적인 표제 생성물 ADC-5(0.82 mg/mL, 13.5 mL)를 얻어서 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis에 의해 계산된 평균: n = 3.88.
실시예 3-6 ADC-6
Figure pct00040
항체 hRS7의 수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05M 수성 PBS 완충액; 10.0mg/mL, 1.4mL, 94.60nmol)에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)의 제조된 수용액(10mM, 50.1μL, 501nmol)을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각시켰다.
화합물 SN38(특허 CN105407891A호의 59페이지의 실시예 1을 참조하여 합성, 2.1 mg, 1419 nmol)을 50 μL의 DMSO에 용해시키고, 얻어지는 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가한 다음, 3시간 동안 25℃의 수조 진탕기에서 진탕한 후 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 탈염하고 Sephadex G25 겔 컬럼(용리상: pH 6.5의 0.05M PBS 완충액)을 통해 정제하여 PBS 완충액에 용해된 hRS7-SN38의 예시적인 표제 생성물 ADC-6(1.03mg/mL, 11.5mL)을 얻어서 이를 4℃에서 보관하였다.
CE-SDS에 의해 계산된 평균: n = 7.56.
실시예 3-7 ADC-7
Figure pct00041
항체 hRS7의 수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05M 수성 PBS 완충액; 10.0mg/mL, 2.18mL, 147.3nmol)에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)의 제조된 수용액(10 mM, 36.8 μL, 368 nmol)을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각시켰다.
화합물 9-A(1.58 mg, 1471 nmol)을 100 μL의 DMSO에 용해시키고, 얻어지는 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가한 다음, 25℃의 수조 진탕기에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 탈염하고 Sephadex G25 겔 컬럼(용리상: pH 6.5의 0.05M PBS 완충액)을 통해 정제하여 PBS 완충액에 용해된 hRS7-9-A의 예시적인 표제 생성물 ADC-7(1.10 mg/mL, 16.4 mL)을 얻어서 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis에 의해 계산된 평균: n = 3.72.
실시예 3-8 ADC-8
Figure pct00042
항체 hRS7의 수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05M 수성 PBS 완충액; 10.0mg/mL, 2.18mL, 147.3nmol)에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)의 제조된 수용액(10 mM, 36.8 μL, 368 nmol)을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각시켰다.
화합물 58(1.52 mg, 1473 nmol, 특허 CN104755494A호의 163 페이지의 실시예 58 참조)을 100 μL의 DMSO에 용해시키고, 얻어지는 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가한 다음, 25℃의 수조 진탕기에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 탈염하고 Sephadex G25 겔 컬럼(용리상: pH 6.5의 0.05M PBS 완충액)을 통해 정제하여 PBS 완충액에 용해된 hRS7-58의 예시적인 표제 생성물 ADC-8(1.02 mg/mL, 16.8 mL)을 얻어서 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis에 의해 계산된 평균: n = 3.93.
실시예 3-9 ADC-9
Figure pct00043
항체 TINA의 수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05M 수성 PBS 완충액; 10.0mg/mL, 0.95 mL, 64.2 nmol)에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)의 제조된 수용액(10 mM, 16.0 μL, 160 nmol)을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각시켰다.
화합물 9-A (0.69 mg, 642 nmol)을 30 μL의 DMSO에 용해시키고, 얻어지는 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가한 다음, 25℃의 수조 진탕기에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 탈염하고 Sephadex G25 겔 컬럼(용리상: pH 6.5의 0.05M PBS 완충액)을 통해 정제하여 PBS 완충액에 용해된 TINA-9-A의 예시적인 표제 생성물 ADC-9(0.99 mg/mL, 7.0 mL)을 얻어서 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis에 의해 계산된 평균: n = 3.99.
ADC 원액(stock solution)의 약물 로딩량 분석
ADC는 항체가교 약물이며, 이의 질병 치료 메커니즘은 항체의 표적화 성능에 따라 독소 분자를 세포 내로 이동시켜 세포를 사멸시키는 것이다. 약물 로딩량은 약물 효능에 결정적인 역할을 한다.
1. UV-Vis 계산 방법
ADC 원액의 약물 로딩량은 UV 방법을 사용하여 결정하였다.
실험 절차
숙신산 나트륨 완충액이 들어있는 큐벳을 기준 셀 및 샘플 셀에 넣고 용매 블랭크의 흡광도를 차감했다. 그런 다음, 테스트 용액이 들어 있는 큐벳을 샘플 셀에 넣고 280 nm 및 370 nm에서 흡광도를 측정했다.
결과를 위한 계산
ADC 원액의 로딩 용량은 특정 파장에서 ADC 원액의 총 흡광도가 특정 파장에서 세포독성 약물과 모노클로날 항체의 흡광도의 합이라는 원리에 기초하여 자외선 분광광도계(기기: Thermo nanodrop2000 자외선 분광광도계)로 측정하였다. 즉,
(1) A280 nm = εmab-280bCmab + εDrug-280bCDrug
εDrug-280: 280 nm에서 약물의 평균 몰 흡광 계수는 5100임;
CDrug: 약물의 농도;
εmab-280: 280 nm에서 모노클로날 항체 원액의 평균 몰 흡광 계수는 214,600임;
Cmab: 모노클로날 항체 원액의 농도;
b: 광경로 길이는 1cm임.
유사하게, 370 nm에서 샘플의 총 흡광도에 대한 식은 다음과 같이 주어질 수 있다.
(2) A370 nm = εmab-370bCmab + εDrug-370bCDrug
εDrug-370: 370 nm에서 약물의 평균 몰 흡광 계수는 19,000임;
CDrug: 약물의 농도;
εmab-370: 370 nm에서 모노클로날 항체 원액의 흡광 계수는 0임.
Cmab: 모노클로날 항체 원액의 농도;
b: 광경로 길이는 1cm임.
약물 로딩량은 두 파장에서 모노클로날 항체 및 약물의 감쇠 계수 및 농도뿐만 아니라 식 (1) 및 (2)를 모두 사용하여 계산할 수 있다.
약물 로딩량 = CDrug/Cmab.
2. CE-SDS 계산 방법
시약 및 기기
Beckman사에 의해 제조된 SDS-Mw Analysis Kit(Cat. # 390953)를 채택했고, 이는 SDS-MW 겔 분리 완충액, SDS-MW 샘플 완충액, 산성 세척액(0.1mol/L 염산 용액), 염기성 세척액(0.1mol 수산화나트륨 용액) 및 내부 표준 물질(10kDa)을 포함한다. 또한 Beijing BioCEart Technology Institute사에서 생산한 SDS 키트(Cat. # BSYK018)도 채택하였고 이는 CE-SDS 겔 완충액 및 CE-SDS 샘플 완충액을 포함한다.
알킬화 용액(0.25 mol 요오도아세트아미드 용액): 요오도아세트아미드 약 0.046 g을 칭량하고, 초순수 1 mL를 첨가하여 용해 및 잘 혼합하고, 얻어지는 용액을 암실에서 2 내지 8℃에서 7일 동안 보관하였다.
모세관 전기영동 장치: SCIEX의 PA800plus.
모세관: 코팅되지 않은 용융 실리카 모세관(내경 50μm). 20cm의 고해상도 방법에 의해 전체 길이 30.2cm 및 유효 분리 길이로 절단.
테스트 샘플 용액의 제조
테스트 샘플을 SDS 샘플 버퍼로 1 mg/mL로 희석했다. 95μL의 샘플 용액(1mg/mL)을 취하여 5μL의 요오도아세트아미드 수용액(0.8mol/L)을 첨가하고, 얻어지는 용액을 볼텍싱하고 잘 혼합하였다. 95 μL의 블랭크 대조군을 취하고 5 μL의 0.8 mol/L 요오도아세트아미드 수용액을 첨가하고, 얻어지는 볼텍싱하고 잘 혼합하였다. 샘플 튜브로부터 75μL의 샘플을 취하여 샘플 바이알에 첨가하고 즉시 분석을 수행했다.
측정 방법
1) 모세관의 전처리: 0.1 mol/L 수산화나트륨 용액을 60 psi 압력에서 3분 동안 세척한 다음, 60 psi 압력에서 0.1 mol/L 염산 용액으로 2분 동안 세척하고, 마지막으로 70 psi 압력에서 1분 동안 순수로 세척하였다. 각 작업 전에 위의 전처리를 수행해야 한다.
2) 모세관의 사전 충전: SDS 겔 분리 완충액을 50psi 압력에서 15분 동안 세척했다. 각 작업 전에 위의 전처리를 수행해야 한다.
샘플 주입: 역극성 10kV에서 동전기(electrokinetic) 샘플 주입을 수행하고, 환원된 샘플을 20초 동안 주입하였다.
분리: 15kV 역극성에서 40분간 분리하였다.
샘플 챔버의 온도: 18℃ 내지 25℃.
모세관의 온도: 18℃ 내지 25℃.
결과의 분석
데이터는 항체의 열린 이황화 결합으로부터 유리된 설피드릴에 대한 해당 약물의 커플링을 기반으로 Beckman사의 소프트웨어를 사용하여 분석하였고, 모든 보정된 피크 면적의 합에 대한 중쇄, 비당화 중쇄 및 경쇄와 같은 수정된 피크 면적의 비율을 계산하였다. 계산식: DAR = [4 Х 중쇄(H) 피크 면적 + 2 Х 1/2 항체(H-L) 피크 면적 + 4 Х 2배 중쇄(H-H) 피크 면적 + 2 Х 중쇄-중쇄-경쇄(H-H-L) 피크 면적]/[중쇄(H) 피크 면적/2 + 1/2 항체(H-L) 피크 면적/2 + 2배 중쇄(H-H) 피크 면적 + 중쇄-중쇄-경쇄(H-H-L) 피크 면적 + 완전 항체 피크 면적]. ADC의 가중 평균을 최종적으로 계산하였다.
본 발명의 항체의 활성은 생화학적 시험법을 이용하여 검증하였다.
시험예 1: 항체 단백질 수준 결합 분석
hTROP-2 단백질을 pH 7.4의 PBS 완충액(Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.사, B320)을 사용하여 1㎍/mL로 희석하고, 96-웰 마이크로플레이트에 웰당 100㎕씩 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 액체를 버린 후, PBS로 희석한 300 μL의 5% 탈지유(BD, 232100)를 블로킹을 위해 각 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 블로킹이 완료된 후 블로킹 용액을 버렸다.플레이트를 PBST 완충액(pH 7.4, 0.1% tween-20을 함유하는 PBS)으로 3회 세척한 후, 100 μL의 구배 희석 항체 용액을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 완료된 후, 플레이트를 PBST 완충액으로 3회 세척하고 100 μL의 1:8000 희석된 마우스 항-인간 IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch사, 209-035-088)를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST 완충액으로 3회 세척한 후, TMB 발색 기질(KPL, 5120-0077) 100μL를 각 웰에 넣고 상온에서 10 내지 15분간 인큐베이션한 후 50μL의 1 M H2SO4를 각 웰에 첨가하여 반응을 종료시켰다. 플레이트는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 검출하고, 항원에 대한 항체의 결합 곡선을 소프트웨어로 피팅하고, EC50 값을 계산하였다. 단백질에 대한 항체의 결합 활성을 하기 표 2에 나타낸다.
Figure pct00044
결과는 본 출원의 PD3 항체가 hTROP-2 단백질에 대한 더 높은 결합 활성을 가짐을 나타낸다.
시험예 2: 항체 세포 수준 결합 분석
안정적으로 형질감염된 TROP-2-발현 CHOK1 세포를 FACS 완충액(2% 소 태아 혈청(Gibco, 10099141) pH 7.4 PBS(Sigma, P4417-100TAB))에 현탁시켜 1 μl 106/mL 세포 현탁액을 얻고 이를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 100 μL/웰로 첨가했다. 원심분리 및 상층액 제거 후, FACS 완충액으로 상이한 농도로 희석한 시험 항체를 50 μL/웰로 첨가하였다. 플레이트를 4℃ 냉장고에서 1시간 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 300g에서 원심분리하여 FACS 완충액으로 3회 세척하고 작업 농도의 Alexa Fluor 488 염소 항-인간 IgG(H+L)(Invitrogen사, A-11013)를 첨가하였다. 플레이트를 4℃ 냉장고에서 40분 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 300g에서 원심분리하여 FACS 완충액으로 3회 세척하고 기하 평균 형광 강도(MFI)에 대하여 BD FACSCantoII 유세포 분석기에서 테스트했다. 안정적으로 형질감염된 TROP-2-발현 세포에 대한 항체의 결합 EC50 값을 계산하였다. 세포에 대한 항체의 결합 활성을 도 1 및 하기 표 3에 나타낸다.
Figure pct00045
결과는 본 출원의 PD3 항체가 hTROP-2 단백질 발현 세포에 대한 결합 활성이 더 높음을 나타낸다.
시험예 3: 항체 세포내이입 분석
이 분석의 목적은 DT3C 단백질이 세포에 들어간 후 활성화된 DT가 세포를 죽이고 항-TROP-2 항체의 세포내이입을 간접적으로 반영하는 것이다. 항체의 시험관내 세포내이입 활성은 EC50 및 Emax에 따라 평가한다.
DT3C는 재조합적으로 발현된 융합 단백질이며 디프테리아 독소의 단편 A(독소 부분만)과 그룹 G 연쇄상구균의 단편 3C(IgG 결합 부분)를 융합함으로싸 형성된다. 단백질은 항체의 IgG 부분에 대해 높은 친화성을 가지며, 항체가 세포내이입될 때 IgG 부분과 함께 세포에 들어가고, 세포내 푸린 프로테아제의 작용하에 독성 DT를 방출할 수 있다. DT는 EF2-ADP 리보실화의 활성을 억제하고, 단백질 번역 과정을 차단하여 최종적으로 세포 사멸을 유발할 수 있다. 세포에 들어가지 않는 DT3C는 세포를 죽이는 활성이 없다. 항체의 세포내이입 활성은 세포 사멸에 기초하여 평가한다.
세포 현탁액은 20% 저 IgG FBS를 함유하는 신선한 세포 배지를 이용하여 2×104 세포/mL의 세포 밀도로 제조하고, 50 μL/well로 세포 배양 플레이트에 첨가하고 5% 이산화탄소와 함께 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 4X 농도의 DT3C를 무혈청 배지에서 제조하고 0.22μm 필터를 통해 여과하여 멸균 용액을 얻었다. 무혈청 배지에 4X 농도의 항체를 준비하고 80μL의 DT3C와 80μL의 항체를 1:1의 부피로 혼합하여 상온에서 30분간 인큐베이션하였다. 희석된 항체-DT 3C 혼합물 50㎕를 세포 50㎕에 첨가하고 인큐베이터에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 50 μL의 CTG를 각 웰에 첨가하고 암실에서 상온에서 10분 동안 인큐베이션하고 Victor3를 사용하여 화학발광 값을 검출했다. 항체의 세포내이입 활성을 하기 표 4에 나타낸다.
Figure pct00046
결과는 본 출원의 PD3 항체가 더 높은 세포내이입 효율을 갖는다는 것을 보여준다.
시험예 4: 항체의 친화도 분석
TROP-2에 대한 항체의 친화도를 포획항체의 형태로 검출하였다. 항체는 항-인간 IgG 항체(Cat. # BR-1008-39, Lot. # 10260416, GE)와 접합된 단백질 A(Cat. # 29127556, GE) 바이오센서 칩에 의해 친화성 포획한 후, 항원 hTROP-2가 칩 표면에서 유동하였고, 반응 신호를 실시간으로 검출하기 위해 Biacore T200 기기를 사용하여 결합 및 해리 곡선을 얻었다. 각 분석 주기 마다 해리가 완료된 후, 칩을 깨끗하게 세척하고 재생 완충액인 Glycine1.5(Cat. # BR100354, GE) 또는 3 M MgCl2(Human 항체 캡처 키트, Cat. # BR100839, GE)를 이용하여 재생하였다. 분석이 완료된 후, 데이터는 GE Biacore T200 평가 버전 3.0을 사용하여 (1:1) Langmuir 모델에 피팅하여 친화도 값을 얻었다. 단백질에 대한 항체의 친화도는 하기 표 5에 나타낸다.
Figure pct00047
결과는 본 출원의 PD3 항체가 hTROP-2에 대해 더 높은 친화도를 갖는다는 것을 보여준다.
시험예 5: ADC 분자의 세포 활성 분석
이 분석에서 사용된 세포는 다음과 같았다: FaDu (+++)(ATCC로부터 구입, Cat. # HTB-43TM); HCC827(+++) (ATCC로부터 구입, Cat. # CRL-2868); Colo205(++)(Cell Bank, Chinese Academy of Sciences로부터 구입, Cat. # TCHu102); DMS53 (++)(ATCC로부터 구입, Cat. # CRL-2062TM); SK-OV-3(+)(ATCC로부터 구입, Cat. # HTB-77); CHO-K1(-)(ATCC로부터 구입, Cat. # CCL-61TM). 여기서, "+"는 세포 집단에서 TROP-2의 발현량을 나타내고, "+"는 TROP-2의 발현량이 더 많은 것을 의미하고, "-"는 TROP-2가 발현되지 않음을 의미한다.
세포 현탁액은 10% FBS를 포함하는 새로운 세포 배지를 이용하여 3703 세포/mL의 밀도로 제조하고, 135μL/well로 96-웰 세포 배양 플레이트에 첨가하고, 5% 이산화탄소와 함께 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. ADC 샘플을 PBS를 이용하여 5μM로 준비하였다. 5μM의 초기 농도를 PBS로 5회 희석하여 총 8개의 농도로 만들었다. 상기 ADC 용액 15μL를 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 37℃에서 5% 이산화탄소에서 6일 동안 배양하였다. 70 μL의 CTG를 각 웰에 첨가하고 암실에서 상온에서 10분 동안 인큐베이션하고, Victor3를 사용하여 화학발광 값을 검출하고, GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행했다.
결과는 ADC-1이 더 강한 세포 사멸 효과를 가지며, 그 사멸 효과는 종양 세포 표면의 TROP-2 발현 수준과 양의 상관 관계가 있음을 보여준다.
[표 6-1]
Figure pct00048
상기와 같은 방법으로 2차 병렬 비교 분석을 수행하였으며, 그 결과는 다음과 같다.
[표 6-2]
Figure pct00049
시험예 6: 방관자 살해 활성 연구
BxPC3(인간 췌장암 세포, ATCC, CRL-1687) 및 MiaPaCa2 세포(인간 췌장암 세포, biocytogen, B-HCL-014)를 각각 RPMI1640+10% FBS 및 DMEM/고포도당+10% FBS를 이용하여 배양하였고; 세포를 트립신 처리하고 새로운 배지로 중화하고 1000rpm에서 3분 동안 원심분리했다. 상층액을 버리고 세포를 RPMI1640 + 10% FBS로 재현탁시켰다. 세포를 계수한 후, BxPC3의 세포 밀도를 6×104 세포/mL로 조절하고 MiaPaCa2-luc의 세포 밀도를 1.5×104 세포/mL로 조절하였다. 500μL의 BxPC3 세포와 500μL의 MiaPaCa2-luc 세포를 12웰 플레이트 1의 각 웰에 첨가하였다. 500 μL의 MiaPaCa2-luc 세포와 10% FBS 혈청을 함유하는 RPMI1640 배지 500 μL를 12-웰 플레이트 2에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 배양하였다.
ADC 샘플은 40X 농도의 중간 용액(0.2μM)으로 제형화하였다. 25 μL의 상기 샘플을 취하여 12-웰 플레이트의 해당 웰에 첨가하였다. 용매 대조군을 설정하였다. 플레이트를 37℃에서 5% 이산화탄소에서 6일 동안 배양하였다. 12웰 플레이트의 세포를 트립신 처리하고, 새로운 배지로 중화하고, 1000rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고 세포를 1mL의 FACS 완충액(PBS + 2.5% FBS)에 재현탁시켰다. 20 μL의 세포를 취하고 20 μL의 트리판 블루로 염색하고 계수하였다. 플레이트 1의 세포를 1000rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상층액을 버리고, 세포를 100μL의 FACS 완충액에 재현탁하고, 2μL의 TROP-2(EGP-1) 모노클로날 항체(MR54)를 첨가하고, 세포를 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 4℃에서 1분 동안 2000 rpm으로 원심분리하고, 상층액을 버리고, 세포를 150 μL의 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 검출은 BD FACSVerse를 사용하여 수행하였다. 데이터는 Flowjo 7.6으로 분석하였다. 방관자 살해 활성 연구의 결과는 도 3에 도시되어 있다.
결과는 본 발명의 ADC-1이 명백한 방관자 사멸 효과를 가지며, ADC는 TROP-2 음성 MiaPaCa2 세포를 사멸시키지 않지만, ADC-1은 TROP-2 발현 BxPC3 세포가 음성 세포 MiaPaCa2와 혼합되는 경우 TROP-2 음성 세포도 사멸시킨다는 것을 보여준다
생체내 활성의 생물학적 평가
시험예 7: Fadu 세포 CDX 마우스 모델의 생체내 효능 평가
Balb/c 누드 마우스 오른쪽 옆구리에 Fadu 세포(3×106)를 피하 접종하였고, 접종 10일 후, 체중이 무겁고 종양이 너무 크거나 종양이 너무 작은 누드 마우스는 종양 부피가 약 245mm3에 도달한 후에 제외하였다. 나머지 마우스는 종양 부피에 따라 8마리 마우스씩 5개 그룹으로 무작위로 나누었다.
0일과 8일에 각각의 마우스에 ADC를 0.1mL/10g 체중으로 복강내 주사하여 1mg/kg의 용량으로 총 2회 주사하였다. 종양 부피와 체중을 주 2회 측정하고 그 결과를 21일 동안 기록했다.
데이터는 Excel 통계 소프트웨어를 사용하여 기록하였다. 평균 값은 평균으로 계산하였다. SD 값은 STDEV로 계산하였다. SEM 값은 STDEV/SQRT(군당 동물 수)로 계산하였다. 플롯을 위해 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하였고, Two-way ANOVA 또는 One-way ANOVA를 이용하여 데이터의 통계적 분석을 수행하였다.
종양 부피(V)는 V = 1/2 Х Llong Х Lshort 2로 계산하였다.
상대적 종양 증식율 T/C(%) = (T - T0)/(C - C0) Х 100. 여기서, T 및 C는 각각 처리군 및 대조군에서 실험 종료 시 동물의 종양 부피이고; T0 및 C0 각각 처리군 및 대조군에서 실험 시작 시 동물의 종양 부피이다.
종양 억제율 TGI (%) = 1 - T/C (%).
그 결과를 하기 표 7 및 도 3에 나타낸다. 그 결과는 ADC-1이 1mpk의 용량에서 FaDu 이종이식 종양에 대해 강력한 종양 억제 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
Figure pct00050
시험예 8: SKOV3 세포 CDX 마우스 모델의 생체내 효능 평가
Balb/c 누드 마우스 오른쪽 옆구리에 SKOV3 세포(5×106)를 피하 접종하였고, 접종 23일 후에, 체중이 무겁고 종양이 너무 크거나 종양이 너무 작은 누드 마우스는 종양 부피가 약 180mm3에 도달한 후 제외하였다. 나머지 마우스는 종양 부피에 따라 8마리 마우스씩 5개 그룹으로 무작위로 나누었다.
각 마우스에 ADC를 0.1mL/10g 체중으로 총 2회 복강주사하였으며, 용량은 다음 표와 같다. 종양 부피와 체중을 일주일에 두 번 측정하고 결과를 기록했다. 데이터는 Excel 통계 소프트웨어를 사용하여 기록하였다. 평균 값은 평균으로 계산하였다. SD 값은 STDEV로 계산하였다. SEM 값은 STDEV/SQRT(군당 동물 수)로 계산하였다. 플롯을 위해 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하였고, Two-way ANOVA 또는 One-way ANOVA를 이용하여 데이터의 통계적 분석을 수행하였다.
종양 부피(V)는 V = 1/2 Х Llong Х Lshort 2로 계산하였다.
상대적 종양 증식율 T/C(%) = (T - T0)/(C - C0) Х 100. 여기서, T 및 C는 각각 처리군 및 대조군에서 실험 종료 시 동물의 종양 부피이고; T0 및 C0 각각 처리군 및 대조군에서 실험 시작 시 동물의 종양 부피이다.
종양 억제율 TGI (%) = 1 - T/C (%).
그 결과를 하기 표 8 및 도 4에 나타내었다. 그 결과는 ADC-1이 상이한 용량에서 SKOV3 이종이식 종양에 대해 강한 종양 억제 효과를 가지며, 그 종양 억제 효과가 용량 의존적임을 보여준다.
그 효과는 용량 의존적이다.
Figure pct00051
시험예 9: Colo205 세포 CDX 마우스 모드의 생체내 효능 평가
Balb/c 누드 마우스 오른쪽 옆구리에 Colo205 세포(5×106)를 피하 접종하였고, 접종 10일 후에, 체중이 무겁고 종양이 너무 크거나 종양이 너무 작은 누드 마우스는 종양 부피가 약 245mm3에 도달한 후 제외하였다. 나머지 마우스는 종양 부피에 따라 8마리 마우스씩 6개 그룹으로 무작위로 나누었다.
0일(D0) 및 10일에 각 마우스에 ADC를 0.1mL/10g 체중으로 복강내 주사하여 10mg/kg의 용량으로 총 2회 주사하였다. 종양 부피와 체중을 일주일에 두 번 측정하고 그 결과를 28일(D28) 동안 기록하였다.
데이터는 Excel 통계 소프트웨어를 사용하여 기록하였다. 평균 값은 평균으로 계산하였다. SD 값은 STDEV로 계산하였다. SEM 값은 STDEV/SQRT(군당 동물 수)로 계산하였다. 플롯을 위해 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하였고, Two-way ANOVA 또는 One-way ANOVA를 이용하여 데이터의 통계적 분석을 수행하였다.
종양 부피(V)는 V = 1/2 Х Llong Х Lshort 2로 계산하였다.
상대적 종양 증식율 T/C(%) = (T - T0)/(C - C0) Х 100. 여기서, T 및 C는 각각 처리군 및 대조군에서 실험 종료 시 동물의 종양 부피이고; T0 및 C0 각각 처리군 및 대조군에서 실험 시작 시 동물의 종양 부피이다.
종양 억제율 TGI (%) = 1 - T/C (%).
그 결과를 하기 표 9 및 도 5에 나타낸다. 그 결과는 화합물 9-A와 접합된 ADC-9 및 ADC-7이 1 mpk의 용량에서 Colo205 이종이식편 종양에 대해 강력한 종양 억제 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
Figure pct00052
SEQUENCE LISTING <110> Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Shanghai Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. <120> ANTI-TROP-2 ANTIBODY-EXATECAN ANALOG CONJUGATE AND MEDICAL USE THEREOF <130> 721008CPCT <140> PCT/CN2021/073279 <141> 2021-01-22 <150> 202010073438.8 <151> 2020-01-22 <160> 18 <170> Patent-In 3.5 <210> 1 <211> 323 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Arg Gly Pro Gly Leu Ala Pro Pro Pro Leu Arg Leu Pro Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Val Leu Ala Ala Val Thr Gly His Thr Ala Ala Gln Asp 20 25 30 Asn Cys Thr Cys Pro Thr Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly 35 40 45 Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala Leu Gly Ser Gly Met Ala Val 50 55 60 Asp Cys Ser Thr Leu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met 65 70 75 80 Ser Ala Pro Lys Asn Ala Arg Thr Leu Val Arg Pro Ser Glu His Ala 85 90 95 Leu Val Asp Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly 100 105 110 Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val 115 120 125 Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg 130 135 140 Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His 145 150 155 160 Arg Pro Thr Ala Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu 165 170 175 Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His Pro Lys Phe Val Ala 180 185 190 Ala Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn 195 200 205 Thr Ser Gln Lys Ala Ala Gly Asp Val Asp Ile Gly Asp Ala Ala Tyr 210 215 220 Tyr Phe Glu Arg Asp Ile Lys Gly Glu Ser Leu Phe Gln Gly Arg Gly 225 230 235 240 Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg Thr 245 250 255 Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp Glu Ile Pro Pro Lys Phe Ser Met Lys Arg 260 265 270 Leu Thr Ala Gly Leu Ile Ala Val Ile Val Val Val Val Val Ala Leu 275 280 285 Val Ala Gly Met Ala Val Leu Val Ile Thr Asn Arg Arg Lys Ser Gly 290 295 300 Lys Tyr Lys Lys Val Glu Ile Lys Glu Leu Gly Glu Leu Arg Lys Glu 305 310 315 320 Pro Ser Leu <210> 2 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Trop2-His <400> 2 Met Ala Arg Gly Pro Gly Leu Ala Pro Pro Pro Leu Arg Leu Pro Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Val Leu Ala Ala Val Thr Gly His Thr Ala Ala Gln Asp 20 25 30 Asn Cys Thr Cys Pro Thr Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly 35 40 45 Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala Leu Gly Ser Gly Met Ala Val 50 55 60 Asp Cys Ser Thr Leu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met 65 70 75 80 Ser Ala Pro Lys Asn Ala Arg Thr Leu Val Arg Pro Ser Glu His Ala 85 90 95 Leu Val Asp Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly 100 105 110 Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val 115 120 125 Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg 130 135 140 Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His 145 150 155 160 Arg Pro Thr Ala Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu 165 170 175 Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His Pro Lys Phe Val Ala 180 185 190 Ala Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn 195 200 205 Thr Ser Gln Lys Ala Ala Gly Asp Val Asp Ile Gly Asp Ala Ala Tyr 210 215 220 Tyr Phe Glu Arg Asp Ile Lys Gly Glu Ser Leu Phe Gln Gly Arg Gly 225 230 235 240 Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg Thr 245 250 255 Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp Glu Ile Pro Pro Lys Phe Ser Met Lys Arg 260 265 270 Leu Thr Ala Gly Leu Ile Ala Val Ile Val Val Val Val Val Ala Leu 275 280 285 Val Ala Gly Met Ala Val Leu Val Ile Thr Asn Arg Arg Lys Ser Gly 290 295 300 Lys Tyr Lys Lys Val Glu Ile Lys Glu Leu Gly Glu Leu Arg Lys Glu 305 310 315 320 Pro Ser Leu His His His His His His 325 <210> 3 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of PD3 <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Gln Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of PD3 <400> 4 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD3 HCDR1 <400> 5 Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD3 HCDR2 <400> 6 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD3 HCDR3 <400> 7 Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD3 LCDR1 <400> 8 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala Val Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD3 LCDR2 <400> 9 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD3 LCDR3 <400> 10 Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 11 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 13 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of PD3 <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Gln Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 14 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of PD3 <400> 14 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 15 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of hRS7 <400> 15 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 16 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of hRS7 <400> 16 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 17 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of TINA <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala 20 25 30 Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 18 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of TINA <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (32)

  1. 하기 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00053

    상기 식에서,
    Y는 -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-, -O-CR1R2-(CRaRb)m-, -O-CR1R2-, -NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)- 및 -S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Ra 및 Rb는 동일 또는 상이하고 수소, 중수소, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 중수소화 알킬, 알콕시, 히드록시, 아미노, 시아노, 니트로, 히드록시알킬, 시클로알킬 및 헤테로시클릴로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나; 또는 Ra 및 Rb는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클릴을 형성하고;
    R1은 할로겐, 할로알킬, 중수소화 알킬, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 알콕시알킬, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는수소, 할로겐, 할로알킬, 중수소화 알킬, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 알콕시알킬, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 R1 및 R2는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클릴을 형성하고;
    m은 0 내지 4의 정수이고;
    n은 소수 또는 1 내지 10의 정수이고;
    L은 링커 유닛이고;
    Pc는 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
  2. 제1항에 있어서, 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변영역은 서열번호 3에 기재된 중쇄 가변영역의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 서열과 동일한 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변영역은 서열번호 4에 기재된 경쇄 가변영역의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 서열과 동일한 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7에 각각 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변영역은 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 각각 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TROP-2 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖거나 이와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고/갖거나, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖거나 이와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 3에 기재된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4에 기재된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함하고. 바람직하게는, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 경쇄 불변 영역은 인간 항체 κ 및 λ 쇄 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는, 항-TROP-2 항체는 서열 번호 11에 기재된 중쇄 불변 영역 및 서열 번호 12에 기재된 경쇄 불변 영역을 포함하는, 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TROP-2 항체는 서열번호 13에 기재된 중쇄 및 서열번호 14에 기재된 경쇄를 포함하는, 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, n은 소수 또는 2 내지 10, 바람직하게는 4 내지 8의 정수인, 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    Y는 -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-이고;
    Ra 및 Rb는 동일하거나 상이하고, 수소, 중수소, 할로겐 및 알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
    R1은 할로알킬 또는 C3-6 시클로알킬이고;
    R2는 수소, 할로알킬 및 C3-6 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는
    R1 및 R2는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 C3-6 시클로알킬을 형성하고;
    m은 0 또는 1인, 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    Y는
    Figure pct00054
    및
    Figure pct00055
    로 이루어진 군으로부터 선택되고, Y의 O-말단은 링커 유닛 L에 연결되어 있는, 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    -L-은 -L1-L2-L3-L4- 이고, 여기서 L1은 -(숙신이미딜-3-일-N)-W-C(O)-, -CH2-C(O)-NR3-W-C(O)- 및 -C(O)-W-C(O)- 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 W은 C1-8 알킬, C1-8 알킬-시클로알킬 및 사슬 원자수 1 내지 8 의 선형 헤테로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 헤테로알킬은 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하고, 여기서 C1-8 알킬, 시클로알킬 및 선형 헤테로알킬은 할로겐, 히드록시, 시아노, 아미노, 알킬, 클로로알킬, 중수소화 알킬, 알콕시 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 각각 독립적으로 선택적으로 추가로 치환되고;
    L2은 -NR4(CH2CH2O)pCH2CH2C(O)-, -NR4(CH2CH2O)pCH2C(O)-, -S(CH2)pC(O)- 및 화학적 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서의 p는 1 내지 20의 정수이고;
    L3은 2 내지 7개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 잔기이고, 여기서의 아미노산 잔기는 페닐알라닌, 글리신, 발린, 라이신, 시트룰린, 세린, 글루탐산 및 아스파르트산으로부터의 아미노산으로부터 형성된 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 할로겐, 히드록시, 시아노, 아미노, 알킬, 클로로알킬, 중수소화 알킬, 알콕시 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 추가로 치환되고;
    L4는 -NR5(CR6R7)t-, -C(O)NR5, -C(O)NR5(CH2)t- 및 화학적 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서의 t는 1 내지 6의 정수이고;
    R3, R4 및 R5 동일하거나 상이하고 수소, 알킬, 할로알킬, 중수소화 알킬 및 히드록시알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
    R6 및 R7 동일하거나 상이하고 수소, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 중수소화 알킬 및 히드록시알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되는,
    화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    링커 유닛 -L-은 -L1-L2-L3-L4- 이고, 여기서
    L1은
    Figure pct00056
    이고, s1은 2 내지 8의 정수이고;
    L2는 화학적 결합이고;
    L3은 테트라펩티드 잔기, 바람직하게는 GGFG의 테트라펩티드 잔기이고;
    L4는 -NR5(CR6R7)t-이고, 여기서의 R5, R6 및 R7은 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 알킬이고, t는 1 또는 2이고;
    L1 말단은 Pc에 연결되고 L4 말단은 Y에 연결되어 있는,
    화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    -L-은
    Figure pct00057
    인,
    화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    -L-Y-는 하기의 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00058
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 하기 화학식 (Pc-La-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인, 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00059

    상기 식에서, Pc, n, m, W, L2, L3, R1, R2, R5, R6 and R7는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같다.
  17. 제1항 내지 제13항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 하기 화학식 (Pc-Lb-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인, 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00060

    상기 식에서,
    s1은 2 내지 8의 정수이고;
    Pc, R1, R2, R5, R6, R7, m 및 n은 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같다.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드-약물 접합체는 하기의 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00061

    상기 식에서, Pc 및 n은 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같다.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    리간드-약물 접합체는 하기의 것인, 화학식 (Pc-L-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:

    Figure pct00062

    상기 식에서,
    n은 소수 또는 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 더욱 바람직하게는 4 내지 6의 정수이고;
    Pc는 서열번호 13에 기재된 중쇄 및 서열번호 14에 기재된 경쇄를 포함하는 항-TROP-2 항체이다.
  20. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 중쇄 가변영역의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 서열과 동일한 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변영역은 서열번호 4에 기재된 경쇄 가변 영역의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 서열과 동일한 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는. 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  21. 제20항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7에 각각 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 각각 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 항-TROP-2 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  23. 제20항 내지 제22항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖거나 이와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖거나 이와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  24. 제20항 내지 제23항에 있어서, 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함하고; 바람직하게는, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 경쇄 불변 영역은 인간 항체 κ 및 λ 쇄 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 더욱 바람직하게는 항-TROP-2 항체는 서열번호 11에 기재된 중쇄 불변 영역 및 서열번호 12에 기재된 경쇄 불변 영역을 포함하는, 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  25. 제20항 내지 제24항에 있어서, 항-TROP-2 항체는 서열번호 13에 기재된 중쇄 및 서열번호 14에 기재된 경쇄를 포함하는, 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 분자.
  27. 제26항에 따른 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  28. 환원된 Pc' 및 화학식 (La-Y-D)의 화합물을 커플링 반응시켜서 화학식 (Pc-La-Y-D)의 화합물을 얻는 단계를 포함하는, 화학식 (Pc-La-Y-D)의 리간드-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 제조 방법:
    Figure pct00063

    상기 식에서,
    Pc는 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고; 바람직하게는, Pc는 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고;
    n, m, W, L2, L3, R1, R2, R5, R6 및 R7는 제16항에서 바와 같다.
  29. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체 또는 이의 제약상 허용되는 염, 또는 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물:
  30. TROP-2-매개 질환 또는 상태의 치료를 위한 의약의 제조에서 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제29항에 따른 약학적 조성물의 용도.
  31. 종양의 치료를 위한 의약의 제조에서 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제29항에 따른 약학적 조성물의 용도.
  32. 종양 및 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조에서 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 항-TROP-2 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제29항에 따른 약학적 조성물의 용도로서, 종양 또는 암은 바람직하게는 두경부 편평 세포 암종(head and neck squamous cell carcinoma), 두경부암(head and neck cancer), 뇌암(brain cancer), 신경교종(neuroglioma), 다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme), 신경모세포종(neuroblastoma), 중추신경계 암종(central nervous system carcinoma), 신경내분비 종양(neuroendocrine tumor), 인후암(throat cancer), 인두 편평 세포 암종(pharyngeal squamous cell carcinoma), 구강 편평 세포 암종(oral squamous cell carcinoma), 비인두암(nasopharyngeal cancer), 식도암(esophageal cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 악성 흉막중피종(malignant pleural mesothelioma), 폐암(lung cancer), 유방암(breast cancer), 간암(liver cancer), 간담도암(hepatobiliary cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 위암(stomach cancer), 위장관암(gastrointestinal cancer), 장암(intestinal cancer), 결장암(colon cancer), 대장암(colorectal cancer), 신장암(kidney cancer), 투명세포신세포암(clear cell renal cell carcinoma), 난소암(ovarian cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 방광암(bladder cancer), 전립선암(prostate cancer), 고환암(testicular cancer), 피부암(skin cancer), 흑색종(melanoma), 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 골암(bone cancer), 연골육종(chondrosarcoma), 골수종(myeloma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 크루켄버그 종양(Krukenberg tumor), 골수증식성 종양(myeloproliferative tumor), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 요로상피 암종(urothelial carcinoma) 또는 메르켈 세포 암종(Merkel cell carcinoma)이고; 더욱 바람직하게는, 림프종(lymphoma)은 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종(primary mediastinal large B-cell lymphoma), 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma), 소림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma), T 세포/조직구가 풍부한 거대 B 세포 림프종(large B-cell lymphoma rich in T-cells/histiocytes), 및 림프형질구성 림프종(lymphoplasmacytic lymphoma)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 폐암은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer) 및 소세포폐암(small cell lung cancer)으로 이루어진 군에서 선택되고, 백혈병은 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 림프구성 백혈병(lymphocytic leukemia), 림프구성 백혈병(lymphoblastic leukemia), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia) 및 골수 세포 백혈병(myeloid cell leukemia)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
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