HU230378B1 - Anti-DR5 ellenanyagok és anti-DR4 ellenanyagok és más terápiás ágensek kombinációi - Google Patents

Anti-DR5 ellenanyagok és anti-DR4 ellenanyagok és más terápiás ágensek kombinációi Download PDF

Info

Publication number
HU230378B1
HU230378B1 HU0600602A HUP0600602A HU230378B1 HU 230378 B1 HU230378 B1 HU 230378B1 HU 0600602 A HU0600602 A HU 0600602A HU P0600602 A HUP0600602 A HU P0600602A HU 230378 B1 HU230378 B1 HU 230378B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
tra
antibody
apoptosis
composition
Prior art date
Application number
HU0600602A
Other languages
English (en)
Inventor
Tong Birmingham Zhou
Kimihisa Yokohama-shi Ichikawa
Robert P Kimberly
William J Koopman
Jun Oshumi
Albert F Lobuglio
Donald J Buchsbaum
Original Assignee
Uab Research Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Uab Research Foundation filed Critical Uab Research Foundation
Publication of HUP0600602A2 publication Critical patent/HUP0600602A2/hu
Publication of HUP0600602A3 publication Critical patent/HUP0600602A3/hu
Publication of HU230378B1 publication Critical patent/HU230378B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/44—Glucocorticosteroids; Drugs increasing or potentiating the activity of glucocorticosteroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Description

TRAR, a TNF-febérjecsaiád tagja, mely családhoz tartozik a IMF~o és a Fas-ligandum is (1). Ezek a fehérjék potenciálisait apopíózss-iítdukálő anyagok. Jelenleg öt TRAIL-recepíorí azonosítottak, amelyek közöl kettő, DR4 yFRAH -RÍ) és D&S (IRAÍÍ-RJ» (2-7) apopto/is-szignalr képesek továbbítani, »»íg a másik báron», DeRl (1RA11 R3), De.R2 (TRA:1L-R4) és oszteoprotegerin (OPG) nem kepeiek apopíözis-szlgnált továbbítani (8-12). Mind az: Őt TRAIL-rsceptor szignifikánsan homológ extraoeiluláris ligapdunikoto doutenjeiben. Fas-reeeptorhoz és TbíF-reeeptörí-kez (a leírásban rövidítése „TNERl) hasonlóan, DR4 és DR5 iuíraeeMárts szegmensei ,,halál”-dosnét?t tartalmaznak, és apopjózis-szignáli olyan folyamatsoron át továbbítják, amelyben Fas-asszociált ,„haíár’-doméxi fehérje (a leírásban rővidítese „FADD’”) és kaszpáz-8 játszik szerepet (6, ?), Az apopfőzls-szigoál továbbításán kívül a DR4- és DR5receptorok: ΜΚκΙνί tartalmazó tblyamatsort is képesek aktiválni (6. 7),
TRA1L biológiai funkcióiról kimutatták, hogy TRAÍL transzformált htíuorsejték apöptózisát képes szelektíven indukálni, amelyek normál sejtekkel viszonylag reziszteasek TR.All,-médiait apóptözíssal szemben (13-15). A szelektivitás alapján feltételezték, hogy Fas-lígandummal ellentétben, TRAlt beadása nagyon alacsony szintű toxieitással társul, amit az mutat, hogy TRAlt szisztémás beadása állatmodellben nem indukált jelentős toxicltást (13). Tehát felmerült, hogy TEAM,· potenciális apoptőzís-indúkáló ágens, amely terápiás ágensként rák és más abnormális seíiprolíFerácíóvsl asszociált betegségek kezelésére alkalmas. TRAlt-el kapcsolatban azt is feltételezték, hogy olyat» potenciális apoptózls-iudukálő ágens, amely autoimmun és gyulladásos betegségek kezelésére alkalmas. Kimutatták, hogy TRAíL-mediált apopiózis játszik szerepet T-sejtek aktivácfo-lndukáh sejípasziulásábau, ezáltal Fas-ligandum mellett: alternatív nxeehumztnuskéní szolgái (16, 17). TRAíF-mediáb apopíózisnak szerepe lehet T-sejtek és órás gyulladásos sejtek npoptőzisásxak Indukálásában is (18), és: szerepet játszik HK-sejtek őlőaklsvitssában (19-21), és denírííikus sejtek immonínodulátör íhnkeiójában (22, 23). Tehát TBAll.,-!nediáh: apopiózis szerepet játszhat az inmtunolögfeiíag kiváltságos (privilegizált} helyek kialakulásában és az hmmmologiai ellenőrző funkciót biztosító reud30 szerben is,
A TRAÜL receptor-rendszer komplex, és legalább két „b&láP’-receptort, DR4-et és DRS-δ», és legalább két nem íipopKstikas receptort, DeRl-eí és DeR2-t tartalmaz. Ezek a receptorok nemcsak nagy mérték ben homológok amtnosavszekvencia-szinten, hanem TRÁIL-hez való kötődési affinitásuk is hasonló (2-12). Dcl'tl- és DcR2-receptorok képesek TRA1L kötéséért kömpeticíóba lépni apopiózis indttkálásts nélkül, ami alapját» feité;eiez»ék, hogy olyan „csali re35 eeptorkéut viselkednek, amelyek blokkolják vagy ntodulálják a TRlAL-íigandant aktivitását. Továbbá, feiríák, hogy nem-trsnszíbrmáií sejtek' nagyobb mennyiségben exprésszáfoak „csali® receptorokat, mist transzformált sejtek. Peiféteíezték tel»át, 'begy a „halál” és „csali” receptorok expressziójáuak a eltérő modulálása kulcsfontosságú szabályozó nwehanizmus lehet, amely meghatározza a sejtek érzékenységét TRÁJl-ittedlálí apoptózlsra, azonban receptor-specifikus ellenanyagok hiánya miatt (2).
Bár DR4 és DRS expresszióját és funkcióját alaposa» vizsgálták, a további előrehaladást gátolta receptorspecifikus monoklonális ellenanyagok hiánya. DR5 sejtfelszlpi: expreszszálását nem dokumentálták. Leírták olyan antíTRAlL-reesptor ellenanyagokból álló panel előállítását, amelyek »®eíatíómasejtek apöptózisátvoltak képesek indukálni itt vsit-o, de csak az ellenanyagok inunöhiiizáíása esetén, amely etősegíMte a kereszikötés kialakulását, és, néhány esetben, a sejtekei aetinomícm-D-yei kellett tenyészteni (24). Számos DRS-speeífílins ellenanyagot állítottak elő (24). Azonban ezek a már előállítóit, DR5~re specsítkns monoklottálss ellenanyagok kismértékű apopiózis-indukáló aktivitással rendelkeztek in vitte, naég a keresÁkötés körülményei között is. /» vívó aktivitást nem írtak le, Ezeket az ellenanyagokat uent alkalmazták TRAÍL-wceplorok se ttols/tni expressziójának vizsgálatára (24), Tehát van igény olyast monoklonális ellenanyagokra, amelyek az egyes konxret TRAíE-receptorokta specifikusak, amelyek nemcsak sejtfelszíni receptorhoz képesek kötődni, hanem- különféle típusé abnormális sejtek, például unnorsejtok apoptózísát képesek erőteljesen indakálni, mind in vivő, mind í« víiro anélkül,, hogy keresrtkötésre vagy immobilizálásra. szükség lenne. Ilyen ellenanyag nemcsak potenciális terápiás ágens lehet, hanem diagnosztikai eszköz Is TRÁfL-receptor fnnk1Ö eíonálrs analíziséhez. Különösen nagy szükség van olyan ellenanyagra, amely az egyes, pusztulást mdnkáló BR4- és
ÜRS-receptorokra specifikus.
Sok betegség kialakulása vagy' előrehaladása, esetén előfordul, hogy sejtek nem pusztulnak el. Számos aufotsnmun betegségben és gyulladásos állapotban a túlélő, aktiválódott sejtek megtámadnak normál szöveteket vagy sejteket. Továbbá, utmörgenezis folyamatát és reumatoid artrúiszbeu proiiierativ pannns kialakulását sejtek akadálytalan proiiferáelója jellemzi, A nem kielégítő apoptőzis tehát betegség kifejlődéséhez vezet, és apoptózlst indukáló ligandum vagy agonista monoklonális ellenanyag alkalmazásai az apoptózis javítása céljából ágy tekinthetők, mint lehetséges terápiás stratégiák a nem-kívánt sejtek eliminálására.
Például a rentnatoid artrittsz (a továbbiakban „R-A”) egy általánosan előforduló, humán autoimmun betegség. RÁ jelenlegi patefodolőglájának értelmezése szerint autoimmun T- és B-sejíek gyulladásos választ indítanak el az
2ö izílfetekben, amely szmoviociták híperprolrferációját okozza. A szinoviáhs sejtek hiperproliferácíójának kővetkezrtiényeként metailoproteázők (a leírásban rövidítésük „MMF’j túltermeSődnek, ami továbbá a -porc és csont erozlv pusztulásához vezet, ami jellemző RA-ra (25), Tehát gyulladásos szinoviálls sejtek biperproliferáeíőjának. szabályzásit egy kulcslépés RÁ kezeléséhen. Szinoviálls sejtek inpetprolíferáeíójáhöz vezető molekuláris mechanizmusok egyelőre még ismeretiének. Bár a hiperproliteratív szinoviálls sejtek nem malígnusak és nem25 transzformáltak, számos kísérletben arra a feltételezésre jutottak, hogy bizonyos tulajdonságaik közösek transzformált sejtekkel (46). Ezeket a sejteket, az úgynevezett „transzformált megjelenésé szinovfoeiiák’'-at sárii durva endopltizmaííkus rettkulum, számos szabálytalan sejtmag, és tiortnál esetben: orsó formájú eifoszkéfeton elváltozásai jellemzik. Feltételezik, hogy onkogének és víruseredetn gének beépülése lehet elsődleges kiváltó oka RA esetén szisoviáhs sejtek transzformált megjelenésének (46).
RA legalább két vonatkozása alapján feltételezzük, hogy a rendellenesén szabályzóit apoptőzis hozzájárulhat a beteg folyamathoz, és hogy apoptózis terápiás úton való előidézése hatásos kezelés lehet: az alapján, hogy aktíváit Tsejtek netn pusztulnak el, feltételezzük, hogy az ilyen T-sejfek akíivácíŐ-índukáit sejtpusztelása defektiv, amely olyan folyamat, amelyben Pás-médiáit apoptózis és TRAÍL-msdiáit apoptőzis játszik szerepet, és az RÁ által érintett szinovíálís sejtek hipetproiitératív természete olyan tényező, amely hozzájárul sz RÁ-paíofiziológíá késői állapotához.
Valóban, kimutatták, hogy antí-Fas ellenanyag beadása a gyulladásos ízületbe gátolja krónikus artribsz kialakulását tor traaszgenikus egerekben, «melyek humán RA-í modelleznek állatban (26). Továbbá, lokalizált transzdukció lasligandummal adenovírus vektor alkalmazásával hatásos kollagén-indukált artrirísz prevenciójába» (27), Mindkét esetben megfigyelték gyulladásos szmoviális sejtek prolifömetőjánuk gátlását Ess-medtált apoptózis fokozódásának következményeként. Bár fás-ligandum erős apöptózist indukáló anyag RÁ által érinteti szinoviálls sejtekben, kásái) hgandtun-medtált apoptózis emberi terápiaként történő alkalmazása korlátozóit letális máj-toxieiiás miatt. Tehát TRÁft-receptorral indukált apoptózis biztonságosabb és hatásosabb terápia RA kezelésére, mint Fas-digándum által ín-310 dukált apöpíózis. TRÁR,-médiáit apopíőzssrol ismeretes, hogy specifikusan indukálja transzformált tumorsejfek apoptőzisát úgy, hogy ütticses hatással normái sejtekre. Kimutatták, hogy a trimerízák, szoiubllls TRAÍL szisztémás beadása nem okoz ioxleitást kisérieti áíláfokban, viszont beültetett tumorok regresszióját indukálta (13, 28). Hagyományos kezelések mellett adjuvárts terápiaként való alkalmazásának lehetőségét alátámasztotta az, hogy a közelmúltban felismerték, hogy ÖR5 expressziója és mellrák-sejtek 'fRAik-indukált apöptézisra való érzékenysége sugárkezelésre fokozódott, ami arra atal, hogy sugárkezeléssel kombhtálva TRA1L hatékonysága fokozódik rákterápiában (29).
Továbbá DRá-jeld TRAíL-reeeptort kódoló gént 8p21-22 kromoszómára térképezték, amely lókuszok bizonyos rákos sejtekben nagy gyakorisággal tartalmaznak mutációi (30). Leírták, hogy legalább kétféle turnojsejt, kis sejtes tüdőrák (31) és a feji és nyaki rák (32) esetén mutációkat tartalmaz DRS-gén ,,haiár~doménjében, Tehát igény van antiDR5-elÍeaanyagre a rákkutatásban annak meghatározására, hogy milyen halasi fejt ki a reeeptor-epitóp variálása rákbetegségek kifejlődésére és lefolyására. Továbbá» TRAIL-reeeptor mutánsainak funkcionális alkalmassága klinikai diagnosztikai eszköz lehet, ha más. biológiai markerekkeí együtt alkalmaznák rákbetegségek korai detektálására, valamint a tumor agresszivitásának előrejelzésére.
A WO ÖÖ7S191, WO ét 19Sdl ás WO Öl 77342 számú nemzetközi közzétételi iratok kemoterápiás hatóanyaggal kombinációs terápiában alkalmazott agonísta monoklonáiis aatbORS ellenanyagokról tanítanak ki. Amint a WO' Öl 19841 számú nemzetközi közzétételi irafoaa látható, a feltárt ellenanyagok keresztreáktívak egyéb TRAlt receptorokkal, kereszíkötésre wt szükségük, vagy keresztreáktívak egyéb TRA1L receptorokkal és keresztkötésre van szükségük.
X, lehíkasa és munkatársai a. „Tmnoríeidal actívíty of a növel arrá-haman DR5 moeional anttbody without hepatoeyte eyfotoxíehy” clmü, a Natúré Medicine (2ÖÖ1) 7. kötete 8. számában, a 954-960. oldalakon megjelent cikkükben leírnak egy új ellenanyagot, kombinációkat azonban am.
A találmány tárgya az 1. igénypontban meghatározott eljárás és a 2, igénypontban meghatározott készítmény. A találmány tárgyát képezi az í. és 2. igénypontban meghatározott ellenanyag, amely DRó-jeifi 2'RÁJl.-receptort képes felismerni, és amely apoptózist indukál DR5-öf expresszáló sejtben ití νΐν& vagy is vitro
Az 1. és 2. igénypontban meghatározott eileóáeyag, amely DR4-jeíü TRAiL-reeptort képes felismerni, és amely apoptózist indukál DR4-t expresszáló sejtben ív vivő vagy in rhro,
A találmány szerinti eljárásban apoptózist indukáhtnk célsejtekben vagy célsejtek proliferációját gátoljuk (így, hogy egy sejtét éríntkeztetünk DR5-höz vagy DR4-hez kötődni képes ellenanyag terápiás mennyiségével. Az eljárás különböző előnyős megvalósítási módjai szerint, az: apoptózis ngy indukálható vagy a sejlprelsferáeló úgy gátolható, hogy a célsejteket más „haiáf’-íeeeptorokna. specifikus ellenanyaggal éríntkeztetjük.
Szinten a találmány tárgyát képezi gyógyászati készítmény, amely DRS-eí szemben aktív, monoklonáiis ellenanyag terápiás mennyiségét, gyógyászaüíag elfogadható hordozót, és adott esetben az ellenanyagot és a hordozót tartalmazó tartályt tartalmaz. A találmány tárgyát képezi továbbá DR5-öt felismerné képes ellenanyag vagy BR4-ei felismerni képes elletmnyag alkalmazása abnormális vagy rendellenesen szabályzóit sejtek szelektív spopíózisára alkalmas terápiás szer előállítására.
A. leírás szerinti egv ellenanyag kölcsönhatásba képes: lépni tumosmekrézis faktorral rokon szerkezetik apopfoztsí indukáló ligandum receptorávák például DR4-gyei, ÖRS-tet, DrRí-gyek DrR2-v&l vagy OPO-vel, apoptózist indukálva Ilyen. receptort expresszáló sejtben. Az eliettányag szelektíven képes kötni egy agenisfa vagy antagonista, ínmornekrózis faktor iigarsdum receptorából származó epitópoi.
Az ellenanyagok alkalmazhatók apoptózissal kapcsolatos betegség, rák, gyulladásos betegség vagy autoimmun betegség olyan eljárással történő kezelésére, amely magában foglalja a betegséget hordozó eélszövet éristkeztetéséi találmány szerinti ellenanyag terápiás meunyiségével önmagában vágy egyéb apoptézlst indukáló: ellenanyagokkal és/vagy egyéb terápiás hatóanyagokkal vagy kezelésekkel együtt
A találmány tárgyát képezi továbbá fúziós fehérje, amely antigenifes TRÁíL-reccptor legalább tiz amínosavóból álló mninosav-szekvenciát tartalmaz immnnglohuhn fehérjéhez vagy ffagmenséhez kapcsolva, amely egy alanyban immunválaszt képes kiváltani.
Ismertetőnk egy génterápiás eljárást, amelyben egy célsejtet teanszfektáhmk egy expressziós vektorban lévő, TRAiL-reeeptort kódoló nukleinsavszekveoeiával, Így a TRAlt-reeepíor a célsejten espresszálódik, Azután a célsejtet ellenanyaggal érmíkezteíjnk, amely szelektíven köti a TRAlL-reeéptort, lö A találmány tárgyát képezik nokleinsavszekveneiák és amlnosav-szekveneiák, amelyek DR'5-re szelektív ellenanyag nehéz és: könayő hsmunglobtiltn-láneait kódolják. Szántén: a találmány tárgyát képezik DR4-er szelektíven kötni képes ellenanyag szekvenciái, Á találmány tárgyát képezik vektorok is, amelyek találmány szerinti: nuklewsavszekvericíát tartalmaznak, valamint találmány szerinti vektorral irnnsztormáit gazdasejíefc,
A találmány tárgyát képezi bumnrsizált DRS-ellenanyag (példán! TRÁ-8) és bumanizáit DR4 (például 2E12), valamint humanizált DRó-ellenanyagöt termelő, transziekíáll sejt, és humanizált BR4-ellenanyagoí termelő, transzfektált sejt,
A találmány tárgyát képezi eljárás humanizált DRs-eílenanyag vagy DR4-ellenanyag előállítására, amelyben egy gazdaszervezetet tratiszforínáitank humanizált immunglobulin könnyű láncát és humanizált immnnglöbalin nehéz láncát kódoló mtkfemsavszekvenciákkai, ezt kővetőé» a transzformált gazdaszervezetet előre megbatározott ideig iíikobáliuk,
Szintén a találmány tárgyát képezi eljárás apoptózis indukálására vagy sejíprohferáciö gátlására célsejtekben, amelyben célsejtet éfhlikeztetönk gyogyászátilag hatásos mennyiségő humanizált BRS-eílenanyaggal vagy humanizált DR4-őiienanyaggal, vagy DRá-elienunyag és egy másik „halár-receptorra, specifikus ellenanyag (például DR4-re specifikus ellenanyag) kombinációjával, más terápiás ágensek éS: kezelések jelenlétében, vagy ezek nélkül,
A találmány tárgyát képezi apoptózis indukálására szolgáló, kereskedelmi forgalomba hozható reagenskészlet, amely DR5-re szelektív, humanizált TRA-S-ellenanyagot, ás L>R4-re szelektív humanizált ellenanyagot (például 2B12) tartalmaz, alkalmas edénybe csomagolva, éa adott esetben használati utasítással.
Ábrák rövid leírása
1. ábra, TR.A-8 jellemzése, (a) TRA-8 kötési specsfitása: Westem-blot analízis (felső panel): TOPR-csaSádhoz tartozó fehérjéket tartalmazó, rekomblnáns fúziós fehérjék, melyekhez próbaként TRA-S-aí vagy anti-humán-lgü-t alkalmaztunk, 1, sáv: BRó/hlgGl fúziós fehérje (immimogén); 2. sáv: DR4/hígöl ITRAIL-Ri):; 3. sáv: DRS/fdgöl: 4. sáv: TRA1L-R3 (DcR-lXhlgÖl; 5, sáv: TRAH.-R4 (DeR-2)/hig(ii; 6. sáv: CDbó/hlgGI; 7. sáv: szolubilfe THFRf BLISA-amdizis (alsó panel); A mérőhelyek számai egyeznek a wesíem-bíotban alkalmazott számokkal, kivéve a 8,. mérőhelyet, amelyben egéreredetö BRS/hlgGI fúziós fehérje vau. (b) Szolubilis TRAIL és TRÁ-S kötési: aktivitása
13R5-höz és DR4-hez; ELlSA-tálcákat f>R5/h.lgGí~ei (bal panel) vagy DR4/hIg6i-e; (középső panel) burkoltunk, és azután TRAlL-el vagy TRA-S-ai inkuháltuk. (c)-DR5 sejtfelszíni expresszlóján&k áramlási eitometriás analízise. Cos-7~ sejtekes transzfektáltunk pcDNA3-jelÜ expressziós vektorra!, amely teljes hosszúságú DR5-cDNS«t (besatírozott lúsztogram), DR4-cDN:S-t (Üres hisztogr&m, folytonos vonal) tartalmazott, vagy' üres vektorra (üres btsztogram, szaggatott vonal). Transzfekció után 48 órával a sejteket meg&steítaR TRA-8-al, azután PE-konjtigált anti-egér Igöl-el.
40. (d) DR5 in .síftí imurunhisztekémiai reaktivitása: DR5~expresszlŐrs trsnszMált Gós-7-sejteket citospm-tárgyiemftzeken megfestettünk TKA-b-al 48 órával a transzfekció után. (e) T.RA-8 sejtpusztttö aktivitású: Jorkat-sejleket inkubáitonk
-5 T&A-í-al a jelölt koncentrációkban, Sejtek életképességét ATPLite, MTT és Fí-kizárási vizsgálati eljárással határoztak meg egy éjszakás tenyésztés után. Az ATPtiíe és MTT vizsgálati eljárások eredményeit tápközeget tartalmazó, kontroll százalékában fejezzük kt, és a Pl vizsgálati eljárás eredményeit Pl negatív sejtek százalékában fejezzük ki, (í) Kászpázaktiválás western-blot analízise: Jurkat-sejteket inkubáltank 5Ö0 ng/ml TRA-8-at a .ategeW időtartamig,
Sejtitzáínmokat elválasztottunk 15%-os S13S-PAGE-n, bloítoltuk és próbaként aott-kaszpáz-ellenanyagökat alkalmaztok, A nyilak áz egyes kaszpázok .hasított alegységeit matatják, (g) Kaszpáz-gátlásí vizsgálati eljárás: lófkafsejteket Inkubáltuuk 50 ng/ml TRA-S-al egy éjszákén ál a jelölt kaszpáz-inhiblforokkal, amelyek különböző koneentíációban voltak jelen. Sejtek életképességét ATPLite vizsgálati élj ásással határoztuk meg.
2. ábra, DRS sejtfelszíni expressziója és érzékenység DRS-jnediáit apopíözisra. Perifériás vérből frissen izolált, lö normál T- és 8-sejteket (a és a'}, glioma- (b és b’), proszfeniták- íe) es B-sejí~ íd) sejtvonalakat inkubátorok TRA-Ü-al vagy egéreredetü IgGi izolipus kontroll ellenanyaggal, ezt követően FE-knniugálf, kecskében termeltetett, aud-egérIgGI-el. Az teres bisztogramok megfelelnek az izotípus eltenanyag-femterAak, míg; a besatirozoít hisztegramok megfelelnek a TRA-8-fesíésnek, Az apopíózist ATPLite vizsgálati eljárással határoztuk meg, mintán egy éjszakán át iiíkölíáitíik szöltihilis TPAÍL-el (üres körök) vagy TRA-8-al (teli körök), az a, fe’ és d ábrákon bematatva,
3a’. ábra. U93?-jeiü T-sejtvönalat inkobáhnnk TRA-B-al vagy egéreredetü ígGi-izotípusú, kontroll ellenanyaggal Apoptőzist ATPLite vizsgálati eljárással határoztak meg azníán, hogy égy éjszakán át inkubáltuk szölübilu 1 RAlL~el (üres körök) vagy TSA-S-ai (telikörök).
3. abra. Gllóma (b) és prosztatarák (e) sejívonslakaí inkuhtilímjk TRA-8-aí vagy egéreredefe tgGl-izodpusü, kontroll ellenanyaggal. Apoptózist ATPLite vizsgálati eljárással határoztok meg azntárs, hogy egy éjszakán át inknháifek szöinhihs TRAIL-el (üres körök) vagy TRA-8-al (teli körök).
A 4. ábrán látható görbe-sorozaton bemutatjuk sejtek életképességét Jnrkat-sejtekre azután, hogy a jelölt koncentrációkban TRA-1-, TRA-8- és TRA-tö-jelü ellenanyag-törzsekkel (.A) és TRAIL-el (8) kezeltük aztokat a találmány szerinti ellenanyag-törzs jelenlétében, amelynek koncentrációja állandó volt a :4,A ábrán bemutattak, szerint.
5, ábra, T.1R5 expressziója normát és rákos szövetekben:: Honná! és rákos .szövethomögenizátainokpn TRA-k25 próbát alkalmaztunk, és keratlumineszeencíás módszerrel hívtak elő. (a) DRS-febés'je western-blot analízise normál szövetekben: L sáv; máj, 2. sáv: agy, 3. sáv;: tttdö, 4. sáv: vese, 5. sáv:; lép, 6. sáv: herék, 7, sáv: petefészek, 8, sáv: szív, 9 sót. ha»nyá!ro»így tbi ta) 15R5-fehérje ocstem-bloí anab/sse rákos szövetekbe» A sákos szövetekből.készült blotoa az alábbi szövetekből származó mintákon «lkaimaztunk próbát: petefészek (1. sáv), tüdő (2. sáv), máj (3. sáv), végbél (4. sáv), (méhjnysk (5, sáv), bor (ő. sáv), herék (7. sáv), pajzsmirigy (8. sáv), méh (10. sáv), gyomor (11. sáv), gnrat abó szakasza (laryogopharynx, 12. sáv) és hasnyálmirigy (13. sáv). Normái humán .szövetek és rákos szövetek in síin knnwnhiszíokémíaí vizsgálata (e). f agyasztott metszeteken TBA-8 alkalmazásával végeztünk immunológiai festést.
ő. ábra. TRA-8 tümoricid aktivitása- SCID-egereket beoltottunk sznbhután ? 32IHG-sejtekkel. Az egereket intravénásán oltottak egyetlen dózis, 1 (10 pg TRA-8-al a tömör beoltását: köveid második napon (a) vagy bárom dózi^ 1.ŐÖ pg TRA-S-al á tumor beoltását követő 7. napon kezdve. Meghatároztuk a tumor tömegét, és híszíelógtaiigg vizsgátok B&L-fesíéssel. Á fényképeken élénk tumornövekedés látható kontroll egerekben, viszont TRA-S-al kezelt egerekben nem (e, felső panel), és bernutafenk H&B-festeö tumorokat (e, alsó panel). SCtD-egereket intravénásán injektáltunk 16í: Jurkat-sejtteL és egyetlen dózis TRA-S-ai kezeltük azokat az istjektálás utáni második napon. Hét nappal később lépsejfekef kivettünk, megfestettük antí-hnmán-CD3 ellenanyaggal, és áramlási eitotnélerrel (d) vagy inununhiszíokémsaiiag (e) analizáltuk.
-6Α 7, ábrán hemulatjuk sejtfelszim' DR5-expresszlót RA (A) és OA (8) áltat érintett sziuoviális sejtekben. 1 x )ö* sztneviális sejtek primer tenyészetéből származó sejtet megfestelek affinhástisztfeott TRA-S-al, azt követben FFtenjugált astí-egé:MgGl eRéháhyággál. lö.ööö életképes sejtet analizáltak FÁCSvunfage alkalmazásával.
A 8. ábráit látható görbe-soreszaton bemutatjuk sejtek életképességét TRAíL- és TR/k-8-kötíceíitráeiö 5 függvényében. RÁ (A) és OA (fí) érintett sztttoviálls sejtek reprezentatív törzseiben npoptőzisí indukáltunk különböző koncentráeióbsn alkalmazott, rekombináns szufubilis TRÁÍVeí (lues körök) vagy sfllnításíisztitQií TRA-8-aí (tele körök). Sejtek életképességéi kezelt sejtekre kapott epm % formájában fejeztük ki kezeletlen sejtekre kapott cpm-hez viszonyítva.
A R ábrán látható görbe-sorozaton bemutatjuk RA által érinteti szinovlális sejtek DR5~mediáfí apoptóztsának 10 kaszpáz-iüggését. RA szíiioviáiís sejteket (RA512) tokuháitunk 5& ng/mí, szoiubilis Fas-ligatidummal {üres négyzetek), anti-Fas-elfeminyaggal (CH-11) (tele négyzetek), szolubilis TRAlF-el (Eres körök) vagy atiti-DRó-ellenanyaggal (TRAS) (telt körök) különböző koncentrációban jelenlévő kaszpáz-inhibiforök jelenlétében. Egy éjszakai tenyésztés után
ATFLtte alkalmazásával megmértük a sejtek életképességét.
A ΙΘ,Α ábrán egy elekfeoforetikus gél-eltolódási {„gei-shiR”) vizsgálati eljárásban bemutatunk hi.Fkb15 aktiválódást. RAíSiő-sejteket inkubáltunk 20 ng/mí TNF-o-val, 50 ng/ml szoiubilis TRAlt-el vagy 50 ng/mi TRA-8al n megjelölt idöporüökhan, majd elektroforézisnek vetettük alá, A 1Ö,B és IÖ.C ábrákon láttató görbén bemutatjuk MMP-1 és MMF-3 termelődését, 1 x tOs/ml jelölt típusú, RA által érintett színeviátis sejteket inkubáiiunk TNE-ot-val {üres körök), TRAft-ei (üres háromszögek) vagy TRA-8-a? (teli körök) megjelölt koncentrációkban. Egy éjszakán át tenyésztettük azokat majd eiküiötbíettük a felülúszókat, MMP mennyiségét a tenyészel felüiúszőjában EUSA-vai határoztuk meg.
ti. ábra. TRA-8 nem indukál tapatoeellüláris toxicttást (a) Normál mészövetek nem expresszálnak E>R5-öt. Két normál mészöveiből, egy hepatöeelitilárís kareínöma-szövetböl készült paraíTm-meíszeiek és KepG2-sejtek eitöspm-greparáiumál előkészítettük H&E-festésre, és a. megfelelő fagysztoit metszeteket TRA-8-al festettük. (b) Sejt felszínen expresszálódb DRS áramlási eitometnás analízise. Két normál szövetből és hepaíoeeilüláris karcinónut25 szövetből izolált hepatomeitákat és HepG2-sejteket megfestettünk TRÁ-8-ai, anti-Fas-ellenanyaggnl (DX2) vagy izoítpos-koniröll ellenanyaggal. A besatírozoSt bisztogramok a TRA-S vagy iXK2-fesfesf matatják, és az üres itiszíogmmök a megfelelő szotipos-kottirol lókat mutatják.
12, ábra, TRAÍL indukál, viszont TRA-8 nem indukál hepatoeeEuláris foxietiásí, Friss, normál, humán hepafocifákat „Ffep&töcyía” tenyésztési tápközegben janortunk font. (a) Hepatociták apoptóxisát I pg/ml szoiubilis
TRA!L-d plusz kereszkötő íinkerrel, vagy Í RA-8~al indukáltunk a megjelölt időpontokban. Sejtek életképességét ATPi,iie-vel határoztuk meg. Az eredményeket tápközeget tartalmazó, kontrollra vonatkoztatott, életképes sejtek százalékában fejezzük ki. A ferdén vonalközöd oszlopok megfelelnek TRAlL-nck, és a fekete oszlopok megfelelnek TRA-S-sak. (b) Hepatoeslák kondenzált magvait megfestettük Hoechsí 33352-vel, és áramlási díomstríávaí analizáltuk, le) Clkiohexirnid hatása hepatociía-apoptozisra. Hepaíocitákaf kontroll fápközegben vagy 1 pg/ml TRAlF-el vagy
TRA-8-ál tenyésztettünk í pg/ml ciklohexsmsd jelenlétében (fekete oszlopok) vagy nélkül (üres oszlopok) b őm hosszáig. Sejtek életképességét ATFLite-vel határoztuk meg, Az eredményeket áiíagySEM-ként mutatjuk be, két kisértetböl szármáztak, három párhuzamos alkalmazásával. (d) Normál itepatoeríák érzékenysége DRS-re és Fas-mediáit apoptézisra, Frissen izolált bepatoeitákaí inkubáltunk a megadott koncerürációjú szoiubths TRÁít-ek TRA-8-al, szoiubilis FasE-el vagy anti-Fas CH1 l-jelü mAb-vai, ó őrá hosszáig. Sejtek életképességéi: ATFLlte-vel határoztuk meg. Az eredményeikét áí1ag±S£M-kéüí mutatjuk be tápközeget tartalmazó kontrolihoz viszonyítva. Normái hepatodlákra hemutatott, átlag+SEM értékek négy egyénből származtak. ílepaíoeelluláris kareinömá-sejtekre és 14épö2-sejfekre kapott eredsitények egy páciensből szármázlak, három párhuzamos: tenyészet átlagát mutatjuk be,
H. ábra, TRA1L hepatitiszt indukál Bó-egerekef mtrávéhásab öltoííunk l:86píuadeno vírus-vektorral, ami teljes hosszúságú, humán TRAíL-í kódoH ..Tet-on” transzkripciós elem szaiuíh'záso alatt, TRAíL-expressziót á megjelölt dózisé tetraeiRlinael fedukáítunk. (a) Májban indukálódott, humán 'TRÁlL-éxpressziő Northern-blot analízise:. A vektorral való beoltás és tetraeikltnuei való indukció után.24 órával Össz-RRS-t izoláltunk: a májakból, és próbaként humán TRAlL-t kódúin cDHS-t vagy β-akíint alkairnazíursk. íb) ÁST mennyiségei szérumban, TRAIL-ét való iranszdukcsó után 24 órával meghatároztuk az: AST mennyiségét széítimban. (c) Adersövírus-vektorral fertőzőit hepstocíták TRAlT.-tnediáif sejtpusztulása: Bő-egereket intravénásán oltottmík tstraeiklmnel indukálható adenovfrusvektorral, A beoltás után 48 órával a. beoltott és nem~nltott, kontroll egerekből hepatocitákat izoláltunk, és a. megjelölt koneentrácíójú TRAlt-el luki báláik 8 óra hosszáig (hal panel). Hepatoeifa-sejfek életképességét ÁTPLhe vizsgálati eljárással határoztuk meg. A fentebb leírtak szerint, adenovirus- vek torral oltott egerekbe intravénásán injektáltunk 18 pg szolubibs humán TRAlL-t 48 órával később. AST mennyiségeit szérumban 24 órával a TRAlL-lnjekció tiíáít mértük (jobb panel):. <d és e) TRÁIL-el indukált májkárosodás hisztológiai analízise, A májakat eiíávolitottuk 24 órával (d) vagy 7 nappal (ej TRAíL-el való tmnszdukeió után:. A parafTsa-snetszéíekeí HAB-vel festettük, és 1Ö0X (felső panel) vagy 4Ö8X (alsó panel) nagyítva fényképeztük.
Á 14. ábrán látható görbe-sorozaton bemutatjuk, hogy humán PBMC-ből tisztiíoíi, aktivált T-seltek és B-sejtek megnövekedeíf mennyiségű DRS-üt expresszálnak, áramlási eitometriával meghatározva nyugvó (üres) és aktíváit (satírozott) sejtekre,
A 15, ábrán látható görbén bemutatjuk az életképességet TRA-S-koncentráció függvényében a 14. ábrán bemutatott, tisztított T-sejtekre és B-sejtekre, amelyeket 48 óra hosszáig strmnláittmk aoti-CDLal vagy aníi-p-vel, aktivált és hlaszt-sejtekkei, amelyeket különböző Eieoll-Papne sűrűségnél különítettünk el. Az életképességet ATPLsfe vizsgálati eljárás alkalmazásával határoztuk meg.
A lő. ábrán látható bisztogramon és áramlási eitometriás görbén bemutatunk CD3-expressziót „kapuzott” Hmfoeita populációban, NK-sejlekben kimerített NOD/S€ID~egerek esetén, amelyeket humán PBMC-vel és TRA-S-a! vagy IgG-vei (kontroll) ol-oríunk.
A 17. ábrán laíhafő celluláris mikrofeivételéken bemutatunk GD3- és TDMEL-iestefí egérlép-szövetet, a 13, példában részletesen kinek szerint.
A 18, ábrán bemutatunk éhoíoxicltási görbéket krónikus hraíolsííkus leukémia-sejtekre (CCE) és bonnál humán B-sejtekre TRA-8, BISVBl és kombinációik jelenlétében,
A 19.a ábra, 2E12 specifikus kötődése DR4-hez; BLföA-táfcákaí burkoltunk humán ÍRAlk-receptor szohibilis formájából és humán IgGl-Fe-ből álló fúziós fehérjével a megjelöltek szerint, és á bemutatott koneentídciójá 2El2-jelü mAb-vei mkubálíak, azután BRP-konjugált anii-egér (gGf-cf inkubáltuk, A reakciót TMB-szubsztráttal hívtuk elő, és az. OD-érfékeket 45íbő58 nm-en olvastuk le.
A 18,b ábra. 2E12 sejtfelszíni DR4-étkőt. Cós-7-sejtekeí írsmszfekiáltunk a teljes hoszszúságú. DR4-et kódoló eöNS-í tartalmazó vektorral (satírozod hisztogram) vagy kontroli vektorral (üres hisztogram). A transzfektált sejteket megfestettük 18 pg/ml 2E1:2-vel és PE-konjugált antl-egérTgöl-el, A sejteket áramlási cstometríávsi analizáltuk,
A :18,e ábra. 2E12 apoptózis-indukáló aktivitása, Humán Rumos B-limf'óma-sejtekeí inkubáltunk egy éjszakát! át a megjelölt koncentrációjú 2E 12-vel eljárással határoztuk .meg, (<ί) 2E12· pg/ml anti-egér-lgö í jelenlétében. Sejtek életképességét ATPLite vizsgálati vei indukált kaszpáz-aktiválódás Rumos-sejteket 2R 12-vel és auti-egér-lgG
-8eilsnanyaggai kezeltünk a megjelölt időpontokba®. Kaszpáz-aktiválósiást és EARP-hasífást westcm-blot analízissel határozttink meg, specifikusanti-kaszpáz: vagy PARP-ra specifikus elieoanysgokkaL
A 20, ábra, 2E12 és adriamícín hatása rnellrák-xenogfafiökaí hordozó, atimtás (psecsemőmíríggyd nem rendelkező) egerekben. 2LMP-sejfékét (3 x 19z) injektáltunk szubkután atúnlás, csupasz egerekbe a 0. sápon. Kél:
csoport egeret miraporitoneáhsan injektáltunk 20Ö pg: 2Ef2--vel a. 7., 19., 14,, 17., 21. és 24, napon. Két csoport egér adrl&mlcint kapott i.v. (6 mg/kg) 8· 8„ 12. és 1b. napon. Egy csoport egér nei® kapott ellenanyagot. Az adatokat az átlagos íamtsrméret változásaként fejeztük a 7,napon tóért értékhez viszonyítva (a - 8 egér/csoport).
A 21, ábra. TRA-S, .2812 és adríamicin hatása ínehrtík-xesograRokaf hordozó, atkniás (csecsemőmiriggyel nern rendelkező) égerekben. 2EMP-sejíeket <3 x iö'') ínjektálttsnk szubkötá® aiínuás, csupasz egerekbe a 0. napon. Két csoport egeret: intraperítoneálísan injektáltunk 290 pg TRA~8-st és 2B12-v$l a 1Ö.S 14., 17., 21. és 24. napon. Két csoport egér adfiamícíöf kapott I.v. (6 isg/Rg) a 8., 12. és lő. napó®. Egy csoport egér nem kapott ellenanyagot. Az adatokat az átlagos fnrsrorméret változásaként föjeztök a 7. napon tűért értékhez viszonyítva (n:::8 egértksoport).
Sejtpusztelás elmaradásának oka az apoptózist indukáló rendszer elégtelensége, amelyek például a figandnrn, a receptor, vagy az. Inlraec i lu láris szabályozó ós efícktor mokka iák expressziójának vagy lünké tójának bizonyos hibái val társultak. A találmány szerinti eljárással lehetővé válik elégtelenül működő apoptózist indukáló rendszer kijavítása, valamint adott, elégtelen apoptózist indukáló rendszerben lévő speciális hibák felderítése.
A leírás tárgyát képezi új monokiosális ellenanyagokat tartalmazó osztályok, amelyek i« vivő és m vure szelektív apoptózist indukáló aktivitással rendelkeznek specifikus TR/klL-recepwrok, például DRS, DR4, DcRl és DcR2 ellen. A leírás szerinti ellenanyagok tehát specifikusan képesek kötni a rRAlL-roeeptorok közül egyet. A „szelektív kötés” vagy „szelektív felismerés” kifejezéseken a leírásban azt értjük, hogy az ellenanyag csak egy TRAfLreceptort köt, és kismértékben vagy egyáltalán ne:m köt más típusú í'RAfL-recepiort, hagyomásryos western-blot analízis alkalmazásával kimutatva. Egy, iaiáhnány szerinti DRS-elíenanyag URS-öt szelektíven köt, .és DR4, DcRl vagy DcR2 esetében nem köt a báltér körülbelül RS-szerese föleit, Ehhez hasonlóan, a találmány szerinti DR4eílenanyag DR4-et szelektíven köt, és DR5, DcRl vagy DcR2 esete® nem köt háttér körülbelül 1,5-szerese felett A ta25 láimány szerinti ellenanyagok reagensként alkalmazhatók apoptózis-jeltovábblíás kihatásában, valamint terápiásán hatékony TRAtL-receptorökaí csprésszálő sejtekkel szemben, például Igen sokfele rákos sejt, rendellenesen szabályzót! apoptózls-rendszert. tartalmazó sejtek, aktivált limibeíták vagy más aktívák immunsejtek (például íimibib sejtek és mleloid sejtek), vlroslertőzöt! sejtek, és autoimmun betegségekben előforduló, abnormálisán prollféráló szdnoviáíls sejtek (például reumátoíd artritisz állal érintett szinoviáüs sejtek, például gyulladásos szmoviális sejtek, aktivált fontold és mieloíd sejtek a szinoviomban, makrofag-szsrü szinoviociták és dbroblaszt-szerű szlnövíocnák) ellen, A találmány szerinti ellenanyagok konkrét TRzklL-receptortfposok kötésére specifikusuk· a köztük lévé homológia ellenére. A találmány szerinti ellenanyagok csak olyan sejtek célzott apopfózssál teszik lehetővé, amelyek eéi-TRAIL-reeeptort expresszálnak, vagy alternatív módon, cél-receptort expresszáló sejtek 'rRAlí..-apoptözísát blokkolják.
A. találmány szerinti f)Rő-jeíü rnonoklosális ellenanyag és DR4-jelö mo-mklönális ellenanyag potenciális apoptózist indukáló anyagként szolgál DR5~ vagy ÖR4-exptesszáló sejtekben, sorrendbe®, ó? wíto. és potenciális apoptózist indukáló anyagként rn vivő. Humanizált ellenanyag-vázakha átülíetett humanizált részleges CDRszekvenciák és a találmány szerinti DR5- vagy DRd-elieoanyagot tartalmazó fúziós fehérjék hasonló apopfofikas tulajdonságokat mutatnak.
Jelenleg nem áll rendelkezésre olyan monok tonális ellenanyag, atnely sejtfelszíni DR5-höz kötődik, és amely még alacsony koncentrációk esetén is DR5-ö; expresszáló sejtek apoptóztsáí indukálja mind ín viíre, mind in vívó,
-9kereszíköíö lisker nélkül. A találmány tárgyát képezi ORÓ-ellenanyag, amely terápiás ágensként kdlösíéíe betegségek kezelésében hatásos. Sár kimutatták,, hegy szolnbiíis TRAÍL hatásos volt mmorsojtek apoptözlsának fndukálásában is vivő, az ölö-aktivitás «ágyon kismértékűnek tóin hagy és ismételt dózisokban, amire gyakran szükség volt (13), A találmány tárgyát képezi tisztított ellénanyag, amely BR5-jeKl TRAft-receptort képes kötni, áhot az említett ellenanyag szolnbtlis formája alacsony koncentrációban apcpíözist indukáló aktivitású ÖRŐ-öí expresszálé célsepefcre ár vivő és i« vidu A tisztított ellenanyag DRS-jelö TRAIL-reeepíort ebetianyag keresztkötése nélkül képes kötni. Az ellenanyag előnyösen nem indukál jelentős mértékű apoptózist normát fibrobiaszS-sejfekben. Az apoptözist indukáló aktivitást előnyösen a célsejtek 60%-nák 50%-nái, 40%-nál, 36%-nál, 2ö°ze~náí, 10%-náf á%~nál kisebb mériékö, vagy a megadott értékek között bármilyen mértékű életképessége jellemzi ö,i, 1, 5, lő vagy' 20 ug/ml-aéi alacsonyabb «lleoshyag-koneehtráciö esetén, vagy a megadott értékek között bármilyen: ehettanyag-konesstrádónál. A tisztított ellenanyag specifikusan képes DR5-jelü TRAlL-reeeptort kötni, és nem köt DR4-, DcRl- vagy BeR2-jeKi TRAlL-reeeptorokaí rutin westem-blot analízisben kimutatva. Az ellenanyag olyan monoklonális: ellenanyag, amely ugyanolyan epitóp-speciflíással rendelkezik, mint az ATCC-ben R'FA-1428 számon nyilvántartod, TRA-d-jelü egér-egér hibridóma,
TRA-h, amely a ialálínány szerinti DRá-eHenanyagok egyike, gyógyászatilag hatásos humán DRS-íranszgént f5 tartalmazó állatokban, és alkalmas modell kidolgozására DR5 és TRAÍL szerepének vizsgálata céljából.
A találmány tárgyát olyan ellenanyagok képezik, amelyek apoptözist indukálnak keresztkötés hiányában. Például a DR5-eílenanyag (például TRA-8) apoptözist indukál keresztkötés nélkül. A „keresztkötés kifejezésen értjük például egy szekunder ellenanyag keresztkötését. A találmány más előnyös megvalósítási módjai szerint, a találmány tárgyát olyan ellenanyagok képezik, amelyek apoptözist indukálnak: keresztkötés jelenlétében, előnyösen ilyen például a DR4~ ellenanyag (2 E12).
Tehát a találmány tárgyát képezi tisztított ellenanyag, amely specifikusán képes DRá-jelő TRAÍL -receptort kötni, ahol az említett ellenanyag szolubílis formájában in ívvo és in váró spóptözist indukáld aktivitású DR4-et expresszáíó célsejtekben. Az ellenanyag olyan monoklonális ellenanyag, amely ugyanolyan epitóp-speeiíhással rendelkezik, mint az ATCC-beö PTA-379& számon nyilvántartott, 2E 12-jeln mbridómn, amelyet 2Ő01. október 24~éh az „BÁB Research Foasdatioh” megbízásából „humán DR4-re specifikus, 2El2~jelü hibridóma klón jelöléssel deponáltak. 2E32, a DRd-elfenanyág-scírözat egyik tagja, gyógyászatdag aktív tumor méretének csökkentésében kezeletlen kontroll állatokhoz képest vagy a ötmor kezelés előtti méretéhez képest DR4 -et expreszszáló rákos állatokban f« vöm.
DR5~ellenanyag hatásos szobbilfs tormában, Ms domddsa»;: kis dózisokon vagy koncemráelön kevesebb mint körül balul 0,t)l és körölbelsl 1 pg/ml közötti dózist vagy koncentrációt értünk ;« vőro, és kőrölbeiüt 1-16 mg/kg-nál ktsefeh dózist vagy koncentrációt értőnk in vivő, A találmány szerinti ellenanyagok előnyös tulajdonsága, hogy szelektív módon indukálnak apoptözist DRS-öt expresszálo sejtekben, anélkül, hogy apopíözssí: indukálnának normái,, nem aktivált, imnszformálaífen hepatocitákhan, fibrociíákban, szinovioeitákban, stb. A találmány szerinti ellenanyagot, olyan TRÁiL-receptor ellen íetmdlehök, amelyet egy kísérleti állatból különítettünk el a találmány szerinti eljárással, de ellenanyag termeltetésére vagy szintézisre szolgáló, bármilyen szakember számára ismert eljárás alkalmazható. A találmány szerinti ellenanyag humanizálásával, amelynek célja a reeepíorkötő aktivitás fenntartása, miközben csökkentett és terápiásán tolerálható immunválasz alakul ki egy humán alanyban, a találmány szerinti, humanizált atrtiTRAlE-recéptör ellenanyagot terápiás agonisíakent vagy auíagonistaként alkalmazzuk adott TRAIL-receptorra. A találmány szerinti ellenanyag hatásosan alkalmazható in vivő terápiás szerként, mivel az. antl-TRAlL-receptor ellenanyag másodlagos kereszíköíéséfe adott esetben nincsen szükség.
- 10A találmány szerinti megoldás iüteutet egyetlen aníi-TRÁll-receptor ellenanyagon, amely agonista vagy mtíagóinsta apoptpítkus hatásokat képes kifejtet. Inkább artöl van sasé,, hogy kér vagy több autl-TSAIL-receptor ellenanyagot érlmkezíetöttk sejítenyészertei in vitre vagy egy alany testszövetével m vivő javított kezelés céljából .Javított kezelésen bánnihen add-ftv. s/naugtkns vagy erösüo hatás értendő Például l'87-jelu gltótna-seifvysul és
119.37- és Molt-4-jelű hemaíöpoetikus sejtvonalak reszponzfvak agonista anti-URd- és apií-DKó-ellenanyagok szinergikus hatására, miközben agonista DRS-elfenanyag hatása egyedöl 'alkalmazva csak korlátozottan sikeres apoptözis ítidokálssábaa.
Továbbá, antagooisía auft-TRAll,-meeptor ellenanyagok különösen akkor alkalmasak, ha egy ellenanyag DcRI, .DcR2 vagy OPG közöl az egyik „csati” récéikor kötésére specifikus. „Csalt” receptor találmány szerinti ellenanyaggal
1(1 való szelektív blokkolása „csalt” receptorokat exprésszáló sejttípusokon fejti ki hatását ügy, hogy eltolta TRAIL kötési egyensúlyát olyan: TRAlt-receptorok irányúba, amelyek apöptózís-sziguál továbbítására képesek. Tehát egy másik, kombinált terápiában egy „csali” receptort kötni képes ellenanyag szenzibiltzál egy expresszáló sejtet agonista apoptózis-szignáíi továbbítani képes 1RAiL-receptor általi kötés hányába.
Á találmány további előnyős megvalósítást tnödia szerint, a találmány tárgyát képezi egy eljárás, amelyben adott
TkAlL-receptor agonista és antagonista epitopjait felderítjük. t ovábbá, polimorfizmusokat találtunk adott TKA1Lreeeptorral asszociált egyedikben, olyan monofclonábs ellenanyagokból álló panel alkalmazásával, amelyekben az egyes ellenanyagok különböző variábilis vagy CDR-régtóval rendelkeznek. Monoklonális ellenanyagokat tartalmazó, jellemzett pattéi hiztosfija, hogy inéghatározhassank agonista és antagonista epitópokat és polimorfizmusokat. Tehát, a találmány szerinti mopoklonális ellenanyagokból álló panel drog (gyógyszer-hatóanyag) keresésére és/vagy egy alany betegségre való hajlamának szkríoelésére alkalmas.
Egy további megvalósítási utódot képeznek sz olyan ftiziös fehérjék, amelyek TRAIL-receptor anttgentkus fr&gmenséí tartalmazzák egy imjmmglobalin-fehériéhez, jmbpeptídfeez vagy ennek részletéhez kapcsolva. Definíció szerint, TRAlt-receptor tragmense elegendő számú antinosavat tartalmaz: ahhoz, hogy Immunválasz alakuljon ki egy alanyban sejlfeiszioen expresszálődott, natív TRAü..-receptorral szemben, A fúzióban TRAil-receptor íragmense legalább tíz aminosava; tartalmaz. A fúziós feltérje által tartalmazott immanglöboimt vagy ffagmensét a leírásban úgy definiáljuk, hogy olyan natív vagy szintetikus fehérje vagy poiipeptíd-szegmeus, amely elegendő számú amtnosavat tartalmaz ahhoz, bogy egy alanyban tmmuo-kuszkadot indítson cl. Immtmogéu anyag lehet TRAÍL-reeeptör fragrnensét egy' immnugiobniíp-fragmensheK kapcsolva tartalmazó fúzió, amelyet í« vivő terápiás anyagként lehet alkalmazni aafiTSAH.-receptor ellenanyag ó? s/fir fenneltetésére egy alanyban.
Bemutatunk egy eljárást apopíózis szelektív hrönkálásárs célsejtekben, amelyben a célsejteket expresszálhatő TRAlL-reeepturt kódoló tmklehíSávszekvenelát tartalmazó vektorral iranszfekfáilnk; a TRAÍL-reeeptör nuklemsavszekvenciája által kódolt TRÁÍL-recepíorí expresszáíjok a síiteken; és a sejteket apopfózis-irsdusáló ellenanyaggal érintkezíesjük, amely TRÁÍL-reeeptor kötésére szelektív. Génterápiás vonatkozásban, célsejteket olyan vektorral transzfektálank, amelyek TRAÍL-receptomak tnegfeleló expresszálhaío szekvenciái tartalmaznak, amely vektor általánosan ismert, és amelyet az. alapján választunk ki, hogy a célsejt érzékeny legyen a vektorra. Génterápiás vektorként alkalmazhatunk példáttl adenovirusf, p.AöCMV5~t< fb a célsejtek vagy eélszövei a transzfektálí TRAÍEreeeptort expresszálja, a sejteket vagy szövetet érbtksztetjífk a találmány szerinti egyik eílenany aggal, amely a iranszfektált TRÁIL-meeptor kötésére specifikus, Nyilvánuló, hogy az anti-TRAlL-receptor éllersmyag lehet agonista vagy antagonista, a kívánt terápiás eredménnyel összhangban.,
- ll A találmány szedni! ellenanyagokat. szercdhíiizátörral együtt ts lehet alkalmazni. Szeözibiiizátoron a leírásban bármilyen olyan síimuiost értünk, amely íipopíözisi képes hídukálni. például ultraibolya fény, szerves molekulák, konfcrétsn például bísz-indokmabííuidek osztálya, nehézfémek és szabad gyökük.
Rákierápiáva! összefüggésben TRÁ-8 kaszpáz-íuggő módon képes apopiózist indukálni a legtöbb TRAH..5 szenziíív óunorsejtben, másodlagos kereszikötés nélkül. TRÁ-8 vagy 2.BI2 egymagában vagy kombinációban más ellwtnyagekkal erős tummícid-aktl:vitással rendelkezik m tao. Az, hogy TRÁ-8 vagy 2E12 a legtöbb TRAlL-szenziiiv sejtben apoptózisr képes indukálni, alátámasztja, begy 1)R5 vagy BR4 önmagában elég apöptózis kiváltásához. A leírásban részletesen ismertetett tumorsejtek nagy része sejtfelszíni DR5~öí expresszál, és TRA-8-indukált sejipusztulásra mulatott éizekenysvgük párhuzamban van TRAII -re való e-zekenységukkel, arat azt n tit.Hu. hogy OR5 h FRAΠ ΙΟ médiáit apöptózis egy elsődleges „halár-receptora a legtöbb mmorsejtben. Hasonló eredményeket kaptunk DR4-re specifikus ellebányagokfeál (például 2B12-vel). Tehát DR5 vagy BR4 eltérő mértékű expresszíőja normál és rákos sejtekben TRAlL-tnediáll apöptózis szelektivitását biztosítja. TRA-8 elkerüli a „csali” receptorokat TRAlk-mediáh apöptózis iödukálásákor, TSAíL-Fezíszíens tumorsejtekúek esak kisebb része érzékeny TRA-S-ra, ami azonban azt mutatja, hogy nem a „csali” receptorok játsszák a legjelentősebb szerepei itnnorssjiek rezisztenciájában TR AlL-mediák apopidzissal szemben.
Bár régebben végzett kísérletekben kimutatták, hogy TR.AR, szolubilis tormájának szisztémás beadása állatokban nem indukál lutnorregresszíét toxíeltás'Axj: kialakulása rtélkíll, humán TRAii.. membrán-kötött formája májkárosodást indukál egerekben, a leírásban ismertetettek szerint. Azonban TRAít májra kifejlett: toxteitása sokkal kevésbé erőteljes, mini Tas-lígandtmt toxicitása. amire az. utal, hogy normál hepaiociták kevésbé érzékenyek FRAR.-in20 dukált elváltozásokra fas-lígartdumhoz képest, és T&Aik nem Ictálís m vivő. Tehát TRAit bírálása rákterápiában alkalmazható.
A leírásban részletesen ísmértetétfck szerint, kimutattuk, hogy nótánál hepatociíák nem expresszáinak jelentős mértékben D85-fehérjél, és ez a hepaíoeita rezisztenciájával asszociált TRA-S-indukálí apöptózissal szemben. DR5 keresztkötése monokionáiis ellenanyaggal nem elég a ,.halár-receptor hömopöifeer formáinak kialafcííásárá, amely apöptbzisi képes elindítani. Sefysnmmjmokon végzett kísérletek azt mutálják, hogy TRA-8 beadása májra nem toxikus. Tehát egy agonista monokionáiis ÖR5-ekenanyag valoszmöieg szelektívebb és biztonságosabb terápiás ágensként. mint szolubüis TRA1L, Ehhez hasonlóan, DR4»et transzformált vagy aktivált sejtek expresszáinak, viszont normál sejtek, például fíbmblasztok nem exptcszszáiuak számottevő mennyiségben, vagy' normál sejteknél csak jóval kisebb mennyiségben. A találmány szerint! DR4-re specifikus ellenanyagok bizonyos célsejtek: apoptózisát indukálják nem30 célsejtek, például bbrobiasztok, stb, számottevő mérték» sejtposzmifea nélkül, A leírásban egy hatás hiánya, vagy számottevő vagy jelentős hatás hiánya arra utál, hogy a hatás teljes mértékben hiányzik, vagy egy hatás mértéke kisebb vagy egyenlő a báltér vagy kontroll szintékkel, és nem haladja meg a háttér vagy kontroll szintékét a háttér vagy kontroll szintjének több, mint .1,5-szeresévei.
A találmány szerinti megoldás szkríneiő vizsgálati eljárásként vagy leképezd eszközként jól alkalmazható olyan kis DR4- vagy DRS-sejikiaszie.rek detektálására, amelyék még muíalhatnak normál sejtmoribiógiál, Például humán rákos sejteket, például tüdő-, prosztáta- és májrákból származó sejteket íaríaknazó metszetek ó; vi.m festésével a találmány szerinti, jelölt ellenanyagok alkalmazásával könnyen azonosíthatók rákos sejtek. A találmány szerinti ellen·· anyagok más beteg ntanífeszlációk. például különböző gyulladásos és autoimmun betegségek, például reumaioid artrítisz szbínelésére is alkahnazháíók. ilyen szkrinelés még a többi klinikai tünet kialakulása előd hasznos lehel, és olyan alanyok kiszűrésére lehet alkalmazm, akikben fennáll, a betegség kockázata, így prpfdáktiktss kezelést lobét kezdeni más dinetek vagy szímptómák megjelenése elölt. Ronkféum megfigyelőik. hogy rákos sejtek DR5-öt nagyon nagymértékben expresszáltak ugyanilyen típusú normál sejtekhez képest, A teirás szerinti megoldás tehát érzékeny szkrlnelési eljárásként a&altnazhatö szövetbe»., legalább tüdőben, prosztatában, vastagbélben, vérben, méhnyakön, mellben és májban eíői&rdulö, isailgnns (rosszijtduíató) daganatok korai stádiumában. A leírásban részletesen ismertetett terápiás eljárás többek között, például :malfgnus rákbetegségekkel és iim&bkns leukémiákkal asszociált, abnormális sejtprolíferáció gátlására alkalmas,
A ttdáhnányi leírásban részletesen ismertetőnk egy aaü-bumán-ÖRS monokíonáíis ellenanyagot, amelyet TRAk-ként jelölőnk, és amelynek A'íCC nyilvántartási száma ΡΎΑ-1428, A találmány szerinti megoldás részletes leírása tehát apspíózist indukálni képes, humán í>R4~re specifikus ellenanyagra vonatkozik. Az ellenanyag ugyanolyan epltájv speóibtássái rendelkezik, mint a 2E12-jelti híbrídóma, amelyet 2ÖŐ1. október 24-én deponáltak az „HAB Research Poundatieií' megbízásából az „American Type Calfure Colieeíion”-nái (Roekvilfe,, Md,), nyilvántartásba vétel céljából. A deponált anyag leírása „humán DR4-te specifikus, 2B12~jelíi bfbridöma-kíón’k a törzs jelölése 2E12, a PCTAJSÖ1/14151. számú nemzetközi közzétételi iratra hivatkozva. Egy apoplózís-rsceplör, példáid Fás expressziöjának mértéke nincsen szüikségszerően összefüggésben a sejtek apoptózlsrá való hajlamával. TRÁlL-mediálí apoptózis esetében feiiételözzük, hogy TRAlbmek megfelelő ..esali” reeeptorök expresszálása befolyásolja a sejtek hajlamát. Továbbá azt is féitéfelezzSk, hogy DRd-nek DR4-gyel asszociáltunk lennie az apoptózis-szignál hatékony továbbításához: PÁDB- és k&szpáz-k-íöíyanmtsoron keresztül. Az, hogy agonisla monokionálií? anti-DRfeebenanyag rendelkezésre áll, lehetővé telte DRő-jeltovabbítás szabályozásának, és TRAJL-mediáR apoptőzishao betöltött relatív szerepének elemzését, A sejtek TRA--S-meáiáli apoptózlsrá való érzékenységének és l'RÁIL-mediáh apoptózlsrá való érzékenységének összehasonlítása betekintést nyújt DR5 TRAÍL-meöiált apoptézisban játszóit szerepére, és azokra a mechanizmusokra, amelyek befolyásolhatják az érzékenységet. Hasonló előnyöket biztosit a DR4~elIenanyag is.
Ez az előny általában vonatkozik a találmány szerinti, humanizál! DR.S- és i>R4~ellenanyagokra. Példán! DR5ellenanyag meiektdáris klórját előállíthatják ismert technikák alkalmazásával, amelyeket az alábbi példákban részletesen leírunk. Rakombináns DNS-módszereket (33) lehet alkalmazni olyan nukleinsavszekvcnciák előállítása céljából, amelyek monokionális elíénanyag-moiekniáf. vagy autigénköiS régióját kódolják.
A találmány szerinti megoldás lehetővé teszi olyan humanizált, TRAÍL-receptorra specifikus ellenanyagok előállítását, amelyek valósztoöieg nem indukálaak humán, antl-egér ellenanyag-választ (a továbbiakban „MAMA'’) (341 miközben megtartják itatásos edlenanyag-eífektor Rmkciójúkaí, Teljesen humán ellenanyagokat is elő isiiét állítani Olyan egerek immunizálásával, amelyek (például genetikailag komán ellenanyagok termelésére módosított egerek) képesek. teljesen .humán ellenanyaga? termUm. HR^-ot vagy DK4-ct kötői képes klánokat v/kríneinnk, amelyekből származó .ellenanyagok apopiózíst képesek indukálni, és kempeíicióba képesek lépni TRA-8- vagy 2Ei2-epitépokérí. Lásd például Lonherg és Huszár, int. Rév. immunoi. 13, óS-93 (1995),. A leírásban a „humán” és „humanizál?” kifejezések ellenanyagok vonatkozásában bármilyen olyan ellenanyagra vonatkoznak, amelyek, terápiában alkalmazva várhatóan tolerálható, gyenge immunválaszt váltanak ki egy emberi atayfeaa.
A találmány tárgyát képezi: HRő-elienanyag, humanizált aníi-ÖRS-ellenanyag, TRA-S nehéz és könnyű láncát tartalmazó immunglobulinok, valamint humanizált nehéz és könnyű láncát tartalmazó immunglobulinok, Szintéit a találmány tárgyát képezi DR4~el!enanyag, humanizál: ÖR4-ellena»yag, ORd-ellenanyag nehéz és könnyű láncát tartalmazó immnnglohtsimok, valamint humanizált nehéz és könnyű láncát, tartalmazó immdnglobuhhoks az éílenanyagókat és sebez és köanyó láncokat kódoló nuhtón»avak, a nuklernsavakat tartalmazó vektorok, és a vektorokat íartshnnzö sejtek. Ezeknek a fehérjéknek vagy géneknek bizonyos rSvidhctt változatai ellátják a teljes szekvenciával rendelkező fehérje vagy gén szabályozó vagy enzimes funkcióit. Például az ilyeneket kódoló nukleinsavszekveaetákat meg lehet változtatni sznhszfiidciókkaí, addiesókktd, deléciókkal vagy muhimer expressziővsi:, amely funkcionálisan • 13ekvivalens fehérjéket vagy géneket biztosit, A kódoló nukteinsavszekvendák degeneráitsága miatt olyan más szekvenciákat is lehet alkalmazni a találmány szerinti megoldásban, «melyek lényegében ugyanazt az ammesavszekvenciát kódolják, aaat amelyek a természetesen előforduló fehérjéket, Ezek tehetnek például olyan nukleinsavszekvencláL amelyek a fentebb leirt pobpeptideket kódoló nukleinsavszekveneiák egészét vagy részleteit
5' tartalmazzák, olyanok, amelyeket különféle olyan kódosok szdbsztitöeiójával megváltozíatíunk, amelyek a székveneiában hmkcioaáitsan. ekvivalens ammosavat kódolnak, így ez néma változtatási eredményezett, Nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti bnmnoglssbalh nukteotidszekvenelája akár 25% homólógia-varltátt is tolerál a szekvesciáhsm, standard eljárásokkal kiszámítva i.Aurrent .Methods ín Sequence Comparlsen and Analysis, Macromoteesle Seqncneing and Synthesis, Seleeted Metbods and Application’', Alatt Ft Láss, Inc. 127-149. old, (1W)j, mindaddig, amíg ilyen variáns működőképes ellenanyagot alakit ki, amely képes DR5-jelű TRAÍL-receptort felismerni. Például egy polipepad-szekvenetában egy vagy több aminosavat sznbsztitttálnt lehet hasonló polaritást), más atniuosavval, amely funkcionális ekvivalensként viselkedik, amelynek eredménye néma változtatás, A szekvenciában helyettesítő aminosavat az adott osztály tsás tagjai közül lehet válaszááts. amely osztályhoz az aminosav tartozik (azaz konzervatív szubsztitúció történik), Például, «poláros (hidrofób) amínosavak lehetnek alaniu, fenéin, izefeuein, vaiin, prolin, ieniiaianin, tripíolan és mebonln. Poláros semleges atmaosavak lehetnek gltels, szerin, treonln, ciszteln, íirozin, aszparagin és glnfamis. Pozitív töltésű (bázíkus) amlnosavak lehetnek arginin, llzin és hisztidin. Negatív töltésű (savas) amlnosavak tehetnek aszparagihsav és glutaminsav. A. leírás tárgya olyan lekérjék vagy fragmsnseik vagy származékaik is, amelyeket külön léteképpen tnódosiíottunk á transzláció alatt: vagy' után, például gllkoziiáelóvak proleoliííkus hasítással, eltenanyag-motekuláboz vagy más ecHuiárfe Ugandámhoz való kapcsolással, stb. Továbbá, a találmány sze20 rhsti ellenanyagokat kódoló uakleinsavszekvenelákat tartalmazó, rekombináns vektort ügy tehet tervezni, hogy módosuljon a vektor processzálása vagy expressziöja. Más módosításekat is tehet végem a nttktemsav-vagy arninosavszekvenciában anélkül, hogy csökkenne vagy lényegi módon csökkenne az ellenanyag apoptózis-aktivltása. Ilyen módosításokat: lehet tenni a CW-ekhen vagy nem CDR-regsőkban szakember szántása rutin technikák alkalmazásával. Lásd például Yang és munkatársai, X .Moh Bioi. 254.3S2-4Ö3 (1995).
Továbbá, inhibitort kódoló hukteinsavszekvenclát in vtiva vagy in vivő mutációnak lehet alávetni transzlációs tnieiádós és/vagy rermmáeios szekvenciák klalakitása és/vagy megszüntetése, vagy a kódoló régiókban variációk kialakítása,, é? vagy uj reshikems endomikkaz hustmhelyek kudakítasa vagy az előzetesen lete/ó dyen helyek megszüntetése céljából, megkönynyitvv így a további h; viiro módosítást. Bármilyen szakember által ismert technika aíkainrazhaiö, például ?« víiro hely-sp« íbkns. muíagenezis, í.í. Bioi. Chem. 253, 65511. Tab-hnkerek alkalmazása t Pharmacia) és hasonlók,
Rőntgen-krisztallográfiás adatok azt mutatják, hogy az ellenanyag-immnnghfenFm kialakult konforrnáciőja általában hosszú hengeres struktúrát: alkot, amely két antiparallel béta-lemezt tartalmaz, melyek mindegyike három vágynégy béta-láncból áll. Variábilis: régióban, a FI- és L-iáncok egyes V-dcaaéjyei&öl három hurok együtt anílgénkSíő helyet alakit ki. Minden hurok komplemersterhást meghatározó régióban (CDR) végződik. A CDR-ek a legvariáhilissh35 bak az ellenanyag sobnossv-szekvenciájában. A variábilis régió olyan részleteit, amelyek a CDR részei, „vázrégiók’nak nevezzük (FF-régiók), és ezek általában a CDR-struktúra fenntartásában játszanak szerepet. Előnyösen egy adott ellenanyag valamennyi CÖR-jét beültetjük egy akcepíoteeliettattyagba altból a célból, hogy megőrizzük a TRAIireeeptor epitóprsgiójára speedtkus kötőhelyet. Nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti megoldásban az öszszes CDR egy részletét is beültethetjük egy donorba. Nyilvánvaló, hogy a beültetés általában helyettesítést jelent, egy csoport cseréjét egy másikra, vagy egy aminosav vagy régió cseréjét egy másikra. Azonban esetenként, különösen régió
-1410 átvitelénél egy vagy több aminosavaí hozzáadhatunk, vagy kihagyhatunk, vagy helyettesíthetünk kívánt módén, és ilyen deléeiók vagy inszereíok, valamint alkalmas cserék és inverziók szakember számára ismertek.
A. találmány szerinti elleuauyagho?, például ágy intünk, hogy anti-'fRAil.,-receptor monoklonáiis ellenanyag Lláneának és. H-láncának megfeleld alegységében az egyes CDR-eksí humán ellenanyag megfelelő CDR-régiójába ültetjük, ezzel TRAlL-réceptor ellen alkalmazható, egéreredetümottoklonális ellenanyagot humanizálunk.
Olyan eilenanyagöfagmensekeí, amelyek a molekula idíotípusát tartalmazzák, szinten elő lehet állítani ismert technikák alkalmazásával, és működőképesek a találmány szerinti eljárásban. Ilyen fragmens lehet például sz autiTRAIL-fseeptsr (AB’)2-íragmense, amelyet az ellenanyag-molekula pepszines emésztésével lehet előállítani, a TR,AIL-receptorra specifikus ellenanyag (AB’)-fragmenseÍ, amelyeket a TRAIL-reeqstona specifikus ellenanyagböí származó (AB’)2-fbagmensekben lévő diszulfíd-hidák redukciójával lehet elöállitoui, és olyan efaanyag-fragmeűsek, amelyeket az ellenanyag-molekttla papainos emésztésével és redukáló ágenst alkalmazó kezelésével lehet előállítani.
A találmány szerinti ellenanyagokat elő lehet állítani számos, szákember számára ismert technika alkalmazásával. Például a TRA-k-jelü, anti-GR5 monoklonáiis ellenanyaghoz egy hlbridőuta tenyésztésével juthatunk, amelyhez viszont ágy juíSiatunk, hogy egeret ímnunfizálnnk humán i)R5-el, és az· kővetően az ·egérből származó iépsejtefeet vagy nyirokcsomó-sejteket egéreredetü .mfelóma-sejtekkel fuzionáljuk.
Monoklonáiis eiíenanyag előállítása például az alábbi lépésekből áll; a) biológiai makromolekula tisztítása antigénként való alkalmazásra;
h) ellenanyag-termelő sejtek előállítása, először az állatot antigén-injekciókkal immunizáljuk, majd az állatból vért veszünk és vizsgáljuk az elk-nanyag-títert annak meghatározására, hogy mikor távolítsuk el a
c) míelőma-sejtek preparálása;
d) ellenanyag-termelő sejtc-k és mlelóma-sejtek fúziója;
e) kívánt ellenanyagot termelő bibridóma szelektálása;
5) egyetlen sejtklón előáll kása (klónozás);
g) adod esetben tenyésztjük a hibridóma-sejteket, vagy olyan állatokat tenyésztünk, amelyekbe a hibridómasejteket. beültettük a monoklonáiis ellenanyag nagy rncnynyiségö előállítása céljából: és h) teszteljük az így előállított monoklonáiis ellenanyag biológiai aktivitásait és speeifitasát, vagy egy markor ágens tulajdonságait vizsgáljuk.
Monoklonáiis ellenanyag előállítására szolgáló eljárást lentebb részletesen ismertetjftk. utalva a fenti lépésekre., A találmány szerinti ellenanyag előállítására szolgáló, bemutatott eljárás csak az előállításra szolgáló eljárás szemléltetésére szolgál. Más ismert eljárásokat is végezhetünk, vagy az alábbi eljárást módosíthatjuk, például olyan ellenanyag-termelő sejtekkel, amelyek nem lépsejték és mieíóma-sejtek.
(ti) Antigén előállítása
Rekombináns fehérjét (a leírásban jelölésük ..rekombináns humán DR5 vagy „rekombináns humán DR4:’), amely hatásosan alkalmazható antigénként, ugv állítunk elő, hogy QBl-293A-sejteket transzíekíáiunk humán DR5 vagy DR4 extraeellnláns doménjét és humán IgGl-ellenanyag (a. leírásban jelölése „igö”) Fe-régióját tartalmazó iüztos fehérjét kódoló pAdBRS-IgG-jelíi expresszíós vektorral (cf, RTA-142R) abból a óéiból, hogy expresszáljuk azt „AOíiNG-Quest kit (Quanínm Bioteelmníogies Inc., Kamnla) alkalmazásával, és az expresszíós terméket elkülönítjük és részlegesen tisztítjuk, A pAdDRS-lgö-pkizmidot úgy állítjuk elő, hogy humán ÖR5-S1: vagy DR4-eí és humán Igö-t tartalmazó fúziós fehérjét kódoló DNíht itíszertálnsk .pAdCMV5-be, amely állat-sejtekben működőképes expressziős vektor..Más anyagokat is alkalmazunk, például a DRő-őt vagy DR4-et kódoló BKS-t, a vektort, és a gazdaszervezetet
15'
A humán ÖRS-öt vagy DRA-et és IgG fúziós fehérjét, amelyet pAdD:R5-lgG-vektorr<d transzfektáit QR1-293 Asejíefc tenyészetének felöluszőjáből állítottunk elő, részlegesen lehet tisztítani Protein-A-Sepharose attlnháskromatográs^ával vagy Rrotem-G-Sephnrose affiniíás-krontatográfsávai, vagy ioncserélő kromatográfíával Resource-Qoszlopon (márkanév; Phurmacia),
Más módszer szerint, humán sejtvoualak sejtmembránjából tisztított DR5 vagy DR.4 alkalmazható antigénként Továbbá, mivel DR4 és DR5 primer sirukturái ismertek (ef. PTA-1428), az I . ítzo&ósltószántu amfeosav-szekvesóiál tartalmazó pepiidet kémiailag szintetizálhatjuk ismert eljárást, például Sapger-módszerreí, és antigénként alkalmazhatják.
(b) Siienanyag-termelő sejtek előállítása
Egeret: immunizálunk az (ál-lépésben előállított immonogénnel, amelyet adjuvánssal, például komplett: vagy inkomplett Freund-adjuvánssal vagy timsóval keverünk. Tovább! alkalmas kísérleti állatok lehetnék például patkányok, tengerimaiaeok, nyulak, kutyák, csirkék, lovak, sertések, szarvasmarhák és birkák.
Kísérteti állat immunizálására alkalmas módszer lehet szubkután, raSraperítoneális, hííravénás, índadermális és imramuszkoláris injekció, melyek közül a szubkután és intraperltoneáils injekciók előnyösek.
Az immunizálást adott esetben egyetlen dózissal, vagy több, alkalmas időközönként (előnyösen 1-5 hetente) ismételt dózisokkal végezzük. Az immunizált állatok szérumaiban követjük az elienanyag-titert, és az elég otagas ellenanyag Éterrel rendelkező állatot kiválasztjuk ellenanyag-íertnelő sejtek forrásaként, Magas ikerrel rendelkező állat kiválasztása a soron kővetkező folyamatot hatékonyabbá teszi. Áss ezt következő fúzióhoz sejteket az állatból általában 3-5 nappal az utolsó immunizálást követően vesztmk ki.
Ellesanyag-fher vizsgálatára szolgáló eljárások lehetnek szakember által Ismert, technikák, példánl radioaktív immunológiai vizsgálati eljárás (a leírásban rövidítve „RlA”j, szilárd fázisú enzimes Immunológiai vizsgálati eljárás (a leírásban rövidítve „EL1SA”), fluoreszcens ellenanyag vizsgálati eljárás és passzív hemagglutmációs vizsgálati eljárás, melyek közöl R.1 A és BUSA részesíthető előnyben kimutatási érzékenysége, gyorsasága, pontossága és automatizálási lehetősége miatt.
Elteoanyag-tltert meg lehet határozni például ELlSA-eljárássai az alábbiak szerint. Először a tisztított vagy részlegesen tisztítóit DR5-öt vagy í>R4-et abszorbeáljuk szilárd fázis felszínére, például M tenyésztőbeIvet tartalmazó ELiSA-táleára, majd tsz antigénnel nem rokon szerkezetű fehérjével, például rosrhoszéruffl-albtanlnnai (HSA) blokkolunk minden olyan maradék felszínt, amelyekhez DR5 vagy ÖR4 nem kötődőd. Mosás márt a tenyészföhólyek felszínét érlutkeztetjük egérszérum-miníákből készült higitási sorral, ami lehelövé teszi a mintákban lévő DK5- vagy DRA-ellenasyag kötődését az antigénhez. Szekunder ellenanyagként hozzáadunk jelöli, auíi-egér ellenanyagot, hogy az egéreredető ellenanyaghoz kötődjön. A jelölés fehet enzim-jelölés, fluoreszcens jelölés, vagy más, szakember számára ismert jelölés, Mosási kővetően hozzáadjuk az enzim sztibsztrátját, és megbecsüljük az: ellenanyag flfert az. áhszorbancia-változás mérésével, amely a szubsztrát vagy hasonló anyag színváltozása miatt kialakult szia.
(c) Mielóma-sejtek előállítása
Kialakítóit, egérerededí sejtvooalból származó sejtek szolgálnak mielóma-sejtek forrásaként, például ÖÁEBAeredetü, 8-azagutmtn-rezisAens egérből származó P3Xö3Ag8U.I (P3-U1) (35), P3/NSl/i-Ag4~l (NS-I) (36), Sp2/ÓAgi4 (SP-2) (37), P3.X63 Ag;8.ó5 3 (Ő53) (38) vagy P3X63AgS (Xb3) (39) jelű mfelóma-íőrzsek. A kiválasztott sej (vonalat sorozatban többször átvittük alkalmas tápközeghe, például 8-azagnanm-tápközegbe. 8-azaguaoio-tápközeg lehet lseove-íéie módosítod Eagle-féle tápközeg (a továbbiakban „SÖMEM”). Gim&mmnal, S-merkapto-etanollal, gentantíemnel, magzati borjúszénmmsal (a leírásban rövidítése ,,R.'S”> és 8-ttzaguaniuoa! kiegészltéít REMI· 1640· tápközeg. Majd a sejteket a- fúzió előtt 3-4 stappal átvittük normál tápközegbe, például ASFW-tápkőzegbe (Ajroomoto, K, KJ, amely 111% FCS-t tartalmazott, abból a célból, hogy a fúzió papján legalább 2 x 10' sejt álljon readeikezésre.
(d) Sejtfúzió
Az állat bármilyen alkalmas részéltöí kinyert limfoeiták és plszmasejíek prekurzor-sejtkésn szolgálnak az 5 ellenanyag előállításához. Limíoeíta- vagy plazmasejtek forrása Sebet példán! lép, nyirokesomók, perifériás vér vagy' ezek bármilyen alkalmas kombinációja, amelyek közöl lépsejteket sfelniasmak fegéherjedtebben.
Az. utolsó ismétlő oltást követően azt a szövetet, amelyben az ellenanyag-termelő sejtek vannak, eltávolítjuk az egérből, amelyben előzőleg meghatároztuk az ellenanyag-titert. A jelenleg leginkább előnyben részesített technikában lépsejtsk és a ej-iépésben prepáiéit míelótna-sejtek fúziójára pohetllén-glíkolt alkalmaznak.
1Ö A telás technikában lép- és: mieióma-scjlekst mosunk szérummentes tapközeggel (például REMI-1 Ő4€M) vagyIbszfét-pnXerolt sóoldattal (a leírásban rövidítése „P8S”) úgy, hogy a iépsejtek és míclóma-sejíek számaránya megközelítőleg 5:1 és 10:1 között: legyen, amelyeket ezt követően ieeentrlfugáhmk, A felöfeót kidobtuk, majd a leüiepileíi sejteket kellően fellazítottuk, és hozzáadtunk 1 mi, 50 vegyes0/» poiietíléu-glikoft (molekulatömege 1: .000 és 4.090 közötti) tartalmazó, szérntntnette tápközeget cseppenként, keveríetés közben. Ezt kővetően 10 ml széremmentes tápközegei hozzáadtunk lassan, majd leeenítífúgáltuk. A. feiúiúszót ismét kidobtuk, és a leüiepitett sejteket felsztsszpendálmk alkaimusan megválasztott mennyiségű HAT-tápkőzegben. amely hipnxantmi, ítmínopterini és líroidmi tartalmazó oldatot (a leírásban jelölése „HAT”), ős. egéreredeíu inferÍeufcm-2-ί (a leírásban jelölése ,,Ik~2”) tartalmazott. A sztiszpenzióí azután szétosztottuk íenyészíöíálcákh& (a továbbiakban egyszerűen csak „tálcák”), és 5 íf% szén-dioxid jelenlétében mkulvdink, 3?ΟΟ on, körülbelül 2 hétig, szükséges esetben kiegésziiotfíik í-íAT-tápközeggel, (c) Hihridómúk szelektálása fia az alkalmazott mielóms törzs rezísztens H-azaguanm-ra, azaz a hipoxantln-guaoin lószibríbozíi-sranszféráz (BöPRT) enzim defíciens, bármilyen nern-feiönáii mielóma-sojí és bármilyen sníelőma-iníelőma fúzió nem képes HA'f-íápközegbén túlélni. Másrészt, ellenanyag-termelő sejtek egymással alkotott felől, valamint ellenanyag-termelő sejtek tnielőma-seiíekkel alkotott híbridőmál képesek túlélni, közülük áz első éleisdsje csak korlátozott. Ennek rneg25 felelően,. HAT-tápkőzegben való folyamatos inkubáiás eredménye kizárólag a kívánt lúbridómák szelektálása.
Az eredményül kapott hibridóarákból kolóniákat növesztünk, amelyeket azután átviszünk ammoptgrint nem tartalnsazó B AT-lápköztígbe (BT-fépközsg). Ezt követően a tenyészet felülószójábót airkvotokai veszünk anti-Eas elfenanyag-titer meghatározására, például ELISA alkalmazásával. 1-la a fentebb említett fúziós fehérjét El.dSA-ban antigénként alkalmazzuk, elimináhn kell: olyan ellenanyagot termelő klónokaí Is, amely specifikusan kötődik Itttsnán
IgG 1 Ec-réglőjához. Ilyen klón jelenlétét vagy hiányát például ELISA-val lehet igazolni, antigénként Fas-lgGl vagy IgGI alkalmazásával.
(1) Klónozás
Olyan hibridómákaí, amelyekről kimutattuk, hogy specifikus ellenanyagukat temelnek, a b)-iépésben leírthoz hasonló eljárás alkalmazásával meghatároztuk az ellenanyag tiieréi, azután átvittük azokat egy másik tálcára klónozás céljából. Alktthnas kiótsozási eljárás például limitáló hígításí módszer, amelyben hlbridómákat annyira meghígíijuk, hogy íenyésztőhelyenként egy sejtet: tartalmazzon, majd tenyésztjük; az lágy agar módszer, amelyben kolóniákat kinyerünk lágy agar-tápközegben való tenyésztés után; miteömaniputálort alkalmazó módszer, egyelte sejt elkülönítésére tenyésztéshez; „sorf-a-elotte módszer, amelyben az egyes sejteket sejtoszíáiyozóval elválasztjuk,
A klónozási eljárásban, például a limitáló hígításí módszert 2-4-sze.r megismételjük minden olyan tenyésztői-elvre, amelyben az ellenanyag-liter megfelelő, és sz olyan klánokat, amelyek stabil ellensnyag-titerrel rendelkeznek, kiszelektáljuk aulí-DRS tnonoklonális ellenanyag-termelő hibrídőmaként Aníi-egér-DR5 eilemmyagőt
-17termslő blbridómákat hasonló módszerrel szelektálunk anti-ORó monoktoKális ellenanyag-termelő sejívuttal előállítása céljából.
A TRA-8~je!ü egér-egér blferidómát, amely a találmány szerinti elíerrnyag-ök alapját jelemí, az „Ároeriean l'ype Cölüsé Coilectiorf’-bán: deponáltuk 2000. március 1-¼. amelynek a nyilvántartási száma P'ÍA-1428. A 2E125 bibrídómát az „American Type Gühure Colleetiori'-ban 2001. október 24-én deponáltuk a fentebb leírtak szerint, és ATCC nyilvántartási száma PTA-3798, Ennek megfelelően, ha egy ellenanyagot TRA -8-JeIú egér-egér bíbridórna, vagy bátmilyeo mán kialakított bíbriéőm- alkalmazásával, termeltetünk, a termeltetést az alábbi ígj-lépéstől kezdve lehet végezni, az (aX^-iépéscket kihagy va.
(gj fllbridőma tenyésztése monoklonális ellenanyag előállítása. céíj ábol 10 A. klónozással előállított bibridómát azután normál tápközegben tenyésztjük, nem HTrtápközegben. Nagy mennyiségit tenyésztést hengeres tenyésztő edényekben végzőnk, nagy tenyésztő edényeket alkalmazva, vagy rázott tenyészetet alkalmazunk. A nagy mennyiségű tenyészetből származó felülószót azután elkülönítjük, és alkalmas módszerrel, példán! gélszöréssel tisztítják, amely szakember számára jól ismert, DR5- vagy E)R4-re specifikus, monoklösális ellenanyag előállítása céljából, amely a találmány szerinti ellenanyagok alapját jelenti. A bibridómát tenyészthetjük Intraperhoneábsan szingenikus egérben is, példát;! BALR/c-egérben vagy nn-hu-egérben, DR5- vagy ÍÖSd-re specifikus monoklonális ellenanyagot fartalntazó aszcitesz nagy mennyiségben való előállítása céljából· Kereskedelmi forgalomban lévő, monekloaálís eiiexíasyag: tisztítására alkalmas készleteket (például MabTrap Gll Kik kharmaeia) kényelmesen alkalmazunk az elkülönített ellenanyagok tisztítására.
A fentebbi módon előállítón monoklonális ellenanyagok nagymértékben specíriknsak humán DRS~re vagy DR420 re, sorrendben.
(h) Monoklonális ellenanyagot vizsgáló eljárás
A monoklonális ellenanyag Izotípusának és alosztályának azonosítására alkalmas eljárás lehet Onchterlosymódszer, EL1SA és RÍ A. Előnyösen kereskedelmi forgalomban lévő reagenské5.zletet alkalmazunk azonosításra, például „Mousc Typer K tf'-et (kereskedelmi forgalomban lévő tennék neve; BloRadl
Fehérje mennyiségi meghatározását Polin-towty-rnódszerrel lehet végezni, vagy 286 rnn-en mért abszorbaneiára alapuló számítással 11,4 (OD280) ~ 1 mg/itsl. imtnungsobulinj.
A monoklonális: ellenanyag által felismert epiíóp azonosítása az alábbiak szerint történik. Először a molekula különféle részleges szerkezetest: állítjuk elő, amelyeket a monoklonális ellenanyag képes felismerni. A részleges szerkezetek olyas módszerrel állítjuk elő, hogy a molekula különféle részleges peptidjeit szintetikusan preparáljuk ismert oligopeptid-szsntézis technikával, vagy oly ars módszerrel, amelyben a kívánt részleges polipepíídeí kódoló DNSt beépítjük alkalmas expresszios phzmidba, és alkalmas gazdaszervezetben, például A. eo/zban expresszáljkk a peptidek termeltetése céljából. Általában a két eljárást gyakran használják kombinációban a fentebb leírt célra. Például az antigén-fehérje C- vagy bí-termínálisáfol kezdve, megfelelően lerövidített poiipepíld-sorozatokat lehet előállítani ismert géntechnológiai technikákkal. Annak vizsgálata, hogy melyik ftagmens reagál az ellenanyaggal, az epitöp helyéről megközelítő elképzelést nyújt.
Az epitőp pontosabb azonosítását különböző kisebb oligopepíidek szintetizálásával végezzük, amelyek megfelelnek a pepiidnek vagy mutánsainak, általánosan ismert ollgopeptid-szmlézis technikákat alkalmazva, a pepfid antí-Dkő-jelő monoklonális ellenanyaghoz való kötődési tulajdonságának meghatározása céljából, amely például alapját képezi a találmány szermti ellenanyag előállításának és a pepiid és antigén kötődésének monoklonális elleaa40 nyaggaí töriénő komperitiv gáilásának. Kereskedelmi forgalomban lévő reagenskészleíeket, például „SPOTs Kif’-et (Genosys Bieteehnologies, Inc.) és egy sor rauliipin peptidszintézisre szolgáló resgeoskészleíet, amelyek a nmltipinszintézis módszerére alapulnak (Chmon Corp,), lehet kényelmesen stlkaíswni igen sokféle obgopepltd előállítására.
A találmány szerinti ellenanyag az alábbi, a}- 0-pontokban ismertetett, különféle funkcionális tulajdonságokkal rendelkezik, amelyek mindegyikét például az alábbiakban leirt eljárással igazolunk.
a) T'MA-8 specifikusan kötődik humán DRS-öt expresvzáló sejtekhez.
A találmány szerinti ellenanyag egyedi tulajdonsága, hogy sejtfelszíni DRS-bőz képes kötődni. Ezt DR5expresszaió sejteken áramlási ciiometriás analízissel mutattuk be. Először, l.)R5 specifikus sejtfelszíni kötését olyan COS-7-sejtékkel igazoltuk, amelyeket humán DRS-kódoló, teljes hosszúságú cDNS-ei transzlektáitunk, Konkrétan, 'fRÁ-8 csak DRS-tei transztéktált. CÖS-7 sejteket ismert fel, de üres kontroll vektorra! vagy DR4-et kódoló vektorra! transzfektált sejteket nem. Másodszor, három különféle forrásbök hematopoeíikus, glióma- és prosztata-rákból
1Ö származó. humán ntalignas tumorsejteket teszteltünk. Az említett trauszfortnálódott tuthorsejtek többsége jelentős mennyiségű sejtfelszíni DRS-öt expresszAlt, bár az expresszio mértéke tág határok között változott. Harmadszor, megvizsgáltunk KA-ben és ÖA-haít szenvedő páciensekből származó, humán, primer sztnoviátis tíferohiaszt-sejiekből álló, két panelt vizsgáltunk. Minden: RA által érintett szmovsális: sejt szignifikánsan nagyobb mennyiségben expresszált DRS-öt, OÁ által érintett sejtekhez viszonyítva.
b) lítunán tnalignuK lumorsejtek apoptózísánsk itt. vi(r& indukciója keresztkötés nélkül.
Azt, hogy a találmány szerinti ellenanyag TRAÍL-reeeptorí képes felismeri» és közverionűl indukálja tnahguus (rosszindulatú) humán tumorsejtek apopíózisáí, sejtek életképességét vizsgáló eljárással (ÁTPLitej határoztuk meg ágy, hogy sejteket fo vhro tenyésztettünk különböző koncentrációban jelenlévő ellenanyaggal, konkrétan TRA-8-al. A lumorsejtek többsége érzékeny TRA-8 által indukált aponíózísra. Néhány sejt esetében TRA-8 erőteljes apopíózist in20 dukáló aktivitást fejteit ki, például TRA-8 humán Jurkat-sejtek apoptözisát képes indukálni pg/ml mennyiségekben. Fontos megemlítem, hogy TRA-8 által indukált apoptózisnál nincs szükség keresztkötésre, és a legtöbb sejtben TRA-8 erőteljesebb apoptózist indukáló aktivitást fejtett ki, mint rekombináns szolubtlis TRAIL az enbanszer jelenlétében.
c) TRA-8 >« vivő tumarioid aktivitása.
TRA-8 tumoricid aktivitását két SCíD/humán tumorsejt-modellben elemeztük. Először SCID-egereket intravénásán bsoitotíuuk humán leukémiából származó íurkal-sejtekkel, és egyetlen dózis flöő pg) TRA-8-al kezeltük őket. Az eredmények tó mutatták, hogy a beültetett Jnrkat-sepek íöbhsége eliminálódott a perifériás vérből és iépból TRA-S-al való kezelés hatására, amit áramlást citornetriás analízissel és íurkat-sejtek in sitit imniunhisztokémiat festésével határaztunk meg. Másodszor, humán 1 <.?. IN 1 -jelű asztroeitóma sejteket szubkután beoítoftuak SÜlD-egerekfae, és a tumort hordozó egereket egyetlen dózis TR.A-8-ai kezeltük. A beültetett 1321N1-sejtek növekedését Szigfüitká«S3n gátolta TRA-8 -keze lés az egerekben, amit a tumor méretének mérésével és hisztológiai analízissel határozniuk meg.
d) RA által érintett szinoviálís sejtek azonosítása TRA-8-al.
RA és 4 OÁ állal érintett páciensből izolált, primer szinoviálís sejteket teszteltünk ÖRS sejtfelszíni expressziójára. TRÁ-8 mindén RA által érintett sejtet képes pozitívan: megfesteni, azonban minden ÖA által érintett sejtet negatívan fest. Tehái'RA usegkülőnhőztethetö ÖÁ-tól TRA-8 által detektált ÖR5 sejtfelázmi expressziójávál.
e) Apoptózis indukáíása TRA-8-aí RA ttííal érinteti szinoviálís ftferoblaszt-sejsekben.
Azt, hogy TRA-8 RA által érintett szinoviálís sejtekben apoptózist képes indokaim, sejtek életképességét vizsgáló eljárással határozták meg úgy, hogy sejteket /» v/ft-o tenyésztettünk különböző koncentrációban jelenlévő TRA-S-aL Minden Rét álta! érintett sejt magas vagy közepes mértékben érzékeny volt lőő ng'tnl ΤΚΑ-8-rs. Ezzel eiienteíiren, valamennyi ÖA által érintett sejt lényegében rezlsztens volt TRA-8 által indukált apoptózisra. Fontos meg40 említeni, hogy TRA-8 jobb apoptózist indukáló aktivitást fejtett ki R A által érintett szinoviálís sejtekbetp mint szolubíiís
TRÁÍL· az imbanszerrek Továbbá untí-íkts ellenanyaggá! (CB-lí) Összehasonlítva TRA-8 szelektívebb volt RÁ által érintett szinoviáiis sejtekre,
f) TRA-8 nem indukál MMÍtoerroelést KA által érintett sztnoviátis sejtekben.
Mivel TMA-8· Ní'-kb aktiválódását képes indukálni RÁ által érintett színoviális sejtekben ugyanúgy, mint TN.F-a, 5 meghatároztuk TRA-8 hatását sztnovíáíís sejtekben MMP! és MMP3 termelődésére, Míg TNF-a MMP-k mennyiségétnek döztsftggő növekedését indakálta, TRA-8 nem volt képes MMP-k termelését Indukálni, és bizonyos koncentrációkban alkalmazva TRA-8 kismértékben csökkentette az MMP-termelés mértékéi RÁ által érintett szinoviálís sejtekben.
gj TRA-8 több 'kaszpáz aktiválódását Indukálja.
Kaszpázok kulcsszerepei játszanak apoptözis indukáiásáhan. Azt, hogy·' TRA-8 kaszpáz-Átiválddást képes indukálni, humán íurkaT-seitekben határoztuk meg. Ha iurkaí-sejtekei kis dózis (50 ng/tnl) FRÁ-8-ai inkubáituk, kaszpáz-B, fcaszpáz-4 és kaszpáz-d aktiválódását inár 15 perccel az uikafeáíás után rneghgyéltük, amit wesícrn-biot analízissel és kaszpáz-hasfrás analízisével mutattunk ki. A kaszpáz aktiválódásának ideje, száma és erőssége szempontjából a találmány szerinti ellenanyagok, például a demonstratív TRÁ-8-eSlenanyag, sokkal jobb aktivitást mutattak, mint bármely más, ismert apopiózlst indukáló ellenanyag, például anti-humán-Fas ellenanyag (CFÍ-11).
A 21 i?-<llenanvag s/olnótlri formásában specifikus képes I)R4 et kőim. <u v,w, és m upugto/isf mdokaiő aktivitással rendelkezik DR4-et expresszáló célsejtekben (például ráksejtekben, reumaíoíd artritisz által érintett szinoviáíis sejtekben, aktiválódott immunsejtekben,: például aktiválódott ümíbeitákban, vftusferíözött sejtekben), és in vive tumoricíd aktivitással rendelkezik (előnyösen nem-tumor-sejíekre nem toxikus), A találmány szerinti DR4-eilen20 anyag apopíózss-indukáló aktivitását előnyösen az jellemzi, hogy célsejtek ételképessége 6(1%, 5ö%, 40%. 30%, 20% vagy ld%-nái kisebb mértékű 30 pg/ml, 3 pg/ml, 6,3 pg/ml vagy 0,03 pg/ml-1 él akusonyabb cilenanyag-koneeníráeíó esetén, és a tumoricki aktivitást a tumor méretének 10%-os, 20%-os, 36%-os, +0%-o\ 56%-os, oö%-os, 76%-os, 80*«os, 96%-os vagy 100%-os-.csökkenése jellemzi. A találmány szerinti ellenanyag olyan anyag, amely? szelektíven képes apopíözísí indukálni patogén sejtekben, tulajdonképpen az. (aHg)-ponfokban bemutatottak szerbi, Fitnek megfelelőén.
hasznosan alkalmazható profi laki ikus és terápiás ágensként sejtek nem megfelelő túlélésével vagy sejtek nem megfelelő pröliferácíóiával asszociált betegségek esetén, például ha a betegség kialakulásának oka rendellenesen szabályzót! apöpfózis-reödszet, például ahol Fas/Fas-Hgandum-rendszer játszik szerepet.
Azí, hogy a találmány szerinti ellenanyag apopfózlsl képes indukálni, sejtek. például íurkat, humán leukémia sejtvonai (American lype Culture No. TIB-1S2) és 1321riT-jelö sszPoeítőma sejtvonaí tenyésztésével igazoltuk olyan tápkö/cgöen, amelyhez a teszímintát adagoltuk, és meghatároztuk a túlélés arányát például ATPIJte vizsgálati c. íáms sut,
A találmány szerinti ellenanyagot, azaz DR5- és DR4-öllen;myag<skat, amelyek csákóéin ugyanolyan mértékben itmnuifogének emberekben, mint a humán ellenanyagok, ágensként alkalmazzuk olyan betegségek profilaxisára vágykezelésére, amelyek sejíek nem megfelelő tölélésévei vagy proilfcrácíójával asszociáltak, például rendellenesen szabályzóit a>x)ptózis~rendszereknek tulajdonítható gyulladásos és autoimmun betegségekben, például szisztétnás Inpnsz erlietnatóznst, Ifeshimotö-íéle betegséget, reumaíoid srtritiszt, graR-versus-host betegséget, Sjögren-sziudrómáf, vészes vérszegénységet (pemíciosus anémiát), Adoison-korí. szkterodetmáí, Goodpasture-szímirómát, Crohn-feie betegséget, autöitntnun hemóíitikus anémiái, terméketlenséget, roiasztéma gráviszt (izorogyeogeségef), szklerózís multiplexet, Basedow-kórt, íroroboiikus tromboolfopésiát, tromhoeitopénrás purpnráí, inzulinfüggő diabetes tnéllltust, allergiát; asztmát, alóplás betegséget; nrterioszklerózist; tniokardiliszt; ksrdíomlopátiát; glomerularis nefeítíszt, hípopiázíás anémiát; kilökődést szervátültetés után és a tüdő, prosztata, máj, petefészek, vastagbél, inéhnyak, nyirok és
-20mell szöveteinek számos malignrtásáf kezeljük, A találmány szerinti ellenanyagokat apoptózis nregcélzására és szelektív mdukálására lehet alkalmazni aktiválódott immunsejtekben, például aktiválódott limfociíákban, Innfoidsejtekben, mieteid-sejtekben, és reuma által érintett: szinoviálls sejtekben (például gyulladásos szinovloeitákban, makrofág-szerű szinovioeitákban, íthrohlaszt-szerü szinovtoettstkban) és vtrusíertözőtt sejtekben (például HíV-fortózött sejtekben) mindaddig, amíg a megcélzóit sejtek expresszáinak vagy expresszálfafoi lehet velük TRÁlL-reeepiorokat (azaz DR4-et vagy ÖR5 -öt).
Ilyen profstaktikus vagy terápiás ágenst különféle tonnákban leltet beadni, A beadás alkalmas módja lehet orális beadás, például tablettákkal, kapszulákkal, granulátumként, porok és szirupok forsnájaban, vagy parenferálísan, például injekcióval vagy kúpokkal,
1.0- Az ellenanyagot vagy terápiás ágenst be lehet adni orálisan, rektáltsan, intracisztemábsan, intraventrikulárisan, inhákrahíálisan, intrátékálisan, uttraartikulártsan, intravagínálisan, parenterTfean (intravénásán, intramuszkuiárisah vagy szubküiánj, lokálisan (porok, kenőesők vagy cseppek fotmájábatt), intraperitoneáltsan, iranszdet-tnálísan, tnhalálva vagy bakká! isan vagy nazális spray formájában. A szükséges ellenanyag vagy terápiás ágens pontos mennyisége alanyonként változó, ítigg az alany korától, tömegétől, általános állapotától, a kezelt betegség súlyosságától, a tumor elhelyezkedésélöi és tneresétói, a konkrétan alkalmazott vegyüleítől, a beadás módjától, és hasonlóktól:. A megfelelő mennyiséget szakember képes határozni a kiianitás szerint,: rutin vizsgálat elvégzésével. Az ellenanyag egyetlen dózisa tipikusan 0,1-10.000 mikrogramm, előnyösen 1-100 mikrogramm. Az ellenanyag koncentrációi tipikusan egy hordozóban 0,2-2000 nanogramm beadott milliliterenként. ízületbe adott injekció esetén az ellenanyag és a hordozó térfogata az Ízülettől foggően változik, de körülbelül 0,5-1Ö ml-ΐ, és előnyösen i -S ml-t tnjekíáltsnk embert térdbe, és körülbelül 0,1--5 ml-t, előnyösen 1-2 ml-t emberi bokába,
A beadás tervezed módjától foggően az ellenanyag vagy terápiás ágens lehet gyógyászati készítményekben szilárd, félig szilárd vagy folyékony döztsformákbam például tabletták, kúpok, pirulák, kapszulák, porok, folyadékok vagy sznszpenziok formájában, előnyösén egyetlen beadására alkahnas dózisegység fortnájában, A készítmények a kiválasztott szubsztrát hatásos mennyiségét tartalmazzák gyógyászatilag elfogadható hordozóval kombinációban, továbbá taríahnazhatttak más gyógyhatású ágenseket, gyógyászati ágenseket, hordozókat és hígítókat, A „gyógyászatilag elfogadható” kifejezésen olyan anyagot értünk, amely biológiai vagy más értelemben nem nemkívánatos, és amelyet egy egyénnek a kiválasztott szabszfráital be lehet adni atrélkili, hogy jelentős nem-kívání biológiai hatásokat okoznának, vagy káros módon kölcsönhatásba lépne a gyógyászati készítmény bármelyik másik komponensével, amelyet a készítmény tartalmaz.
ttarenieráhs injekcióra alkahnas készitmények (biológiailag elfogadható, steril vizes vagy nem-vízes alapú oldatokat:, diszperziókat, sznszpenzíókat vagy emulziókat, és steril jwokaf tartalmazhatnak, amelyekből sterd, injektálható oldatokat vagy diszperziókat lehet készíteni. Alkahnas vizes vagy nem-vizes alapú hordozók, hígítók, oldószerek vagy vivőanyagok lehelnek például víz, etette!, pultotok (propilén-ghkol, polfetilén-glikol, glicerin és hasonlók), ezek alkalmas keverékei, növényi olajok (például olívaolaj), és injektálható Szerves észterek, például eíii-oléát. Az alkalmas folyókon} ság t fhndítos) fenntartható például burkolóanyaggal, például lectfinnei, a szükséges részecskeméret fenntartásával diszperziók esetében és folületektiv atsyagök alkalmazásávak
Ezek a.készítmények tartalmazhatnak adjuváttsokat is, például tartósító, nedvesítő, etnulgcáió és diszpergáló ágenseket, Mikroorgamztnusok hatását különféle faaktérntmólö és gotnbaöló ágensekkel lehet megelőzni, ilyenek például parabének, kloro-hutanol, fenol, szorhinsav és hasonlók. Az is kívánatos lehet, hogy a készítmény izotónlás ágenseket íáríahnazzou, például cukrokat, náíriasn-klorldot és hasonlókat, A? injektálható gyógyszerfortna
-21 felszívódásának idejét meg. lehet hosszabbítani felszívódást késleltető ágensek, például alünttnintn'ítionoszteaí'át és zselatin alkalmazásával.
Orális beadásra alkalmas, szitázd dőzlsforuták lehelnek kapszulák, tabletták, pirulák, porok és granulátarnok. Ilyen szilárd dózisfornsákban a hatóanyag össze van keverve legalább egy, szokásosan alkalmazott, inért segédanyaggal (vagy hordozóval), például nátríum-eítráttaí vagy díkaicíum-foszfáttal, vagy (a) töltőanyagokkal, ilyenek például keményítők, laktóz, szacharóz, glükóz, mannít és szalfoilsav, (b) kötőanyagokkal, ilyenek például karfeoxóínettl-ceüulóz, alginátok, zselatin, polivirúi-pírroiídön, szacharóz és akáela, (e) nedveshőszerekkel. például giíeerinöei, (d) mállasztószorekkel, ilyenek példán.! ggar-agar, kaleiurn-karbonái, burgonya vagy tapíöka keményítő, slghísav, bizonyos komplex szilíkátok és nátrium-karbonát, (e) oldódást késleltető anyagokkal, például paraffinnak, (t) felszívódást gyorsító anyagokkal, például kvaterner anunóníurn-vegyüietckkei, (g): nedvesítő ágensekkel, például cetli-alkohollal és glicerb-monesztearáttai, (h) adszorbensekkel, például kaolinnal és bentoulitaL és (i) slkosíto anyagokkal, ilyen például talkum, kaldum-sztearát, magnézíam-sztearát, szilárd polietdén-glíkolok, nátríum-lauríl-sznífát vagy ezek keverékeivel. Kapszulák, tabletták és pirulák esetében a dózisfonnák tsrtahuazhatnak pufl'ereló ágenseket is.
Hasonló típusú, szilárd készítményeket töltőanyagként szintén, lehet alkalmazni lágy és félig töltött zselaíin15 kapszulákban, ilyen segédanyagok, például láktóz vagy tejcukor, valamin! nagy snolekulaíomego polfettlémglíkolok és hasonlók alkalmazásával.
Szilárd dőzísformákst, például tablettákat, drazsékat kapszulákat, pirulákat és granulátumokat elő lehet állítani bevonatokkal es burkolatokkal, például eoterikus bevonatokkal és más, szakember által ismert anyagokkal. Tartalmazhatnak fedő ágenseket, és lehetnek olyan készítmények, amelyek a hatóanyag vagy hatóanyagok felszabadulását a béiíraktus egy bizonyos részében, késleltetetten biztosítják. Beágyazódó készítményként például polimer anyagokat és viaszokat lehet alkalmazni. A hatóanyagok lehetnek mikrokapszníázott formában is, szükséges esetben, a fentebb említett, egy- vagy több segédanyaggal.
Orális beadásra alkalmas, folyékony dözísformák fehetnek gyógyászatilag elfogadható emulziók, oldatok, sznszpenziók, szítnpok és eiíxirek. A. folyékony dózisformák a hatóanyagon kívül tartalmazhatnak szakember által általánosan alkalmazott, mert higitőszerekst, például vizet vagy más oldószereket, szolnbilizáló ágenseket és eomigeaiószeteket, például etd-aikohoit, izopropil-aífcóheit, etil-karbonátot, etlbaeetátot, benzíl-alkoholt, benzí.ibenzoátot, propiieu-glikoít, Kd-bníilén-ghkolí, dimetíl-fonstamidot, olajokat, különösen gyápoímag-rdajái, foldimogyoró-olaM kukorfeacsira-oiaját, olívaolajat, riciawlajat és szezámolaját, glicerint, tetradudro-feriuril alkoholt, poiíetiién-gllkolokaí és szorbltán zsírsav észtereit, vagy az említett anyagok keverékeit, és hasonlókat.
.A készítmény ilyen inért hígttószerekea kívül tartalmazhat adjuvánsokat is, például nedvesítő: ágenseket, ermdgeáiószereket és szuszpesdálő ágenseket édesítő:, Ízesítő és illatosító ágenseket.
Sz&szpenziók a hatóanyagon kívül tartalmazhatnak sznszpendáiö ágenseket, például eioxiláit izosrtearíiaikoholokat, poiksxietiléu-szorbitoí és: szorbitán-észtereket, mikrokristályos cellulózt, al.uminímn-sneíaiúdrexidot, betttoBsíoí, agar-ágart és tragammézgát, vagy ilyen anyagok keverékét, vagy hasonlókat,
Rektális beadásra alkalmas készítmények lehetnek előnyösen kúpok, amelyeket úgy állítunk elő, hegy a találmány szerinti vegyídetóket és alkalmas, nem irritáló segédanyagokat vagy hordozókat összekeverünk, például kákaóvajat, políetílén-glikoit vagy kúpviaszt, amely normál hőmérsékleten szilárd, de testhőmérsékleten .folyékony, így a végbélben vagy vagmális üregben felolvad, és a hatóanyag kiszabadul.
A találmány szerinti vegyüiet topikális beadására alkalmas dózisfonnák lehetnek kenőcsök, porok, spray-k és mhalálőazerek, A hatóanyagot steril kőrtttmények között rtziológiailag elfogadható hordozóval és bármilyen
-22isrlősitöszerrei, pu-ffentí, vagy szükség szerint hujtóanyaggtííl keverjük. Szemen alkulmttzhafó formák, kenőcsök, porok és oldatok, szintén a találmány által igényelt oltalmi körire tartoznak,
A „gyógyászaulag elfogadható sók, észterek, amídek és prodrogcvk” kifejezésen a leírásban a találmány szerinti, vegyületek karboxílát-sólt, aminosav addlcíös sóit, észtereit, smidjah és prodrogjatí értjük, amelyek alapos orvost megítélés alapján alkalmasak páciensek szöveteivel való érlntkeztetésre nem-kívánt isxícitás, srrtíáció, allergiás válasz és hasonlók, nélkül, ésszerű, arányban van a baszott és kockázat, és Itatásosak a tervezett alkalmazásra, valamint ahol lehetséges, a találmány szerinti vegyületek zwitterionos fortöátf. A „sók” kifejezésen a találmány szerinti vegyületek viszonylag nem toxikus, szervetlen és szerves savval képzett, sddlciós sóit értjük, Ezeket a sókat elő lehet állítani fo sifo a vegyületek utolsó izolálási és tisztítási lépésében, vagy a tisztított vegyidet szabad alapformájában alkalmas szerves lö vagy szervetlen savval való reagáltatásaal, és az így képződő só Izolálásával. Reprezentatív só lehet például hidrogénbrorníd, feidrogéu-klorid, szulfát, bidrogés-sznlíát, nitrát, .acélát, oxaiáí, vaferáí, oleáí, pahnítát, sztearát, iaurát, bórái, benzoáí, laktát, foszfát, tozilát, eitrát, maisát, fomarát, szakéinál, tartami, nefrilát, mezUál, glákobepictnát, laktobionát, metán-szalfonát és lauril-szulfonái-sők és hasonlók. Lehelnek például alkálifém- és alkáli tőid fém-alapú kationok, például náirtttm, lítium, kaikon, kasztom, magnézium, és hasonlók, valamim nem-toxikus anmtőnknn, kvatern&r ammónsunt és amín-kationok, például ámmőnium, tetra-inetil-ámmónmm, telra-etd-ammóniám, meíd-anno. dimeíilamin, irimetfl-amin, trieíil-arnin, eíiiamm és hasonlók. [Lásd például S. feL fíarge es: mtsai., J, kitartó. Sel., óó, 1-19 (I97?)j.
A „prodrog” kifejezésen olyan vegyőleteket énünk, amelyek in fero gyorsan átalakulnak, és a fentebb felsorolt képlett! sztllbi vegyületek keletkeznek, például verbert való hidrolízissel. A téma alapos tárgyalását lásd Ϊ. I-líguchi és
V, Stella, „Pro-drngs as Növel Delivery Systems”, 14. kötet, A.C.S. Symposium. Sértés; és „Btorevetsible Carriers in Örug Design”, szerk.; Edward fí. Rocbe, American Ph&nnaeetttteal Associatfon and Pergamen Press (lük?).
Egy célsejt állati eredetű sejt, például emberből, nem-humán főemlősből, macskákból, kutyákból, patkányból, egérből, íengerimalacból, nyálból, kecskéből, jtthból, marhából, lóból, csirkéből, sertésből, közönséges: selyesmnajomból és vadászgörény bőt származik.
Továbbá az ellenanyag vágy terápiás ágens lehet netn-szolvatáit vagy szoivatáli: formákban gyógyászatílag elfogadható oldószerekkel, például vízzel, etanollal vagy hasonlókkal. Általában a szolvatált formák ekvivalensnek tekinthetők s nem-szötvatált formákkal a találmány szerinti megoldásban.
Az eiienanyag-melektd&kat femed tetbntkakkal tts/iittuk, például amtno-abszorpctoval xags ammo-atítnttás kromatográfiásai, kromatográriás technikákkal, például nagynyomású folyadék-kromatogrártávai, vagy ezek kombinációjával.
Egy másik vonatkozása gyógyászati termék biológiailag aktív, tmti-í'RAlL-receptor ellenanyag vagy humanizált anii-TíLÁíL-reeepíor ellenanyag célba juttatására történő alkalmazásra egy gerinces szervezetben. A gyógyászati tennék gyógyászatílag hatásos mennyiségé, anfi-TRAil.-receptor ellenanyagot vagy fragmensét, gyógyászatílag elfogadható hordozói és olyan tartályt tartalmaz, amelyben a hordozó és azellenanyag sterilen körtsimények között van lezárva.
A találmány szerinti ellenanyag gyógyászatílag hatásos mennyisége sejtprohíerációt gátol vagy apopsózist indukál célsejttel vagy célsejtekkel való érintkszfetés esetén:. DRfoót vagy DR.4-ct feltsntemt képes ellenanyag, vagy DR5-ÖÍ vagy ÍÍR4-et felismerni képes, hnsnsntzáit ellenanyag gyógyászatilag hatásos mennyisége akkora mennyiség, amely egy egyednek beadva elegendő a kívánt hatás eléréséhez. A leírásban a „gyógyászatilag hatásos mennyiség” és „terápiás mennyiség” kifejezések jelentése szinonim. B&S-üí vagy ÖR4-et felismerni képes ellenanyagból gyógyászatílag hatásos mennyiség beadásának kívánt hatása például egy1 vagy több célsejt ptrszfolása, egy vagy több
-23 célsejt növekedésének gátlása,: DR5 vágy DR4 stjmuíáiása. sorrendben, ORS-höz vagy DR4-hez váló kötődés, sorrendben, és egy célsejtben N'Fk.B menny iségének vagy aktivitásának növekedése. Egy célsejt olyan sejt, amely DR5öt vagy DR4-ei expresszál, ilyenek lehetnek például abnormálisán növekvő sejtek és tumorsejtek, például papíllőmák és szemölcsök; mellrák, vastagbélrák, hepatómák, lenkémiák, tüdőrák, melanómg, mielőmák, psAeoszarkÖmák, petefészek-rák, hasnyáhnirigy-rák, prosztatarák, feji és nyakí rák, pajzsmh tgy-rák, agyíumorok, például asztrocitómák, aktiválódott imtnupséjtek (például aktiválódott limlbelíák, límfotd és miekhd-söitek), gyulladásos sejtek, resunatód artritisz által érintett szhwiális sejtek és vlrusíeríőzött sejtek. /« v/vo, a célsejt egy patológiás állapotban lévő egyed sejtje, amelyben példán! a sejtproliferáeló abnormális vagy rendellenesen szabályzóit, például rosszindulatú (maiignus) vagy jóindulatú rák és reumatoíd artritisz: esetén,
ΙΌ A találmány egy másik előnyős megvalósítási módja szerint, a célsejtet terápiás ágenssel is érinifceztetjük. Tehát, a találshány szerinti ellenanyagokat és készítményeket he lehet adni egymagukba® vagy kombinációban egy vagy több terápiás ágenssel. A terápiás ágensek lehetnek példán! a TNT-család más tagjai, kemotempiás ágensek, ellenanyagok, antívlrálls ágensek, szteroid és nem-sztetöid gyulladáscsökkentők, hagyományos immuníeráplás ágensek, eitokinek, kemoktnek és/vagy növekedési faktorok, Készítményeket beadhatunk együtt (például keverék tormájában), külön15 külön, de egyidejűleg (például külön intravénás vonalakon ugyanabba az alanyba), vagy egymást kővetően (például először bersdjnk az egyik komponenst vagy ágenst, azt követően a másodikat). Tehát, a “készítmény” kifejezés a leírásban jelenlhet ké; vagy söbb ágens egvulíes, egyidejű vagy egymás; követő beadását.
A találmány egy megvalósítási módja szerint, a készítmény alkalmas a TNF-család egy tagjának beadására. TNF, TNF-e! rokon szerkezetű vagy ΤΝΓ'-szerü molekulák lehetnek, amelyeket a találmány szerint! ellenanyaggal beadhatunk, például Ί'ΝΤ-α, iimlötoxin-o (Lf-o, TNF-B-kéni is ismert), Ι/Γ-β (heterotrimer LT~o.2-p-kompl:exbcn található) OM, Fást, CD27L, CD501 CD4ÍIL, 4-1BBU DcR3, OX4ÖL, 'ΓΝ’Ρ-γ (WO 96/14328. számú nemzetközi közzétételi hal), TRAIL, AiM-íí tWO <T 34913. számú nemzetközi közzétételi hat), APRIL :[1 Exp. Med, 188, 11859% endökm-o; (WO98/Ö788Ö. számú nemzetközi közzétételi irat), TR6 (WO 98/30694. számú nemzetközi közzétételi irat), OPG és ideg! növekedési faktor (NGF) szoiubilis formái, és Fás, CD3Ö, CD27, CÖ40 szoíubihs fonnál és 4-ÍBÖ,
TR2 (WO 96/34095. számú nemzetközi közzétételi írat), DR3 1WO97/33904. számú nemzetközi közzétételi irat), DR4 (WO 98/32856. számú nemzetközi közzétételi irat), TRS t WO 98/3Θ693, számú neínzetkőzi közzétételi irat), TRANK, TR9 (WO 98/56892, számú nemzetköz) közzétételi irat), TRÍÖ (WO 98/54202. számú nemzetközi közzétételi irat), 3I2C2 (WO 98/06842. számó nemzetközi közzétételi imt), és TR12, és CD154, CD7Ö és CÖ153 szoiubilis fonnál
A falaimén} egy mánk meg\.dobhass módja sze-mt. a találmány szeunu ellenanyagok ulk,dinas.al·. tennes/eíesen
3Ö előioidulo, szintetikus vagy mödosím-t CB40-!sgaodumokkaí (CD4ÖL) együttes beadásra, például CD40L szoiubilis formásával (például AVRENDj, CD4ÖL, GO4Öl,-ellenanyagok biológiailag aktív fragmenseível, variánsaival vagy származékaival (például agonísta vagy antagonista ellenanyagok) és/or CDdO-ellenanysgokkaí (például agonissa vagy ániagonlslá).
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagok alkalmasak együttes hadásra, az alábbiak közül egy, kettő, három, négy, öt vagy több anyaggalkomhinácíóhan: taerolimus (Fujlsawa), iahdomid (például Ceigene), anti-Tac (Fv)-PE40 (például Protein Design Labs), inohmomab (Bioiest), MAK-Í95F (Knoil), A&M-981 (biovartis), intette akin-1-receptor (például Immunex), mferleokia-4-reeepter (például immunex), IGM3 (ICOS), BMS-188667 (Bristol Myers Sqnthb), anti-TNF Ah (például terápiás: ellenanyagok), CG- 1Ö88 (Gelgene), ants-B? maókloaáiís ellenanyag (például Innogeftes), MBDI-50? (BíoTransplant) és ABX-CBL (Abgenbt).
A találmány szerinti megoldásban, a találmány szériát! ellenanyagok alkalmasak Fas-hgandumímd t Lss-L) vagy
-24olyan Fas-ellenanyaggal kom húsáéi óban történő együttes beadásra , amely Fas-t képes kötni, és apoptózist eredményező biológiát szignált képes tovahbitani, A találmány szerixtti eljárásban alkalmazott Pas-ellenanyagok előnyösen tnonoklonális ellenanyagok,
A találmány bizonyos előnyös megvalósítási módjai szerint, a találmány szerinti ellenanyagokat kombinációban 5 adjuk be amlretrovírális ágensekkel, nukleozid reverz transzkriptáz. inhibitorokkal, netn-nukleoztd reverz transzkriptáz inhibitorokkal és/vagy proíeáz-inhibitorokkal, A találmány szerinti eHenanyagokkaí kombinációban beadható, rmkleozid reverz transzkriptáz inhibitorok lehetnek például RBTROVíR® (ziáovndm/AZT) (Gaxo-Wellcome, Resc&rsb Trísngle Park, NC), VIDEX® (didanozim'ddlj (Bristol-Myers -Squibb, New York), H1VID® (zaleitabine/ádC) (Roche, Nntley, New Jersey), ZBRíTíR (stüvudine) (Brístöl-Myers Sqmhb). A találmány szerinti ellenanyagokkal kombinációban beadható, nem-nukleozid reverz banszkriptáz inhibitorok: lehetnek például VÍRÁMUNE® ínevirapine) (Boehringer iagelheitn/Roxanne, Coiutnbus, Ohio.s, RESCRlPTOR<g> (deiaviráine) (Pharmacia & Upjohn Cotnpany, Kalatnazeo, Miehlgan) és SUS'HVAY' (eíavirenz) (Bristol-Myers. Squibb).
A találmány szerűm ellenanyagokkal kombinációban 'beadható, proteáz-lnhibitorok lehetnek például ClUXtYÁW {mdixtavir-szulíat) (Merck & Cotnpany, Whiteheuse Starton, NJ), NORVIRs® (ritonavlr) (Abbeli
Laboratories, Chicago, II.), INVÍRÁSE® (ssqmnavir) (Rache Phísmaeemlcals, Nntley, NJ) és VIRACBPT® (nelfinavír) (Agouron Pharmacentícals, Sésíego, CA). A találmány egy konkrét előnyös megvalósítást snódía szerint, Mifetrovírálls ágenseket, tmkleozsd reverz transzkriptáz inhibitorokat nem- nukleozid reverz transzkriptáz inhibitorokat és/vagy profeáz-itibíbítorokat bármilyen kombinációban lehet alkalmazni a talámány szerinti készítményekkel AIDS kezelésére és/vagy HíV-íertözés prevenciójára vagy kezelésére.
A. találmány más előnyös megvalósítási módjai szerint, a találmány szerinti ellenanyagok alkalmasak anbopporíunísta fertőző ágensekkel kotnhmáciöhan történő beadásra, A találmány .szériáit készítményekkel kombinációban beadható, antíopportartista ágens lehet példáid trimetheprím:, pentamidm, szttlíametoxazoí, DAPSÖNE® (íaeobns Pharmacentícals, Prineeton, 50), ATÖVAQUONE® (GlaxoSMithKiine, Research Triangle Park, NC), ISONiAZilXk iCÍBA Pharmaceutiesís, Summir, Ni), R1FAD1N® (rifemptH)(Höechst-Msr)-iqn-Rousscl,
Kansas City, MQ), FYRAZÍNAMIDE® (Ledefrle, Pearl Rsver, NY), B1AXIN1> (elarítromlcm) (Abbott Laboratories, Chicago, ít), ΕΤΙ·1ΑΜΒί.;'Π'>!,·Α· (Leáelrie, Pearl River, NY), RIFARU'HNtfe (Pfeanoaeía & Upjohn Compssny, Kafcmtazoo, Mi), AZITHROMYC'FNík· (Füzér Inc., NewYork, NY), GANCICLOVIR (Roe.be Pbarcnaeeuricalx, Nuiley, Ni), FOSCARNEW (Ashfa,. Wesífeorongb, MA), C1DOFOV1R® (Gileaá Sciences, Festet City, CA), KETOCONAZOLE® (.lanssen, Títusvíilc, NI), ELÜC0NA2OLE® (Pfizer Inc., NewYork, NY), iTEACONAZOi..E«>
(Janxsen, Tiinsville, Ni), ACYCLOV1W (Ölaxo-Weíiconse, Research Triangle Park, NC), FAMClCOi.CIRf» (SmithKlme Beeehant Fharsnacentieals,, Pittsburgh, PA), pirimetsmin, leocovoría, NlriJPOGEN® (fiigrasfim/GM-CS]') (Arogen, Thonsand Öaks, CA) es LBUKlNDíő (sargramosbnvGM-CSFj (ímmnoex, Seattle, WA).
A találmány egy konkrét előnyös megvalósítási módja szermi, a találmány szerinti ellenanyagok és trsmetoprims/uliatneioxazoí és/vagy Atovaquone, Dapsone, Pentamidíne bármilyen kombinációját' adjak be opportunista .Pnt'toíuv.ysris carítmpneumostia-fertözés profi taktikus kezelése és/vagy prevenciója céljából,
A találmány egy·' másik konkrét előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagok és
Isoroazld, RlEADIN® (Merrell Dow Pharmaceuticais, Cmctrmati, Ohto), Pyr&zmaroide és/vagy Efharobuíol bármilyen kombinációjúi alkalmazzuk opportunista Áfycaiincterinm avium komplex fertőzés píOÍrlakíikns kezelése és/vagy prevenciója céljából. A találmány egy másik konkrét előnyős megvalósítási utódja szerint, a találmány szerinti: eltena40 nyagofc és RiS'abotin, Cíaritromicin és/vagy Azithnnnyctn bármilyen kombináttóját adjuk be opportunista Mycobacterium i®&wcul0sis fertőzés pro fi lak tikos kezelése es/vagy prevenciója céljából, A taiáitnány egy másik
-25konkréí előnyös megvalósítási módja szériák a íaiáhuány szerinti ellenanyagok és Ganciciovir, Fosearaet és/vagy Cidöfovir bármilyen kombinációját alkalmazzuk opportunista eitómegalovirus fertőzés psofilaktikus kezelése és/vagy prevenciója céljából. A találmány egy másik konkrét előnyös megvalóshási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagok és Fluconazolé, Tíáetmazole és/vagy ketoconazole bármilyen kombinációját alkalmazzuk gombafertőzés proiiiaktiktís kezelése és/vagy prevenciója céljából. A találmány egy másik konkrét előnyős megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagok és Ácyelovir és/vagy Farncicolvir bármilyen kombinációját alkalmazzuk opportunista, i. és/vagy II. tipusá herpes siurplex vírus fertőzés profilaktikus kezelése és/vagy prevenciója céljából. A találmány egy másik konkrét előnyös megvalósítási módja szerűit, a találmány szerinti ellenanyagok és pirimeíamin és/vagy leucovorin bármilyen kombinációját alkalmazzuk opportunista 'duvno göm/zí fertőzés profilaktikus lö kezelése és/vagy prevenciója céljából. A találmány egy másik konkrét előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagok és leueovorm és/vagy NEüPööíshí® (Arngen, Thonsand Oáks, CA) bármilyen kombinációját
Á találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a táláíaiány szerinti eilenariyagókat anlivirális ágenssel kombinációban adjuk be. Beadható aníivirális ágens lehet például ácyelovir, ribavirih, amanísöm és rernantidin.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagokat anílbakteriális ágenssel kombinációban· adjuk be. A találmány szerinti készítményekkel beadható anílbakteriális ágensek lehetnek például amoxicillln, aminoglikoziáok, béta-laktám (glíkopeptíd), béta-lakíarnázok. kbndamícin, kióramfenikol, celálosporinok, eiproíloxacin. eritrotnicln, flurokinolonok, makrolidok, tnelronidazol, penicillinek, kinolonok, ritampin.
szíreptomieia, sznlfenamid, tetraciklinek, trnaetoprisa, trfmeloprim-szulfamíoxazol és vankomicin.
Hagyományosan alkalmazott, nem-speeihku» nnnmnszupresszsv ágensek, amelyeket a találmány szerinti ellenanyagokkal kombinációban lehet beadni például lehetnek szieroidok, ciklösporia. ciklosporin analógok, eiklofoszfamid, metilprednizon, prednizon, azatsoprin, FK-506 (Ftgisawn Pharmaeeuíieais, Deerfreld, 1L), 15dézöxispergualin és más imnwnszupreszszlv ágensek, amelyek reszponzlv immunsejtek hmkciőjának szupresszálásával bálnak (ilyenek például T-sejtek), közvetlenül (példán! az ímmöasejtre hatva) vagy közvetve (ásás mediátor sejtre hatva).
A találmány konkrét előnyős megvalósítási módjai szerint, a találmány szerinti ellesanyagokat iminunszupresszánsokkal kombinációban adjuk be. A találmány szer m« t ellenanyagokká’· beadható Immunszapresszánskészítmény lene! például ORTHGC’LONE« ÍOKT3) (Ortho Biotech, Raritan, Ml), SÉS1MMUNE® ORAL (ciklosporin) (Sésoz Pharmaeeuíieais, Manőver, NI), PRÖGRAF® (tacrolitous) (Fujúawa Pharmaeeuíieais, Deertield, IE), CEELCEPT® (mikofenolát) (Roehe Pharmaeeuíieais, Nntley, Ml), azatsoprin, giükorüköszíeroulöh, és RARAMITNE® (sirolimus) {Wyeíh, Coliegevilie, PA). A találmány egy konkrét előnyös megvalósítási módja szermt, immunszupresszánsokaí az ellenanyagokkal kombinációban szerv- vagy csontveiö-traoszplanátunt kilökődésének prevenciójára lehet alkalmazni.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szermt, a találmány szerinti ellenanyagokat egymagában, vagy egy vagy több intravénás irnnmnglobulin-készitnrénnyeí kornhinációban adjuk be. A találmány szerinti ellenanyagokkal beadható, intravénás immunglobulin-készítmény lehet például GAMMARE® (Genteon, Kimkakes, 1L), IVEEGAMdé (Immutto-US Inc,, Rochester, Mi), SESOGLOÖtlLFN·® (Sésoz Fhannaeeutleals, íianover, NI), GAMMAGARD® (Baxter Healthcare, Glendaie, CA) és GAMIMGME® (Bayer Biologicak West líaven, CT)·.. A találmány egy konkrét előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagokul komhináeíóhtú? Intravénás immunglobulin-készítményekkel transzplantációs terápiában (például csoííivelÖ-transzplantáelőbari) adjuk ~2dbe.
A találmány egy további előnyős megvalósítási módja szerint, a találntány szerinti ellenanyagokat egymagában vagy gyulladáscsökkentő ágenssel kombinációban adjuk be, A találmány szerinti készítményekkel beadható, gyulladáscsökkentő ágensek lehetnek például glükokoríikoidok és nem-sztereód gyulladáscsökkentők, amme-arsi5 karbonsav-származékok,, sril-eeéisáv-szánnazékok, ári I-vajsav-származékok, aril-karbonsavak, arii-pröpíonsav-származékok, pimzolok, pirazolonok, szalicilsav-szátmazékek, ttazís-karboxamidok, e-aeetamido-k&pnonsav, S-aőchózlb metionin, í-amino-'l-hídroxi-vajsav, anhxetrm, benáazac, bcnztdamm, bueolome, dítenpíramld, ditazöl, emorlazon, guaiazulén, nabnmefon, mnesulid, orgoíein, oxaceprol, paranilm, perisoxal, pifextme, proqaszöns, proxazel és tenidap.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagokat szteroíd-íerápsával 10 kombinációban adjuk be. Kombinációban beadható sztél éid lehet példáid metil-predntzolon {példáid metil-prednizölonIV). A találmány egy konkrét előnyös megvalósitásl módja szerint, a találmány szermti ellenanyagokét prednizonnai kombinációban adjak be, A. ialálmány egy1 további konkrét előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerint! ellenanyagokat prednizoanal és egy immtmszupresszlv ágenssel kombinációban adjuk be, Rrednizonnat beadható tmmtmszupressz.lv ágensek lehetnek a leírásban felsoroltak, például azattopríu, eikíofosafamsd és ciklöfeszíátnid-IV. A találmány egy konkrét előnyős megvalósítási módja szerinL a ialálmány szermit ellenanyagokat metil-prednízoiönmti kombinációban adj uk he, A találmány egy további konkrét előnyős megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagokat metíl-prcdnizolonnai és egy mmmnsztipresszsv ágenssel kombinációban adjak he, Metthpredmzolono&l beadható mmmnsznpressziv ágensek lehetnek a leírásban felsoroltak, például azsittoprin, oifelofoszlatnid és ciklofoszíamiiMV.
2Ö A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szermti ellenanyagokat antimaláriás ágenssel komhínáetóban adjuk be. A találmány szerinti készítménnyel beadható aHtimaUtbs ágens lehet például hidroxik lorokin, klorokin és/vagy kinakrin
A ialálmány még egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szermti ellenanyagokat NSAlD-al kombinációban adjuk be, A találmány szerinti elienanyagokai adott esetben az alábbi drogok közül egy, kettő, három, négy, őt, tíz vagy több kombinációjával adjuk be: NRD-löl (I-Ioecbsí Marion Ronssel, Rsnsas City, MO), dictofenao {Dimethaid, Ontario, CN), káhum-oxaproztn (Monsanto), meeasermm (Chiron, 'Bmeryvrlie, GA), T-Ó14 (Teyama), disátrium-pemetrexsd {Eli Lilly, Indianapoiis, IN), ntreieuton (Abbott, Chicago^ IL), vgldeeoxib (Monsanto), eiíeuac (öyk Gulden, Melvíiíe, NY), cumpath, AGM-I47Ö (Takeda, Lmeoinslure, 1L), CDP-571 (Ceiltech, Rochesier, NY). CM-töl (GarhoMed, Nashvtífe, TN), M.LOOOO (Merek), CB-243Í (SS Biomedix, Surrey, UK), CBF, BS2 (KS
Bíomedlx, Surrey, UK), IL-tra gene therapy (Valeatis, Bnriíngatne, CA), JTE-522 (Japan Tobacco, Tokyo, Japan), páciítaxel (Angsotech, Vancouver, BC), DW-lóóliC (Dong Whs, Seoul, Korea), dürhufelone-mezilát {Pfizer Iné., New York, NY), szoinbílis TNF-reeeptor-i (synergen; Amgen, Thousand Oaks, CÁ), ÍPR 6081 (tefilttíe fór Pharmaeeuticaí Research), troeade (Roö'man-La Roche, Ntnley, N.1), BF5 (Scotia Pharnnteeuficals), BIJL-284 (Boehringer ingclheim, Ridgefieid, CT), BIIF-i 149 {Boehringer Ingeiheim. Ifidgeűeid, CT), LEUKOVAX® (Infiammaíics, Maivem, PA), MK--Ó63 (Merck, Whíiehótise Siaiton, NJ), ST-1482 (Sigma- Iau, Gahhersburg, MD) es feuííxöcori-propíonáí (Pfizer Iné., NewYork, NY).
A találmány még egy előnyös megvalósítási módja szerint, a ialáhnásty szerinti ellenanyagokat BMARB-ufckal kombinációban adjuk be. Tehát, az alábbi drogok közöl egyet, kettők hármat, négyet, ötöt vagy többet lehet alkalmazni: meíoírexáf, íefhmömtd, edatrexate, spsfoprim, íometrexol, piritrexirh, trimetrexát, brodímoprim, MX-6S, N-[4-[3-(2,440 diamino-ő,7-dih.idro-5H-cíkloi)enfa-[dj-piri!nídm-ő-il)-propil|-benzoií.]-L-gh.tiím5.insav, N-Π5--(.2 -(?.-amino-l,4,5,6,7, hexahsdro-4-oxopírido-[2,3-dj-píri!nidín-Ó-íi)-etslj-2-tseniíj-ktsrfeönilj-L-gluíamtnsav, ÍR)N-|j5-i'2-(2-amino-Í,4,5,6,7,8-27bfixahídro-4-<íXnpiridOr-(2,3-d]-plrimidin-ó-tljetii]-2dienilj4ía3‘böntlj-L-gháat«msav. bl-((2(4-diatnlno-2,4,5,4,7,8bexaÍi!dru-pirido-[2,3-d)ptrimídin-6-iij-etiÍ)-2~tienii-karboínl-L-glutíim!nsav, (5)-2-(1 (4-karboxi-4-[[4-[i(2,4-diamino-6~ pteridini5)-meíi!|-amínöj-benzoift-ammoj-but3i]-aminoj-k&rbönilj-benzöesav, N-í4-j3-(2,4-diamino-l-H-plrrolo-[2,3~ dj-pirimidin-5-ii)-propili-benzoílj-l<gk»ammsay, 2,4-diam!no-ó-(N-(4-(iénil-sznlíóni;}-benzü)-meti)~amino)-kínazolúi,
2,4-dia!ri!no-544-l3-(4-aínmö-feslL4-szulíönii-feni)-ammo>propoxi)-3,5~djmeÍoxi-beRzilj-pirintidis, ^-(4-4-(2,4diamino-S-pirimidimlj-butill-beíizoin-t-glníaminsöv, N-(4-(3-(2,4-dÍamlno-5-pirimidiml)-propil]~benzoílj-Lghítaminsav, N-ld-P^^-díamíno-S-pteridinHj-ettlJ-benzosiH'^^n-DL-gluiaíninsav és N-(i-ineíil-«tji)-N”[3(2,4,S4riklór-fenoxi)-propoxij-iutide~dikarbonimid~diamld-hidroklorid (FS35), szultázalazin, Ráírium-auroíiontaláí, auranotm. ciklosporin, perbáliam;», azatiopris, antimaláríás drog (példáid a leírásban ismertetett), ákloíősztámid, kiőrsmbueii, arany, Erimet (etaoereepij (Wyáh-Ayersi Laboratories, Philadelphia, FA), anti-TNE-ellenanyág és prednizolón. Λ íaiálmátiy egy előnyösebb megvalósítási módja szériák a találmány szerinti ellenanyagokat aoíima&iás ágenssá, metotrexáítal, antí-ThiF-sl, Enbrei-sl és/vágy szulfezalinnal kombinációban adjak be,
A találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagokat metotrexáítal kombinációban adjak be. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagokat anti-TNF-ellenanyaggal kombinációban adjuk be, A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagokat meío'rexáttai és aníi-TNP-ellenaoyaggal vagy arui-kas-ellenanyaggal kombinációban adjuk be, A találmány egy mastk előnyös megvalósítás! módja szerbit, a találmány szerinti ellenanyagokat sznlfazalínnai kombinációban adj uk be,
A találmány egy másik konkrét előnyős megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellennnyagokoi metotrexáítal, anti-TKF-ellensnyaggal, anti-Fas-sHenaayaggal és szallázalinnal kombinációban adjuk ize. A találmány egy másik előnyős megvalósítási módja szerire, a találmány szerinti ellenanyagokat fotbrel-el kombinációban adjuk be. A találmány egy másik előnyös meg valósítási módja szer im, a találmány szerinti ellenanyagokét Fnbrel-el és rnetotrexáttal kombinációban adjuk be. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagokat az alábbi anyagokkal kombinációban adjak be: Enbrel, meíoirexát, szulfcaiazm, leílunentid, etforicoxib, titisoprostökdielofenac-ttátrims, valdecoxíb, túacöxib, rofeeoxib, eeleeoxib, galaníanna, darbnfelonemezslál, aceclofenac, Mt-ŐöOŐ, anakinra, nátrium-bíalaronáí. mmeszutíö, mikotfenelát-moiétik dtaeerein, nátriumsiveieslst, deilazacon, nataefétr-hldroklorid, szarnárium-152-lexidrosam-pentanátrimn, pentöstatin, Ί-614, arniprdosehidroklorid, roeepalánt, ampíroxieam, prednizolon-femezilát, meloxieam, náiriurn-áiklofenac, lomoxieani, szalazo.sznlfepiridine, eíödolae, ílupirírne-maleát, ebselen, tacrölhmís-bnirát, nabumeíone, cloprednöL pir<fx.iearn-ám!nmát, prepuazone, rimexolone, fenretiníde, imidazol-bidroxsbenzoát, droxicam, ientiazae, alfaeafeideí, haiopredon-diacetát, gnsperimns-bidrisklorid, inozin-pranohex, aetarit, indometacin-íámeiíil, tnizötibine, toltenámsav, dlíbtaisat, piróxiéam, oxaprozin, nátriutn-h.ialuronát, buesilatmn, cikiosporim ílektafenin, tenoxieam, dexgmetazöft-palxöitát, nátriumamténae, acemeíáein, anranofin, diráírioor-lnbensarii, vagy bármilyen konrbmámőikkal,
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, á találmány szerinti ellenanyagokat Fnbrel-el, msíoírexátíal és szn.lfezalisnal kombinációban adjuk be. A találmány más előnyös megvalósítási módjai szerint, egy vagy több autimaláriás ágenst kombinálunk a fentebb felsorolt kombinációkkal. A ialábríány egy konkrét előnyős megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagokat antimaláriás ágenssel (például hidroxi-kiörokttmel), Enbrel-el, mefotrexáttal és szulíázalínnal kombinációban adjuk be. A találmány egy másik konkrét előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti eilenanyágoköl autimaláriás ágenssel (például btdröxi-klorokinuei), szttiíázaibmal, antí-TNF-ellenanyaggaí és nmoirexáttal kombinációban adjuk be.
A találmány más előnyős megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagokat kemoterápiás
-28ágeassel kombinációban adjak be. A találmány szerinti készítménnyel beadható kemoterápiás ágensek lelteinek például antibiotikma-szártnazékok (például doxorubicin, bleomiein, daunorubtem és daktinöniicin)- andőszt-Ogéitek (például íatnoxiíén); antirnetabolitok (például fiuor-uraeti, 5--R.1, usettórexák fioxuridin, interferon-alía-cB, giuiaminsav, plíkaroiein, merkaptopurín és ő-tiog-nanlnín}; eitotoxiktis ágensek (például earmusíine, BCNU, iornustíne, CCND, citozln5 arabinozid, eiklofószfatnid, Sszírarousfin, bidroxi-kmbamid, prokarbazin, rmtomicin, buszúik®, eisz-piat® és tónkrisztin-szulini); hormonok (példán! medroxi-progeszteron, sátriam-öszd-srnustine-fbszfát, efinil-ösnt&diol, ösztradiol, megesztrol-acetát, metil-tesztnszteron, dietií-sztilbesAroi-difbszlát, kíőr-tríaniz.én és feszfolakíon); nitrogén · mustár származékok [például mefalén, chorambueil, mekforetamítt (nitrogén-mustár) és tioiepaj; ssseroidok és kombinációk (példán! betarnetazon-nátríum-fbszfát)· és inások (például dikarbazin, aszoaragináz, nsitotant, vinkrisztínlö szobát, vlbblasztin-sznllát és stópozid).. Más kemoterápiás ágens lehet például CPT-1 i, deflunorttid, etkloheximid és rnüoínicin,
A találmány egy speciális előnyős megvalósítási módja szeri®, a találmány szerinti ellenanyagokat kombinációban adjuk be CíiöF-al (ciklofoszfamid, doxorttblei® vbíkriszlin és prednizon) vagy CilOP-vegynietek bármilyen kombinációjával, A mlálmány egy másik előnyös megvalósítási mórija szerint, a találmány szerinti ettertanyagokot Riimtitnab-ai kombinációban -adjuk be. A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagokat Rituximab-sd és CHÖP-al, vagy Rituxtmab-al és CHÖP-vegyülereL bármilyen kombinációjával adjuk be,
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagokat eiíokiuekkel kombinációban adjuk be. A találmány szerinti készítménnyel beadható eitokin lehet például GM-CSF, G-CSF, ÍL20 lalpba, lldbeia, 11,-2, Í.L-3, 11..-4, 11,-5, IL-ő, IL-7, ÍL-S, 11..-9, II.,-10, 1L-31, it-12, 11,-13, 11,-14, ik-15, It-lő, 11,-17, ÍL-18, ÍL-19,1L-2Ő, 11,-21, anti -CIM0, CÍMÖL, IFN-aíik íFN-béta, IFN-garmmr, TNb-aífá és TNÍ-'-béta.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szeriül, a találmány szerinti ellenanyagokat hematopoetíkus növekedési faktorral kombinációban adjuk be. A találmány szerinti készítménnyel beadható, hematopoebkus növekedési faktor lehet például EEUKINB®· (sargramosd®) és NEÜPOGEN®: ifügrast).
A. találmány további előnyös megvalósítási módjai szerint, a találmány szerinti ellenanyagokét egy vág}' több, más terápiás vagy profílaktikus kezelési renddel, példáid sugárterápiával kombinációban adjuk be.
Egy terápiás ágens olya® vegyület vagy készítmény, atnedy hatásos patológiás állapot javítására. Ilyen terápiás ágens lehet például egy rákellenes vegyület, a TNF-esalád tagiak gyulladáscsökkentő ágensek, antiviráks ágensek, anhretrovirális ágensek, ;®i:iopportunista ágensek, ántibiotikámok, immunszupressziv ágensek, immenglebuíinök, aníimaiáriás ágensek, betegséget módosító betegség-módosító aníireumaíikns drogok (DkfARD-ok), citoksnek, ke> ruokinefc, növekedési faktorok és olyan második ellenanyag, amely elősegíti a célsejtek apopfózisáí.
Egy rákellenes vegyület vagy kemoterápiás készítmény olyan vegyületet vagy készítmény, amely hatásos abnormálisán növekvő sejt növekedésének: gátlására vagy fékezésére. Tehát, ilyen ágenst terápiásán lehet alkalmazni rák, valamint olyan más betegség kezelésére, amelyre abnormális sejtnövekedés jellemző. Rákellenes vegyület győgyászatilag hatásos mennyisége olyan mennyiség, amely egy «gyednek beadva elegendő abnormális:® növekedő sejt növekedésének gátlására vagy megfékezésére. Rákellenes vegyületek például: bleomiein, karboplgtus, klóraisbueil, eiszplaf®, koícfeietn, ciklo&szlbmid, dauítorubiesi, dakíinomicm, dietfl-sztilbesztrol, doxorubíct® stopozid, S-íluoruracil, fioxuridín, melfálárs, metotrexáí, mitomlcm, ó-merkaptögurin, íempozid, 6-tioguanin, vmkrisztín és vinbiasziin, Rákellenes vegyületekre és terápiás ágensekre további példák találhatók; „The Merck Ma-mai of Díagnosis and
Therapy”, 15, kiadás, Betkow és munkatársai (szerk.) (1987); Rabuay, N. .1 és Sladek és munkatársai, „Metaboíism and Actkm of Amí-Cancer Drugs, Powis és munkatársai (szerk,), I’aylor and Prancis, New York N.Y. i 198?).
-29A íalátodny szerinti ellenanyagok továbbá kombinálhatok más terápiákkal, például kemoterápiával és/vagy sugárterápiával maíignitás (rossztndulatö daganat) kezelésére, és a terápiás hatás javítható ápoptózis-índukáló vegyűletekkel, például biszindólíTriialelríííd-Vin-al (BisVl 11} vagy más szénzíbílízáló ágensekkel, például SN-SÖ-nel és LY2940Ö2-vel. Tehát a találmány egy előnyös megvalósítási utódja szerint, a találmány szerinti ellenanyagokat kombinálni lehet BlsVRl-aí és egy kemoterápiás szerrel (ilyen például adriamíein, etopezid, tepetecan, taxotere és paehtaxel). A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti ellenanyagot vagy ellenanyagokat kombinálni lehet ücm-sztcroid gyulladáscsökkentő droggal (például szulindak-szulfiddál vagy más COX-1- vagy' COX-2-inhibitorokkai), kemoterápiás szerrel (ilyenek például adrianricín, eto.poz.id, íopeteean, taxotere és paelitaxel). Más betegségek, például autómwnm és gyulladásos betegségekre kezelési kombinációkat is lehet alkalmazni, Például egy ellenanyagot be lehet adui más terápiás ágensekkel, például kemoterápiás ágensekkel, gyulladáscsökkeníö ágensekkel, DMARD-okkal, meiotrexátüri, bisz-indolil-maleimíd-Vin-al, vagy más xzenzibiiizálö ágenssel és hasonlókkal együtt. Sugárterápiát szintén lehet kombinálni más terápiás ágensekkel gyulladásos és au20 toimmun betegségek kezelésére. Szakember képes adaptálni a sugárterápia formáját a konkrét gyulladásos vagy autoiíuíuun betegségre (például sugárzásos szmovekíóroia attrtrisz kezelésére).
A találmány szerinti ellenanyagokat alkalmazó terápia kombinálható találmány szerimi. másféle ellenanyagot alkalmazó terápiával is. Például DRS-re specifikus ellenanyagot és I)R4-re specifikus ellenanyagot be lehet adni ilyen kezelésre szoruló alanynak TNF-re, B?-re, GlMb-lígaudumra, CD40~re, CD28-ra (például rítuxítnab), Fas-ra specifikus ellenanyaggal vagy kombinációjukkal együtt, ezeket megelőzve vagy ezeket követve. Ilyen kombinált ellenanyagterápiát tovább lehet kombinálni egy vagy több terápiás ágenssel (például kemoterápiás szerekkel, doxortibícinnal és/vagy metofrexáttal), sugárterápiával vagy mindkettővel.
Tehát, a találmány tárgyát képezi, az 1. igénypontban meghatározott, ót vtóz? eljárás apoptözís szelektív isdukálására vagy proüferáeió gátlására DR5-őf expresszálő célsejtekben A célsejteket olyan sejtek lehetnek, amelyekben az apopiózís-rendszer renáellensen szabályozott, neutrofílek, aktivált límtóeiták vagy aktivált ímrnnnsejíek (például tlmícid-sejtek és mtelöid sejtek), virusisriözöíí sejtek, és abnormálisán probíerálő sztnoviális sejtek atttoitntnún betegségekben (például reurnatoid artritiss által érinteti szmoviáüs sejtek, ideértve gyulladásos sztnoviálís sejteket, aktivált liratbid és míeloid sejteket az ízületi hártyában, makroí'ág-szern szinovioetíákai és Shröhiasxí-szeríí szioövíoeítákat}. A. régebben leírt anií-DR5-ellettanyaghoz (24) képest a találmány szerinti, demonstratív TRÁ-8ellenanyag apoptózrst indukáló aktivitása nagyon erőteljes, és Xukat-sejtek apoptőzísát képes pg/ml koncentrációban tó i-síri.’ indukálni, és a régebben leírt, szoiubiiís TR.Altóhez képest jobb íumorieid aktivitással rendelkezik tó vrw. Egyetlen dózis .fRA-8 intravénás beadása elegendő mind szilárd, mind bematopoetikus tumorsejtek növekedésének gátlására, míg tó vtóo tumor-regresszió sndukáiásához szohibilis TRAlL-el sókkal magasabb dózisra van szükség (napi 5t>0 pg 111 napig). A találmány szerinti tud i-TRAÍ tó-receptor ellenanyagok olyan biztonságosnak tűnnek, mint szoiubiiís TRA1L, űrivel például a TRA-S-ellenanyag nem indukálja nern-íranszfornridt Ííbroblaszt-sepek apoptőzísát. Hasonló eredményeket figyeltünk meg DRA-ellenanyagokksl is.
A vektorok lartnhnazhnísták D.R5- vagy DR4-eiicnanyagnak megiékdő immunglobulin nehéz, vagy könnyű láncát kódoiő nuklemsavszekvenciát működőképesen kapcsolva szabályozó elemhez, például promóterhez vagy ebhatrtzerhez. A ..mliködöképesen kapcsolódik’' kifejezésen a leírásban nukieínsavszekveneíák olyan elrendezését értjük amely ügy van konfigurálva, hogy szokásos funkciójukat elvégezzék. Tehát, egy polipepíidet kódoló nnkíeoudszekveneíához működőképesen kapcsolt szabályozó elem képes s pölipeptid: transzkripcióját, repiíkáclóját és/vagy transzlációját vezérelni. Szakember számára nyilvánvaló, hogy egyetlen vektor adott esetben tartalmazhat DR5- vagy k>R4-siienanyagnak megfelelő immunglobulin mind nehéz, mind könnyű láncát kódoló szekvenciákat.
-30A vektorok kódolhatják immtmgloh',dinek humanizált könnyű vagy nehéz láncát.
Az alábbi példák a találmány szerinti eljárások és eredmények illusztrálására szolgálnak A példákat: nem arra szántuk, hogy a találmány szerinti megoldás valamennyi vonatkozását tartalmazzák, hanem inkább reprezentatív eljárások és eredményei szemléltetésére szolgálnak.
1.1 ÜRS-eDNS klónozása
Humán I>R5-fehérjét kódoló DNS-t az alábbi RT-PCR-módszerrel klónoztunk:
IÖ ajTemplát
HeLs-sejtekből össz-RNS-t extraháltunk „TRIxel Rengeni” (GíBCO BR.L) alkalmazásával. RCR-reakeiőhoz templátkést olyan cDNS-í a&almazttmk, amelyet „birst-Sírand «DNS synthesis kit” (Amersham Pharmacia Blotech) alkalmazásúval állítottunk elő a reagenskésziethez mellékelt használati utasítás: alapján.
b) PCR-prímerek
Az alábbi lánc ind í tó oligennkleohdokat szintetizáltok a PCR-hez:
SAgacgatgcecgatctaedtaagggG’ (DR5pl: I . az. számú szék ); ő'-ceactgggtgatgttggatggg-y (DR5p2: 2. az. számú szék.);
Ha máskén· nem jelöljük, ebben a példában: alkalmazott, valamennyi öílgwkleotidot a ..Lsíemchnologies” eégnél sziníebzáhatmnk. Minden öligonukleötldot -2ÖöC-on tárolunk, mintán feloldottuk desztillál! vízben.
e) PO-reakeló
A PCR-reakeióoldat összetétele: cDNS-tempiát, 5 pl (33 pl a reakció Sssztértogata)
DRjpi-jeKí láncinditó oligonakleótíd, 10 pmol;
DP.5p2-ielü íáncindito oligonnkieotid, IS pmol;
10 x koncentrált PCR-pnftér (a készlet tartalmazza), IÖ p l;
dNTR-k (egyenként 2,5 mM), 4 μί; és Taíppolimeráz (Rromega), S egység.
Steril desztillált vizet adtunk az oldathoz 1Ö0 pl végtérfogaíig. Hacsak másképpen nem jelöljük, a dNTP-k, azaz dA TP, dCTP, pGTP és dí TP mennyisége a keverékben ekvimoláris (egyenként 2,5 ruM).
A PCR-reakciót az alábbiak szerint végeztük. Az oldatot először felmclegitettük S4°€-ra 2 percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük: $4«C 30 másodpercig, 52öC 1 percig és 72°C 3 percig, 40-sz.er ismételjük. Az eljárás befejezése után a reakcióoldatot ?2GC-on melegítettük 10 percig.
Az így amplifikált DHS-fragmenseket 0,25 pg/ml etídium-hröm dót tartalmazó, 1%-os agaróz-géles elválasztotpík. Azokat a csikókat, amelyekről rnegállspltodök, hogy tartaimazzí k a ki vaut DNS-Iragmenseket, kivágtuk .35 borotvapengével, és a DHS-t kinyertük belőlük „Gene Cicán kit” (Blölöi) alkalmazásával, A DNS-írugmenst ,J'A Cloning Kit” (Inviírögen, CA)· alkalmazásával klónoztuk. Ezt az. alábbiak szerint végeztük.
A PCR-reakcióoldáíból kinyert DNS-fríigmensl, 50 ng pCR2 1-vektorral (amelyet tartalmaz a „JA Cloning Kit) összekevertünk 1 pl, tö X ligáz-reakeiópüfferrei (6 mM Trss-HCI (píí 7,5), ó mM megnézíum-klorid:, 5 mM nálrlumklorid, 7 mM 3-toefkaptoetanól, Ő,1 mM ATF, 2 niM DTT, 1 mM spermidin és 0,1 mg/ml íttarhaszérum-aibnmlnj, amelyhez 4 egység T4~13NS-IÍgázi (1 pl) adtunk. A keverék össztéríogatáí 10 pl-re kiegésziiettük steril ionmentes
-31 vízzel, és az eredményül kapott ligáz-oldatot 14°C-on inkubáltuk 15 óra hosszáig. Ezután 2 p.i llgáz-reakeíöoidatot hozzáadtunk 5(1 pl, kompetens £. coli TOP lÖF’-iörzsbdz, amelyet a „TA Cionlng Kit” tartalmasod, és kompetenssé lettök a használati utasítás szerint, ebhez 2 μι, 0,5 M β-merkaptoetanoft adtunk, és az eredményűi kapod keverékei jeges iartoduk 30 percig, majd 42Λ0-οη 30 másodpercig, és ismét jégen 5 percig. Fzutáís SÖÖ ul, 2 tf% rtíptoni, 0,5 ve5 gyes% éíeszidkivonatok 0,05 vegyesük nálrium-kloridoi, 2,5 bsM káhum-kloridot, 1 snkí magnézinm-kloridot és 20 mM glükóz! tartalmazó tápfcözegel <a továbbiakban ,,SÖG”-íápközeg) adtunk a tenyészethez, és a keveréket 37C-on 1 óra hosszáig inkubáltuk rázatva, Ezután a tenyészetet löö pg/ml ampicíliint tartalmazó, „1.,-hrotb” agar-tálcára (Diíco) (1 tí% tripton, Ö.5 vegyes% éiesztőkívottat, 0,5 vegyesük nátrium-klorid, 0,1 vegyes% glükóz és 0,ő vegyesTó feactougar) széieszteltök. A táScán megjéfenfi ampíeiílm-rezisztens telepeket kiszelektáltuk és iekapastuk platina oltőhurokkai, és í 0Ö: pg/ml amptoílimt tartalmazó, „E-brotb” tápközegben tenyésztettek ST'G-on, egy éjszakán át,. 200 r.p.m.-en rázatva. inknbálás után a sejteket ceHrrifbgáiással elkülönítettük, amelyekből plaznnd ÖNS-t preparáltunk alkalíkux módszer alkalmazásával. Az igy kapod plazmidbóT származó, DRS-cÖNSí lartidmazé BcoRt?BeoRl-irzgdienSt szdbklóaoztuk peBlslÁ3-p!szmidba (Invítrogón, CA). A peDNAa-bau lévő, teljés hosszúságú l)R5-gé«t szekvenátok, és ez egyezet! a közök szekvenciával. Az igy kapud plazmiáöí pcBriA3-i')R5-plazmidnak jelöltük.
1,2 DRS-lgG expressziós vektor előállítása
Humán D85 transzmembrán dómén nélküli, szoluhiiis fórmájának előállítása céljából eiöálhlötbmk egy expressziós piazmidvektort. Ezt a vektort ágy terveztük, hogy humán DRS extraceiktláris doménjét humán IgGl-FeDNS-hez fuzionálva tartalmazó, fúziós fehérjéi kódoljon (41). Olyan humán OR5-Ő1 kódoló DNS-t, amelyből hiányzik a iranszmembrán dómén, az alábbi PCR-reakcióval állítottunk elő.
A PCR-reakcíőboz áíkalmazott tempiát peDbl A3-DR5. b) ECR lánchnildi rdígoKukleotktok
Az alábbi láneínditő oiigodukleotídofert szintetizáltuk a PCR-bez:
5'-gaegatgeeega!etaertíaaggg~3’ (DR5p 1:3. az, számé szék.);
á’-ggsücegtggaeacartegatgte-S' (DR.5p3: 3 . az. számó szék,)'
Hacsak másként nem jelöljük, ebben a példában alkalmazott,, valamennyi oiigonukieotídot a tifeíechnologies eégnél szinielizáiíatdmL Minden csligrmnklestláot -20cC-on tárolunk, műdén feloldottak desztillált vízben, e) RCR-reakció
A PCR-reakcio! és az amplifikálí DNS izolálását az 1 t (e) példában leírtak szerint végeztük.
Az Így előállítod plazmídot p(..'RADR5-piazmidkéní jelöltük. Humán Fc-fragmeusí kódoló Bámílf/EenRlRagmenst, amelyet pmFas-hlgGlFc-bőí nyertünk kí, peDNA.I Bandii- és BcoRl-jelü snultiklóuozó helyeire szubklóhoztuk. Az így kapod plazmldot peDNAFc-nek jelöltük. Továbbá, a humán szolnbilis DR5-régiós kódoló BámHi/BamHf-iragmensk amelyet pÜR»ADR5-bőt nyertünk ki, peDNAÉe-plazmld E&mfif-heiyébe szubklóuozdtk. Az így kapott plazmldot pcDNAADRS-Fc-plazmidkent jelöltük, A humán szofubiiis DR5-ÖÍ és humán IgG-Fc-régíói kódoló BcöRí-íragmesst, amelyet kinyertünk a peBN AADRS-Fe-piazmídból, tompa végűvé aiakhod.uk QNS-poiimeráz Ktenow-fragniensévei (CISCO 13RL), majd szubklónoztuk pAdCMVS-jelti ingázó („shuüle”) vektorba (Quantum Bioíeebnolögíes iné., Kanada), amelyet tompa végövé alakhortunk. miután BamHÍ-enzimmel hasítottuk, így jutottunk a pAdADRó-Fe-plazmidhoz
E3 Humán-l>8S-lg€it fúziós fehérje expressziója és tisztítású
QBI-2ó3A-sejíeket (az AHENÖ-Qoesl Kit tartalmazza) kotransziéktáidmk pAdADR5-Fc-vei és QBi-virális
-32DNS-sel (az ADENO-Quesf O tartalmazza) „ADENÖ-Quesi Kit” alknlntazásával (Qümüum Bíotfidmoiogies Inc., Kanada), a gyártó által mellékelt használati utasítás szerint. A rekernbináns virusplakkokat tenyésztettük és DRS-lgG fúziós feltétje expressziójára szkfinéitök á félülúszó ELISA-ánaíizisevel. A pozitív plakkókat QBi-293Á-sejtékben ampliftkáituk, és -S0°C-on tároltuk vísmskészieíkent. 50 tenyésztőedényben (150 mm) QBl-293A-sejtet transzíéktáitunk pAdADRő-Pe rekombmáns vitmssai: 1Ö m.o.Lveí (fertőzést egységgel), A tenyésztési sápkőzegekef & transzfekiálás alán 4§ órával elkülönItett11k.
A DRS-tgö-gónt tartalmazó, transzfektált sejteket 1 x lö* sejt/mhes sűrűségig növesztettük ágy, hegy 10 tí% ECS-i tartalmazó, 500 ml DMEM (GIBCQ) tápközegben mkabáltnk 37’T-ost, 5 tf% szén-dioxídot -tartalmazó atmoszférában, 2 napig. Majd a tenyészetet lecentrifegáítuk (1000 r.pmt,, 5 pereig), és a teiülüszét elkülönítettük. DRS10 IgG tisztítását a felolászőhói ErotelnG-Sepharose CE-4B allmífás-kromatográfiával (Phannaesa) végeztük az alábbi körülmények között:
oszlop: ProteinA-Scpharose CE-4B oszlop (oszlop mérete: 2 mi; Pharmaeía); eineiós puf&r: 0,1 M gilcin (pH 2,4), 0,15 M MaCl; semlegesítő pufiét·: 1M Trís-HCí (pH 8,5).
Az összes íelülúszoí felvittük az oszlopra, azután 20 mi PBS-el háromszor mostuk,, ntajd 1 ml térfogatú dúciős puffért adagoltunk tízszer. Mértük az előáll frakciók (1 ml) optikai denzitását. A 2-5. számé frakciókat (> ΟΟ2β0 =*· 0,1) szedtük, hozzáadtunk 100-1 Őö pl semlegesítő puffért, és az eluáíumokat dialízis-zacskóba tettük külön-küiős, és az eluáiumokat 1 liter PBS-el szemben (pH 7,5) díalízáitűk 4üC-ön. A dialízis-pufiért kétszer cseréltük.
Azután az eiuáfamokat DRS-igG-géntemtók expressziójára vizsgáltuk Et.lSA-val. Először, az egyes ífákciókból i Öö-iOO pl-t 96 mérőhelyet tartalmazó mikroíiter-fáicába (Costar) adagoltunk, és egy óra hosszáig inkubóltuk 37°C-oö. Ezután íí mérőhelyeken lévő oldatot eltávoiííotíuk, és a tálcái háromszor mostuk 1ÖÖ pErsérőheíy 0,1 tf% Tween 20-aí (a továbbiakban „PBS-Tweetf’) tartalmazó PBS-sei. A mosást követően 2 vegyes% ntarhaszérura-albuminí fa tovabbuKbun „BSA”) tartalmazó PBS-t adagoltunk 100 pi-mérőhely mennyiségben, majd a tálcát 37°C-on utkubáltuk egy óra hosszáig, Ezután a mérőhelyeket további háromszor mostuk 100 μί/mérőhely PSS-Tween-eí, majd ezt követően
PBS-Tween-hen íOOŐ-szer hígított, anti-human-IgGl monoklonálts ellenanyag-oldatból 1Ö0 pl/mérőhely mennyiséget adagoltunk az egyes mérőhelyekre, és a tálcát még egyszer inkubákuk 3?°C-on, 1 óra hosszáig. Azután a mérőhelyeket háromszor mostuk 1Ö0 pl/méröhely PBS-Tweeu-eh Azután 3<3y5,5'-tetran:setil-benzÍdln (a továbbiakban „TMB”) folyékony szubszttát rendszert (Slguta) adagoltunk löt) pl/méröhely mennyiségben, és a tálcát szobafeőtnérséklelen hagytuk állni 5 percig, majd a nsakeiót 190 μΐ/mórőhely 0,2 hl HjSO^ hozzáadásával állítottuk le. Az egyes mérőhelyek abszorhanelájáí 459 nm-en leolvastuk a kötött ellenanyag koncentrációjának meghatározása céljából, kontrollként a 959 nm-en leolvasott ahszörhaneiát használtuk. Az abszorbaneiát míkrotiter-íátcaieolvaső alkalmazásával mértük (Molecular Devices). DRS-lgG 3 -termelését ezzel az EL1S A-eljárással igazoltuk. Az expresszáit DrS-ígGi íuziós fehérje molekulatömegét western-bloi analízis alkalmazásával hahboztuk meg, amelybe» amí-hnrnán-ígG I mAb-t (Sigma) alkalmaztunk az ellenanyag detektálására a gélbett. Az expresszáit ÖRS-lgGl fejős fehérje molekulatömege köröiheiüi 59 kDs. Az elért tiszíaság 90%-nái több, amit SDS-PÁGE- analízissel vizsgálunk és a fehérjéi Coomassie blue festéssel detektáltak.
pékks
Hnmáa DRS-ellenl monoklonáhs eltenanyngok előállítása
-336-8 hetes nőstény Baib'c-egereket (Jackson Laboratoty, Bar Harbor, ME) imm-inszáhnnk afírnitás-tisztdott humán DRóíklgGl föziös fehérjével· Az első .«amunízátást talpba adtok, a fúziós fehérjét <50 gg) komplett Freundadjuvánsban (öl&o, Gettóit, MI) emulgeáítok. Ezt követően az egerek négy ismétlő injekciót kaptak, amely 50 pg fúziós fehérjét tartalmazod adjuváns nélkül, minden második napon. .Az utolsó injekció után három nappal a lokális nyi5 rokcsomóhól származó ümíócitákat fuzionáltuk NS-l-jeiu mselörna-sejtekkel, és a hihridóniákat 10% magzati hörjttszérummní kiegészített Fi04-tápközeghe® tenyésztettük. Pozitív hibridómákat szelektáltuk EUSÁ-val, amelyhez a tálcákat I pg/ml DRó/hlgGI-el, vagy kontrollként ugyanilyen koncendációhan Eas/hlgGl-el burkoltok, Á htbrídómák ízöíiptisát BLíSA-val határoztuk meg, amelyben kecskében termeltetett, egéreredeto Ig-izotlpusra specifikus ellenanyag-panelt (Southern Biotechnology, Birmingham, Át) alkalmaztunk. Monoklonális ellenanyagokat affinitás1Ö kromatográfíával tisztítottunk, immobtHzálí anfí-egér-lgG1 vagy proteinG (Slgnsa) alkalmazásával.
2.2 Sejtfúzió
A harmadik napon, az ismétlő injekció után a lokális nyirokcsomókat eltávolítóitok az egérből, és lö ml szésormmeotes RPMl~i640~tápközegbe (GIBCO BRl·) tettük, amely 50 egység/mí penfelílmt, 50 pg/ml szdeptomíemí és 3öŐ pg/ml L-ghdammsavat tartalmazod, majd a szervet szétroncsoltok úgy, hogy szitán (Cell Sirainer; Falcon) átoyomtuk spatulái alkalmazva. Ennek eredményeként kapott sejtszuszpenziőt íecetdrifugáltok a lokális nyirokcsomósejtek leüiepdése céljából, amelyeket ezután kétszer mostunk szérummenies RPMf-tápközeggei. A mosott sejteket azután újra felszuszpendáltok szérammeníes RFMl-tápkőzegben, és megszámoltok.
Közben NSl-jelü mlelóma-sejtekeí (American Type Culture Coileetlon: TIB-18) 1 x lö* seji/mi-t nem meghaladó sejtsürüséglg növesztettük lő íf% FCS-t (Gíbco BRL) tartalmazó ASF104-tápközeghen (Ájirmmoío, K. K.;
„ASíMápkőzeg szérummal”), 37Ύ.’-οη, 5 tf% szén-sisoxidot tartalmast atmoszférában, majd ezeket a fentebb leírtakhoz hasonlóan szétzúztuk, mostok, újra felszuszpendáltok és megszámláltok.
Az NBI-sejtszuszpenziö olyan mennyiségét, amely számításaink szerint 3 x lő' sejtet tartalmazott, Összekevertük olyan mennyiségű íépsejt-szuszpenzíóval, amely szánkásaink szerint 3 x 10s sejtet tartalinazoít, Az eredményül kapod keveréket lecenirlfugáitok, és a felülúszót eltávolitoduk. Elvégeztük az alábbi lépésekből álló sejtfúziót, miközben az üledéket tartalmazó műanyag csövet állandóan 37°C-os, meleg vízben tartottuk egy főzőpohárban.
Ezt kővetően 1 ml, 50 vegyes% políetllén-gllkol-lSÖÖ-aí (Boebrioger Mannheim) adagoltunk lassan a csőbe, miközben az üledéket folyamatosan kevergeítük a pipetta hegyével. Ezt követően 37°C-ra előmelegített, 1 ml szérummentes RPMl-tágkÖzeget adtunk hozzá két részletben, azután további 7 ml, szérummentes RBMI-táphőzeget adtunk hozzá. Az eredményül kapcát keveréket ieeetiüiftígálíuk, a felülúszót kidobtuk, és 10 ml, 10 ;f% FCS-t tartalmazó líAT-tápkőzeget adíunk hozzá, miközben pipetta hegyével gyengéden kevergeítük. További 2Ö mi, 10 d% FCS-t tartalmazó HAT-tápközeget adíunk hozzá, és a szuszpeuziói: szétosztottuk 96 tenyésziobelyet tartalmazó, míkrotitertálcákba, í OÖ gl/tenyésztóhely mennyiségben, és 37°C-on inktrbáítok 5 tf% szén-díoxidot tartalmazó atmoszférában. 78 óra ebekével hozzáadtunk 100 pl/teoyésztöhely mennyiségű, friss BAT-tápköz.eget a túpsöz.eg cseréje céljából tnindea olyan tenyésztöhelyen, ahol megjelent sárgás elszíneződés. Az ilyen lenycsrtőhelyekböi szárntazó fúziós sejteket limitáló hsgdássul klónoztuk az alábbiakban leírtak szerítü.
2.3 Kfóorszás linsitáks hígítással
4-10 hetes nőstény BALÖ/c-egerek (Japánból, SEC, íné.) cseesemötnirígyét elíávölliöduk, hálón (Cell Sdainer; Falcon) szétroncsoltok a fentebb léiríak szerint, és a széttoncsolí sejteket kétszer mostuk lö lf% FCS-t tartalmazó HT40 tápközegben. Egy egérből származó Sejtszámsdk megfelelő cseesemömirigy-sejtmennyiséget félszuszpendátomk 30 ml, . 34 10 tl% FCS-t tartalmazó FÍT-tápközegben, tápláló sejtszuszpenzió előállítása céljából, A 2,2 példában leírlak szerint előállított fúziós sejtpreparátumot ezzel a tápláló sejtsznszpenziöval higftottnk lö-löö-szorosára, és tovább hígítottuk hígítás! sorban a tápláló- sejuzuszpéázsóvái 5, Hs 0,5 sejteni fúziós séjísüröségá szuszpénziők előállítása céljából. Az így előállított mintákat: szétosztottak 96 teoyészí&helyeí tartalmazó, sejttenyésztő míkrötster-iáleákba, 1Ö0 jthíenyésztó5 hely mennyiségben, és 5 hapíg, 37°C~on, 5 íl% szén-dioxldot tartalmazó atmoszférában inkubáituk,
2.4 Szkrinelés
A növekvő bíbrldőmákbói származó, tenyésztési feiíílúszókat ELISA-haa szkriaelhik 1 pl/íol DR5/hlgG Lel vagy kontroliként ugyanilyen koncentrációban Fas/hlhGl-el (41) hurkok tálcákat alkalmazva. A kötődött ellenanyagokat tormából származó perosidázzal (HRF) konjugált aníi-egér-imttfungtobullnokkal (Southern
Bíotechnotogy, Birmingham, AVI detektáltok, szubsztrátként TMB-t (Sigtna, Sí. Louis, Mi) alkalmaztunk. Tisztított DR54gűl-et i pi/mt koncentrációban, vagy ugyanakkora mennyiségben Fas-idgG 1-et bemértünk 96 mérőhelyet tartalmazó „ELISA R1A STRí F FLATB” íCosíar, NY) tálca egy mérőhelyére. A tálcát egy éjszakán át 4*C~on tartottuk, hogy lehetővé váljon a fehérje a;iszorbcíőja a mérőhely felszínére. Ezután a mérőhelyeken lévó oldatot kidobtok, és az egyes mérőhelyeket .háromszor mostuk PBS-Tween-uei. Azután 109 pl, 1 vegyes% marhaszéruot-aibtttttiní (A3RÖ3;
Sigma Chemicals Co.) tartalmazó PBS-t adtunk minden mérőhelyre, és a tálcát 37°C-on inkubáituk egy óra hosszáig. Maid a mérőhelyeket további három alkalommal mostok PBS-Tween-nel, és ezután minden mérőhelyre az egyes növekvő Ihhrsdómákfeói: származó tertyéssttésí felülúszőkból Sö-Sö pl-t adagoltunk. Majd a tálcát 37T-on inkubáituk egy óra hosszáig, és a mérőhelyeket ismét négyszer mostok BBS-Tweeb-nel. Mosás után méróhelyenként hozzáadtunk 50 pl, PBS-seS iööő-szeresére hígított, tormából származó peroxidázzal jelölt, kecskében termeltetett, antí-eger20 mmumglobídís ellenanyagot (Soafbern Bioieehnoíogy, Birmingham, ALs, és a tálcát iámét inkubáituk 37°C-on egy óra hosszáig, ezután a mérőhelyeket négyzet mustok PBS1 ween-neí Azután 3 < AA’ teir&meíil-ben/idm (a továbbiakban „TMB”) folyékony szufaszírát rendszert (Sigma) adagoltunk 1ÖÖ pl/mérőhely mennyiségben, és a tálcát szobahőmérsékleten hagytak állni 5 percig, majd a reakciót iöö phrnéröhely 0,2 N H3SO.< hozzáadásával állítottuk le. Az egyes mérőhelyek áhszorbafteiáját 45© tini-en leolvastuk (kontroll 650 ont} mikrotiter-táícaleoivasó (Mökcuiar
Devices) alkalmazásával és olyan fúziós sejteket szelektáltunk a mintából, amelyeknek megfelelő abszorhancia (-150 nm ~ 650 nm, ÖD-értékek; > 9,5) egyértelműen magasabb volt, mint űzőké, amelyekhez nem adtunk fúziós fehérjének megfelelő felíilúszót (ÖD értékek': « 6,93). Továbbá, a növekvő hibridómákbői származó tenyésztési feiülúszókat funkcionálisan is szkrinshnk apoptózisí indukáló aktivitás mérésével Jurkaí-sejíet alkalmazva. Júrkat-sejtekel (10ÖÖ sejtet mérőhelyenként): tartalmazó, 5Ő pl RRMI-tápközegef és 5 pM hisz-lndolil-maleimíd-Vlll-at (BísVIll, Aiexts, San
Diego, CA) adtunk 96 mérőhelyet tartalmazó tálcákba 5ő pl, növekvő inbridóma-íensésze idöhíszőmak jelenlétében. A sejteket magas nedvességtartalmú mknbátorbajt tenyésztettük egy éjszakán át, 37 L-on. Apoptózisí a sejtek életképességének mérésével határoztuk meg, A ÍTtke reagenskészíet alkalmazásával, a gyártó (Packard Instruments) használati utasítása szerint, és a mintákat TopCounter (Packard Indttutnents) berendezés aikaímazásávai számláltuk,
2.5 TRAÍL és TRA-8 kötődésének vizsgálata a receptorokhoz ÉMSA-val
EUSA-tálcákat burkoltunk 2 pg/ml ÖR4-lg vagy DR54g fúziós fehérjével egy éjszakán át, 3%-os BSA-val blokkoltunk, majd hozzáadtunk szoínbtiis TRAlL-FLAG-et vagy TRA-S-at a jelölt koncentrációkban^ és egy óra hosszáig Inkuháltuk 3?*C-on. TRÁÍE vagy TRA-8 kötődését üRR-vel konjugált, anfí-Flag-ellesanyaggai (Alexisj vagy HRP-veí konjugált, anti-egér-IgG 1 -el (Southern Biotechnology) detektáltuk, sorrendben. A reakciókat TMB-szubsztráipuffert-el hívtok elő, és „Senchmark” mikrotiter-tálcaleoívas<)ban (RíoR&d) mértük. A Kd-értékeket: nem-lineáris regressziós, egy kötőheíyes: modellben, „GraphPad Prism szoftver (GraphFad Software, San Diego, CA)
-35alkalmazásáva! határoztuk meg. Kompetitív ELíSÁrhaa Í6Ö ng/mi TRAlL-FLAG-ef adagotok.: és különféle koueerttrációbaít jelenlévő TRA-S-al inknbáltuk. 'FRAfL kötődését a fentebb leírtak szerint határoztuk meg.
2-6 Klónozás
A 2.3 és 2,4 példában leírt lépéseket ötször megismételtük a 2,4 pontban leírtak szerint szelektált sejtekre, így 5 lehetővé vált számos hihrldóma-klón szelektálása, amelyek mindegyike olyan egy tele ellenanyagot termel, amely DR5lgG~t képes kötni, viszont nem képes kötni Pas-lgG-í. A szelektálást eljárás eredményeként egér-egér Iribrtdómához jutottunk, amelyet TRA-8-kánt jelöltünk, és amely DR5-ígö~hez kötődő, de f'as-igű-hez nem kötődő ellenanyagot termel. Ezt a bibridómát, TRA-8-aí, az „American Type Caltnre ColleetimG-nái 26Ö0. március 3-én deponáltuk, PTAi428 nyilvántartási számon,
Kitnutattuk, hogy TRA-8-jelü egér-egér hihridóma (a továbbiakban egyszerűen „TRA-8) által termelt ellenanyag alosztálya Igűl, se monoklorsális ellenanyag izotlpizálására szolgáló reagenskészlettel (Pieree) tesztelve.
A találmány szerinti humán BRS-lgGl fúziós fehérjénket alkalmazva immunogénként hét hibrídőrna kíónbuz jutottunk egy kezdeti Ef.lSA-szkrtneléssel, amelyek mindegyike erősen pozitív DES-lgG-re, de Fas-lgfí fúziós fehérjére nem, ami azt mutatja, hogy az igy előállított kibrídomák olyan ellenanyagokat termelnek, amelyek '085 extraceiloláris részletét képesek felismerni, de IgGl Fe-részéí nem {az adatokat nem mutattuk be).
2.7 Western-hkít analízis
Normái hutnátí és rákos ssöveíbouíogemzátamok n-estem-bíot analíziséhez, szőröket a Geno 'feclutology cégtől (St, Louis, MG) szereztünk be. Minden sávba azonos mennyiségű fehérjét vittünk lek atttl-jJ-aktm-eilenátivag alkaltnazásávaí meghatározva. A hlottskon 1 pg/ml TRA-8-at alkalmaztunk próbaként egy éjszakán át, azután 1-ÍRP20 knnjugait kecskében termeltetett, egéreredetfi IgGS -ei (Southern Blötechoology) inknbáltuk szobahőmérsékleten egy óra hosszáig, és kstnilnmlneszceneiás módszerrel előhívtuk.
2.8 in sitit immunhísztókémia
Banán szöveteket az „HAB Tissue Rroeurement Center-höl szereztünk be. Fagyasztott metszeteket ?6%-os etanoiban fixáltunk, PBS-ben oldott, 16% lószérmmnal blokkoltunk, majd 1Ö pg/ml, sffimtásAisziitofi TRA-8-&1 itobálíuk szobahőmérsékleten, 60 percig. Az anti-egér-Igö kimutatására ssdéllé ABC kit”-eí alkalmaztuk dismmobefizidmnel (Vector, Biu-ltagiune, CA) kotorísnetóás szufesAráíként a reakíivif η í sí utóvá tétele céljából.
J Kaszpáz-akfivátödás anatfeise
Jurkst-sejíeket (1 χ leTmí) ínkubáitonk 500 ug/mt TRA-8-sl. A sejflizánnnok alikvotjast (3© pg fehérje) elválasztottuk 15%-os SÜS-PAGE-n. nylon membránra btottoto, és a biotokon ants-ka.szpáz~8, -4 és -3 etfenanyagokat (BD Pbamúngen, San Diego, CA) alkalmaztunk próbaként, majd HRP-konjugáit szekunder ellenanyaggal inkubáltuk, és a hasított termékeket kemllumiueszcesre sásán tettük láthatóvá. A kas2pá2bhnbitorkészletet az R&D Systems cégtől (Minneapolis, MN) szereztük be, Az egyes kaszpáz-lnhibiíorokát á jelzett koncentrációkban adtuk a tenyészethez.
A pd/í&t
TRA-8 mono kionáiis ellenanyag ttszthása
A TRA-8-jefíi egér-egér hibridötnáí 1 x li)6 spjiAni sejtsürsíséglg növesztettük ügy, hogy SÖÖ mi. 30 tf%FCS-t tartalmazó ASF-tápközegben inkubálítsk 3?':'C-ou, S tf% COj-et- tartalmazó atmoszférában, 5 napig. Majd a ienyészéiéí lecenírtfugáltuk (1Ö08 r.p.tn., 5 percig), és a íeltilúszót elkülöniíettfök. TRA-8 tisztítását a iélüíúszóbóí ProteinGSepharose GE-4B atfmitás-kromatográBávai (Ehartsutoia) végeztük az alábbi körülmények között:
oszlop: RröíeihG-Sephárósé Cl.-4 B oszlop (oszlop mérete: 2 ml; Pharmacia);
-36elúciös puifer ö, 1 M giiein (pH 2,4), 0,15 M NaCl:. semlegesítő puffért 1 M Tris-HCI (pH 8,5).
Az összes felüiúszőt felvittük az oszlopra, azután 20 ml PBS-ei háromszor mostuk, majd I mi térfogaié, eiúdós puffért adagoltunk tízszer. Mértük az eluáit frakciók(1 ml) optikai denziíását A 2-5, számú frakciókat (:> OD:!S0 ~ 0,1) külön szedtük, és fcillőn kezeltük,
100 pl semlegesítő puffét hozzáadása után az elnáíumokaí dializts-zacskoba tettük küiöa-külőn, és az eiüátnínokat 1. liter PBS-el szemben (pH 7,5) dtalízáltuk 4®C-on, A dialízis-puffért kétszer cseréltük. Ezt a mintát autiDRó-ellenanyag aktivitására EtlSA-val vizsgáltuk hntnán-DR5-lgG fúziós fehérjét alkalmazva, amelyet a fentebb leírt technikákkal állítottunk elő.
W4-attfrgén, exprcssziós vektor és ants-ffR4 umnokionáiis ellenanyag előállítása
Az 1-3. példákban leírt eljárásokat megismételtük DR4~rc specifikus templát-cDNS-sel és lánemdltö oligouukieoíidokkas az 1. példában részletezettek helyeit, ÖR4-aníígén előállítása céljából, amelyeket az 1.2-3 pontokban leírtak szerint alkaltnáztunk OR4-re specifikus monokionális ellenanyag előállítása: céljából.
Monokionális ellenanyagokat termeltettünk DeRl és DcR2 „csalt” receptorok ellen úgy. hogy a megfelelő antigének előállítására az 1, példában ismertetett, megfelelő cDNS-t és láneindíló olígonuklcotidokat kicseréltük. Expressziéi, vektorokat DcRl- vagy DcR2-i«zíókhoz immunglobulin-G-vei, és az eredményül kapott, tisztított monokionális ellenanyagokat a 2. és 3. példában leírták szárast állítottuk elő.
MenpMpmrt^
Mivel minden TRAlf .-receptor és a THFR-esaiád más fehérjei szignifikánsan ivnuologok, a példaként bemutatóit, DR5-öt kötni képes TRA-fr specltitásáí westetn-feíöt analízissel határoztuk üteg, amelyben két különböző btítnán DR5-igG fúziós fehérjét és más, rokon szerkezete fehérjék sseinbsiis, rekomhmáns formást használtuk fel. Előállítottunk egy első BR5~lg fúziós fehérjét DR5 extracellnlérís részletének 1-180. ammosavát kódoló effhiS és humán Igö! konstans régióját kódoló cDNS fúziójával, A íuzíouálf cFfMS-t rekotobínáns aőenovkwyektorba {kjusntom Bíotecbsolögies, fne„ Montreal, Kanada) klónoztuk. Az expresssúit DR5/hfgGl fúziós fehérjét, amelynek a relatív molekulatömege 50 klón volt, arsd-lmínán-igö affinitás-oszlopon (Sigma, St, Louis, MO) tisztítottuk. Speeifttás svestem-blot analíziséhez az Aiexís cégtől beszereztünk egy második rekömbináns humán DR5/lgöi fúziós fehérjét (S2-212, ansínosavak), valamint TRAÍL-R1, -R3 és -R4 fúziós fehérjéket. Humán kas és ÍWR1 szolubitís formáit Dr,
Cári gdwards (Amgcn. Inc. Thousands Öaks, CA, USA) bocsátotta rendelkezésünkre. Az alkalmazott szolubiiis, rekömbináns hantán ÖR4, DeRl, DeR2, TNFR1, R4 és Ess molekulák humán-lgGI-el fúziós fehérjék voltak, Minden fehérjéből 0,5 p.g-ot elválasztottunk 16%-os SDS-RAGB-vsl, és aitrocefrulóz-membráma hioiíotíuk. Á biotokat 5% tejport tartalmazó PÖS-él blokkoltak szobahőmérsékleten egy óra hosszáig, és próbaként 0,1 pg/ttrl, tisztított monokionális aníi-DRS-ellenanyaggal (klón: TRÁ-8), vágy Őrt pg/ml, HRF-vel kosjugált, kecskében termeltetett antí40 hamáu-lgO-vef 4eC-on, egy éjszakán át inkuháiíuk. 3 ormából származó péröxiőázzaf (HRP) konjngáis, kecskében
- 37 termeltetett, anti-egér~lgG-t alkalmaztok szekunder ellenanyagként a kötődött TRA-8 detektálására. A biotokat kérnilumlueszeenelás módszerrel hívtuk e'ö.
A teljes hosszöságú DR5-et vagy* DR4-ÖI tartalmazó peDVVj-vektorral (Clonteeh, Ealo Áho, CA) vagy üres vektorral transzfektált Cos-? sejteket alkalmaztunk áram láss eifometrsás analízishez. Humán TK AÍL-; vagy egéteredeíő
Fas-liganáumot kódoló, teljes hosszúsága cDNS-t klónoztunk pTRE-vektorha a tetraclklinnei szabályozható pföíttóteríól (Ciontech) szintézisíranyhan. pTRE-hTRAÍL vagy pTRE-mFÁSL Xhoi/DindlR-fragmenssit tovább klónoztok pAdBN-jeit'l, Ingázó („shuífle”) adem>vitus-vektorba (Quantum Bioteehnologles, Inc.). 293-jélÜ gazdasejfeket koíranszíektáitok linearizált pAd-TRE-bTRAIL-ei vagy pAd-TRE-mPasL-al és az adsaovírus nagy DNSffagmensével, A rekombináns víntsplakfcokböt származó, funkcionális humán I'RAIE vagy egéreredető Fas-Iigandum expressziöját szsrlnelíök 'kér-felszabadnlási alkalmazó vizsgálati eljárással, célsejtekként Jnrkat-sejíeket alkalmaztunk.
TRA-8 erőteljesen reagált a DRS-ígö fúziós fehérjével (körülbelül 50 kDa mérető), amelyet immunizálásra alkalmaztunk az. I.a ábrán bemutatottak szerint, DRS, hl, és gyengén reagált a második DRS-lgÖ fúziós fehérjével (körülbelül 6Q kDa mérető), az La ábrán bemutatottak szerint, DRS, P2. TRA-8 nem kötődik szignifikáns mértékben DR4-hez, DeRl -hez, DeR2-hőz, Fas-bos (CTDS) vagy ThiFRI-hez. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy TRÁ-S olyan epliöpokat képes felismerni, amelyek DR5~re specifikusak, de amelyek a család többi tagjában úetn találhatók meg.
TRA-8 sem magái a TNF-reeepiorok szuperesaládjáhak többi tagjával, például Fas-al (CD95) es 1. típusú TNFrecepíorrah és TRA-8 nem reagál DRS egérben előforduló hornölőgjávíd sem, amit a 450 tun-en es §50 mu-ert mért optikai abszorharsc ia-arányok mutatnak, amelyben 1-7. alsó panefezátnok (La ábra, alsó panel, 8. oszlop). Szolnbslis
TRAIL és TRA-8 összehasonlítható mértékben kötődnek immohillzált DR5~höz (Eh ábra, bal panel); Ezzel ellentétben, TRAIL DR4~hez képes kötődni, de TRA-8 egyáltalán nem aktív DR4 kötésében (l.h ábra, középső panel). TRAIL és TRA-8 DRS-höz való kötődésének Kd-értékeii 59 nM-ra és 3 nM-re becsültök, sorrendben. Fontos megemlítem, hegy TRA-8 hatékonyan kompettelóba lép i'RAll.-el DRS kötéséért, de DR4 kötéséért nem, amit kompéin ív ELI 8 A-ban mutattok ki (1 .b ábra, jobboldali pástéi). Ezek az eredmények azt mulatják, hogy TRA-8 humán DRS-re specifikus.
TRA-8 képes DR5 sejtfelszíni expressziójáí detektálni, áramlási citornetriás analízissel specifikus kötődést lehet kííimtaini teljes hosszúságú, humán DR5-eI banszfekíált Cos-7~sejtek sejtfelszínén, azonban DR4-el transzfektált Cos7-sejtek vagy üres vektor sejífeiszínén nem ( Le ábra).. Ehhez hasonlóan, TRA-S-al végzett in situ imrnunhísztokémiai vizsgálatban: teljes hosszúságú humán DRS-DNS-el íratiszlekiáii. Cos-7-sejiek reagáltak, áé kontroll vektornál transzfektált sejtek nem (Ld ábra), TRA-8 nem indukálja nem-üanszfekrált Cos-7-sejrek apopíózisát, és Cos-7-sejtelíbSl
Izolált RNS-en végzett RT-PCR-bea, humán DRS-öt kódoló, párosított Iáneinditó oiigonukleotídokai: alkalmazva ttöm mutattunk ki specifikus PCR-termékeket. Célként humán íurkat-sejtekef alkalmazva, további fimkeíonálís analízissel kimutattuk, hogy TRA-8 erőteljesen indákéi sejtpusztulást kereszíkötés nélkül, amit sejtek életképességének vizsgálatára szolgáló, bárom különböző vizsgálati eljárással, ATPUte-vei, MTT-vel és P?-kizárással (Le ábra) mutattuk ki. TRA-8 nanogrannn-színfü mennyiségei Jurkat-sejtek több, mint 5t)%-át elpusztították, ATPtiíe vizsgálati eljárással kimutatva, TRA-8 pusztító aktivitásit DRó-re specifikus, ami DR5-lg fúziós fehérjével blokkolható, azonban DRA-lg feíés fehérjével nem (az adatokat nem mutatják be). Ksszpáz-8, -9 és -3 hasítása rvesíem-bloí analízisben már lurkaisejtefc TRA-8-kezelése után 30 perccel kimutatható (tf ábra), és jnrkat-sejiek pusztulását teljes mértekbe;! gátolta általános hatású kaszpáz-mhíbitor (Z-VAD) (Lg ábra). Egyedi, kaszpáz 8-ra, 3-ra, 9-re és íö-re ható kaszpázinhibltorok részlegesen gátoltak sejipusztulást, ami további bizonyítékot jelent -arra vonatkozóan, hogy TRA-8-közvetl~ tett sejtpusztídás elsősorban kaszpáz-íüggő apoptofiküs mechanizmuson keresztül megy végbe.
i>RS sejtfelszíni ewrcsszióiáuak áramlási eisosnetrlás analízise; tamarserteken a iegsetenfóscbh haláRreceoter.
Meghatároztok, hogy FRA-& sejtfelsztnen expresszáit DR5-ut képes kötni, és azután meghatároztak a reakció 5 specííhását teljés hosszúságú, barnán DR5- vagy DR4-eDNS-t íartalmazö exprssszíós vektorral, vagy kontroliként üres vektorral transzfektál? COS-? (American Type Cukoré Coltoeíion, CRL- lőS 1) sejtek alkalmazásával. Fíkoerltrmnel (FEj-konjugáh amí-egér-igCD-i (Phamdngen) alkalmaztunk szekunder ellenanyagként a TRA-g-köíés detektálására. 1
X 1Ö4 sejt fluoreszcenciáját áramlási eitométerrel (FACSVantagc) suértük az alábbi körülmények között:
Gerjesztés hullámhossza; 488 ntn:
Detektálás hullámhossza: őöö mn.
Áramlási eitometríás analízissel kimutattuk, hogy DR5~vektorrai transzfektálí CÖS-7-sejték megközelítőleg 30%-áí TRA-8- megfestette, atm az l.e ábrán bemutatott, bessitrozotf hísztogramon látható. Ez a százalékos arány párhuzamban áll a transzfekciós hatékonysággal, amit a transzfekcíd analízisével zölden fínoreszkálö fehérje (GFP) alkalmazásával határoztunk meg (az adatok nincsenek bemutatva). TRA-8 nem festett: meg szignifikáns mértékben
DR4~el (üres hísztogf&m) vagy könírall vektorral (pontozott blsztögrum) iranszíekiáit sejteket, mai azt mutatja, hogy T RA-8 sejtfelszíni DR5-re specifikus.
Bár DR5 íunmrsejíefeben való expresszióját mRNS-sziuíen alaposan vizsgálták, DBS sejtfelszíni expresszióját nem dokumentálták. Azzal, hogy rendelkezésre áll monoklonális anu-DRS-ellenaoyag, lehetővé válik DR5 sejtfelszíni mennyiségeinek vizsgálata, és az expreszszío mértéke és a sejtek TRAlL-mediáit apoptózísra való érzékenysége közötti kapcsolat vizsgálata. Lentebb ismertetett, sejtekből álló partéit (1 x Itt6} inkabáliunk 10 pgtod, afRniSáSrtisztítoti: TR.A8-al szobahőmérsékleten 30 percig, majd PR-konjugáíf, anti-egér-lgöl-el (ifearmmgen) további 30 percig festettük, ΙΟΛΟ életképes sejtet analizáltunk a „FACSvantage” típusú áramlástcitomélétben, az alábbi kőrühnények közötti:
Gerjesztés hullámhossza: 488 ma;
Detektálás hullámhossza; Óöő nin.
Az öt tesztelt hemutopoetíkus sej (vonal az alábbi: Jurkat CEM-ό-, Molt-4-, H-9- és l)93?-seítek. DR5 expressziója Hurkai, CEXÍ-ó, H-9 és C937-sejtek felszínén detektálható, azonban csaknem áetefctálhatatíun Moh-4sejtekers, amit a Xa és 2.a’ ábrán bemutatunk. Bár leírták nagymértékű DR5-RNS-expmssziót (43), 3 FACS-attalízis azt mutatta, hogy ezek a sejtek nem expresszálnak sejtfelszíni DRS-ot nagy mennyiségben. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy DR5 sejtfelszíni expressziója nincs ősszeföggésbeo BR5 trarsszkripeíós expressziójávai, ami ilyen receptor 0 esetében nem váratlan. DRS sejtfelszíni expressziójának mértéke lehet sejívonal-apeoiirkus, mivel hemufopoeitkus eredetű sejtek többsége DRó-öí kismértékben expresszál, míg a legtöbb glióma- és prosztata-sejt DRS-öt nagymértékben expresszál.
TRA-8-jeiü monoklonális ellenanyagot alkalmaztunk DR5 szerepének meghatározására 'flRAiL-medíáit apoptőzis hidukáíásáhan, amelyben sejtfelszíni expresszíójáí vizsgáltuk különböző típusé:, humán punorsejteket tartalmazó panelben, valamim meghatároztuk a sejtek mind TRA1L-, mind TRA-8-juedUlí apupíózisra való érzékenységét. Primer períferiás vérből származó T-sejfek nem expresszálnak sejtfeiszini DRS-öt szignifikáns mennyiségben, és rezísztehsok mind TRA1L-, mind: TRA-8-mediáít sipoptózisra (2.a, 2.a’ és 3.4’ ábrák). Bár a fesziéit tonnán T-ieukémiu-sejtvontsiak közül mind az ötben detektálható sejtfelszíni DRS expressziója, bár viszonylag kis mennyiségben, közülük kettő fiunkat és CEM-ő) nagymértéklton érzékeny mind TRAÍL-niedlált, mind TRA-8-medláh apoptózísra, ami azt mutatja, hogy DRS örtmagábau elegendő az említett sejtek apoptózisának tudattá lására, Molt-4- és U937~s«jtsk részlegesen érzékenyek TRAÍL-medáit apoptózísra, de viszonylag reziszíensek TRA-8-mediált
-39 apopiózissal szemben, amely alapján iélíéteíezzúk, hogy más TRAlL-reeeptörok is szerepel játszhatnak apoptózisszignál továbbításában. H-Wsejtek rezísztepsek mind TRAIL- mind TRA-S-mediált apoptózisra, amelyben egy infraeeiíuláris, anti-apoptözís föly-ajnatsorrai médiák blokk játszik szerepet.
A sejt-panel Hs683~, Ü251MG-, D37MG-, D54MG-, U373MÖ-, C1123SMG-, ü'«7-jelő.barnán maligous glíótna5 sejtvonaiakat és normál humán aszírocitákai tartalmaz, amelyeket Dr, Yaneey Gllkspse bocsátott rendelkezésünkre (Uníversity of Alabatna aí Binnjngham, idegsebészeti Osztály). Dúl 54-, FC3- és LnGap-jelii, humán prosztatarák» sejtvonaiakat Dr, Wííliao Grizzle bocsátotta rendelkezésünkre (University of Alabanm át Birmingham, Patológiai Osztály), a sejfyooaiakat az „American Type Culture Goilection-toi szerezlek be. Humán leukémia T-scjt-vonalakat, B-sejtes limlomát, HepG2 Jurk&t·· (American Type Culture Goíleetion No. T1B~152) és CCRF-CEM OEM-ó-sejtvonaíaí (American Type Cuitttre Cöilecíion No. CGL-119); monoclta sejtvonaiakat, U937~sejlvonalat (American Type Culture Coliection Na. CRL-236?) az „American Type Culture Coiieeííon’foől szereztünk be. Valamennyi sejtvonálat 10% BCS-vei kiegészített, RFM1 1640-ben tenyésztettük. 132 INT-jelű humán aszíröeííótna sejtvonaiat Dr. Rlebard Jope bocsátotta rendelkezésünkre (íhúversity of Alabama at Binningham, Pszicldátriai Osztály), amelyet 5% FCS-vel kiegészített OMEM-ben tenyésztettünk,
Szolnbíiis, rekombínáns, humán TRAIL, amelyet Alexís Cswporattio» cégtől (San Diego, (ISA) szereztünk be, olyan fúziós febétje, amelyben humán TRAIL extraceííuláris dotnénjéhez (9S-281. teninosavak) fuzionálva van az N~ tormináUsnál égy FLAö-toidaléfc és egy 8 aminosavból álló, linker peptid. A már leírt His-toldalékot tartalmazó TRAiL-íól eltérően, ez a TRAfL-préparátom önmagában nem indukál erős apoptotíkus választ Rtrkat-sejtekbes, és keresztkőtö imkerként aníi-FLAG-ellenanyag szükséges az apoptózis javításához. Aníi-TLAG-ellenanyagof szintén az
Alexís cégtől szereztük be.
A 10 tesztelt humán malignus glióma-sejt közül mindegyik detektálható mértékben expresszált DR5-Ői a sejtfélszmen. A legtöbb sejt közepes vagy nagymértékben expresszált :DR5-öí, a 2, b ábrán bemutatottak szerint, Három sejtvonal, D-54MG-, V373MG- és Cíi-23SMG~jelú sejtvonal nagymértékben expresszált DR5-ÓL míg hat sejtvonal, Hs-őíO-, Ö251-MÖ-, D37-MG-, 087-, SMK.1- és 132 I N I -jelű középes mértékben expresszált ORS-öt. Gsak egy, a 1125 465-sejtvunal expresszált kismértékben DR5-öt. Mindhárom proszíaíarák-sejtvonal nagy mértékben expresszált DRS~öt. ezt bemutatjuk 4 2,e ábrán,
A trónnál primer T-sejtekhez hasonlóan, primer B-.sejmk sem expresszáltak DRS-őt jelentős mértékben, es nem történt apoptózis TRAIL- vagy TRA-fokezelesre (2.d ábra), A négy tesztelt B-ínnfbms sejtvonal közül három (SKW6.4, Í3B-3 és Raji) viszonylag nagymértékbe» expresszált DR5~öt, és mind TRAIL·.-, mind TRÁ-8-meáiáit apoptózisra nagyon érzékeny volt. A negyedik sejívonaL Oaudi, nagyon alacsony mértékben expresszált ORÓ-öt, sokkal kevésbé volt érzékeny mind TRAIL-, mind TR.A-8-medíáh apoptózisra. Bár primer asztrociták nem expresszáltak detektálható mértékben sejifeWni ©R5-öt (2.b’ ábra), mind a négy tesztelt gliórna-sejtvonal nagymértékben expresszált DR5-öt, Oltóma-sejtek ORS-expresszidja nagyabb méríéfcú, mint T- és B-sejtek esetében, amivel nem jár szignifikánsan jobb érzékenység IRA11. - és: DRS-medíáít apoptózisra, ami alapján feltételezzük, hogy DR5 sejf&íszhú expressriójának mértéke nem függ össze szükségszerűen a tumorsejtek apoptózisának mértékével. DR4-. DR5- és DCR2~mRMS mennyiségének meghatározására végzett RT-RCR-el valamennyi tesztelt sejtben detektáltunk orRNS-t (1, táblázat). Azonban primer normál sejtek általában viszonylag kismértékben expresszáltak DR5-öt ttanszfoonáh timwrsejíekhez képest.
1, táblázat: TRAIL-reeeptor expressziójának RT-PCR amtbzfee*
Sejíek DR5 13R.4 DeR2
Primer T-sejtek <0.003 <b,eöi 0,015
iurkat 0,10 <0,001 0,21
CEM-6 0,30 0,59 0,25
Moit-4 0,10 <0,001 ö,05
H-9 0,73 0,61 0,07
Primer Π-sejtek <0,001 <0,091 0,02.4
SKWő.4 0,95 0,66 0,45
ESB3 0,40 <0,601 0,35
Raji 0,55 0,11 0,45
Bandi Ö,73 0,36 0,63
Normál asztrociíák 0,05 <0,001 0,12
SH683 0,56 6,96 0,34
U87 0,44 0.56 0,21
Dód 1,15 0,46 0,12
E321NE 0,25 0.35 0,05
* Sexekből össz-RNS-t l/ntólluk. és RP-ö€R-í vége/íönk az 'nőd^zereket iunutcto löszben kutak szerint A PGR-termékefeiet elválasztottak 3%-os agaróz-gélben, és „Eluur-S MAX Multíimager System” (BioRad) alkaltoazásával vizsgáitok, .Az értékeket β-akthátoz viszonyított: arányként mutatjuk be,
Ágajttozis fa váfrg indufcálása malignas sejtekben /Annak meghatározására, hogy TRA-8 transzformált sejtekbe® fa vfam indukál-e xpopíózist, valamennyi DR5puzitfv totoöfsejtet megvizsgáltok TRA-8- vagy TRAll-mdukálí apopiózísrá való érzékenységükre.
Célsejteket (1 x lő3 tePyésztOheíyenként) 96 tenyésztöbelyet wlsheszó tálcákban tenyésztettünk szoinbriís 10 TRÁÍL plusz keresztkötő linket (Alexis) vagy TRA-8 jelöli koncentrációinak jelenlétében, 37°€-on, egy éjszakán át Sejtek életképességet (I) ATPLite reagenskészlet aikafenazásával a gyártó használati utasítása szerint (Paekard Insírornents, Muridén, CT); (2) az MTf sejtpí<íhferáeiöX''életképesség meghatározására szolgáld reagenskész.let alkalmazásával (Sigmai; vagy (.3) elpusztult sejtek Pl-festésévei és áramlást eitometrias analízisével határozlak meg. Á tenyésztés végén a sejteket megfestettük 10 pgttnE Pí-vsl, és Pl-negatív sejteket életképes sejtként kapuztnnk, líepatoesták kondenzált sejtmagvalnak analíziséhez a sejteket megfestettük lö ng/ml Hoechsí 33352-vel (Mbleeuiar Frobes), és áramlási eiíometríáv&l analizáltuk.
A fRA-8-eiiex;myag apnptózist képes indukálni a malignos, imroáa glióma-sejivönalak többségében ¢9/10), három prosztata rák^sejtvonal közöl kettőben, és négy BRS-pozitiv hetnatopoeiikas sejtvonal közöl kettőben. Nem todukáií apopíózist MolM-sejtvonaiban, amelyben DR5 sejtfelszíni expressziőiának mértéke szinte deíektálhafatlan. A sejtek TRA-8-mediá.h apoptózísra való érzékenységének mértéke azonban jelentősen különbözik a sejt vonalakban.
A sejtek TRÁ-8-eÍlenanyaggai indukált apopíóztssal szembeni érzékenységének variabilitása arra utal, hogy' bár ntínitnális mértékű í>RS sejtfelszíni expressziója szükséges, az érzékenységet nem elsősorban DR5 sejtfelszíni expresszípjának mértéke határozza még, hanem má»s tényezők is befolyásolják a folyamatot. Sár áltálába» minden gliőma-seit jelentősen nagyobb ménekben expresszált se/felszíni DRS-öt, mint a hematopoehkus sejtek, a glióma-sej-4.1 lek TRÁ-S-íadukáít apoptózlsra való érzékenysége nem volt ezzel arányosan nagyobb mértékű a hematopoeíikus sejtek érzékenységéhez képest. A gliöma-sejtvonalak közöl öl, D-37MÍ.Í-, O54-MG-, U373-MG-, CH235-MG- és 1321N1leifi sejtvonal érzékenysége TRÁ-8~índukáit apoptózisrs magas, és megegyezik TRÁIL-meálált apoptözisra való érzékenységükkel, a 3,b ábrán bemníaröbsk szerint. A glióma-sejtvönalak közül kettő, Η-456-j'elü és SMRt-jelű sejtvonal, sokkal kevésbé érzékeny TRA-8-índtrkáh apoptózlsra. Κ-456-sejtekben DR.5 sejtfelszíni expressziójának mértéke alacsony: azonban OR5 sejtfelszínt expressziója SMKl-eö hasonló a legérzékenyebb sejt vonalakéhoz, ami arra utál, bögy! más mechanizmusok is szerepet játszanak a TRAÍL-mediált apopíóztsra való érzékenység megbatározásában. Bár ndndhátom prosztaíarák-sejtvonai nagymértékben expresszált DR5-8t, a Dn 145-sejíek voltak a legérzékenyebbek TMAk-indnkáit apoptózlsra, a PC3-sejíek részlegesen érzékenyek, míg a LnCÁR-sejtek teljesen rezlsztensek voltak, a 3,e lö ábtán bemutatottak szerint Hemapovttkus sejtek eseteben azt találtuk, hogy .bukat- t'LM-ó-aepck nagymértekben érzékenyek voltak TRA-8-indukáÍí apoptózisra, a 2.a ábrán bemutatottak szerint, bár mindkét sejtvonalra azt laláltuk, hogy kismértékben expresszáltak DRS-öl. Bár DR5 detektálható U937~sejteken, ézek a sejtek rezisztensek ÍRÓ·»indukált apoptözisra. Ehhez hasonlóan, bár a H-P-sejtek detektálható mértékben expresszáltak DR5-öf, Η-9-sejtek reztsztessek TRA-Rdndukáif a|»ptőzfesal szemben. Az eredmények alapján feltételezzek, hogy léteznek olyan.
szabályozó mechanizmusok, amelyek ÜR-madiáií apoptózlsra vannak hatással.
További sejtfelszínhez kőtődö anti-DRS-eltenanyagokat állítottunk elő az 1-3. Példákban leírt eljárások szerint.
Két további, TRA-i- és TRÁ-10-jelö anti-DR5~eilenanyagoi vizsgáltunk TRA-S mellett annak tnegbntározására, hogy képesek-e összehasonlitható mértékű apoptózisí indukálni, és ezáltal agonistaként hatni, vagy ezzel ellentétben képeseke TRAiL-mediáií apoptózist blokkolni, és ezáltal ahtagönistaként hatni. Humán Jurkat-sejteket alkalmaztunk célsejtekként bárom, TRA-1-, TRA-8- és TRA-lü-jelíf anti-DR5-ellenanyag agonistfeanatagonisía tskítvitásának meghatározására. A 4. ábrás látható, hogy' a sejtek életképessége körtlibeltil 90%, 70% és 20% TR.A-10, TRA-1 és TRA-8 esetében, sorrendben, ha 2,5 pgónl koncentrációban htknbálfnk azokat egy éjszakán át, TRA-8 erőteljes apoptotikus választ indukált dózisfüggő módos, míg TRA-1 csak mérsékelt apoptotikns választ, TRA-íö pedig gyenge választ, indukált. TRA-8-at ezért sgoniste antí-DRÓ-ellenanyagnak minősitettiík. A 4. ábrán bemutatjuk humán íurkat25 sejtek életképességét TRAlL-índöRált apoptózis foggvényében, dozisRíggő módon, TRA-ÍÖ szignifikáns mértékben blokkolta humán Jurkat-sejtek apoptózisát alacsony dózisu TRAÍL-indukáit apoptózis esetén. Tehát TRA-i Ö~et antagonbta antt-I>R5-éllénanyagnak minősítettük.
A glióma-sejtvonalak közül őt, D-.37MG-. D54-MG-, U373-MG-, CH235-MG- és 132 INI-jelű sejtvonal érzékenysége TRÁ-8-mdiiká3i apoptózlsra ekvivalens mértéin: TRAiL-mediált apoptózisra való érzékenységükkel, a
30- 3,b ábrán bemutatottak szerint, arai arra utal, hogy a TRAlb-indukák apoptózis ezekben a sejtekben elsősorban DR5 által médiáit. Továbbá, a gnöma-sejlvonaiak közül kettő, Hsó83- és U2S i -MCí-jein sejtvonal rezisztens TRAIL-mdukált apoptözisra, de részlegesen érzékeny TRA-indnkált apoptözisra, ami m utak hogy „csaik’-receptorok működnek ezekben a sejtekben, és túra, hogy iTtA-8-eIlenanyag alkalmazása elkerüli ezt a szabályozó mechanizmust. Prosztatarák-sejtvonalakban a TR A-S-índukált apoptózlsra való külánfele mértékű érzékenység ellenére, ez párhuzamba állítható a sejtek 'rRAit-mdnkáh apoptózlsra való érzékenységével, ami szintén arra utal, hogy DR5 fontos szerepei játszik prosztatarák-sejtek TRAiL-mediált apoptózisában. Hematopoetikus sejtekre azt tál áltnk, hogy' Jurkat- és GEM-ósejíek nagymértékben érzékenyek mind í'RA-8-mediált.. mind iRAíL-medlált apoptózisra, TRA-8-mdukáit apoptózis összehasonlítható mértékű a TRAíí.-indukált apoptózis mértékével, a 2.aés 3.a’ ábrákon bemutatottak szerint. Gliómasejtvönalak közül csak egy, ÖST-sejtvonal, valamint két hematopoetikus sejtvonal, U937- és Moh-4-jeiü volt érzékeny
TRAlL-isdakált apoptözisra, de ezek kevésbé érzékenyek vagy rezisztensek TRA-8-tndukáit apop-ozisra. Egy sejsvöítah a Η-9-sejtvonal expresszálí detektálható mértékben ÜR5~öt, de rezísztens volt TRÁ-8- vagy TRAlL-índukált
- 42 19 apoptözisra. Bár mmimális mértékű DR5 sejtfelszíni expressziójá szükséges TRÁ-8-iadukálí apoptozishoz, DR5 expressztójának mérteke- m jelzi szükségszerűen előre a sejtek TRA-S-medíűlt npoptóztssal szembeni érzékenységét; ,,csali”-reeeptotok szerepet játszanak a TRAlL-tnediáll apeptózís modulálásában néhány sejtben, de nem íönik úgy, hogy '.fontos szerepet játszanának az eddig tesztelt sejtek többségében; amint előre jeleztük, a I'RA-8-ellenanyag elkerült a „ésair’-reeepíorok hatásait; transzformált sejtekben előfordulhatnak a DRŐ-reeepíor funkcionális mutánsai; és végiig intraeellaláris szabályozd medsamzmnsok ugyanolyan íboíös&k vagy lantosabbak lelteinek, miül a „csalk’-reeeptorok a sejtek TRAÍL- és ÖRS-mediált apoptózissal szentben mutatott érzékenységének meghatározásában.
Előzetesen végzett kísérletekben kimutatták, hogy DR5-mRNS eloszlása normál szövetekben7 széles körű, DR5expresszíó fehérje- színien történő elemzéséhez normál humán szövet-hömogenizámmokböl álló panelen (Geno Technology, Sí, Lotus, MO) próbaként TRA-S-ellenanyagot alkalmaztunk wesíeru-bloi analízisben. Kilenc normál humán szövet közül az agyszövei enyhén pozitív (ő.a ábra, 2. sáv). öRS-iehétje nem detektálható TRA-8~reakíivhással a májba?; (1. sáv), tüdőben (3 sáv), vesében (4. sáv), lépheti (5. sáv), herékben (6. sáv), petefészekben (7. sáv), szívben (8. sáv) vágy hasnyálmirigyben (9. sáv). Ezzel szembén, mind a tizenhárom humán rákszövet pozitívan festődéit TRAif-sl (5.b áferá), ezek á petefészek (1), tüdő (2), máj (3), végbél (4), méhnyak 15), bor fő), herék (7pajzsra irigy s 8). méh (10), gyomor (11), garat alsó szakasza (laryngopharynx) (12) és hasnyálmirigy (13) rákos esetei. Továbbá, normál és rákos szövetek TRA-9-aí végzett fa sím íntraunhisztokérátsí vizsgálatban igazoltuk, hogy .eltekintve· néhány elszórt pozitív sejttől a lépben, DR5 expressziója mell-, tüdő- és lépszövetben nem detektálható (5.c ábra), A megfelelő rákos szövetek, például mellbe ioöbrálő duksálís karcinótna, kissejtes tüdőrák és lúnfóma pozitívan reagáltak TRA-S-s! i'S.d ábra). A 22 vizsgák rákszövet közül a ő mellrák közöl i, a 2 tnéhnyahrák közül 2, 5 májrák közül 4. 8 limfótna közül 5. 2 tüdőrák közül 2, 2 prosztatarák közül 2. reagált pozitívan TRA-S-al. Ezek az eredmények összhangban vasnak az áramlást c«omsirtás: analízis eredményeivel, és arra utalnak, hogy rátok szövetek nagyobb mértékben expresszálnak DRS-féhérjél, mint normál szövetek.
TKA-8 fa Gw toramricld aktivitása
Különféle okok miatt számos ágens, amelv ra v;tr& kísérletekben ígéretesnek mníaikozríí, /« vöm nem hatékony. Ezért fontos. 1 RA- 8 hatékonyságát fa vívó álhitmodellben tesztelni. Ebből a célból TRA-8-jeiü antl-b.umán-ÖR5 ellenanyagot beadtunk humán xenografiokaí hordozó egereknek, amelyek humán DR5-malekulát expresszáiták. 6-8 hetes NOD/SClD-egerektt! (lackso·? Ldlxnatory) alkalmaztunk, amelyeket 1.32 iN í -jelű immár! asztroeiióma-,sejtekkel (fxlö') szubkután vagy humáii íeokémsa Jnrkat-sejtekkei (1x10) intravénásán oltottunk be, A tantor beoltása után két nappal az egereket intravénásán beoltottuk TRA-S-eal (löö pg). 'fRA-Ü-cal végzett kezelést követően öt nappal meghatároztuk a B21Nl-íumor növekedését a tetwtönteg mérete és tömege alapján. íorkat-sejtek növekedését a lép tömegének mérésével, és a beoltott állatok lépében található barnás Cl) 3-pozitív Jurkat-sejtek százalékos arányával határoztuk tneg. Blopsziát vettünk a tutnorszövetekböl, és hisziotogíai vizsgálatot végeztünk.
1ÖÖ pg TRÁ-8 egyetlen intravénás dózisával végzett, korai kezelés egy nappal a tumor beoltása után teljes mértékben gátolta 132 INI-sejtekből szilárd tumor képződését (ó.a ábra). Három dózis tÖÖ pg TRA-S-cal végzett késői kezelés egy héttel a üanor beoltása után negyedére vagy nagyobb mértékben esökkertíefíe a tumor tömegéi (ö.b ábra). Tumor kialakulása nent volt látható TRA-S-ca; korai idöpönfoa® kezelt állatokban (ö.e ábra, felső panel), flisztológiai analízissel drámaian degenerált rummszövetet lehetett kirmtSatttí TRA-8-cal kezelt állatokban ,(ő.c ábra, alsó panel). Ebhez hasonlóan, TRA-S-eal végzett kezelés gátolta Jtirkaí-sejtpöpuláció megjelenését a lépben, amire az utalt, hogy
-43Cl>3 -pozitív lurkaí-sejtekeí nem voltak a lépben íís.d, ó.e ábrák). A beültetett tumor hisztológíaí analízisével kimutattunk néhány elszórt tworsejíet a TRA-S-kezelt állatok lágy szövetébe®, míg a kontroll állatokban szilárd tumor alakult ki, amit bemutatunk a tíx ábrán. Jurkat-sejtéksi alkalmazó modellben a luikat-sejtek száma a TRA-8-kezelt állatok lágerben kevesebb κΰηΐ .2%. volt, a kontroll állatok légében viszont csaknem 109«, amit áramlási citomeíriás analízissel mutattunk ki a ö.a ábrán beinotatoltak szerint, és in sün. CD3-festéssel a 6 c ábrán bemutatottak szerint.
Ezek az eredmények alátatnaszíiak azt a kózeinitdíbafi lein megfigyelést, hogy keresztkötött rekotttbmáns
TRAIL szisztémás beadása í« vívó íumornövekedést gátol {13), Ezek az eredmények azt mutatják, hogy TRÁ-8 egyetlen dózisa nagymértékben hatékony tonaorsejtek is vívó eliminálására,
Antl-humán ellenanyagként alkalmazva egér-modellhen a TRA-S-kezeíés toxíeitáaát nem lehetett meghatározni. 10 Azótiban egy in vivő kísérletbe® kimutatták, hogy TRAIL beadása nem társult szignifikáns toxíeítás ezzel a kezeléssel
03),
T'RAlE-mediáit apopíőzissal kapcsolatos, ezt megelőzően végzett kísérletek többsége malignus sejtekre fókuszéit. A találmány szerinti, TRÁlE-mediáit apoptózla szintén terápiás hatású autoimmun és gyulladásos állapotokban, például RA esetén.
lő.l Sejtfelszíni ÖRS expressziójának áramlási citomeíriás analízise RA áltól érintett tókaovlálls sejtekben DR5 expressziójáí RA-ban szenvedő páciensektől ved, nyolc primer tenyészetből származó, sziööviálís sejtekből álló panelen Összehasonlítottuk oszteoartritiszhen szenvedő páciensektől (a továbbiakban ,,ÖA’’) vett, nyolc primer tenyészetből származó, szmoylálts: sejtekkel. A nyolc humán, primer, RA állal érinteti szinoviális sejttenyészetet, RA1014-, RA· 1016-, RA-ÍÖ21-, RA-512-, RA-707-, RA-8Í1-, RA-7I6- és RA-929-jeSúekd EV. Obtsukí (Sankyo Co. Ud. 'fokío, Japrln) bocsátotta retidelkezéshnkre, és 10% FCS-vei, peniciiUnnei, szírepiomiemnel és glutamiaoal kiegészített DME.M-ben tenyésztettük. A. hér OA által érintett, szinoviális sejt printer séjifenyészetéi: OA által sújtott páciensek szinoviális szöveteiből Izoláltuk standard koilageház eljárással, és ugyanilyen körülmények között tenyésztettük, A passzálások száma valamennyi primer sejt esetén ló alatt volt. DR5 expresszióját PACs-analízissei határoztuk rneg az 5. példában leírtak szerint.
RA által érintett sejtek valamennyi primer tenyészete nagy mennyiségbe® expresszáit sejtfelszíni DRa-ót, és a különböző páciensekből izolált szinoviális sejtekben az expresszié mértéke kismértékben különböző, a 7 a ábrán bemutatottak szennt. Ezzel ellentétben, sejtfelszíni DR5-expressziö OA-sájtott páciensekből izolált szinoviális sejtek felszínén nagyon kismértékű. vagy detektálbaíatlan, a 7.b ábrán bemutatottak szerint. SV4ö-transzformált szinoviális sejtekre azt találtuk, hogy nagymértékben expresszáhtak DRS-öt, ahhoz viszonyítva, amekkora az expresszió mértéke RA. által érintett sejteken. Ezzel ellentétben, nem-tomszfoítnált flbroblaszt sejtek kismértékben expresszálnak DR5-8t, ahhoz viszonyítva, amekkora az expresszíómértéke az OÁ által érintett sejteken, a 7.b ábrán bemutatottak szerint.
10,2 RA áltál érintett szinoviális sejtek érzékenysége TRÁ-S vagy TSAfL-medíált apoptózlssal szentben
Általában RA által sújtott pácíensekhől izolált minden színevtális sejt érzékeny mind TRAIL, tolod anti-DR5~ ellenanyag által Indukált apeptózisra. és minden OA által érintett sejt rezisztens TRAIL és anti-DRd-ellenanyag által indukált apoptózisra, amit bemutatunk a 8,a és 8,b ábrán. Ezek a kísérletek azt mutatják, hogy a í R Α-8-ellenanyag Inkább megváltozott sejteket céloz meg, mint normál sejteket. Továbbá, TRAlT.-indukáit apoptózlssal szembeni érzé40 kenység vagy rezisztencia mintázata összhangban van azzal, amit anií-I>R5-e;ienanyag indukál, ami arra utal, hogy a szinovi ális sej lekben elsősorban DR5 j átszik szerepet TR AlL-apopíozis k tv ittasában.
- 44 Amint mafignus sejtekre leírtuk, TRAíl.. vagy anti-DRS ellenanyag. által indukált apoptózissai szembeni feéfeayság mértéke különféle volt RA állal érintett szmovíáiis sejtekben, bár hasonló mennyiségben expresszálták DR5-ŐÍ. RA-SF2 és RA-70? & legérzékenyebbek, mivel a sejtek több, műit 80%-a oipusztnii TRAIL vagy TRA-R 2Ö ng-ml-nél alacsonyabb koncesíráctója esetén, RA-1014, RA-811, RA-716 és RA929 TRAlL-ra vagy TRA-8-ra középe5 sen érzékeny, közel 100%-os sejlpusztulás történi nagy koneentráeióban (>5Ö ng/ml) jelenlévő TRAIL vagy TRA-8 hatására. RA»t0i6 és RÁÍŐ2i~sejtekbeu, bár a sejtek többsége (több, mmt 60%) elpusztult TRÁ1E vagy TRA-8 alacsony dózisára, a sejtek egy része éleiben maradt TRAfl., vagy TR.A-8 nagy koncentrációinak jelenlétében, ami arra utal, hogy sejtek egy alpopnláeiója rezásztens TRÁIL-mediáit apoptózisra. Ezzel szemben, valamennyi OA által érintett sejt sokkal kisebb mértékben érzékeny TRAlt vagy TRA-8 által indukált apoptózisra. A sejtek 60%-nál nagyobb része nem pasztáit el az OA52F- ás ÖASSF-sejtvonalban, még magas koncentrációban jelenlévő TRA1L vagy TRA-8 hatására sem. OA72M-sejíek teljes mértékben rezísztensek TRAIL vagy TRA-S állal indukált apoptózlssal szemben. SVO-öaaszformált színovlális sejtek szintén érzékenyek TRAIL és TRA-8 által indukált apoptózisra (az. adatokat nem mulatjuk be), Ezzel szemben, nem-transzformáli Ssbrohlaszt-sejtek reziszíensnek tűnnek TRAlL-ra és TRA-8-ra.
Ezt megelőzően kimutatlak, hogy DR5 FADD kaszpáz-8-föggő felyamstsorml aktivál apopíózisí (44). RÁ állal érintett szmoviálls sejtekben, DRő-medíált apoptózis kaszpáz-ídggőségéuek meghatározása céljából RA-sejteket tenyésztettünk TRÁlt-ial vagy aníi~DR5-cl tananyaggal specifikus kaszpáz-lnlubitorok jelenlétében. Nyolc ícsztclt kaszpáz-inhibitor közül kaszpáz-6, -8 és -10 inhibitorok képesek RA által érintett színovlális sejtekben «ind TRA11... mind DR5 által indukált apoptózist gátolni, amit bemumnmk a 9, ábrán, ami azt jelzi, hogy ez a három tosszpáz szerepet játszik DR5-mediált apoptézishan.
10,3 TRA-8 vagy TRÁÍL NF-srb aktiválódását íadefcáij» RA által érintett szfonvtelfe sejtekben MMP-k fokozott síértékő felszabadóiása nélkül
Tekintélyes mennyiségű bizonyítók támasztja alá azt az -elméletet, hogy szoros kapcsolat van apoptózis jeltovábbítása és proiileráeiö jeltovábbítása között (45). Ismeretes, hogy DR5 NE-Kb-folyamaisori képes aktiválni apoptózis szigsál-íranszdnkcióján kívül, és hogy NF-xb aktiválódása képes lehet uníl-apoptózis szignál továbbítására,
Szért gél-eltolódási („gel-shrlT) vizsgálati eljárást végeztünk. Sejteket 50 ng/ntl rekombináns szolubilts TRAIL-lel, Fás ligandnmínal simudáhonk í tng/tní enhanszer.ietaniétében, vagy 50 ng/rol TRA-8-aí a megjelölt időtartamig. Nukleáris extraktutnokat preparáltunk, és duplán festet·, [!?Ej-jelölt ofigo-DNS-próbáva! mkubálfok azokat. Az eredményeket ciklon foszfo-leképező berendezés (TöpCouot NXT, Packard insíruntent Cotnpany, CT) alkalmazásával analizáltuk. Ha RA állal érintett szinoviális sejteket TNF-o-vai vagy TRAlL-lai inkubátorok, NF-xb aktiválódott időtől fbggd módon,
TRA-Ü-ellenaoyag képes NF-xb erőteljes aktiválására. Ezzel szemben, Fas-ligandtsn sem képes NF-xh aktiválódását iudakábd, áruit bemutatunk a Itta ábrás.
Tehát, bár TRAlt és TRA^S-ellentmyag erőteljes apoptózis-választ Indukálnak RA által érintett szmoviáiis sejtekben, MF-sb-t is aktivátják, és foltéíelezzük, hogy NF-xb aktiválódása hozzájárni TNF-« gyulladást megelőző ípromüamroatörikus) szerepéhez RA~ban. Tehát lehetséges, hogy TRAlt, TNF-ó-böz hasonlóim, promfimnmatorikus ciíokinfcéni képes működni. Annak meghatározása céljából hogy·· NF-xb aktiválódásának TRAlt által és TNF-α által hasonló biológiai következménye van-e, meghatároztak MMP-k termeléséi ELlSA-val. Szmovíálss sejteket tenyésztettünk csak lápkőzegbes, vagy SÖ ngósl mtertaukin-lb-veh lő ng/m! TNF-a-val, 50 nghni TRÁlt-lal vagy 50 ngíml TRA-R-eal egy éjszakán át, MWM és MMP-3 mennyiségeit a tenyészet felűiSszóibsn EUSA-teagesSkészletek alkídmazásával határoztuk meg,
Ha RA által érintett szinoviális sejteket proinfiammatodkus citokinnel, TNF-a-vál vagy IL-lb-vei inkabáitnnk,
- 45 IvfMP-l, -.3 és -13 termelése fokozódott a iÖ.b,c ábrást bemutatott, csak tápkőzegbeu tesyészíeú kontrolihoz képest. Ezzel szemben, TRAlE-t vagy artíi-DRa-ellenanyagoí alkalmazó kezelés bsih társult az említett M&ff-k Fokozott mértékű felszabadulásával.
órás sejt-életképességi vizsgálathoz friss, aorinái humán hepatocitákat 96 tenyésztőbe lyot tartalmazó tálcákban vásároltunk az ,.ln Vitro Technology” cégtől (Baltitnore, Mö). A bepaioetíákáí 1 pg/ml, szohibilis TRAfL-t vágj' TRA-8-at íasbrimazó, bepátociták tenyésztésére szolgáld tápközegheu tenyészteftöak. ó-órás éieiképességi vizsgálathoz normál hepatocitákat vagy hepatoeeilulárís ráksejteket izoláltunk friss, sebészifeg kimetszett mintákból, amelyeket a „UAB Tsssue Éroeuremcnt €enter”-hen gyűjtöttünk. A barnán· bepátociták izolálásához alkáteázoií valatnennyi reagenst, beleértve hopatocita perfúziós pufiért, emésztő tápközeget, mosó tápközeget és letapadást elősegítő tápkőzeget a Gibco cégtől szereztünk be, A szövet-szeleteket hepatoeiíák emésztésére szolgáló tápközegben emésztettünk 37X«©ns rázatva (50 r.p.m.j. egy óra hosszáig, Ax· izolált hepatocbákat elkülönítettük alacsony sebességű eeníriftsgálásssl (50 g, 3 percig) különítettük el, és hepatoeita mosó-tápkőzeggel hatszor mostuk. Egyetlen sejtet tartalmazó szuszpeuziókat tenyésztettünk 10% FCS-t tartalmazó, letapadást elősegítő tápközegben, 96 tonyésztőheiyet tartalmazó Malrigel-táleákbtm (BD) hat óta hosszáig. A le nem tapadt hepatocitákat eiíávolitottuk előmelegített, letapadást elősegítő tápközeggei végzett, két mosással. A letapadt hepatocitákat tovább inkubáltuk különböző koncentrációjú, sitolubiiís TRAtL-eí vagy FaxL-al, keresztkötő línker jelenlétében, vagy TRÁ-b-al vagy CHil-el 6 óra hosszáig.
TRAlL-nek legalább két olyan receptora vart (DR4 és DR5), amely apoptózisi képes indukálni. TRA-8~at annak meghatározására ttlkáitnazzuk, hogy vajon DRá kereszíkötése önmagában eiegendŐ-é norntál bepátociták apoptóztsának indukálására, DR5 expressziót fehérje-szinten előszűr Őt normál humán májszövsfbett és öt rákos májszőveibert í« .«'tó vizsgáltuk immuíibisztokéíükií tnódszerreb TRA-8 alkalmazásával. A normál májszovetekhől vett metszeteken normál szerkezetet és sejfínoríológíat láttunk H&E-festés után (11 .a ábra, bal Ibise panelok) TRA-8 nem sdotí pozitív reakciót DR5-re (11,a ábra, bal alsó panelek}., Ezzel ellentétben, humán bepatoeelluláns ixareinőma-szöveí pozitívan reagált íRA-S-cal olyas mintázatban, amely összhangban vari D&5 mind sejtmembránoö, mind chöpíiawábas való jelenlétével rákos sejtekben. Hepö2-jelű humán hepaíoeellnláris kareinón^u-sejtvonai szintén pozitív DRő-re. Következetesen ezeket az erédményekel. kaptuk az őt normál májszövetre, és az öt mójrákos szövet közöl csak egy (máj-adenóma) volt DR5-uegatív, Ezek az eredtnények megegyeztek az S.a ábrás bemutatott westem-bíot adataival, amely szerint, a többi normál szövethez hasonlóan, nonnáí humán tnájszövet nem expresszál szignifikáns mennyiségű ÖRS-ibhérjét Továbbá, normál bumáa hep&töcíiákbóí származó mintákkal végzett wesíero-felot analízisben próbaként TRA-8-ar alkalmazva nem mutáltunk ki detektálható mentő í»egii DR5-Ö1.
DR5 sejttélszfni expresszióját humán hepatocüakon vizsgálva áramlási eitometriás analízissel kimutsttuk, hogy frissen preparált, norínál bepátociták nem expresszalnak detektálható mennyiségű sejtfelszíni I>R5-öt 111 ,b ábra. bal. felső panelek). Olyan normái Iróniáit bepatoeí Iákon sem detektáltunk DR5-0Í, amelyeket mélyhűtötten tároltunk vagy rövid ideig tenyésztettünk. Ezzel szemben, frisseit izolált hepatoeeilulárís kareinóma-sejtek, valamint HepCi2-sejisk expresszálnak sejtfelszíni DRS-öt Eas-al összehasonlítva. normál bepátociták. hepatoeeilulárís karcínóma-sejtek és EepG2-seitek mind expresszálnak ekvivalens mennyiségű Fas-t (ll.b ábra, alsó panelek). Ezek az eredmények Összhangban vannak szakkal, «melyeket tó sitit immünbísztometriával és vvestem-bloítal kaptunk, és azt mutatják, hogy rákos májsejtek nagymértékbe» expresszalnak sejtfelszíni DRS-Őt, azonban normái bepátociták at». DR4-, DR5-,
-46DeRl- és DcR2-mRNS humán hepatockákban való jelenléte alapján (RT-FCR2>-rei kímittatva) léltételezzűk, hogy humán hepatociíák valószínűleg olyan nagyon kis mennyiségben expresszálnak DR5-fehérjét, hogy' ez nem éri el a kimuutthatőságl határi 1 RA-k-eal.
Altnak meghatározása céltáhbl, hogy TRA-S képes-e hépatoeelluláris toxicitást indukálni, némái humán hepatoeiták érzékenységéi vizsgáltuk apoptózism, amelyet TRÁ-8-cal és szoluhiiis IRAlL-ei plusz kereszlkötö iínkerrel isdttkáituaL Abban az esetben, ha normái hepatocitákat tenyésztettünk magas koncentrációban jelenlévő TRAIí,-et, sejtek életképességének időfüggő csökkenését figyeltünk meg A.TRI.iíe és MIT vizsgálati eljárás alkalmazásával (IXa ábra). Normál hepaioeiíák TRÁíL-mediált sejtpusztuiását TRAfL hozzáadása után már négy érával látható volt, 24 órás tenyésztés veget) a hepatociíák több, mint 80%-át elpusztította a TRAfL. Ezzel szemben, ugyanekkora tenyésztési idő után TRA-8 nem indukált szignifikáns mértékö sejtpusztalásí normál hepstochákhan. Hoeehst-ml festett, kondenzált sejtmagok száma, ami jellemző az. apoptó2isra, TRAík-tel kezelt hepatochákban nőtt, azonban a TRA-k-eai kezelt hepatociiákban netn (12.b ábra). Az apoptotikus hepatoeiták szánta összhangban volt a csökkent életképességgel, ATPL&e vizsgálati eljárással meghatározva, ami alapján föltételezzük, hagy a hepatociíák TRAR..-i!5Őnkált sejtpusztuiását ápopiézls medhilja. Mindezt alátámasztotta, hogy 2-VAD képes hepatoeiták TRA.1L15 médiáit toxieitásáí gátolni. Mivel eiklobeximid potenciális apópiózts-eohanszep a vegyibe; hatását vizsgáltuk TRA1.Liai és TRA-8-caf kezelt bepatócítákra. Négy órás tenyésztés alatt a cíkluheximid szignifikánsan növelte s hepatoeiták TRÁlL-indukáit sejtpusztuiását, a hepatoeiták több mint ?S%-ái elpusztította a TRAii.. cikioheximsd jelenlétében ( i2,c ábra). Azonban a eiklobeximid kezelés nem képes hepatocítákhan a TRA~8-medíáit sejtpasztulás mértékét növelni. Hepafoeítákbán TRA-S-indukált apöptózis és TRAit-mdukáh apoptözis tulajdonságainak összehasonlítása céljából, normái hepaiociiákut valamint ráksejteket inkubáitunk különböző koncentrációjú, szolnbilis TRAlL-el keresztkötő linkerrel, vagy TRA-R-cal. ő órás tenyésztési idd alatt T&AIL -mérsékelt apoptotikus választ indukált normái bopaloehákban. A. hepatoeiták több mint 2ö%-a elpusztult 500 ng/ml TRAII.· jelenlétében tlz.d ábra, balra fent). Normál hepatoeiták TRA-8-kezelése azonos időtartam alatt nem váltott ki szignifikáns sejtpusztolást. Normái hepatocifákknl elleniéiben elsődleges hepatocelfufánS karcinóma-sejtek (T2.d ábra, középen fent) és BepG2~sejtek (12.d ábra, jobbra fönt) nagymértékben érzékenyek TRAII.. vagy TRA-R által médiáit apoptómra. Hépatoeelluláris kareinőmasejtók több, mint SOTföa, és HopOS-séjíek megközelítőleg iÖŐ%-a elpusztult a nyolc órás tenyésztési idő alatt. Estek az eredmények azt: mutatják, hogy normál hepatoeiták teljésen reztsztensek TRA-S-mediáit apopiöztsrá, és sokkal kevésbé érzékenyek TRAÍL-raediált apoptózisra, mint a rákos májsejtek. Fas-ligandumot és anfi-Fas~eliena;tyagot {CR-11) alkalmazva nem volt szignifikáns különbség Fas-snediált apoptózisra való érzékenységben normál hepatociíák, hepatecellulárís karcinóma-sejíek és flepCü-sejtek között (I2.d ábra, alsó panelek),
Hepatitisz ó? vivő indukálásn
8-111 beles nőstény Bő-egereket intravénásán beoltottunk 109pfu Ad/hTRAIL-ld5 és azonos számú „Ad/Tet-on”35 nal. Az egereknek különböző konoentrácíöban tetraeíklint .adtunk ivóvízen keresztül, kőzveilenöl adenovírus-vektorok beoltása után. A máj károsodását ART szérumban mért értékeivel határoztuk meg, AST diagnosztikai reagenskészlet {Slgma) aikalniazásá val. TRAII.. expressz tóját N orthern-blo; analízissel határoztok meg.
Annak meghatározása cs'jaoöl hogy TRAÍL membránkötött tormája in vivő májkárosodásái indukál-e, előállítottunk teljes hosszúságú iramán FRAík-t kódoló, rekotóbínáns adenovirus-vekíort (Ád/hTRAIí..), amelynek expressziója tetraeikihmel indukálható promóter szabályzása alatt áll. B6-egereket beoltottunk AáhTRAil..-el intravénásán, majd 24 óra elteltével megfigyeltük humán TRAii, tettaeiklln-indiAálí, dözísíiiggő expresszióját a
-47rnájban, amit Norfóerafeloi analízissel nmtatbmk ki (13.s ábra). Az expresszit TRAIL mennyisége jól összhangban volt a inéjkárosodás «festékével, amit ttanszsnninázok satumban mért mennyiségeinek tetra ciki in-függő «övekeáése mutatta, szintén dÓzisfoggS módon (13.b ábra). Mivel valósziuuleg az adenoviras-vektor beoltása /»er se növeli bepatociták érzékenységéi TRÁlL-mediált npopíózisra, Ad/TRAIL-el oltott egerekből származó itepaíoestákat izoláltuk és teszteltük TRAIL-snedíált sejtpuszíuiásra, Az Ad/TRÁIL-ct fertőzött hepalíwitákbmi nem növekedett meg szignifikánsan a sejípttsztniás mértéke kontroll egerekhez viszortystVá (13,c ábra, bal alsó pattéi). Továbbá, az Ad/f RAiLel oltott egerekben nem volt tokozott májkárosodás szolnbiiis immáo TRAIL intravénás injektálása titán. Ebbői tehát az következik, hogy Ad/TRAIL által indukált hepatitiszt .membránkötött formájú IRAK, nagymértékű expresszója medtáija. MájmetszetekbisAoIőgiai analízisével .kimutattuk, hogy a hepatöoifák károsodása wte 24 órával a vektor beoltása után látható (13,d ábra), és legalább 7 napig megmaradt (L3..e ábra). Ezek a patológ elváltozások a májban szintén tsttaeiklin-függóek, és a dózísinggő módon történtek. A 24 órás kezelés alatt, a TRAiL-tndúkáh májkárosodás korai fázisát nekrózis fókuszok jellemzik. Gyulladásos sejtek heszöfem lését nem figyeltük meg ebben az állapotban, azonban vérzés előfordult. Az oltás utáni 7. napon dilfoz májkárosodás jelent meg jellegzetes lebsnyszerü rendezetlenséggel, bepaeiták súlyosan degenerálódtak szabálytalanul összeesapzódott cltoplaztnával és nagy tiszta tnrületekkeh valamint szembetűnő apöptózissal és nekrőztssal. Mononak leáris sejtek fokozott mértékű infthráetója volt jellemző etre az állapottá, Ezek áz eredmények azt mutatják, hegy humán TRAIL nrembrán-kötóft formában képes in vivő májkárösedásí indukálni. Humán TRAil, ugyan egerekben súlyos hepatitiszt képes okozni, azonban nem indukált letálls választ. Ezzel szemben, Fas-ligandumot kódoló, hasonló tettaeiklm-szahttlyzeíi vektorokkal oltott egerekben heveny hepatitisz, fejlődött ki hepaíodtak masszív apoptöztsáyal és nekrózisával, melyet súlyos vérzés és mortítiítás kísért dózístüggő módon az oltás alán 72 órán belől. A pusztulás aránya 48 órán belül elérte a löö%~oí azokban az alcsoportokban, amelyek 3 tng/tnl vágy több fetraciklmt kaptak, Ezzel szemben minden olyan egér, amely Ad/hTRAILt kapott, a tetracikltu-dózistól föggetlenöl, az oltás után négy héttel még életben volt. Ebből tehát az következik, hogy TRAIL membrán-kötött; formája fo vmo kevésbé erőteljesen indukál hepatoeelluláris károsodást, mist Eás-ltgándum. Az eredmények alapján továbbá azt: is: feltételezzük, hogy IRAK, olyan nteebattiztmsson keresztül indukál májfeárosodást, amely különbözik azoktól, asnelyek Fas-ligandum toxicliása alapiéul szolgáinak, /2. pAkfo
Akflyájtbagnán.T-;ésB-seífókfokozott,mét^Mfó«.exprgss^hmkl)ROj:
Annak maghatározása céljából, hogy ÖRS szerepet játszik-e aktivált T- és B-sejfek TRAlL-mediáií
36' apopfoztsában, DRS sejtfelszíni expresszióját vizsgáltuk nyugalomban lévő és aktivált T- és B-sejíeken, TRÁ-8slkalrnazásávnl. A nem stimulált, humán T-sejtek PBMC-ben nem expresszáhnk DRS-öt szignifikáns mennyiségben (14. ábra), AMÍ-C.D3- vagy Cen-Á-stímulácíó után 48 órával a sejtfelszíni DR5 expresszió mértéke szignifikánsan mégnövekedett. Ehhez hasonlóim, nem stimulált B-sejíek nagyon alacsony snetmyifogben expresszáítafc BR.5~öt. Ánti-psdntuláetó fokozta, LPS-,stimuláció viszont nem fokozits DR5 sejílelszsm expressziÓját. Ezek az eredmények, azí mutatják, hogy aktivált I-sejtek és B-sejfek egyaránt nagyobb mértékben expresszálnak. DRŐ-öt. A sejteket 20 pg/ml TRÁ-S-cal és PE-kottjngáit, anti-egér IgG 1 -gyei festettük.
Aktivált T- és B-seitek érzékennyé válnak TRA-8-ntediáR anontózisru
Annak meghatározása céljából, hogy aktivált T- és B-sejtek érzékenyek-e TRA-8-ntedlálí spogfőzisnh humán
-48PBM€-ből származó T- és B-sejíekei 48 éra hosszáig.t/rvitro sthnuláltuk arsR-CD3~mai vagy anti-p-vel, soíaendben. Az életképes sejteket és prolilerálő blaszí-ssjfeket: gradíens-centrifugálással el választottuk, és kölöaböző koncentrációjú TRA-S-eal iírknbáitók, Nem-stimulált T~ és B-sejíék nem veltak érzékenyek TRA-8-mediálí apoptózisra (15, ábra). Minden stimulált T~ és B-sejt érzékenysége mérsékelten megnövekedett TRÁ-8-mcdiált apoptózisra, ahol a sejtek 20%?
át elpusztította TRA-8 egy éjszakás tenyésztés alatt. Sőt, a nagymértékben proliferatív blaszt T-sejtek érzékenyebbek valtak TRA-8-rnediáh apoptózlsrá a többi sejthez vtszonyílvm Ezek az eredmények azt mutatják, hogy aktívák T- és Bsejtek érzékenyek HRS-medíált apóptózisra.
/4. jtólda
TÜA-8 kinserB aktivált T-seítekes hniuán/SCIP egerekben
TRA-8 tó φ anti-T-sejt hatékonyságának meghatározása céljából NGD/SClD-egerekbe lx 1Ö8 humán PBMCt injektálttmk Intravénásán, Normát esetben feutuán T-sejtek SCiD-egerekhen gyorsan aktiválódnak xenogén stimulációra adott válaszként. Humán PBM&'SCJD-egerekbe 1ÖÖ pg ΤΕ.Α-8-at vagy kontroll IgGJ-et injektáltunk fetraperiioneáiisan az odaszáih'tás napjától három naponként Ismételve. Öt nappal a szállítás után ioonettukieáris
IS sejtekéi izoláltuk a lépből, és megfestettük azokat antÍ-humán-CD3-ellenanyaggal, és a luniocita-populációt áramlási eitometriás analízissel kapuztók, és a D3-pozítiv, humán T-sejteket vizsgáltunk, tápból származó limföclták körülbelül 3Ö%-a volt humán T-sejt, amit anfi-humán-CD3-íéstéssei határoztunk meg a kontmllal kezeli egerekben. Azonban csak kevés humán {'-sejtet (kevesebb, mint 3%) figyeltünk meg a lépből származó limibciíák között TRA-S-cál kezelt egerekben (lő. ábra). /«· vük iusztológtói kísérletben kimutattuk, hogy kontroll egerekben humán T-sejtek újra
2ö megjelentek a lépben, ahol csak kevés apoplotikus sejtet lehetett megfigyelni, 'HJNEL-fesléssei kimutatva. Ezzel szemben nem ügyeltük meg, hogy életképes humán 1 -se t benépesítik a lepet 1 R.A-8-uil kezelt egerekben, inkább több apoptotlkus sejtet figyeltünk meg (17. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy TRA-S tó vtóo anti-T-sejt aktivitást képes kifejteni, és a jalálfnány szerinti ellenanyagok alkalmasak G VH-beiegség kezelésére,
TBÁ-5 rákellenes terámás aktivitása /5. / 9Λ5 ioytressrtótó és funheláfa &s/ttsátt zdtejövefetótóít ás sefruöftufeábutt
1} &HS exprersróijítóuT és/u»kddjú»<tó megfetóározúse humán féhszávetehhen TA/l-4 festéssel
Árnak meghíUaíozasa céljából, hogy ráksejtek es szövetek dirtereneiálw expresszáJhafc-e nagyobb meuayiségií
DRS-őt, humán rákszösetekből álló panelt, amely tóbb, mmt 2Ö mellrákból, ő petefészek-rákból, 5 vastagbél-rákból és 5 prosztatarákbői származott, megfestettünk TRA-8-cai mmtunhiszfokémiai vizsgáimhoz. A rákszövetek nagy része detektálható tóennyiségü DR5-öt expresszáit. Az expresszáit DR5-memíyiségek különbözőek voltak a szövetekben. Általában mkszövetek nagyobb mennyiségben sxpresz&ttak BR5-öf, mini rákkal nem érintett szövetek. Továbbá, í)R5 expressziója láthatólag nem volt összefüggésben p53 mutációjával.
Z><? ex/irmdíW tó /bvÁró.yv humán eáhívh->wmlnhhiín (2. táblázati
Kilenc humán rneilrák^sejtvonal, három pettüévekrák-sejtvonal, három vastagbéirák-sejtvonal ás három prosztatarák -sejtvonal sejtfelszíni DR5 expresxztójál és '1 RA-8-mdukáit apoptózisra való érzékenységéi vizsgáltuk tó vám.. A 9 mellrák sejtvoaal közül 7, 3 petefészekrák-sejtvonai közül 3, 3 vastagbéirák-sejtvonal közül 3, és három proszíatnrák-sejlvonal közül 3 expresszáit sejtfelszíni DS5-öí különféle mértékben, A 9 meilrák-sej ivónál közül bárom nagyon: érzékeny, három közepesen érzékeny, károm pedig rezisztsns volt TRA-S-tnediálí apoptózisra, MüAárom petefészékrák-sejtvönal nagyon érzékeny volt. Á három vastagbélrák-sejtvonal egyike nagyon érzékeny, míg kettő közepesen érzékeny volt. A hám® pm&zíatarák-sejíx-őnal közül kettő közepesen érzékeny, egy pedig rezisztens vök.
2< táblázat: ÖRS espressziója és takeiója humán: ráksejtekben
Sejt vonal Eredete Expresszió1 1 rzéketnxóg
2LMP mell -·!·
LCCő mell 444- 4444
M.B468 mell 444 444
MB231 mell 44 Ύ T 1
ZR-75-1 mell .ί..:..;. T ‘ * 44
SKBR5 mell 4 44
MB453 snell 44 +-
BT474 mell 4 -
DY36T2 mell -
Caov-3 petefészek 4 44-44-
OVCAR-3 petefészek 4-l· 4444
Skov-3 petefészek 4- 4·4·4·
VVtDR vastagbél S-44 j-w
HST29 vastagbél 44
T84 vastagbél 4- 44 :
BC3 prosztata -Í-d.- 3.· -4-t·
LnCap prosztata j. · · 'T
Du-145 prosztata
Me^egyzés: ^Áramlási ehöntefriával határoztak meg, a sejteket 20 gg/thl TRA-S-cai megfestettük, és kontroli ellenanyaggal összehasonittottük. '\ATELite vizsgálati eljárással határoztak meg., -h~h·:; 80%-nál nagyobb arányú puszndás, +-+·<·: 60-80% közönt pusztulás, 44-; 40-60% közötti pusztulás, 4·; 20-40% közötti pusztulás, - nincs pusztulás.
&/j Γ&Μ és tfértan/m fctwÓfedA etoáextcttása. Néhány rodlrák-scjtvonalban adt bankán hatását vizsgáltuk 10 OA-8-srtáukáIt apoptózisra. Adriánké® nagy dózisban additív hatást fejtett kt. Azonban néhány TRA-8-rezísztens sejtvonalban adriamioin kis dózisban sziricrgikasan javította a TRA-S által indukált upeptoztst.
fej ?R.4~S itt víteo és irt vivő k&i&iléxl afáhtötása kutsán rdfefíetóec. Radioaktív izotóppal jelölt TRA-S-at aikahnnztnnk. TRA-8 kötődési aktivitását vizsgáltuk mellrák-sejtvonalboz ifi v/Ovj és ® v»yí olyan SClD-egerekben, amelyekbe tumort ültettünk be. Az /« vh?-ö .kötődési aktivitás becsült értéke ráksejtekhez Kd t;; 3 hM, ami megfelel az előzetes, ELíSA-ra alapuló becslésnek, és legalább 50-szet több, mint szoiobílís 1RA1L e&etéheu, TRA-8-ut /« vívó a beithe tett tmnorszö veihez lokalizál tűk.
15.2 Krónikus limfobiíkns kukéinál terápiája NOö/SCID-egerckben TRA-8-al
Krónikus limíolítikus leukémia (CLL) 8-seites roalignitás közönséges formája. A legtöbb tnalignns B-sejt CL1ben érett fenotípusú, és rezisztens sokféle apopuvis-vtírnulussaí szemben. ŐfClá, által érintett páciens 8-sejtjeihe» megvizsgáltuk ÖRS expresszióját és Funkcióját. Valamennyi páciensben magas volt a perifériás B-sejtek száma, amit az mutatón, hogy 95% CD19t B-sejt volt a PBMC-beu. Normál, primer B-sejtekkel összehasonlítva, az összes páciensből
-50 származó, CLL álfcáí érinteti B-sejteken a sejtfelszíni DR5 nagyobb mennyiségben volt jelen, és in vifeo érzékenyebbek voltak TRA-8-mdukáit apoptézisra. Érdekes módon, a CLL által érintett B-sejtek érzékenyek voltak bisx~í«dólmaleimid-Vni (BisVíll) által indukált cítotoxieiiásra is. TRA-8-cat és RisVlll-caí végzett kombinált kezelési után megközelítőleg 58% CLL által érintett B-sejt pusztult el, míg a normál B-sejíefc nem adtak választ (18. ábra). CLL által érintett Ö-sejtek NOD/SCIP-egerekbe való bevitele körülbelül 25-38%~os CDÍ9+ B-sejlet tartalmazd új populációt eredményezett a reciptenx egerek lépében öt nappal a bevitel után. Három dózis 1'ΘΟ pg TRA-8-kezelés azoaban teljes •mértékben elimmálta öt páciens közül négyben a CLL által érintett B-sejteket a reelpiens SCtIXegerek lépőben. léhát, J'RA-8 önmagában vagy más anyagokkal együtt aktív terápiás ágensként krónikus Ümfblítikns leukémiában, (1) TRA-8 nehéz és könnyű láncában az N-termináíis aminosav-szekvenda meghatározása
TRA-8 nehéz és könnyű láncát kódoló cDNS előállítása céljából meghatároztuk 'í‘RA-8 nehéz és könnyű láncában az N-fermsnálls aminosav-szekvenelát és a klónozott JRA-8 gének szekvenciáit, Ismert technikák alkalmazásával.
pg, TRA-8-jelö anti-iuunán-DRá ellenanyagot tartalmazó oldatot SfeS-puliakriíanud-gélelekttolőrézisnek feSDS-PAGIF) vetettünk alá 12 vegyes%~os gél, 100 V állandó feszültség alkalmazásával, 120 percig. Az elektroforézist követően a gélt 25 mM Tris-MCI-t (pH 9,5), 20% metanolt, 0)02 tí% SDS-í tartalmazó transzferpufferben áztattak 5 percig, Ezután a gélben lévő fehérjéket: átvittök pölivintlidéR-djduörid membránra („PVDF-memb20 iái?”: pórusmérete 0,45 pm; Mllilpore, Japan), amit előzőleg szintén transzfer-pufferben áztattunk, bloííolá berendezést alkalmazva {KS-8451; Marisol) 18 V állandó feszültségen, -RC-on, 14 óra hosszáig.
Ezután a FVDF-membránokat 25 mM NaCl-ot, 10 íbM nátrinm-horátot tartalmazó, mosó ptsRérrel (pH 8,0) mostuk, majd festóoldsttai festettük (50% íf% metanol, 20 trió eeetsav és 0,85 vegyesbe Coomússíe Brilliaui Blue) üt percig a fehérjeesíkok lokalizálása céljából. Majd a I WF-membráni 90 trió vizes méta tollal festékteleniietiük, és a nehéz láncnak megfelelő esikol, ami a kisebb mobilitásé csík, és a könnyű láncnak megfelelő, nagyobb mobilitást) csikót, amelyeket előzőleg a BÖVE-membránon lokalizáltunk, kivágtuk, és ionmentes vízzel mostak,
A nehéz és könnyű lánc H-fermmáits aminosav-szekvencíáját Edman-íele automatizált módszerrel határoztuk meg [Edman, P. és mtsai., Eur.. J. Biocbem., 1, 80 (1967)], gázfázisú fehérje-szekvenátof alkalmazásával (PRSQ-ΊΟ; Shimadza Seísakusyö, R. R.),
A nehéz, láncnak megfelelő esik bi-temtínáits aminosav-szekvenciáját meghatározva az alábbi szekvenciához jutottunk:
ClIn-Vaí-Met-Leu-yal-Glu-Ser-Gly-Gly-üly-Leu-Vál-LyS-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Lys-Leu (a szekvencialistában a 4, azonosítószámú szekvencia);
és a könnyű láncnak megfelelő csík N-temtinális atninosav-szekvenciáját meghatározva az alábbi szekvencsáboz 35 jutottunk:
íksp-lle-Val-Met-'fhr-Gln-Ser-H:is-I.ys-Phe-Met-Ser-Tbr-Ser-Val-Giy~Asp-Arg-Vai-Ser (a szekvertcialistában az 5. azonosítószámú szek vencia).
Az így kapott aminosav-szekvenciák, és Rabat és munkatársai altul [Rabat E, A. és mtsai,, „Setpjences of Proteint: of Imomnoiogíeal interest”, 11. kötet, L.S. Department of Health and Humán Services (I99i)j összeállított, ellenanyagok ammosov-szekvenda-adatfeizisban lévő szekvenciák összehasonlítása kiderítette, hogy TRA-8 nehéz
-51 lánca (yl-láac) és könnyű lánca (k-láne) a 3d. és 1. altípusba tartozik, .sansndfeen.
(2) d>N5 klónozása
A fentebb leírt erednrényekböl kiindulva láiícrndifö obgonukieotidokat színtetizáltuiA, amelyekről az várható, hogy az ilyen egéreredefú atópsshoz tartozó gének 5 -végi netn-traúszláiödó régióinak részleteivel és 35-végi netn5 ttwzlálódö régióinak. legvégéivel képes blbridizálódnl. Azután l'RA-8 nehéz és könnyű láncát kódoló cDN'S-eket reverz transzkripció és PCR alábbi koínbistáetójával (RT-PCR.) kiónoztok:
TRA-8-at termelő bibridómáböi ösaz-RblS-t (ATGC nyilvántartási száma; RTA-H28) exteaháltok “TRIzoi Reagent” (G1BCÖ BRL) alkaitrtszásával. A PCR-reakcíóhoz íetnpláíkéni aikabnazoit eí>NS-í a ''Flrst-Sö-and cDNS systhesis kit” (Atnersltarn Pharrnacta Biotech) reagenskészlet alkalmazásával álbíottek elő, a gyártó által mellékeit használat: utasítás szerint.
b) FÜR láneiudító «lígosnkteotidok
Az alábbi íáneindítő oligonukteotidokaf szintetizáltuk a PCK-bez.
-eageseígaa eacggaccee-3' (HSlOl: a szekvencíabslábaá a ó. azonortíóvutnu szekvenciák
I.5 d’-aaaggtsatí tettgagaag-I’ (I45NCS2; a szekveneiaiistában a ?. azonosttoszantu szekvencia:;
S’-ecteaceatg aaettegggc-3' <H5SS1; a szekveneiaiistában a 8. azcnosltószánn: szekvencia);
S’-eígítgteíg cacatgagac-3’ (1Í5SS2: a székvetsctellsiábsn a 9. szonostfószámó szekvencia);
S’-gaagfgaígc tgg.tggagte-3’ (M5CS1; a szekveneiaiistában a 10. azonositószámú szekvencia);
S'-agtgtgaagt gaí.getggtg-3' {II5CS2: a szekveneiaiistában a 11. azonosítószámú szekvencia);
S’-trtaceagga gagtgggaga g-3’ i'M3CR.: a szekveneiaiistában a 12, azonosítószámt: szekvencia);
5’Ageagagaca gtgaecagag-3’ (B3VR; a szekveneiaiistában a 13. azonositószáusú szekvencia); ó’-tgdeaggac cagcatgggc-3* (L5NCSÍ; a szekveneiaiistábana 14. azonosítószámú szekvencia);
5’-aagacatttt ggattctaac-3’ (I.5NCS3: a szekveneiaiistában a 15. azonosítószámú szekvencia); S’-íatcatgaagtcíttgtatg-J' (L5SSÍ: a szekveneiaiistában a ló. azonosítószámú szekvencia);
S'-g&tggagaea eatteteagg-3’ (LSSS2; a szekveneiaiistában a : 7. azonosítószámú szekvencia);
5!-gacattgíga ígacccagtc-3’ (LSÜS: a .szekvenciái istában a 18, azonosítószámú szekvencia);
SMtaacaetea ttectgiíga-3’ (1.3GR;: a szekveneiaiistában a 19. azonosítószámú szekverteia); és S'-gaetgggtea teacaafgíe-3’ (LCSR: a szekvenciallsishan a 2(1.. azonosítószámú szekvencia),
Hacsak másként nem jelöljük, ebben a példában alkalmazott, valamennyi ohgoaukteotidot a Pharmacia Biotech cégnél szinfetlzáliatfunk. Minden oíigonukleotidot -2ü’C-on tárolunk, miután feloldottuk desztillált vízben, e) PCR-reakeió A POR teakmóddaí ov. odúidé eONS-templát, 5 μΐ (33 μΐ reakció őssztórfogata) l)R5p 1 - jelű Iáncíodltő oiie.onukíeotíd. 10 psnol;
DR5p2-jelu láncindííó oligonnkleotíd, 10 pmoi;
x koncentrált PCR-pttófer (a készlet tertalmazza), 10 μί; áNTP-k (egyenként 2,5 mM i, 4 ul; és
Taq-pöfeneráz(Fromega), 5 egység.
Steril desztillált vizet adtunk az oldathoz 100 ul végíéríógatig. 'Hacsak másképpen nem jeiöhak, a dNTP-k, azaz dA1P dí ΓΡ, cGÍPcsdn P mennynege ,t keverékben ekvrneiáru iegvenkent 2 s mM*
- 52 A PCR-reakciőt az alábbiak szerint végeztük, Az oidatot először tbimelegfiettük' <M*C-r«* 2 percig, azután az alábbi hőmérsékleti eiklusokat végezzük: 94®C 30 nmodpéreig, 82®G I percig és 72öC 3 percig, 40-szer ismételjük. Az eljárás után a reakcíóoldatst ?2°C-on melegítettük 10 percig.
Az. így amplíikált DMS-iragmenseket 0,25 pg/ml eUdimu-bromidöí tartalmazó, 1%-ös agarőz-géien 5 elválasztottuk, Azokat a csíkokat, amelyektől megállapítottuk, hogy tartalmazzák a kívánt DNS-f'ragmensekeí, kivágtuk borotvapengével, és a DNS-t kinyertük belőle „Gene Ulean kit” (BlOlöi) alkalmazásával. A GMS-fragmenst „pGEXl-T
Easy” vektor (Promega) alkalmazásával klónoztuk. Ezt az alábbiak szerint végeztük.
A PCR-teukcióoidatbol kinyert DNS-frsgmenst, 50 ng „pGEM-ϊ Lasv' vektorral (amelyet tartalmaz a „TA Closing Kit) összekevertünk 1 pl, 10 X ligáz-reakeiőpufferrel |6 mM Tns-WCi (pH 7,5), 6 mM megnézium-klorid, 5 stM nátrium-kiorid, 7 m.M β-merkaptoetanol, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 m.M spermidin és Ö,i tng/tnl marh&széramalbmninj, amelyhez 4 egység T4-WS-iigázt (I pl) adtunk, A keverék össziérfbgatáí 10 pl-re kiegészítettük steril ionmentes vízzel, és az eredményül kapott ligáz-oldstoi 14®C-on infetháltak 15 óra hosszáig. Ezután 2 pl iigázreakeióoldatot hozzáadtunk 58 pl, kompetens El eoO IMIOÜ-törzsbőz (amelyet a készlet tartalmazott, és kompetenssé tettük a használati utasítás szerint), ehhez 2 pl, 0,5 M β-merkaptixnanolt adtunk, es az eredményül kapott keveréket jégen tartotmk 30 percig, mmd 42®C-on 30 másodpercig, és ismét jégen 5 percig. Ezután 500 pl, 2 'tf% íriptoöt, 0,5 vegyeska élcsztökívonatot, 0,05 vegyes% nátrinin-kioridot, 2,5 mM. káimm-kloridet, 1 mM magnéziutn-kloridot és 20 mM glükózt tartalmazó íápkdzeget (a továbbiakban „StáCMápkőzeg} adtunk a tenyészethez, és a keveréket :37°C-on 1 óra hosszáig iuknbáltak rázaiva. Ezután a tenyészetet szélesztetíük 109 pg/ml ampseiílint tartalmazó, „L-feroih” agartáleára (Difco) (1 ífíá tripmn, 0,5 vegyesé-» élssztőkivonai, 0,5 vegyes®/» nátrium-kiorid, 0,1 vegyes®/» glükóz és 0,ő vegyes)» bacto-agar). A tálcán megjelenő ampicillin-reziszíens telepeket kiszelektáltak és lekapartuk platina oltóhurokkal, és 109 pg/ml ampísühni tartalmazó, „1,-broíb” tápközegben tenyésztettük 37®C-on, egy éjszakán át, 200 r,p,m,~en rázaiva, Inkubáiás után a sejteket centrifugál ássál elkülönítettük, amelyekből plazmid DNS-t preparáltunk alkáli-módszer alkalmazásávak Az eredményül kapott plazmid jelölése pE62t ami TRA-8 nehéz láncát kódolja, vagy pE28, arai TRA-S könnyű láncát kódolja. A plazmidokat tariálmazö, tmnszíhrmáns S. coli törzset, amelyek jelölése El eoö JM199/pií62 és £1 cö/í JM109/pE28, 2001, április .20-án deponáltuk az alábbi intézményben: „International Patent Organism Depósifary, Maiiénál ínsiltuté of Advanced industriai Science and Technology” (1-1, Hlgashi 1 chptse Tsukuba-sbl, íbarakbken, 395-5466, Japán), a nükfóöfgamznmsök. deponálását szabályozó, Budapesti Szerződés szerint, és nyilvántartási sitámuk FERM BP-7560 és FERM ÖE-7561, sorrendben. TRA-8 nehéz láncát és könnyű láncát kódoló DNS-ek nukleotidszekvenciáját didezoxi-módszerrel igazoltuk [Sangér, F. S, és mtsm., Proc. Háti. Acad, Seb
USA, 74,5463-5467 (1977)] „3700 DMA Analyzer” (ABIBRISM; Perkin Elmer Applied Biösystem, Japán) alkalmassásávul,
TRA-8 nehéz és könnyű láncát kódoló nukleotidszekvenciákat a szekvencialistában 31. és 22. azonosítószámú szekvenciaként adtuk meg, sorrendben, TRA-8 nehéz és könnyű láncának aminösav-szekvencíáit a szekveneialistáöau 23, és 24. azonosítószámú szekveneiakéut adtuk meg, sorrendben. TRA-8 nehéz és könnyű láncának lentebb leírtak:
szerint előállítóit M-íérmmális andnosav-szekvenctáí tökéletesen illeszkedtek. Továbbá, ha a nehéz és könnyű láncok ammosav-szekvenciáit az ellenanyagok atnitfsav-szekyeneiáinak adatbázisával összehasonlítottuk, megállapítottuk, hogy a nehéz lánc esetén, a 21, azonosítöszúmű szekvencia 58-414, számú núklootidlái alkották a variábilis régiót, míg a 21. azonosítószámú szekvencia 415-1392. számú nukleoddjai alkották a konstans régiót. A könnyű lánc esetén a 22, Azonosítószámú szekvencia 64-487. számú nakleoíidjai alkották a variábilis régiót, mig a 22. Azonosítószámú szekvencia 388-702. számú nukleotidja alkotta a konstans régiót. A CDR-ek elhelyezkedését és szekvenciáit szintén
-53.kídethetfok, az adatbázisban lévő hottrológták összehasottlítesával. TRA-8 nehéz láncában a CDR1, CDR2 és CDR3 aminosav-szekvenciáit bemutatjuk a 25., 26. és 27. azonosítószámú szekvenciaként, sorrendben. TRA-8 könnyű láncában a CDR I, CÖR2 és CDR3 aminosav-szekveneíáknt bemutatjuk 28., 29. és 30. azonosítószámú: szekvenciaként, sorrendben.
(1) TRA-R variábilis régiójának motektiitsíííoílellezése
TRA-R variábilis régiójának molekula-modellezését homológta-íutoiellezéskéní általánosan ismert eljárással lö végeztek [Meífeöds of Enzymology, 203, 121-153 (1991)1. Összehasoslftottuk humán immonglobulm variábilis régiók “Protein Data Sank’Msan (Nuc. Acid Rés 28, 235-242 (20ö0)J regisztrált primer szekvenciáit, amelyekre röntgenkrisztaltegráBás adatokból származó háromdimenziós struktúra rendelkezésre állt, TRA-8 lentebb leírtak szerint meghatározott vázrégioivai. Ennek eredményeként kiválasztottunk \CD-t és I IllL-t, amelyek a legnagyobb mértékű szekvencís-hömolőgiával rendelkeztek TRA-S könnyű és nehez lánc vázréglőivaí, sorrendben. A vázrégiók hároíodhoetizios stroktúráh előállítottuk 1 NCD és I Ilii, koordinátáinak kombinálásával, amelyek meg léiéinek TRA-8 könnyű és nehéz láncának, „vázrégió-modeil létrehozása céljából. Chothia és munkatársai éltei definiált osztályozását alkalmazva TRA-8 CDR-jett az alábbiak szerint osztályoztuk: CDRLi, CDRL?, CDRHt és CDRIF a 2„ í„ I. és 3. kanonikus osztályba tartozik, sorrendben, míg CDRLj sem tartozik egy ik konkrét kanonikus osztályba sem. C13R.E;, CDRU, CDRHt és CDRIR CDR-tófeaít az adott kanonikus osztályra jellemző konforntáesókhoz rögzítettük, és beépítettük a vázrégiő-íoodelíbe, CDRJ-R at a RA-klaszter konformációjához soroltok Thomton és munkatársai osztályozása szerbi p. Mól. Bioi. 263, 800-815 (19ő6)j, és CDRU-at k(8)C-be soroltuk a 1-13-szttbáiy alkalmazásával [FEBS téliért. 455.188-197 (1999)], Azután CDRf.j és CORK. reprezentatív konformációit beépítettük a váz,modellbe.
Végül eaergissszámitásokat végeztünk az atomok közötti kedvezőtlen kontaktusok eliminálására abból a célból, hogy TRA-8 variábilis régiójának energetikailag valószínű molekula-modelljéhez jussunk. A fenti eljárást kereskedelmi forgalomban lévő ASM (Oxford Moléeuiár limited, Inc.) közönséges mölekttla-ntodellcző rendszer alkalmazásával végeztük. Az. így kapott molekttía-modeilen a struktúra pootossságát tovább elemeztük PROCHÉCK-szoRver (1. AppL Crvst. Tó, 2.S3-T91 (1993)] alkalmazásával.
(2) Humanizált TRA-8 amlnosav-szekveoeiáiKak tervezése
Humanizált TRA-S-eílenanyagokat általánosan ismert eljárással, CDR-átülteiéssel [Proc. Hat!. Acad. Sci. USA .86, 18029-10833 (19891) hozmuk léire. Az akeéptor ellenanyagot a vázrégióhao lévő ammosav-homoiögia alapján választottuk ki. Összehasonlítottuk TRA-8 vázrégí ójának szekvenciáit a Kabat-féle ellenanyagok ammosavszekvenciáií tartalmazó adatbázisban [Nttri Acids Rés, 29, 285-206 (2081)) található valamennyi tanán vázrégíó szekvenciáiéval. Ennek eredményeként akcepterként kiválasztotosk az, mAB58’CI..-ellenanyagoí, mert a vázrégtőhan a legnagyobb mértékű, 80%-os volt a szekvencía-homoiógia. m.AbSiFCL vázrégíöjábaa találhtdó amiuosavakat és TRA-8 vázrégiójában lévő ammosavakat egymás alá rendeztük, és azonosítottuk azokat a helyzeteket, ahol eltérő aminosavak voltak. Az ilyen aminosavak elhelyezkedéséi TRA-8 fentebb leírtok szerint létrehozott, háromdimenziós modelljét alkalmazva analizáltuk, és Queen és munkatársai állni [Proc. hinti. Acad. Sel. USA 86. 101)2.9-10833 (1989)] megadott krítérinotok alapján kiválasztottuk a donor amínosavafcai, amelyeket át kell ültetni az akceptorba. Humanizált TRA-8szekveneiákat az alábbi példában leírtak szerint állítottunk elő úgy, hogy néhány dormr-antinossvaí átvittünk
4Ö mA b5 8’CL- jelű okeeptor-e llenaoyagha.
- 54 Kspressziós vektor elóálhtása a humanizált ellenanyag nehéz Sáncához (1.) Hnmanízátt TRA-8 nehéz láucának variábiiis régióját kódoló DNS-í tartalmazó pkszmíd etöáltRása Hamanizáh TRÁ-8 aktivitásának meghatározása eéljáhók humanizált TRA-8 nehéz láncát tartalmazó píazmidot .az alábbiak szerint ailitottak elő. Azonban..nyilvánvaló, hogy TRA-8 humanizálása nem kor’a-ozódik ezekre a példákra.
A szekvenciaiistában, a 31, azonosítószámú szekvencia szerint, TRA-8-jeiű, egereredeiü aoti-hutnán-DR5 éUeuányag nehéz láncának megfelelő amisosav-szekveoeia humanizálása céljából a 13, aminosavat (lizht), a 19. aminosavat (lizín), a. 40, aminosavat (treonln), a 42. aminosavat (gloíamissav), a 44. mmoosavat (argtnin), a 84. atnixtosavat {szerin}, a 88. aminosavat íszerin), a 93, aminosavat (metioninj, a 114. aminosavat (treonln), a 115.
aminosavat (ieocin) kicseréljük glutammra, argininre, afaninra, ghcinre, gbcmre, aszparaginra, alsómra, útónra, ieuci nra és vallóra, sorrendben.
Humanizált TRA-8 nehéz láncának variáhtiis régióját (a szekveneíalistában a 31. azonosítószámú szekvencia) kódoló ÖNS-t tartalmazó: piazmídoi az alábbiak szerint állítottunk elő,
PCR-t alkalmaztunk az alábbi DNS-szekvenciák előállítására, amelyek mindegyike tartalmazta a fentebb leírtakat:
Az alábbi 12 oiígöítufeíéoódot szintetizáltuk:
5’- ttggataage ttggctígac eteaccatgg gatggagdg latestedé íidtggtag eaaeagetae aggtgteeac -3’ (A; 32. azonosítószámú szekvencia);
5’- feígaagtaaigeiggtgga gfdggggga ggettagtae agcetggagg gteodgaga etetectgtg cagcctctgg -3' (R; 33, 20 azonosítószámú szekvencia);
5- dfeaedfe agisgftafg taaígtctíg ggfteggeag geaeoaggga agggtdgga gtgggtígca acealtagta -3’ (C; 34, azonosítószámúszokveoeia);
5’- gtggtggtsg ttaeacetac íateeagaca gtgtgaaggg cegatteace atetceagag acaatgeeaa gaaeaeeetg -3’ (D; 35, azonosítószámú szekvencia);
5’:- íaíeígcaaa igaaeagtet gagagcagag gacacegetg ttíatíaetg igeaagaagg ggtgactda ígattacgae -3 ’ (E; 36, azonosítószámú szekvencia);
5'- ggaetaetgg ggeeaaggga ccdggteae agtctcétoa gcetc eaee aagggoceat eggte -3’ (F; 37. ítzönösltószámá szekvencia);
5’- daeeaagaa gaggaígata cagetccaío ccatggígag gtcaagecaa geúatccaa -3’ (G; 38. azonosítószámú szekvencia);: 30 5'- íetcagggae ectccaggct gtadaagcc teece.eagae íccaeeagca íiadícaga. gtggacacct: gtagetgttg -3’ 04; 39.
azonosítószámú szekvencia);
5’- tccagacccl tccctggtgc ctgcegaaec esagac&tis eaíaaetaet gaaagtgaat ccagaggdg cacaggagag -3 ’ (l; 48. azonosítószámú szekvencia);
5’- etetggagat ggtgaatcgg ecctícaeac tgtctggata gíaggígtaa daceaceae taetaatggt ígcsaceeae -3’ ()'; 41.
azonosítószámú szekvenciát;
5’- cetícttgea eagtaataaa ettgccgtgte etcígotcie agacígttca tttgcagata eagggtgtte ttggcattgí -3 ’ (K; 42. azonosítószámú szekvencia); und
5’- gaeegatggg ecettggtgg aggetgagga gaetgtgacc agggteedt ggoeccagía gíeegtcgta ateatagagt caec -3’ (L; 43.
ázonostiószamó. szekvencia).
Az alábbi 2 PCR íáneindho oiígonukleotidot szmtetizáhnk a fentebb leírtak szerint
5’- ítggataagc ítggdtgac -3’ (Rt; 44. azonosítószámú szekvencia); és
-555’- gaccgafggg eectíggigg a -Γ (P2; 45. azonosítószámú szekvencia).
Szekréciós szígnálszekvenciát, huraanizák TRA-8 nehéz láncának variábilis régióját és az tgö-CHl-régió Nterminálísának 8 sminosavát tartalmazó ptdipepdd-iáncoí kódoló DNS szintézisét FCR-ek megfeieió konfeínáciőjával végeztük.
A DNS~fra.gmenst az alábbiak szerint állítottuk elő.
A PCR-reakcsóoldat összetétele:
A-oiigomíkleotld, lö pmul;
B-oligonukleotid, 1b porol;
C-oiigonuk lentid, 10 porol;
D-oligonuk lentid, 1(.) ptnol;
Eroljgoaukleotld, H) ptnol,
F'-oligonuklcotid, 10 porol;
G-oligon.ukfeotid, lö porol;
B-otigi>r;uk.U-.otid, SÖ porol;
1-oligonuk lentid, lö porol:
.l-ongoaukleotíd, lö porol;
R-oiígonokleottd, 10 pstol;
L -oligonuk lentid, 10 porol;
Pl-jelu lásteindlíó oligoaukleoíid, 2 pM;
P2~jelö láneinditc ollgonukleoiid, 2 pM;
X pyrnbesí-puffer Π., 10 pl; dNTP-keverék, 8 pl;
Pyrobesí DNS-pnürneráz. 8,5 pl; és végtéribgalilt 5Ő pi-re áOitoiiuk kétszer desztillált vízzel.
A PCR-reakcióí az alábbiak, szerint végeztük. Az oldatot először fetóelegítettük 94°C-ra 5 percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük: §8°C 10 másodpercig, 55SÜ 3Ö másodpercig és ?2ÜC 1 percig, 7-szsr ismételjük. Az eljárás után a reafe iooidatoí TXX'-on melegítettük 15 percig.
Azonos térfogató fenol-kieroformot (5b tf% fenol vízzel telítve, 48 tí% kloroforor, 2 tf% izoamíl-alkohoi) box2áadtunk egyes, 208 pl térfogatú PGR-termékekbez, és erőteljesen keverteüük I percig. Ezután a keveréket
3(1 ieeentri fugáitok tö.OOÖ X g~n, és a vizes fázist kinyertük, összekevertük, azonos térfogaid kiorotbrm-izüamil-alkeboi keverékkel <96 tl% kloroform és 4 tí% ízoamil-aikoböl), amelyet ismét erőteljese» kevertetíünk, ieeemrifugáituk 1Ö.ÖÖ0 X g~n, és a vizes fázist kinyertük, (libben a bekezdésben ismerteiért lépesekből álló eljárást a leírásban a továbbiakban „íéuotos extrakció”-nak nevezzük.)
Azután etanolos kicsapást végeztünk a kinyert vizes fázisban, Az. eljárást a leírásiján a továbbiakban „etanolos kiesapiis,’-:nsk nevezzük, amelyben a kezelendő oldathoz bózzáaduúk l/lörtérfbgaötyi 3 M náírium-aeetátot (pH 5,2) és 2,5 íérfegatnyi 108%-es elánok, és a keveréket lefagyasztjuk szárazjég alkateazásával. Az eredményül kapott keveréke; azután 10,000 X g-n centrifugáljuk, ezzel a DM S-t csapadék tormájában kinyerjük.
Eenolos extrakelö és etanolos kiesapás után az eredményül kapott DNS-csapadékot vákuumban rttegszárlíoítok, minimális mennyiségit kétszer desztillált vízben feloldottak, és 3%~rss poliakriiamid-géleiekíroferézissel elválasztottuk.
A gélt elekíroferézis titán megfestettük 1 pg/nd etidium-bromlddal, hogy lehetővé tegyük a DNS BV-fény alatti
- 56 detektálását. A htmtasrtah 3'RA-8-DN8-aek megfelelő DNS-cslkökst botóivapengévd kivágtuk, és eWlípk a gélből „öenecfean Spin Kif' (RIO löl, CA, USA) alkalmazásával. henolos extrákéi?) után az eluált DNS-t eestrlfegálással (7,500 X g) ítknényketíük, azután etanollal kicsaptok, és végül 5 μΐ desz!illák vízben feloldottuk.
Az eredményül kapott, extrahált DNS-eket az alábbiak szerint klónozlak „pGEM-T Easy” vektor (Promegaj 5 alkalmazásával:
A PCR-reakc tóból kinyeri DNS-irágtnens, 5 μΐ;
X Tag-polimeráz-pufier, 1 pl; dN'i'P-keverék, 1 μΙ;
Taq-polímerá? (5 egység/mt), I pl; és végtérfega-át 50 pi--re állítottuk kétszer desztillált vízzel.
A fentebb leírtak szerint elvégzett műveletek után az egyes oldatokat TÖ^C-on reagáltatok 30 poréig, majd az egyes DNS-ekiátokat és ,,pöEM~T Essy” vektort ligáitok DNS-lígáeiős reagenskészlet („DNA Ugatta Kit, Version 2.0, Takara Sbuzo, C«. Ltd.) alkalmazásával, a gyártó által, adott használati utasítás szerint.
óra hosszáig ínkubáí tok 15°C-on, majd 2 pl mkubáli reakcíöoldsíot összekeveríönk 100 pl koiupetens, E. eori lMlö9-törzzsel 1-2 x !09 scjt/ml sűrűségben (Takara Shuzo Co., Ltd.), és a keveréket jégen tartottak 30 percig, azután 42“C-on 3Ö másodpercig, és Ismét jégen 1 percig, Azután 500 pl SOC~tápközeget (2 tf% tripto, 0,5 vegyes% élesztők!vonat, 0,05 vegyese nátrium-klorid, 2,5 m.M kállam-klorid, 1 mM magnéziutn-klorid és 20 ttúM glükóz) adtunk a keverékhez, amelyet egy további óráig inkubáltnnk rázatva. Azután izoláltuk a transzformáns törzseket, és plazmid-DNS-l preparálttmk: a törzsekből a „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” című könyvben leírtak szerint,
Humanizált TRW nehez láncát kódoló. Igy elót-Jhlnti DNS míkíenjuls/ekvenmajaí dÍdez-w-rnoiK/crrel (Sanges, 1 S és mlsai., Proe. Hall. Aead, Scí. USA 74, 5403-5467 <1977)1 igazoltuk, „3760 DNA Anaiyzer” herertdezés (ΑΒΪ PRISM; Ferktn Elmer Applied Bíosystems, Japan) alkalmazásával.
Az eredményül kapott plattod jelölése pl7314 (hamamzálf TRA-8 nehéz láncát kódoló eDNS-t tartalmazó plazmád). A plazmidt tartalmazó, transzformáns £. co# törzset, amelyek jelölése £ coli JMI09/pH814 2001. április 2025 át? deponáltok az alábbi mlézméttybetr: „Internattaal Patent Organism Depos&ary, National Institute of Advanced Indústóal Science and Technoiogy (1-1, Blgasht 1 cborae Tsttküba-shk Ibarakl-kén, 305-5466, Japan), a mikroorganizmusok deponálását szabályozó, Budapesti Szerződés szerint, és nyilvánSartásí száma FEBM BP-755Ü (2) ííomtazáH TRA-8 nehéz láttattok variábilis régióját kódoló DNS-t tartalmazó expressziós plazmídok toáiiitása
3(1 Állaisejtekben aisatóazliatő, rekomhhiárss expressziós vektort úgy állítottunk elő, hogy- humanizált TRA-S nehéz láncát kódoló DNS-t (klónozás a lentebb leírtak szerint történi) inszeriáitursk az alábbiak szeríru.
Humanizált aníi-Fas, HFE7A-jeíü monoklonális ellenanyag nehéz láncának variábilis régióié? és barnán IgGI konstans régiójátkódoló genom 1 DNS-t taifelntaző, '1 pg pSRHHH3-plazntido; (EP 0-909-816.AL szárítóeurópai szabadalmi bejelentés), amely emlős sejtekben alkalmazható expressziós vektor, HindlllzApaí-jelS restrikciós enzimékkel emésztettünk, és 3%-os agatóz-gélelektroforézissel elválasztottuk, A gélt elektroiorézis utas? megfestettük I pg/ml etiáíto-bromid vizes oldatával, hogy az előállított DNS detektálását DV-feny alatt lehetővé tegyük. A barnái? IgGI konstans régiójának megfelelő genotni DNS-t a humanizált BFE7A nehéz láncának variábilis régiója nélkül tartalmazó vektornak megfelelő DNS-cslkokat borotvapengével kivágtok, és eiuálíuk a gélből „(3et?eclean Spin Kit alkalmazásával. Eenolos extrakefo írtán szektáit DNS-! cemrifogálássa! (7,500 X g) tömény nedűk, azután etanollal kicsaptok, és végül 5 pl desztillált vízben feloldottuk, és azután CíP-eí deföSZÍorilalniL Az eretaényüi kapott,
- 57 deibszferilák pbzmidot (1Ö9 ngj ligátok l pg, humanizált TRA-8 nehéz láncának variábilis régióját kódoló DNS-t tartalmazó, ptíöl4-höi származó BbiS-lragmensseí, melyet szintéi! Hiudllh'Ápal -enzimekkel emésztettünk, a. ligálást DNS-íigácíős reagenskészíét (,,DNA Ligádon Kit, Version 2.6, Takar» Sbuzo, Go. Ltd.) alkalmazásával végeztük, A llgáeiós keverékkel azután £, sori JM1 ()9-tSrzset transzformáltunk, és 50 gg/ml atnpieillínt tartalmazó LB-agar5 táptalajra szélesAetiük.
Az így kapsií trauszTernránsőkat 50 pgünl ampseiltot tartalmazó, 2 mi folyékony LB-tápközeghén tenyésztettük 37eC«on, egy éjszakán át, és aA kővetően a plazmid-DNS4 extraháltnak az eredményül kapott tenyészethői, alkaltknsSDS-módszer alkalmazásával.
Az extrahált plazmid-DNS-t Hindlfh'ApaTenzimekkel emésztettük, és 3 vegyes%-ös agardz10 gélsleklroferézásnek vetettük alá a humanizált TRA-8 nehéz láncának variábilis régióját kódoló DNS jelenlétének vagy hiányának igazolása céljából. A vektorban lévő, kívánt DNS-iragmeas inszereióját és orlenláeiójm DMS-szekvenálással igazoltuk, génszekvenda-analixátor („ÁSl Prisro 3706”' típusú DNS-anallzátor; Applied Biosysfems) alkalmazásával.. Az eredményül kapott, humanizált TRA-8- nehéz láncát kódoló c,ÖNS-í tartalmazó, expresszíős plazmid jelölése pl 11.114-1.
(1) Vektorok előállítása TRÁ-R-eiiesanyag humanizált változatainak könnyű táncaihoz.
A szekveneialistábau, a 46. azonosítószámú szekvenciában bemutatottak szerint, TRÁ-S-jelú, egéreredétü anti20 hnmán-DRó ellenanyag könnyű láncának megfelelő ammosav-szekvencia humanizálása céljából a TRA-8 könnyű iáítcáuak megfelelő amínosav-szekvetscia N-fermmáiisábau a 8, aminosávat (hisztűhn), 9. aminesávat (llzín), 19, amistosavat (fetrilaiaítin), 1I, aminosavat (metiontn), 13, atomosával (treomu), 20. ámiaosávat (szerit!), 42. aminosavat (glutamin), 43. aminosavat (szerin), 60. aminosavat (aszparaginsav), 63. aminosavat (treonin), 77. aminosavat (sszparagtö), 78, aminosavat (vakuk §Ö. aminösavat (szerín), 83. aminosavat (fenéin), 85. aminosavat (aszparaginsav),
87. aminosavat (ienríalanit!),. és 99. aminosavat (gíicin), 193. aminosavat (ieúclu), és 1.68.. aminosavat (atatun) kicseréljük prolimra, szerűire, szerűire, ieucűira,, aianűira, treoomra, lizinre, alanlnra, szerinte, szerinte, szerbire, leuclnra, prolimra, fenifelaninra, treoninr;·:, tírozmra, glutöminra, valinra és ireemnra, sórréudhen. Az eredményül kapott szekvencia jelölése LMX
TRA-8 jelű, aníi-huiuáu-ÖR5 ellenanyag ilyen típusú humanizált könnyű láncának megfelelő aminosav30 szekvenciát tartalmazó expressziős plazmldokat az alábbiak szerint állítottunk élőt
1) Láneüiíh'tó oligonukSeoíldOk szintézise humanizált TRÁ-8 könnyű láncában lévő, variábilis és konstans régiók előállítására.
Az LMS-poiipeptid-láncot (46, azonosítószámú szekvencia a szekvenciahstában) kódoló DNS-t, amely humanizált, TRÁ-8-jelü, antl-DK5~eilenanyag könnyű láncának variábilis régiójából és a humán lg könnyű lánc (k35 lánc.! konstans régiójából álló iuziós fehérjét kódol, PCR-ek megfelelő kombinációjával szintetizáltuk.
7ALÍP-n (47. azonosítószámú szekvencia) és 7ALCN-rt (48. azonosítószámú szekvencia) kívül az alábbi lánclnditő oligonokieotidokat szintetizáltuk PCR-hez:
5- gtcececaea gatgcagaca aagaaettgg agattgggtc atcacaatgí eaeeagtgga -3’ (HKSRR I1; 49. azonosítószámú szekvencia):
4Ö 5'- eeaagÉtctt ígfcígeaíe: agt&ggagae agggteaeea teaeeígc -3’ (HKCD.F 11; 50, azonosítószámú szekvencia):
- 58 5 agtgf gccgg .gtggatgcec agíaaatcag tagtttagga gcftectg gittéig -3 ’ (H KCDR1 2; 5 í. azonosítószámú szék véne iá);
5’- tgggeaieca cceggcaéac tggggtccéa ageaggttta gtggcagt -3 ’ (HKCDF22; 52, azonosítószámú szekvencia); 5’- ataactacta íattgctgac agtaaiaggi tgeaaaatcc tccggctgca gactagagat ggt -3’ ÍHKCDR22; 53, azonos stószátnó
5: szekvencia); és ’- eageaatata geagetateg gaegtteggt caaggcaeea uggtggaaat eaaacggact gtg -3’ (HKCF12; 54. wnösitószámú szekvencia).
2) pCR3«I/M2~l-pk8ztnííf clőálRiása (humaászált TRÁ-8 könnyű láncának klónozása)
LMd-DNS-iragmensí, amelyet a szekveneialistában az 55. azonosítószámú szekvenciaként definiálunk, és amely a 4ő, azonosítószámú amlnosav-szekvenelát kódolja, úgy állítottunk elő, hogy 2 iépéses ECR ~t végeztünk, egy plaznúdvektorba mszertáhuk és coó'ba klónoztuk.
a) Első lépés ECR
LM2-Fl-DNS-fragtnenst, amely szekréciós szignálszekveneiát és az. FELj-réglő egy részletét kódolja, S’-végén fibtdHl-jclő restrikciós feasítéhely van hozzáadva,, az alábbi kőrübnényék között állítottunk elő. A ρ,ΗδθΉΜΠ- és pSREDÍ is s-jeíti templát-plazmidökhoz az BE Ö 909 816 Al. számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak alapján
A rcakciéoldat összetétele;
pHSGHMl 7-iélü plazmid-DNS (BF ö 909 8 ió Al, számú európai szabadalmi bejelentés), 25 ng 7Ál. I E-jeíű láncindító olígonukisetid, 5Θ porol
HXSER11-jeli! táncmdííó oligonukieotid, 50 pmoi áNIP-keí tartalmazó koktél, 5 pl 1 ÖxPCR-puffer, 5 pl arnpliTaq DNS-pohmeráz (Eerk in kimer), 2,5 egység
Á fenti összetételű reakcióoldat végtérlögatát 50 μί-re állítottuk kétszer desztillált vízzel, és FCR-ben alkalmaztuk,
ECR hőmérsékleti ciklusok körölméoyei: Irevhés 94°C 2 percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük: 94% I percig, 55%.' 1 percig és 72% 2 percig, 5ö-s»w ismételjük, majd hevítés 72% 10 percig,
LM2-E2-DNS-fragmvnst. amely FRL; egy részletét, CDRLj-eí, FRL2~i és CDRU-t kódol, az. alábbi körülmények között alh tollúnk elő,
A reakc ióoldat összetétele:
pL28-:eiű piazmid-DNS, 25 ng HKCDFi i -jelé lánc indító oligonukieotid, 50 pmoi HKCDR12~jelS láncindító oligonukieotid, 50 pmoi dNTE-ket tartalmazó koktél, 5 pl
1 öxECR-pufíer, 5 pl ttmplfi'aq DbíS-pohmeráz, 2,5 egység
A fenti ősszeiéfehi réakeióoldat végtérlogátát 5ö pl-rc állítottuk kétszer desztillált vízzel, és ECR-hen alkalmaztak.
EGR hőmérsékleti ciklusok körülményei; hevítés §4°C 2 percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat végeztük: WC 1 percig, 55°C 1 percig és 72% 2 percig, 30~szor ismételjük, majd hevítés 72%) 3:-0- percig.
-59LM2-P3-Í>NS4ragJneast, atnely CÖRL2-I, FRLs-at és CDR'hs egy íésatóét kódolja, sz alábbi körülmények között állitottük ele.
A reakcióoldat összetétele:
pSRPDHH-jeiü plaznrid*DNS(FPö 909 810 AL szarná európai szabadalmi bejelentés), 25 ng 5 HKCDF22-jelá láncmdRő oíigomtkleoíid, 50 ptnol
BKCD.R22-jelü láueindtló oHgonukleotid, 5b púm; dNTP-ket tartalmazó fekték 5- pl löxPCR»psfíbr, 5 ni ampHTaq DMS-pollmeráz, 2,5 egység
A fenti összetételt reskeióoid&t végtértogatát SQ pl-re állítottuk kétszer desztillált vízzel, és PCR-ben alkalmaztuk,
PCR hőmérsékleti ciklusok körülményei: hevítés 94°C 2 peréig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük: 94°C I percig, 55®C 1 percig és 72°C 2 percig, 30-szor ismételjük, majd hevítés 72°C ÍO percig.
LM2-F4-DNS-fragrnettst, amely CDRL;,-at, FRL4-et és a konstans régiót kódolja, 3’-végén EcoRI-jelö 15 restrikciós hasitőhelv van hozzáadva, az alábbi körülmények közéit állítottunk elő.
A reaketóoídat összetétele: pSRPDHH-jelü plazmid-DNS, 25 ng HKCFI2-jeiű láncindiló olígosakleotid, 50 pmol TALCN’jeíő láncindító oligonukleotid, 50 pmol dNTP-ket tartalmazó koktél, 5 pl
IbxPCR-pufTer, 5 pl amplffaq DNS-poíimeráz, 2,5 egység
A fenti összetételű reákeiőoídat végtértogatát 50 pl-re állítottuk kétszer desztillált vízzel, és PCR-beu alkaltnazíak,
PCR hőmérsékleti eikittsok körülményei: hevítés 94 C 2 percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük: 94?C 3 percig, 55’C 1 percig és 72°C 2 percig, 3b-szor ismételjük, majd hevítés 72C 10 percig.
Az arnpiifskáít DNS-lfagmensefef PCR után elválasztottuk 5%-os poliakrílamíd-gélelekörsforézisseh A gélt elekttoforézts után megfestettük 1 ug/nsí etídimn-hrorniddal, hegy az elöálliíott DNS-t IJV-fény alatt detektáljuk. Az Így detektált, tnegfeielö DNS-csífcokai pengével kivágtuk, bj Második lépés PCR
Az LM2-DNS-L amelyben lentebb leírt, í.M2-PM)NS-, LM2-F2-BNS-, LM2-P3-DNS- és LM2-F4-ÖNSfragmejisekeí fuzionáljuk, az: alábbi körühnények között állítjuk elő.
A. reakcióokiaí összetétele:
az első lépés PCR-ben előállított, LM2-Pl-DNS-géllragnie«s, az első lépés PCR-ben előállított, .bM2-F2-DNS-gélíragtnens, az első lépés PCR-beo előállított, LM2-F3-DNS-gé3fragmeas, az első lépés PCR-ben előállított, L.M2-F4-DNS-gélfragmens,
7A 1,1 P-jeiü lánc indító obgotntkieotid, 50 ptnol
7ALCN-j.e3ö lánciodltó oligotmkleofid, 50 pmol 40 dNTP-ket tartalmazó koktél, 5,0 pl
-601 OxPCR-pufFer, 5,0 μΐ ampiiTaq DNS-polimeráz, 2,5 egység,
A fenti összetételű reakcióoldaf végtérfogatát: 5(1 μΐ-re állítottuk kétszer desztillált vízzel, és PüR-hen alkalmaztok.
PCP. hómérsékiefs ciklusok körülményei: hevítés foCC 2 percig, azután az, alábbi hőmérséklet! eiktesokat végezzük: 94ÖC 1 percig, $5ÖC 1 percig és ?2°C 2 percig, 30-szor ismételjük, majd hevítés 72CC 10 percig.
Az Igv előállított LM2-DNS-hAgmenst pCR3.1-DblA-plazrnidba mszertáithk „Bukatyotíc TA klónozó reagenskészlet. (Invitrogent alkalmazásával, a gyártó használati utasítását követve, és hevítsük kompetens £. cob TÖPIOF' sejtekbe, amelyet a reagenskészlef tartalmazott. Humanizált TRÁ-ü könnyű láncát kódoló DNS-ek nukleofidszekveíteiáját didezoxi-ntódszerrel {Stmger, F. S. és mtsai., Prpc. Natl. Aead. bei. USA 74, 5463-5467 (197?)] Igazoltok, „37(10 DNA Analyzer” berendezés (Aöl FR1SM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan) alkalmazásával.
Az eredményül kapott piazmidok jelölése pCR3.1/M2-1 (humanizált TRA-8 könnyű láncának variábilis régióját és egy humán lg könnyű láncának kpaslaos régióját kódoló cDNS-t tartalmazó plazmíd).
Az így előállított, I..M2-DNSTragfnenst tartalmazó pCR3.1/M2-1 -píaztnidot Hindi B/bcoRl-jelű restrikciós 15 enzimekkel emésztettük.
pg, pHSG399DNA-|elö klónozó plazmidot Híndin/EeoRl-jelu restrikciós etótnekkel emésztettünk, és azután CIP-el defoszforiíálmk, Az eredményül 'kapott, defoszforiiált pHSG399-E)NA-t és LM2-E>N$-ítogrneost, stnelyekeí előzőleg Hindii l/EcoRí-jW restrikciós enzimekkel emésztettünk, ligáitok DNS-ligációs reugenskészleí („DNA Ligádon Kit, Version 2.Ö, Takara Shazo, Co. Ltd.) alkalmazásával. Azután R. eo/í 13H5a-törzsel transzformáltunk a ligáit DNS-el, és 0,1 m.M IP'i'G-t, 0,1% X-Gal-i és 50 pg/ml kloramfenikolt (végkoncentrációk) tartalmazó LB-ugartáptalajra széíesztettük. Az így kapott, fehér tranxz&rmánsokat 50 p.g?/nd klőramfentkoit tartalmazó, folyékony í>tápközegben tenyésztettünk, és ptozmfd-i3NS~i extraháltunk az eredményűi kapott tenyészetből, alkalikas-SDS~mődszer alkalmazásával Az extrahált piazmid-ONS-í HindBi/EcoRl-enzimekkei emésztettük, és azután az LM2-BNSfoagmenst tartalmazó kiónt 1% agaróz-géieiektroforézissel választottak ki.
A lenti eljárás eredményeként előáliitoitnk a humanizált LM2, TRA-S könnyű láncának variábilis régiójából és humán igx-láne konstans régiójából álló, fúziós ftogíoenst tartalmazó pHS<b'M2-i-4-plszmídot. A plazmidot fadalsrtaző, transzförmáns £. iwti·. törzset, amelynek jelölése R .ceti DH5a/pHSG/M2-l-4, 2001. április 2Ö-án deponáltuk az alábbi intézményben: „Intethafionál Patent Organism Depository, National tostitute of Advanced fednstrial Science unó Technology” (1-1, ffigashi 1 ehome Tsukuba-shi, lbarakj~ken. 305-5466, .topán), a mikroorganízmasok deponálását szabályozó, Budapesti Szerződés szerint, es ny llvátdartóst szánni FERM ÖP-7563,
3) pSB/M2-t-piazmid előállítása (expresszié® plsszmid h«ma»feóit LM2, TR A-8 könnyű lánchoz)
A fentebb leírtak szerint előállított, humanizált LM2, TRÁ-& könnyű láncának variábilis régiójából és barnán
IgK-láne konstans régiójából álló, fúziós fragmenst tartalmazó pH$ílA42-s-4-plazrmdoí Hrndllí/LeoRLfeio restrikciós enzimekkel etnészteitük.
Egy pg pSRPDlíH-DNA-jélö klónozó plazmidot <EP Ö-9Ö9-816.AL számú európai szabadalmi bejelentés)
Hindill/EcoRÍ-jelü restrikciós enzimekkel emésztettünk, és azután CiP-ei deíoszforilákuk. Az eredményül kapott, öeíbszforilált pSRPDHH-DNA-t és pHSG/M2-l-4 Hindi Ib'EcoRi-enzímes emésztésével előállított löNS-iragmenst ligáitok DNS-ligácsős reagenskészlet („DMA Ligádon Kit. Version 2,0, Takara Sltuzo, Co. Ltd.) alkalmazásával. Azután & eoA Í3H5ct-íőrzset temsztórmáltunk a ligáit DNS-el, és Lö-agar-íáptalajra szélesztettük. Az így kapott üanszformánsökat 1ÖÖ pg/ml ampieiliint tartalmazó, folyékony tB-tágközegben tenyésztenünk, és piaztfod-foNS-t
-61 extraháltunk az eredményül kapott tenyészetből, aikalikus-SÖS-mődszer tdhahnazásával. A pSRPÖRH-vektotban lévő, kívánt DNS-fragmens tnszérciőját és orientációját DNS-szekvenálássai igazoltok, génszekvenc ia-analizátor (,,ΑΒΙ Prísm 3700*' típusú DNS-analizátor; Applied tSiosystems) alkalmazásával.
Az eredményül kapott, humanizált TRA-8 könnyű láncát kódoló cDNS-t tartalmazó, expressziós plazmid 5 jelölése pSR/MR-1.
26. f éfeóí
CÖS-'i-s.tfUek, azaz majom-veséből származó sejtvonal transzfékelőjáí a fentebb leírtak szerbi előállított, 10 humanizált TR A-8 nehéz láncának és humanizált TRA-8 könnyű láncának megfelelő expressziós^ plazmátokkal FUGENE6 transzfekciós reagenst alkalmazó módszerekkel (Beehrlüger Mannhetru) végeztSks a resgeuskészfeíbez mellékek használati utasítás szerint.
COS-7-sekekei („American fype Cidíure Coliectlon” No. CR.L-1651} sxemikonííuendáig (3 x HÉ sejtrédény) növesztettünk egy tenyésztő edényben (a tenyészet területe: 57 cnf; Suntitotno Bakelité), amely 1Ö% magzati borjúszérummal (a továbbiakban „FCST-nek jelöljük; Moregate) kiegészített, Dulbecco-féle módosított Bagletápközeget tartalmazott (ezt a továbbiakban „D-MED''-nek jelöljük; Gibeo 8RL)
Közben összekevertünk 10 pg/tenyészö edény (összesen 5 edényben) humanizált DR5 nehéz láncnak megfelelő expressziós plazmid-DNS-t (pOAlS-t) és 10 pgAenyesző edény humanizált DR5 könnyű láncnak megfelelő expresszié» piazntid-DNS-h melyet alkaiikus SÖS-mődszemel és eezium-klorid sőrüséggradlens cenirífesgálással preparáltunk, és azután etanollal kicsaptuk, majd fdszüszpendáiiuk 5 ph'edény dH2O-ben.
.Miután 15 pl/edény R.1GBNE6 transzlekciós reagenst összekevertünk i 80 «Ι/edény KCS-t aesn Ísíráthtraxá DMEM-ei, ezt a FUGENE-oldatet (185 ph'edény) összekevertük 5 uhedény DNS-oldattal, amely íö pkedétty humanizált DR5 nehéz láncnak megfelelő expreszszlós piazmiö~i3htS-t és 10 plfedény humanizált DR5 könnyű láncnak megfelelő expressziős plazmid-i>NS-i tartalmazott. 15 percig inkubáituk sznbahőmérsékeleten, majd az így kopott plazmid25 sznszpenziót (200 pl) hozzáadtuk az előzőleg előkészített COS-7-táieákhoz. 5% szén-díextdot taríalswő atmoszférában, 3 7cC-on inkubáituk 24 őrá hosszáig, majd a tenyésztési tápkőzeget kicseréltük ECR-t nem tartalmazó: DMEM-el. 5% szémdiöxídöí tsríahnaző almoszferában, 3?0€-οη inkubáituk 72 óra hosszáig, tnajd a tenyészet feiülíiszóját elköiöm'teítük a felülásző-fölyadékban lévő expressziós termékek tisztítása céljából. A fentebb leírt eljárással COS-7-sejrekeí transzfekíálínnk az alábbi, egyes plaznud-kombináelőikkai:
(A): plazmid-DNS nélkül (8): köiranszfekctó pHBl í-l-ei és pSR'MS-l-el
A tenyészetet azután leeenlri fugái tok (1000 r.p.m., 5 percig), és a fdülüszót elkülönítettük. A íelüíuszót újra centriíúgáituk (9800 r.p.tn,, 15 percig) és leszűrtük 0,45 pm-es szőrűn (ADVANTEC TOYO DISMiC-25cs, kat.sz. 25CS045 AS). A szőrietekből az IgG-t „Protein ö-PGROS” (Applied Biosysförats) aftmítás-kromaíográtiával tisztítottuk az alábbi honumenyek között:
HPLC-rendszm BtoCAD 700b (Applied Biosytéms) oszlop: ProíemG-„lD sensor cartridge” (oszlop mérete: 2,1 mm belső átmérő x 30 mm bosszúság, agytérfogat: 0,1 ml; kat.sz. 2-1Ö02-ÖÖ. Applied Biosysterns) elúcíős pnffer: 0,1 M gl le in-1-IC 1 (pH 2,5) · 62 - semlegesítő puifer: ) M I'ris-HCÍ (pH 8,5) detektálás: 28Ö ura áramlást sebesség: 1 nikpere frakció méret: 8,5 ml/8,5 pere frakciőszedő cső: 1,5 ml polipropilén nttkrokémeső hőmérséklet 4‘C
ΙΟ
Miután minden szüríeteí felvittünk az oszlopra, 30 ml PRS-ei (Sígma, kat.sz. iÖÖO-3) mostuk az oszlopot. Amikor rávidük az eiúciós puffért, beindítottuk a frakciószedót. A frakciók szedésére szolgáló, egyes mdcrokémcsővekbe előzőleg 55 pl, 1 M NaCi-t, 118 pl semlegesítő pníl'ert és 74 pl, PBS-ben oldott, 2 mg.'ml mathsszérnm-aíbummt (Sigma, katsz. A-7838) adagoltunk. A 8-18. frakciókat szedtük, és 1 liter FSS-el (pH 7,5) szembén dialízáltük 4’5C-on, 1 napig, „Slide-A iyzer' (Plerce, Látsz. 664 50) alkalmazásával, A dialízis-puffért kétszer cseréltük.
A humanizált ellenanyagok expresszlójának igazolására és az expressziós termékek kvantitatív vizsgálatára BldBA-eljárást végeztünk a tenyészetek felüiüsző-folyadékában anti-humán ígG-rs specifikus ellenanyag alkalmazásával.
mérőhelyet tartalmazó tálca (MaxiSorp, Nőne) egyes helyeire adagoltunk löfl pl, kecskében termeltetett, antihumán igö-Fc-re specifikus, poiikionális ellenanyagot íKappel), amely 0,5 pg/ml végkoncenrtáclóban, adszorpciós pufterben (8,85 M nátrinm-hidrogés-karbonát, 8,82% nátrium-azid, pH 9,6} volt feloldva, és a tálcát 37°C-on inknbáituk 2 óra hosszáig, az ellenanyag kötődése céljából. Azután a tálcát 350 pl, 8,05% lween~28~at (BioRad) tartalmazd PBS-eí mostuk (a továbbiakban „RBS-T’-nek jelöljük} ötször. Mosás után a tálcákhoz hozzáadtuk a tenyészet lelülúszoját, 18% FCS-t tartalmazó ö-MBM-ben hígítva, es 37°C-oa íxikubáitók 2 óra hosszáig. Újra mostok PBS-'f-vei, majd az egyes mérőhelyekre adtunk 188 pl, alkalikus íeszlátázzal jelölt, kecskében termeltetett, antihumán-lgG Fe-specifikns, poiikionális ellenanyagot (iaekson Immuno Research Láb.), amelyet 18.8Ö8-szeresére bígítotitmk RBS-T-vel, és 37”C-o« inkubálmk 2 óra hosszáig. Újra mostuk PBS-T-vel, majd hozzáadtunk p-nifiofenil25 foszfát szubszizát-oidaioi, amely az „alkalikus fbsxfáiáz szobsztrát-reagenskésziefi’ t Bio Rád) része, a reagenskészfethex mellékelt használati útmutató szeriüt. 3?°C~on mkabáituk 8,5-1 óra hosszáig, azután megmértük az ahszorbaneiát 405 nm-en. Ezekben a kísérletekben 18% FGB-t tartalmazó D-MEM-ben bizonyos koncentrációkra hígított, hamás plazmából származó, immuftglobniln-G i, alosztályt (IgG 1} (Biopure AG) alkalmaztunk referencia-standard mintaként a tenyészetek felől úszó-folyadékaiban lévő, humanizált DRS-ei fenarg ugok koncentrációjAaák méréséhez.
3Ö Ennek eredményeként, a tenyészet felülúszójában express/amdó és tisztított termékeket detektáltunk specifikusan anti-hamán-IgG ellenanyaggal. A humán ígG-elienanyag 8,9b pg (888 pl) volt
Humauizátt elhmsmvag apoptózisí Indukáló aktivitása
Jurkat-sejteket (ATCC No. ΤΪΒ-152} alkalmaztunk: a tisztítód, humanizált TRA-k-eitemmyag apopldzisf.
indukáló ütövilásának vizsgálatára.
jurkat-sejteket 18% FCS-t tartalmazó RR.MÜ ő4Ü-iapközeghen (Gibco BRl.) tenyésztettünk 37aC-on, 3 napig, 5% szén-dioxid jelenlétében, melyeket 96 fenyésztőhelyel tartalmazó mikrotifer-táica (Sumifoxso Bakelité) egyes helyeire 58 pi/íenyésztőheiy sűrűségben adagoltunk, Á 20. példában leírtak szerint előállított, tamamzált TRA-8 koncentrációját úgy állfiottok he 18% FCS-t tartalmazó RRMÍ648-íápközeggel, hogy a kérdéses végtermék
-63koncentrációja 100 ng/ml legyen, a 20. példában leírt módszer szerint, a folyadékban lévő, becsölt koncentrációk alapján. Az egyes expresszíós termékek 10Ö ng/ml-re így beállított oldataiból felező sorozathigitástféat készítettünk 10% FÜS-t tartalmazó RPM1164ö-iápközegbett, .Az egyes hígítod, humanizált TRA-iböldatokból 5Ö-SÖ pl adtunk az egyes tenyésztőbelyekre. 37<;C-on, 12 óra hosszáig reagáítattuk, majd hozzáadtunk 50 pl, I mg/mt XTT-t {2,3-hisz-(25 metoxi-4-nltro-'5-sz.td fofénslj--2tl-4ptrazölium-5-kari>oxÍ8.nfrid belső só; Sigöta Chemical Co.) tartalmazó 25 p.M PMS-t yónazm-metoszulláf, Slgma Chemical Co.) (végkoneenlráeiák 25Θ pg/ml XTGre és 5 pM PMS-re). '3 óra hosszáig inkubáltuk, 450 ntn-en megmértük az abszorbanelát az egyes tenyésrtőbelyeken a sejtek életképességének kiszámítására, indexként mitokondriumok redukáló képességét használtuk fel.
A sejtek életképességét az egyes fenyészíöheíyeken az alábbi képlet szerint számítottuk ki;
Életképesség {%)::: I öö x (a-b).·· (e-h) ahol „a” jelentése egy tesztrtenyészíőheíyen mért érték, ..b” jelentése sejtek nélküli tenyészíőhelyen mért érték és „c” jelentése egy tenyésziőhelyen mért érték ellenanyag hozzáadása nélkül.
Címek eredményeként a 20, példában leírtak szerint előáliitolt expresszíós termékről (humanizált TRA-S-ról) kúnntatíuk, hogy apoptózist indukált humán DRö-antigént expresszáíö, T-lirofbma-sejtvooal seiijeilfeit.
22, pé/db
TRA-8 különböző DR5-tnoíekeíákkal szembeni reaktivitásának meghatározása céljából, TRA-8 reaktivitását az alábbiak szerint vizsgáltak aktiválódott Sirnlbeíták alkalmazásával.
Elsőként, perifériás vérmintákat vettünk: egy emberből (30 ml), közönséges selyemmajorohóí (3 ml) és eiuomöígus majomból (20 mi). A vértnintákboz I ml: keparint. (Novobeparin; Növő) adtunk, és azníán a mintákat lassan rárétegeztük azonos tériogatú Ficolí-Paque FL'ÜS oldatra (Amersham Phartuacía Biotech.; fejsoíya 1,877 minden esetben, kivéve einomolgns majmokból származó minták esetén, áltól 1,0723, és 1.700 r.p.m,-en eenírifegáltuk: 3-0 percig perifériás vérből származó, mononnkleans sejtek izolálása céljából, Ezt a mononukleáris sejt-frakciót kétszer mostok Ifenks-féie egyensúlyi sóoidaltal, és azután félszuszpendálmk IÖ% TCS-t tartalmazó RPMI-Í Ődö-íápközeghen I x IS* sejl/otí sőrtrséghen, Az eredményül kapott sznszpeiizíóhoz hozzáadtunk ftlobemaggluiinin-E-t (PHA-P, Sígma Chentféals, Co.) 5 pg/ml végkoncetdráeióban, és a mintás 3?°Cor Inkubáltuk \zcn-dtnxidoi iartalfnazó atmoszférában, 24 óra hosszáig. Ezután a sejteket centrífugálassal elkülönítettük, mostuk és félszuszpendáltuk 10 tí% PCS-t tartalmazó RPMÍ-lé40-tápközegben. Azután az aktivált, kinyert sejteket tartalmazó szuszpenzlóhoz interfeukin-2-t (Arnershaní Pharmacia Bsoíecb) adagoltunk 10 egység/ml végkoncetitrae'óbau, es ezt 3?':'€-pn ínfatbáituk S% széndioxidot tartalmazó atmoszfeiahan, 72 óra hosszáig.
Az aktíváit preparátumból 1 χ lö* aktivált hmíbeíta-sejtet egy kémcsőbe adagoltunk, és féfczuszpenckálítsk 50 pl, 0,5, f, 5, 19 pg/ml TRA-8-aí, amely PöS-ben volt féloldva, vagy csak PBS-el, Az eredményül kapott szuszpénziól hagytuk jégen állni 1 óra hosszáig, azután a sejteket 3-szór mostak 500 pl-es PBS-alikvotokkal, és azután félszuszpendáltuk PBS-ben oldott, 50 pl, 29 gg/ml RTC-jelölt and-egér-ígG ellenanyag-oldattal (öloresource). Kontrollként csak 500 pl PBS-ben felsztíszpendálí sejteket alkalmaztunk, megmértük a fluoreszcencia intenzitásait áramlási citométer (FACSCalibur; Beeton Dícktnson) alkalmazásával.
A sejtszám fluoreszceacla-latenzííls szerinti eloszlásához jutotturik, és kiszámítottak a festődön sejtek számának arányát az összes sejthez viszonyítva. Továbbá kiszámítottuk az egyes Kd-értékekef a TRA-k-koneeníráció alkalmazásával, és a festődött sejtek számának arányát az összes sejthez viszonyítva. Humán, seiyemmajoínhől
.. 84 származó és einmnoigas majmokhéd származó aktivált liinfoeiták reaktivitása majdnem azonos. Bnnsfc megfelelőét?, TRA-S sokféle főendős eredetű OR5-öt képes kötni, beleértve az etthrert DRS-öt, amely ellet? eredetileg preparáltuk.
T'RA-8 előzetes toxieltósl vizsgálataként növekvő áózisadagölási kísérletet végeztünk 1 Mm és 1 nőstény közönséges selyemmajom alkalmazásával. A kísérlet három sorozatból állt, amelyekben egy-egy intravénás dózist adtunk be, a sorozatokat 7 napos elvonás? időszak választotta el. A TRA-8 dózis-sorozat 50. 250 és 1250 pg/test vólt. 48 órával az egyes kezelések után véri vettünk a femoráiís (comb) vénából, és plazmát preparáltunk. Megmértük a plazmában lévő aszpartát at??i?mtrai?szferáz- és alatti?? aminotraftszferaz-ahJivt’asokat analizátor (FUJI DRl-ChiEM: Fuji Fiit?? Medicai €«., Ltd.) alkalmazásával. Valaptennyi vérvételt anesztézia nélkül végeztük. Ennek eredményeként nem találtunk májkárosodásra utaló jeleket a plazma biokémiai vizsgálatával az egyes kezelések utóit.
Annak meghatározása céljából, hogy TRA-8 terápiásat? hatékony-e rákellenes terápiában, TRA-8 ő; v/Ro sejtpusztitó aktivitását vizsgáltok különböző rák-sejtvonatak alkalmazásával az alábbiak szerint.
Különböző ráksejteket (2-8 x lő3 sejt/SÖ pl) tenyésztetdlnk RPMIlődÖ-tápközegben (Turkat-sejtek esetén), DMEM-íápkőzeghen (HCT-1 ló-sejtek esetést), MEM-R-ben (WiOr-s^íek esetést) vagy DMRM-F 12-ben (CÖL2-íek~ sejtek esetén), amelyeket a öibeo ARI, cégtől szereztünk he, és 10% FCS-vei voltak kiegészítve, & tenyésztést 3?':'C-0u, 5% szén-dtoxid jelenlétében végeztük, a sejteket 96 tenyésztöbelyet íiulalmaző mikrotiter-iálea C&mtitösno Bakelité) egyes helyeire 50 pidessyésztőhely sűrűségbe?? adagoltunk, A TRA-8 kói?ee??tráci6jáí: ügy állítottuk be 16% FCS-t tartalmazó tápkőzeggei, hogy a kérdéses végtermék koncentrációja 100 ng/ml legyen. A TRA-8-oldatból (100 ng/ml) felező soí-ozathígításokat készítettünk 16% FCS-t tartalmazó tápkőzegben. Az egyes hígítod, TSA-S-oldatokból 50-50 pl adtunk az, egyes tenyészíőiseiyekre, és 37°C~ön mknbákuk, 37°C-o?t, 72 óra .hosszáig reagáltatok, majd hözzáadtsmk 50 pl, 1 í?rg/nrl XTT-t tartalmazó 25 pM PMS-f {íemszist-n?etosz.?díÓt, Signsa Chensteal Co,) (végkusceutráeiók .250 pg/ml ΧΪΤ-re és 5 pM RMS-re). 3 óm hosszáig inkubáltuk, 450 nsn-ett megmértük az abszorbaneiáí az egyes lenyészlőhelyeken a sejtek életképességértek ksszámttására, i??dexké«t smíokondrimnok redukáló képességét használmk lék
A sejtek életképességét az egyes tenyésztöiieiyeken t?z alábbi képlet szerint számítoltuk ki:
Életképesség (%) - 100 < (a-b).'(e-b) altul „a” jelentése egy teszi-tenyésziöhelyes? mért érték, ,,h” jelentése sejtek nélküli íenyésztöhelyen tűért érték és ,.c” jelentése egy íenyészlöhelyen met? ették ellenanyag hozzáadása nélkül.
Az eredményeket bemuiaíjnk az alábbi 3, táblázatba??.
3.táblázat
Sejtek ÉD5Ö (pg/ml)
Jurkaí O.OOi ··· 0.01
HCT -116 0,004.....O.02
WiDr 0,00? - 0,03
COI.2-.lek 2,28
Különböző rák-ssjtvmsalakban TRA-8 erőteljes apoptozlst indukált m Wo körül menyek között.
Továbbá meghatároztuk TRA-8 iíi vi\'a tumurelleaes hutását olyan csupasz egerekben, amelyekbe WiBr-sujteket ültettünk be, ugyanis TRA-8 oetn keresztreaktív egéreredetn DR5-el.
TRA-8-jelű, anti-humán-DRS ellenanyagot beadtunk humán xenograhökai hordozó, csupasz egereknek, amelyek humán DRS-tnölekulál expresszáhak, Az aíkalmamtt egerek 6 hetes ÖALb/e nude/hude-égömk voltak (nőstények, Cica Japan Inc. cégtől szereztük be), amelyekbe WiDr-jelö, humán vasíagbéirák-sejtvonalakat: ültettünk be (5 mm!). A tumor beültetése után egy nappal, ezeket a transzplaní&íumokat hordozó egereket TRA-8 intra&rtíknlárísan beadott injekciójával kezeltük (5 pg/test) 14 alkalommal. Naponta meghatároztuk a WiDr-tttmomövekedést a tumortömeg mérésével. Az eredményeket bemtstaipsk lentebb, a 4, táblázatban.
4. táblázat
8 n<ip 11 nap 15 nap 18 nap 22 ntsp 25 nap
Kontroil(PBS) SD 196 ±55 249 ±77 469 ±149 584 ±220 833 ±274 1193 ±419
TRA-8 SD 158 ±78 9? ±30 155 ±60 195 ±58 365 ±91 530 ±J?5
Ebben a modellben, míg minden kezeletlen állatban látható volt temoroövekeáés, TRA-S-al kezelt állatokban a tutnornövekedés gátolva volt, mait a tumor méretével szemléltetünk. Ez az eredmény azt mutatja, hogy TRA-8 hatékony tumorsejtek m vivő ehtnsnálásáhan.
25; jpéfdzí
TRA-8 kombinációs vizsaálate
PC-3-jelti, humán prosztata ráksejt-vonalat az „American Tlssue Culíure Colleciíou”-tól (ATCC) szereztünk be, és „P-12K Nttirienl Mtxture’-ben (21127-Ö22, Gibco BRL) tartottuk lent, amely 10% magzati borjűszérumot (FBS, Wyeiooe), 1%, 200 m.M l.-glutamint (25030-149, Gtbeo BRL) és 0,5% penicillín-sztreptomiein-oldatot (P-7539, Sigma) '20 íartahnazott. ÍÖ% FBS-el és 0-,5¼ pesíetllm-szbeptmnidn-oldatíai kiegészített REMII 64ö-íápkőzegeí (MBÍTÖŐS, 1WAK1) alkalmaztunk az alábbi kísérletben. Exponenciálisan növekvő E€-3-sej leket tripszines kezeléssel leválasztottunk, és kétszer mostuk friss íápkozeggei. A sejteket azután megszámoltuk, újra íélszuszpendálíuk friss tápközegben 5 χ 1Θ* sejt/mi sürüségbetp és szétosztottuk lapos aljú, 96 mérőhelyet tartalmazó tálcákba (3598 Corning Costár), bárom párhuzamos alkalmazásával, mérőhelyenként 100 rd őssztérfogatban, egy nappal a kísérlet kezdete előtt.
Egy reprezentatív rákellenes drogot, Pachíaxéh (líPMSő! 1, Wako) feloldottunk dnnetíl-szul.foxidban (10 mg/mi), friss tápközegben hígítottuk, és azután a sej teket tartalmazó, 96 mérőhelyei tartalmazó tálcákba adagoltuk, mérőhelyenként 50 pl-f. A dímeiilsztsi(oxid végkoneentráeíója kevesebb, mint 0,1 % volt. 24 óra hosszáig luk nbáltuk 37e€-pn. 5% széndioxidot tartalmazó atmoszférában, majd friss íápközegben hígított ΤΚΑ-8-at adagoltunk: a mérőhelyekre. További 24 őrá hosszáig Inkubáltuk, majd a mérőhelyekre adagoltunk 50 pl, 1 mg/rol XTT-t és 25 sbM EMS-t tartalmazó, mínítnális esszenciális tápközeget (Minimum Essentíal Médium, 11095-(198, Gibeo BRE), és a tálcákat 6 óra hosszáig inkubáltuk. Azután megmértük az üD450-et SPEC i'RA MAX 250 berendezésen (Moleetdar DesicesT és a sejtek életképességét az alábbiak szerint számítottuk:
Sejtek életképessége (%)' (013450 Taxollal és/vagy TRA-8-ágeussek'ágetisekkei kezeit sejteket tartalmazó mérőhelyeken) - OD4SÖ sejteket sem és ágenst sem tartalmazó mérőhelyeken) x 1O(1/(ÖD4$Ö ágenssel nem kezelt sejteket tartalmazó mérőhelyeken - OD45Ö sejteket Satu és ágenst sem tartalmazó mérőhelyekén).
-66A fentebb leírt, TRA-8 és egy reprezentatív rákellenes drog, Pachíaxel kombinációjának alkalmazásával végzett vizsgálati eljárás eredménye az alábbi. Pachtaxeí csökkentette PC-3-ssitek életképességéi, de a jelek több, mist 40%-a életképes ráksejtekre utalt, ami megmaradt egészen 200 nM koncentrációig. Figyelemre méltó, hegy 0,1 xtg/nti TRA-8 hozzáadása nagymértékben csökkentette a ráksejtek életképességét maximum 10%-ai, még akkor is, ha a sejtek életképessége nem csökkent I'RA-8 egyszeri beadása után emséi a koncentrációnál. Ez az eredmény világosan mutatja, hogy TRA-8 rákellenes aktivitást képes kifejteni szinergtknsan, ha más rákellenes droggal kombináljuk:.
TRA-8-ra snecifekos, más tinóvá ellenanyagok analízise 10 (1) Haíoanszáh: ellextanyagok tervezése
TRA-8: humanizált változatát általánosan ismert eljárással, CDR-átüitefessel („CDR-grnfiing”) áhítottunk elő. mÁB58’CL-ellenanyagot alkalmaztunk akceptorként, a 2. referencia példában leírtak szerint, és a TRA-8-ehenanyag CBR-régíóít átültettük az akceptorha. A vázrégióban néhány aminosavat átültettünk az akceptodsa TRA-8-ról vagy humán konszenzus: szekvenciákról, Qneen és munkatársai által [Proc. Naíl. Acath Sói. USA 8j>. 10029--1(8)35 11988)]
I§ megadott kriférisxnok alapján, és humanizált TRA-S-szekveneíáí az alábbiakban leírtak szerint állítottunk, elő.
(2) Más típusú humanizált vagy egéreredetíi TRA-8 nehéz láncának vatiábűts régióját kódoló DNS-t tartalmazó piaznrid előállítása
A szekvencialístában, az 56. azonosítószámú szekvencia szerint, TRA-8-jeiü, egereredetü ants-humáo-DRS ellenanyag nehéz. Sáncának megfelelő aminosav-sz.ekvencia Hl-típusú humanizálása céljából a 3, anűnosavat (metíoran), T3. anűnosavat (lizín), a 19. aminosavat (lizín), a 4Ö. aminosava; (treotűn), a 42. anűnosavat íglut&nxinsavl, a 44. asűnosavat (arginin), n 84., anűnosavat (széria), a 88. aminosavat (szerin), a 93. anűnosavat (metionin), a 114. Ammösaval (treonin), a 115. anűnosavat (letudó) kicseréljük gháaminra, gluíanxlara, argininre, aianinra, gíicinre, gbemre, aszpnruginra, alaftinra, vallóra, Ieucinra és valinra, sorrendben.
A szekvexiciolistában, az 59, azonosítószámú szekvencia szerint, TRA-8-jelö, egéreredetü anti-humán-DRő ellenanyag nehéz láncának megfelelő aminosav-szekvencía H.l-típusö humanizálása céljából a 13. anűnosavat (liz.in), a 19. anűnosavat ílizin}, a 40. aminosavat (treoxűxí). a 42. aminosavat í gl utam m. sav), a 44. anűnosavat (arginin), a 88. aminosavat (szerin), a 93, anűnosavat (metionin). a 114. anűnosavat (treonin), a 115, aminosavat (leucin) kicseréljük gluiamsnra, arghűnre, aianinra, glicune. ghcmre, alanitxra, valinra, Ieucinra és valinra, sorrendben.
A szekvénesalistában, a óh. azono&üöszámú szekvencia szerint, TRA-8-jelü, egéreredetö anfi-hnmán-DR5 ellenanyag: nehéz, láncának megfelelő: aoűaosa.v~szekvéne|a 114-íipasú huntaxúzátása céljából a 13. aminosavat (lizín), a 19, aminosavat (lizín), a 88. anűnosavat (szérűi), a 93, anűnosavat (metionin), a 114, aminosavat (treonin), a 115. amixiosavaí (leucixí) kicseréljük ghttasnmra, arghűnre, ateninra, valinra, Ieucinra és valinra, sorrendben.
-A szekvencialisfában, sót azonosítószámú szekvencia szerint, kiméra TRA-8 nehéz láncának variábilis: régióját kodölő ÖRS-i tartalmazd plazxnld jelölése „M-hpus”, 'Továbbá, a 17, és 18. példában leírt, húmánizáít TRA-8 jelölése „T12-típus
Thímaxuzáií vagy kunéra TRA-8: nehéz láncának variábilis régióját kódold DNS-t tartalmazó plaznűdot az alábbiak szennt állítottunk elő.
FCR-t alkalmaztunk az alábbi DNS-szekveneiák előállítására, amelyek mindegyike tartalmazta a fentebb leírtakat:
Az alábbi 24 olígonnkleotldot szintetizáltuk:
Ó7
5’- ttggatsage ttggctígae eteaeeatgg gatggagetg íatcsiceíc ítcttgg tag eaacagctac aggtgtocao -3’ (Λ; 32.
azonosítószámú szekvencia);
5’- tetgaagtaa tgeíggigi ;a gtetggggga ggeítagtae agceíggagg gteee igaga ctcteetgtg cagceietgg -3’ (B; 33.
azonosítószámú szekvencia);
5’- tclgaagíae agctggtgí m gtetggggga ggeítagtae agceiggagg gteect gaga ctcteetgtg eagectetgg -3’ (82; 57,
azonosítószámú szekvencia);
S4- tetgaagtaa tgetggtgg ;a gtetggggga ggctíagíaa agceíggagg gíeeet gaaa eíetcelgtg esgccíctgg ~3! (83; 66
azonosítószámú szekvencia);
5’- atteaettte agtagttatg Si'ZtfVSttöít’χ'ΖίΊί \ίί>ϊ7>ί sA ; taalgtettg gj jttcggcag. geaceaggga agggte tgga gigggtigca accaitagta -3’ (C; 34,
5'- ateaeiítc agtagttatg taísigtétig gt ítteggeag actceagaga agagget. gga gtgggttgea. accaitagta -3: (C2; 64,
azonosítószámú szekvencia);
5’- gtggtggtng ttacaccís íc taíeeagaea gígigaaggg ecgatteace aícteet igag aeaatgeeaa g&ae&eeete; -3’ (Π; 35.
ΪΑ*”Ζγ Ϊ V» jYví · JjC iCC í A.t S A vtv.'VAX γ V» · Av 3 ΑΛ ft 5’- íaictgeaaa tgaacagti ;t gagagcagag gaeaeggctg tiíattaelg tgcaas isagg ggtgacteta tgattacgac -3’ (E; 36.
azonosítószámúszekvencia);
5’- taieígeaaa tgageagú fí-f* iíí )' ;t gagageagag gacaeggetg tttattaetg tgeaag aagg ggtgacteta tgattacgac -3’ <82; 62.
5’- tatcigeaaa tgageagú ;t gagatctgsg gacacggets tgtattactg tgcaagí mgg ggtgacteta tgattacgac -3’ (83; 67.
2Ö azonosítószámú szekvencia);
5’- ggaetaeigg ggecasggga eectggteac agtctectea gccteeaee aagggeecat eggte -3’ (F; 37,. azonosítószámú szekveaeía);
S’- ggaetaeígg ggeeaaggga ecaeieleac agtctectea gecteea.ee aagggeeeat cggtc -3’ (F2; 68, azonosúőszámú szekvencia);
etaecaagaa gaggatgata csgetccatc ceatgglgag gteaageeaa geííaíeeaa -3’ (G; 38, azonosítószámú szekvencia);
5- íetcagggae c< teeagget gíactaagcc teccccagac tecaeeagca ttae tíeaga giggaeaect gtagctgtíg -3’ 1 H; 39.
azonosítószámú szekvem la);
5’~ teíeagggae ct •teeagget gtaetaagee teccccagac tceaeeagct gtact teaga gtggaeaeet gtageígtlg ~3S (í 42; 58.
azonoslíőszúmú szék vem la);
5’” itteagggac ec teeagget ítactsagcc teccccagac tecaeeagca tlaet eaga gtggaeaeet giagetgttg -3’ <1 43; 69
azonosítószámú szekvent la);
5’- teeagsceet te cetggtge- ctgecgaace eaagaeaíta cataaetaci gaaag ágaat ccsgsggctg eaeaggagag -3’ (1; 40
í4\zi> Avíii-t Wííx· >’- tceágcctcí tét ívzönosítöszániű S2£kv$?T& elggágt ctgecgaace csagacatís caiaaetací gaaagt la); gaaí eeagaggctg eaeaggagsg -3 ’ 1 12; 65
5’- cíeíggagat gs jtgaalegg ceetícacae tgtcíggatg. gtaggígtaa otao meeac taetaatggt tgeaacecae -3’ (1; 41
azonosítószámú szekvencia);
5’- ecttettgea eagtaataaa. cageegígtc cíctgetcte agaetgííea tttgeagata cagggtgtte ítggcatígi -3’ (K; 42. azonosítószámú szekvencia);
5'- cetíetígca eagtaataaa eageegtgte eteígetetc agaetgtea tttgeagaía eagggtgtte tiggeattgt -3? iK2; 63, azonosítószámú szekvencia),
- 68 5’- cettóttgca eagiaataca. íagecgtgte ctoagateíc sgactgctea títgeagaía cagggtgtte tíggcattgi -3’ (K3; 70. azofmsiíőszáutü szekvencia);
5’·- gaecgatggg eccttggtgg aggctgagga gacigtgacc agggteecit ggecceagta gtccgiegta atcatagagt eacc -3’ (L; 43. azoftosltószáutá szekvencia) és
5’- gaccgatggg cccttggtgg aggctgaggu gactgtgaga gtggtecett ggceecttgta gtcegtcgta aleatagtígt cucc -3’ (L2; 71. azonosítószámú szekvencia).
Az alábbi két PCR Iáncindltó rmkleoddot szíutetizáliuk a fentebb leírtak szerint:
5'- ttggaláage iíggeügae -3’ (Pl; 44. azonosítószámú szekvencia.);: és gaeegatggg cccttggtgg a -3' (P2; 45. azonosítószámú szekvencia).
Szekréciós szignálszekvenciát, humanizált TRA-8 nehéz láncának variábilis régióját és az igö-CFil-régió Nteműnsiísának 8 aminosavát tartalmazó polipeptld-iáncot kódoló, Hl-típusú DNS szintézisét PCR-ck megfelelő kombinációjával végeziPk.
A ü l -típusú DNS-Ragmensi az alábbiak szerint áliitoítók elő,
A FCR ívakcíooidat összetétele:
A-oligonuk lentid, 1 ö pmni;
Öi-öligonttkleoítd, 10 pmol;
C-oligooukteotid, lő pmol;
D-ollgonukleotíd, 1 ö pmol;
E-olígonukicobd, lö pmol;
F-oligonnkleotid, lő pmol;
G-oligonukleotid, K) pmol;
H2-oligonuktootíd, IÖ pmol; í-oligonnkleoíád, lö pmol;
-oligontikieottá, lő ptnol;
K-oiigonukleotid, 10 pmol;
k-oiigonakleoíid, 10 pmol;
Pl -lelő lüncindtló oligonukleotld, 2 pM;
Pz-jelú Iáncindltó ohgonukieoíieL 2 uM;
1Ö X Pyrebesf-puííer Π., Kí pl;
dNTP-keverék. 8 pl;
Pyrobesí DNS-polimeráz, 0,5 pl; és végtóríógatái 50 pl-re állítottuk kétszer desztillált vízzel,
A PCR-reakelót az alábbiak szerint végeztük. Az oldatot először íélmelsgítettök 94°C-ra 5 percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük: 9ÍPC lö másodpercig, 5S°C 30 másodpercig és 72ftC 1 percig, 7-szer ismételjük. Az eljárás után a reakcíőoldatet Vd^Ü-on melegítettük 15 percig.
Feoolos extrakció és eíanolos ktcsapás ólán az eredményül kapott DNS-csapadékoí vákuumban megszáritottuk, minimális mennyiségű kétszer desztillált vízben feloldottuk, és 3%-os jxrliakrílamid-gelelcktroíbrézissel elválasztottuk. A gélt éiekteöfórézís után megfestésük 1 pg/ml elidium-bromíddaí, hogy lehetővé tegyük a DNS W-iéöy aláiti detektálását. A 111 -típusú DNS-nek megfelelő DNS-cslkokat borotvapengével kivágtuk, és eiuáknk a gélből „Gene40 ciéan Spin Kit” (BIO 101, CA, VSAI alkalmazásával. Fénolps extrakció alán az «kiált .ONS-t centriíngálássai (7,500 X
-69g) tbroényiíe-tük, azután eumoliát kicsaptuk, és végűi 5 p.t desztillált vízben feloidottok.
Szekréciós szignálszekveneiái, humanizált TRA-S nehéz láncának variábilis régióját és az. Igö-CH's-régsó Nterminálisának 8 ammosavM tartalmazó polspeptid-lánept kódoló, N3-tÍpasú DNS szintézisét PCR~ek megfelelő kombinációjával végeztük.
A H3-típusú DNS-lragtnensi az alábbiak szerint állítottuk éld.
A PCR. reskdóöldat Összetétele:
A-oltgonukleoiid, 10 pmol;
S-oligontikleotid, löpmol;
C-ollgonnkleatid, 10 pmol;
Dmlígontíkleotid, i 9 pmol:
E2-oijgoa«kléotid, 10 pm<d;
P-ohgosukleotiá, lö pmol;
G-oligomikleotid, lö pmol; lí-oligortukleotid, 10 pmol;
.15 i-oiígomtkieotid, ÍÖ ρηχοί;
.l-oligonukleníid, lö pmol:
K2-oiigon«kleotid, lö pmol:
L-oiigonukieotid, lö pmol;
Pl-jelű láneindító oligonnkleotid, 2 μ,Μ;
P2-jelű iánemdito oligonukleotid, 2 pM;
X Pyrobest-puffer 11, 19 pl; dN ΓΡ-keverék, 8 pl;
Pytóbesí DNS-polhneráz, 0,5 pl; és végtérfogatát 50 μΐ-re állltoitnk kétszer desztillált vízzel,
A PCR-rcakcíőt az alábbiak szerint végeztük, Az. oldatot először felmelegitettük 94öG-ra 5 percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük: WC· 10 másodpercig, 55*C 30 másodpercig és TP/'C I percig, ?-szer ismételjük, Az eljárás után a reakciőoldatot 72°C-on melegííetttik 15 percig.
Fenoios exirokeiö és etanolos kiesapás után az eredményűi kapott DNS-csapadékot vákuumban megszárítotfuk. minimális mennyiségű kéiszer desztillált vízben feloldottuk, és 3%-os poliakrilamid-géielektroförézlssel elválasztódok.
A gélt elektroferézis után megfestettük I ng/mi eiídmm-brömiddal, hogy lehetővé tegyük a DNS ÖV~fény alatti detektálását. A H3-tipnsd DNS-nék megfelelő DNS-csikokaí borotvapengével kivágtok, és eluáltuk a gélből „öeíteclean Spin Kit”' (KO 181, CA, USA) alkalmazásával. Fenoios extrakeló után az eluált DNS-t centriíugálással (7,589 X g): töményiíeitoh, azután etanollai kicsaptok, és végül 5 ni desztillált vízben feloldottuk.
Szekréciós sztgnálszekveneiáí, humanizált TRA-8 nehéz láncának variábilis régióját és az ígö-CHl-régió N35 terminálisának 8 amlnosavát íartahnaző pollpeprid-láneoí kódoló, Hü-típusú DNS szintézisét PCR-ek megfelelő kombinációjával végeztük.
A H4-i;fpasü DNS-fragmenst az alábbiak szerint állítottuk eló.
A PCR reakcióoldat összetétele:
A-oligonukleotkl, 18 pmol;,
41) S-ohgonukleottd, 10 pmol;
- 70 C2'öiígnnukleodd, 10 patoi;
D-0li.g0mik.fe0s id, 10 pmol;
F2-ohgöoukfeo;id, 10 pmol;
F-obgonukfeoí id, 10 pmol;
G-otigomikfeotíd, 10 porol;
HoligonnkleiXid, 10 porol;
12-ölígumskleotíd, lö pmol; j-oligonukíootid, lö porol;
&2-otigöUrtkleeíid, .10 pmolj lö k-öiígosukfeötid, löpmel;
Pl-jelű láncindító n.ligetn.ikfeolid, 2 μΜ;
P2~jelü láncisdító oügonukleoiíd, 2 pM;
X PyröbeA-pufe 1.1., 11) pl; dNTP-keverék, 8 pl;
Pyröbest DNS-polimeráz, 0,5 pl; és végtéríbgaíát 50 p.l-re állfiotíok kétszer desztillált vízzel,
A FCR-reakclőí az alábbiak, szerint végeztük. Az oldatot először feiroelegíieiitik 94°Ora 5 percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük; WC 10 másodpercig. S5°G 30 másodpercig és 72°C 1 percig, ?-szer istrtéíeljük. Az etiárás után a reákciósldatol 72*C~osí melegítettük 15 percig.
Fenoios extrakciö és etanolos kíesapás titán az eredményül kapott 13NS-esapadékoi vákuumban megszáriíoltuk, minimális mennyiségű kétszer desztillált vízben feloldottuk, és 3%-as pöliakrilamtd-géiefekiroforézissei elválasztódok. A gélt elektrofórézis után megfestettük 1 pg/ml ettáium-bromiddal, hogy feketévé tegyük a .DNS UV-fény alatti detektálását. A. ϊ-14-tlposú DNS-nek megfelelő DNS-esikekat borotvapengével kivágtuk, és elnáitnk a gélből „Geneclean Spin Kit” (Blö 101, CA, USA) alkalmazásával. Fenolon extrákéit) után az eiuált DNS-t eenínfugálással (7,500
X g) tömény itettök, azután etánollal kicsaptuk, és végöl 5 pl desztillált vízben feloldottuk.
Szekréciós szignálszekvenciát, kirnórá TRA-8 nehéz láncának variábilis régióját és az tgö-CHl-régió Ntenminálísának § aminosavát tartalmazó poíipeptíd-iáncot kódoló, M-tipusö DNS szintéziséi PCR-ek megfelelő kombinációjával végeztük.
Az M~tiposú DNS-fragnienst az alábbiak szerint állítottuk elő.
A PCR reakeióoldai összetétele;
.A-ollgonükfeotid, 10 pmol;
BS-oiigonukleotid, 10 ptnol;
C2-sligonuRieoíid, 10 pmol;
D-oligonakieotld, lö pmol;
F3“oligonnkseotid, 10 porol;
ϊ'2-obgonuk.leotid, 1 ö pmol; ö-obgonukleotiá, 10 pmol;
113-oligonukleötiá, 10 porol; íá-olígömikleoíid, lö pmol;
.l-oligonukleosid, 10 pmol;
Κ3 -ol igenüklentid, lö pmott,
U-oligormkleotid, 10 pmoi;
P i-jelö láncintiítö ohgonukleotid, 2 pM;
P2-jelü iáncínditó oligonukleotid, 2 pM;
lő X h'yrohcsi-poffer 11., 10 pl,
ONTP-kevetók, 8 ul;
Pyrobest DNS-polimcráz, 0,5 pl; és vógtérlögaíát 50 fd-re állítottuk kétszer desztillált vízzel,
A PCR-reakctóí az alábbiak szerint végeztük, Az oldatot először feirnelegitetíük 94®C~ra. 5 pereig, azután az 10 alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük: 98’X; lő másodpercig, 55’C 30 másodpercig és 72*C I percig, 7-szer ismételjük. Az eljárás uiárt a reakciórddafoí ?2*C-on melegítettük 15 percig,
Eenolos exttfció és eianoios kiesspás «Ián az eredményül kapott ONS-csapadékot vákuumban megszáritottuk. minimális mennyiségű kétszer desztillált vízben feloldottuk, és 3%-os poliakriiamid-gélelektrolórézissel elválasztottuk, A gélt elektroforézis uián megfestettük 1 pg/ml ettdium-brorniddaf, hogy lehetővé tegyük a DNS UV-iény alatti detektálását. Az M-tfpusú DMS-uek meglelslö DNS-csikokat Ixnotvapengével .kivágtuk, és eluálíuk a gélből „Geaedean Spin Κ5Γ (BIO 101, CA, USA) alkalmazásával, Feuolos extrakető «54« az: eluált DNS-t centrifugálással (7,500 X g) fOrnéuylfettök, ttzuíán efanollal kicsaptuk, és végül 5 μΐ deszíillált vízben leloldöttttk.
Az eredményit! kapott, extrahált DMS-ekef (Hl -típus, H3-ttpns, Hó-típus és M-típus) az alábbiak szerint klónozlak „pGEM-T Easy” vektor (Promega) alkalmazásával:
A PCR-reakcióból kinyert DNS-fragroens ílí 1,113,114 vagy M), 5 μΐ;
X 3'aq-pölimeráíí-pufler, 1 pl; űbfí’P-keverék, 1 μί;
Taq-polímeráz (5 egység/mli, I ul, és végfériögalut 50 pi-re állítottuk kétszer desztillált vízzel.
A fentebb leírtak szerint elvégzett műveletek után az: egyes oldatokat WC-oa reagálíatíuk 30 percig, majd az egyes DNS-oidstokaí és „pCEM-'T Easy vektort Ugattunk DNS-ligációs reagenskészlet t,,DNA Ligádon Kit, Version 2,0, Takara Shnzo, Co, Ltd.) alkalmazásával, a gyártó által adott használati ut&sitas szerint, éra hosszáig inkultáituk I SRXon, majd 2 pl inkabáit reakcíöoláatot összekevettüttk 1ÖÖ μί kompetens, A, coft’ JMlÖO-förzzsel 1-2 x 10v sejt/mí sűrűségben (Tabura Shuzo Co,, Ltd.), és a keveréket jégen tartottuk 30 percig, azután dS^'C-on 30 másodpercig, és isinél jégen 1 percig, Azután 500 ul SOC-tápközeget (2. tf% trlpíou, 0,5 vegyesbe élexztSkivonaL 0,05 vegyes% nátríum-kioríd, 2,5 wM. kálium-kferid, I mM magnézttmi-kiorid és 20 mM glükóz) adtunk a. keverékhez, amelyet egy további óráig inkubálmnk rázatva, -Azután izoláltuk a transzíbrmár® törzseket, és pl&zmíd-DNS-t preparáltunk a törzsekből a „Molecnlar Cioning: A. Laboratory Manual” című könyvben leírtak szerím. Humanizált vagy egéreredetü TRÁ-8 nehéz láncát kódoló, így előállított DNS nnkleoíidszekvenciájáf didezoxi35 módszerrel (Sauger, E. S, és mtsai., Proc. Nad, Acad, Sei. USA 74, 5403-5467 (19?7)j igazöttnk, „3700 DMA Aaaiyzer” berendezés (ASf PR1SM; Perkin Elsner Applied Biosysiems, Ispán) alkáimazásávai.
Az eredményül kapott plazmádjelölése pílAíS (humanizált TRA-8 Hl-típusú nehéz láncát kódoló cÖNS-t tartalmazó plazmid), pHClÖ (bumanízált TRÁ-8 íB-ttpnső nehéz láncát kódoló cDNS-t tartalmazó plazmid), pHD21 (humanizált TRA-8 H4-t|pnsü nehéz láneát kódoló eDNS-t tartalmazó plazmid) és pM l 1 (tóméra TRA-8: nehéz láncát
- 72 kódoló eDNS-i tartakttazó plazmid), A piazmidokal tartalmazó, transzfonuáns £. <»0 törzseket, amelyek jelölése £. eoS .SMW/pHAÍS, £. <»//JMlOV/pHCiO, £. <-<m 1Ml09/pííD21 és £ «d/JMlWpMl 1, 2001. április 20-án deponáltuk az alábbi iotézméuybeo: „Intematióoal Fateot Organtstn Deposltary, Nettónál insí tntle of Advanced ladastrial Science and Technology” (1-1, í-íígasín 1 chorne Tsukuha-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan), a mikroorganizmusok deponálását szabályozó. Budapesti Szerződés--szerint, és nyilvántartási számuk FERM ÖP-7555, FERM BP-7557,1ERM 13P-7558 és FERM BP-7559, sorrendben, (3) Néhány típus, humanizált vagy egérereáetS TRA-8 nehéz láncának variábilis régióját kódoló DNS-í tartairnaző plazadd előállítása
Áílatsejtekben alkaimazbatő, rekranbináns ezpressz-iős vektort úgy állítottunk elő, hogy H1 -típasö, 1-13-tlpusú és
04-rtpnsa humanizált vagy Mdipusá ksmóra TRA-8 nehéz: láncát kódoló DNS-t (klónozás a. fentebb leírtak szerim történi) inszsrtáliunk sz alábbiak szerint.
Humanizált snti-Eas, HFEzÁ-ielü monoklonáiis ellenanyag nehéz láncának variábilis régióját és humán IgGi konstans régióját kódoló genond DNS-t tartalmazó, 1 pg pSRHBH3-plazmidot (EP 9-999-816.A1, számú európai szabadalmi bejelentést, amely emlős sejtekben alkalmazható expressziás vektor, i-iíndlii/Apal-jelü restrikciós enzimekkel emésztettünk, és 3%-os agarö/.-géielefctroforczsssel elválasztottuk. A gélt elekJroforézis után megfestettük 1 pg/ml eddlum-bromid vizes oldatával, hogy az előállított DNS detektálását. DV-lény alatt lehetővé tegyük. A humán íg<31 konstans régiójának megfelelő genom! DNS-t a: humanizált H.FE7Á nehéz: láncának variábilis régiója nélkül tartalmazó vektornak megfelelő DNS-csíkokat borotvapengével: kivágtuk, és eluáituk a gélből „Geneclean Spin Kit” alkalmazásával. Penolos: extsakeió után az előáll DNS-t eeníriíugálással {7-,509 X g) tömény ítettük, azután etanollai kicsaptok, és végül S pl desztillált vízben feloldottuk, és azután CFP-el de fősz fordáitok. Az eredményül kapott, defoszforiláh: plazöndot (190 ng) ligáitok 1 pg, Immunizált vagy kíméra TRA-8 nebez láncának variábilis régióját kódoló DNS4 tartalmazó, pFlAlS-, pHCIO-, pHD21- és pMil-böl származó DNS-ffagmenssei, melyet szintén Híndiií/Apal-enzimekkel emésztettünk, a Hgálást DNS-ligácíós reagenskészíet í„DNA i.,tgafton Ki?, Version 2.0, Takaró Sbuz.0, Co, L.íd.j alkalmazásával végeztük. A hgációs keverékkel azután E. coli JMlÖ9-?őrzset transzformáljunk, és
50 pg/ml ampíeíllíttt tartalmazó LB-agar-táptalajra szélesztettük.
Az így kapott transzforrnánsokat 50 pg/ml ampicillint tartalmazó, 2 ml folyékony Lö-íápközeghen tenyésztettük
37“G-osg egy éjszakán át, és azt kővetően a plazmid-DNS-t extraháltunk az eredményül kapott tenyészetből, alkaíiknsSDS-módszer alkalmazásával,
A vektorban lévő, kívánt. DNS-ftagmens: ínszeresőjáí és orientációját DNS-szekvenálássai igazoltok, géoszekveneia-artalizáter („ÁBí Rrtsm 3799”' típusú DNS-anslízátor; Applied Bfosystetss) alkalmazásával. Az eredményül kapott, humanizált vagy kanéra TRA-8 nehéz: láncai kódoló: e.DNS-t tartalmazó, exptessziós plázmídok jelölése pBÁ 15-1, pHC 10-3-, pHD2i -1 és pM 11-1, sorrendben.
(4) A humanizált könnyű láncoknak megfelelő vektorok előállítása (4.1) A humanizált ellenanyag (LMMÍpws) könoyú láncának megfelelő, estpressxids vektor előállítása
A szekvencíab'stábtuí, a 72, azonosítószámú szekvenciában bemutatottak szerint, TRA-8-jelű, egéreredetú asrtíhurnáo-DRS ellenanyag könnyű láncának megfelelő aminosav-szekvencía másfele humanizálása (LM 1-tipus) céljából a TRA-8 könnyít láncának megfelelő ammosav-szekveneia N-tertrdnáíisáhan a X amínösavat ívalm), 8. ansaosavat (hisztidin):, 9. ami sósavat (Ibin), 10. ami nosavat (len Hakniin.), 11, antittosavaf (tnelionin), 13. anrinosavat (treonin), 20. airtíoösava? (szerbi). 42. amínösavat (glntamín), 43, amínösavat (szerin), 60, amínösavat (aszparagínsav), 63, astínösavat (treonin). 77, anrmosavat (aszparagot), 78, amínösavat (valín), 80, amínösavat (széria), 83- átmnosavst
-73 (lenem), 85. ammosavat (aszparaginsav). 87. atninosavat (íenítalanln), és 99. antinosavat (glicin), 103. amínosavat (leucin), és 108. aroinosavat (alanín) kicseréljük glu'.aminra, prolinra, szerinte, szerinre, íeucinra, alansnra, treonínra, lizinre, alansnra, szertáré, szerűire, szertáré, Íeucinra. prolinra, fenilahttt tora, trooninra, tirozinra, glutaminra, vallóra és treenlnra, sorrendben. Az eredményül kapott szekvencia jelölése EMI.
TRA-8 jelű, ;mii-humán-D&5 ellenanyag ilyen típusú humanizált könnyű láncának megfelelő atninosavszekvendát (IMI-típus,, 72. azonosítószámú szekvencia a szekveneiaiistában) íartabtsnzó expressziós plazmidokat az alábbiak szerint állítottunk elő:
1) Lánehrdiró oligonokteolKlok szintézise humanizált TRA~8 (EMi-tipus) könnyű láncában lévő, variábilis és konstans régiók előállítására.
Az ÉMl-polipepiid-láncot (72. azonosítószámú szekvencia a szekvefieiulisíában) kódoló DbiS-t, amely humanizált, TRA-8-jeíú, aníi-E)R5~ellensnyag könnyű láncának (LMl -típus) variábilis u guanói és a humán íg könnyű lánc (κ-lánc) konstans régiójából álló fúziós fehérjét kódol, FGR-ekkombinációjával sz níenzeituk, sorrendben.
7ALiP~n (47. azonosítószámú szekvencia), 7AIX:btm (48. azonosítószámú szekvencia), H&CBPlI-n (58. azonosítószámú szekvencia), HKCDR'12-η (51. azonosítószámú szekvencia), HKCDF22-n (52. azonosítószámú szekvencia), I4RCDR22-n (53. azonosítószámú szekvencia) és IiKCDPÍ2-n (54. azonosítószámú szekvencia) Ltv4U ,tz.
alábbi iándndhő oiigonukleotidot szintetizáltuk PCR-bez:
5’- gíeecceaea gatgeagaca aagaacögg agaítgggíc atetgaatgt eaceagtgga -3’ (HKSPR12; 77. azonosítószámú szekvencia).
2) pCR3A/EMl~2-plá2ssid előállítása (hataasízáit TRA-8 LMl-tlpnsá, könnyű láncának klónozása)
LMl-DNS-fmgrneusf, mély a 72. azonosítószámú ammosav-szekvenclát kódolja, úgy állítottunk elő, hogy 2 lépéses FCR-Í végeztünk, egy piazmíd-vekíorba inszertáltnk ésro/rba klónoztuk.
a) Első lépés FCR
LMl-Pl-BNS-íragmensi. amely szekréciós szignálszekvenciát és az FRLrrégtó egy·' részletet kódolja, 5’-végén Hindlil-jelű restrikciós basitóbely van hozzáadva, az alább; körülmények között áhítottunk elő, A pHSGHMl?- és pSRPDHB-jelŰ lempláí-plazusidokhoz az EP 0 909 81 ő Al. számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak alapján .lúitoittmk,
A reakcióoldat Összetétele:
piiSGílM 1 ? -jelű plazmíd-DNS. 25 ng 7AtlP-jeW láricindító olígonukleotid, 59 pmoi
HK.SFE12~jelü lánemdító oiigouukieotid, 59 pmo?
dNTP-ket tartalmazó koktél, 5 μί l OxFCR-paffer, 5 μί ampliTaq DNS-poümeráz {Perkín Elmer), 2,5 egység
A fenti összetételű reakcióoláa! végtériógaúa 50 μί-re állítottak kétszer desztillált vízzel, és FCR-ben alkalmazzak.
PCR hőmérsékleti ciklusok körülményei; hevítés 94*C' 2 percig, azután az alábbi hónrérsékleb ciklusokat végezzük: 94°€ 1 percig, 55CC 1 percig és 72°C 2 percig, 39-szor ismételjük, majd hevítés 72”C ÍÖ percig.
l..M1-F2~DN;S-lragmenst, amely FRLs-et, CDRLj-et, FRl-z-í: és CPRL3-t kódol, az alábbi körülmények között állítottunk elő.
A reakcióöídat összetétele:
pL28-jeíö plazmíd-ÖNS, 25 ng
KKCDEI1-jelű lánc indáé oligonukieotid, 50 pmoi
HXCDR12-jeiö Iáncinditó ohgönukfeöíid, 50 pmoi dNTP-ket tertalmazó koktól, 5 pl lÖxFCR-pafför, 5 ni íitnpliTaq DNS-poiímeráz, 2,5 egység
A fenti összetételű reakcióoldat végtérlögatát 50 pl-re áhtíoítnk kétszer desztillált vízzel, és FC’R-ben alkalmazzuk.
ECR hőmérsékleti ciklusok körhlmétíyei: hevítés WC 2 percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat 10 végezzük: WC í percig, 55% 1 percig és 72°C 2 percig, 30-szor ismételjük, majd hevítés 72°C 10 percig,
LMM'3-DNS-5ragmensí, amely CDRL2~t, PRl..rat és Cf>Rl.3 egy részletét kódolja, az süábbi körülmények közölt áiiiíottónk elő.
A jcakcióoldal: összetétele; pSRPDHÍ Meló plazmid-DNS, 25 ng
HKC DF 72 -jel δ iáncinditó oligonukieotid, 50 pmoi
HK.CDR22-jelü iáncinditó oligonukieotid, 50 pmoi dx i'k-keí íartahnsízö koktél, 5 pl lüxPCR-pufíér, 5 pl atnpilTaq DNS-poi««éru/„ 2.5 egység
A fenti ősszetételö reakcióoldat végíéringatát 50 μί-re állítottuk kétszer desztillált vízzel, és ECR-hen alkalmaztuk,
ECR hőmérsékleti ciklusok körülmények hevítés WC 2 percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük: WC 1 percig, 55% } percig és 72% 2 percig, 30-szpr ismételjük, majd hevítés 72% 10 percig,
LM2~F4d>NS-fragínensí, amely CÖRt-W, FR'W^í & a konstans régiót kódolja, 3’-végén EcoRI-jelS 25 restrikciós hasítóhely van hozzáadva, az. alábbi körülmények között állítottunk elő.
A reakclőoldat összetétele: pSRPOHH-jelÖ plazmíd-ÖNS, 2S ng HKCF12 -jelű Iáncinditó oligonukieotid, 5d pmoi 7ALCN-ielü íáneindiíŐ oiígonukleotid, 50 pmoi dX'TF- két tartalmazó koktél, 5 pl tÖxECR-puffer, 5 pl ampli'Iaq DNS-poiimeráz, 2,5 egység
A. férni összetételű reakcióoldat vegiéríbgatát 50 pl-re állítottuk kétszer desztillált vízzel, és RGR-bett alkalmaztuk.
ECR hőmérsékleti cikhtsok körühnésryei: hevítés WC 2 percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük.; WC 1 percig, 55% 1 percig és 72% 2 percig, 30-ssor ismételjük, majd hevítés 72% 10 percig.
Az amplítlkáh DHS-fragmenseket ECR után elválasztottuk 5%~os pOiiakrilamid-géielektröforézissel. A gélt eiektroíorézís után mégftsietíüfc 1 pg/ml ettdinm-brossíddal, hogy az előállított DNS-t líV-fény alatt detektáljuk. Az igy detektált, megfeleld DNS-csíknkat pengével kivágtuk.
b) Második lépés FCR »7*f λ·
LMl-DNS-í, amelyben a föntebb teirt LM 1-FI-DNS-, 1.M1-F2-DNS-, LMI-F3-DNS- és I.MI-F4-DNSfragmeoseket íttótonáljtsk, az alábbi körülmények közöd áliilpik elő,
A reakeióoldat ősszeföiele:
az első lépés FCR-ben előállítod, I.M1-F 1 -DNS-gélf'ragmens, az első lépés PCR-bén előállítod, LMl-FS-DNS-gélfragmens, az első lépés PCR-ben előállított, LM 1-F3 -í>NS-gélfragroeos, az első lépés FGR-béü előállított, Í..Ml-F4-DNS-géiiragniens,
7ALl.i-’-jelu láncindító oligomíkieotid, 5Ö pmol 7ALCN-jelü iáneinditó oligonukleotid, 58 pmoi dbí'f P-fest tanataassó koktél,: 5,0 pl lÖsPCR-ptdíér, 5,8 pl antpiíTttd DNS-polimeráz, 2,5 egység.
,R fenti összetételű reakeióoldat végtérfogutét 50 pi-re állítottuk kétszer desztillált vízzel, és RCR-hen aikaintazttik.
POR hőtnérsékleti elkldsők körülményei: hevítés 94ÖC 2 percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük: 94'5C i percig, 5S°C 1 percig és ?2°G 2 percig, 3Ö~szor ismételjük, majd hevítés 72CC 10 percig,
Az így előállítod LMl-DbiS-tragmenst pCR3J-DNA-plazmidba inszertáltnk „Eukaryotic TA” klónozó reagenskészlet (íovitrögen) alkalmazásával, a gyártó használóit utasítását követve, és bevitídk kompetens A. eo/í TÖP18F sültekbe, amelyet a reágenskészföt tartalmazott, Humanizált TRA-8 kőattyü láncát (LM'l-íipus) kódoló DNS20 ek nukleotídszekvendáját didezoxi-módszérrel [Sanger, F. S, és mtsai., Proc, Natl. Acad. Sci USA 74, 5463-5467 (1977)]: igazoltuk, „3708 DNA Aoaíyzer” berendezés (ARÍ PRíSM; Fefkin Elmer Applied Öíosystetns, íapau) alkalmazásával.
Az eredményül kapott plazroídok jelölése pCR3.RLMI-2 (hunianszált, LM 1 -típusú, TRA-8 könnyű láncának variábilis régióját és egy hantán lg könnyű láncának konstans régióját kódoló cDNS-t tartalmazó plazmid).
Az így előállított, LMÍ-DNS-fragmenst tartalmazó pCR3, i/LMi-2-plazmidot Hindili.'EeoRI-jelti restrikciós enzimekkel emésztettük.
I pg, plTSG399DNA-jelő klónozó plazmidot Hindlil/EcoRl-jeld restrikciós enzimekkel emésztettünk, és azután ClP-el defoszforiláliak. Az eredményűi kapott, defeszforiiált pfISö39O-I>NA-t és l.Mi-DNS-fragmeosí, amelyeket előzőleg fílndiil/EcoRÍ-fohl restrikciós enzimekkel etnésztettünk, ligáitok öNS-lígáeíós reágenskészföt („DMA
3(1 1 marion Kit, Version 2.0, Takara Shuzo, Go. Ltdj alkalmazásával, Azóta: £ cr;A DB5n-íörzset teanszlbnuáltdnk a hgalt DNS-eb és 8, i mM IPTG-t, 0,1% X-G&l-t és 58 pg/ml klóratnfenikolt (végkoueentráeíók) tartalmazó LB-agartáplafeiira széiesztettük. Az Így kapod, fehér transzformánsokat 58 pgRml kióraraíémkoit tarttdmazó, folyékony L8tápkőzeghen tenyésztettünk, és. plaztnid-DNS-t extraháltunk az eredményül kapott tenyészetből, aikaiíkus-SDS-módszer alkalmazásával. Az extrahált plazmíd-DNS-f HindBlZEeoRFenzssnékkél emészfödük, és azután az LMl-ÜNS35 ftagmenst tartalmazó kiont 1% agaróz-gélelektrofbrézisseí választottuk ki.
A fenti eljárás eredményeként előállítottuk a humanizált 1..ML TRA-8 könnyű iáacáttak variábilis régiójából és tortán tgk-láne konstans régiójából álló, fúziós fi-agntost tartalmazó pBSG/M 1-2-2~plazmldöt A plazmidot tartalmazó, transzformáns E. coli törzset, amelynek jelölése £ coli DH5a/pHSG/M 1-2-2, 2001, április 20-án deponáltuk az alábbi intézményben: „ínteroatíonal Patent Organtsm Deposhnry, National insíitute of Advanced
4(1 Industriíd Science and Teehnology” (1-1, Hígashí 1 ehome Tsukuha-shi, íharaki-ken, 385-.5466, Japanl, a nőiknxug-76aniztinisők deponálását szabályozó, Budapesti Szerződés szerint, és nyilvántartási szánta FERM BP-7562.
3) pSR/Mí-2-píazmld előállítása (expresszlóx plazmid humanizált LM 1, TRA-8 könnyű lánchoz)
Á fentebb leírták szerint előállítod, humanizált LM1, TRA-8 könnyű láncának variábilis régiójából és humán IgK-lánc konstans régiójából álló, fúziós fragmenst tartalmazó pBSG/Ml-2-piazmidot HindiO/EcoRi-jelő restrikció» enzimekkel emésztettükEgy Pg pSRPÜHH-DNA-jőiü klónozó plazundot· (EP Ö-9Ö9-81Ő.A1. számú európai szabadalmi bejelentés) )?iíndíi.VEcoRi-jelű restrikció» enzimekkel emésztettünk, és azután CIP-ei deíoszforiláitnk. Az. eredményül kapott, defoszforilált pSRPDHH-DNA-í és pHSG/M 1-2-2 Híndill/EcoRl-enzimes emésztésével előállítod DNS-fragmenst ligáitok BbiS-Iigáeiós reagenskészlet („DNA Ugarion Kit, Version 2.0, Takara Simze, Co. Ltd.) alkalmazásával,
Azután El cö/í EtHóa-tőrzset transzformáltunk a ligáit DhIS-el, és LB-agar-táptaiajra szélesztetíük. Az így kapód transxfonnáasokst 100 pg/im ampicillim tartalmazó, folyékony Lö-iápközegben tenyésztettünk, és plazmid-DNS-t extraháltunk az eredményül kapott tenyészetből, álkallkus-SDS-módszcr alkalmazásával, A pSRPDifi 1-vekíorban lévő, kívánt DNS-fragtnens mszsrcíóját es orientációját DNS-szekvenálássai igazoltuk, génszekvencla-analizátor („ARI Prism 3700” típusú DbiS-anaitzáíor; Applied Biosystems) alkalmazásával.
Az eredményül kapod, humanizált LM 1, TRA-8 könnyű láncát kódoló cDNS-t tartalmazó, expfesszió» plazmid jelölése pSR/LM 1-2, (4.2) A humanizált ellesranysg <LM3-tfp«s) kűnnyá láncának megfelelő, espresszlós vektor előállítása A szekvenciabstában, a 73, azonosnoszamn szekvenciában benudaiortak szerűd. ΓΚΑ-8-jehí, egereredetu antibtintán-DRá cd lenanyag könnyű láncának megfelelő amínosav-szekvencia másféle humanizálása (LM3-tipus) céljából a
TRA-8 könnyű láncának megfelelő aminosav-szekvencia N-termínálisában a 8. aminosavat (hiszráiin), 9, amínosavat (liz.m), 10. amínosavat (feniialanin). 11. amínosavat (metionin), 13. amínosavat (treonin), 20. amínosavat (szerin), 42, amínosavat (glutamin), 43. amínosavai (szerin), 77. amínosavat (aszparagin}, 78, amínosavat (valin), 80. amínosavat (szerin), 83. amínosavat (leucin)., 85 amínosavat (aszparaginsav), S7. amínosavat (feniialanin), és 99. amínosavat (glictn), 103, amsnosavat (leucin), és 108. amínosavat (alanin) kicseréljük prolinra, szefínfe, szerinte, leucmra, áiantnra, íreoninra, lízlnre, alanínra, szerinte, feucinra, prolinra, fenilalaninra, íreoninra, Erózióra, gluíaminra, valmra és treonínra, sorrendben. Az eredményül kapott szekvencia jelölése LM3.
TRA-8 jelű, antí-hömán-DRS ellenanyag ilyen tlpnsn humanizált könnyű láncának megfelelő atsraossvszekvenciát (LM3-típus, 73, azonositószánul szekvencia a szefcyencíalisiáb&n) tartalmazó expressziós plazmidokat tsz alábbiak szerint állítottunk elő:
1) táueisditó oiígooufeíeoridofc szitrtézise bemanbálí TRA-8 (LMdriípus) könnyű láncában lévő, variábilis és konstans régiók előállítására.
Az LM3-polip«ptid-iáncot (73. azonosítószámú szekvencia a szék véne ialtsíábas) kódoló GbíS-f, amely humanizált, TRA-S-jelű, antí-L3R5-ellenanyag könnyű láncának variábilis régiójából és a humán lg kömtyú lánc (xlánc) konstans régiójából álló fúziós fehérjét kódol, PCR-ek kombinációjával szintetizáltak, sorrendben,
7ALiP-n (47, azonosítószámú szekvencia) és ?AI,CN-n (48. azonosítószámú szekvenciái kívül az alábbi lánemdltö oligonuklcótldot szintetizáltuk PCR-hez:
5’- atetágttet cagagatggá gácágacacá aléeígcíat gggtgetgCf gcteígggtt ecagg -3’ (ΜΟ13!ί-'ί; 78. azonostiószámij szekvencia);
cagcacccat agcaggattg ígteígtcíc catetctgag aactagátga gsggatgctt ettaagett -3' (MÖD1R1; 79, 40 azonosítószámú szekvencia);
- 7?~
5’ - etecactggí gacaitgtga tgaceeaaíc tecaagttct itgtctgcat etgtggggga cagggtc -3’ (MDD1P22; 86.. azonosítószámú szekvencia);
S’~ acttggagaí tgggícatca casígteoc agíggageci ggaaeccítga geag-3’ {MÖDÍR22; 81, azonosítószámú szekvencia);
S’-accateaecí gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgelg tagcelggta eeascagaaa ccaggaa -3’ (MODIF3; 82.
azonosítószámú szekvencia);
5S- tacagcagta cecaeaicct gactggcctt gcaggtgatg gígaccctgí eocecaeaga ígcagacaag ga. -3’ (M0D1R3; 83. azonosítószámú .szekvencia);
5— aagcacccaa actccteate lattgggeai ecaeccggea eacxggggtc ccagaíaggt ttacaggcag t -3’ (MOD1P42; 84. 10 azonoslíószáínn szekvencia);
5’- cceagtgígc egggtggatg eccaatagai gaggagt ttg ggtgcítfte etggtítctg ttggkícctíg gc -3’ (MOD1R4; 85.
azonosítószámú szekvencia);
5’- gggtétggga cagactteac ectcaecate tctagtetge agecggagga ttógcaacc tat -3’(MOD1P5: ; 86. azenosltószAarú
Sívh V Ví kv IíS. / v S’- aetagagatg gtgagggiga agyctgjccc sgacceact ζι·:»'ννΐΑν?ΛΛ\ /> x»vv?· g cctgtaaacc tatetgggae -3 ' (MOD1R52: : 87. azonosítószámú
3Λ·ν;Κ Vv-jIv 5>i/j S'« taetgtcágc aaíatagcítg etátéggaég tteggteaí tg. gcaceaaggt ggaaate -3' (MODlPó; 88, azonosítószámú
&Ζ£ΚΥνϊΚ·Ια}« S:X~ cgtccgatsg etgctamt getgaeagta aiaggítgc sá aaatcctccg getgcne -3’ (MÓDI Ró; 89. azonoshószátnú
szekvencia.) aaacggactg iggcigcacc atetgtettc atcttcccgc catctgatga g -3' (ΜΌ.0i F7; $0. azonosítószámú szekvencia);
5’- gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgart iccaccttgg tgccttgace gaa -3' (MOD1R7; 91. azonosítószámú szekvencia); és
5’- agaiíícaac tgcteatcag ntggcgggaa (LR 17; föl. azotmsiíóswtú szekvencia).
2) p€R3, l.T.M3-3-44-plazm«t előállítású (hamanlzált TRA-8 1.-M3-4ipnsá, könny ü láncának klónozása)
LMS-DNS-ft-agmenst amely a 73, azonosítószámú atninosav-szekvetrciáí kódolja, ágy álhtottnrtk elő, hogy 2 lépéses PCR-s végeztttók, egy plazmtó-vekíorba inszertáltnk és £. «A/ha klönossnk, a) Első lépés PCS
LM3-F3I B-DNS-fragínenst, amely szekréciós szignáiszekveneiáí, amelyhez 5'~végén Hindlö-jelü restrikciós hasítohely van hozzáadva, FRL,-et, CDRLj-et. FRLyt, és CDRL>-L F’RL;--aí, CDRLyat, PRL,;-eí és a konstans régió eg.v részletét kódolja, az alábbi körülmények között áShtotiunk elő.
A reakciőoldaí összetétele;
MÓDI Pl lánc indító ohgonnkleoíld, S porol MÓD I RÍ lánc indító olígonukleotid, 5 ptnol
MOD1P22 kbciítdhó oiígönukleoh< 5 ptnol
MOD1R22 iáncindlíó öligosmhleotld, 5 pmel MÓD 1F3 láncíndító oligeúrtkleorid, 5 ptnol MOD1R3 lánc indító oligotmk lentid, S pmól MÖDIF42 láncindító olígomífcleööd, 5 porol
MODIR4 láneindlíó oligertukleorld, 5 ptnol
MODÍF5 láaeindiíö oligestnkleoíid, 5 ptnol ~?8·
MÖD1R52 iáneinditó oligísnukleotid, 5 pmol MÖD IFő láneindíte oligonukleotid, 5 prftol M0D1R6 láúéinditó oligonukleotid, 5 ptnoi MÓD í Ff Iáneinditó oilgonnkleotid, 5 pmol
MÓDIK? íáöcindítóoligonukleotid, 5 pmol
7ALÍP iáttetúditó oligonukleotid, 50 pmol LR 1 7 láncindító oltgonukleotld, Sí) pmol dNTF-kei tartalmazó koktél, 5 pl löxPCR-puftsr, 5 pl ampliTaq DNS-poimteráz (Perktn Elmer), 2,5 egység
A .festi összetételű reakeióoidaí végtóríogasát 5Ö uí-re állítottuk kétszer desztillált vízzel, és PCR-ben alkalmazzuk.
PCR· hőmérsékleti ciklusok körülményei: hevítés 94°C 2 percig, azután az. alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük: 94“C 1 percig, 55°O 1 percig és 7240-2 percig, 3d~xzor ismételjük, majd hevítés 72°C 1Ö percig,
LM3-F3 IC-DNS-fragmenst, amely a konstans régió egy részletét kódolja, amelyhez 3’-végeP EeoRt-jelő restrikciós basítóheiy vas hozzáadva, az alábbi körülmények között állítottunk elő,
A. pSEFDHll-jelö tetnplát-plazmídlíoz az EF Ő 909 816 Al, számit európai szsbadaírnt bejeleníésbett leírtak alapján jirüoítunk.
A reakcióoidat összetétele:
pSRPDHlkjein pl&zmid-DNS, 25 ng
MODlF7-iolü Iáneinditó oligonukleotid, SÖ omol 7ÁLCN-jeíS lánehtdító oiigomAleotíd, 50 psnol dNTP-ket tartalmazó koktél, 5 pl i ÖxFCR -purtér, 5 pl ampliTaq DNS-polhneráz i Rerkitt Elmer), 2,5 egység
A fenti összetételű reakcióoldat- végtértögatát 50 pi-re állítottuk kétszer desztillált vízzel, és PCR-ben alkalmazzuk.
PCR hőmérsékleti' ciklusok körülményei: hevítés 94°Ε 2 percig, azután az aiahbt hőEnérsékleti ciklusokat végezzük: 94°G I percig, 5SaC 1 percig és 72*€ 2 percig, 30~szor ismételjük, majd nevnés 72' V 10 percig,
Az ampllfikák p-NS-iragmeítseket PCR után elválasztottuk 5%-os poiiakrílnrntd-géielektroíórézissek A gélt elektroferézis után megfestettük 1 rigóul etidíunt-bromlddal, hogy az előállított DNS-t IJV-fény alatt detektáljuk. Az igy detektált, snegfelelő DNS-csikokat pengével kivágtuk,
b) Második lépés. J*CR
LM3~DNS-t. amelyben a fentebb leírt LM3-F3Í8-DNS- és LM3-F31C-ÖNS-lrtigrnestseket fozionáljtsk, az alábbi körülmények között állíijuk elő.
A reakcióoidat összetétele:
az első lépés PCR-ben előálirtott, LM3-F31 B-DNS-gélfragmens, az első lépés PCR-ben előállttop, LÁi3-F31C-DNS-géhrsgmens,
7ALIP-jelü Iáneinditó oligonukleotid, 50 prnoi
7ALGN-jeln Iáneinditó oligonukleotid, 50 pmol
-79dNTP-ket psrtaímazó koktél, 5,0 pl lÖxPCR-puffér, 5,0 pl ampiíTaq: DNS-polimeráz, 2,5 egység.
A fend összetételű re&keióoldaí végtérfögaíái 50 pl~re állítottuk kétszer desztillált vízzel, és PCR-ben 5 alkalmaztuk.
ECR hőmérséklet ciklusok: kőrlllínéttyeú hevítés 94®C 2 peréig, azután az alábbi hőmérsékleti eíkiusofcái végezzük: 94*ü ! percig, 55SC 1 percig és 72X7 2 percig, 30-szor Ismételjük, majd hevítés 72X 10 percig.
Az Igy előállított EM3-DhiS-ífagraenst pCR3.i~DHA-píaznűdba iuszeriáltuk „Eukatyotlc TA” klónozó reagenskészlet: (InGírogen) alkalmazásával, a .gyártó használati utasítását követve, es bevittük kompetens A. coo
TOPlöF sejtekbe, amelyet a reagermkészlet tartalmazott. Humanizált TRA-8 könnyű láncát (i..M3-tipns) ködeid DNS* ek nukleoíiíiszekvenciáját dídemxi módszerrel [Sanger. r. S. és mtsai,, Proe. hinti. Átad. Sei. USA 74, 5463-5467 (1977)] igazoltuk, „3700 DhlA Analy/er” berendezés (ABÍ PRÍSM; Perksn Elmer Applied Biosysterns, íttpttn) alkalmazásával.
Az eredményül kapott plazmldok jelölése pCR3.í7LM3-3~44 (humanizált, LM3-típü< TRA-8 könnyű láncának
IS variábilis régióját és egy humán lg könnyű láncának konstans régióját ködoló eöhfS-t tartalmazó plaztnid),.
Az igy elÖálltíöit, LMl-DNS-hagmenst tartalmazó pC;R3.LT,M3-3-44-plazmidct HíndOEEcoRl-jelu restrikciós enzimekkel emésztettük.
pg, pHSG399E>NA-jelű klónozó plazmidőt Hindi 11/EcoRl-jelü restrikciós enzimekkel emésztettünk, és azután CIP-el: defosztbriláltnk Az eredményül kapod, defoszíbriiáh pKSG399-ONA-t és LM3-ONS-írsgmenSi, amelyeket előzőleg HíndlnTEeoRHelű mstrikeiös enzimekkel emésztettünk, ligáitok DNS-iigáeiós reagenskŐszlöí: („DbíA Ligádon Kit, Version 2.Ö, Tákara Sbazo, Co. Ltd.) alkalmazásával Azután E coli DHSo-törzset transzformáltunk a ligáit DNS-el, és ö, í mM IPTG-t, Ű,l% X-öal-t es 50 pgdní klóramfeníkolt (végkoneentrációk) tartalmazó LB-agartáptalajra széiesztettük. Az igy kapott, fehér transzformánsokat 50 pgAml klóramfeníkolt tartalmazó, folyékony LBtápközegben tenyésztettünk, és plazmid-DNS~t extraháltunk az eredményül kapott tenyészetbői, aíkalíkus-SDS-módszer alkalmazásával. Az extrahált plazrmd-DNS-t flmdlUZEcoRI-enzímekkel emésztettük, és azután az EM3-DNS* íragtnenst tartalmazó klóm 1% agaróz-géielektroferézissel vaHsztmtok ki.
A fenti eljárás eredményeként előállítottuk a htmtatuzad LM3, TRÁ-8 könnyű láncának variábilis régiójából és humán IgK-láne konstans régiójából álló, fúziós ífagmenst tartalmazó p:HSGZM3-3-22-plazmidot. A piazmidot tartalmazó, iransztormáns E. törzset, amelynek jelölése & coE DiíSa/^lSötW-3-22, 20ŰL április: 20-án deponáltuk az alábbi intézményben: „internattonal Patent Orgtutistn Depositary, Hátsónál Insthnte of Advanced indusírial Science .and Techaolögy (1-1, Bigasiti 1 chome Tsukuba-sbi,. iharaki-ken, 3f)5-546ö, Japan), a nűkröörgan izmusok deponálását szabályozó, Budapesti Szerződés szerint, és nyilvántartást szánra FERM BP-7564.
3) pSR/LiM[3-3-44-l(Npí»2:mid előállítása (expressziós plazmid hsmamzátf LM3, TRA-8 könny» lánchoz)
A -fentebb leírtak szerint előállított, luunanízált IMI, TRA-8 könnyű láncának variábilis régiójából és humán lgK~íáne konstans régiójából álló, fúziós íragtnenst tartalmazó p.llSGÓM3-3-22-plazmidoí Hindi n/BeoRÍ-jeiű restrikciós enzimekkel emésztettük.
Egy pg pSRPDHH-DNA-jelö klónozó piazmidot (EP 0-909-816,A1. szántó európai szabadalmi bejelentés) HmdlIl/EcoRl-telü restrikciós enzimekkel emésztettünk, és azután ClE-ei defoszíbrilálíuk, Az eredményül kapod, defoszforilált pSRPDHH-DNA-i és pHS>G/M3~3-22 HísdílI/EcoRbenzurtes emésztésével előállított DNS-fragmenst ligáltuk DNS-llgációs reagenskészlet (,,L5NÁ Ligádon Kit, Version 2.0, Tajfcara Shuzo, Co. (..id.) alkalmazásával.
-80Azotán £. coii DHSot-tÖrsset transzformáltunk a ligák DNS-et, és kB-agar-táptalajra széiesztettúk. Az Így kapott írauszibrmáú.s<skaí: WO pgAnl ampiciliiní tattalmazó, folyékony LB-iápközegben tenyésztettünk, és piazmid-DNS-t extraháltunk az eredményül kapóit tenyészetbők alkalik«s-SDS-möds«er alkalmazásával. A pSRPDHH-vektorbaa lévő, kívánt DNS-íragsnens ínszereíóját és orientációját DNS-szekvenálással igazoltuk, gétíszekvencia-ítnöiizátot („AB1
Prisas 3700 típusú DNS-anabzáfor; Applied Biösysteras) alkalmazásávni.
Az «redEttényül kapott, ha:tsmi2.áít LM3, TRÁ-8 könnyű láncát kódoló cDNS-t tartalmazó, expressziós plazmád jelölése pSR/LM3-3-44-I0.
(4.3) A humanizált ellenanyag (tiM4-tipus) könnyű láncának megfelelik expressziós vektor előállítása
A szekvencialísíáhan, a 74. azonosítószámú szekvenciában bemutatottak .szerint, TRA-8-jelü, egéreredetű antl10 fiomán-DRS ellenanyag könnyű láncának megfelelő aminosay-szefcveneia másféle humanizálása (LM4~tipusj céljából a TRÁ-8 könnyű láncának megfelelő amánosav-szekveneia N-terminálisában a 8, aminosavaí (hisztldm), 9, ammosavái {fizlak 1Ö, amínosavat (térűialanin), 11. amínosavat (metionin), 13. aminosavat (íreonin), 20. amínosavat (szerin), 42. aminosavat (glatafciia), 43, ami'nosavát (szerin), 77. aminosavat (&$zp&ragio)s 78. ambtosavsí (vaun), 30. aminosavat (szerin), 83, aminosavat (isiseink 85. aminosavát (aszparaginsav), 99. sminesavaí (glicín), 103. andoosavat (leucin), és
108. aminosavat (alanin) kicseréljük proisnra, szerinre, szermre. leneinra, uianinra, treoninru. bzinre, aianinra. szerűire, leucinra, profinra, feniialaniro. íreoninra, aíutaminra. vaíinra és íreoninra, sorrendben. Az eredményül kapott szekvencia jelölése 1,M4.
TRA-8 jelű, antí-humán-DRS ellenanyag ilyen típusú humanizált könnyű láncának megfelelő aminosavszekvenciát (LMA-tipus, 74. azonosítószámú szekvencia a szekvencialistában) tartalmazó expressziós plazmidokat az:
alábbiak szerint állítottunk elő:
1} Láodndííő ofigomíkleotidok sadstíézBe humanizált TRA-3 (LMd-típus) könnyű láncában lévő, variábilis és konstans régiók előállítására.
Az LM4-polipepijd‘-látícot (74. azőnositöszámú szekvencia a szekvencialístában) kódoló DNS-t, amely humanizált, XRA-8-jelü, anti-ÖRó-eilesumyag könnyít láncának variábilis régiójából és a bmnán lg: könnyű lánc (te25 lánc) konstans régiójából álló fúziós fehérjét kódol, PCR~ek kombinációjával sziideflzáitök, sorrendben.
7Al.lP-n (-17. azonosítószámú szekvenciái é* 7ALCN-n (48, azonositószamn szekvencia), MüDUl-n (78.
azonosítószámú szekvencia;, MÓDIRl-π 679. azonosítószámú szekvenciák MODlF22-n (80. azonosítószámú: szekvenciái; MODÍR22-n (81 azonosítoszamu szekvencia). MODlP.3-n (82. azonosítószámú szekvencia), MODlR3-n i83. azonosítószámú szekvencia), MODÍF42n (S4. azonosítószámú szekvencia), MODsR4-n (85. azonosítószámú szekvencia), MOD'P5-n (86. azonosítószámú szekvencia), MODIR52-n 187. azonosítószámú szekvencia), MODlF7-« i90. azonosítószámú szekvencia), MODtR7~n (9t. azonosttoszmua szekvencia) és i,-R17-a (löl. azonosítószámú szekvencia) kívül az alábbi láneioditó oiigonuiiicotüloí: szintetizáltak FCR-bez:
5'- ttcigícagc áaíaíegcag etateggacg ííeggícaag gcaccaaggt ggaaate ~3! (MOD1FÓ2; 92. azönesítőszámú szekvencia)
5’- egteegatag etgeítdaíí gctgacagáa utaggtígca aaaíeciccg gctgcag -3’ (MÖD1R62; 93. azonosítószámú szekvencia)
2) pCR3.l/LM4-3-3-píazmtd előállítása (Ssamamzsíít TRA-8 LM4-típusú, könnyű láncának klónozása)
i..M4-DN$-ífagmenst, amely a 74. azonosítószámú amínosav-szekvenciát kódolja, úgy állítottunk elő, hogy 2 lépeses PCR-t végeztünk, egy plazmíd-vcktorba inszeríálújk és £. coúba klónoztuk.
a) Első lépés PCR
-sí LM4-F41B-DNS-fragtnenst, amely szekréció» szignálszekvenciát, amelyhez 5’-végén HindlH-jeiü restrikciós basltóbely van hozzáadva, FRLret, CDRLret, FRL3-t, és CDRLM, FRLj-at, CDRFrat, FRL4-et és a konstans régtó egy résztelét kódolja, az alábbi körülmények között áiiitottunk elő,
A reakeióoldai összetétele;
MÓDIF1 lástcindító oíígonukleofid. 5 pmol
MODIRi láncindító oligerrokleotld, 5 pmol
MOBIF22 láncindító oligonukleotid, 5 porol
MOOIR22 iánctnditó oligonukleotid, 5 ptnol
MÓD 1F3 íáneitsditó oligornrkleotsd, 5 ptnol 10 MODIRI láncindító eiigomskleoíid, 5 pmol
MÓDI F42 láncindító oligotutkieoild, 5 pmol
MODIRI láncindító oiigotsukieotld, 5pmol
MODlf 5 láncindító oiigotrnkleoíid, 5 pntöl
MOD1R.52 láncindító oligonnkleotid, 5 pmol 13 MODIF62 íáncínditö oligonnkleotid, 5 ptnol
MODIR62 láítetndiíó oligonukleoíid, 5 ptnol
M0D1F? íánemdító oíigonukieoud, 5 pmol
M0DÍR7 láncindító oligonukleoíid, 5 pmol ? Al. ÍR lánc indító oiígonnkleoítd, 50 ptnol 20 ÍR í 7 lánc indító ollgomddesííd, 50 pmol dNTP-ket tartalmazó koktél, 5 pl
OxPCR-paffct·, 5 pl nroplí'Faq DNS-pöilmeráz, 2,5 egység
A tebti összetételű réákcídóldáí végtéríbgaiát 50 pl-re állítottuk. kétszer desztillált vízzel, és PCR-ben 25 alkalmazzak.
.FCR hőmérsékleti ciklusok körülményei; hevítés 94“C 2 percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük: 7ÁC 1 percig, S5*C 1 percig és 725C 2 percig, 30-szor istnételjük, majd hevítés 72Aé 10 percig.
LMd-FálC-DNS-fragmenst, amely a konstans régió egy részletéi ködo|a, amelyhez 3’-végén BcöRí-jelö restrikciós hasitóheiy van hozzáadva, az alábbi körülmények közöst iUiömtsmk elő.
A p$RPDHH~jeiá terápiát-pia/midhoz az FF 0 009 Rió AF számú sátrópai szabadálixri, bejeiéptésbeu kúriák alapján juttoPiuík.
A reakcióoldat összetétele: pSRFDHH-jehi píazmsd-DNS, 25 ng MÖDÍF7-jelu láncindító oligonukleoíid, 50 ptnol 7ALCN-jelö láncindító oligonukleoíid, 50 pmol dN'FP-két tartalmazó koktél, 5 pl 1 ÖxFCR-puffer, 5 pl ampiíTaq DNS-poiitúeráz, 2,5 egység
Á lenti összetételű reakcióoldat végíériogatát 5Ö pl-re állítottuk kétszer desztillált vízzel, és FCR-feen alkalmazzuk.
PCR hőmérsékleti ciklusok körülményei: hevítés 94ÖC 2 percig, azután az alábbi hőmérsékleti eíklnsokat végezzük: 94ÖC 1 percig, 55®C: 1 percig és 72°C 2 percig. 30-szor ismételjük, majd hevítés 72°C 10 percig.
Az amplifíkált DNS-fragdtensekeí PCR. után elválasztottuk 5%-ss poliakrilaínid-géleiekdoforézlssél. A gélt elekiroforézss után meglestettük 1 dgónl eíidium-bromsddal, hogy az előállított DNS-t UV-feny alatt detektáljuk. Az így detektált, megfelelő DN'Sreslkokat pengével kivágtuk.
b) Második lépés PCR
1M4-DNB-Í, Melyben a fentebb leírt LM4-F41B-DNS- és LM4-E4 iC-DNS-fragmensekeí fuzionáljuk, az alábbi körülmények között állítják elő.
A reakcióddal összetétele:
az első lépés PCR-ben előállított, ÍJVh1~E41 B-DNS-géllragmens, az. első lépés PCR-feen előállított, LM4 -F41C-DNS-gél í'ragmens,
AL IP· jelű lánc indító oligonnkleoíid, 50 pmol ?Al..,CN~jeíü láneinditő olígoouk terűid, 50 pmol dNTP-ket tartalmazó koktél, S,Ö pl löxPCR-pulfer, 5,0 pl ampiiTaq DNS-poiimeráz, 2,5 egység,
A férni összetételű reakcióoldaf végíérfogatáí 58 pl-re állítottuk kétszer desztillált: vízzel, és PCR-ben alkalmaztak.
BCR hőmérsékleti ciklusok körülményei: hevítés 94®C 2. percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük: 94°C 1 percig, 55ÖC 1 percig és ?2:°C 2 percig, 38-szor ismételjük, majd hevítés 72A7 18 percig.
Az így előállítod i,M4-DNS-fragmenst pCR3.!-DNÁ-plazmidha mszertálíuk „Eukaryotie TA klónozó magenskészlet (Invítrogen) alkalmazásával, a gyártó használati utasítását követve, és bevidük kompetens & colt TÖP1ÖF’ sejtekbe-, amelyet a reagenskészlet tartalmazott. Humanizált TRA-8 könnyű láncát {LM4-ö'pus) kódoló DNSek nukteotidszekvenerájái ditlezoxí-Rtődszerml {hangét; F. S. és aitsai, Proe. Natl. Aead. Sel. USA 74, 5463-5467 (1477)] igazoltuk, „3788 DNA Analyzer'’ berendezés (AB1 RR1SM; Ferkm kimer Applied öiosystems, fapan) alkalmazásával.
Az eredményükkapott piazmidok jelölése p€RXl/:EM4-5~3 (humanizált, LM4-tlpusú, TRA-S könnyű láncának variábilis régióját és egy humán lg könnyű láncának: konstans régióját kódoló eDN'$-t tartalmazó plazmid).
Az így előállítod, í,M4~DNS-b'agmenst tartalmazó pCfL>.17i.,M4-5-3-plazmidöí Blndlíf/BcoRl-jehl restrikciós enzimekké 1 emésztettük, i pg, pHSG399DNA-jelű klónozó plazmidot iiíndíii/EeoRi-jelü restrikciós enzimekkel emésztettünk, és azután ClP-el defoszíoríláttuk, A2 eredményül kapod, defoszlbriláit pHS6399-i.>NA~í és l..M4-í.)NS-ífagmensí, amelyekei előzőleg HindlH/EcoRl-jeiű restrikciós enzimekkel emésztettünk, ligáitok DNS-bgációs reageoskészier („DNA Lígatíon Rst, Version 2.0, Takara Shuzo, Co. idd.) alkalmazásával. Azután R. eo(r DH5«.-tőtzset ír-utszformálmnk a ligáit DNS-el, és 8,1 m.M IPTG-t. 8,1% X-öal-t és 50 pg/mi klóram fen lkok (végkoncentrációk) tartalmazó LB-agartáptalajm széfosztettük. Az így kapód, (ebét trímszformárisokst 50 pgAmi klőratnfonikoit tartalmazó, folyékony LBtápközegben lenyésrtedünk. és ptemiá-ÖNS-t extraháltunk az eredményit! kapott tenyészetből, alkabküs-SDS-toódszer alkalmazásával. Az extrahált plazmid-DNS-t Ilindlll/EcoRl-enziínekkei emésztettük, és azután az LM4-DNSfragmesst tartalmazó Móni 1% agaréz-géfolektroforézíssel.választottak fel
A fenti eljárás eredményeként elöáiiítoduk a humanizált LM4, TRÁ-8 könnyű láncának variábilis régiójából és hasisán Igtc-lánc konstans régiójából álló, fúziós fhtgmensí tartalmazó pl-iSG/M4-5-3-l-piazmidöt. A pfazsnídot: nsrtalreazó., trasrszRsrmáns £. coli törzset, amelynek jelölése E. eelí DH5eMpH.SG/M4-5~3-l, 2001. április 26-án deponáltuk az alábbi intézményben: „íníemaíional Patent Organism Deposltísn', National Instítute of Advanced indusírsal Science and Teckoölögy’’ (i-1, Higashi 1 cbome Tsukuba-sbi, fbaraki-ken, 36S-546Ő, JapanS, a snikroorgauizsreistsk deponálását szabályozó, Budapesti Szerződés szerűit, és nyilvántartási száma FERM BP-?5ő5.
3) pSSI/LM4-S-3~3-plazsfdd előállítása (expresszJös piazmfd husnani/á 111,M4> TRA-8 kütsityű lánchoz)
A fentebb leírtak szerint előállított, humanizált LM4, TRA-8 könnyű láncának variábilis régiójából és homárt igk-láne konstans régiójából álló, fúziós fragtnenst tartalmazó pl<S<.i/M4-5-3-l-plazmidoí HindlIlTeoRI-jelu restrikciós enzimekkel emésztettük.
Egy pg pSRPDHH-DNA-jelü klónozó piazmidot (EP Ö-9Ö9-816.A1. számú európai szabadalmi bejelentés) Hiítdklb'EeoRl-jelÓ restrikciós enzimekkel emésztettünk, és azután ClP-ei defbszfóríiákuk. Az eredsisényű) kapott, defoszforüálí pSRPDfS-l-DNÁ-í és pHSG/M4-5-3·-1 Hindkii/EcoRl-ertziínes emésztésével előállított iTNS-ifagmeust feálíuk BNS-ligáeiós reagenskészleí („DbiA Ligádon Kit. Version 2.0, Takara Shuzo,. Có. Ltd.) alkalmazásával. Azután coli Df-iSer-íörzset Irsrsssforusáltisnk á ligák DNS-el, és ES-agar-tápialajra szétesztettük. Áz Így kapott transzlbrmánsökat 161) pg/ml ampscilliní tartalmazó, folyékony LR-tápkbzegben tenyésztettünk. é\ plazmíd-DNS-í extraháltunk az eredményül kapott tenyészetből. alkálik us-SDS-reódszer alkalmazásával, A pSRPDsll-Lvekíorban lévő, kívánt DNS-íragmesis Inszereióját és otiemáeióiái DMS-szekvenáiással igazoltak, génszekrencsa-analízátor („AB! Prissn 37ÖÖ” típusú DNS-analizátor: Applied Bíosyssems) alkalmazásával,
Áz eredményül kapott, humanizált EM4, TRA-8 könnyű láncát kódoló cDNS-t tartalmazó, expressziás pkszmtd jelölése pSR/EM4-S~3-X (4.4) Á husnanizált ellenanyag (LMS-tipus) könnyű Sáncának snegfdeiö, expresszíós vektor előállítása A szekvenciafistáháö, a 75. azonosítiíszánstí szekvencíábslts héjpütatótíak szerint, TRA-8-jelű, egéreredetü areihtmián-DRA éfleremyag könnyű láncának megfelelő aminosav-szekveneia másféle humanizálása (LMS-tipus) céljából a TRA-8 könnyű láncának: megfelelő aminosav-szekveneia N-tenninálísáhan a 8. aminosavat (hisztidink 9, smínosavat (lizis), lü. ammosavat (fénilaiasis), 11. aminosavaí (meíkmm}, 13. aminosavat. (treonin), 20, aminosavat fszerin), 42.
amínostsvaí (gluíasnin), 43. aminosavat (szerin), 77. aminosavat (aszparagin), 78. auiinosavat (vaíin), 86. aniinosavat (szerin), 83. asnitsosavat (lenéin), 163.. aminosavaí: (leucln), és 508. audnosavat faiamn) kicseréljük proféira, szerbire, szerinte, ieueinra, alanmra, treonínra, ilzisire, alaninra, szerbire, ieueinra, profínra, ferelaianiura, vallóra és treouinra.
sorrendben. Az eredményül kapott szekvencia jelölése EM5.
TRA-8 jelű, asüi-humán-OR5 ellenanyag: ilyen típusú hupsauszált könnyű láncának snegíélelő aminosavszekveuciát <LM5-tspus, 75. azonosítószámú szekvencia a szék vénéi alistában) tartalmazó expresszíós plazmidokat az alábbiak szerire álíitotamk elő:
1) Láncinditó olsgounkleoísdok szásiiézisc humanizált TRA-8 (LAf 5-típ«s) könnyű láncában lévő. variábilis és konstans régiók előállítására.
.Az LM5-poÍÍpeptid-láneot (75. azonos Itőszámü szekvencia a szekvencíalisláóaa) kódoló BNS-t, amely humanizált, TRA-8-jelis, antí-DRS-ellenasyag könnyű láncának variábilis régiójából és a humán lg könnyű lánc (telánc) konstans régiójából álló fúziós feliérj ét kódol, PCR-ek .kombinációjával szintetizáltak, sorrendben,
7ÁLiP-n (47. szónositőszámú szekvencia) és 7ALCN-» (48, azonosítószámú szekvencia), MöOiFI-n (78. azouosííószáraú szekvencia), MÖDlRl-n (79. azonosítószámú szekvencia), MÖEsiP22-n (80. azonosítószámú szekvencia); MÓD 1 R22-n (81. azonos!főszám ú szekvene la), MÓD 1F 3-n (82. azonöshószátaú szék verse la), MÓD 1R3 -n • 84(83. azonosítószámú szekvencia), MÖD1F42-n (84. azonosítószámú szekvencia), MOE)íR4-n (85. azonosítószámú szekvencia), MODiF5-n (86. azonosítószámú szekvencia}, MOD!R52-n (8?. azonosítószámú szekvencia), M0DlF7-n (90. azonosítószámú szekvencia), M0D1R7-U (91. azonosítószámú szekvencia) és l,RI?-n (lói. azonosítószámú szekvencia) kívül az alábbi iáncindltó oligonnkleotidoí szintetizáltuk PCR-bez:
5 ’ - gggtetggga eagacítcac cctcaceatc tetagíctgc agecggagga ttttgcagat tat -3'’ (MÓD 1FS2; 94, azonosítószámú szekvencia)
- ttcigtcage aataíagcag ctatcggacg iícggtggag gcaecaaggt ggaaatc -3’ (MÓD í F63; 95. azonosítószámú szekvencia)
5’- cgtccgatag ctgetatatt gctgacagaa ataaíctgea aaateeteeg gcígcag -3' (MOD1R63; 9ő. azonosítószámú lö szekvencia)
5’- gaagatgatsg acsgtrtggig cagccacagl ccgtitgatt tceaccttgg tgcctccacc gaa-3’ (MOD1R72; Í02. azonosítószámú szekvencia)
2) pCR3, ÍZLM5kM2~plaz8«d előállítása (humanizált TRA-8 LMlS-típnsú, könnyű láncának klónozása)
EMS-DHS-fegmensí, -amely a 75. azonosítószámú amínesav-szekvenciát kódolja, úgy állítottunk elő, hogy 2 15 lópéses PGR-í végeztünk, egy plazutid-vekíorba mszertáltuk és £. eoiiba klónoztok,
a) Első lépés PCR
LMÓ-FSíS-DNS-frsgntensí, atncly szekréciós sziguáiszckvencsák amelyhez S’-vcgétt i-iútdíil-jciú restrikciós hasítóhely van hozzáadva, FRI,;-et, CDRLpet, FRi..>-t, ás CDRLj-t, FRLi-ai, CDRlj-at, FRDj-et és a konstans régió egy részletét kódolja, az. alábbi körülmények közölt állítottunk eíö,
A reakcióoídat Összetétele:
MÓD;Fi láneínditőoligonnkleotid, 5 pmol
MODÍRÍ Iáncindltó oiigonukleoiid, 5 ptnol
MÖD1F22 láncinöiló oiigonukleoiid, 5 pmol
MÓDI R22 iáíípindítö oligonnkleotid, 5 pmol 2.5 MÓD i F3 lánemd hó oligenükleoiid, 5 pmol
M0DIR3 Iáncindltó oligonukicotid, 5 pmol
MODIF42 iáneíndíló oligonukicotid, 5 pmol
MÖDlR-l iáncindltó oligonukicotid, S pmol
MDD1F52 láneínditó oligonukicotid, 5 pmol 30 MODí R52 iánemdltó oligonukicotid, 5 pnsoi
MODÍkó.3 !áíicin<htó oligotiuk lentid, 5 pmol
MÓDIRó? láneínditó oligonukicotid, 5 pmni
MOD1F7 láneínditó oligonukicotid, 5 ptnol
MODIR72 láneínditó oligonukicotid, 5 pmni 35 7AL1P Iáncindltó oiígointkieo-id, 50 pmni
R17 lancindítóoligottukleótíd, óÖpmöi dN1 P-kcí taríaitnazó koktél,: 5 pl lÖxPCR-pui'íer, 5 pl ampÜTaq DNS-polimeráz (Perk.in Elmer), 2,5 egység
A leüti összetételű renkcióöldaí végtérfogatát 50; ul-re állítottuk. kétszer desztillált vízzel, és PCR-bett
- 85 alkalmazzuk.
PCR hőmérsékleti ciklusok körülményei: hevítés 94T 2 percig, azután az alábbi hőmérsékleti «Iklusokat végezzük: 94°C 1 percig, 5S*C 1 percig és ?2°C 2 percig, 30-szor ismételjük, majd hevhés 72aC 10 petcla.
LM5-F5IG-DMS-á»gmenst, amely a konstans régió egy részletét kódolja, amelyhez 3'-végén EeoRI-jeíü 5 restrikciós hasstóhely van hozzáadva, az alábbi köróbnények között állítottunk elő. A pSRPDHH-jeiS tsmpláfplazmidhoz az EP 0 909 8 íé A I. számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak alapján jutottunk.
A reakcióoldaí összetétele;
pSRPDHH-jelft plaznud-DNS, 25 ng
MÓDIÉ?-jelű láncmdlto oligonukleotid, 50 pmol
7AI-CHdelű láneindító obgonukleotid, Söpmul dNI'E-ket tartalmazó koktél, 5 pl I öxPCR-pntiér, 5 μ! ampliíáq DNS-pAxícráz. 2,5 egység
A: feni! összetételű teakdőoldat végtérfogatát 50 pl~re állítottuk kétszer desztillált vízzel, és PCR-ben alkalmazzuk.
PGR hőmérsékleti ciklusok körülményei: hevítés 94°C 2 percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük: 94°C 1 percig, 55°C I percig és 72°C 2 percig, 30-szor ismételjük, majd hevítés 72°C 10 percig.
Az amplifíkált DNS-fragmenseket PGR után elválasztottuk SW-os pohakrdamid-géleisktrotbrézlssei. A gélt elektroferézis után megfestettük: 1 pg/ml etidinm-bromiddak hogy az előállított DNS-í IJV-féuy alatt detektáljuk, .Az így detektált, megfelelő DNS-cslkokat pengével kivágtuk, b) Második lépés FCR
LM5-DNS~t, amelyben a fentebb lein. L:M5-F5ÍB-DNS- és LM5-F5 IC-DHS-feagmenseket fuzfenáijuk, az alábbi körülmények között állítjuk elő.
A reakcióoldaí összetétele:
az.első lépés PCR-ben előállított, LM3-E51 B-DNS-gélíragmens, az első lépés ECR-ben előállított, LMS-fölC-DNS-gélfrugínens,
7AÍ, 1 P-jeln láneindító olígonukfedtid, 50 pmol
7AI.GN-ie;ű láneindító oligonukleotid:, 50 pmol dNTP-ket tartalmazó koktél, 5,0 pl löxPCR-pnífér, 5,0 pl ampliTaq ONS-polimeráz, 2,5 egység.
A fenti összetételű reakeióöldaí végtérfogatát 50: pl-re állítottuk kétszer desztillált vízzel, és RCR-beu alkalmaztuk.
FCR hőmérsékleti ciklusok körülményei: hevítés WC 2. percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük; 94°C 1 percig, 5S°C 1 peréig és 72°C 2 percig, 30-szor ismételjük, majd hevítés 72°C 10 percig.
Az Így előállított LM5-DNS-hugnteitsl pCR3,.í-DNArplszmidba. inszedáituk „Eukstyotic TA” klónozó reíigenskészlet (Ínvitrogen) ídkalmazásávak a gyártó használati utasítását követve, és bevittük kompetens £ eofí TOPlöE’ sejtekbe, amelyet a reagenskészlet tartalmazott, ifamanizáh TRA-8 körmyű láncát iLM5-(lpus) kódoló DHSek nukleotidszekvenciáját didezoxt-módszerrel [Sanger, F. S, és mtsai., Proc. Háti. Acad. Sei. USA 24, S4Ő3-54Ó7
40' (1977)]: igazoltuk, ,3?ŐŐ DHA Analyzer” berendezés (AŐl PRISM; Rerkin Elmer Applied Ríosystsms, Japan)
-86alkaltnazásávaL
Az eredményül kapod piazmidok jelölése pCR3, !,<t,M5-3'-42 (humanizált, LM5-típusa, TRA-8 könnyű láncának variábilis régióját és egy hantán lg könnyű láncának konstans régióját kódoló cDNS-t tartalmazó plazmid).
Az így előállított, LMS-BNS-fragmesst tartalmazó pCS3.1/LM5-3-42-plazraidoí HfedOíZEceRtjelü restrikciós 5 enzimekkel emésztettük.
pg, pi-!SG399DNA-jeiü klónozó plazmídot ΙΙίηόΗΡΈεοΕ,Ι^Ιΰ restrikciós enzimekkel emésztettünk, és azután ÖP-el defoszforiiáltuk. Az eredményül kapod, defoszforilált -pHSö399-DNA-t és LM5-DNS-fragme'nst, amelyeket előzőleg blmdíRTRcoRlJelő restrikciós enzimekkel emésztettünk, ligáitok HNS-ligációs reagenskész.iet („BNA Ligaííon Kik Version 2,0, Takara Shuzo, Co. kid.) alkalmazásával. Azután £. z-oő DHSíi-tórzset íranszformálrtmk a
ÍÖ ligáit DNS-ei, és 0,1 raM fPTört, 0,1% X-öul-i és 50 pg/ml klóramfenikoit ívégkoncentráeiók) tartalmazó LS-agaríápíalajra széleszieüük. Az így kapott, fehér transzíórntánsokat 58 itgrtrol klórandeníkolí tartalmazó, folyékony 18tápkőzegben tenyésztettünk, és plazmid-DM S-t extraháltunk az eredményül kapott tenyészetből, alkalíkus-SDS-módszer alkalmazAsával. Az extrahált plazmid-DNS-t Bindíil/líeoRí-enzimekkel emésztettük és azután az LM5-DNSíragmeirtí tartalmazó kiónt 1% agarőz-géieicktrotörézissei választottuk ki.
1.5 A fenti eljárás eredményeként előállítottuk a humanizált LM5, ÍRA-8 könnyű láncának variábilis régiójából és humán igs-lánc konstans régiójából álló, fúziós fragmenst tartalmazó pHSö/'M3-3-27-plazmidöt
3) pSíVkM>3-27-l-ph!zmid előállítása (expresszíós plazmid humanizált LMS, TRA-8 könnyű lánchoz)
A fentebb leírtak szerint előállított, htmramzált IMS, TR'A-8 könnyű láncának variábilis régiójából és humán
Igx-lánc konstans régiójából álló, fúziós fragmenst tartalmazó pHSG/M5-3-2?-piazmídot HindiB/EcoRl-jelü restrikciós
2Ö enzimekkel emésztettük.
Egy pg pSRRDEH-DNA-jelü klónozó plazmidoi (ER 0-909-81Ő.A1. számó európai szabadalmi bejelentés) Hindi ll/EeoRl-jeiü restrikciós erómekkel esttóteftünk, és azután CiE-ei deíoszíoriláirttk. Az eredményül kapóit, defoszforilált pSRPDHH-ÖNA-t és pHSG/MS-2-27 HindtíEEcoRLeuzémes emésztésével előállított DKS-ífagmenst ligáitok DNS-ligácíós reagenskészlet („DNA Ligádon Kit, Version 2,0, Vakara Shuzo, Go. Ltd.) alkalmazásával,
Azután £. évii Díi5«-törzseí transzformáltunk a ligáit DNS~el, és LR-agar~táptaiajra szélesztettök. Az így kapott íranszlbrmánsokai. 1Ü0 pg/ml ampiclllini tartalmazó, folyékony LB-tápközegben tenyésztettünk, és plazmid-DHS-t extraháltunk az eredményül kapott tenyészetből, alkalikus-SOS-tttódszer alkalmazásával. A pSRPDHH-vektorban lévő, kívánt BNS-fragmens ínszercíóját és orientációját DNS-szekvenálássat igazoltuk, génszekvencía-analizátor („ARI Rrism 370Ö típusú DNS-analizátor: Applied Biosystems) alkalmazásával.
Az eredményül kapott, humanizált L.M5, TRA-S kötmyü láncát kódoló cDNS-t tartalmazó, expressziós plazmid jelölése pSR/LM5-3-27-l.
(4,5) A humanizált ellenanyag (kíméra típus) könnyű láncának megfeieSö, expresszlós vektor előállítása
A szekveneialistában a 76. azonos kószámét szekvenciaként bemutatjuk kintiéra típusú TRÁ-k-eliettanyag könnyű láneáoak megfelelő andnosav-szekveueiáí, amelynek jelölése LMfs.
TRA-8 jelű, antt-humáft-DR5 ellenanyag ilyen típusú humanizál! könnyű láncának megfelelő aminosav·· szekvenciát (LMó-tipus, 75, tszonositószámá szekvencia a szekveneialistában) tartalmazó expresszsós piazmsdokat az, alábbiak szerint állitottunk elő::
1) Láneinditó ohgsmakkoíúfok szintézise humanizált T.RA-8 (LMó-tipus) könnyű láncában íévőj, variábilis és konstans régiók előállítására.
Az LMö-polipeptííMáncot (75. azonosítószámú szekvencia a szekveneialistában) kódoló DNS-t, amely humanizált WA-8-jélö, egereredeiö anít-DRü-ellenanyag könnyű láncának variábilis régiójából (LMő-tipus) és a humán lg kSanyö lánc (κ-láncj konstans régtójából .álló íhzíós fehérjét kódol, PCR-ek kombinációjával szintetizáltuk, sorrendben.
7AElP-n (47. azonosítószámú szekvencia) és 7ALCN-n (48, azonosítószámú szekvencia) kívül az alábbi 5 Íáneindíto oligonnkíeotídot szintetizáltuk PCR-hez:
5’- tgatgtggac atga&ítígt gagaétgggt catetícaatg tcsceagtgg a -3’ (liKSPRI 3; 97'. azonosítószámú .szekvencia);
5’ - tgggttccag gcíccaetgg ígaeattgtg atgacceagt cteaeaaatt e -3' (MVF11; 98. azonosítószámú szekvencia);
5’- aagacagatg gtgoagccac agcecgtttg alticcagct íggtgeete -3’ (MVR11; 99. azonosítószámú szekvencia); és
S’;- aágetggaaatcaaaeggge tgtggctgca ctalclgíct teste -3’ÍMCPi 1; iöö. azonosítószámú szekvencia), lö 2) pCRS.i/Lbló-l-í ó-plítzmsd előállítása (bnnnsnktóh TRA-8 LMb-tipusú, könny» láncának klónozása)
LMö-DNS-fegtnenst, amely a 75. azonosítószámú ammosav-szekveoeiát kódolja, úgy állítottunk elő, hogy 2 lépéses PCR-t végeztünlí, egy glazmid-vektorba ínszertáltók és A. en/tba klónoztak.
aj Első lépés FCR
LMő-FI-DNS-iragtnenst, amely szekréciós szignálszekvenciái és az FRL:-régió egy részletéi kódolja, 5’-végéti 15 Hlndíll-jelŐ restrikciós hasítóhely van hozzáadva, az alábbi körülmények között áliííohunk elő. A pHSGHMI?- és pSRPí.hllj-jciü terapláí-plazmidokhnz az, EP Ö 909 816 ΆΙ. számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak alapján jutunk.
A reakeióoidat összetétele; pIlSGil'MI 7-jelü plazmid-DNS, 25 tsg
7AL ÍP íáneindíto olígostnkleoíld, 50 psnol
HKSPRI3 Íáneindíto oligonnkleotid, 50 pmol d.Nl P-ket tartalmazó koktól, 5 μΐ • OxlfetR-pníTcf, 5 ttl amplíTaq DNS-pohmeráz (Perkin Elmeri 2.5: egység
A lenti összetételű reaketóoldat vegieriógstáí 50 pUe állífodok kétszer desztillált vízzel, és PCR-ben alkalmaztuk.
PCR. hőmérsékleti ciklusok 'körülményei: hevítés 94°C 2 percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusukat végeztük: 94°C 1 percig, 55°C 1 percig és 72°C 2 percig, 30-szor ismáícltnk, majd hevítés 72°C 10 percig.
I,Mö-E2~DNS-b-agmenst, amely FRLi, CDRL|, P'RL;, CDRL.j, 1RL5, CDRL5, FRL» egy részletét és a konstans 30 régió egy részletétkódolja, ez alábbi körülmények között állítottuk elő.
A reakeióoidat oss 'Ctotele: pU.S-jeiü plazznid-DblS, .25 hg:
MVF13-jelű láncíndító oligoímkleoiiá, 56 pmol MV Rí 2-jelű láncmdiíö oligonukleotid, 50 pmol íiNTP-ket tartalmazó koktél, 5 μΐ
ÖsPCR-pnfíer, 5 pl amplíTaq: DNS-poiimeráz, 2.5 egység
A fenti összetételű reakeiőöldaí végtérfogaiát 50 pí-rs állítottuk kétszer desztillált vízzel, és PCR-ben alkalmazzuk.
PGR hőrnérsékieti ciklusok körtlhnényei; hevítés 94®C 2 percig, azután uz alábbi hőmérsékleti ciklusokat
-88végezzük: 94nC í percig, 55°C 1 petéig és 72ftC 2 percig, 30-szor ismételjük, majd hevítés 72°C 10 percig.
LMő-FEDNS-fragmenst. amely FRÍ..,-régió egy részíeié! és a konstans régió! kódolja, amelynek d’-végén
EeoRTjelö restrikciós hasítóhely van hozzáadva, az alábbi körülmények között állítottunk elő.
A reakcióoldat összetétele:
S pSRPDKH-jelű plaznud-DNS. 25 ng
MCFÍ 1-jelsí láneinditó oligosuskleotid, SÖ pmol 7Al,CN-jeiö láneinditó ölígonukleoíkl, 50 prnoi dNTP-ket tartalmazó koktél, 5 pl Í ÖxPCR-pnS'ter, 5 pl
0 ampiíTap DNS-gohmeráx, '2,5 egység
Á fenti összetételi! reakcióoldat: végíérfogatát 50 pl-re állitottnk kétszer desztillált vízzel, és PCR-ben alktdmazzuk.
PCR hőmérsékleti ciklusok körülménye!: hevítés 94°C 2 percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük: 94*€ 1 percig, 55°C I percig és 72T 2 percig, 39-szor ismételjük, majd hevítés 72*C 10 percig,
Az ampltfskáií DNS-fragmenseket PCR után elválasztottuk 5%-os poliirkrilamíd-gélelektroforézissek A gélt elektrolbrézís után megfestettük 1 pg/ml etídiam-bromtddal, hogy az előállított DNS-t UV-fény alatt detektáljuk. Az így detektált, megfelelő DNS-csikokat pengével kivágtuk,
b) Második lépés PCR
LMŐ-DNS-t, amelyben a fentebb leírt LMÓ4T-DNS-, LM6-T2-DNS- és LM6-F3-DNE-tragntcnsekeí fuzionáljuk, az alábbi körülmények között állítjuk elő,
A reakcióoldat összetétele:
az első lépés PCR-hen eiöálliíötí, LMó-Fl-DNS-gélfragntens, az első lépés PCR-ben előállított, LMóF2-BNS-gélfragrnenst az első lépés PCR-benelőállított, EMó-E3~BNS-géÍifagmeas,
7ALlP-jelü láneinditó olígfönukieotiá, 50 pmol
7ALCN-jelő láneinditó oligonukieotid, 50 pmol dNTP-ket tartalmazó koktél, 5,0 p| löxPCR-poffer, 5,0 pl amplí'Taq DNS-polímeráz, 2,5 egység.
A fenti összetételű reakcióoldat végtérfogatát 50 ui-re állítottak kétszer desztillál? vízzel, és PCR-ben alkalmaztuk.
PCR hőmérsékleti ciklusok körülményei: hevítés 94°C 2 percig, azután az alábbi hőmérsékleti ciklusokat végezzük: 94°C í percig, 55CC 1 percig és 72’C 2 percig, 30-szor ismételjük, majd hevítés 72eC 10 percig.
Az igy előállított LMó-DNS-fragmenst pCR3. i-DNA-plazmídba ínszenálluk „Eukaryoiíe TA” klónozó reagenskésziet (Invitrogenl alkalmazásával, a gyártó használati utasítását követve, és bevittük kompetens «?// TOPÍÖF’ sejtekbe, amelyet a reagenskészlet tartalmazott. Plnmaulzált TRA-8 könnyű láncát kódoló DNS-ek nukleotidszek venctájáí didezoxí-módszerrel igazoltak, DNS-anaiízátor alkalmazásával.
Az eredményül kapott piazmidok jelölése pCR3.ll,M6-l 16 (egéreredetű TRA-8 könnyű láncának variábilis régióját és egy humán lg könnyű láncának konstans régióját kódoló cDNS-t tartalmazó piazmtd},
Az így előállítóit, LMÓ-DNS-fragmensí tartalmazó pCR3.1/LM6-1-i6~pi8zmidoí HindlIÍ/EeoRl-jelü restrikciós enzimekkel emésztettük.
p.g, pKSG399DhiA-jelü klónozó piaznridot Lhndiil/EcoRtjeíü restrikciós enzimekkel emésztettünk, és azután ClP-el defoszforitáliuk, Asr eredményül kapott, deföszforiláh: pRSG399-Dbl A-t és LMó-öhlS-lragmenst, amelyeket előzőleg HindííbbeöRljeiü restrikciós enzimekkel emésztettünk, íigéltuk DNS-ligáciős reagenskészleí („DNA
Ligádon Kit, Version 2.0, Takara Shuzo, Co. Ltd.) alkalmazásával, Azután A. coli DH5o-törzse· transzformáltunk a ligáit DNS-et és 0,1 rnM IPTG-t, 9,.1¾ X-Gal-í és 50 pgfel kióramfenikolt (vegkottoentráeiók) tartalmazó LB-agaríáptalajra szeiesztetíük. Az így kapott, lekér transzformánsokat 50 pgó'm! kiőrarnfeníkolt tartalmazó, folyékony LBtápközeghen tenyésztettünk, és plazmid-DNS-t extraháltunk az eredményül kapott tenyészetből. aifcalíkus-SDS-módszer alkalmazásával. Az extrahált pbzmsd-DNS-l HindlH/keöRl-enzímekkel emésztettük, és azután az LM6-DLÍSH) fragmenst tartalmazó kiönt ITeagsiróz-géleiektroforézissel választottuk ki,
A fenti eljárás eredményeként előállítottuk az egéreredetü TRA-8 könnyű láncának variábilis régiójából és humán ígx-láne konstans régiójából álló, fúziós ífagmens; tartalmazó pfiSG/Mó-M-l-pkizznidoí. A plaztnidot tartalmazó, transzfonnáns £, caii törzset, amelynek jelölése S. coh DHJa/pHSCnWl-M-t, 2001. április 20-án deponáltuk az alábbi intézményben; Jniernationai Patent örganísm Depositary, National fnstítute of Advanced industriai Science and Technology'’ (1-i, Hlgashl i ehetne Tsukuha-sht, Iharaht-ken, 305-5406, Japan), a mikroorganizmusok deponálását szabályozó, Budapesti Szerződés szerint, és nyilvántartási száma FERM BP-7566.
3) pSR/LM6~1-4-ó~píaz.nrid ekiáliiíása (expresszíós piazmíd kiméra típusú LMő,.TRA-8 könnyű lúneStoz)
A fentebb leírtak szerint előállított, egéreredetü TRA-8 könnyé láncának variábilis régiójából és humán IgK-lánc konstans régiójából álló, fúziós fragmenst tartalmazó pj ISG/LMiS-M-1-piazmidot HiadíH/EcoRl-jelÖ restrikciós 20 enzimekkel emésztettük.
Egy pg pSRLDllií-DNA-yeiü klónozó: piazmido? líisdHLT,eoRI jelű restrikciós enzimekkel, emésztettünk, és azután CiP-el de&szíötiiáibik. Az eredményül kapott, defpszforiiáli pSRPDHH-DHA-t és pRSG/LMó-1-4-1 Hindín/EcoRI-enzimes emésztésével előállholt l.lNS-bagmenst ligáitok DNS-Itgáeíós reagenskészlet („DNA Ligádon Kit, Version '2.9, Takara Shüzo, Co. Ltd.) alkalmazásával. Azután £ caií DK5o.~íörzset ttanszibrtnálütok a ligáit DNS25 el, és LR-agar-tápíalajra széiesztettük. Az így kapott iraaszibrntánsokaí 109 pg/'mi antptdliinf tartalmazó, folyékony LB-inpközegben tenyésztenünk, és plazmid-DNS-t extraháltunk az eredményül kapott tenyészetbök aikalikus-SDSmódszer alkalmazásával. A vektorban lévő, kívánt DNS-ifagmens inszereiőjáí és orientációját BNS-szekvenáiássai Igazoltuk, génszekvencia-anaíizáíof alkalmazásával.
Az eredményül kapott, TRA-8. könnyű láncát (kiméra típus) kódoló cDNS-t tartalmazó, expresszíós plazmtd jelölése pSR/LMö-i-4-ö.
(5) Néhány típus humanizált vagy kiméra TRA-S-eíteusnyag előállítása
COS-7-sejtek transzfekcióját FUGBNBő iranszlekeiós reagenst alkalmazó módszerekkel (Boehringer Mannheím) végeztük, a reagenskészioíhez mellékeit használati utasítás szerint.
COS-?-sipékét L-Amenean íype Culture Cűlkctton No CRL-ltDD szemtkon&wciatg (3 x KI* sejtfedény) növesztettünk egy tenyésztő edényben (a tenyészet területe: 5? cm; Sumitomo Rakehte), amely 1Ö% magzati borjúszérummal (a továbbiakba® ,:,FCSMmek jelöljük: Moregaíe} kiegészített, Dolbecco-tele ntődosiíoít Eagletápközeget tartalmazott (ezt a továbbiakban ,,D-MBD~ttek jelöljük; Gibco RRL),
Közben összekevertünk íö gg/tenyésző edény (összesen 5 edényben) humanizált DR5 nehéz láncnak megfelelő expresszáős plazmid-DNS-t (p.KAi5-i) és 10 pg/lenyészö edény humanizál; DR5 könnyű láncnak megfelelő
4Ö expresszíós plazmid-DNS-t (pílAIS-1), melyei aikalíkus SDS-módszerrel és eézinm-kloríd sürűséggradíens . 90 ecstruuga ássa! preparáltunk, és azután etanollal kicsaptuk, majd felszuszpendáitak 5 ul/edény dH2O~ben.
Mohán 15 ui/edény FUGENEó öahwfekciós reagenst összekevertünk Í80 ul/edóny ECS-t nem tartalmazó DMEM-el, ezt a FUöENE-oldafoí (I85 pltedénv) összekevertük 5 pl/edény DNR-nidattal, amely 10 μί/edény humanizált DR5 nehéz láncnak megfelelő expressziós plazmid-ÜNS-t és 10 μί/edény humanizált DR5 könnyű láncnak megfelelő expressziós piazmid-DNS-t tartalmazott. 15 percig inkubáltuk szobahőmérsékeleten, majd az így kapott piazrnidszuszpenziót (200 pl) feosszáadluk az előzőleg preparált COS-7-táleákboz. 5% szén-dlexidót tartalmazó atmoszférában, 37°€-on Htkubálínk 24 óta hosszáig, majd a tenyésztési tápfcőzeget kicseréltük FCS-t nem tartalmazó D-MEM-el. 5% szón-dioxidot tartalmazó atmoszférában, 37Y.:-on inkubáltuk 72 óta hosszáig, majd a tenyészet felülúszójóí eikulómtettslk a felűhrt/ó-fOAndeklMu leső espsess?iO\ teonekek ns.)í,rt\a tebanol 4 ienkbo kun eljárással COS-710 sejteket transzlektálíunk az alábbi, egyes plazm Id-kombináciőkkal:
(A) : kotTanszíekeiópHAiS-! és pSJVLMi-2 (Hiti) (B) : kotranszfékeiő pH814~i és pSR/M2-l (H2L2) (Cj: koiranszfekeió pHS14- 1 és pSR;l.M3-3-44-lö (H2U) (D) : koíranszfekeió pHB14-l és pSR/EM4-5-3-3 (H2L4) (E): koíranszfekeió pHC 10-3 és pSR/M2-1 (H31,2) (E) : koiranszfekeió pHC10-3 és pSR/EM3-3-44-lÖ (1131.3) (ö);: fcotmnszfokciő pHCÍÓ~3 és pSR/LM4-S-3-3 :(ΪΠί.4) (ti>: kotemszfokció p,HD2E-1 és pSR/LM5-3-27-l f IUj 5 s (1 >; kotesnszibksió pM i 1 - 1 és pS 8,/í ,Mb -1 -4-6 (kisóéra)
A tenyészetet azután lecentrifugáltuk (3580 f.p.m., 15 percig), és a hdukixzói elküSönstetíhk. Á folhlúszót leszűrtük 0,45 pm-es szűrön (ADVANTEC TOYÖ DÍSM!C-25cs, kat.sz. 2*CS045: AS). A szőrietekből az lgö~i „Protein G-POROS” ( Applied Stosystesns) aíEnitás-kromatográfiávai tisztítottuk az alábbi körülmények között:
HELC-rendszer: BleCÁD 780E íAppded Biosyterns) oszlop: Proteinéi-,,1D sensor cartridge” (oszlop mérete: 2,: t .mm belső átmérő χ 30 mm bosszúság, agytérfogat: Ö, I mi; Applied Biosystems) elúeiös puffer: ö/i Mgbeln-HG (pH 2,5) .semlegesítő puffe 1 M Tris-HCI (pH 8,5} detektálás: 28O ntn áramlási sebesség; 1 ml/perc ibakeiö méret.; 0,5 ml/0,5 pere írskelószedö cső: i,5 ml polipropilén mlkrokérncsó hőmérséklet: 4°C
Miután ininden szűrtetet felvittünk, az oszlopra, 50 mí PÖS-el (Sigma, kat.sz, 1000-3) mostuk az oszlopot. Amikor rávittűk az elúeiós puffért, beindítottuk a frakcibszedet A frakciók szedésére szolgáló, egyes mikrokémcsövekbe előzőleg 55 ul, 1 M NaCi-t, 110 μί semlegesítő puffért és 74 pl, PBS-ben oldott, 2 mg<'ml marhaszéram-aibumint (Sigma, kat.sz, A-70.30) adagoltunk, A 7, és 8, frakciót szedtük.
A humanizált ellenanyagok expressziójának igazolására és az expressziós termékek kvantitatív vizsgálatára EUSA-eljárásl végeztünk a tenyészetek felülászó-folyadőkában anti-bwán IgG-re specifikus ellenanyag alkalmazásával.
9ő mérőhelyet tartalmazó tálca (MaxsSorp, hinne) egyes helyeire adagoltunk 180 pl, kecskében termeltetett, antl- 91 humán IgG-Fe-re specifikus, poliklnuáiís eífeaanyagot (Kappei), amely 0,5 pg/pal végkonccníráelóhan, adszorpció* pufierbcn (0,05 M nátrium-hidrogcn-karbmiát, 0,02% nátríum-azid, pH 9,Ő) volt feloldva, és a tálcái 37°C-o« inknbáliuk 2 óra hosszáig, az ellenanyag kötődése céljából. Azután a tálcát 350 plEföS-T-vel mostuk ötször. Mosás «tán a tálcákhoz hozzáadtak a tenyészet fidülúszóíái, 10% PCS-t tartalmazó D-MEM-besr hígítva, és 37°C-oa inkubáliuk 2 óra hosszáig. Újra mostuk E8S--3'-vei, majd az egyes mérőhelyekre adtunk löt) pl, aikaiikus: foszfetázzal jelölt. kecskében termeltetett, ami-htunán-lgG Ee-specifikus, polikkmális ellenanyagot Gackson Immuno Research ts&b.), amelyet 10.000-széresém hígítótínnk PÖS-T-vel, és 37°G-eii ínkubáituk 2 óra hosszáig. Újra mostuk PRS-T-vel, majd hozzáadtunk p-nit.rofenil-fó\zfát szubszírát-oldaloí, amely az ..aikaiikus foszfatáz szubszírál-reagenskészlef’ (Rio Rád) része, a reagenskészlethez mellékelt használati útmutató szerűn. 37‘C-oti mkubáltuk 0,5-1 óra hosszáig, azután megmértük sz ahszorbaneiát 405 nm-en. Ezekben a kísérletekben iö% ICS-t tartalmazó D-MEM-ben bizonyos koncentrációkra hígított, humán plazmából származó, ímmunglobulin-G 1. alosztályt (IgG;) (Bsopure AG) alkalmaztunk referencia-standard mintaként a tenyészetek feiülúszó-folyadékaiban lévő, humanizáli DR5-eíienanyagok koncentrációjának méréséhez.
Ennek eredményeként, a tenyészet felliluszőjáhan expresszálódó és tisztított teonéfcekr-t deiekíálúmk specifikusan anu-humán-igG ellenanyaggal. A humán IgG-eilenanyag végkoneentációja 44,03 pg/rnl (Ilii 1), ^9,8 pg/ml (H2L2), 20,7 pg/ml <H2i,3), 41,6 ugúní (H2U), 39,3 :pgúnl (H3L2), 24,7 pg/ml (H3L3), 23,5 pg/ml (H3E4), ió,7 pg/ml (1141,5) és 18,3 pg/ml (htméra), sorrendben.
(6) Humanizált eíteroinyag néhány Opusának és tóiméra ellenanyag apuptózisí indukáló aktivitása lurkal-sejleket (ATCC No. TÍB-1S2.) alkalmaztunk a tisztított, humanizált TRA-8-ellenanyag apopiózíst indukáló aktivitásának vizsgálatára.
Jurkat-sejteket 10% ECS-ΐ tartalmazó REMII640-tápközegben (Gibeo BRL) tenyésztettönk 37':'C-on, 3 napig, 5% szén-dioxid jelenlétében, melyeket 96 tenyésztöheíyet tartalmazó mikroiiter-íálea (Sumítotno Bakelité) egyes helyeire 50 ptöenyésztőhely sűrűségben adagoltunk. A 26. példában leírtak szerint előállítóit, humanizált TRA-8 koncentrációját úgy állítottuk be 10% ECS-í tartalmazó RPMII640-tápközeggei, hogy a kérdéses végtermék koncentrációja 100 ng/tnl legyen, a 2ó. példában leírt módszer szerint, a lólyadekben lévő, beesőit koncentrációk alapján. Az egyes expressziós termékek 100 ng/ml-re igy beállított oldataiból, felező sorozníhighásokat készhehhnk '10% FCS-i tartalmazó REMIIő4Ö~tápfcőz.eghen. Az egyes hígított, humanizált TRÁ-8-oidatökbel (Hl LL H2L2, H2L3, H2.1..4, 1131..3, .0314 vagy H41.,5) 50-50 pl adtunk az egyes tenyésrtőheiyekre. 37*C-on, 12 óra hosszáig reagáltalak, majd hozzáadtunk 56 pl, I mg/ml XTT-t tartalmazó 25 μΜ EMS-t (végkoneen (rációk 250 pg/ml XTT-re és 5 pM PM530 re), 3 óra hosszáig inkubál tűk, 450 nm-en msgmértttk az ahszorbaneiát az egyes tenyésztőheiyekes a sejtek életképességének kiszámítására» indexként mítokondrínsnok redukáló képességét használtuk fel,
A sejtek életképességét sz egyes lenyésztőhelyeken az alábbi képlet szerint számítottuk ki:
Életképesség (%) ::: 100 χ: i a-b)· (c-b) ahol „a” jelentése egy íeszt-tenyésztóheiyen mért érték, „b” jelentése sejtek nélküli tenyésztöheiyen mért érték és
S „c” jelentése egy tény észiőheiyen mért érték ellenanyag hozzáadása nélkül.
Ennek eredményeként a tesztelt, humanizált ellenanyagokról kimutattuk, hogy apoptözist indukáltak humán
DR5-antígént expresszáló, T-limfóma-sejtvonal sejtjeiben.
Továbbá, humanizál! TRA-8 PC-3-ra kifejteit apopióztsl indukáló aktivitását vizsgáltuk taxoi hozzáadásával a
25. példában leírtak szerint.
•4(1 PC-3 mié, humán ptos/lata táksep vonalat az „Ameruun lt»»uc t’ultmc Coliét tton-lói (4 1C< í s/eíe/iönk be.
-92és „E42K Nutrieot Mixture”-ben (21 127-022, Gibco BRL) tartottuk fent, amely 10% magzati borjisszérumot (FBS, Hyclone), ΐ%, 200 mM L-gíutatnmt (25030*149, Gibco SRI.) és 0,5% penicillin-sztrepíomicin-oSdatoí (P-7539, Sigroa) aríahntizölf. 10% FBS-ei és 0,5% peniedlin-sztreptomicin-oldaítal kiegészített RPMUő4ö-tápközeget (MED-008, ÍWÁKí) alkalmaztunk az alábbi kísérletben. Exponenciálisan növekvő PC-3-sejteket tripszines kezeléssel leválasztottunk, és kétszer mostuk friss tápközeggei. A. sejteket azután megszámoltuk, újra feiszaszpendáituk friss tápközegben 5 χ I01 sejt/mí sűrűségben, és szétosztottuk lapos aljú. 96 mérőhelyet tartalmazó tálcákba (3598 Corning Cosfar), három párhuzamos alkalmazásával, mérőhelyeoként 100 ul össziérfogaíbart, egy nappal a kísértet kezdete előtt Egy reprezentatív rákellenes drogot, Paclítaxeít (169-1861 1, Wako) feloldottunk dímetil-szsRöxidhan (10 mg/mi), friss tápközegben hígítottuk, és azután a sejteket tartalmazó, 96 mérőhelyet tartalmazó tálcákba adagoltok, mérőhelyenként
50 μΐ-t, A dimerllszuífóxid végkoncentrációja kevesebb, mint 0,139 volt. 24 óra hosszáig inkubáitok 37cC-on, 5% széndioxidot tartalmazó atmoszférában, majd friss tápközegben hígított TRó~8-eí len any agot (Hl Ll, H2L2, H2L3, H2L4, 1-13L2, FBi.,3.11314 vagy H4L5) adagoltunk a mérőhelyekre. További 24 om hosszáig inkubáitok, majd a mérőhelyekre adagoltunk 50 μΐ, 1 mg/ml XTT-t és 25 mM PMS-t tartalmazó, minimális esszenciális tápkőzeget (Minimum Esseníial Médium, 1Í Ö95-O98, Gíbco BRR), és a tálcákat 6 óra hosszáig mkofeáltuk, Azután megmértük az ÖJD4S<M ARVO
H'FS 1429 „Multilabei Coubier’’ berendezésen (Wallae Benhold), és a sejtek életképességét az alábbiak szerint számítottuk:
Sejtek életképessége {%) ~ (09450 Taxollal és/vagy humanizált TRA-k-ágenssel/ágensekfce? kezelt sejeteket tartalmazó mérőhelyeken) - C©450 sejteket sérti és ágenst sem tartalmazó mérőhelyeken! x 100/(09450 ágenssel nem kezelt sejteket tartalmazó mérőhelyeken - OD4SÖ sejteket sem és ágenst sem tartaltnazó mérőhelyeken).
Ennek eredménye, hogy a tesztelt humanizált ellenanyagokról kimutattok, hogy apoptózist képesek indukálni humán DRS-antfgéní expresszáló humán prosztula-ráksejtekben,
27. pétik
ÓR4-e0ebányag élőáíbtása
Humán Í5R4 exiraeeiluiárfs deménjét (1-236. ammosavak) és hantán IgG i Fe-részletét tartalmazó iüztós feltétjét expresszáltonk Cos-7-sejtekben rekombináns adenovtes- vektorral. A fúziós fehérjét megtisztítottuk protein-A aRsnitás-oszloppak Balb/e-egereket imntonizáituírk a tisztított íSzíós fehérjével a fentebb leírtak szerint Egy hihridónia kiónt, jelölése 2E12 (IgCrt, k), amely specifikusán kötődik DR4-hez és képes Ramos, humán B-tímfóma-sejteh apoptózísáoák indukálására, háromszor szubklónoztupk. Meghatároztuk 2E12 kötési specífstását ELíSA-vai és westem-blot analízissel, kontroll antigénekként humán DRS-öí, DcRI-gyet, 9cR2-í és IgGi fúziós fehérjét aíkaimazhmk. 2E12 kötődését sejtfelszíni £>R4-hez olyan Cos-7-sejtek áramlási eitometriás analízisével határoztuk meg, amelyeket humán DR4-et: kódoló teljes- hosszúságii cDNS-sel transzfekláiíunk, Az apoptózis-sndukáíö aktivitást Rumos-sejtek 1 pg/ml 2E12~ve! történő ínkubáíásávai határoztuk meg, kecskében termeltetett antf-egér-igGí jelenlétében. A sejtek életképességet ATELÍíe vizsgálati eljárással határoztok meg, a fentebb leírtak szerint.
25. pétik
DR4 monoklonáiis ellenanyag (2E12) humán DR4-re specifikus, mivel nem kötődött más TRA1Lreceptorokhoz, például DRó-hőz, DcRl-hez és DeR2-hőz ELISA vizsgálati eljárásban (19,a ábra). 2E12 sejtfelszíni
DR4-et képes felismerni simít DR4-el trauszfékíáíí Cos-7-srjtek áramlási eitometriás analízisével mutattunk ki (I9.b
-93ábra). 2Bt2 képes volt Raraos lúnfőnta-sejtek apoptőzisái isátácáloi második ellenanyag Fereszikbíődés jelenlétében dözisíuggö módon (19.c ábra). Rumos-sejtek 21212-vel való m váró kezelésének eredménye kaszpáz-8, -9 és -3 időfüggő aktiválódása és PARÉ-hasitás leit (19,d ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy 2E12 agomsia astíDR4-eliensnyag, amely apoptózist indukál kaszpáz-lbggő módon.
Aníl-DR4~et (2E12), majd PE-konjugáli, kecskében termeltetett, anti-egér-lgG i ellenanyagot és áramlás) citometnát alkalmazva kimutattuk, hogy DR4-ellenanyag fd>r<$szmkóma-sajtvnnai (Hs 9I3T) és néhány mellráksejtvon3Í(2LMP.MDAMB?.31 és MDA-MB 453) sejtjeihez képes kötődni, de kismértékben vagy nem kötődön normái emberi bór-fíbroblaszt-sejtyonal sejtjeihez (MaÍme-3).
2EI2 inmorieíd aktivitásit mellrák íusnormodeiiekeí alkalmazva teszteltük. Csupasz egereket szubkuíán oltottm-k 2i..MF-jelíi, Immásr rneiiriák-sejlvonaliai, 2E12 2ÖÖ pg-os i.p. dózisaival kezeltünk a iumorsejt injektálása utáni 7., 10,, 14., 17., 21. és 24. sápon. Az állatok adriaratcmt (doxorublcín) kaptak intravénásán (6 -mgtkg) a 12. és tő.
Ϊ 5 napon. 2EI 2 és adríamicines kezelés együtt (28. ábra) a tomomövekedés nagyobb mértékű gátlását eredményezte, mint 2EI2 vagy adriamlcln: önmagában.
TRA-8 tmnorleld aktivitását 2F 12-vel kombinációban teszteltük ugyanezt az mellrák tumormodelit alkalmazva. TRA-8 és 2.E12. 200 pg j.p, dózisaival kezeltünk a iumorsejt injektálása utáni ?,, 10,, 14., 17., 21. és 24. napon. Az állatok adriamieint kaptak intravénásán (fi mg/kg) a 8,, 12. és lő. napon. TRA-8-cal plusz 2EÍ2-vei, vagy TRA-8-eal plusz 2F12-vel és adríanrio ionéi történő kezelések 88%-os és 18S%-os, azaz teljes mértékű tuomrregressxiót eredményeztek, sorrendben (21. ábra).
JR pdófe
WáZIBiRteRvagökmswrlddj^^ (1) Sejtvonalak és reagensek
MDA-MB-231 humán méiífák-sejtvönai 2LMF-sznbkló.níát, M:ÖA~MB~43 S-sepvonai LCCó-szobklóuját és M:DA-MB-3ői -sejívonal BV3őT2-szubkiOnjnt Dr. Maré Lipmanntól kaptuk (Georgetown University, Washington, D.C.), és 18% FBS-el kiegészített, javított MFM-ben (Hyclono, Bogán, CT) tartottuk fent. MDA-MB-23 f~, MDA-MB453-, MDA-MB-4ÓŐ-, BT-474-, SR-BR-3- és RR-75-1 -jelű, barnán meiirák-sejivonalakai az „American Type Cnlture
CollectioC'-tói (Manassas, VA) szereztük be. MDA-MB-231-, MDA-MB-453-. Ml)A-MB-46F-seiteket MEMviiammokkal, MÉM nem-esszenciális amínosavákkal, 1 mM náifsnrh-piruváttai es 10%FBS-el kiegészíted BMEM-ben növesztettünk. ΒΤ-474-sejíeket 10 pg/ml inzulinnak 4,5 g/i glükózzal, 18 mM HBRES-el, 1: mM nátrimmplruvátía! és 18% FBS-ei klegészitetí R?»MMő4Ö-ben növesztettük, SK-BR-3-sejteket 15% FBS-el kiegészített, MeCoytápközegben növesztettünk. ZR-?5-1 -sejteket: 28% FBS-el kíegészttett, fiain-féle FI2K-tápközegbon növesztettük.
Mindegyik sejívöualai antibiotikum-mentes íápkőzegben tartottuk fent 37uC-on? 5% szén-dioxídot tartalmazó atmoszférában, és rutinszerűen szkrfneiíük mikoplazma szennyeződésre,
Tisztitótt TRA-S-jelü OgOi) m.Ah-t az öAB-hen állítottak elő, és: a Sankyó Co. I.td. (Tokyo, Japán) cégtől beszereztünk FAcermmnd Konmgait, kecskében tetmdtt lett, aníi-egér-IgGI et es í/o^pus-spec rt'ihus IgG 1 kórból! eilensnyagot; a „Southern Biotechnoíogy Associates” (Birmingham, AL) cégtői vásároltunk. Adríamlcínt és pacihaxelt a
Ssgma Chemical cégtől: (Si. Louls, MO) szereztük be. melyekből 1:8 mM törzsoídatoí készítettünk: desztillált vízben
-94 vagy DMSO-ban, sorrendben, Aí Iáik isérletek céljára paelhaxei (Bristol-Myers Squibb Co., Princeton, N.1) klinikai alkalmazásra szolgáló formáit az „Líniversity of Alabama aí Birmingham Kospitai Pbannacy!'-iól (Birmingham. Ál.) kaptok. Ezt a készítmény; 1:5 arányban hígítottuk PBS-ben közvetlenül felhasználás előtt.
(2) DRS expresszió mdsrekt tmtntínnuoreszeeaciás és áramlási estomelriás analízise
Sejteket exponenciális növekedést fázisban egyszer mostunk Dnlfeeceo-íéfe BÖS-el (Ca2+ és Mg2-t hiányos), és elkülönítettük azokat 4 mM BDTAa és 0,5% KCl-st íarialmazó oldatban, 37°C-on. A sejteket 4^C-on, 5 percig centrifugáltuk 1ÖÖ0 r,p.m.-en, egyszer mostuk azokat, és 1% ÖSA-t és 0,01% nátríum-azidot tartalmazó FBS-hen (FACS-puffer) újra felszuszpendáltok azokat 4nC~oo. A sejteket 10 pg/ml tisztított TRA-8-cai vagy izotípus-speeiltkas IgGI kontroll ellenanyaggal inkubáltuk 60 percig 4-C-on, egyszer mostuk puflerrel, majd lö pg/ml, PB-konjugált, kecskében terineltetett, anti-egér-lgöl-el inkubáltuk 2© percig, 4°C-on- Elienanyagfesíést követően a- sejteket egyszer mostok FACS-püftorrel, és 1% pttraformaldehldbmj fixáltuk 15 percig, jégen. A mintákat Beeton Dlekinson FACScan (San íose, CA) alkalmazásával analizáltuk, és az adatokat Cet IQuest-szeft vert alkalmazva analizáltok, (3) Sejtek életképességének vizsgálata ATPLite alkalmazásával
Sejteket tripszinnel kezeltünk, és CeSszuszpendáltuk teljes tenyésztést íápközegben. TenyésztÖhelyenként ezer sejtet mértünk be optikailag tiszta, 96 tenyésztőkéivel tartalniazó, fekete tálcákba (Costar #3904, Corning, NY), és egy éjszakáit át inkubáltuk 37°C-oa, mielőtt a kezeléseket elkezdtük. A drogokat és ellenanyagot tenyésztési tágközegben hígítottuk közvetlenül tóihasztíálás elölt, ahol a DMSÖ végkotmentráelója minden esetben ^6,001% volt. Sejtek életképességét azután határoztok meg, hogy l'RA-8-cal egymagában ériníkeztcttök azokat 24 óra hosszáig, Cítötoxlktts drogokkal végzett kombinációs kezelések eseten a sejteket előkezeltük a droggal 24 óra hosszáig az ellenanyag hozzáadása előtt» és további 24 óráig mkubáltuk azokat a sejt életképességének meghatározása előtt, amit cellulárís ATF-mennyiségek mérésével végeztünk ATRLite lumineszcencia alapú vizsgálati eljárás (Faekurd Instruments, Meriden, CT) alkalmazásával. Követtük a gyártó által mellékelt használati utasítást azzal a kivétellel, hogy minden reakció-térfogatot (tenyésztési tápközeget és reagenseket) a felére csökkentettünk. Minden mintát három párhuzamos, alkalmazásával mértünk, és az eredményeket átlag T SE formában adtok meg, amely minimum három független kísérletből származott « Terápiás vizsgálótok TBÁ-S-sí egymagában vagy kemoterápiával vagy sugárterápiával kombinációban alkalmazva, mellrák-xenograftökaí hordozó, aíímiás, csapass egerekfoets
Atímiás (csecsemőmiriggyel nem rendelkező) egerekbe 3 x 1Ö7 2tMP-sejíet injektáltunk szubkután, A tomorsejt injektálását követő 7» napon, 200 vagy Ő00 pg (10 vagy 60 ®g/kg) TRA-8-at adtunk be i.p., amelyet öt további injekció követett a 10., 14., 17., 21, és 24. napon. A tumorok növekedését az idő ffiggvényében követtük. Ezután olyan kisériefeket végeztünk, amelyekben 2L.MF-n.um>rokaí: s.c, hordozó állatokat injékíálíüsik í.p, 2(10 p.g TRA-8-eal a ?,» 10., 14,, I?., 21, és 24. napon egymagában, vagy adriamieinna; (6 mg'kg i.v, a 8., 12, és 16. napon) vagy paciitaxellel (20 mg/kg l.p, a 8.» 12„ ló, 20. és 24. napon) kombinációban. Meghatároztuk a iumorméretet és a. regressziós sebességet. Egy kísérletet TRA-8-eal és adriatnieínnel is végeztünk a fentebb leírt kezelési rétid aíkahnazásávak kombinációban 2EMP-xtotograílok 3 Gy 6uCo-bes«gárzásával a 9. és 17, napon.
(S j Apoptózis analízise xonogroftókfean χ 1Θ7 2Í.MP~sejtíel a 0. napon s.c, injektált atímiás (csecsemőmiriggyel nem rendelkező) csupasz egerek iöö pg TRA-8-at kaplak í.p. a 7. és lö. napon. Két egérből álló csoportokba?; minden áltat adriamícint kapott (3 ntg/kgl ?s 8. és 1 f. napon, paclítaxelt (10 mg/kg) a 8. és 11. napos, vagy TRÁ-8 és adriamlcis vagy paelhaxei kossblnációjdt ugyars40 ilyen dózisban és időrendben. Egy csoport egeret nem kezeltünk. A xenograílokat kimetszettük a tomorsejt injektálása
- 93 utáni 14. napon apoptózís vizsgálata céliából. A kezelés intenzitásának lényegi csSkkeöJáse a standard kezelési rendhez képest lehetővé tette, hogy elegendő tumor-szövetet analizáljunk a 14. napon. Tumor xenograttokban TŰNÉL vizsgálati eljárást végeztünk apopiózísra az alábbiak szénné A szövetből ötmíkronas paraffines metszeteket készítettünk Stiperfi-osí/Plus-tárgylemez.ekre, és 58°€-οη melegítettük 1 óra hosszáig. A szövetmetszeíeket paraíTn-tnenfesítettük háromszor cserélt xiiollal, és rehidratáituk abszolút etanolktl, 95%-os etanollal és ?ö%-os eísnsllsl, 5 percenként egyszer cserélve. Majd a metszeteket Tris-pufferelí sóoldatba (ö,5 M Tris-házis, ö, 15 M NaCI, Ő,Ö802M Triton X-10Ö, pH 7,6) helyeztük, Apoptotikus sejfmagvákat „Apop Tag Peroxidsse Kif’-et (intergen, Purehase, NY) alkalmazásával detektáltunk. Prcáeioáz-N-t (20 pg/ml desztillált, ionmentes vízben oldva) adtunk a szövetmintákhoz, és szobahőmérsékleten mknbáltuk azokat 15 percig, Endogén peroxidázokaí hidrogén-peroxid 3%-os vizes oldatával kvencseltük 5 percig. A metszeteket ekvílíbrációs puiTerrel kezeltük 30 percig, és azután TdT-enzimmel (jelölő reakciókeverékben hígítva) inkiíbálttik 1 óra hosszáig, 37°e-ons parafilm Fedést alkalmazva. Az inhubálás közben a TdT-enzim köti a DNS-iragmensek 3’-ÖI-I-végeh, és dlgoxígenin-jelölt és jelöletlen dezoxínukieotidok hozzáadását katalizálja. Negatív koatroilokat desztillált vízzel (jelölő reakció-keverékben hígítva) inkohátbmk TdT-enzim helyeit. Hozzáadtonk stop-puffért 1Ö percig, szobahőmémeklcícn, ajelölési reakció leállítása céljából. .Aníi -digoxígemn konjogámmoí adtunk az egyes tárgylemezekre 3Ö percig, Kromogénként 3,3’-DAB-oí sikalmaztttk a DN8-ffagrnensek jelölt 3’-OB-végének láthatóvá tételére. A tárgylemezeket ezután leöblítettük ionmentes vízzel, és enyhén utánfestettük hetttatoxilintsel, dehidmtáittifc tiszta alkoholokkal és xiiollal, és fedőlemezzel láttuk el Pernmmd alkalmazásával. KörtllbePfl 10 random mezőt elemeztünk Tunel-iestődés százalékos arányának és a szövet míttden részében található, intenziven fesíődöít apoptotikus testek százalékos arányának meghatározása céljából, (6) Statisztikai analízis (A) TRA-8 és d rog-etí otoxteRás m v/w kólesösbatásának analízise
A citotoxieitás adatait elemeztük annak meghatározására, hogy vajon a kombináció estotoxíkus hatásai addítívak-e, kisebbek-e, mint additívak (antagooisíák), vagy nagyohbak-e, mint additívak (szlnergikus). Modelleztük a dózis-válasz kapcsolatokat az ágensekre egymagákban és kosnblnáeiöbaH, másodrendű válasz-felszín modellt alkalmazva lineáris, négyzetes és kölcsönhatási tagokkal mind a kilenc sejtvonal esetén [Monígomery, D, €., „Design and Analysis of Experirsenís”, New York: Wíley, (2ÖÖ1)), öenníngs ajánlásai szerint [“On Testing fór Drug/Chetnieal Iníeraetíöns: Deftrsitíons and inferenee”, 457-4Ó8, old. Í2QÖŐ}], Szignifikáns kölcsönhatási tagot attól függően minősítettünk szioergíkusoak vagy antagoulsíának, hogy' a kölcsönhatási tag negatív volt-e több, mint additív eitotoxieitással, vagy pozitív volt-e kevesebb, mint additív citotoxieitással. Ha a kölcsönhatási tag nem volt szignífskáns, akkor TSA-8 é& adriamlcio, vagy TRA-8 és paeliíaxel közötti kapcsolat additívnak tekinthető, feltéve, ha az additív tagok szignifikánsak, (R) TRA-8, kemoterápia, sugárterápia és kombinációs terápia analízise egyedi állatkísérletekben ő független állatkísérletből származó adatokat analizáltunk egyedi kísérlettel. Kezelések kombinációit összehasonlítottuk /« tw« tumorellenes hatékonyság, azaz tumornövekedés gátlásának vonatkozásában, amelyet három végpontként mértünk; a tumor megduplázódásához szükséges idő meghosszabbodása, turoorregjesszíó százalékos aránya és a növekedési sebesség az idő függvényében, A megduplázódást idő analízisekben a napok tényleges szántát használtok, ami alatt a tumor megduplázódod felszínének területében (két átmérő szorzata) az alap-állapothoz viszonyítva rumorsejt mjefciálása utáni ?. napon. Nem-parametrikus Kraskal-Walllis-tesziet alkahoazíünk tumor megduplázódásához szükséges időtartamok középértékének összehasonlítására az egyes kezelések esetén. Fisher-próhát alkalmazniuk a iumorregreszsziók és visszaesés-mentes regressziók arányainak összehasonlítására az egyes kezelési csoportokban. Annak meghatározására, hegy vajon bármilyen kombinációs terápia elöldézi-e a temornövekedés
-96szignifikáns szinetgikus gátlását, azaz additívnál tőbb-e, terület sörozttíinéfosesiiől származó növekedési görbéket összehasonbtotiunk lineáris keveri modell alkalmazásával a terápia kezdetétől az első három héten (Ltndsey,. 1 K., “Models fór Repested Measuremertls”, 100-142, old., Oxford (1993)]. A kombitsáciös terápiák szinergikus hatásainak tesztelésére egy kölcsönhatási tagot tartalmazott a modell. Ha a kölcsönhatási tag szignifikáns volt és a növekedési sebesség gátlására kilejtett hatás az additívnál nagyobb tnértákts volt, akkor a kölcsönhatást szinergikttsn&k tekintettük. t€) Terápiás hatások aggregáhtm-ánalbise összesen Idd állatöt, üö kezelési esopíutöt vontunk be és 6 független kísérletet végeztünk az aggrogátnmanalízisben. A kezelési kombinációkat 7« vivő lúmordfenes hatékonyság vonaikozdsábat! hasonlítottuk össze. KtüskaiWaiils-te'Sztet alkahnaztíHik tumor megduplázódásához szükséges Idötartatnok középértékének Összehasonlítására, és kisbér-próbát alkalmaztunk a tnmorregressziók és visszaesés-mentes regressziók aranyainak összehasonlítására az egyes kezelési csoportokban.
Valamennyi statisztikai analízist SAS®' (Sas/Stat llser’s Guide, SAS Online Gse, 8. verzió, Cayy NC: SÁS ínsritute Inc,, 1999) alkalmazásával végeztünk.
(7) ÖRS-cxpresszió és TRÁ-8-hsdukáb eitntoxicdás ntelirák-sejfvonalakbnn 15 A 22.A ábrán bemutatjuk, hogy mind a kilőne mellták-seitvonal DR5-poz«ív volt, amelyekben az expresszié mértéke különbözött az erősen pozitívtól (LCCó és MDA-M.13-453) a gyengén pozitívig (MHA-M3-468 és SK-3R-3). A 22. B ábrán bemutatunk TRA-8-índiikáít ciíoíoxiciíásí mind a kilenc sejt vonalban. Mégy sejtvonal érzékeny volt TRA-8-indokéit, ciíoíoxiciíásra, ahol az lCSi)-koncemrácidk. 17 és 299 ng/ml között voltak (LCCó, 2LMP, MDA-Mfí~ 231, MPÁ-,MS-4ö8), ntig mások egészen rezisztensek voltak (PY36T2, BT-474, MDA-MÖ-453). Nem volt jó összefüggés a DRó-expresszié mértéke és a I'RA-8-índukáSt eltoioxicitás között, az MDA-MB-453- és MPA-MB-468jelű seitvonalakkal szemléltetve.
Azután TRA-8 hatásait vizsgáltuk kemoterápiával indukált eitotoxioifásra aártamlcínnel (23 .A ábra) és paclitaxellel (23 .R ábra). Az ellenanyag és drog-hatások közötti kölcsönhatás leszedésére végzett analízis eredményeit összefoglaljuk az 5, talrlázaiban. Nem volt szignifikáns sz.inera.ikus kölesönbauts TRA-8 és paclhaxei között azzal együtt, hogy a kölcsönhatások többsége additív volt. Kilenc sejtvonalból négyre teljesültek szinergikus kölcsönhatás kritériumai TRÁ-8 és adriamiem között. A 2LMP-seitvonal jó érzékenységet mutatott TRA-8-ra, valamint érzékeny volt akár adríautíeinre, akár paelitaxelre. Ezt a sejtvonalat választottuk az ellenanyag és/vagy drogok út vivő hatékonyságának vizsgálatára.
5. táblázat 7« vpr;> kölcsönhatás hatásai kombinációs kezelések esetén
TRA-8 T adriamiem TRA-8 + paclii&xel
Sejtvonal kölcsönhatás p-értéks kölcsönhatás p-érték3
LCCÓ szinergiktts <0,001 additív 0.624
MDA-MB-45.3 szinergikus <0,001 nincs válasz' 0,615
2I..MP additív 0,153 additív 0,937
MDA-MB-231 additív 0,61/3 additív 0,064
131-474 szinergikus <0,001 bil>:' 0,992
ZR-75-Í szinergikus 0,013 additív 0,172
DY3ŐT2 NI.T 0,808 ND* 0,798
.MDA-MB-468 additív 0,184 additív 0.724
SK-BR-3 additív 0,361 nincs válás?/ 0,871
- 97 “p-érték a szinergtkus kölcsötdtatási tag szigntfikanciájára utal. Ha TRA-8 és a drog hatásai szignifikánsak, és a köfcsönhatásí tag szignifikáns, akkor a kombinációs hatásokat szinergíkusnak tekintjük, Ha a kölcsönhatás p-értéke nem <0,85, akkor a kombinációs hatásokat additívnak tekintjük.
Mínes meghatározva, mert TRA-8 hatása .nem volt szignifikáns, de az adrianriciu/paelitaxel hatása szignifikáns volt, 5Hem volt szignifikáns dózlsfiiggö válasz egyik ágensre sem.
(8) TRA-8 fit ids’o tttmorellenes hatásai egymagában vagy kemoterápiával és/vagy sugárterápiával kombinációban
TRA-8 2Ö0 gg és 600 pg dózisban, hetente kétszer beadva, összesen 6 dózis tumomöyekedés hasonló gátlását idézte elő kialakult 2LMP s e. tumorokban (24. ábra). Három további független kísérletben 200 pg dózist alkalmazó kezelési rend lumomövekedés statisztikailag szignifikáns gátlását idézte elő (p«0,ÖÖ4, Kraskal-Wailis-teszt tumor tnegduplázódásí idejére) kezetlen kontroliokhoz képest, és ezt a dózist és kezelési rendet választottuk ki a további kísérletekhez. A 25. ábrán bemutatjuk TRA-8, adriamicin, vagy TRA-8 és adriamicin kombinációjának hatását a tutnorelienes hatékonyságra. Kezeletlen kontrol tokhoz képest, TRA-8-at egymagában alkalmazó terápia vagy TRA-8 plusz adnamicin-terápia tomornövekedés szignifikáns gátlását idézte elő (p—0.002, Ktuskal-Wallts-teszi), inig adriamíeiü-kezelés eredménye nem különbözött a kontrolitól. TRA-8 plusz adriamicin kombinációja tumornövekedés nagyobb mértékű gátlását idézte elő, mint bármelyik ágens egymagában (p’ó,002), valamint szignifikánsan teljesebb (négyszer nagyobb mértékű) tumorregressziöt Idézett elő, mint bármelyik ágens egymagában, amely esetekben nem láttunk teljes tumorregressziöt (p<ö,Ö01, Flsher-próba), TRA-8 és adriamicin út v/vo szinergizmusát korai növekedési görbe analízisével elemeztük. A kölcsönhatási tag szignifikáns (p<ö,Ööl) és szinergikus volt. A szinergikns kölcsönhatási: megerősitettük egy második független kísérletben.
i'RA-8 és pacliíaxel hatásait vizsgáltuk ugyanebben a modellben, ahol hasonló megfigyeléseket tettünk (26, ábra). Kezeletlen kontroliokhoz képest, TRA-8 és TRA-8 plusz paclitaxel tuiuomövckedés szignifikáns gátlását idézte elő (p<8,ÖÜl, Kruskai-Wallis-íeszt). Tumornövekedés szignifikánsan különbözött TRA-8 plusz pacbtaxeilei kezelt állatokban olyanokhoz viszonyítva, amelyeket pachtaxellei egymagában kezeltünk (p-<l,SÖ8), és 8 állatból 3-ban (3/8) teljes regresszió volt, bármelyik ágenssel egymagában kezeit vagy kezeletlen állatokhoz képest Korai tumornövekedés görbéinek analízisével kimutattuk, hogy szinergikns hatás majdnem szignifikáns veit (^=0,003), mig additív hatások szignifikánsak voltak (p<0,00i).
Végűi, TRA-8, adriamicin és n0Cc-fccsugárzás hatásait aftalfeáltuk úgy, hogy az ágenseket egymagukbán alka'mazmk és különböző kombinációkban, amit a 27. ábrán szemléltetünk. Szignifikáns különbségek voltak mindea esetben a inmorduplázódás i idők vonatkozásábau (p<Ö,001), és többszörös összehasonl itások azt mutatták, hogy hármas terápia TRA-8-eal, adriarnichmel és ^’Cö-al tumornövekedés gátlását idézte elő, amely szignifikánsan különbözött az összes többi kezelt csoportétól, mig mindkét csoport, amelyben kettős terápiát alkaltnazíirok (adriamicin plusz TRA-8, vagy ^Co plusz TRA-8), különbözött bármelyik «gyeden ágenssel kezeit csoporttól (p<O,öÖI). A kizárólag í>u€ö-ai sugárkezelt állatok nem különböztek a kezeletlen koníroilökról (p«ö,926), Az összes kettős kezelési kombináció szignifikánsan szinergikns hatású volt (p<ö,fiö l). Teljes regressziót láttunk 8 olyan állatból ó-hun (6/8), amelyek hármas terápiát kaptuk, és 4 állatban nem újult ki a tumor 180 napos utókövetési időszak alatt.
(9) Terápiás hatások aggregátum-analízise
Tmnorelíenes /« v/vo kísérletekben léó állatot alkalmaztunk, és a tumor megduplázódást idejét és a teljes tumorregresszíó gyakoriságát analizáltuk az egyse kezelési: csoportokban (6. táblázat). Átlagos iutnor-duplázódási időkre alkalmazott ANOVA-anallzlssel szignifikáns íp<0,0(ll) különbségeket mutattunk ki. a kezelést csoportok között.
-98többszörös összehasonlítás azt eredményezte, hogy TRA-8 t paeiitaxeí, TRA-8· ;· adríaínicin és: TRA-8 * adnamteb.-h *<?£ο alkalmazása esetén szignifikánsan hosszabb vök a tumor átlagos megduplázódást ideje, mint bármelyik TRA-8néiküit kezelési csoportban. Bármelyik kezelési módszerhez TRA-8 hozzáadása hosszabb tuniordnplázótláss idői eredményezett, mint a kezelési módszer egymagában, Ehhez hasonlóan, Krnskai-Walhs-tesztben tantor megduplázódást idejének középértékeire azt kaptok, hogy a középértékek szignifikánsan különböztek minden -esetben (p<6,9öl), Páröíikéoli összehasonlítások Wileoxín-féíe előjeles rangsoroló tesztben hasonló mintázathoz jntottuok tumor tnögdbplázódási idejének kőzépértékeire, mint az ANÖVA többszörös összehasoslkásokkal. Ez az amilizis alulbecsüli a leghatékonyabb kezelésekkel előidézett növekedési gátlást azokban a csoportokban, amelybeti a tumor mérete nem ért el a dupláját a kísérlet végére, amelyet a kísérlet befejezési napjának jelöltünk ki. A 6, táblázatban bemutatjuk a teljes tumorregresszió gyakoriságát és a regresszió tartós jellegének gyakoriságát a kísérlet végére. Nem tapasztaltunk teljés tiMBüiregresszió! olyat! állatokban, amelyeken kemoterápiás kezelést vagy sugárterápiát alkalmaztunk, tűni arra utal, hogy a turnornövekedes és a mmor agresszív húsa erőteljes volt. Fisher-próbával szignifikáns különbségeket találtunk a tumor teljes regressziójának gyakoriságára a kezelési csoportokban (p<0,06l). A löő állatból 3i)-ban teljesen visszafejlődött a tumor, ás ezek közül 28 TRA-S-a; kapott egymagában vagy' kontó mád óban más kezdési módszerrel.
Teljes regresszió 42 kontroll állatból l-hen fordák elő; 54 állatból i-ben, amelyek, kemoterápiát, besugárzást vagy kombhsáeiól kaptak: és 68 állatból 28-ban, amelyek TRÁ-8-at egymagában vagy TRA-8-at kombinádós kezelési rendben kaptak, A TRA-S-al kezeit csoportban szignifikánsan (ρ<0,ίΧΐ1) nagyobb gyakorisággal fordult elő teljes regresszió. Ehhez hasonlóan, 68 olyan állatból 14-ben nem újult ki tntnofnövekedés, amelyek TRA-8-ai vagy TRA-8·· kombinációkat kaptak, kontroílokhoz (1342) és kemoterápiával és/vagy besugárzással kezelt állatokhoz (0-521 képest.
Visszaesés-mentes regressziókat a 99. naptól a í 71., napig terjedő időszakban figyeltünk meg (146 £ 24 nap).
-996. táblázat. .Aggregátum-analízis eredményei 21..MP-tumorok megduplázódás! tdejere és teljes regressziójára Teljes regressziók
Tumor duplázódás! Átlagos
Kezelés Áilíttok száma ideje (napok) {áííagdtőzépérték) Összes í%) Nincs kiújulás (%) megfigyelési idő (napok)
kezeletlen kontrollok 44 (42)a 12/8 1 (2%) Ϊ (2%) 177
«te 8(7} 14/10 Ö Ö 186
adriamicin 31 (28) 17/48 0 0 197
paciitaxei 7(5} 25/20 0 ö *
adriamiem v f!ÖCó 8(8) 39/36 1 (13%) 0 197
TRA-8 30 (26) 47/23 6(30%) 5(1796) 159
TRA-8 4· *eCo 8(8) 65/50 3 (38%) I (13%) 186
'TRA-8 + paciitaxei 8(8} 71/62 3(38%) 1 (13%) 148
TRA-8 T adriamiein 14(12) 81/64 .10 (71%) 3 (21%) 1.85
TRA-8 + adriantiein v i,:'Co 8(6) >140/179 6 (75%) 4 (5066) 192
’A zárójelben lévő számok a nem ellenőrzőit állatok számát jelentik.
(10)A poptózis kezeltíu «sorokba n
Apoptözis indukálását 2LMP-xenogiaftokban TIlNEL-techníka alkalmazásával határoztunk meg TRA-8«, adriaroicitt-, paciitaxei-, TRA-8 t adriamietn- ás TRA-8 + paclitaxél-kezelós után, Kezeletlen állatokban lévő tatnotökban 4% festődön sejt vök (1% intenzív}, míg adrianncío-- vagy paelibixel-kezelés után 8% (6% intenzív} és 7% (2% intenzív) festődön sejt volt. Kizárólag TRA-8-al kezelt állatokban szembetűnő apoptözis volt, 25% (.15% intenziven) festödötí sejiíeb TRA-8 plusz adrkorotm-kezelés után 28% (22% intenzív) és TRA-8 plusz paeliíaxeíkezelés után 2.6% (12% intenzíven) festódóít sej· volt.
Jsrdiíásto
1-102. azonosítószámú szekvencia: Mesterségesen előállítón, szekvencia leima/'megjegyzés:
szintetikus konstrukció.
-100 HIVATKOZÁSOK JEGYZÉKE
Dee ÖÖ3-4 we Deaa KC, Lyn S, Silvenaaa C, Dal E, m ER, Bntetan C, DiPrbzfo K, Dodds RA, James ÍB, Rftse^WsΟ.
j'C, Voung PR, J Bioi Otem 1998 Juh 5;273(23); 14363-7 AteR H, Miller PB, Ami!X Glnnak S, Griffííh TS, Kufcia M, Chiu Wj 3H.es X Woodward A, Le Τ» Sántít 0, Smolsk P, Goodwíu RG, Rsueh CT, &DB W Med' 1999 Peb;5(2): I57-61 /;13(i 1):1817-24 yl;427(I):124-8
XHmlBoeMéT.M
Búr 3tasssol 199 b •52
17, Mattel
3, Gsmen S, Kim KJ, Chunibampal A, Pmeko A, Naval I, And A. Búr 3 immunoi 1998 Sep;2$(9):2714-25 Phillips TA, NI I, Patt Gs Ruben SM, Wd YP, Ptux? 1L, Hunt JS. J Inuuaaol 1999 May 15; 102(10):6053-9
13; 183(4); 1906-13 j'ohmen ÁC, linux 3, Stdtikjer Bs bfon$Ud U, Egeberg K5 Surndsn A, (lyiokme 1999 Sep;l 1(9):664--72 ,·, Ábmad M, Semmit IM, Ázzon! t, Ahmtnd ES, Pertum B, J Exp Med 1998 Dec 21 ;188(12):2375-80
Tanger ΉΑ, Maitszwskí CR, Schootey K, Griffith T$, J Bxp Meá 1999 Get 18)190(8):1153.04 ifdth TS, Wifoy
KSjcνλ·ϊ; £'*?$·. ** «M-&SS «#-· i rWWtt Λ\},
CA, Goodwm RGS Rubin MZ. X Immunofogy 1999 162:2597-2805
, Mali ®wái CRS Bsnger
ni S and Óaw» ΡΑ» 1 997 Arfeith aaá allied ew 8 ycbme 2,979-992.
,,«««,... Hasimimto T; xxx»<>^« ,» íwaknra Y, Yonehafa S, SwMa T, «á Ntehioka IC 1 Cint tevess 98(2); 271-278
Zhang B, Ytog Υ» Körten JL, Stnneilovo ΒΒ» Jndge TA, Tort’T Á JM, aed Chen Y, 1997 X Cltn. tevést 100(8), 19514957.
Μ
19;265(2):479-S3 Cfeíjwuyan TL? Köss
97(4):1754-1759
Arai T. Akiyarn Y, fitte S, Stóo &, hvai T, Yml Nov 27;133(2):197-204 Lee SB, Shm MA fóm HS, Lee HL,
Fark JY, Oh B, teng B, Has JY, Lee JY, V
..e«
tel SÍ, Wu QS, Ooti N, Wn Le Jen J,
Ug t5;S8<16);3SIS-3Sl8 tteate SA, teirt RM, Gumey A, Rfös tótom CW CL, BfoW <» Woed WL Gcddard mó Asbkesazi A, 1997 Science, 277,818-821.
Chccg j et al, 1994 Sctence, '263, 1759-I762
43, Shmdce JP. Gkdste'S ÁS, Pnti BM Gutccy A, Stóafefe M, Batóía D,
cr,
Sehneider P, Thssső M Bums Κ» Bedwer JL, Höihwaa R, &
, Tsehopp X» 1997 tawiíy Dec;7(6): 831-836. isdy Mh ΒΛ L Tatoopp X sró BöMMC, 1999 X B
fcteróer LL öav RE, and Gw S, 199' ·*? .c ,<
of íheowlobgy, 13^ «dinen, Voltsne L 243-254.

Claims (26)

  1. SZABADALMI IGÉNYLŐNTÖK
    1. Ni.ro eljárás apoptózis szelektív indukálásám DRS-öt expresszálő célsejtekbe», amely eljárás magában fogúiba a következő lépéseket: (a) a célsejtek érintkeztetése DRS TRÁIL-receptort specifikusan kötni képes ellenanyag
    5 terápiás mennyiségével, aitol az, ellenanyag epitópsgecí díása azonos a PTA-1428 ATCC nyilvántartási számú TRA-8 egér-egét hibrídömáéval, ahol az ellenanyag szolúbilis tormában /« Nvo és in vitro apoptózisi indukáló áktlvlíásó DR5öt expresszáló célsejtekben, és (b) a célsejtek énntkézíefésé DR4 TRÁiL-reeepmrí specifikusan kötni képes ellenanyag terápiás mennyiségével, ahol az ellenanyag eprtópspecifitása azonos a PTA-3798 ATCC nyilvántartási számú 2Fl2egér-egér hibridómáéval, ahol az. ellenanyag in vivő és in vitro apoptózist indukáló aktivitású DR4-el expresszálő lö célsejtekben.
  2. 2. Készítmény, amely a következők kombinációját tartalmazza:
    (a) DR5 TRAIL-zeeepiort specifikusan klánt képes ellenanyag terápiás mennyisége, almi az ellenanyag epltőpspeeilttása azonos a FIA-1428 ATCC nyilvántartási számú TRA-8 egér-egér hlbridőmáévat ahol az ellenanyag szölubilis formában in vivő és in vitro apoptózist indukáló aktivitású DR5-öt expresszálő célsejtekben, és
    15 (b) DR4 TRÁIL-receptort specifikusan kötni képes ellenanyag terápiás mennyisége, ahol az ellenanyag epitöpspecRIfása azonos a ETÁ-3798 ATCC öyílvántartási szántó 2E12 egér-egér bibriáómáévai, ahol az ellenanyag ö? vivő és in viíro apoptózist mdúkáló aktivitásé DR4~et expresszáló célsejtekben,
    DRS-öt és DR4-et expresszáló célsejtekben apoptózis szelektív indukálására szolgáló alkalmazásra,
  3. 3. .A 2. igénypont szerinti készítmény, amely további terápiás hatóanyagokat is tartalmaz,
    20
  4. 4. A 3. igénypont szerinti készítmény, ahol a további terápiás hatóanyag Vagy terápiás hatóanyagok a TNFcsalád tagjaiti,
  5. 5. A 4. igénypont szerinti készítmény, ahol a TNF-család tagja vagy tagjai CD404sgandmnfnk \agy fragmense(i) vagy származékai 1).
    ö. A 4. igénypont szerinti készítmény, ahol a INT-család tagja vagy tágját Fas-ltgandtimioki, vagy
    25 ffagmense(i) vagy származékait J,
  6. 7. A 3. igénypont szerinti készítmény, ahol a további terápiás hatóanyag vagy hatóanyagok gyuiladásgátlö h&lóanyagípk),
  7. 8, A 7. igénypont szerinti készítmény, almi a gyuíladásgátió hatóanyag vagy hatóanyagok nent-srteroid gvalladásgátló hatóan;,·ágink).
    30
  8. 9. A 8, igénypont szerinti készítmény, amelyben a nem^sztereM gyűlladásgátio hatóanyagok COX-1 inhibitorok vagy COX-2. inhibitorok.
  9. 10. A 7. igénypont: szerinti készítmény, ahol a gytdladásgátlő hatóanyag vagy hatóanyagok sztereód gyellaóásgáíló hafóanyagfok),
  10. 11. A 3, igénypont szerinti készítmény, ahol á további terápiás hatóanyag vágy ágensek virnséllenes
    35 hatóanyagtok},
  11. 12. A 3, igénypont szerinti készítmény, almi a további terápiás hatóanyag vagy hatóanyagok antlrettovirális haíóanyag(ok).
  12. 13. A 3. igénypont szerinti készítmény, ahol a további terápiás hatóanyag vagy hatóanyagok antiopportunísta hatóanyagtok).
    40
  13. 14. A 3. igénypont szerinti készítmény, ahol a további terápiás hatóanyag vagy hatóanyagok amíbíotikmofok).
    - 1Ö4
  14. 15. A 3, Igénypont szerinti készítmény, ahol & további terápiás hatóanyag vagy hatóanyagok iimnunszapresszív hatóanyagtól;).
    ló. A 3. igénypont szerinti készítmény, ahol a további terápiás hatóanyag vagy hatóanyagok irarnuügiohulirn· készstmény(ek).
    5 17. A 3, igénypont szerint t készítmény, ahol a további terápiás hatóanyag vagy hatóanyagok maláriáéi lenes hatóanyagínk).
    IS. A 3, igénypont szerinti készítmény, ahol a további terápiás hatóanyag vagy hatóanyagok betegségmódosító axitireumás hatŐ3.«yag{ok).
  15. 19. A 3. igénypont szerinti készítmény, ahol a további terápiás hatóanyag vagy hatóanyagok eito.kin(ek).
    10
  16. 20. A 3. igénypont szerinti: készítmény, ahol a további terápiás hatóanyag vagy hatóanyagok kemokín(ek),
  17. 21, A 3. igénypont szerinti készítmény, attól a további terápiás hatóanyag vagy hatóanyagok növekedési faktor(ok).
  18. 22, A 3. igénypont szerinti készítmény, ahol a további terápiás hatóanyag apoplórist indukáló vegyidet és ahol az apoptózisí indukáló vegyidet SN-50 vagy LY2940Ö2.
    15
  19. 23. A 2. igénypont szerinti készítmény, ahol a célsejt abnormálisán prolileráló szinoviális sejt.
  20. 24. A 23. igénypont szerinti készítmény, ahol a szinoviális sejt reumás artritisz-szinoviáiis sejt.
  21. 25. A 2. igénypont szerinti készítmény, ahol a célsejt aktivált immunsejt.
  22. 26. A 25. igénypont szerinti készítmény, ahol az aktivált immunsejt aktivált limtbciía,
  23. 27. A 2. igénypont szerimi készítmény, ahol a célsejt neatrofii granulocka.
    2(1
  24. 28, A 2. igénypont szerinti készítmény, ahol a célsejt virasferíőzStí sejt
  25. 29, A 2. igénypont szerinti készítmény, amely győgyászaíilag elfogadható hordozót is tartalmaz.
  26. 30. Az, 1. igénypont szerinti eljárás vagy a 2. igénypont szerinti készítmény, ahol az ellenanyag hnnrán vagy humanizált ellenanyag.
HU0600602A 2001-11-01 2002-10-25 Anti-DR5 ellenanyagok és anti-DR4 ellenanyagok és más terápiás ágensek kombinációi HU230378B1 (hu)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34640201P 2001-11-01 2001-11-01
US60/346,402 2001-11-01
US39147802P 2002-06-24 2002-06-24
US60/391,478 2002-06-24
PCT/US2002/034420 WO2003038043A2 (en) 2001-11-01 2002-10-25 Combinations of dr5 antibody and other therapeutic agents

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0600602A2 HUP0600602A2 (en) 2006-10-28
HUP0600602A3 HUP0600602A3 (en) 2012-09-28
HU230378B1 true HU230378B1 (hu) 2016-03-29

Family

ID=26994839

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0600602A HU230378B1 (hu) 2001-11-01 2002-10-25 Anti-DR5 ellenanyagok és anti-DR4 ellenanyagok és más terápiás ágensek kombinációi

Country Status (21)

Country Link
EP (1) EP1506285B1 (hu)
JP (1) JP4663232B2 (hu)
KR (1) KR20040081422A (hu)
CN (1) CN100506277C (hu)
AT (1) ATE491019T1 (hu)
AU (1) AU2002360307B2 (hu)
BR (1) BRPI0213846B8 (hu)
CA (1) CA2465314C (hu)
CO (1) CO5650175A2 (hu)
DE (1) DE60238560D1 (hu)
HK (1) HK1068914A1 (hu)
HU (1) HU230378B1 (hu)
IL (2) IL161686A0 (hu)
MX (1) MXPA04004184A (hu)
NO (1) NO333828B1 (hu)
NZ (2) NZ533164A (hu)
PL (1) PL216750B1 (hu)
RO (1) RO123525B1 (hu)
RU (1) RU2313368C2 (hu)
WO (1) WO2003038043A2 (hu)
ZA (1) ZA200403573B (hu)

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6342369B1 (en) 1997-05-15 2002-01-29 Genentech, Inc. Apo-2-receptor
TWI318983B (en) 2000-05-02 2010-01-01 Uab Research Foundation An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
US8071740B2 (en) * 2000-11-17 2011-12-06 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same for regulation of angiogenesis
AU2003222427B8 (en) 2000-11-17 2010-04-29 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same
CA2447602C (en) 2001-05-18 2011-11-01 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Anti-trail-r antibodies
DE60232660D1 (de) 2001-07-03 2009-07-30 Genentech Inc Humane dr4-antikörper und deren anwendungen
AU2002307793B2 (en) 2001-10-19 2007-01-25 Vascular Biogenics Ltd. Polynucleotide constructs, pharmaceutical compositions and methods for targeted downregulation of angiogenesis and anticancer therapy
AU2008201431B2 (en) * 2002-11-27 2011-11-24 Irm, Llc Methods and compositions for inducing Apoptosis in cancer cells
PL210174B1 (pl) * 2002-11-27 2011-12-30 Irm Llc Sposób indukowania in vitro apoptozy komórek nowotworowych, przeciwciało anty-DR5 do zastosowania w tym sposobie, kompozycja farmaceutyczna i komórka zwierzęca wykazująca ekspresję kwasu nukleinowego kodującego to przeciwciało
US20060228331A1 (en) 2003-10-10 2006-10-12 Novo Nordisk A/S IL-21 Derivatives and variants
MXPA06004199A (es) * 2003-10-17 2006-06-28 Novo Nordisk As Terapia en combinacion.
KR20070010046A (ko) * 2004-04-06 2007-01-19 제넨테크, 인크. Ｄｒ5 항체 및 그의 용도
JP5237638B2 (ja) 2004-08-06 2013-07-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド バイオマーカーを用いたアッセイおよび方法
RU2410438C2 (ru) 2004-08-06 2011-01-27 Дженентек, Инк. Анализы и способы, использующие биомаркеры
BRPI0515604A (pt) * 2004-09-08 2008-07-29 Genentech Inc método para o tratamento de células de cáncer e método de tratamento de uma doença imune relacionada
RU2007112929A (ru) * 2004-09-08 2008-10-20 Дженентек, Инк. (Us) Способы применения лигандов рецептора смерти и антител к cd20
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US8129124B2 (en) 2005-02-02 2012-03-06 The Uab Research Foundation Agents and methods related to reducing resistance to apoptosis-inducing death receptor agonists
US8029783B2 (en) 2005-02-02 2011-10-04 Genentech, Inc. DR5 antibodies and articles of manufacture containing same
AU2011259844B2 (en) * 2005-02-02 2012-11-01 The Uab Research Foundation Agents and Methods Related to Reducing Resistance to Apoptosis- inducing Death Receptor Agonists
JP2006265155A (ja) * 2005-03-23 2006-10-05 Link Genomics Kk 癌の免疫療法
WO2006138739A2 (en) 2005-06-17 2006-12-28 Tolerx, Inc. Ilt3 binding molecules and uses therefor
CN101365951B (zh) 2005-08-16 2013-09-11 健泰科生物技术公司 通过检测细胞/组织中galnac-t14的表达判定对apo2l/trail的凋亡敏感性
AU2007345745C1 (en) 2006-06-19 2013-05-23 Merck Sharp & Dohme Corp. ILT3 binding molecules and uses therefor
ES2725023T3 (es) 2006-10-12 2019-09-18 Galera Labs Llc Métodos para el tratamiento de la mucositis oral
CN101157729B (zh) * 2007-10-23 2011-01-12 南京大学 一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体及其应用
US9120855B2 (en) 2010-02-10 2015-09-01 Novartis Ag Biologic compounds directed against death receptor 5
CN103282495B (zh) 2010-10-29 2017-06-09 第一三共株式会社 新的抗dr5抗体
TR201808018T4 (tr) 2011-04-25 2018-06-21 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-B7-H3 antikoru.
JP6267638B2 (ja) 2011-09-26 2018-01-24 ガレラ・ラブス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＧａｌｅｒａ Ｌａｂｓ， Ｌｌｃ 疾患の治療方法
EP3632471A1 (en) 2012-10-11 2020-04-08 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate
JP6272230B2 (ja) 2012-10-19 2018-01-31 第一三共株式会社 親水性構造を含むリンカーで結合させた抗体−薬物コンジュゲート
CN104383520B (zh) * 2013-08-19 2016-09-07 江苏靶标生物医药研究所有限公司 一种抗肿瘤药物组合物
SI3088419T1 (sl) 2013-12-25 2019-01-31 Daiichi Sankyo Company Zdravilni konjugat anti trop2 protitelesa
KR20230162159A (ko) 2014-01-31 2023-11-28 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항-her2 항체-약물 접합체
IL300540B1 (en) 2014-04-10 2024-04-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Preparation method for drug conjugates - antibody against - HER3
AU2015380455A1 (en) 2015-01-26 2017-08-03 Macrogenics, Inc. Multivalent molecules comprising DR5-binding domains
CN116059395A (zh) 2015-06-29 2023-05-05 第一三共株式会社 用于选择性制造抗体-药物缀合物的方法
CN108350009B (zh) 2015-08-11 2021-07-09 加莱拉实验室有限责任公司 具有口服生物利用率的五氮杂大环状环络合物
CN108472359B (zh) * 2015-08-19 2022-02-01 北京先通国际医药科技股份有限公司 Trail受体结合剂及其用途
LT3354729T (lt) 2015-09-24 2024-04-25 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-garp antikūnas
JP6797203B2 (ja) * 2015-12-17 2020-12-09 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー デスレセプターアゴニストによる全身性硬化症の改善
CA3046293A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and immune checkpoint inhibitor
WO2018138297A1 (en) 2017-01-27 2018-08-02 Kymab Limited Anti-opg antibodies
US11246950B2 (en) 2017-04-13 2022-02-15 Galera Labs, Llc Combination cancer immunotherapy with pentaaza macrocyclic ring complex
CN108992671B (zh) * 2017-06-06 2021-02-12 深圳市中科艾深医药有限公司 一种药物组合物及其制备治疗肝损伤的药物中的用途
TW201919692A (zh) 2017-06-07 2019-06-01 荷蘭商珍美寶公司 包含抗體之醫藥組成物和其使用方法
KR101951025B1 (ko) * 2017-08-17 2019-02-21 서울대학교산학협력단 세포사멸 수용체 저해제를 유효성분으로 포함하는 cx3cl1 케모카인 과발현으로 인한 질환 예방 또는 치료용 조성물
WO2019039483A1 (ja) 2017-08-23 2019-02-28 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの製剤及びその凍結乾燥方法
AU2018327171B2 (en) 2017-08-31 2023-03-09 Daiichi Sankyo Company, Limited Improved method for producing antibody-drug conjugate
BR112020003466B1 (pt) 2017-08-31 2023-12-12 Daiichi Sankyo Company, Limited Métodos de produção de composto, e, composto
CA3125713A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
CN109810194B (zh) * 2017-11-21 2020-11-03 深圳市中科艾深医药有限公司 抗dr5的抗体及其制备方法和应用
CN109810193B (zh) * 2017-11-21 2020-11-03 深圳市中科艾深医药有限公司 抗dr5的抗体及其制备方法和应用
AU2019337051B2 (en) 2018-09-06 2023-11-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel cyclic dinucleotide derivative and antibody-drug conjugate thereof
US20220177601A1 (en) 2019-03-25 2022-06-09 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-her2 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
WO2020196474A1 (ja) 2019-03-25 2020-10-01 第一三共株式会社 抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート
BR112021023901A2 (pt) 2019-05-29 2022-01-18 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado anticorpo-fármaco anti-trop2, composição farmacêutica, método para tratar ou prevenir câncer, e, uso de um conjugado anticorpo-fármaco anti-trop2 na fabricação de um fármaco para o tratamento ou prevenção do câncer
WO2021079958A1 (ja) 2019-10-25 2021-04-29 第一三共株式会社 抗ｇａｒｐ抗体と免疫調節剤の組み合わせ
BR112022015283A2 (pt) 2020-03-06 2022-09-20 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado anticorpo-fármaco incluindo derivados de dinucleotídeos cíclicos
CN115348971A (zh) 2020-03-30 2022-11-15 国立研究开发法人国立癌症研究中心 抗体-药物缀合物
US20240115720A1 (en) 2021-01-13 2024-04-11 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
TW202241454A (zh) 2021-02-01 2022-11-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－免疫賦活化劑共軛物之新穎製造方法
WO2024052685A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 MyricX Pharma Limited Cytotoxic imidazo[1,2-a]pyridine compounds and their use in therapy

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6812327B1 (en) * 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
JP2001514888A (ja) * 1997-08-15 2001-09-18 アイドゥン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｔｒａｉｌレセプター、これをコードする核酸、およびその使用方法
ATE330972T1 (de) * 1999-06-09 2006-07-15 Genentech Inc Apo-2l rezeptor-agonist und cpt-11 synergie- effekt
US6294546B1 (en) * 1999-08-30 2001-09-25 The Broad Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Uses of diterpenoid triepoxides as an anti-proliferative agent
JP2003510253A (ja) * 1999-09-15 2003-03-18 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ａｐｏ−２レセプター抗体
LT2857516T (lt) * 2000-04-11 2017-09-11 Genentech, Inc. Multivalentiniai antikūnai ir jų panaudojimas
TWI318983B (en) * 2000-05-02 2010-01-01 Uab Research Foundation An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
RU2004116476A (ru) 2005-03-27
PL216750B1 (pl) 2014-05-30
CA2465314C (en) 2013-12-10
NZ568727A (en) 2009-08-28
BR0213846A (pt) 2006-11-21
NZ533164A (en) 2008-09-26
HUP0600602A3 (en) 2012-09-28
HK1068914A1 (en) 2005-05-06
IL161686A0 (en) 2004-09-27
EP1506285A4 (en) 2007-09-26
ZA200403573B (en) 2005-08-31
CN100506277C (zh) 2009-07-01
ATE491019T1 (de) 2010-12-15
NO333828B1 (no) 2013-09-23
NO20042266L (no) 2004-07-23
RO123525B1 (ro) 2013-04-30
CA2465314A1 (en) 2003-05-08
WO2003038043A2 (en) 2003-05-08
BRPI0213846B8 (pt) 2021-05-25
JP4663232B2 (ja) 2011-04-06
AU2002360307B2 (en) 2008-01-17
WO2003038043A3 (en) 2004-11-18
CN1630516A (zh) 2005-06-22
JP2005519871A (ja) 2005-07-07
CO5650175A2 (es) 2006-06-30
BRPI0213846B1 (pt) 2019-10-15
EP1506285B1 (en) 2010-12-08
HUP0600602A2 (en) 2006-10-28
EP1506285A2 (en) 2005-02-16
RU2313368C2 (ru) 2007-12-27
PL374061A1 (en) 2005-09-19
KR20040081422A (ko) 2004-09-21
IL161686A (en) 2010-12-30
DE60238560D1 (de) 2011-01-20
MXPA04004184A (es) 2005-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU230378B1 (hu) Anti-DR5 ellenanyagok és anti-DR4 ellenanyagok és más terápiás ágensek kombinációi
KR102638104B1 (ko) 이특이적 her2 및 cd3 결합 분자
RU2573897C2 (ru) Антитела к cxcr4 и их применение для лечения рака
JP6912386B2 (ja) 癌特異的なＩＬ１３Ｒα２を認識するＣＡＲ Ｔ細胞
CA2163989C (en) Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US20180036421A1 (en) Methods of making dll3 antibody drug conjugates
JP5496897B2 (ja) Ｂ７ファミリーメンバーのｚＢ７Ｈ６ならびに関連する組成物および方法
JP2023099206A (ja) Ｃｄ２０結合分子およびその使用方法
JP5769969B2 (ja) Ａｘｌ抗体
JP5535633B2 (ja) 癌の診断および処置のための組成物および方法
US20160264673A1 (en) Mic-binding antibodies and methods of use thereof
HU229417B1 (hu) Egy tumornekrózis faktorral rokon apoptózis-indikáló ligandum receptorára specifikus antitest és alkalmazásai
KR101370164B1 (ko) 신규 항ｃｄ98 항체
JP4371814B2 (ja) 腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドレセプターに対して選択的な抗体およびその使用
KR20150002621A (ko) 항 ｓｅｚ6 항체들 및 사용 방법
JP2011505120A5 (hu)
KR20190015747A (ko) Baff-r 표적 키메라 항원 수용체-변형된 t 세포 및 그 용도
TW202031687A (zh) 一種融合蛋白及其用途
CN115989242A (zh) 间皮素靶向抗体、嵌合抗原受体及其应用