HU229417B1 - Egy tumornekrózis faktorral rokon apoptózis-indikáló ligandum receptorára specifikus antitest és alkalmazásai - Google Patents

Egy tumornekrózis faktorral rokon apoptózis-indikáló ligandum receptorára specifikus antitest és alkalmazásai Download PDF

Info

Publication number
HU229417B1
HU229417B1 HU0400951A HUP0400951A HU229417B1 HU 229417 B1 HU229417 B1 HU 229417B1 HU 0400951 A HU0400951 A HU 0400951A HU P0400951 A HUP0400951 A HU P0400951A HU 229417 B1 HU229417 B1 HU 229417B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
tra
antibody
seq
dna
Prior art date
Application number
HU0400951A
Other languages
English (en)
Inventor
Tong Zhou
Kimihisa Ichikawa
Robert P Kimberly
William J Koopman
Original Assignee
Uab Research Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Uab Research Foundation filed Critical Uab Research Foundation
Publication of HUP0400951A2 publication Critical patent/HUP0400951A2/hu
Publication of HUP0400951A3 publication Critical patent/HUP0400951A3/hu
Publication of HU229417B1 publication Critical patent/HU229417B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Description

A találmány tárgya olyas 0lansuyag, amely képes spscínkusan kötődői temoroekrózis taktoraal -(amit a leírásban «zéróul „.THF’-nek nevezőnk) kapcsolatos apoptözist inddkáiö h'gandum (amit a bírásban ezentúl ,,TRA1U'-r.sk nevezitek) recepiorasak egy típusához, közelebbről egy nmaeklonális ellenanyag, amely apoptözisi indukál te vbm és úrrte-o a receptor egy típusát expresszáló sebekben, valamint az azon .alapúié terápiák,
A TRAÍL a fehérjék 'IW-esaláájAn&k tagja, amely tartalmazza a TNF-ö-4 és a Fas-iignndumot (I i, Ezen fehérjék az apóptózis hatásos iadukáiószercí, Mindmáig a TRÁÍL 5 receptorát azouoskshák. amelyek közöl kettő, a DR4 (TRAI.L-R.I) és DR5 (TRA.IL-R2) (2-7) képesek az apóptózis jel továbbítására, míg a másik bárom, a DcRi (TRAÍL-R3), öeRT (TRAiL-R4), és oszteoprotegerin ÍOFG) nem transzdukáija az uptíptozis jelet (§-12), Mind az öt TíLófL-reeeptor szígaifiksos homöíőglát mutat az exitaeeHoláns ilgsndumkőtő doroéoj.ében. Hasonlóén a Fas-hoz és TNe-reespíor-i-has (snfif a leírásban ezentúl „'n^FRF’-aek ncvszünk), a ÖR4 és ÖRS íntraeeikdáfis szegmense hakil-dnroéní iartaimaz, ás íransztíukálja az spoptezís jelet egy olyan Kivonulón keresztül, amelyben részt vesz a Fas-asszecíúit haláidomén-fohétje (amit s leírásban ezentúl „FADD”nák nevezitek) és a kaszpáz-8 (6, 7). Az apopiózís jel továbbítása tnslleü a DR4 és ÖRS receptorok képesek aktíválíK a NFxb-útvonalat is (ő, 7).
A TRAÍL demonstrált biológiai funkciói közé tartozik a képessége transzformált daganatsejtek apoptózásának szelektív mdokálására, míg normális sejtek viszonylag raslsztensek a TRASL-kőzvetiíetí spoptózísta (13-15); Ez a szelektivitás azt sugallja, hogy a Fas-iigandammal ellentétben TRAÍL beadása nagyon alacsony színbi toxickással jár, amint ezt demonstrálták TRAIt szisztémás beadásával állati modellben, szignifikáns toxicitás iiidukálása nélkül (13). Ezáltal & TRÁlL-t javasolták hatásos apopsőzls-indelíáló szerként, amely alkalmas lenne terápiás szemek rák és abnormális sojiprofiferáeiővai járd egyéb betegségek terápiás szerekém. Azt is javasolták, hogy a TRÁÍL hatásos anspíózis-indukáló szer, amely alkalmas lenne autoimmun és gyulladásos betegségek kezelésére. Demonstrálták, hogy a TRAiL-közveíitett apostőzls teszt vesz a T-sejtek aktiválás-indukált halálában, ezáltal a Fas-iigandum alternatív mechanizmusaként szolgái (lé, 17). A TRAít-közvstiteh apóptózis szerepet játszhat T-sejtek és egyéb gyulladásos sejtek apoptözisának tedukáíásába® is 08), és szerepet játszik az NK-sejtek ölőaktlvitásáhan (19-21), ős a dendrikus sejtek itnronnmodnlsfor működésében (22, 23). Ezáltel a TRAIL-feözvetlteti apopiázis szempet játszhat az immunprivlíégium ás immunteiügyeíésben is.
A TRíML-neeeptor rendszer komplex, és legalább két baiábeeepísrt, a ÖRT-et és DR.S-öf. és legalább két nem-apoptőzisös receptort, a DeRi-et es DcB2-i foglal magában. Ezen receptorok mindegyüké nemcsak, nagy aminnsav-szekvencia homológját maist, hanem hasonló kötési aktivitást a TRAIt iránt (2-12), A DeR 1 és DeR2 receptorok képessége versengésre a TRAÍL kötéséért apóptózis índukólása nélkül azt sugallja, hogy azok álcareeeptorokként hathatnak, amelyek gátolják vagy mmioiáliák a TRAlt-iigsodum aktivitását. Ezenkívül arról is beszámoltuk, hogy nem transzformált sejtek az áicareceptorok magasabb szintjét expresszálják,, ínint a transzformált sejtek, Ezáltal azt javasolták, hogy a halál- és álcarsceptorok expressziójának differenciális moduláció}?. kulcsfontosságú szabályozó mechanizmus lehet, amely meghatározza sejtek érzékenységét TRAÍLközvetíteti apoptözísra, a receptor-specifikus ellenanyagok hiánya miatt (2), Habár a DR4 és ÖRS expresszióját és funkciójút behatóan taoulmányoz-ák, a haladást gátolta a receptor-specifikus monbklonáhs ellenanyagok hiánya. Nem dokumentálták a ÖR5 sejtfelszíni erpressziéját. beszámoltak erről, hogy antí-TRAlL-reccpíor ellenanyagok panelját aliítotiák elő, amelyek képesek Szudánomé sejtek apopíózisénak iasfokálásám í« vöm, ás csak S2 ellenanyagok ímnísfoilizálásával a kerasztkötés elősegítésére, és - bizonyos esetekben - a sejtek akíínomieíoD-vcl való tenyésztést igényelnek (24). Számos antl-l>R5 ellenanyagot előállítottak (24), Azonban ezen korábban előállított anti-l>85 monoklönálts ellenanyagoknak alacsony az apoptózist indukáló aktivitása ó? vöm, még keresztkőtés mellen Is, Nem szántónak be fo vívó aktivitásról, Ezen ellenanyagokat nem alkalmazták TRAItreceptorok sejtfelszíni expressziójáusk vizsgálatára (24). Ezáhnl igény van az egyes specifikus TRAILreceplssrokm szelektív moaokfosálís ellenanyagokra, amelyek nemcsak képesek kötődni a sejtfelszíni receptorhoz, Essem képesek éréssé spoptózíst indukálni abnormális sejtek kökmléle tlposaíbsu, beleértve dsgsnatsejrékeí, minő in Άνο, mind I» vlfro, anélkül, hogy kereszikötésrs vagy immobilizációra lenne szükség. ilyen ellenanyag nemcsak lehetséges terápiás szer lenne, hanem diagnosztikai eszköz is a TRAIt-receptor fookcíouáiís elemzésére. Különleges igény w a haiáMadukáiő DR4 és DRS receptorok mindegyikére speclfíkns ellenanysgáány.
Számos betegség kialakulásában vagy előrehaladásában gyakran az történik, hogy a sejtek nem tűnnek, el. Sok aotrsimroiíö betegségben és gynllaáásos állapotban a tálaló aktivált ..sejtek megtámadják a normális szöveteket vagy sejteket, Ezettkivöi & iumorigenezás előrehaladását és a renmatoid mtritisz prolifetatlv patmszának kialakulását is a sejtek ellenőrizetlen jsolberámója. jsllemíá.. Ezáltal as .elégtelen apopfdzís betegség kialakulásához vezet, és az apoptózist indukáló ligámban vagy agonisfo monoklooálís ellsosnyag alkalmazása apoptózis fokozására potenciális terápiás stratégiának tekinthető ezen nemkívánatos sasiak slitniaslására.
Példáol a renmatotd artritlsz (amit a leírásban ezentúl ,,RA”-nak nevezünk) gyakori komán amoimmtm betegség. Az RA patoíizmlög?,íjának jelenlegi értelmezése az, hogy autoimmun T-sejtek ás B-sejtek gyniksáásos választ hrdlíao&k meg az ízületekben, ami létrehozza a szioovfoclták hlperpruhferáeioját. A xzhtoviáhs sejtek hipeiprolitsréclőiának kbveíkezméuyeképpsi· metalfoproteinázok (amit a leírásban ezentúl .„MMRrének nevezünk) íúhermdöáuek, ami ezután a porc és csont erozív destrukciójához vezet, ami az. RA jellemzője (25). Ezáltal az mtiammaterikus szlnoviális sejtek kontrollja kulcslápáa as RA kezelésében. A szirsovláiss sejtek hiperprokferáciájához vezető molekuláris mechanizmus még ismeretlen. Habár & híperproiíteráló szisoviáiis sejtek nem rosszindulatóak ás asm traosztermáltaií, sok vizsgálat javasolta, hogy varrnak közös folajdooságaík a transzformált sejtekkel (4új. Ezen sejteket, az úgynevezett „b'anszíbtmáiréak tűnő szmovioehákat” söré durva felületű endopiazmatikus retikoinm, számos szabálytalan aiská sejtmag és a normálisan orsó alakú sejtváz változása jellemzi. Azt javasolták, hogy onksgéuek és vírus eredetű gének beépülése lehet az elsődleges oka az RA szineviálls sejtek transzformált kinézetének.(46),
Áz RA legalább két aspektusa sugallta azt, hogy a szabályozatlan apoptózis hozzájárulhat a betegséghez, és hogy apoptózis terápiás kiváltása hatásos kezelés lehet: az aktivált T-sejtek eliüoteiésének hiánya azt sugallja, hogy ezen T-ssjteknak detektív az akíivácfo-iutiuRóli sejthalála, ami olyan folyamat, amely Faskőzveíkett spisptózlst és TRAlL-közvelhett apoptózist foglal magában, ás az RA szinoviáus sejtek htperproiii'e.rativ természete hozzájáruló tényező az RA patait biológiái ának későbbi fázisaiban. Sőt azt is kimutatták, hogy aoti-Ess efemysg beadása a gyulladt ízületekbe gátolja krónikus srttiösz kialakulását fos- ttwszgeolkas egerekben, amelyek a hssmáa RA. állati 'modellje (2ő). Ezenfelül Eas-ligsndns'í génnel adenovirus vektor útján történő lokalizált transzdakció hatásos a kollagén-indukált artritlsz megakadályozásában (22). Az ioílamntaíorikas szinrsviáhs sejtek prellferáeiélának gátlásét ügyelték meg mimikát esetben Fas-közvetüett aospíózls fokozása révére Habár a fas-ilgandum érés apoptózis-índokáiöszer RA szmovlális sejtekben, a kasligandum-közvetitett apoptózis alkalmazása terápiaként emberekben korlátozott a totális májtoxlcitás miatt,. Ezállal a TfiAlI.-reeeptor-lndnkáh apoptózis egy hrzsooságosahb és hatásosabb terápiát istent az RÁ kezelésében, {nini 3 has-hgansinfíuiudukált apoptózis,
A TRAlL-recepíor-isdukáit apoptózis egy biztonságosabb és hatásosabb terápiát jelent rák kezelésében Is, mint a Fas-ligaífeum-hsdnkáh jgxíptózls. A TKAlL-tózvettet apoptőzisről ismert, hogy specifikusan indukálja Uanszfermált dagaoatsejtek apoptóKisát, anélkül, hogy befolyásolná a sonaális sejteket Kimutatták, hogy irimerizált oldható TRÁit szisztémás beadása nem volt toxikus kísérleti állatokban, de mégis képes veit beülteteteti daganatok regressziójának indukálására (13, 23). Az. alkalmazását járadékos terápiára hagyományos kezelések mellett kiemeli az- a nemrég! eredmény, hegy a DR5 expresszlóia és etniótáksejíek érzékenysége TRAILindukált spoptózlsra feknzódnh besugárzás hatására, sogallvs, hogy besngárzással kombinálva a TRAIL hatásossága növekedne rákterápiábaa (29).
Ezenfelül a 13R5 I^AlL-recepfestkódoló gént a 8p21-22 kromoszómára térképezték, astely lókusznak nagy a mutációs gyakorisága. bizonyos ráksejtekben (30j, Beszámoljak attól, hogy legalább kétfelé dagaííassejp a kis tüdőrák (31) és a tej és nyak rák (32) mutat mutációkat a DRS-gén haláláoméniéhsn. Ezálsal igény vaa ami-DRó ellenanyagra a rákkutatásban a receptor epiíápvarlációja hatásának meghatározásra a rákok kialakulásában és előrehaladásában. Továbbá a 'FRAlL-rseeptor muttlelók nmkoionalitása hasznos 'klinikai diagnosztikai eszköznek bízonysihot, amikor együtt alkalmazzuk nafe biomsrkerekkei a rákok sorai detektálásában és daganatok agresszivitásának megjóslásában.
A találmány tárgya az. 1. igénypontba® feltárt ellenanyag.A találmány tárgya olyan ellenanyag., amely felismeri a .ÖRS TRAlL-teeeptotí, és amelyapopíózist indukál DR5-öt espresszálő sejtben ín vivő ás felismeri a DRS-ői, de oetn Ismeri föl a DR4-et, DoRi-eí és DcRM
Á találmány szerinti ellenanyag alkalmazható sejtproliferáció gátlására a sejt kitételével DRA-höz kötődni képes elfeoaoyag terápiás .mennyiségének. A találmány tárgyát képezi továbbá gyógyászati kőszitnvány, astely a találmány szerinti I3RS ellent aktivitású ellenanyag terápiás mennyiségét rartahsazza, valamint gyósyászatilag eliogadbsíé hordozót és sz. ellenanyagot és a hordozót tartalmazó tartályt. A találmány tárgyát képest, továbbá DRS-öt felismerő ellenanyag alkalmazása abnormális vagy hibásan szabályozott sejtek szelektív apoptózisára alkalmas terápiás szer előállítására,
A találmány tárgya az ellenanyag alkalmazása apoptózissal kapcsolatos betegség kezelésére olyan eljárással, amely szerint apöpíózissal kapcsolatos betegséget mutató célszövetet kifeszűnk tuláimáoy szermii ellas-anyzg terápiás mennyiségének..
A találmány tárgya, továbbá fúziós fehérje, amely legalább lő bázssnyl onilgénbalásü TRAIL-rccepior ammessv-szekveneiái tartaknsz, kapcsolva immsngfehulin fehérjéhez vagy ansmk fragmenséhez, amely képes ismnjinváfesz kiváltására az alanyban.
A találmány iárgyát képezik, nokiernssv-szekvenclák és ammosav-szekvsuoiák, ajnelyek PRS-re szelektív ellenanyag nehéz és könnyű immunglobuf nláncái kódolják.
A tsdáLmáoy tárgyát képezi humánizék TRA-S-at termelő gazdasejt.
A találmány tárgya eljárás humanizált DRS ellenanyag előállítására,. amely szerint gazdát mmszfertnáisjnk humanizált: inimungioboliísn kőnísyd láncot és hmnanizáii immunglobulin nehéz láoeur kódoló nskleiosavszekvenclákkaL ami vitán a Sranszformák gazdát inkaháljuk egy előre megbatározott Ideig.
A találmány tárgya továbbá eljárás scjtprollferácíö gátlására, amely szerint célsejtet érintkezésbe hozunk humanizált DR.5 ellenanyag gyógyászatliag hatásos mennyiségével.
A találmány tárgya kereskedelemben forgalmazható reagerjskésriet sejthalál indukalására, amely DR5re szelektív humanizáit TRA-8 ellenanyagot tartalmaz, megfelelő tartályba csomagolva, használati utasítással együtt
Az alábblakbas röviden ismerte dák a leíráshoz tartozó ábrákat:
Az 1, ábrán a TRA-® jellemzését mutatjuk be. (aj s TRA-8 kötöspeelfstáss: Wesiermhiot elemzés (leisó rész): a TNFR családba tartozó rekombináns fúziós fehérjéket prőbázstek TRA-8-cál vagy nntl-homojn-lgGvek I. sáv: BRf/hlgGl fúziós fehérje (ítniönnogén): 2. sáv: DlGGhlgQI (TRAIE-RÍ'X 3. sáv: GRÓtbigGÍ 4. sáv: TRAIL-Rl <pcR>!>StlgGl; 5. sáv; TRA1L-R4 (löeS-zjóágGI; 6, sáv: COüfehlgGl 7, sáv: oldható TNFSL BUSA elemzés (alsó rész): Á mérőhelyek száma megegyezik a Western-blotéval, kivéve a 8. mérőhelyet, amely egér DRSZfeígOl fúziós fehérje. (b.) Oldható TSAIL és TRA-8 kötési aktivitása BR3-böz és DRá-hez: ELSSA mskrotiíerle-mezeket vontunk be í>R5/hlgGl-gye1 (balolslali rész) vagy DK<VhIgGl-gyel (középső rész), és azután inkubákuk TRAlL-lei vagy TRA-S-eak (e.) ÖRS felszíni expresazíójásssk áramlási csomeírtás elemzése, Cos-? sejteket Iranszfektáhn&k peDNAd expresszids vektorral, amely tartalmazza a teljes hosszúságú DR5 cDNS-t (leli hísztograso), DR4 eÖNS~t (üres hisztogram, sima vonal), vagy üres vektorod (üres hlsztogram, szaggatott vonal). 48 érával a irauszfekció után a sejteket festettük TRA-S-uai, maió.PE-ve-l konjugálí snti-egérIgGí-gyek (á.) fa só» immmshisziökémtal reaktivitás DRS-re: ORS-éí expresszálo vagy kontroli vektorral Iranszfekíáh Cos-7 sejtek Cyíosrá» letnezait festettük TRA-8-cai 48 érával a traoszfekcié mán, <&> TRA-8 ölőaktivitása: Juthat sejteket inkubáitunk TRA-Ü jelzett koncentrációival, A sejtek életképességét kfRéííe, A?7T, és Rf kizárási vizsgalati eljárásokkal határoztak meg éjszakán keresztéi történő tenyésztés után. Az ATRáke és MIT vizsgálati: eljárások eredményét a lápközeg-kosíroli százalékában adjak meg, és a Pl vizsgálati eljárás eredményét: a Rí-negatív sejtek százalékában adjuk meg, (f.) Kasspáz-aktíváiás Western-blot elemzése: farkat sej teket inkuhálfemk óRö sgínü TRA-S-cai a jelzett sósig, A sejtlizátumokat !$%-os SGS-RAGEm választottak el, bloítoituk, és próháztnk anti-kaszpáz slfenanyagijkksl A oviink jelzik a kaszpáz hasítod alegységeit. («,) Raszpáz-gátlási vizsgálati eljárás: Jutkái, sejteket mkubáltank Sö ngmtl TRA-8-eaí éjszakán keresztül a jelzett kaszpázénblbiiotnk különböző koncentrációinak jelenlétében, A sejtek életképességét A fTbuíe vizsgálati eljárással határoztuk meg.
,-á 2. ábrán ÖRS sejtfelszíni expresssióját és a ÖRé-kösvatitatt apoptozrstu való érzékenységet mutatjuk be. Peri fériás vérből frissen izolált normál T« és B-sejteket la és a’), gliómát (b és b'), prosztatarák sejtet (c) és B-sejt sejtvomdakat (d) inkubálttstk TRA-S-csl vagy egér igG í izotípus kontrol ellenanyaggal, majd PS-vel közjogéit kecske antl-sgér-lgGi-gyel. Az üres hlsztogmmok jelentik az izotípas ellenanyag kontrolit, míg a teli biazfegrantok jelentik a TRA-8-festést. Az apeptözisí sz ARRbüfe vizsgálati eljárással határoztuk meg éjszakát! keresztül inkah-álás után, oldható TRAlL-lai (üres körök) vagy TRA-h-oal (seb körök), amint az a, fe* és ő ábrán bemutatjuk.
A 3a* ábrán 1.1937 T-sejtvonalat. inknbáhonk: TRA-S-cal vagy egér IgGl izotipus-kontroll ellenanyaggal. Az iipöptózisí az, 4-77%W vizsgálati eljárással határoztuk meg éjszakán keresztül történő inkubálás után, oldható TRAÍL-iei (üres körök) vagy TRA-8-cai (teli körök).
A. 3. -ábrán güoma (b) és prosztatarák («'} sejívort&lrskat Inkübáitank. TRA-8-eal. vagy egér IgGl iztstspus-kontrőíí ellenanyaggal. Az spoptóziat azÁTFiífe vizsgálati eljárással határoztuk meg éjszakán keresztül történő uskübálás mán, oldható TKAlL-iei (üres körök) vagy TRA-S~cáí (teli karok)
A 4. ábrán ábrák sorozatát matatjuk be, atnelyek humán Jtsrkat sejtek életképességét matatják (Aj TRA-L -8 és -19 ellenanyag törzsek és (B) TRA1L jelzett koncenteáeióival történő Inkubálás «társ: a találmány szerinti- eileitenyagtőrzs 4Á. ábrán bemutatott rögzített kattetmtráciájáask jelenlétében.
Az 5, ábrán DRS expressaiőját mutatjuk be «orrnál és rákos szövetekben: Normái és rákos szöveti hmstegenizáttertőkaf próbáztunk TRA-8-eái, és festettünk keteilncnteeszeensiával (tus DkŐ-fekérje Westetubfet-elemzése normális szövetekben; 1. sáv: máj, 2, sáv: sgy, 3. sáv: tad§s 4. sáv: -vese, 5, sáv; lép, S, sáv; here, 7, sáv: petefészek, §, sáv: szív, 9. sáv: hasnyálmirigy, (b.) DRS-tebérje Wesíerrt-blot elemzése rákos szövetekben. Az alábbi szövetekből származó rákos szöveti blofot próbáztttk: petefészek (i. sáv), ítsdö (2, sáv), máj (3, sáv), végbél (4, sáv), méhnyak <5. sáv), bér (é, sáv), here (7. sáv)·, pajzstnirsgy ék. sáv), méh (lö. sáv), gyomor <11. sáv), garat (12, sáv) és hasnyálmirigy (13. sáv). Normál (c.,j és rákos iá.) szövetek m .tea immaniúsztokésniája. Fagyasztott metszeteket immun otógiailag testete':nk:TRÁ.-S-cal.
A ő, ábrán TRA-8 öagsuteaifcues aktivitását mutatjuk be, SC1D egeteket oltottunk be sztshkatáu I321N i sejtekkel. As egereket intravénássá elteltek löt) ug TRA-8 egyetlen dózisával a daganat beoltása utáni '2. napon ín,}, vagy 100 g.g TRA-8 három dózisával 7 nappal a daganat beoltását követőét: kezdve, (b) A daganatok növekedését a tömeg slagján határoztak meg, és szövettanilag elemeztek K&S festéssel. A fényképek életképes ásgaaateövekeáásí mutatnak a kontroll egerekben, de a TRA-S-eal kezelt egerekben nem <e„ felső rész), és a daganat H&E fesfödését <«., alsó rész). SQIP egereket oltottunk intravénásán lö4 Jutkát sejttel és keretetek TRA-8 egyetlen dózisával az ebás mán: második napon. Hét nappal később iéosejtekaí gyűjtöttünk, festettük szokat antí-ütettán-CDő elletttetyaggal, és elemeztek árstulási ciiatneulával (d,), vagy ímuínti-húteokéntíával <e,},
A 7, ábrán sejtíelszite ÖRS expressziójáf ntufetjük be RA (A) és ÖA (R) szlnovlális sejtekben. Ixiö4 elsődleges tenyésztett szlnőviáiis sejtet festettünk sRlnstás-tisztttott TRA-b-eal, majd PS-vel konjugált kecske anö-egér-igöi ellenanyaggal, 10ÜÖÖ életképes sejtet elemeztünk R-éCSwnage készülékért.
A S. ábrás ábrák sorozatát mutatlak be, amelyek sejtek életképességét nmíatják KA (A) és ÖA (B) szhsoviáiis sejtek reprezentatív törzseinek TRAIL és TMA-8 koacentráciő által indukált apoptözisa függvényében, a rekombíttáríS oldható TRAIL (üres körök) vagy afőnitás-tisztltett 'TRÁ-8 (teli körök) különböző koncentrációs mellett, A sejtek életképességéi a kezelt sejtek e.ptn-je és kezeletlen sejtek epnt-je százalékában adjuk meg.
A 9. ábrán -az RA sziaovislis sejtek DRo-kőzvetkeít apopfözfeánaR kaszpáz-ihggésél bemutató ábrasorszatot nmtatenk be. RA szánoviális sejteket (RAS 12) inkubátenk 59 ngónl oldható Rts-iiganduínteal (üres négyzetek), anti-Fss ellenanyaggal (CH-ÍI) (tel: négyzetek), oldható TRAlL-lel (üres körük), vagy sísti-ÖRé eltenanyaggai (TRA-8) (tel: körök) kaszpáz-mhibborők különböző koneentráeiőmak jefenlétében. Éjszakán keresteti történő tenyésztés után a sejtek életképességét meghatfs.mzzük vizsgálati eljárás alkalmazásával
A I0A. ábrán elekbe fbretiktts „gél-shiS’’ vizsgálati eljárást mteníitnk be, ami Nhkb-aküváiasí jelez. RAlÖlő sejteket mkubálüök 29 ngitel TRP-o-vsl, 50 ng/ml oldható TRAiL-lel vagy 50 ng/ml TRA-k-eal a jelzett időpontokig, telelőit elesírofereiizáljuk. Á Ί9Β. és löC. ábrán MMF-1 és MMP-3 termeléséi óvásijuk be, A jelzet! RÁ sxlnoviáíis sejtek íxlü^únbét inkübáljttk 7NF-n jelzett koncentrációival (üres körök), TRAlL-lel (üres háromszögek) vagy TSA-8-eal (teli körök). Éjszakán kérésztől történő tenyésztés után a tenyészetek íekilúszóit összegyűjtjük, Az MMF száaaMöS szituiéi a tenyészetek feiülúszóibzn ELISA-vsl határozzék meg.
A 1 L ábrán azt mutatjuk be, begy TRA-8 sm indukál hegteoeellulóris toxlcitásó (a.) Normál nrájszövet nem expresszál L>RS-ös. Két normál snájszövet psraffisos metszetét, egy itepteoeelluláris kardnómás szövetet, és HepG2 sejtek Cmspb? készdsnestyét áílitöüuk elő B&E festéshez, és a megfelelő fagyasztod metszeteké) festettük TRA-á-csl. (b,) ÖRS sejtfelszíni expresszíőjáuak áramlási eítometriás elemzése, Két normális ntájszövetfeál és egy hepteoee! teltess karebbstsás esetből «totált hepstedtákst és Hepő2 sejteket festettünk TRA-k-caL zaö-Eas eliemsnytrggaí fí>X2) vagy Izotipus-kontroll eifensnyaggal. A telt hisztogramok jelzik a TRA-8 vagy ÖX2 festést, és az üres hisztogramok jelzik a megfelelő izoíipas-kontroilokat.
A 12. ábrán azt mutatjuk be, hogy a TRAIL- indukálja, áe a TRA-S pádig nem a hepatocehtláns íoxieiiád, Friss, normál humán hepstoteiákat tartottunk fen® Ifeptenosta Tenyésztő Tápkózegben, (a.) A hepsteadták apoptózisát t Ug/ml oldható TRA)L-!éi és keresztkötövel, vagy TRA-ü-oal mdukáítek a jelzett időpontokig. .A sejtek éfeiképssségét ATFLíte vizsgálati eljárással határoztuk meg. Ax eredményeket életképes sejtek százalékában adjuk meg a tápkőzeg honlrollhoz képest, As árnyékolt téglalapok jelzik a TEAtl..~L és a fekete téglalapok jelzik & TRÁ-S-at (b.) A bepteueiiák kondenzált sejtmagjait Koeöfoí 3J35?~vei festettek meg, és áramlási oiKuneteiáv&i elemeztük. (c.) Clklohexlmid hatása a irepteix:dák apoptexlsára, Hspsmeitákaí tenyésztettünk kontroll tápkőzegbén vagy 1 agán! TR Alt,-lei vagy TRA-H-e&i 1 pgúnl oikiohextmíd jelenlétében (teli téglalap) vagy biáuyáhau (üres téglalap) 8 öten keresztek A sejtek életképességét ATALne vizsgálati eljárással határoztuk meg, Az eredményeket két kísérlet hdrnxts párhuzamos tenyészetének átlag & szőtesakésü adjuk meg. (d.j Normál hepaioeiták ÖRS- és Eas-közvteitett apoptőzisra. való érzékenységének összehasonlítása. Frissen izolált hepatoohákut iakubáítenk oldható TRAIL, TRA-S, oldható EasL vagy- a CK1I atei-l'-'as roonokionális ellenanyag jelzett kerteeníráeióval 6 órán keresztül. A sejtek életképességét AZ'RUte vizsgálati eljárással határoztuk meg. Az eredményeket életképes sejtek százalékában adjak meg a tápkózeg kontrolihoz képest Normális hepatöelíák esetén négy·· «orsnál egyén átlag i szórás értékét adjuk meg. Az egy pácienstől származó hepalooellnláris kardnómás sejtek és l-lepö2 sejtek eredményei; hárem párhuzamos tenyészet átlagaként adjuk meg,
A 13, ábrán azt mutatjuk be, hogy a TRAIL hepatitiszt Indukál, Bő egereket «ítravénéssn oltottunk' lö’ pfn adenovifus vektornál, amely humán TRAIL· teljes hosszúságát kódolta a „Tet-oo” transzkripciós elem szabályozása alatt. Á TRA1L expressziéi teiraciklio jelzett dózisával indukáltuk, (a.) LLunán TRAIL-expresszié Nertbem-blot elemzése májban. A vektor beoltást; ás tetrsolRliunei történő mdukálása «ián 24 órával őssz-lTNSt izoláltunk a májból, próbázrnnk humán TRAIL eÖNS-se! vagy β-aktinaai. (fe.) AST szérutnszimje. 24 órával a TRAIL trasszdskotója. után meghatároztuk az· AST szérumszistjét (e.) Adenovirus vektorral fertőzött Uepatociták TRAIL-közveiített sejthalála: Só egereket iruravénásan oltódunk tetmeiklumel indukálható adenovtms v«k:torral, 4S órával az oltás teán hepaíoeiiákat Izoláltunk az oltott és nem oltod koatro.ll egerekből, és inkuhátíuk azokat a TRAIL jelzett koocentteeteival § órán kérésztől (baloldali rész). A hsp&tocita sejtek efetképességet .df'Aőm? vizsgálati eijásdss&l határoztuk meg, Adenovirussal a festi módon oltott egereket oltottunk intravénássá 10 pg oldható hamán Í'R Alt-lei 48 órával később. Mértek az AST szénonszítejér 24 érával a TRAIL injektálása után (jobboldali rész), (d, és e j TRAIL által indukált májkárosodás szövetem! elemzése. A májukat 24 órával (d.) vagy 7 nappal (e,) a TRAll,-ld történő transzdukeiö után gyűjtöttük be. A parafűnos metszeteket H&E festettük, és lefényképeztük IOÖx (felül) es 4felx (alul) nagyításban.
A 14. ábrás ábrák egy sorozsíát mutatjuk be, amelyek azt mutatják, hogy barnás PRMC-bol tisztított aktivált T-sejtek és R-sejtek ΏΕ5 megrsövekedeó: matjét exprssszálj.ák, amist azt áramlási oiteínetriával meghatároztuk ayagafemfean lévő (üres) és aktivált (árnyékolt) sejteken,
A 15. ábtása éleikópességl görbéket mulatunk be TRA-b koncemrácló függvényében a 14. ábrás bemutatott tisztított T-sejtek és R-s«jtek esotebeo, amelyeket 4S órán kérésétől stimuláltunk antl-CDS-mal vagy aotiP-vel, és RSlőohöző sursségö Fifeo/ΑΑβ^β alkalmazásával gyüjuSít aktivált blssztsejtckkcl, Ας életképességet 4 FPáíte vizsgálati eljárással határozzuk meg,
A 1.6. ábrán hsszáogrsmöt és áramlási citemefriás pioíot mutatunk be, amelyen humán E8tM€-vel és TRA-8-cai vagy IgG-vel (kontroll) oltott NÖD/SCiD egerek NK-sejlekm kimerített kapuzolt Rakodta popnláe lójának CD3-o>;pressziójá.t mutatjuk be,
A 17. ábrán CD3-mal és TUNBL-lef festett mikrogsmnokat mutatunk be a 13. példa szerinti egér lépszövetekből..
A IS. ábrán dtotoxicitáss plotekat mutatunk be krónikás Umfodta leukémia (CCL) és normál 8-sejtei hordozó emberekben TRA-S, BÍSYÍH, és azok kombinációja jelenlétében,
A sejtek eltávolításának hiánya sz apoptózis-indukáló rendszer hibái miatt vast, amely kapcsolatos olyan hibákkal, amelyek közé szemlélteíéskénf a ligandum, a receptor, vagy intracelielárlx szabályozó és ofeektor molekulák expreszszlőjának vagy funkciójának hibái tartoznak, A találmány tárgyát olyan eljárásban alkalmazható eszközök képezik, amelyek alkalmasak a defmiens apoptozis-indokáló rendszer kijavítására, valamint egy adott hibás apoptozis-indsikálá rendszer specifikus hibáinak telderltésáre.
A találmány tárgyát az 1. igénypontban definiált ellenanyagok képezik, anrelyek szelektív ív vivő és &t vtem apoptózis-indukáló aktivitása vsa DBS ellen. A taláhnámv reagenskéníalkateazlmtóapoptózisjeitováöbE tásl kutatásban, valamint terápiás szerként alkalmazható TRAlL-reaeptorokaí expresszáló sejtek ellen, anmlyek közé tartozik szemléltetésként ráksejtek széles köre, az. apoptózis rendszer hibás szabályozása ellen, és autoimmun betegségek abnormálison prolíferáló szioovíáiss sejtjei ellen. A találmány szerinti ellonanyagok kötése specifikus egy adott TRÁIL-reeepterm. A találmány szerinti ellenanyagok lehetővé teszik csak azon sejtek célzott apoptőzlsát, amelyek a célzott TRAlL-mceptori exptesszállák,
A találmány szerinti aml--DR5 meoökkmáhs ellenanyag apoptózis hatásos indukálószerkání szolgál ITRó-ot 1« vte-o expresszáló sejtekben, és apoptózis hatásos indukólószere ó? vívó, Humanizált ellettanyaggerlncto ölfetetí humanizált CDR-szekvenda-lfagutetssek, és iáiáimásy szerinti arsó-í>ES oikmanysgok lözlös fehérjéi hasonló apoptózisos tuiajdouságokaí mulatnak.
Mindmáig nem volt elérhető olyan monokkmális ellenanyag, amely kötődik a oejtlelszsm DRS-böz, és keresztkötö hiányában apoptózisí indukál DR5-öt expresszáló sejtekben mind te vteo, mind is ote-o. A találmány tárgya tói.....ö.RS ellenanyag terápiás szerként betegség állati modelljébem mint például xenograEoit állatokban, vagy ó? vívó. Hsbár az oldható TRAIL-receptorröf kimutatták, hogy hatásos dagnnatsejtek apopfózisáusk mdukáittsábsn te vám, az ölőoktivhás nagyon alacsonynak tűnt, és gyakran nagy és ismételt dózisok voltak szükségesek (13), A TRA-ő, amely találmány szerinti ííuú-DEó ellenanyagok sorozatának egyike, gyogyászabiag hatáson humán 1>R$ trsoszgént hordozó állslokban, és alkalmazbaíó a X>ES és TEÁK., szerepérsek vizsgálatára szoigálö modell létrehozására Is.
Találmány szerinti, TRAlL-reeeptor ellen tejmelíetett ellenanyagot a találmány szerint kisérlsh állatból állítunk elő. A találmány szerinti ellenanyag humanizálásával - a recoptorkötö aktivitás fenntartása és emberi
- 8 alanyban csökkent és terápiásán elfogadható immunválasz kiváltása melíett - találmány szerinti humanizált anfí-TRAIE-receptor ellenanyagot alkalmazunk terápiás agoassíakéní, A találmány alkalmas te; víw terápiás szerként, mivel nincs szükség az ami-TRAIE-receptor ellem eiieosoysg másodlagos kcresztkötesére,
A saíélmsav továbbmetat egyetlen antl—TRAlE-ruceptor elten ellenanyagon, amelynek agonista apoptózisos hatása van, inkább két vagy több aníí-TRA'IE-receplor skeni ellenanyagot hozunk érbtkszesbe sejttenyészettel te vites, vagy az alany testének szövetében te v;v<?, hogy szioergista kezelést hozzunk léim. Például az US? gilésns sejtvosa'; és az U93? és Melt-4 hemntnpoietiküs sejtv»nal érzékeny agonlsta anti-DR4 és soriDR5 ellenanyagokkal történő édotttezéste, ntlg agonísts aati-DRS ellenanyag egymagában csak korlátozott eredményt mutat spoptózss ihdukálásábaa.
Ezenfelül antagonísta shti-TRAIE-receptör ellenanyagok különösen hasznosak, amikor egy ellenanyag specifikusan köti a Öc RÍ, DcR2 vagy ÖPG álcsraceptomk egyikét. Álcateceptor szelektív gátlása tsz áfcsreceptort «scprekszáló sejtekben olyan hatásé, hogy eltolja a TRAIE-kötósi egyensúlyi azon TRAILreceptorok irányába, amelyek képesek az apeptőzis jel továbbítására. Ezáltal egy kotnhmálí terápiában álwecepmrt kötő ellenanyag szeozltítel. egy espresszálő sejtet az agonlsta apeptózisos jelét továbbító TR.A1Lreceptor kötésére.
Egy másik megvalósítási mád szerint a találmány szerinti ellenanyag sikalomsható adott TRAÍLreeeptor agóniáin. és aptagonisía epitötótetsk meghatározásra szolgáló eljárásban. Továbbá o',sgb;Rározbaíó egyének közötti, egy adott TRAlE-recepterral kapcsolatos polimorfizmus, különböző CDK-régiéjú moRokkmá.lis ellenanyagok panehánsk alkalmazásával, Monokionélis ellenanyagok jellemzett. panelja lehetőséget ad agomsta és antagomstn epitópok és polimorf zmnsok meghatározását». Ezáltal monokhmáiis eíleHanysgok panelja hasznos drogfőlfedezésben és/vagy alanyok betegségre való fogékonyságának szkrbseiósébea.
A leiárs istactfet fóziás fehérjéket, amelyek TRAlL-rseeptör tmíígéríhatású fragmensét tartalmazzák immunglobulin iehérjéhez, poíipcptidhez vagy annak bagmenséhez kötve. Egy TRAlL-receptor hagmens a leírás szeristi értelemben elegendő bázist hatalmaz ahhoz, hogy Immunogén. választ váltson ki a sejt felszínén sxpresszáh natív TRAIE-teeepter ellen. Egy Immunglobulin fóziős fehétje vagy annak frsgtaenss a leírás szerinti értelemben natív vagy szintetikus- íösérjét vagy peiipeptid~szegmeast tartalmaz, amely elegendő számé aminosavat tartalmaz ahhoz, hogy .aktiváljon egy immunológiai kwkáá választ az alanyba?» A találmány szerinti ellenanyagok szcnzitizerrei együtt Is alkalmazhatók. A leírás szerinti értelemben szenzitissr alatt bármilyen síimolost értőnk, amely apoptözist jndnkál, beleértve olíraíhölya fényt, szerves molekulákat, különöset? beleértve a híszlntfeímüleissidekní, nehézfémeket és szabad gyököket
Rosszindulatú daganatok kezelésével kapcsolatán a TRA-8 képes apopfözist indukálni a legtöbb TRAlL-re érzékeny dísganatssithen, kaszkádíöggó módos és másodlagos keresatköló nálkal. A 'TRA-8 erős dsgaoatsbenes aktivitást mutat te wvo. A TRA-ó képessége a legtöbb TRAlL-érzékeny sejt apoptőzfeáaak tnaakalására stegerősiti, hogy a DR5 egymagában elegendő az apoptózis- kiváltására. A leírásban ismertetett daganat· •sejtek többsége sejtfelszíni DR5-Őt evprexvzái, és a TRA-8-cal indukált sejthalálra való érzékenységek együtt jár a TRAIL iránti érzékenységükkel, jelezve, hogy a DR5 az elsődleges h&iáirecepíor a TRAlE-közvetiteíi apoptözi.sbnn a legtöbb daganatsebben, Ezáltal a DR5 differenciális expresszsóju normál és rákos sejtek között hatásos a TRAlL-közvetitett apoptózis szelektivitásában. A TRA-8 kikerüli az áleareceplotokat a TRA1Lközvetstetf apoptózis tndukálásában. A TRAlb-reaiszíens daganatsejteknek azonban csak a kisebb része érzők.erty TRA-S-ra, Jete®* hogy az áteecepWok mta játszanak lószerepet a daganatsebek TE-AlL-közvetlted apoptózlsa elleni reztsss-eaciában.
Habár korább i vizsgálatok jelezték, hogy a TRAIL o ldható formájának szisztémás beadása állatoknak a daganat regresszióját Indukálja toxifotás okozása nélkül (3, 4, 22), a humán TRAlt msmbráokötött formája májkárosödóst indukál egerekben, amim azt bemutatjuk a leírásban. Azonban a TRAIL hepafite toxfoitásn sokkal kevésbé efos. otint a Fos-llgandamá, zmfot ezt a somtól hepatociták kisebb érzékenysége mutatja a TRAlLdaáokált károsodásra a Fas-ligarsdusnsual összehasonlítva, és ezt mutatja a TRAÍL ót vb-o legalitásának hiánya. Ezáltal a TRÁH, bírálása haszaos a ráteerápiábso.
Amint részletesen leírjuk, kimutatjuk a ÖRS lehárjeoxprssszló szignifikáns szintjének hiányát normál hepaíoetlákbau, és ez kapcsolatos a hepatoosták rezisztenciájával a TRíkiE-iodokált spoptózisbsn. A DR5 keresztkütéso monoklösáiE ellenanyaggal nem elegendő az apoptózist kiváltani képes haiálroeeptor homopölimer formáinak létrehozásához. Selyornmújnmhari végzett kísérletek nem adnak bizonyítékot a TRA-S beadásának tövis hasára. Ezáltal egy agemsta snil-.DK5 mcsckionálls ellenanyag valószínűleg szelektívebb és bistemságosabb terápiás szerként, mist az oldható TRAIL.
A találmány szerinti ellenanyagok jól ulkaisnazztók szkrinelö vizsgálati eljárásban rosszindulatú sejtek kis csoportjainak ástsktáíásárs, amelyek még aertaálts sejtrneríóióglát mutathatnak. Humán ráksejtek - beleértve tűdo·, prosztata- és málrákokaí - sejttnetszet Is sím festése találmány szerinti jelölt öltenanytrgokkat azonnal azonosítja a rákos sejteket. Ezen rákos sejtekről megfigyelhető,, hogy DR5 nagyon magas szintiét expresszálják, összehasonlítva az azonos típusú normál sejtekkel. Ezáltal a találmány hasznos érzékeny szkrmeiésí eljárásként rosszinduíatá daganatok kötni szkrinelésére szövetekben, mint például töddbsn, prosztatában és májban. A találmány tárgyát képezi terápiás eljárás tthnormális ssjtproíhéráeiő gátlására, szemléltetésként rosszindulaté rákok és bmíatlkas leukémiák gátlására.
A találmány tárgya különösen auu-hnmán-l>E.S monoklomtlis ellenanyag, amelyet TRÁ-S-nsk rtevctíhnk, és az ATCC elérési szánta PTA-142S. Egy Uptíptozís-réeeptör, mint például Fás expresxzsójásak a szintje sem szükségszerűen korrelál a sejtek apoptózis Iránti érzékenységével. A rRAlL-közvethed apoptózis esetén azt javasolták, hogy az TRAlE-áteateeepíorök exprexsziojo befolyásolja a sejtek érzékenységét. Ezeokivíil azt Is javasolták, hogy a DR5-nek kapcsolatban kell lennie a DR4-gy«l az apoptózis jel hatásos átviteléhez a .FADD és a kaszpáz-3 útvonalon kerssztSl. Agonssta snó-DRS monokionális ellenanyag hezzáférnetősége lehetővé tette a DR5 jeltovábbítás szabályozásának értékelését, és viszonylagos szerepét a TRAlL-kőzvetlteít apoptózlsbtm. Sejtek TRA-3-közvetÍteti apoptózis iránti érzékenységének összehasonlítása azok TRAíL-közvetített apoptózis iránti érzékenységével Estek Intést nyújt a D85 TRAlL-kőzvetttett apoptózssbtm betöltött szerepélje, és azokba a mechanizmusokba, amelyek hefolyásolhatjak az érzékenységet.
Ez sz -előny általában kiterjed a találmány szerinti humanizslt anti-DRS monoklmtáíis slíensítyagökra ÍS: OR5 «Feni ellenanyag molekuláris klórját ismert módszerekkel sildjük elő, surfot az alábbi példákban bemttlatink. Rekombináns DNS technológia 133) hasznos olyan ttok;esosav-szekvcncíák előállítására, amelyek monoklonális elíenartyag-snolekulát vagy annak tmógénkötő régióját kódolják.
A találmány tárgya humsmzák anti-TRAIL-reeeptor cilcttanyagck előáll kása, amelyek nem valószínű, hogv humán antl-egér ellenanyag (sutit a leírásban ezentúl „l-ÍAháA-oak nevezünk) ettem választ (34) indukálunk, míg még mindig hatásos tólóktor eítonastyug bmkcíóink van. A leírás szerinti értelemben ellenanyagok vo-IÖnatkozásábau a „hnnsán és „hnmanizáíf' kifejezések alatt olyan ellenanyagot érőink,amelytől azt vádak, hogy terápiásán föletüíhssó., gyenge izonómogés választ vált ki emberi alanyban,
A találmány tárgyát 3öti-DR5 ellenanyag, tenaalzéit snti-DRÓ ellenanyag, TRA-§ nehéz és könnyű lánc amusgksbelinok, és humanizált nehéz és könnyű lánc imsnöngtobnlitrok képezik. Ezen Mérjék vagy gének bizonyos csonkok femás végrehajtják a teljes szekvettelájú fehérje vagy gén szabályozó vagy enziotaskos fcnkeiójáí. Példán! az azokat kódoló nnkteinsas-szekvendákat mcgvákozáatbatiuk szobszSltúciókkal, adáicrókfeal, tfeléctekknl vagy multimer expresszi-óval, amelyek funkcionálisan ekvivalens fehérjéket vagy géneket eredményeznék. Á míkteinssvakat ködeié szekvenciák dcgeneraiisága miatt más szekvenciák Is alkalmazhatók a találmány gyakorlatba vételében, amelyek lányegébosr ugyanazt az atnlnoscv-szekvenelát kódolják, mint a termászeíbeo döístdtsió fehérjék, Ezek nem korlátozó példái közé tartoznak olyan nuklemsav-ssekveneiák, amelyek magukban logtelják a fenti pollpeptiáeket kódoló nukleinsav-sxekvenolák egészét vagy részietek, és amelyek meg vannak változtatva különbőzé kodonok szubsztitúciójával, amelyek fónkcionátisan ekvivalens amittosav-oldaiiéneot kódolnak a szekvenciába®, ezáltal csendes ntatációí hoznak létre.. Nyilvánvaló, hogy egy találmány seermti immunglobulin nnkleotiá-szekveneiája akár 25% szekvenels-bomoiógia variabilitást is eltűr, amiét: azt szokásos módszerekkel számítják f'Cttrrem: Methods in Segueo.ce Comparlson aná Astalysls'', „Maeromotecolc Sequeuemg and Syothesis, Selected Methods aná Applkadons* 127-149. óié., kiad.: Alán R. üss, Inc. <199§}j, mindaddig, amíg az Ilyen variánsok hatásos ellenanyagot alkotnak, amely íeíissneri a DRS TRAIL-reeeptort, Például sgy pollpeptld-szekveneiábaa szuhsztituálhátank egy vagy több tmsinosav-oldaihmeot hasonló polaritásai másik amlsosavval, amely funkcionális ekvivalensként fest, ezáltal csendes változást eredményez. A szekvenciában található smlnosavak szubszdteense tehet azon osztály bármelyik: tagja, amelybe az ammosav tartozék, Példán! a nsrapoláros (bidrofób) amlöosavak közé tartozik az: alanin, teán, utóiméin, valló, prolin, fenitelanin, triptofán és metionm, A poláros semleges amloosav&k közé tartozik a glseltg szerin, treontn, clsztelo, íirozáíg aszparagio és giawnsn. A pozitiven töiíóst (bázikus} nroltsosavak közé tartozik az argódig iixin és hisztsdm. A negatívan töltött (savas)· amioosavsk köss tarlosik az aszpsnsglosae és glataminsav. Szintén a találmány tárgyát képezik fehérjék vagy azok l'ragtneosei vagy szátroazékai, amelyek dlfesrcoclálisao ssódosttöttak a transzláció alatt vagy után, példáéi gllkoziladóval, protsoíltlkus hasítással, ellemmyag-möiekaiáköx vagy más sejíbeli ilgaodomhoz történő kötéssel, stb. Ezenfelül a találmány szerinti antl-DRó elienaoyagek mikilclosav-xzekvensiúlt kódoló rekömbináns vektort génsebészeti úton égy móáosithátjtsk:, hogy megváltozz®?! a feldolgozása vagy espressziója.
Ezenfelül inhibitert kódoló smklemsav-szekvencis?. mutáitaűsaíusk ót v?mo vagy /« róva transzlációs, miciációs és/vagy termsnáclós szekvenciákat hozva létre, vagy variációkat létrehozva a kódoló- régiókban és/vagy éj restrikciós helyeket kialakítva, vagy korábban létezőket tönkreíéve, hegy elősegítsük a további te vteoo móítesitást. A szakterületen muíaganezlsre ismert bármilyen módszer «Ikalmazbasó, nem korlátozó példaként az öt váró hsiyspecffikíss mttíagenezis (!,. Riói. Chem, 253, 655!. oldj, Tssó /ösécr-ek (Pharmacia) alkalmazása, és hasonlók.
Róntgeskrisztallögmfíiii adatok, azt mutatják. hogy sz ellenanyag Immsnglobnlm feltekeredése általában hosszú hengerese szerkezetet síkot, amely két réteg söriparaiét β-tedőbői áll, amelyek mindegyike hárem vagy négy β-láncot tartalmaz. A variábilis régióban három hurok a Ή és L láncok V deménjalbél áll össze egy antigénkötő helyet alkotva. Ezen hurkokat komplementaritást meghatározó régiónak (CDR) nevezzük. A CDieknek v-an a legrss^yohb sotlaosav-varlabiiltásts sz eítemmya-g-meteksrlában. A vatráölhs régiónak az a részletet.
amely ness része a CQR-nek, vázrégiőaak (”FR” régió) uevezzök, és áliaiáfesn a CÖR szerkezeiének fenntartásában játszik szerepei. Előnyősén egy adott ellenanyag. összes CDR--ót akceptor ellenanyagra visszük rá. annak érdekében, hogy megőrizek a TRAlt-recegíor epitóprágiólának a kőíőréglőját. Nyilvánvaló, hogy a CDR-sk összessége egy részének donorba törtéjfo átültetése is hasznos. Nyilvánvaló, hogy az átültetés alatt általában öldaliáneonkéntl helyettesítést értitek, amisossvanként vagy régiónként. Azonban alkalmanként, különösen régió áívitelétiéi egy oláalláneot tetszés szedte addicteoáltsíhamnk vagy deletálhaíunk vagy szubsztituáltettunk, és az ilyen deléoíók és Inzerciók, valamint megfeleld helyettesítések és inverziók, a szakember által megvalósíthatók.
Találmány szerinti ellenanyagé például sntí-'ÍRÁlL-reoepfor menokfonális ellenanyag L-iárzra és Rhteoa CDR-régiőjának átültetésével állíthatunk elő humán ellenanyag megfeleld CDR-réglójáhtt, ezáltal humanizáljuk a TRAlL-mcepfor ellen hatásos egér ntonoklonslis ellenanyagot.
A molekula idfotípusáí tartalmazó ellena.ayag-fragtneöst ismert módszerekkel állítunk elő. Például ilyen fesgmens szemléltsíésként lehet anti-TRAlL-rsceptor <Α1Γ)2 feagutesse, amelyet az ellsnanyag-ssölekula pepszines emésztésével állrtsuk elő, a TRAIL-reeeptor ellenanyag AB’ fragm.ense, amelyet a TRAlL-reeeptor (AB’)2 teagnsess redukálásával állítunk elő, és olyan öUeswyag fmgmens, amelyet az ellenanyag pápámnál és redakálószerrel történő kezelésével állítunk elő.
Közelebbről, a TRÁ.-S antr-RRS m.<ía«klonáils ellenanyagra: táhrídőraa tenyésztésével állíthatják elő.
Mosökkteális ellenanyag előállítása szemiéfeeskéte. az. alábbi lépéseket foglalja magában:
a) bíomakromolékulának antigénként történő alkalmazásra való tisztítása;
b) ellenanyag-termelő sejtek előállítása, először állatnak az antigénnel történő Immunizálása, majd az, állat véreztetése és az ellenanyag-iker mérése «ián, annak érdekében, hogy meghatározzuk mikor kell a lépet eltávolítsák
c) mle lém» sebek előállítása;
d) az ellenanyag-termelő sejtek és a mislöms sejtek fezionáltatása; ej a kívánt elleísanysgsrt tertoelo hibrláöms kiválasstssa; íj egysejtes kolóniák előállítása (klónozás);
g) adott esetben a ldbriáé>mák tenyésztése, vagy olyasa állatok növeszsése, amelyekbe a blbridóma sejteket beültettük, a róottoklonálís elfenat?yag:nagyléptékű előállítása érdekében;
h) az így előállított monoklonális ellenanyag biológiai sktivitásármk és s speoiíífosának tesztelése, vagy a. marker Sulajdonságaínák mérése.
Az anő-DR5 monoklonális ellenanyag előállítására szolgáló eljárást részletesen bemutatjuk az alábbiakban a fenti lépések alapjáé..
(a) Az antigén eíoállhása
Antigénként szolgáló rekombináns fehérjét (amit a leírásban ezentúl „rekombináns humán ORS”-nek nevezőnk) áilttenk elő QBÍ-292A sejtek transzfektáiásávai a pAdDRS-ígG expressz^ vektorral, amely a humán DR5 exíracelluiárls doménjának és a humán ígö 1 ellenanyag (amit a leírásban ezentúl ,,ígG-nek ueve2önk)(vö. PTA-Í428) Fc-régiójásrak íiizlóját kódolja expresszáhirtás végett az AZ>£M?-0<esf reugenskésztet (Quantum Sloteehnologies Inc., Cansáa) slkahntizásával, és összegyültjük és részlegesen tisztítjuk az expresszáhatoít terméket. A p.AdDR5-lgG glazmiöoí s humán ÖRS és komán Ígö tüziős fehérjét kódoló DNS-oek pAdCMVS vektorba történő inzertálásával áilkjok elő, amely egy állati sejtekben működő expressziős vektor. Más anyagok, mint pékléol a £tR5-őt kódoló DNS, vektor és a gazda tg alkalmazható itt.
Í ··>„
JX·
A pAáDM-ígC vektonal transzformált QEI-293A sejtek feiütüszöjáhan ««Ottón hnmás DR5 és IgG feíós fehérjét részlegesen megtisztíthatjuk FröíeMtóÉ^éörase síTímíáss ktomaíográfesvat vagy /‘rofóíeGFtísA'jí-íise alSaitási kromatnsyáfíávsl, vagy ioacserélö kronmtográitával Reso;weg-Ó? oszlopon (k«restek?!mi név; Pfesmsscis).
.Más megsíldásképpen humán ssítvosalsk sejtmémbráttjából előállított tisztított DKS-űl &lkaimaztmk antigénként. Ezután - mivel a DE5 elsődleges szerkezete Istnest {vö, ΡΤΑ-Ι428) -> sz L <r?:onositószárt? ezsrintl mrönosav-czekveseiát tartalmazó pepiidet kémiai úton szintetizálunk ismert módszerrel, mint például a San(b) Blfensnysg-termeíö sejtek előállítása
Egeret immtmizáíunk tsz. (a) lépésben elöállifett, adjuvanssai, mim például Freasá-téle komplett vagy Inkomplett adjuvánssal vagy atommal összekevert imtonnogénnel. Más szemléltetésként adott alkalmas kísérleti átlátok közé tartozik a-patkány, ísngerhnalac, nyűi, kutya, csirke, ló, sertés, szarvasmarha és juh.
Alkalmas beadási «lak kísérleti állat immunizálására a sznbkuíán, iuírapariiuneáiís, intravénás, mitaáermális és mmmwszkoláris injekció, előnyös a sztátóán és lmrap«rí$oaeá.bs injekció,
Az immunizálásokat adott esetben egyetlen dózisban vagy számos ismételt dózisban végezzük megfeleld időközönként {előnyösen 1-5 hetente). Az inununizált állatokat eíienőrizzük az clfensnyagAsterrs a széramukbsn, és egy elegendően magsa elfetnsrsyag-iítera állatot kiválasztunk az amlgéu-térorelő sejtek fcrtásátrak. Magas titertl állat kiválasztása a későbbi eljárást hatékonyabbá teszi, A későbbi luzióhoz a sejteket általában 3-S nappal a végső bmnonizáiás ultin gyüpjük be az állattól.
Az ebemmyag-íher méreséte szolgáló eljárások közé tartoznék külösfele jól Ismert módszerek, mint példáid a radioaktív immunológiai vizsgálati ellátás (amit a leírásban ezentúl „R!A”~nsk nevezünk), szilárd íaziaü enzimes immunológiai vizsgálati eljárás (amit a leírásban ezentúl „El JSA!í-nak nevezünk), fluoreszcens ellenanyag vizsgálati eljárás és passzív hemaggíatioáeiás vizsgálati eljárás; a R1A és ELiSA előnyős a detekcíő érzékenységé, gyorsasága, pontossága és aatomauzálási lehetősége miatt,
Az edenaoyag-bter tneghatározását például EMSA-val végezhetjük, az alábbiak szerint. Először tisztított vagy részlegesen, tisztított DRS-öt aászorbestonk szilárd fázis felszínére, salat például 96~méröhelyes EtISA m ikrolherlemezre, majd blokkosak a fennmaradó fe lszínt, amelyhez a DR.S rsem kötödSfe az antigénnel nem rokon fehétíévei, tniní például szarvasisarha-széfumaimmiínnsi (8SA). Mosás után a mérőhelyek felszínét érintkezésbe hozzuk sorozatban hígított egárszérum-mmlákkal, hogy lehetővé tegyük az aati-ORS ellenanyag kötődését a mintában lévő antigénhez. Enzimmel jelölt antí-egér ellenanyagot sáutsk másodlagos ellenanyagként a kötött egér elföímnys.ghoz. Mosás után enzí.mszuhsztrátot adunk, és az ellenanyag-isten megbecsüljük az ahszorbanoís változásából, amelyet a szubszlráí tuegváltozásáböí adódó szfovátesás: okoz.
(e) Mielótna sejtek előállítása
Megállapodott egér sejívimalakhól szártnazó sejtek szolgálnak a mfelóma sejtek. timósakésd, köztük példán! S-azagnanía-reziszténs egét, amely az alábbi 8.ALS/C nnslóma törzsekből származik: P3X«3Ag§ü.l(H-U!) {35), P3/NSi/i-Ag4-!{NS-!) (3ő), Sp2á)-Agl4(SP-2) 07), ?3XS3AgÜ,Ö53{ó53) (38) és E3Xö3AgS(Xő3) (39), A kiválasztott sejtvonalst sorozatban hígítjuk megfelelő lápközegben, mint például Sazaguanin tápközegben, A S-azagesnln tápkézeg tseove-féte Afödbled Díífeeeeob Λ-fedíam tápközeg {amit a leírásban ezentúl „IMDfeT-nek nevezünk) vagy DidMocok áfedí/fed óogfö áfönfem tápközeg (amit & leírásban ezentúl ,,DMEXT-nek nevezünk) vagy RPMÍ-lödő tápközeg, kiegészítve glutamtnnaí, 2-merkaptoetanolial, genönnicimmb magzati boijúszéfummal (amis a leírásban ezentúl „FCS-nsk nevesünk}, és k-azag«anln«al. A sejteket sántán: átvisszük nonnáil tápkézegbe, sast példatti ASF1Ö4 tápkőzegbe (Ajwweto, K. K), amely 10% FCS-t tartalmaz, 3~4 nappal a tnziót megelőzően, hogy biztosítsuk, hogy legalább 2x i 0? sejt tegyen jeles a fúzió napján, (d) Sejtfúzió
Az állat bármely alkalmas részéből előállított límioeiták és plazmasejíek a preknrzor sejtek síz ellenanyag előállításához. Szemléltető lissfócita ős plazmnsejt-források közé tartozik a lép, nyirokcsomók. perifériás vér, vagy ezek hónai Íves megfelelő koarbmáclúia; a lép & leggyakoribb fonás.
Az atoiső megerősítő oltás atáa azt a szövetet, amelyben az eilenarívag-termelö sejt található eltávolítjuk a meghatározott ellesanyag-therü egérből, A jelenleg favorizált módszer iépsejteknek a e) lépesben. előállított rrlelátna sejtekkel történő íuzlooülistására apoiietilénglikol alkalmazása,
A fúziós módszer magában foglalj a a lép és mlelöma sejtek mosását szérnmmentes tápközeggei (mint például RPMi I64Ő) vagy íöszfát-pnffemlt sőoiőattal (amit a leírásban ezentúl „PSS”~aek nevezünk) oly módon, hogy a lépsejíok ős mielóma sejtek aránya megközelítőleg 5:1 és 10:1 között legyen, ős azután lacentrifúgáljuk azokat. Mintán a féiüiúszöt eldobtak és a csapadékhars lévő sejteket megfelelően fellazitotbsk, I ml, 5Ö% (w/v) polietilénglikolt (molekulatömeg 1OÖO-40Ö0) tarbalmazó szérommerstes tápközeget adnák cscppenkeoí a sejtekhez kevertetésssl. Azt követően lö ml szőrummentss tápközeget adónk ho.zzájak lassan, majd lecestriídgáijok. A felShlszói ismét eldobjak, ős a csapadékban lévő sejteket lelszaszpendáljak megfelelő mennyisőgö HAT lápközegben, amely hipoxantist, amíooptersnt és tímidint (amit a leírásban ezentúl «ΗAT-nak nevezünk) és egér mlerleukin-2-t (amit á leírásban ezentúl ,,lL-?.-íiek nevezitek) tartalmaz A sznszpenzíőt azután tenyésztő lemezek (amit a leírásban ezentúl egyszerűen lemeznek nevezőnk) mérőhelyeire mérjük szét, és iokuháljok 5% v/v COj jelenlétében ŐT^'C-oo kórülbelSl két héten keresztel, HÁT íápközeg további, szükség szerinti hozzáadásával,
o) Hlbridoroák szelektálása
Amikor az alkalmazott mieíöma törzs rezlsztens S-azagozomra, azaz defmiens Inpozantm-guanbtfbszfbribozli-transzferáz (HGFRT) enzimre, bármely sem Aszionák mielóma sejt es oúelőma-miolőma fúzió képtelen túlélni HAT iápk Szegben. Mársrészröi, ellenanyag-termelő sejtek egymás közti fúziói, v&imuint oliensoyag-tetmelö sejtek és mielőma sejtek hjbridőmát táléiheluok, de az előbbiek esek korlátozod ideig. Ennek megielelőem a folyamatos tenyésztés HAT iápköxegben csak a kívánt híbrkSómák szelekcióiéi: eredményezi.
A kapott hihrídőmák kolóniákká nőnek, amelyeket azután aminoptermt nem tartalmazó HAT tápkőzegbe viszünk át (HT tápközeg). Ázsián a tenyészet lel Slúszőj ának alikvoíjait ehávollljok, hogy meghauhozznk nz ami-Eas eileiranyag-tiierí, például EidSA-vsi, Amikor a fent említett fúziós fehérjét alkahuszztsk. Ei.i.SA antigénként, szükséges az. olyan ellenanyagokat termelő klánok eltávolítása, amelyek specifikusan kötik a humán IgGI Fc-rőglőláí. Az Ilyen klón jelenléte, vagy hiánya ellenőrizhető, például sntiuőnként Fas-lgöi-st vagy IgGl-et alkalmazó ELISA-val.
t) K lónozás
Azokat a kibrroómákaí, amelyről a b) lépésben az eifenatívag-íher meghatározásra bemutatott eljáráshoz hasonló módon kimutattuk, hogy specifikus hihridőmákat termeinek, azután egy másik lemezre visszük üt klónozás végett. Az alkalmas klónozási eljárások közé tartoznak az alábbiak; korlátozod higitásn elyácás, amelyben a híbridőmákat mérőhelyenként egy sajtét tartalmazó koncentrációra hígítják, és ozmán tenyésztjük; a lágy agsr eljárás, amelybes kelónlálmi állítunk dó lágy agai' tápközegen történő tenyésztés után; mikrosuanipölátort alkalmazó eljárás egyedi sejtek tenyésztés céljára történő elválasztására; és s „sort-a-elon« eljárás, amelyben egyedi sejteket: választunk el sejtváingatő berendezéssel.
A klónozást ellátást, példáid a korlátozó higstasí módszer szerint 2-4 alkninmmsl mesisméídjíík minden egyes mérőhelyre, amely etieüanysg-ííiesí mutat, és a stabil eikmauysg-tifotü klóitokat kiszelektáljuk amiDR5 mtmokionálís ellenanyagot termei» hibridémákkérst Az attli-egér-DRó ellenanyagot termelő híbriddmákat hasonló raódxzetrel szelektáljak, sad-DRÍ m>oao:kl.osábs ellenanyagot termelő sejtvonal előállítására.
A TRA-8 egér-egér hibridómát, amely a találmány szerinti ellenanyagok alapja, letétbe helyezték az „Ameriean Type Calture Colieedon-nál 2000. március 1-és, sz elérési szánts FTA-1428. Ennek megfelelően & TRA-8 egér-egér hibridémávsl vagy bámmly más megállapodott hihridőmávd ágy állíthatunk elő ellenanyagot, hogy az alábbi, (g) lépéstől kezdve bemsímoü eljárást követjük, az fe.KO lépések, elhagyásával.
(g) Hifenáőma tenyésztése mosmklonáhs ellenanyag előállhiksáhos
A klónozással előállított hibridómat aztdá® normál tápközegben tenyésztjük, nem pedig HT tápközegben,. hlagyié ntékő. tenyésztést hajtőnk végre „roller bottie” tenyésztéssel, nagy tenyésztöedények alkalmazásával, vagy „sphmet bottie” tenyésztéssel, A nagyléptékű tenyésztésből származó felüiüszót megfelelő eljárással hegyíjjíjük és tisztítjuk, mini például gélszöréssel, ami jól Ismert a szakensiser számára, hogy előállítsuk az antiDRS moaoklösáiis ellenanyagot, ami a tálálmány tárgyát képező ellenanyagok alapja. A kibrídőrnáí luíraper-itoosáhsao is moyászsheíják szingén egérben, mint például BALhVs egérben vagy mdha egérben, hogy nagy mennyiségű, anti-DRS monökíonális ellenanyagot tartalmazó asze Ítészt állítsunk elő.. Kereskedelmi forgalomban kapható monoklosáhs ellenanyag tlsztdő rcagenskészlsíek (például ΛΑίΐή’ζηρ ö// Kőt Pksrmaeia) kényelmesei; aláaknázhatok a begyűjtőit ellenanyagok tisztítására.
A fenti nfedos liszlitot· menokioaáhs ellenanyagoknak nagy a speoiiitása humán ORS-rs.
(h) Monokionális ellenanyag vizsgálata
A mosoklonáhs ellenanyag ízeítpasansk és az alosztályának azonosítására alkalmas eljárások közé tartozik az Ouchterlony eljárás, StíSA. és R1Á. Előnyösen kereskedelmi forgalomban kapható reagenskészletet alkalmazunk az azonosításra, mint például ;ΐ/.··/οκ?» feper á'ü-et (kereskeáeImi név; Bloraá).
A fehérje mennyiségi meghatározását a Eoil-Losvry eljárással végezhettek, vagy a 28$ nm-en mért ábsiíorbaneia alapján történő számítással (lyí (OD28Ö)·» í mg/ml immunglobulin).
A möísekloríáiis ellenanyag által istenért epltőp azonosítását sz alábbiak szerint végezzük. Először előállítjuk a monöklortális ellenanyag által felismert molekula különféle részleges szerkezetéit. A részleges szerkezeteket olyan eljárással állítjuk elő, amelybe» a molekula különféle részleges psphdleií szintetizálják meg Ismert olígopeptid-színtézis módszerrel, vagy olyan eljárással, amelyíren a kívánt részleges pepiidet kódoló DNS-t építünk be alkalmas expresszié® plazmiáfet, és eapresszáiímjuk. alkalmas gazdában, mint például £ eohban, hogy előállítsuk a peptideket. Általában a két eljárást kombinálva alkalmazzák a fend cél elérése érdekében. Például előállíthatjuk megfelelően csökkentet; hosszűságő poilpeplvfek sorozatát, az asdgéo fehérje Cvagy N-sermmálístöl indulva, bevált génsebészeti módszerek alkalmazásával. Megállapítva, hogy nfelyik h'&gmerss reagál az ellenanyaggal, megkőz.elítőleges elképzelésünk lehet a kapón epítőp helyéröl.
Az epííópot: ponlosabban szonosijiok ktdönhőzö kisebb oligopeptid szmfetixáiásával, amelyek a pepiidnek vagy mutánsának feleinek meg, bevált ollgopeptid-szintézís módszerek alkalmazásával, hogy meghatározzuk a peptidek kötődését a találmány szerinti ellenanyagok előállításának az alapját képező anti-DRS maokia^ts sliemmysgböz, és meghatározzák a pepiidnek antigénhez való kötődésének kotspétlilv gátlását a snonoklonáks ellenanyaggal, Koreskcdehnl fergalotnban k&phatö reageuskészfeíek,. műd például a- SFDTs A'fe {'Genosys Sioteclmnlogies, Inefe és a mutíspm szintézismódszeren alapuló számos nmllípín pspiidszmiézls tosgenskésziet (Chiron CarpJ kényelmesen alkalmazhatók különféle ollgopepödek előállítására.
Egy találmány szeried eílenaovagnnk kttónfele, az alábbi aj-fj pontban leírt fankcfeaáüs tniajdossagai vaunak, amelyek mindegyikét az alább bemutatod eljárásokká igazolhatjuk.
a) TRA-8 specifikus kötődése humán DRS-őt ezpresszáló sültekhez.
A találmány egyedi jeifetszője a kőtőképessóg sejtfelszíni ÖRS-hőz. Ezt DR5-öt exprssszáló sejtek áramlási etóuseiriás elemzésével demonstráljuk. Először Igazoljuk a ÖRS kötését a humán DR5-öí kódoló teljes hosszúságú eDHS-sel transzfektált Cos*? sejtek alkalmazásával. Közelebbről, a TRA-8 csak a DR5«tel úanszféktált COS-? sejteket Ismeri fel, és sem ismeri fel az üres kontroll vektorral, v&gy OR4-et kódoló vektorral iraoszléktáitakat. Másodszor, három különböző eredetű (hematopotetikes, glsóma és prosztatarák} rosszindulatú humán daganat sejtjeit teszteljük, Ezen transzfermáít daganassejtek többsége seiífelsslni DR5 szlgntfkáns tnennyiségér expresszálta, habár aa expresszios szint nagymértékben különbözött. Harmadszor, RÁ. ás OÁ páciensektől származó humán elsődleges szomsvtélis isbrobiaaztsejiek két panelját vizsgáljuk meg. Áx összes RA szineviáhs sejt sziguif kánsas magasabb szinté DRS-öt exprssszált az ÜA sejtekhez hasonlítva.
bj Apoptözis índakáíása keresztkütés nélkttl humán rosszmduiaiá daganatsejtekben in átíró.
A találmány szerint termeltetett ellenanyag képességét TR.AíL-reoeptor felismerésére és apöptózís közvetlen induhalásám resszindufetű humán daganatsebekben sejtéletképességl vizsgálod eljárással (,d TAátój határoztuk tneg őt v/fro a sejteknek különféle koncentrációjú ellenanyaggal, különösen TSA-S-cal történő híkuhálása során. A daganstsejrek többsége érzékeny a íEA-k-esl indukált apoptózisra. Bizonyíts sejtekben a TRA-8 erős apoptőzis-lndnkáiő aktivitást mutatott, például a TRA-8 képes apoptörist indukálni hemátt íurkat sejtekben a pgőnl szinten. Fontos módon a TRA-8-cal mdnkált apöptózís nem igények ksresztkötést, és a. legtöbb sejtben a TRA-8 erősebb spoptózis-lndakáló hatást matatod, mint a rekonsbissss oldható TRA1E enhaoeer jeleolátébím.
e) A TRA-8 daganatellenes hatása ó; vivő.
A TRA-8 daganatellenes aktivitását két SCID.feumán daganatsejt modellben értékeljük. Először, SC1D egereket Intravénáson oltunk humán leukémiás Jurfcat sejtekkel, és TRA-S egyetlen dózisával (lőű ug) kezeljék. Az eredmények azt mutatják, hogy a beültetett Jurkai sejtek többsége enmlttálódik a TRA-S-eai történő kezelés hatására a perifériás vérből és a lápból, -rmot azt .birkát sejtek áramlási elíomumiás elemzésével és én riía Immimhiszí-ökémlai. festésével meghatározzuk. Másodszor, humán asztrocfta sejteket (132INI) szábkután oltunk SCÍD' egerekbe, és a daganat»· hordozó «'ereket TRA-8 egyetlen dózisával kezeljük. A beültetett 1321 H l sejtek növekedése sxigsdfkánsan gátolt a TRA-8-eal kezelt egerekben, a daganatok: mérete alapján és szövetumi elemzéssel meghatározva.
ő) RA szioovlálss sejtek azonosítása TRA-8-esl
RA és 4 GA páciensből izolált elsődleges szmoviális sejteket tesztelünk ÖRS sejiíslszhsí aspressziőjáfa. A TRA-8 képes pozitiven festeni sz összes RA sejtet, de a testes negatív az összes ÖA sejten. Ezáltal megkülönböztetjük az RA-t az OA-iól a ÖRS felszíts exprssszsöiával, TRA-ő-cal detektálva, ej Apöptózís indakálása RA szinoviál is ribrohlaszí sejtekben TEA-S-eal χοΑ I'RA-k képességét HA szioevíslis sejtek apoptézisáaak inöukálására scjíéletképességi vizsgálati-eljárással határozzuk meg fo vfo·» tenyészetbe??:, TSA-8 kSktefele koneenirációmak jelenlétében. Az összes RA magas -közepes érzékenységet s?«áahrts ιρρ ng/rnl TRA-8-ra, Ezzel ellentétben, az összes GA lényegében? rezlzriens a TRA-R-iudukált apoptézism, Fontos mádon a TRA-8 jobb apoptézls-indukálé aktivitást muta-ott RA szisoviális sejtekre, mint az oldható TRAiL onhancerrél, Bzettkiváí, összehasonlítva atet-Fus ellenanyaggal (CH-1 1), a TRA-8 elicaaoyagjebb szelektivitást ítmteiísif RA szfooviáiis -sejtekre.
s) A TRA-S nem indnkáljs MMF-k termelését RA szmoviális sejtekben.
Mivel & TRA-S képes NF-scb aktiválást iuduksinl RA sztnoviális sejtekben, ugyanúgy mint. a TNF-ö, meghatározzak a TRA-S hatását MMFI és MMp3 termelésére szrnoviálís sejtekben. Míg a TNF-a az MMP-k dózisütggá növekedését indukálta, a THA-S nem volt képes MMR-k termelésének íttástkéiására, és bizonyos koncentrációkban a TRA-á kissé -csökkentette a M’ME-k termelését sztnovlábs .sejtekben.
gj A TRA-S többszörös kaszpáz aktiválást indukál
Mivel a kaszpáz kulcsszerepet játszik az spopR&ás mdukálásáhan,: meghatározzuk a TRA-8 képességét kaszpáz-aktíválás ináckálására barnán Jutkát sejtekben. Amikar ímkaf sejteket T&A-S alacsony dózisával (5Ö ng/xníj ÍHSubáijíis, Ra-sípás-S, kaszpáz-$ és kaszpáz-3 aktiválását Isgycljilk meg, akér 15 pam belül az inkabélés «tán, Westem-bloi elemzéssel és kuszpáz hasítás! elemzéssel, demonstrálva.. Az iáílritést, a tezpázaktiválás számát és -erősségét tekintve «.találmány szerinti ellenanyagok, belsértve a szemléltető TRA-8 ellenanyagot. sokkal jobb aktivitást matattak, mint bármely más ismert: apoplózis-ináukáló ellenanyag, mást például az anfi-humás-Fas ellenanyag (CH-1.1).
Ezáltal. egy találmány szerinti ellenanyag olyan anyag, amelynek az a tulajdonsága, begy szelektíven, •apoptózist indukál patogéa sejtekben, amist azt lényegében bemutattuk az- (a) és Cg) pontokban. Ennek megfelelően az ellenanyag hasznos proülakttkas és terápiás szerként sejtek nem megfelelő táiélézévsi vagy sejtek abnormális pröiiíeráeiójávsl kaposofoios betegségekben, mint például amelyek az -apoptázis rendszer - beleértve a Fás/Fss-ligsRdnm rendszert - hibás szabályozásának íudbatók be..
A találmány szerá-rt ellenanyag képességét apoptózis ladnkáíására. sejtekkel történő tenyésztéssel igazoljuk, műit például a Jutkát barnán leukémia seitvonabte (Aoxerican Type Csíkom No. TiB-5.52) és a 1321N1 asztrocite sejtvonaliak nly&o tá-pkSzegfeen, amelyhez' a tesrtmksf&í hozzáadtuk, és megbatárazzok a túlélési arányt, példán! dTff ke vizsgálati. eiiárással.
A t8lstírtá,«y szerinti. nab-DRd ellenanyagot, .amelynek- majdnem azonos az. immunogenitám emberekben, mint humán ellenanyagoknak, alkalmazunk proftlsldikns vagy- terápiás szerkón·, sejtek nem megfelelő túlélésével vágy sejtek abaotmális pretíiíetáeiójával- kapcsolatos betegségekben, mint példáid amelyek az apoptérisrendszer hibás szabályozásának toáhaték be autornumm betegségekben, amelyek szemléltető példái késé. tartozik a szisztémás iapusz eritematőzus, Hasbltnoíe-féie betegség, reomsteid artritisz, ’grafe-versus-bosf betegség, Sjögren-szmeróma, s-észes vérszegénység, AddisoEx-féle betegség, s:zki«ro-;ierto;g Goodpestura-szindróma, Crohs-feie betegség, autohmmm ivmsolmkns anémia, sterilitás, mlaszténia. gravts, multiplex szklarézis, ídasedöw-féie betegség, trombopét&a purputa, imtuhn-Rlsgő diabétesz meilitnsz, allergia; atoptktts betegség; artenosriderózis; miokarditlsz; Rardíomiepétia; glomeruíáris tsetrttisz; hlpoplsszókox skíísiís: kilökődés szervátültetés után és a tüdő, prosztata, máj, petefészek, nyirok ás emlő szöveteinek számos rosszindulatú -nagbetegcdése.
ilysR profilakúkuáés terápiás szereket kttteféte formákban adhatóak be. AMmss beadási tsódnk: köze tartozik az orális beadás, mint például tabletták, kapszulák, granulátumok, porok és szirupok, vagy parontetáks beadás, mint például tnjsketó, csepegtető injekció és köpök.
Az ellenanyagot vagy terápiás szert beadhatjuk orálisan, raktál isan, Itstmcisztentehsao, íutraYentíikuláríszig intrakmrsiáhsan, imtatekálissm, inlrsvagtoálisars, parsotetólssas (intravénásán, intratímszkniarisan vagy szubkután), lokálisan (porok, kenőcsök vagy cseppek), intraperitoneáiis injckolóvái, iranszáermáilssa, inhalálással vagy hukkális vagy nazális »pray-vel. A szükséges ellenanyag vagy terápiás szer pontos mennyisége változhat szentélytől személyre, a szentély kortól, tömegétől és általános állapotától, a kezek betegség súlyosságától, a daganat helyétől és méretétől, az alkalmazott vegyületek fej táj ától, a beadás módjától ás hasonlóktól feggőeu, A megfelelő ömnsmisége· a szakember mtin vizsgálattá határozhatja meg a leírás szerinti khasitás érte hőében. Tipikus egyedi ellenanyag-dózis a ó,l-tbC<>ő gg tartományba esik, előnyösen Ilöb gg közé. Tipikus hordozó-ellenanyag koncentráció a 8,2-200© ng/rul tartományba esik.
A beadás tervezett módjától függően az, ellenanyag vagy terápiás szer lehet gyógyászai! készítmény szilárd, íélsztlárd vagy folyékony adagolási alak formájában, mint például isbletny kúp, pirula, kapszula, por, folyadék vagy ssaszpsnziő, előnyösen pontos dózis egyszeri beadására alkaitnas egységdózis formájában, A készítmények a kiválasztott szubsztrá: hatásos mennyiségét tartalmazhatják győgyászatilag elfogadható hordozóval, és emellett nsás gyógyhatású szerekkel, gyógyászati szerekkel, hordozókkal vagy oldószerekkel együtt, A ..győgyászatilag elfogadható” kifejezés alatt olyan anyagot értünk, amely biológiailag vagy másképpen nem káros, és amelyet be lehet áttol egy személynek együtt a kiválasztott anyaggal anélkül, hogy szignifikáns káros biológiai hatásokat okozna, vagy káros módon kőlesürhatna amsak a gyógyászati készítménynek bármely komponensével, amelynek része.
hatemerális inísfctsiásra alkaknas készítmények toftalmaznstnák fiziológiailag elfogadható steril vizes vagy nemvizes oldatokat, diszperziókat, szuszse-nzidkat vagy·' emulziókat, és steril porokat steril injektálható oldatokká vagy diszperziókká fortenő feloldásra, Megfelelő vizes vagy nstnviz.es hordozók, oldószerek vagy boídozóesíikózök példái közé tartozik a viz, etunel, poiiolok {propiléuglikos, poiietlléngiikol, gliconn és hasonlók), essek aihahuas keverékei, uővétsyi olajok (mini például olívaolaj) és injektálható szerves észterek, mint például etil-oieát, A megfelelő folyékonyságot például hevonószer, mint például leolt in alkalmazásával, diszperzió esetén a szükséges részecskeméret fenntartásával és felületaktív anyagtíx alkalmazásával tarthatjuk fenn.
Ezen készítmények tartalmazhatnak adjaváusokat is, mint például tartositő, nedvesítő, emnigeáló és: diszpergélő szereket. A mikroorganizmusok hatásának megakadályozását különféle baktáriumellenes óz go.mbaeifeses szerek, mint példáid parabének, kforohntanoi, fenol, szorbinsav és hasonlók alkaintezásáviii érhetjük el, Klváastos iehst izotóníás szerek, mint példán! cukrok, nátrium-klórid és hasonlók alkalmazása is. Az injektálható gyógyászati készítmény hosszan tartó abszorpcióját ügy·' érhetjük el, isogy abszorpciót késleltető szereket aikíiinuísunk, mim például aluutínmm.-monosíaearátot és zselatint.
Orális beadásra alkalmas szilárd alakok közé tartoznak: kapszulák, tabletták, pirulák, porok és granulátumok. Ilyen szilárd adagolási alakokban a hatóanyagot összekeverjük legalább egy inért szokásos kőtöszerrel (vagy btsrdozóvafk mini például oátrium-cltrát: vagy dikalciem-toszfát vagy (a) toltoszorekkei mint például keményít©, laktóz, sznkrőz, glükóz, ««maitól szlllká, (h) kötőanyagokkal, mint példán· kárto-foemeliieellulóz, slsgnátök, zselatin, poiivínd-plrrolidím, sznkróz és akácra, (c) nedvesitoszerekksi, mmt példátsi gheerm, iás Itosntesztőszerekkel, mint például agnr-agar, kalcium-karbonát, burgonya- vagy sápiókz-keményhő, algasav, bs;8· zonyes komplex szillkátok ás tsáttőtm-karhotíáí, (e) oldódást lassító szerekkel, hsím1 például naraífn, ff) abszorpciót gyorsító szerekkel, mint például kvatemer ammóniám vegyületek Cg) nedvesőőszerekkel, mint például eetöalkohel és giteetírt-mörín$ztS3.ráf( (b> adszorbemtekkel, mint példás! kaolltt. és bentottít, ás (?) konósnyagokkal, mint például tulkom, kaiclom-sztearát, magitózíutn-szteatát, szilárd pohstíléogllkolök, nsttium-laurissznifá;:, vagy ezek keverékei. Kapszulák, tabletták és pirulák esetében az adagolási alakok pufferolÓ szereket is tarialmsshaüuík..
Hasonló típusú szilárd készítményeket is alkalmazhatustk töltóanyagokkóm lágy ás kemény töltött zselafekapszmákbsn, olyan köiösserek alkalmazásával, mint például lak-oa vagy tejcukor, vaktmint nagy moleknlatömegü pohetliénglíkolök és hasonlók.
Sziláid adagolási alakok, mint például tabletták, drazsék, kapszulák, pirulák és granulátumok készíthetők bevonattal ás hunokkal, mint például a szakterületen ismert eníerikus és más bevonattal, Szék tartalmazhatnak opalizálö szerekéi, és olyan készítmények is lehetnek, amelyek a hatóanyagot vagy hatóanyagokat a bélrendszer egy bizonyos részén szabadítják fel késleltetett módon. Az alkuitnazható bezáró készílutények példái közé tartóznak polimer anyagok és viaszok. A hatóanyagot tnikroenkspszulázhatjuk is, adott esetben egy-' vagy1 több lent ismerteteti kötöszerrel.
Orális beadásra alkalmas folyékony adagolási alakok közé tartóznak gyógyászatilag elfogadható emulziók, oldatok, sznszpenziők, szirupok és sllsdrek, A hatóanyag mellett a folyékony adagolási slak tartalmazhat szakterületen Ismert ínért: oldószereket, mist például vizet vagy más oldószereket, szolubíilzáié szereket és emalgeátorokst, mint például etilalkoholt, izopropihalkoholt, étíl-katbonátóg stsl-aeeíátot, befítdlalkohok, benzii-betrzoáíot, propitéttgiikolt, 1,3-hutíléugííkoh, dímetiiiorotasnidui, okitokat, különösen gyatxsimagoiajat, tóidímogyoroolsjat, kokoóca-csíraolajat, olívaolajat, rtentosolsjas és szezámolajat, glioeríat, teteahidsofurfuriialkoholt, polietiléngilkölokat és szorhitán zslrsavésztereit, vagy ezen anyagok keverékeit, ás hasonlókat.
Az ínest oldószerek mellett a kásziíurény tattaímazbat aojuváusokat Is, mntf például nedvesitöszereket, emalgeálószereket és szuazpeodáiószereket, édesítő-, Izesltó- és ilkttosttöszsraket.
Szuszpenzíók a hatóanyag mellett tsrtaltnazhainak szuszpoudáléiitzerskei, mint például em,vitáit iznszsssril alkoholokat, políosiarilén-szorititói- vagy szorbitás-észterekeí, mikrokristályos cellulózt, alumíniummetahidromáot, bentouitot, sgsr-agart és tragskantgumit, vagy ezek ke verékeit és hasonlókat.
Kektális beadásra alkalmas készítmények elónyösen küpok, atneíyekeí a találmány szerinti vegyületek összekeverésével áhíthatttsk elő alkalmas uem irritáló kötószerekkei vagy hordozókkah mint például któtaóvsjjtri, polieiiláitgriköiiai vagy kúphoz való viasszal, amelyek szőárdak közönséges hömérsékietesr, da folyékonyak testhömórsóklsten, és ezáltal elolvadnak s vegbélhen vagy a hüvelyben és iölszáöaditják a hutösnyugot.
Tuláimáuy szerinti vegyület tópikáils beadására alkalmas adagolást alakok közé tartoznak kettócsük, porok, spray-ek és sobalánsok, A hatóanyagot steril kürühnönyek között összekeverj ülk fiziológiailag elfogadható hordozóval és bármilyen szükséges tartósítószerrel, pufferrel vagy vívóauyaggah Oitaiamikus kiszerelések, azemkenőcsök, porok és oldatok szőttén a találmány tárgykörébe tartoznak.
A „gyógyászatilag slíogaáhstó sók, észterek, amsöok és proárogoC’ kifejezés alatt a loiárs szerint; érteteutóen a találmány szerittti vegyületek azon k&rboxilátsótt, uminosav-adöSelás sóit, észtereit, moidjait és prodregjali értjük, amelyek helytálló orvosi vélemény alapján alkalmasok páciensek szöveteivel való érintkezésbe hozásra Indokolatlan tosíciSás, irriíáció, allergiás válasz és hasonlók nélkül; ésszerű előoy.-koekázat arásynyal bírnak, és itatásosok a tervezett célra. Ezek a találmány szerinti vegyületek ikerionos focinál Is lehetnek, A
-19„sós kifejezés alatt & találmány szerinti vegyidet viszonylag sem Wlkas» szemtan és szerves savaddfeiős sód értjük,, Ezen sókat őr .sím állitbaíjnk elő a vegyület végső izolálása vagy tisztítása során, vagy küldő reagáltam a tisztított vegyáletet szabad bázis formájában megfelelő szerves vagy szervetlen savval, és IseBva tsz így keletkezeti sóé Reprezentatív sók közé tartoznak a Indzohromid, kidroklorid, szálfát, hiszulíát, nitrát, sceíáí, oxaiát, vaíéráí,. irtsál, pabnstát, sztearát, lanrát, borát, benzoát, laktál, -osztás, tezüát. nitrát, maleát, temaráí, szukemáS, íartarák natfllát mozliát, glukoheptímát, isskiobionás,. metáoszulíbnáí és laaríiszulfonás sók és hasonlók. Ezek közte tartozhatnak alkáli- és alkáirfoldfém kationok, mint példáni nátrians, lítiom, kállsnr, ksfciw,. magnézium és hasonlók, valamint nem íoxikns ammónimn, teatesr ammőnims, és amin kationok, nem korlátozó példaként ammóniám, tetrasnetil-aísrmőcfom, tetraetil-ammósinnt, metilamin, dimotílatnin, tristetíiamln, öáetílamla, euteös és hasonlók (lásd például $M Barge és tstsat., Tbarmacettticai Saks”, R Fhasn, Sci. §R 1-19, old, (1977), -amely hivatkozás átjárt a kitonitas részét képezij.
A „prcdrog” kifejezés alatt olyas vegyieteket értünk, amelyek gyorsas átalakulnak ős vöm a fonti képlet szerint széiővegySletet alkotva,, példáni a vérben történd hidrolízis átján. Alapos áttekintés található T. Rlgnehi és V. Stella által -’Fna-dsaigs as Kővel .Deliwry Sy»tems,K címmel az.„Á,C.S. Sympösium Series” 14. kötetében, és a „Biereversiitle Canáers bt Rrtsg Efesigu” (szerk.: Edwrd B. Röehe, kiad.; Asnerleas? Fharmaceotscal Assoelatina ássd Pergasnon Press Íl9S7)j című könyvben.
A célsejt állat sejtje, példáni ember, nem. ember Fterelös, patkány, egér, íengerimalac, nyúl, kecske, juh, szarvasmarha, ló, csirke, sertés, selyemmafont és menyét sejtje.
Ezenfelül a találmány szerinti ellenanyag vagy terápiás szar sem szóivá; formában létezhet, valamint: szolváskéní, gyógyászatilag elfogadható oldószerekkel, mint példán; vizzol, etasollal és hasonlókkal. Általában a találmány szempontjából a szóivá: fonná; ekvivalensnek tekintjük a nem szóivá; formával,
Eifonaoytsg-möiekolákat ismert módszerekkel tisztítási, szemléltetésként amlnö-ahszorpcióval vagy smlno-afiinitási kromatográftával, kromatográfiás módszerekkel, mint példán! magasnyomású foiyodékkromaiográSával, vagy ezek kombinációjával.
A találmány egv másik megvalósítási módja gyógyászati tetnfek biológiailag aktív antí-TRAÍLreeeptor ellenanyag vagy hnntanizáí;. tmsi-'í FAIR-receptet ellenanyag bejuttatására gerincesbe. A gyógyászati termék mi-TRAlE-reeeptor ellenanyag vagy annak iragmense gyógyászáig hatásos mennyiségét, gyógyászatilag elfogadható hordozót ás a hordozót és az ellenanyagot steril módon tartalmazó tartályt tartahnaz.
A találsoány agy előnyös megvalósítási módja szerint aníi-DFó ellesanyag gyógyászatilag hatásos mennyisége gátolja a sejtpteiiferáeiót a célsejttel történő érintkezés víá«. DS3-ÓÍ felismerő ellenanyag vagy 17R5-ÓÍ felismerő hnnn;ntzált ellenanyag gyógyászattag hatásos mennyisége olyan mennyiség, amely egy egyeditek beadva elegendő a kívánt hatás eléréséhez. A DRő-őt fölsimerő ellenanyagok gyégyászaólag hatásos mennyisége beadásának kívánt hatásai közé tartozik a célsejt halálának Indakálása, DR5 stonuláiása, BRS-te történő kötődés és megnövekedőit NFsb-szís;: vagy -aktivitás kiváltása a célsejtben, A célsejt olyan sejt, amely l>F5-őt ezpresszál, és például lehet abnormálisán növekvő sejt és daganat, talsf példáni papillóma ás szemölcs; emlőrák,, vasíagbélrák, hepstdma, leukémia, tüdőrák, tnehmöma, mielónta, ossteoszarkótna, petefoszekmk, tasnyálmlrigyrák, prosztatarák, fej és nyak rák, ptgxstairigyrák, méhrák, és agydaganat, mint például asztrochóma. A? vívó a célsejt patológiás egyed sejtje, például amelyben a sejsproiifeáciő abítorn-ális vagy szabályozatlan, mint például rosszindulatú vagy jóindulatú rákban és remnafoid. artritlszben.
Egy másik előnyős megvalósítási mád szerint a célsejtet érintkezésbe hozzak terápiás szerrel is.
-20A terápiás szer olyan vegyület vagy készítmény, amely hatásos patológiás állapot enyhítésére. Terápiás szer szemléltető példája rákellenes vegyület.
Rákellenes vegyület olyan vegyület vagy készítmény, amely hatásos abnormálisa» növekvő sejt növekedésének gátlására vagy megállítására. Rákellenes szer gyégvászatilsg hatásos mennyisége olyan mennyiség, amely egy «gyednek beadva elegendő abnormálisán növekvő sejt növekedése gátlásának vagy megállításának ksváltáaárü. Rákellenes vegyületek sZönléíletö pékiái közé tartoznak a?z alábbiak: bleotnlcis, k&fhopkttm, klorambacil, eiszpiada, kolhidn, cikiofoszfamiá, daanorsbícin, áaktlnomlein, dietüsztilbesztrol. doxorubiels, etopozM, d-ihtöronrsisí, fllbosridm, meiíoian, metolresát, mitomiem, ö-merkapteparl», tenipozid, ő-tíoguanin, vinkrisztln és víshlasziin. Rákellenes vegyületek és terápiás szenek további példáit megtalálhatjuk a „The Merek Másnál of Diagnosis and Tberapy” című könyvimn tszerk.: Berkmv és mtsai,, kiad.; Rahway, hl, 3. (1987)), és Slaáek és tstsak „Métabolism and Aeílm; ot Ashi-Canoer Dntgs” (szerk.; Fonás és mísss., kiad.: Taplót and Francls, New York, N'.Y. (1987}] cimö könyvében,
A találmány szerinti ellenanyagét tovább kombinálhatjuk a rosszindulatú daganat kezelésére, más terápiákkal, mint példán! kemotorápiával és radioíerápláyal együtt, és s terápiás hatásosságot fokozhatjuk spontózis-indükáló vegydietekkel, nrint psídánl bísz.indedilrnaíeinnd Vlií-eoi.
A korábban Isirí aott-DRá ellenanyaggal (24) összehasonlítva a találmány szerinti szemléltető antiIÖR.S ellenanyag apoptöxls-sndokáló aktivitása nagyon erős, és képes apoptózlst mdakáini Torkai sejtekben a pg/pi szintes m váz», ás kiváló to vö-o daganatellenes aktivitást mutat a korábba» leírt oldható TRAiL-kez képest. A TRA-8 egyetlen dózisának úmuvénás beadása elegendő mind szilárd daganat, mind hemaíopoieílkus daganataejtek növekedésének gátlására, őrig « daganatregresszié ót vtoo isdokálása oidlmtő YRAÍL-leí sokkul magasabb dózist Igényel (áőO pg naponta 1Ö napon keresztül). A találmány szerinti anSi-TRAlL-reeeptor eUetsanyagok ugyanolyno biztonságosnak tűnnek, mist az oldható TRAIL, mivel a szemléltető TRA-Ő ellenanyag nem indukál apoptőzíst nem transzfoonáit ilbrobiaszt sejtekben.
Az alábbi példákká: részletesebben is bemutatjuk sz. eljárásokat és erttöftrénygksd. Ezen példákat ügy tekintjük, mint a reprezentatív eljárások és eredmények illusztrálása. Ezen példák nem zárják ki a találmány ekvivalenseit és variációit, amelyek nyilvánvalóak a szakeorber számára.
1, pólds. ÖRS antigén előállítása
ÍJ A ÖRS e&NS klónozása
A hantán DR5 fehérjéi kódoló DNS-t RT-PCR eljárással klónozzak meg az alábbiak alkalmazásával:
a) Teái plát
HeLa sejtek össz-RNS-ét exbaháljuk TRfox reagens (CdBCO SRkj alkalmazásával, A FCR-reakclő tempiáíisként ttikalmazolt cDNS-Ι fómöóiívmd eöAJ yríhóosó resgenskészíet <Amersham Pharmaeta Bloteeb) alkalmazásával állítják elő a reagenskészlethez mellékek kézikönyv umshásat szerint.
b) PCR lásreindítők
Az, alábbi oligomtkieöíkl láoeiodkőkát szintetizáltük meg a PCR-hez:
T-gaegatgeeegatetacttíaaggg-dJDRSpk 1. azonosítószámú szekvencia):
Y~ceaeígggís:stgítgg.síggg'd' (£>R5p2:2, azonos kószámé szekvenciák
Hacsak másképpen nem adjuk meg, a példákban szereplő összes oiigonekleotlöot a Lite teehnologies céggel szlntet lzáhaljak meg. Az összes oiigsnakleotldot -ktTC-on tároltok miután íelolíloíütk desztillált vízben.
ϊc) RCR-reakesÓ
A PCK-ntakcióefegy összetétele ez alábbi: temolát cDNS, 5 ul a teljes 33 μί reakcióból ÖRS p l jelű iáneindltő, 10 ptnol;
DRSpz jelű láneistdító, 10 pm.ok .I9x koneesírált PÜR-snt'íer (a reagenskészlet része), 10 μί; dNTP-k (mindégvik 2,5 saM), 4 pl; és Taq-pollmerás (Promega), 5 egység.
Steril dssAillált vizet adunk az oldathoz Összesen 100 μί-re. Hacsak osásképpes nem adjak :tnegs a dMTF-k -áATP, dCTP, dOTP es dTTP ekvánoláris. keveréke (mindegyik 2,5 raM).
A PCR-reakciót az alábbiak szerint végezzük. Az oldatot először 94’C-ra melsgltjllk 2 perere, ami után §4°C«ö8 30 másodperc, 52’C-on 1 pere és ?2A>oo 3 pete ciklust 40-szer ismételünk. Ezen eljárás befejezése más a resketüs elegye* 72°C-ra nmlegiíjük 10 peresre.
Az így előállított usnpiitikáit öW-lhsgmgísseket 1% agarözgéien választjuk «1, amely 0,2$ ugíml etidinrn-bromidot tartalmaz, Azokat a csikókat, amelyekről meghatároztuk, hogy a kívánt ÖHS-fragmenseket tartalmazzák, kivágjuk borotvapengével, és a DNS-t vissannyerjük a ínon; Cferos reageoskászledel (BlOlől), A DNR-iragmenst a X-t Cáunng Ad (lovltncígen, CA) alkalmazásával klórozzak. Szt az alábbi utódon végezzük,
A PCK-teakuléelegybó! visszanyert HNS-lrzgtnenst 58 ng pCR2 vektornál együttiantely Ed Clo.mkg RR résre s összekeverjük 1 ui löx Unsz reakclópnÜérrel [-5 mM Tris-HCi (pH 7,5), 6 ®M magnéztum-klond, 5 taM nátrium-klorld, 7 tnM β-merkaptoetsnol, 0,1 tnM ATR 2 rrsbá ÖTT, 1 tsM spermáim és 0,1 mg-ml szúrvastutuha-ssérumaiburoin), amelyhez 4 egység T4 DNS-Ügázt (1 pl) adtunk. Az elegy Osszíérlogaíát 10 μί-re állítjuk be steril ioncserélt vízzel, és a kapott iigáz-oleatot 15 órát ketesztül inkubáljuk i-RC-on, Szén idd letelte után .2 ul ligás reakciőelegyet adnak 50 pl kompetens ΎΟΡ10Γ A co/í törzshöz (amely a ΓΑ m'ontng tó része, és s használni! utasítás szerint lett kompetenssé téve), atselyhaz 2 μί 9,5 M jkmerksploetanolt adtunk. A kapott elegyet jégen Imájuk 30 percen keresztül, majd 42 'C-on 30 másodpercen kérésztől és ismét jégen 5 perces keresztül. Azt követően SÖÖ ál, 254 v/v tripínni, 0,5% Wv élesztökivomíto·, 0,0554 név násrinm-kiorsdot, 2,5 íhM kálium-kksridot. 1 mái magséziam-klori-det és 29 mái glükózt tartalmazó tápközeget (amit a leírásban ezentúl „SOC” tápkőzegnek nevezünk) adunk a tenyészethez, és az elegyet inkubáljuk 1 órán kérésztől 37°C-o« rázatássai. Ezen. idő letelte mán a tenyészet széleseink L-tápközeg agaresészére (1% v/v trlpton, (1,554 sv;v élesztőkivonat, 9,5% Wv nátrknn-kiorid. 0,1% vriv glükóz és 0,ó% w/v bakto-agar (Dllbe)], amely 100 pg/ntl ampidihnt htrloimaz A csészén meglelenö asnpkdilm-reziszáons kolóniákat kiválasztjuk és platina átvivő kacsom! lekaparjuk, és tenyésztjük 189 pghrtl mspielilini tartalmazó L~íápkőzegben 37’C-tm éjszakán keresztül 200 rprs rázaíássnl. Az mkubálás után a sejteket csníriíhgálással begyüjtjők, és azokból plazmád DINS-t állskmk elő az sfclikns eljárás alkalmazásával, Az Így kapod piazmldokból az EeoRi-BsoRi ÖRS eöMS-tragtseust szofeklórsozztik pcDNAS plazundba (Inviírogen, CA). A peöNA3-ban lévő ÖR5-§őnt teljes hosszúságban megszekvenájjuk, és az megegyezik a publikált szekvenciával. Az igy kapott piazmidot pcÖNA.3-öRS plazsnldnak nevezzük.
1.2 HRS-IgG expresszids vektor elSáliitása
Annak érdekében, hogy előállítsuk a humán ÖRS oldható termáját a transzmembrán dómén nélkül, egy expressziős vektort konstruálunk. Ezt a vektort ágy tervezzük, hogy olyan fúziós iehérjét kódoljon, amely a humán ÖRS extraeeliuláris áomónját tartalmazza iuziönáliatva s humán IgGl-Fe DNS-éhez (41), A trartssmembnús etemén nélkül! humán öR5-őt kódoló DNS-t sz alábbi PCE-reaketöval állítjuk elő·
a) Templát
A FCR-raskelőhoz alkalmazok temulát a psDNÁM>R$.
b) FCS-l&sdsdföők
Az alábbi olígonukleotíd láncssdltókat szintetizáljuk nseg a FGR-hez:
5'-gaegat,zeecgaícíacfttaaggg-.3í (DRSph 1. asososítöszámő szekvenciák;
5''-ggaic.egtggueaoaticgaigio-3> (DR5p3; 3, azonosítószámú szekvencia);
Hacsak másképpen nem adjak meg, a példákban szereplő összes öfigosaklesnídoí a Life ieeítnoíogies céggel szlntetizóitstínk meg. Az összes ollgönakleofiítet -20eC-on tároljuk miután feloldottuk desztillált vízben,
c) FCR-renteríö
A FCR-reakció végrehajtását ás az aropliEkák DNS Izolálást az 1 ,l(e) példa alapján végezzük.
Az így kapott piszrmdot peR- ADR5 plazmádnak nevezzük, A humán Fe-fragmensi koholó BamHl'BcoRI ffagmensi,. amelyet a pmFas-hfgGIFc piazmidböí áilitsftusk elő,. szabklónoz.zuk a jscDNA3 BaraBI és EooRI többszörös klónozó helyeire. Az így előáliltstt piazmiáet pcDNAFc piazmtdnak nevezetik, Ezután a pCR«ADR5 plasmiából előállított, humán oldható DRS-róglót kódoló BamHl-BsmHI tbsgmesst szubklénozzuk a peSDHAFo plazmid Bami-fi helyére. Az így kapott píszraidei pcDNAADRS’Fö plazmidnak nevezzük- A pcDNAADR5-Fc plazanidből előállított, humán oldható DRS - humán IgG Fo-rőglót kódoló EeoHl ífagtnenst tompa végűvé tesszük a BNS-polrmeráz Riesovv-fiagtnense (GIBCO 8Rt) alkalmazásával, és azután szubkiósozzuk a pAdCMVS ingázó vektorba (Quantum Bíoiecbnologies Inc., Canada), amelyet tompa végűvé alakítottunk SamEií hasítás után. Az Sgy előállítón plazmídot pAdADRS-Fe pi&zmidnak nevezzük.
1,3 A humán DRS-ígd fúziós A hérje exprnsszáiPstása és tisztítása
QBÍ-293A sejteket (az ^D£/VÖ-0ítssf A7t része) együtt irtmazfekíálunk pAdADRS-Fc nlnzmidásl és Qfil viráiís DNS-sel (sz 4£lS¥ö-<3ííítH K7f része) az .4£Wfíb()öerí A7r (Quantara BlöteehnolögíCS Inc.., Csnada) alkalmazásával a használati utasítás szerint, A rekombínáns vlrustaríottekat tenyésztjük, és szkriseljük DRS-ígO fiiztes fehérje «agressziójára a iéiülúszó BUSA elemzésével A pozitív tártokokat aropkbkáliok QBI293A sejtekben és. -IRCC-os tároljuk vfeus törzskultúrskónt, 50 csésze (150 mm) Q8I-2O3A sejtet trassziéktálünk.pÁáADRS-Fcrekombínáns vírussal ló tn,oJ,(„Mnltipllcíty of Itdectíon) tnsliett. A tenyésztő tápközeget 43 órán keresztül tartó transzfekeiö titán begyújtjuk.
A DR5-lgö gént tartalmazó bastszískták sejteket 1 s l(f sejbmi sejtsörüségíg «Svesztjük SOö sd 10% v/v FCS-í tartalmazó DMBM-íápkőzeghen (GÍBCO) 57’C-os 5% v/v Cö2 tartalmú atoiOszlÓrában 2 napon keresztül, A tenyészetet azután leceottifugáljuk (1000 rpm, 5 perc), és a iélülószó; összegyuiljnk. A ÖK.S-tgO íélölüszóbél történő tisztítását C1-4B affinitás! kromatográfia {Fksrtn&cia) alkalmazásával az alábbi köshilmények közöd:
oszlop; Brteefízé-Sepóurnse C£-íB oszlop (osztepméret 2 ml; Pharmacia); eiáelős pufiért 0,1 ,M glicin (pH 2,4), 0,1.5 M NaCI; semlegesítő pofiért 1 M Tris-BCi (pH 8,5),
Miután az összes ielfliüszöt felvittük az oszlopra, mossuk hátotsszor 20 tnl PBS-sel és azután 3 ml elócsős pufiért adunk 10 alkakmunal, Megmértük minden egyes- cinéit frakció (I ml) optikai denzhását. A. 2-5. Irakcíót (asnelyeknek nagyobb az OD280 értéke 0,1-nel) összegyűjtjük, és 100 pl semlegesítő puffot hozzáadása után ss efestnmokai kiiiöo-küihn dialízis csőbe helyezzük. és az eluáímnokat diaiizáljtsk I Hfer FBS-sel (pH 7,5} szemben 4*C-«o, Á. dialízis puffért kétszer eseréljük.
Az gJeátöffiöRai azuítbt megvizsgáljuk a DR5-í§0 géntersnék expresszzőjára EUSA-v&l, Először 109 ph; tesaSttk minden egyes mtketóból külőn-küiört 9ó-méröhelyes tuskrotlterleníez (Costar) mérőhelyeibe, és inkuháljnk 37H7-tín 1 órán keresztül. Ezen Idő letelte utáa 82 mérőhelyen lévő oldatot ekávoiittuk:, és a mikreíkerletnezí mossuk 3 alkalommal 108 pi/mé.rőhely, 8,1% Wv Tween 20-ui tartalmazd l'BS-sel (ámít a leÍrásban ezentúl PBS-Tsvees-nsk nevezünk}. A mosás mán 2% w/v szsrvasfnarhíi-szé'rttmalfcnmmt (smst a leírásban ezentúl ,,B5A”-nak nevezünk; tartalmazó FBS-t adunk 180 ul/mérőhely mennyiségben, és a nükrntiierlssnezt inkubállok 3T*C-oa I órán kérésztől. Ezen idő letelte után a mérobelysks; még háromszor mossak 188 plórtérőhely PSS-Tsveen-rtei, ami után. 188 gi/mérőhely oidatet adu^k minden, egyes mérőhelyhez, amely FBS-Twen-ael lOOö-szeresre hígított unö-humán IgGi nronokionális ellenanyagot tartalmaz, és a míktooierlernezt még egyszer inkesáljuk 37%:-οη l órás keresztül, A mérőhelyeket azután háromszor mossak ISO gbmárőheiy PRS-Twen-nel 3,3!,5,.V-teSrametíl-be?5zklia (amit a leírásban ezentúl ..TMEf'-sek nevezünk) folyékony szobsztrátot (Sígma) adónk 180 gíónórőheiy mennyiségben, és a mikrottierlesnezí hagyjak szobahőmérsékleten áílttt 5 percig, ás azután a reakciót feáühjek 108 piánérőhely 8,2 N ,H2SO4 hozzáadásával. Leói vassok miden egyes mérőhely abszerbaneláját 458 um-em hogy megbecsüljük a kötött ellenanyag mennyiségét, a őóő tun-en mért abszorhmteíát alkalmazva kontroll mérésként. Az abszorhanesát mikrotiterlemezdeolvasóval tséíjük (Mofocoiar Devices}. A DR54gÖ I. íetmeléséí ezzel aa BUSA eljárással Igazoljuk. Az expresszált DR5IgGI fúziós fehérje molekulatömegét Westero-blot elemzéssel határozzak meg, amelyben aníi-hmnán-lgö 1 .monoklonális ellenanyagot (Sígma) alkalmazunk az: ellenanyag gélben történő detektálására, Az: expresszit GR5-igGi biztos fehérje molekulatömege megközelítőleg 50 IcDa, Az elért tisztaság ssagyohb mint 90%, amint azt SDS-FACE-n Coommme Élne festéssel történő elemzéssel megállapítják.
2, példa, Mossokkmátis ellemmysigok iétirehoztoa humán DRS ellen
2.1 Immunizálás ő-S hetes nőstény Balh/C egereket (laekson Lsborztory, Bar Hatkor, &<E) ismnamzáltmk affinitástiszíhott iramán DRőfüigöl fúziós fehérjével. A kezdett, tnipoo történő immunizáláshoz a fúziós fehérjét (50 pgj emslgeáljuk Freund-fele komplett adjutánsban (Diíeo, Detroh, Ml). Az egerek azután négy megerősítő oltási kapmtk 58 pg adjuváns nélkül beadott fúziós fehérje bjoktáiásával minden második napon, Három nappal az· ofolső Injekció mán nyirokcsomókból szártnazó llmtocitákaí íúzlooáliatunk Hb-1 mielóma sejtekkel, és a hibrldőmákfe: 1G% magzati borjúszérammal kfegásssíett FI 84 íápközegben tenyésztjük. A pozitív hibrtáótnákaf FLISA-vai szelektáljuk ki, amelyben a mikroüterfemézeket vagy í pgúnl fefefohlgGÍ-gyel vagy kontroliként azonos mennyiségő Fas.fe.lgG 1 -gyei vontak be, A hibridómák. izoüpusáí EUSA-val határozzak üteg egér lg Izettpus-speeíőkus kecske ellenanyagok paneljának alkalmazásával (Southern Bustaehaology, Birmingham, AL). A monokfosáiis ellenanyagokat affinitás! kromatosrálBval tisztitjak immebilizálí antt-egéolgGl vagy Proteln-G alkalmazásával (Sígma).
2.2 Sejtfúzió
A megerősítő oltás után a harmadik nttptsn a oyirukcsmnőkai eltávolítjuk az egérből, és 18 ml szérummentes REMI 1648 tápközegbe tesszük (G1BCO BRL), amely 50 egységZml peofeiliíaE 50 pg/tui sztrepíomicmt és 388 ttgóni L-glmamsnsavat tartalmaz, és a szerves spatulával szitán íőrtéstő átoystoással bernijük szét (Lett SMwr, Falcon). A kapott sejiszuszpesxlói leeentrihígáljnk a nyífokesomó-spítek csapadékba viteléhez, ame-24lyekot sántán kétszer mosnak szérammentes RPMl~i:ápkőzeggeí. A mosott sejtekéi azután tefezaszpendáljuk szésarmmentes RRMftápközegben és leszámoljuk.
Közben NS~I. micíőma sejteket (Áruérteim Type Cukoré Cöltecíioo TIB-IÖ) növesztettünk 5 x 1ÚS sejé'ml-í {aeg .setR hatódó sejtsnrSségre ASFIÖ4 iápközeghen (Ayinomoto, K, KJ, mely 10% v/y FCS-t (Gibeo BRT) tartalom?, (ASF tápközeg szérummal) 37%1-tm S% CCh-ben, amelyeket hasonlóképpen feltárunk, mossuk, rssznszpeudálonk és számlálunk.
Az NSI sejtszuszpenziö számított, 3 x 10? sejtet tartalmazó: menny bégét összekeverjük sépsejtsznszpenzíő számított, 3 x 18* sejtet tartalmasé mennyiségével. A kapod keveréket lecentrifogáljuk ás a félülúszót eldobjak. A sejtfúzió áléból lépéseit ágy végezzék, hogy a csapadékot mindvégig mőanyagcsöben tartjuk. IT^C-oa egy meleg vízzel lökött fezőpohárban.
ml $O34( tw/v) poíjetüéngiikol-lóöO'Kt (Eoehrínger Maskebs) adtunk aztttás lassan a esőbe, mi.ala.tt a csapadékot egy pipetta 'negyével keverjék. Azt követően I mi szérummsntss, 37C-rs előmelegített RF'Ml tápközeget adunk lassan két részletben, majd további 7 ml seérnmmentes RRMÍ tápközeget. A kapott keveréket lecentrifugáljuk, a féiüluszőt eldobjuk és 10 ml, lö% FCS-l Wtelmzó HAT íápközegeí adunk hozzá, miközben ovafosas keverjük a pipetta hegyével. További 20 nrl, l.ö% FCSa tertelmazb HAT tápközegeé adunk hotezd, és a szoszpenzlóí szétmértük bö-mérőhelyes tenyésztő mifeotkertemezte löd μΙ/méröhely mennyiségben, és 3?”Cos?· Isksbáljak 5% COj-t tartalmazó atmoszférában. 7-8' nap elteltével 1ÖÖ pl friss HAT tápközeget alkalmazunk a sápközeg helyettesítésére a sárga árnyalaté mérőhelyekben. Az ezen mérőhelyekből való fúziós sejteket klónozzak az alább leírt korlátozó hígítás áíkaaoaztísávaí.
2.3 Klónozás korlátozó higlíássnl
4-1 δ hetes nőstény BALB/c egerek {Japan SIC, Inc,) csecsemőmirigyeit ebávolkjuk, feltárjak szitást (Ceü ötemúrer; Falcon), amint azt fent leírtuk, és a feltárt sejteket kétszer mossuk 10% FCS-t tartalmazó HT tápközeggel, Sgy egérnek megfelelő csecsemőmirigy-sejtet feiszuszpendúhmk 30 ml, 10% FCS-f tartalmazó HT tspközegfeen, táplőiösejt-sztsszpenzsőt létrehozva. A lenti 2.2 példában előállított fSziös sejíkészltményf iO-lőOszoresra hígítjuk: ezzel a tápíálőseli sznszperzíővtd, és tovább hígítjuk sorozatban a tápiálősejt-sznszpenziovaí 5, 1 és Ö,5 fúziós sejt/mi sűrűséget előállítva. Az igy előállított mintákat Oő-méröhelyos mikrotiterfesnez mérőhelyeibe osztják szét IÖ0 μΙ/méróheiy mennyiségben, ás 37°C-on inksháijuk óké COj-ben.
2.4 Szkrlnelés
A növekvő hibrldómák tenyészeí-telúiúszőb SUSA-wl szkrínsíjűk, vagy 1 pg/ml drá/higGI-gyel, vagy kontrollként azonos mennyiségű FaszhlgQl-gyei bevont mikrotiterfeisozek alkalmazásával (41). A kötött ellenanyagot tormaperoxldázzal (HRF) ktmjitgált ami-egér-mmsungloholbmkkaí (Southern Bsoteehooiogy, Birmingham, AL) detektállak TMB-í (Sigma, St Leüss MO) alkalmazva szuhsztrálként. I pg/ml koscentráciéjd tisztított DRó-ígöTeí vagy azonos mennyiségű Fas-IgGl-st adunk úő-méröhclyes £71/.3,4-0¾.% >TfB/r‘ Fűd/Ti (Cortar, NY) mérőhelyeibe. A mikrooterlemezí állni hagyjak 4*C-on. éjszakán kérésztől, hogy lehetővé tegyük a fehérje mérőhely felszínére történő adszorpcióját. Ezen idő leteltével: a mérőhelyekben lévő oldatot eldobjuk, és mérőhelyeké 3-ssor mossak BBS-Ttvésn-nel. Azután löö pl, 1% (w/vj szarv;5smsrira-szétumalbnmmt (A38Ö3; Sígma Chemicals Co.) tartalmazó ŰBS-t adunk mindegyik mérőhelyhez, és s mskrötiteríemezt 37°C-on. infcobáljuk 1 érán keresztül. A métöhelyekeí azután még 3-szor mossuk PBS-Twen-neí, ás 30 ui tenyászmielülúszoí adunk növekvő hibrfoötoákhői az egyes mérőhelyekhez. A mikrotiterfemezt azután .s/^C-on mkubáijok I órán keresztel, és a mérőhelyeket megint 4-szer mossuk FBS-Tsveen-nsI, A mosás atán 30 ni tormaperexidázzai jelöl; wHgér-BsmegfobaíÍH ellenanyagot (Southern Bioíeehnology, Birmsrsgham, AL) lőüő-szeresre hígítva PBS-bes - adunk mérőhelysnkéní, és a nükröllierieisezl ismét bskübáljük 3 7C-on 1 órés keresztül, ami után s márőheiyekuf 4-szer mossak PSS-Tween-ael. 3.,%5’-tdrtóetsbbea£iáÍ8 (’TMBj felyékoay szussztrátnt (Sigmu) adnak 1ÖÖ gl/méröhuly mennyiségben, és a mikrrhzterlsnruzl hagyjuk szobahőmérsékleten áüni 5 páréig, és szatsa a reakciót leállitjük 100 gl/nséröhely ö,2 öl H2SO4 hozzáadásával Másjuk az, egyes mérőhelyek abszítfbanclájás: 45ö ran-en (kontroll ÓSÖ ont) mlkrotiterlsínez-leoivaső (Molecular Devices) alkalmazásával, és kiszelektáljuk azokat s fúziós sejteket a mintából, amelyeknek az abszsrbsneiáía {4S0 nmÓ5Ö am, OD-érték > 11,5) nyilvánvaiősst -uagasabb, mód szóké, amelyekhez nem fúziós feialúszo tett adva <ÖD« érték » Ö,Ö3), Ezenkívül a növekvő hibndőosák ísnyészet-felülúszólát fűnké lónál isan is szkrineljők. az apopíózss-iudökálö aktivitás mérésével Járkál sejtek alkuim,adásával 31) pl Jurkaf sejtet tartalmazó SFM1 tápközegef (lódó sejt mérőhelyenként) és 5 μΜ biszindolihnalemud Vlil-at (BisVHL Alexis, Sas Diego, CA) adunk. ÖŐméróhelves mikrötiferíemezbe, növekvő hihridómából származó 50 pl tenyéazet-telOlószó jelenlétében, A sejteket párásítód inkubátorban tenyésztjük 37°C-on éjszakást keresztül. Az apoptózist a sejtek életképessége alapján iratározzuk meg az. .47P£íío rsagenskészlet alkalmazásával, a gyártó utasisássi szerint (Faeksrd Instruments), és a mintákat CopCounfez isésziilékkei számláljuk (Paekard Instruments).
2.5 TRA1L és TBA-8 receptorhoz való kötésének SLISA-ja
E1..1SA ntikrsdterlemezskéf vonnak be 2 pg/íírl DR4-lg vagy DRSdg iuzlós fehérjével éjszakán keresztül 33's BSA-val történő blokkolás után az szidható TRAlL-FLAG-ot vagy TRA-Ű-at adónk a jelzek konceníráelókbsn, és hdsubáljuk 3?nG-on I órán keresztül. A TRAÍL vagy TRA-8 kötődését sorrendben HRP-vel konjogslí aső-FLAG ellenanyaggal (Alexis) vagy líRR-ve) boningéit anti-egér-lgGI-gyei (Seuthern Bioíechnology) detektáljuk. A reakciókat TM8 szuhsztráfíal hívjuk elő, és RsemAnmA' AAmmpfere AYmAv· készülékkel (Blorad) mérjük, A. Rd-értákekef az „on-ssts kötési modell alapján nemlineáris regresszióval a GrupACsö/Irton szoftver alkalmazásával (GrapbPad Software, San Diego, CA) becsüljük meg. KompétIflv BliSA-htsz 10b ng/ml TRA'lL-PLAG'Ot alkalmazónk, és inknbáijok, TRA-k kölönböző koncentrációsnak jalertiőíébsír, A TRAIL kötését a fentiek szerint határozzuk üteg.
Hő Klónozás
A fenil .2.3 és 2.4· példában kárt lépeseket 5-ször mögisméteijük a 2.4 példában kiszelektált sejtekkel, ezáltal lehetővé ;.esszilk több hibridóma klór, kíszeíekíálásá;, amelyek mindegy ike olyan egyedi ellenanyagot termel amely kötódík DRÓ-lgG-bez, de nem kötődik Fas-igG-hez, Ezen szelekciós eljárás eredményeképpen egy egér-egér hibridőnrát óllitonk elő, amelyet TRA-S-rsak nevezőnk, és DR5-;gG-hez kőtódő, de Fas-lgG-hea nem kötődő ellenanyagot tértnél. Szí a TRA-S bihriáőmát letétbe helyeztük az „Amurié,au Typs Cukoré Colleefiöm'-nál 211011 íuárehxs 1-én, ás a ΡΤΑ-1428 elérési számot kapta.
A TRA-S egér-egér hibridóma által tenned ellenanyag (amit a leírásban ezentúl egyszerűen „TRA-S”nak nevezünk) alosztálya Igö i, E., mit egy mottöklosáiis ellenanyag izotipizáló reagenskészlettei történő teszteléssel demonstráltunk (P'wree).
A humán DE5-igGI fúziós fehérjét imxnrssogénként aikslmazvn hét hibridóma klóm áliiíoSümk elő a kezdeti EtiSA szkrtneléssel amelyek mindegyike erősen pozitív DES-igG-rs, de a Fas-lgG l'üzdőa fehérjére nem, jelesve, hogy a kapod: hibriöömák olyan eibn&nyagokaí termeinek, amelyek felismerik a. DBS sxíracelhuárls részét, de az igö Fc-régiójá; nem (adatokat nem közlünk).
3.7 Western-IslM elemzés
Normát numáa es rakes szöveti Itemogeaizát&nok tesztelésére szolgáló szűrőket vásárolunk a Oeno xeshttogy cégtől <St I-outs, MO). Mindegyik sávba azonos meanyíségh fehérjéi viszünk fel amint a®: and-βtót ellenanyaggal raegbirtározzak. A htokat 1 yg/teí TRA-S-cal ptebázzek éjszakén keresztek és azután RnP-vsl konjugált satt-egér-igöl-gyeí (Sotehem Báotechnology) szobahőmétsékleten 1 órás keresztek és kentllamtneszceaslával hiyíok elő,
2.8 te síte immashlsztokémia
A humán szövsteke: az S,UÁB Tissus Ptectszement Ceníer’Mél szerezzük be. A fogyasztott metszeteket >’ö% etanolban rögzítjük,. blokkoljuk 10% lőszármnmal PBS-ben, és azután iakabáljék íi; gg/taí afFaútásttsztttott ΤΚΑ-8-cal szohahömérséktefes öü percen keresztet And-egár-tgG ABC reageagkésztol (Vector, ©orllngsmc, CA) síksimazask diassiaobenzsdtenel ktete'iteeíriás sznhssteátként. a rcsktivhás kimutatására.
2.9 Ksszpás altíváíás elemzése
Júrkai sejteket 0 x föUml} ré.ksfeáluEk S00 ng/tní TRÁ-8-cnl A sejílizátera alikvodad <30 pg fehérje) eívstesztjtík 15% SOS-FAöE-s, nylon-membránra Isfotteljok, és a biottokst prőbáaznk ejtíékaszpéz-H, -9 és -3 ellenanyagokkal (SD- Phanamges, San Diego, CA), majd HRP-vol koajttgáH másodlagos .ellenanyaggal, ás a isasiteít termékeket kenaluminesacemáával mutatjuk ki. A k-as^áa-lahlbbte· rescsnskészSetet az R & D Systems cégiéi (Mmneapotis, MN) vásároljuk Mindegyik kaszpáz-lífelbitert a jelzett koncenteáctóban. adjuk a 'tenyészethez.
3, példa, A TRA-8 moaoklenáíls ellenanyag tisztítása
A TRA-8 egér-egér hibr-időmát 1 x 10* sejttel sejteűteségíg növesztjük 10% v/v FCS-t tartalmazó 5Ö0 ml ASF tápközegbea 37*C-on 5% CO?-bez. 3 napon, keresztül. A tenyészetet azután teeerteíthgáijsk: <1ŐOO rptft, 5 perc), ás a fol-ülúszőt őaszegyöjtjök. A TRA-8 fefelüstebőí történő Esztitását RrotoG-S^Aemse t'í-48 aRV sHtesi kromategráfia alkalmazáséval végezzük az alábbi köteirnéayek kötete oszlop: Pmeteő-Sepbntwe CX-Í8 -oszlop íoszbpteéteí 2 ml: Fbazraacsa); eláclós puffer: 0,1 M gllcm (pH 2,4), 0,15 M NaCl;
semlegesítő pulfer: 1 M Tris-HQ (pH 8.S).
Miután az összes fek-lüszót felvittük az- oszlopra, 20 ml PBS-scí mossuk háromszor, ás azután eiűoíős puffért adtunk ÍQ-azer 5 ml térfogatban. Megnrérjék tntodea egyes eloált frakció (1 ml) optika.; áenzdásat.. A 2S. frakciókat (amelyeknek .nagyobb ez 0D280 érteke ÖJ-rtéí) kPíös-kSiörs összegyéjfjük.
ISO p- semlegesítő poffer hozzáadása utátt az eluátnraokat kölön-küiürí dtaltzíscsöba helyezzük, és az ehsáttanokat disllzálink 1 liter PBS-sel (pH 7,3} szemben 4'·Οοη, A teaílzís portért kétszer csereijük. Ezt ,-s srsirstái: eletaezzök snti-DRő ellenanyag aktivitásra ELlSA-val a fent előállított hantán DRS-lgö hszsrss fehérjévé;, a fest. leírt módszer alkalmazásával.
4. példa. Ö8t4 siatígén, ÖRd-ígC ctprcsszlős vektor és n«ís-l>R4 moáoktoálls ellenanyag stfiislis tása
Az 1-3. példában telis eljárásokat megismételjük. ÖS.4 templát-oDNS és láncisáltök alkalmazásával az t. példában leírtak helyett, DR4 antigént előállítva, amelyet az í.:, 2. és 3, példák szerint alkalmaznak DR4-re specifikus- monoklonálts ellenanyag étőáltttsaara.
S. példa, Öe&i és DR'2 ellesi. monoklonáils ellenanyagok
Moaosíiunskús .ellenanyagokat termeltetünk a DeRl és DeR2 áteamepferek ellen a megfelelő eDFlS ás láncindkék belyettessiésével ttz megfelelő antigének előáliúásáhtsz az l. példa szerint A De&i vagy öcR2 és kutnuaglabalm-0 festők expressziös vektorait és a megfelelő tisztított numoskmálls ellenanyagokat 3 2, és 3, példa szerint állítjuk sls, δ, példa. Mesokiosálís ellessayag speelflfása
Mivel a TRAIL és & TiúFR-esslád más fehérjéinek az összes receptora szignifikáns mértékben homológ, a DK5 éileni szemléltető TRA-k ellenanyag speelSiásái Westem-blot elemzéssel határozzuk meg, két különböző hantán DRS-IgC.i hiziós fehérje és más rokon fehérjék oldható rekombmáns formáinak alkalmazásával, .Egy első DRő-ig feziéz fehérjét állúurtkelö a DR5 extraceilátárss részletének 1- 5 SO óldalláneái. cöNS-ének és a humán igö l állandó régióját kódoló eDNS feziouálúttssával. A fuzionáltatott eUNS-t klónozzuk rekontbináns sdenevirss vektorba (Quantum Riotschnngies, Inc., Montreal, Conada). .Ax expresszáltaíoít DRőfeigCI fúziós lekérjék amelynek a relatív molekulatömege 5Ö kiás, megtisztítjuk atüi-hurnári-lgö affinitást oszlop fisigma, St Louis MÖ) alkahnazáxával. A speolfeás Westera-bloi elemzéséhez egy második rekontbináns butnéu BRSÁgG fúziós fehérjét (52—212, sminosavsk), valamint TRA1L-RT -SÍ és -R4 fúziós fehérjét vásárolunk az Aiexis cégtől. A humán Fás és TNFR1 oldható fontnál Dr. Cári Edovards (Amgsn, Inc,, Thousands Öaks, CA, Amerikai Egyesült Államok) ajándéka. Az alkalmazóit oldható rekombsnáus humán O&4, DcRl, DeS2, TblFE.I, R4 és Fás molekulák bontás IgO-velaikololf fúziós fehérjéi. Az egyes fehérjékből Ö,5 gg-ot elválasztunk 18% SDSFAöE-n és nitroeeiluíőz. membránra blattul; uk. A bioitokat blokkoljuk FífS-ben oldott 5% tejporral szobahőmérsékleten 1 órás keresztül, és prób&zznk 1 ygfml tisztított ann-DAS monokliméi is ellenanyaggal (klóm TRAáj vagy ú,l ng/ml HRF-vei konjugáit kecske ants-humtm-igC-vel éjszakán keresztül 4’C-o». Tormaperoxidázzai (HRP) konjngált kecske anri-egár-lgö-t alimhsaztmk másodlagos ellenanyagként a kötőit TRÁ-3 detektálására. A biottokat kemilumiseszeeneiával hívjak elő.
Teljes hosszúságú í)S5-üí vagy DRá-et tartslrsaző cöHA'l vektorral vagy érés vektorral srauszfektáh COS-? seíteket (CRmteck, Fale Álto, CA) sikalmazmrk áramlási cítometriss elemzéshez. A humán TRÁIE-t vagy egér Fas-ligandtonoí kódoló teljes isosszúságú cöNS-t a pTRE vektorba klónozzuk a leolvasással megegyező irányban a tetracikiinnel szabályozható promőtaríöl (Clostech). A pTRE-nTRAlt vagy gTRE-mFask Xbol-Hindfil ffagntensét pedig a pÁsBN adenovirus ingázó vektorba (Quaestura Sioiecbnologies, isse,) klónozzuk, A 253-35 gazdasejtoket együtt tmnsxfektáljok 3lírstarizáh pAd-TRE-hYSAlt vagy pÁá-TRE-mFast vektorral és ntientsvirns DHS-ének nagy fragmerssévei. A rekomblnáus vtsusíarfoltok működőképes barnás TRAIL vtsgy egér Fas-ligandtan expressziójái''Ct-fsfczahadulást vizsgálati eljárással szkriualjúk farkat sejtekkel,
A TRA-8 erősen reagált s DR5-ígO fúziós fehérjével (-50 kl>a), amelyet az immunizálásra alkalmaztunk, amint ezt az la. ábrán bamutatjuk (i>R5, -1), ás gyengén a második BRá-lgíl tnxrős fehérjével (-őő kDa). amint ezt az la. ábrán bemutatjuk (DR5, k2), A ΪΕΛ-Ü nem kötődik szignifikáns mértékben DR4-hez, DeSlhez, l>cB.2~lsöz, Fas-boz (CI>9S) vagy TNFRI-hez. Ezes eredmények azt mutatják, hogy a TSA-8 olyan epitőpnkal ismer fel, amelyek spstafíkasttk a Dliő-re, de nem közösek a esdád ütés tagjaival.
A TRA-S nem rétsgái a TNF-recepror sxupsresaláá más tagjaival, mint például Fas-sat iCIÜÜs) ás TMF 1-ss receptorral, ős a TRÁ-8 sem kerssztreagái s DRS egér hmnnlogjával sem, amint ezt a 451) és éSŐ tnn-es optikai abszorhancla aránya muísijs, az alsó rész 1-? számai alak (la. ábra, az alsó rész S. oszlopa). Az oldható TRAIL és T8A-S összemérhető mártéklmn kötődött, az immobsiizált DRő-höz (1b. ábra, baloldali rész), Ezzel eíteotétbcn a T.RAIL kótódött s DR4-bez, de a 'TRA-8 nem nmtatett semmilyen köiöakt.ivhást a DR4-hez (lb. ábra, középső rész), A TRAIL és TRA-8 £>R5~höz vasé kötődésének Kd~értékér sotrestöbcti 59 sM-ra és 3 sM ra becsültök. Ftmtos .módon a TRA-8 hatéktmyan verseng: a TRAIL-Íel a DR5 kötéséért, de a DR-l-ést nem, assmst ezt kmnpeílilv ELISA-bsn kiinateítuk (lb. ábra. jobboldalt rész). Ezen eredmények megalapozzák a TRA-8 specHltásáta barnán DR5 iránt,
A 'TRA-8 képes a DR5 sejtfelszíni exprssvzlójának. detektálására áramlási etfómetr&s elemzésben, speesiíkas kötődést mutatva teljes hosszúságú barnán DR5-tél ünnszfektálí Cos-? sejtek sejtfetóaéítez, de DR4guel vagy üres vektorral tr&oszfektátokhöz asm (le. ábra), Hasoslóképpes az. w són írmnenhlsztokérnia TRA8-cal reaktivitást dotsonslráít teljes hosszúságú RR5 DNS-sel transzfektáh Cos-? sejtekkel, de sem azokkal, amelyek kontroll vektorral vannak tr&nsziektáh'a (ld. ábra). A TRA-8 nem indakál apoptozlst uem trarsszíekíák Cos-7 sejtekben, és Cos-7 sejtekből származó RNS RT-PCR-je nem mutatott spscsílkas PCR-tsrmékeket hantán DRS-öt kódoló párosított láocindkökkab. További lénké inná hs elemzés humán .hsrkat sejtek alkslmazásável azt ntüsnta, hogy - ksmsztkétés hiányábott - a TRA-8 erősen sejthalál! tndokák három különböző vizsgálati eljárással demonstrálva: seííéleíképerség, ,47-½¾. AfTTés Pá-ktzárás (le, ábra.), A birkát sejtek több mást 59%-ót elpusztította TRA-8 wsogyam szirtije, amim /17½¾ vizsgálati eljárást matatja. A TRA-8 Slöaktivstása spemllkns DRS-re, mivel az gátolható J>R5-lg fúziós fehérjével, de nem ssíolható DR4-lg házié» fehérjével (adatokat .sem köziünk). Xaszpáz-8, -9 és -3 hasítását detektálhatjuk Westem-bíot elemzéssel akár 3Ö perccel a Itekat sejtek kezelése után is (IX ábra), és a ,birkát sejtek sejthalálát teljesen gátolja az általános kaszpáz-mhlbiior (Z«VAB>) (lg. ábra). A kasxpáz-8, -3, -9 és -lö egyedi kaszpáz-inhibiíöral részlegesen gátolták a sejthalált, tovább jelezve, hogy a TRA-S-közvetheh sejthalál elsődlegesen ksszpáz-függő anoptőzíscss mecbaolztmtsm keresztül történik.
?. példa. Sejtfelszíni BRS expresszié) árnak árasstlásl eitomotriás elemzése: fő fealáírseeptor sok rlííganaísejts», de normális sejteken sasa
Azután megvizsgáltuk a TRA-8 kőtöképességéf a seltfe-színen expresszált DR5-nöz, és ezen reakció speciTsfásás CÖS-7 sejtek {American Type Cnítere Collecíion CRL-loSl) alkalmazásával amelyek traaszíektálva vártnak teljes buszszóságú DR5 vagy OR4 cDN'S»!: tartalmazó expresszié»' vektorral, vagy kontrollkém üres vektorral. Eikoeritrktsel (kb) kortjogált anti-sgér-igöl-et (Ebarmingen) síkaimaznnk második ellengnyagkém a kötött TRA-8· detektálására. 1 X lö4 sejt Stsoreszeeneiáját ntérjílk, áramlási eitométer (A/RI'SRm&íge) alkalmazásával az alábbi körülmények között;
Gerjesztési hohámhossz: 488 nm;
Dstekcsós hullámhossz: S03 ma.
Az áramlást uitemutrlúselemzé» azt mutatta, hogy az arsti-TRAlL-méeptör eiisnanyag a Dkő-tel tmrsszfektálr COS-7 sejtek .megközelítőkig 30%-át festette mag, amint ez; tsz re. ábra teli bisztogramja marsija. Ez a százalék párhuzamba állítható a transzfekláláss hatékonysággal, amint azt a trassszfektálás elemzésével megállapítottak zöld tlnoreszeess fehérje (OFF) alkalmazásával (adatokat ttom közlőnk). A TRA-S nem festette szignlSikáns mértékben a DR4-gvei (üres Isisztogram) vagy kontroli vektorral (pontozott hisztogfam) trajsszíbksált sejteket, jelezve, hogy a TRÁ-8 specifikus a sejtfelszíni .DRS-re.
Habár a DRő-sxpras;s;döí alaposan tanai mányozták áagaoateejfekhen az mRNS színijén [Rí-eger 1. és mtsai., FEB'S Tett:, 427, 124-128; old, (1998)], a £>R$ tetsződ expreszszlcját nem értjük jól (Gihson S.B. és mtsai,, Mól, Ceíi Blol, 20, 205-212, old. (2000); Kim X. és mtsaí., Clin. Csmoer Re», ó, 335-346. old,. (2l)ö0)]. Ezáltal a aoti-öRá monökionálls eliemsnyag elérhetősége lehetővé teszi szántunkra a DR5 felszíni mennyiségé-29aek vizsgálatát, és hegy korreláljuk az expressziét a sejtek TRAIL-készv^tat upoptozisra való érzékenységével. A sejtek (1 χ '{§*) alábbi panelját 19 pg/sni aíBnuás-uszíitott. TRA-S-eal ihkubáiluk szobahőmérsékleten 30 perces keresztül, és azután festjük PB-vai ksmjugsbt ants-egér-igöl-gyel (Fhartpingenj még Ml nemen keresztül.. 1Ö098 éleiképes sejtet eismzüsk a GéGyvoeüzge áramlási cnoroéíarrel sz alábbi körülmények között:
Gerjesztési hoilámbussz: 490 tart;
Detekciós hullámhossz: őftö ms.
Az öt tesztelt hematopiehkos sejívonal .a .íurkat, GEM-ő, Molí-4, H-9 és G397. DR5-expresszió detektálható & .fnrkat, CEM-G H-9 és U937 sejtek felszínén, de majdnem áetekiáthatatlae a Moií-4 sejteken, amint ezt a 2a. és 2a’, ábrán bemutatjuk. Habár DR3 R.MS-expresszlÓ magas szintjét leírták korábban (43), a FACS elemzés jelezte, begy eze n sejtek nem expresszál.nak magas szinten íefezim DES-öi. Ezen eredmények azt mutatják, hogy a DR5 felszíni expressziója nem korrelál a D85 transzkripciós expresszíójávak ami nem váratlan egy ilyen receptor esetében, A DBS sejtíelszin.i expressziOjániak a mértéke :;ejt-leszámsozás-speciíikos lehet, mivel a bommoposetlkus eredetű .rejtek többsége alacsony szinten expresszálodlk, mag a legtöbb gl.iómtt és prosztata sejt DR5 magas színijét exprssszáita.
TRA-S motsokionális ellenanyagét alkalmasaik a DR5 szerepének meghatározására TRAlL-közvetitett npoptőxis teihíkálásában a sejtfelszíni expressziéi rínak vizsgálatával különböző típusú humán dagamhssjtsk panelján, valamim ezen sejtek érzékenységé· TRAB.- és TKA-b-közvetitett apoptázisra, Elsődleges perifériás vérsejtek ttent exprosszáiísk sejtfelszíni DR? szignifikáns mennyiségét, és reziszlenssk mind a T8AIL-, mind a 'rEA-S-közvetkeé apopíőztsra (2s^ 2a’, ás Mf. ábra). Habár nrind az öt tesztelt barnán. T-leukémia sejfvonai expresszit delekíálhatö, noha viszonylag alacsony mennyiségű sejtfelszíni BR5-öt, közülük kettő (Jnrkaí és ÜEM-ó) osgyon érzékeny mind a TRAiF-közveiifett, .mind a TRA-S-kösvetkett apop-őzlsra, jelezve, hogy 3 DR3 egymagában elegendő apopt.ózis indsdáiására ezekben a sejtekben.. A Moli-4 és 1)937 sejtek részlegesen érzékenyek a. TRAiL-közvetheti apopfőzism, de viszonylag rezlsztensek a TRA-H-kőzvetíteít apoptézisra, sugallva, hogy más TRAfL-trecepíurek is részt vehetnek az apoptozis jel továbbításában, A E-9 sejtek reziszíénsek mind a TRAR,-, mind a TRA-S-közvehtett apopiózlsm, feltételezve egy immcellulárts apoptéziseliesos ótvonal által közvetített gátlást.
Az alkalmazóit sejtek panelját az alábbiak alkották: a HséSo, U2S1MG, D37B1G, DS4MG, G373MG, C1H235MG,US? butnár· rosszrndnhüá glséma sejtvunalak, és normál hutnátt aszlroetták, amelyeket Gr, Yancey Gíliespie-ső! (hlenrosnrgery Department of the ünivemity of Aiabams st Birmingham) kaptuk. A Gulá4, FC3 ős LnCap humán prosztatarák sejtvonaiskaí Gr. Wiiiiam Grizzle-sői íRathology Deparhaeru of the ümverelíy of Alahama at Birmingham) kaptuk, aki a sejtvormlaknt American Type Cukoré Coileotion-töl szőrözte be. A .ta márt leukérma Y-sejívonalsktít, a B-sejt limlomát, BesG2 .torkát sejteket (American Type Cukoré Gollectiort TIR-l52) és a CCBP-CEM CEM-ő sejteket ÍAmeriean Type Cstlsore Collecilon CGL-119); az G39? inosoeiía sejtvonalat (Amerietm Type Culiure Cnllscüon CRL-23Ő7) az American Type Cudaré Colleedoo-tői vásároltuk. Az összes lenti sejívönalat 1Ö% FCS-sel kiegészített REMI 1049 tápköznghen tenyésztettük. Áz 132 INI hamárs aszttoeita sejtvönal Gr. Rfchurd Jope (Rsvchíatry Department of the Umversity of Aktbama at Birtuitsgharn) ajándéka volt, és 5% FCS-sel kiegészített |>MDM íápközegben tenyésztettük.
Az oldhmő rekornbiuáns hotnárt TRAlk, amit az Alexis Curpomiks cégiős vásárolótok (San Diego, GA) egy fúziós fehérje, amely humán TRAfL sxtraeeilaiáris doménját Í9S-2S1, oldaliánc) tartalmazza az Nterminálison FGAö-cfroRéhex és 3 arnioosavből álló kapexoiopeptidhez íhdmusltatva. Ellentétben korábban kö-30Zök rns-címkézeít s RAiL-iss, a TRAih ez«a preparátuma egymagában sem. képes erős apnptöziscs választ indekáiul juntát sejtekben, és antt-í'LAö ellenanyagja igényel kereszíkötókéat sz spaptőzls fokozására. Az antiFEAO ellenanyegot is az Alex is-tői vásároltuk meg.
Maxi a 30 teszlek husná;· :twzmdaiaté. gllbma sajt detektálható mennyiségű DRS-őt expresszáit a sejt felszíné», A legtöbb közepes-magas színtű DR5-öt expresszáfe amint ezt a 2b, ábtárs beumtaíjak. Bárom, seitvoζδΐ, a D-54M&, B373MG és CK-235MÖ magsa szinten sxpresszáh DR5-Öt, míg bet ssstvcnal, a Bs-bks, U251MG, Ö37-MG, US7, SMK1 és 1321 Ni közepes szinte» espresszált. DR3-öí, Csak sgy sejlvuaak a H-465 expresszáit alacsony szinten DR5~öt. Mind a három prosztatarák ssjtvotial magas színien sxpresszált ÖRS-öt, amim ezt a-2c, ábrán bemutatjuk,
A nsrmál eísóáfegca 'Γ-sejtekhez hasonlóan az elsődleges B-sejtek sers expresszáltak szignifikátss mennyiségű ?3R5-öS, és nem mentek át apoptözlsím TRAlL-fei vagy TRÁ-8-cal történő kezelés után (2d. ábra). A négy tesztelt bmfetna sejtvönal közöl károm (SKWó.4, EB-3 és Rajt) expresszáit viszonylag magas szinten i3&5-öt, ás nagyon érzékenyek voltak tód a TRAIL·, tulud a TRA-á-közvetííett apöptózlsra. A negyedik sejtvonal, a Bandi nsgyets alacsony szintért axpresszál; DRS-dt, ás sokkal kevésbé volt érzékeny TRA1L- vagy TSA-S-közvshtett apoptózísta, Rabár az elsődleges mtrecíták sem expíesszáltak detektálható szinten sejt-felszíni DRS-dr <2b\ ábra), mind a négy tesztelt gliéma sejtvonnl magas színien expresszáit DR5-öt. A ÖRS expresszspjénak glmtaa sejteken mért, a T- és R-scjteknél magasabb szintje nem jár egyött szignifikánsan nagyobb érzékenységgel TR.A1L- és TRA-k-közvetitett apopíézisra, sugallva, hogy a ÖRS sejtek sejtfelszíni expressziója asm saükségssseröea korrelál az apöptózís szi.ntjévsi daganatsebekben. RT-PCR-í végeztünk a DR4, DS.5 és DcR2 hírvivő szintjének meghatározására az összes tesztelt sejtben (1. táblázat). Azonban általában az. elsődleges normál sejtek viszonylag, alacsony szinten expresszáltak DR5-öt, összehasonlítva a transzformál: díignssísejí ekk el.
1, Táblázati A TRAfL receptor expr-essxíájánssk RT-PÜR. elemzése*
Beitek DR5 ÖRA DeR2
Elsődleges T-sejtsk <0,001 <0,001 0,015
jurkaí 0,10 <0,001 0,21
CEM-b 0,50 0,59 0,25
Melt-4 0,10 <8,001 0,05
H-9 0,73 fedi 0,87
Elsődleges B-sejtek <0,001 <0,001 0,024
SR.W4 0.05 0,08 0,45
SB3 0.40 <0,001 9,35
Raji 0,55 0,11 Ö,45
Danái 0,73 0,36 0,63
Normál aszírociták 0,05 <0,001 0,12
SBŐ.05 9,56 8,00 0,14
D«7 0,44 0,5b 0,21
Ö54 1,15 9,46 0,12
13211x1 0,25 0,35 0.05
-31* Össz-RMS-í izoláltunk a sejtekből, és RT-PCR-t végeztünk sz Eljárások részben teák szerint, A RCR-tertne keket 3% agsrőzgélben választottuk el, és /-'«ίοη-Α AfhA ááfeífeszger ójoreaf íBiorad) aikrílmszásá' val elemeztük. Ax értékeket a β-aktiohoz viszonyított aránykési matayok he, & pékfo, Aptsptézís mőnkálása msteáalatö sejtekben /» te?
Annak mcgbatárezásársr, hogy a TRA-ö indukál-e apoptózisl transzforínálí sejtekben íx vitro, az összes DRÓ-poxtsív dagsnatsejtet megvizsgáltuk azok érzékenységére TRA-8 vagy TRAIL által Indokait spoptőzisfa.
A célsejteket (1 :< iö~ mérőhelyenként) tenyésztőnk öfomérőhelyos mikrotiterletnezeken oldható TRA1L jelzett konoeurtacjója és keresztkötő (Aiexisj jelenlétében,, vagy IRA-8 jelenlétében, ,3?ö€-oo éjszakán kérészied. A sejtek életképességét az siáhbiak alkalmazásával határozzuk meg: (!) ,4JPIrte reagenskészlet a gyártó utasítása! alapján (Rsckará ínstroments, Maridén, CT); (2) aa ΜΓΓ C'm7 ρζοίόΰΓοίί&οό'ίοόήόη.· fc'f (Sigma); vagy (3) elpnszíuk sejtek Pl-festése, és s sejtek áramlási cltomehiás elemezésével, A tenyésztés végén a sejteket lő pg/ml Pl-vel fejjük, és a Pl-rsegaíiv sejteket életképes sejtekként kspuzzuk, A hepatociták kondenzált sejtmagjainak elemzésére a sejteket 16 jig/od Efosefe? J 5352-vel (Moteáar Probes) festjük, és áramlási eitotnetriávai elensezzük.
A TRA-8 ellenanyag képes apoptózis indokáiására a rosszindulatú humán gliéma sejtvonalak többségében (9/16), ís .3 proxK-atarákns sejtvonal köztd 2-ben, és a 4 DRS-pozátív hemaiopoietikus sejtvonal közöl 2ben, Kern indukált ssopiózist a Molt-4 sejtvonalban, amely majdnem: detektálahstatias szimá sejtfolssini DR5öt expresszáh. Azonban a se jtek TtSA-k-közyai.tíeSt spopióztsta való érzékenységének a szentje figyelemreméltó ásódon változott a sejtvossalak között.
A sejtek TRA-d ellenanyag által indukált apoptózisra való érzékenységének változékonysága azt s«gallja, hogy habár szükség van DR5 minimális sejtfelszisi expresszlöjára, s DRS sejílelszmi sxpressziójámsk szintje nem feltétlenül sz elsődleges meghatározója az érzékenységnek, és más faktorok is befolyásolják ezt a folyantatot. Habár az összes giióma sejt általában szlgnlükánsan magasabb szinten expresszit. felszíni DR5-őt, romi a hematopoietlküs sejtek, a glioma sejtek érzékenysége TRA-8 által indukált apoptözlsm nem növekedett arányosan a hetriaínpoietikus sejtekhez, viszonyítva, Az öt ghösna sejtvónai, a D-37MQ, D54-MG, U373-MG, CH235-MC és 132 I N I érzékenysége TRA-S állal indukált upopiézism magas, és ekvivalens az<& érzékenységével TRA.IL-közvetített apoptözisra, amint ezt a 3h, ábrtln bemsittojtsk. Rét gdotaa sejívortai, a H-4S6 és SMKL sokkal kevésbé érzékeny TRA-8 által indukált apoptózista, A H-456 sejtek esetében a DRS tblszlni expressziőjs alacsony; azonban a ÖR5 felszíni exoressziőja SMK1 sejteken hasonló az érzékenyebb sejtekéhez, azt sugallva, hogy más tseehanizraus játszhat szerepet a TRAÍL-közvatlteít apoptózisrs való érzékenység meghatározásáhun. Habár mindhárom prosztatarák sejtvossl magas szinten expresszálte a DR5-8t, a OuléS sejtek a legérzékenyebbek a TRÁ-d-lnöokáií apopiézlsm, a PÜ3 sejtek részlegesen érzékenyek, míg a LnCAP sejtek teljesen rezisztensek, amint ezt a 3 c. ábrán beürnlatlok, A hentatepoietlkus sejtek közöl azt találtuk, hogy a birkát és CEM-ő sejtek nagyon érzékenyek a TRA-8 apoptőzisrs, amint a 2a. ábrán bemutatjuk, habár nrindkét sejtvonalról szí találtuk, hogy alacsony szinten expresszálja a DR5-llt. Habár a DRS feektáfető 13397 sejteken, ezen sejtek reziszíensek a TRA-d-indiikúii apoptózista. Hssnnfoképpeju a H-9 sejtek detektálható szinten expresszáíták a DE5-ÓI, azonban reziszteusek s TRA-3 által indukált apopíózisra. Ezen eredsnények: íbltéíelezxk a DRó-kezvetitétt apnptózlsf szabályozó mcchnniztnasök létezését.
További antí-DRS ellenanyagokét álhtunk elő az 1-3. példa eljárásai alapján. Két további, TRA-Í és TRA-iö leid anti-DRo ellenanyagot vizsgálunk aTRA-S mellett az apaptezis indnkálásúra való komparatív kópesseaüá magnatarozásara, és ezáltal agosistaként való ntóködésükrc, vagy ellenkezőleg, a TRAIL-kézvetbeít apoptózis gátlására, ausagonistskénf működve, ΗηοΆη Jutkái sejteket aikaJntazutsk célsejtként a hárem ;mtiDRa ellenanyag r;RA-l, TRA-8 és TRA-lö) agonista és/vagy antagonlsta a kit vitásának atóghatározásáfa, Ásajst a 4, at-uan «emta^uk, a sejtek életképessége 9054, 7ő% és 20% sorrendben a TRA-lö, TRA-i és T'RA-8 sejtek esetében, éjszakán keresztül 2,5 pg/ml-rel tótíétiS mkubálás után, .A TKA-Ő erős apopfézisos választ indukált dézistóggo módon, súg a TRA-1 csak közepes apoptózlsos választ stsdukálí és & TtiA-lö csak. gyenge választ Indukált, A TRA-3 tehát agonista anti-DRS ellenanyagként sorolható be. A 4. ábrán a humán Jurkaí sejtek életképességét s TRAft-mdukáft apoptózis dözistóggá függvényekéi mulatjuk be, A TRA-fószignifikáns mértékben gátolta humán Jutkát sejtek apoptőzisáí az alacsony dózisa, TRAÍL-ssdukált vizsgálatban, Ezáltal a TRA-10 tehát asiagonista aml-DRS ellenanyagként sorolható be. A TRA-í-et letétbe iselyeztók az „Amerieao
Type Cuhure Coilection”-náf ETA-1741 elérési szán alatt, A TRA-ill-et hasonlóképpen letétbe helyeztük sz „American Type Cultóre Coflecthm'Vnál RTA-1742 elérési szám alatt.
Az öt gliórns sejtvemai, a D-37MÖ, Ö54-MG» U373-MG, CH235-MG és 02! Ni érzékenysége TRA-S által indukált apoptóalssa ekvivalens azok érzékenységével TRAIL-küzveíheü apoptözisra, amint ezt a 3b. ábrán bemutatjuk, jelezve, hogy a TRAlL-lndukált apoptózis ezekben a sejtekben elsődlegesen a DRS-éti kárásztól történik, Ezenkívül a glióraa sejt vonalak közül kettő, a JJsöd.J és 1.125:1-MG reziszíarss a TR.AJL-mdukáit upopfözisru, de részlegesen érzékeny a TEA-8-indukált apoptözisra, jelezve, hegy ezekben a. sejtekben mükődnek az áteareeeptorok. és hogy a TRA-3 ellenanyag alkalmazása kikerülte ezt a szabályozó otóchanizfnosí. A prosztatarák sejtuonaiakban, a TRA-8 által indokéit epontóztóm való különbőzé érzékenység ellenére, ez párhuzamos volt a sejtek TEA1L által indukált apoptózisra való érzékenységével, megüti sugallva, hogy a DR5 főszerepet játszik a TRAJL~közvetheti apoptőzfshan: a prosztatarák sejtekben. A hanun-opoisökas sejtek között azt találtuk, hogy a .kokat és CEM-ő sejtek nagyon érzékenyek mind a TRA-8-, mind a TRAlL-közttótfetl spoptózisra, A TRA-R által indukált apoptózis szintje asszehasnniitbatö a TSAIL által indukáltéval, amint a 2a,. és 3a*. ábrás bemutatjuk. Csak az egyik glldtna scjtvonal, azU87, és két bematoposetikus sejtvönak az U937 és Moit-4 mutatóit érzékenységet a TRAÍL-Indukált apoptözisra, de kevésbé érzékenyek vagy rezistóessek a ΓΑΛΕ indukált apoptözisra. Egy sejtvonal, a H9 sejtvonal ospnssszélt detektálható szinten DRS-öí, de rezfsztens a T8A-8 vagy TRAJL-indukálí apoptózísra is. Míg minimális szintű ÖR5-ex pres-sió szükséges a TRA-S által Indukált. apoptózishoz, a DR5 expressziós színje nem feltétlenül jósolja meg a sejtek érzékenységét a TRA-Rközvetített ajx;píózista; áleuraueptörok szerepet jáíszsnas a TEAlL-kSzvetltótí apoptózis modulálásában bizonyos sejtekben, de nem tűnik ágy, hogy szerepe t j átszattuk tsz eddig teszteli sejtek többségében; smüsi vártuk, a TRA-S ellenanyag kikerüli az áleatecoptorok hatásaik a DRS-réceptór funkcionális mutációi előtórdnlhnfnak transzformált sejtekben; és végezetól lutraecliuláris szabályozó tneoh.-mizmasok lőnfosak lehetnek, vagy fontosabbak, mint az álcareceptorok a sejtek TSAIL- vagy TEA-S-közvetíieti apoptézisra való érzékenységének meghatározásában.
Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a ÖRS mKNS-e széles hősben elterjedt normái szövetekben (7). A DR5 teherjeszÍnten tórtóaö expressziójának értékelésére normál szöveti homogenfzátómok panelját pGeno Technology, St Lón is, MO) ptóbáztók a TRA-8 ellenanyaggal Wcstern-bíot elemzésben. Kilenc normál humán szövet közül az agyszövet gyengén pozitív {5 a, ábra, 2, sáv). A tüRS-Sbhérje nem detektálható TRA-3 reaktivitással májban fi. sáv), -üdében (1 sáv), vesében Í4. sávjlépben 15. sáv), herében (ö, sáv), petefészekben (7. sáv), szívben (8, sáv) vagy hasnyálmirigyben {§, sáv), Ezzel ellentétben mind a tizenhárom hnmán rákos szövet pozitiven festődön l'RA-8-eai (Sb ábra), beleértve petefészek (1. sáv), födő (2. sáv), máj (3, sáv), végbe) (4. sáv), méhnyak (5, sáv), bor ÍS, sáv), here (?. sáv), pajzstsitigy (§. sáv), méh <10. sáv), gyomor (i1. sáv), gasat f 12. sáv) és hasnyálmirigy 03. sáv) rákját. Ezertkívöi normál és rákos szövetek ;« terv immtethitertökdtniája LRA-S-cal megerősítette, begy néhány lépne» található elszórt pozitív sejt kivételével nem deleklálhntó a DRS expresszióta marnál emlő. tüdő és lép szövetekben (Se, ábra), A párhuzamos rákos szövetek, köztük az emlőbe beszűrődő duktáds ksreifióma, kissejtes tüdőrák és llmföma pozitívan reagált TRA-ő-eal (5á. ábra). Az összeses 22 megvizsgált rákos szövet között ő közöl 5 emlőrák, 2 közüt 2 arőbsyafarák, S közöl 4 májrák, 8 közül 5 Hmfóma, 2 közöl 2 tüdőrák és 2 közöl 2 prosztatarák reagált pozitiven IRA-S-est, Ezen eredsnéöyek megfelelnek az áramlási csotneíriávni kapottaknak, és szí jelzik, hogy a rákos szövetek magasabb sziníaa axpresszálják a DR5-ÖS, mint a normái szövetek.
2. példa, TRA-S őagasatsReses aktivitása te vrvo
Különböző okok miatt sok szer, amely ígéretesnek mutatkozik te váró vizsgálatokba», asm hatásos te vívó. Tehát fontos tesztelni a TRA-8 hatásosságát te vivő állati modellben, Ennék megvalósítása érdekébén TRA-8 ajrtt-DRS ellenanyagot adnak be humán ÖR5 molekulát exprssszáiő humán xenogmöos hordozó egereknek. Ax alkalmazott egerek S-S hetes NQB/S-CID egerek (Jaekson Laboratory), amelyeket szabkotárr ökonk komán 132INI ásztrocitönm sejtekkel (1 x lő j, vagy intravánás&ö oltunk hantán leukémiás farkat sejtekkel (1 x. iü'j, A daganat beoltása olást 2 nappal sz egereket Intravénásán oltjuk TRA-b-cal (löb pg). Őt nappal a.TRA-8eal történő kezelés után, meghatározzuk a 1321N1 dagasatsejíek növekedéséi a daganat mérete és tömege alapján. A sarkat sejtek növekedését a láp tömegének növekedése és az oltott állatok 'épében található Ci>3-gtsziísv bumáts farkat sejtek százaléka alapján itatsrezzíik meg. A daganatos szövetekből hiopsziát veszítek, és szövettanilag megvizsgáljak azokat,
Korai, kezelés löö pg TE.A-é egyszeri intravénás dózisával egy nappal a síagsnni beoltása irtán teljesen gátolta a ;32iNl sejtek .számáré a szilárd daganat kialakítását (őa. ábra).. Résöl kezelés TRA-k három íöö pg-os dózisával egy héttel a daganat beoltása után negyedére vagy- az alá csökkentette a daganat tömegét íöb. ábra), A daganat kialakulása oeut látható a TRA-S-eal kúrán kezelt áliatök.has (eb. ábra, felső rész). A szövettani elemzés drámai módon degeosráh daganatszövetet tárt fel a TRA-R-cal kezelt állatokban (Se. ábra, alsó rész). Hasonlóképpen a TRA-b-kezelés gátolta a Jutka: sejtek lápba történő betelepedését, amim ezt a lépben megtalálható CD3-pozitlv farkat sejtek ritkaságával demonstráltuk (éá., ős. ábra).. A beültetett daganatos szövetek szövettani elemzése kevés, elszórt aagtasatsejset matatott a TRA-k-caí kezelt állatok lágy szöveteiben, míg a kontrohokbon szilárd daganatok alakoltak ki, amint ezt a éc. ábrán bemotaijuk, A hakat sejtes tnoöeílben a farkat sejtek száma a TRA-S-ca; kezeit állatok lenében kevesebb, mint 2%, összehasonlítva a majdnem i íAá-kaS a kosittoli állatok lépébeo, amint azt áramlási citomeíriával a óa. ábrást és irt rím CO3-festéssel a őr. ábrán bsnuosíjnk.
Szén eredmények megerősítik annak a nemrég! demonstrálását, bogy a kersszthöíöít rekombináns TRAIL szisztémás beadása, gáteljs daganat növekedését ín vivő { 13). Ezen eradményak azt is jelzik, bogy TRA'§ egyetlen dózisa nagyon hatásos daganttetejíek eiitninálásárts .te vivő.
Mivel anti-homán sítemyagot alkaimazíunk sx egérmadeliben, a TRA-S-kozelés tozieitását nem tudtuk megállapítani, .Azonban a TRAIL te vóm bemiásásak vizsgálata azt őmiatta, bogy nem kapcsolódik szigntítk áns tösiclíús ebhez a kézéiéshez .(13).
Sd, példa, Áz RA szmoviálís sejteknyék s TRAÍL- és TRÁ-k-sndukáit apnp tézise,a
A rKAIt-kdsv-sdtőg apöptózís legtöbb korábbi- vizsgálata rosszi.ndulató sejtekre koneesuáit A találmány szerűm TRAlL-fcSzm&ett apoptózis terápiás hatású autoimmun és gyulladásos álhpotokbas is, mint például RA-bsn,
18J Sejtfelszíni ÖRS expresszié jártak áramlási citumetríás elemzése RA sáuevjjdfe sejtekbe»
Összekssozthtjuk a ÖRS cxpresszsőját RA páciensekből szártstazö nyolc elsődleges tenyésztett színoviálls sajt panalján emsosnrttims (amit a leírásban ezentúl „ÖAMsak nevezünk) páciensekből származó nyele elsődleges tenyésztett szirsovlális sejtével, A nyele barnán elsődleges RA szisoviális sejt tenyészet a ΕΛΙΟ 14, RA-ilŐlő, RÁ-i821„ RA-S12, RÁ-7Ö7, RA-8H, SA-7S4 és RA-928, Dr, M. Obtsakl (Rsnkyo Co, Léd., Tófcyo, Japats) ajándéka, íunelysket lő% FCS-sel, penicillinnel, szírsptosnsoinsel és glotísmlnnal kiegészített DMEM Sópközegbtm tenyészttlak, A hét ÖA szíaoviális elsődleges sejtrenyészetat OA paciensek szíooviátts szövetéből izoláltok szokásos konagenázeljátóssaí, és azonos körlíímények között tenyésztjük. Az összes elsődleges .sejt pa.sszálási száma 13 alatti. A ÖR5 expresszujját RÁCS elemzéssel határozzak meg, amint azt az 5. példában leírtuk.
A RÁ sejtek össsks elsődleges tenyészete magas szinten expresszálí felszíni DR5-0L és csak kis variáció vsa az expresszibe szintek között ezekben s különböző páciensektől izolált szirsovídlrs sejtekben, ondra ezt a ?s. ábrán bemutatjuk. Ezzel ellentétbcfi a felszíni OR5 expresszlőja az Oá páciensektől izolált szmovsális sejtek felszínén nagyon alacsony vagy detektáíbasúlau, amint a 7b, ábrán bemutatjuk. Azt találtuk, hogy az S V4ö-nel transzformált szír·ovsális sejtek magas szintért cxpresszáluak DRS-St, ami összehasonlítható sz RA sejtekkel, Ezzel ellentétben a nem úansztessnált fibrefehszt sajtok alacsony .szinten sspresszúilak DES-öt, összaiísseniíthntő utódon a 7b. áitráo benmtaííitt ÖA sejtekkel.
1&2 Ra szlnoviális sejtek érzékenysége TRA-8 vagy TRAÍL által közvetített apoptózisra
Általában a KA páciensektől izolált összes sziooviális sejt érzékeny rólad a TRAS.-, mind a TRA-8indokak spoptőzism, és az összes GA sejt: rsziszSeos a TRAIL- és naínDIkS-alienanyag-kőzvetiiett apopiózism, amint ezt g 8a, és 8b. ábrás bemutatjuk, Ezen vizsgálatok azt matatják, hogy a TRA-8 ellenanyag célpontjai megváltozott sejtek, num pedig sortnál sejtek. Ezenkívül a TRAIL· által indokéit apeptőzisrs való érzékenység vagy' rezisz.tencm mintázata korrelál az antl-ORő ellenanyag. által indukált opopíózlséval, jelezve, hogy a szlnoviális sejtek elsődlegesen DRŐ-Őt alkalmaznak a TRAi L-apostözls kiváltására.
Amint a rosszindulatú sejtek esetében leírtak, a TRA1L vagy anti-DRS ellenanyag által indukál·, apept&ziara való érzékenység változó a RA színoviálls sejtek közöst, habár hasonló szisífen expresszáih&k DR5öt. A RA-512 és RA-787 a legérzékenyebb, mivel a sejteknek több mist 8Ö%*a elpusztult 20 ng/ud alatti TRA1L vagy TRA-8 konecnmáeiönál, A RA-IŐ14. RA-SIl, RA-71Ő ás RAŐ27 azok, amelyek közepesen érzékenyek ,a TRAIL-re or TRA-Ő-ra, a sejthalál megközelítőleg 188%-a s magas TRATL vagy TRA-8 koítesníráeiósrái <>50 Rg/ml) történik. A .RÁ-1818 és RAi821 sejtekben - isabár a sejtek többsége (őö:lá felett) elpusztul TRAIL vagy TRA-8 alacsony dózisától, & sejtek egy része túlél TRA1L vagy TRA-8 magas koncentrációjának jelenlétébe», jelezve, hogy a sejtek egy szubpopuláciől» rezisztens a yíVDL-közvetstetí apoptózisra, Ezzel ellentétben tsz összes OA sej·, sokkal kevésbé érzékeny a TRAíL- és TfeA-8-kéz.veístatí apoptózisra. fe'em több mlrtt a sejtek: 60%-e pusztul el az OA52F és OÁŐ9F esetében, még TRAIL vagy TRA-8 magas kmneeasrációjáSV40-nei mnszfomSR szmoviálix sejtek színién érzékenyek a TRAIL- és TRA-k-índukált apoptózisra (adatókai asm köriünk), Ezzel ellentétben a nem bteüszfóíutáll. Ebroblaszt sejtek rez&ztenmek tűntek a 'TRAÍL-re és TR.A-8-ra.
Korábban kimutatták, hogy a ÖRS egy FADD/kaszp;iz-S-feggö útvonalat basznál es apoptözls kiváltására (44). A RA sejtek OR5-közvetitett apoptézisa kaszpéx-fü^ésének meghatározására RÁ síteket tenyószSíak TRAlt-lal vagy TRA-S elieasayaggal, specifikus kasxpíbj-inbsbitorok jelenlétében. A nyolc teszteli kasKpáz-snbibitor közül a kaszpáz-ú, -8 és -ló iohibitoru képes gátolni RA srinoviális sejtek TRAlL-és TRA-8teáukált spoptózísót, amint ezt a 9. ábrán bemutatjuk, jelezve, hagy ez a három kasspáz-inhibtfor részt vesz a DR5-közvetRett apoptóztskau.
I#3 TRA-8 v»gy TRAIL NF-xb aktiválást indukál RA szisoviáhs sejtekben MMF-k nteguhvekedett felszabadulása nélkül
Kézzelfo^tató bizonyítékok vannak annak a. koncepciónak az alátámasztására, hogy közeli kapcsolat van az apoptóris jelwshbbása és a probferáeió jeltovábbítása között (45). Megállapították, hogy a X>R5 képes aktiválás az NF-xh élvonalat is az apoptéris-szignóiaanszdutóö mellett, és axNF-xWfctiválósképes lehet ausapoptézís jel. traaszóakálására,· Tehát „gól-shtft” vizsgálati eljárást hajtunk végre. Sejteket stimulálunk. 50 ng/mt tékombhíáns oldható TRÁlE-iel, Fss-ligapdmsíu&l 1 xng/ml esthancer jelenlétében vagy SÖ ttg/ssl TRA-R-eal a jelzett Ideig.. Sejtmg-exbaktemokat készítünk, és ínkubálunk kétszeresen testeit f?Pj-vei jelölt eisgo-GNS próbával. Az eredményeket tyrfone pfcospAo-fcmger készülékkel elemezzük <ífep€b;m? NAT, Facsard íustrumeut 'Cotnpsny, CT). Mintán a Rá sriftoviáhs sejteket TNP-sr-vai vágj' TRAIL-lei inkuháljuk, az NF-xb sdőStggö módon aktiválódik, A TRA-8 ellenanyag képes erősen aktiválni az NF-xb-t Ezzel eltentótben a Fas-ltgandum képtelen NF-xb aktiválás mdukálására, amint ezt a 10». ábrán bemutatok, 'Tehát habár a TRA1.L és TRA-8 cllenanytsg erős apoptórisos választ indukál RA szinovi'ális sejtekben, azok aktiválják az NF-Kb-t is, és ügy vélik, hogy az Nf-xb aktiválás hozzájárul a TNF-α promfiasumaferikns .szerepéhez·: sz RA-ban. Ezáltal lehetséges, hogy s TRAÍL, csakúgy, mint a TNF-α, proimfiananatorEm's «hokinként. szolgálhat. Annak rucghatározásáru, hogy hasonló hioibgisj következménye van-e az NF-ah aktiváiásának TRAÍL és TNF-o álfái, meghatározzak sz MMP-k termelését EtiSA-val. Erinoviólis sejteket tenyésztitek tápközegben egyedül, vagy 58 nghni latettenkln-lp·» 10 ngönl TNF-a, 50 nghnl TRAÍL vagy 50 ng/nsí TRA-8 jelenlétében éjszakán keresztül:. Meghatározzuk az MMF-1 és MMF-3 szintjét a tenyészetek folüiüszójábau az BUSA teagenskósziettel.
Amikor a RA szmoviáEs sejteket promtlammatorikns citokln, TNF-α vagy Π..-1β jelenlétében irikaháijuk, az .MMP-Í, -3 és -13 termelése ső a tápközeg-konhroíihoz -hasonlítva, amint czi & 10b. és 18c. ábrán bemutatjuk. Ezzel ellentétben a TRAÍL- vagy arsö-DRd-sltenunyug-kezcíé:; nem kapcsolódik ezen MMP-k megaövekedeti felszabadulásához.
U.A példa, Hepatoeelinlárts tostekás hiánya órás st^téleikópességi vizsgálatokhoz bó-suéróhalyaa mikretiterlemezben lévé friss normál hantán hepoiocitákat vásároknak az 1» Vítro Technology cégtől (Balílmore, MD). A hepuíocstákat 1 ggőul oldható TEÁIM vagy TRA-S-at tartalmazó F/éptemyte Cídfore Medbteí-ben tenyésztjük; A ó órás sciíálctképcsségi vizsgálatokhoz svamtól hepatocilókri. vagy lajpatocei-lulórís ráksejteket izolálunk friss műtéti mintákból, amelyeket „UAB Tissae Precusémest Center’-ben gyűjtöttek. A komán hepatoeiták izolálásához alkalmazott összes reagenst, beleértve a bepafociía perfúziós púdért, emésztést oldatot, mosóoldatot és tapadási oldatot a Glbco cégtől vásároltak, A szöveti lemezeket hepatecita emésztési, oldatban emésztjük 3?”C«on rázatás mellest <5Ö rpjB) I órán keresztül. Az, izolált beptnockáknf alacsony sebességű eenirifegáfessal gyűjtjük be (Sű g, 3 perc), és teíszoí mossuk hepatoeíte mosőoldaíbsu, Hepatoeiták egyssjtes ssuszponzioiát tenyészt jük 10% FCS-t tartalmazó hepameha tapadási oldatban üő-rsőrőbelyas Mofrige/ ntikröilteriemezekbon (BD) hot órán keresztül, A Msni tapadt hepziocttákas ehávolőottek elömeiegbett tapadási oldattal történő kétszeri mosással. A letapadt hepsioeiíükat tovább mknbáljuk kőlönbőzö koncentrációjú oldható TRAlt-fel vagy·· Fas-ligasdummai tees^kötő jelenlétében, vagy TRA-k-eal vagy CH 1 i.-gyel, b érán keresztül,
A TR.Aft~ne?k legalább két olya» receptora van ('OR4 és DRS), amely képes apoptőzist indukálni, TRA-S-aí alkalmazunk annak meglsstározására, hogy a DK5 keresztkötése üamagábsn elegendő-e ne-mtál hepstoeitűk apoptőzisának incfokálásám. Megvizsgáljuk ti Ö&5 expressziét fehérjeszisten, kezdetben öt normál humán májszövutben ás Sí máj rákos szövetben te,ráüt iínmunhlszfekéíulávai TRA4 alkalmazásával,. A normál májszövetek metszetei nstrmális szerkezetet és sejttnorfblógiát mutattak H&S festéssel t i la. ábra, bal felső részek), ÖRS iránti pozitív TRA-k reaktivitás nélkül (1 la. ábra, bal alsó részek). Ezzel ellentétben a barnán hepatoeoiluláris karemőma szövetek pozitiven reagáltak TRA-R-cal, konzisztens mintázattal a DR5 sejtthembránbeli és eiioplazmabkus jeleaiétével a rákos sejtekben, A humán iiepG?. itepatoeeiíuláds karetnöma sejtvonai szintén pozitív r>R5-te. Ezen eredmények konzisztensek az öt normál májszíiveí esetében, és öt méjrákos szövet közül csak egy (máj adettéma) DRS-uegaíiv. Ezen eredmények konxís:ztensek az 5a. ábrán bemutatott áVestem-bioí adatokkal, miszerint mint más normái szövetek, a romnál humán májszővet sérti exptesszál szignifikáns szinten f>R3-fehérjét. Ezenkívül izolált normál tatán hepateelták TRA-H-cal próbázott Western-hlotja nem mutat detektálható szinten DRS-ét.
DRS humán heaptoeltákoo vajé sejtfelszíni expresszíójáaak áramlási citometriás elemzése kimtstarts, begy frissen preparált nomtál hepatoeiíák sem expresszáltak detektálható szintes sejtfelszíni DRS-ét (1 Ib. ábra, bel felső részek), Nem. detektáljuk olyan normái humán heptitoettákon sem, amelyeket fegyussztoít állapotban tártíkunk vagy rövid időn keresztül ienyősztetttlnk. Ezzel ellentétben frissen izolált hepatóeeihijáris karcíooma sejtek valstüint HepGS sejtek expresszálnak sejtfelszíni DR5-St< Fas-f alkalmazva összehnsottlííásra, a normál hepatoeiták, hepatoceilalárss karcbmsna sejtek és HepG2 sejtek mindegyike ekvivalens szmten sxpresszált Eas-t (1 ib. ábra, alsó részek). Ezen eredmények konzisztensek azokkal, amelyeke: ör s.áte ímnnmfeisztekémiával és Wesiero-blottaí kaptunk, ás azt jelzik, hogy a sejtfeiszísl DR5 magas szinten expresszálédík rákos májsejtekben, de normális bszpatocítákon nem,. A DR4, DR5, DeRI és DcR2 mRNS-ének jelenléte humán hepaíocitákbsn E'F-RCR-rei kimutatva (23) az: sugallja, hogy a humán bopatooiták nagyon alacsony szmten exprosssálbaínsk DRS fehérjét, amely a TRA-8 általi detekció kimutatási határa alatt van.
Annak nteghatározására, hegy a TRA-S indukál-e hepatocelisláris toxmstást, megvizsgáljuk normái hsmsm hepatoeiíák érzékenységét TSA-S' által és oldható 7RA.1E és keresztkóíő által Indukált apoptezisra. Antikor aormál hepatoeitákot tenyésztőnk 'TRA1L magas koncentrációjának jelenlétében, időfüggő csökkenést figyelünk meg a sejtek életképességében díEböe vizsgálati eljárással (12a. ábra) és íflT vizsgálati eljárással. A normál hepateelták 'fRAIL-közvetíteü sejthalálát akár mát 4 érával &TRÁ1L hozzáadása után is láthatlak. A 24 őrs» tenyésztés végére a hen&tix-iták több mint SIEk-a, elpusztul a TRA1I.· hatására. Ezzel ellentétben ugyanolyan tenyésztési időszak alatt a TRA-li sem indukált szi.gmSkáos sejthalált normái hepstooifákbsn. A //oeoöír-festekkei festeti kondenzált sejtmagok száma, ami az apoptözis jellegzetessége, növekszik a TEAlL-lel kezelt hepafechákhan, de nem. növekszik a TRA-d-ctd közei: hepaíocitákbafs ί I2b, ábrtt). Az apöplozisos hepstöeliák száma jól korrelált az vizsgálati eljárással meghatározott csökkent seltéletképességgei, azt sugallva.
hogy a hepatoetíá.R TiLáiL-indukátt sriíbalálát apcptózis közvetíti, Ezt megerősíti a 'Z-VAD képessege hepafocltak TíSÁÍL-közvsS&stt toxieíínsanak gátlására. Mxvsi a cikiobexltnld egy hatásos apítpiózásös snhaocer, megvjzsgáijnk ezen vegyidet kRAlL-iel és TRA-k->ral kezest Isepatociíákra gyakorolt hatását, Négyórás tenyésztés alatt a elkiottextínid szignifikáosas fokozta a itepaiociták TRAÍL által indukált sejthalálát, a hepatocitakaak több jomt TOáv-a eipuszteli a eskloheximid jelenlétében (J2c. ábra). Azokban a ciklohexim.id-kezelés képtelen a TR.Á-á-köz.vsfiíett sejthalál fokozására hepatoeitákbarx, Azárt, hogy össze hasottliístsk hepatítejtákban az 1RA-S által mdúkáit apoptózts Jedegzerességeii a TRAÍL által indukáliéval, aearaál hepatoefíák&í, valamint rákos sejteket tttkíiháittnk oldható 1RA1L. és keresztkötö vagy TRA-R különböző koncentrációival. Hatórás tenyésztési idOszak alatt a TRAÍL közepes apoptózisos választ indukált normál kepaiocitákeam A hepatooiták több mint 20%-a elpusztult 566 ng/mi TRAÍL jelenlétében (120, ábra, dal felsó rész). Romtál hepatoeisák TRAk-fexeisse nem váltott ki szígtnitkátts sejthalált ugyanezen időszak alatt, A normái hepatuchókkal ellentétben, elsődleges hepatoeelluiáris kareinőraa sejtek (I2d. ábra, iélsö középső rész) ás HepG2 sejtek (124, ábra, jobb felső rész) nagyon érzékenyek akár TRAÍL, akár TRA-S által indukált spoptdzisra. A hspatoceiiuiáris kareinőma sejtek több mint §S%-a és a Hepö2 sejtek majdnem iööfo-a elpusztnlt a S ötös tenyésztési időszak alatt. Ezen eredmények azt jelzik, hogy & norrttái hepatochák teljesen rezísztensek a TRA-b'-közvshiest spoptózisra, és sokkal kevésbé érzékenyek a TRAiL-közveiitött apoptezism, mint a tnájrákos sejtek. Fas-ligaaáum és amiFás ellenanyag alkalmazásával (CK-ii) nincs szignifikáns különbség a Pas-közvctített apegfősisra való érzékenységben a ttomnál hepatoctiák, bepaloeeSlulárb kareinőma sejtek és HepG2 .sejtek között (I2á. ábra,, alsó részek),
Összelrastmilfé 1 LRpélda, Hepatitisz ístdakáiása ra vfoe hajítást saaraöráRRötöft TRAÍL által
8-10 hetes nőstény M egereket intravénásán «ltunk ΗΓ p& Ad'hTRAlk vektorral és azonos szántó Aá/Td-on vekmmsl. Az egereket kftlöttbőzO koncentrációjú, az Ivovizokbe tett. tetrsciklksnel etetjük közvetlenül az udenovhus vektor oltása után, A májkázosedásf ÁST szémmszintjének meghatározásával határozzuk meg, AST dinganszílkai reagenskéazleí (Sigms) alkaítnazásávni, A TRAÍL exprcsszlöjái Nortem-blöt elemzéssel határozzuk. meg.
Annak megherározására, hogy a TRAÍL rnembrásköteif formája indukál-e májirarnsodási te vtvo, teljes hosszúságú humán TRAít-í kódoló rekombináns adenovlro;; vektort (AfohlRAlL) állítunk elő, amelynek az expressziója a tedaelklinnel indukálható pronteter szabályozása alatt. áll. 24 érával Só egerek AdfoTEAlL-lel történő intravénás oltása oiáts, megfigyeljük a botsán TRAIL dózisfoggó tnódoa történő, tefracikknAodokálí expressziéját a stájban, amist azt Northem-blöt elemzéssel kmumatjnk 03 a. ábra), A TRAÍL expresszié» szintje jól korrelált a májkárosodással, amint azt RlmtnaijuR & franszsminázok szérumszmtjétrak tetradkiln-íiiggö növekedése útján, ismét dözísföggO módos 03b. ábra), Mivel az adenoviras vektor beoltása dsmsgábsrt növelheti a hepstoeiíák TRAlL-közvctheit apoptözisra való érzékenységét, az AdíTRÁlL-lei oltott egerekből bepafodtákaf izolálunk, és teszteljük azokat TRAÍL-közvethstf sejthalálra. Nincs szlgsiíikáss módos megnövekedőit sejthalál AdlTRAiL-lel fertőzőit hepntocitákban ösrízeltasonlitva kontroli «perekkel ti 3c, ábra, baloldalt rész). Ezenkívül az AdlTRÁit-lel öltött egerek nem mutattak tnegnövekedett májkárosodást oldható komán TRAÍL intravénás beoltás után. Ebből :sz következik,, hogy az Ad/TRAlt által indokait hepatitiszt a membránkötött formában lévé TRAÍL magas szintű expresszlom közvetíti. Májmetszetok szövettani elemzése feltárta, hogy a hepatöciták károsodása látható már 24 ótávtsi a vektor beoltás után {134. ábra), és legalább 7 nanoa keresztül féímmarsdi 03e, ábra). Ezen patológiás változások a málhán szistén tetraetklis-tüggöok, és dőzlsínggó saédes sörtéttíek. A TRAlL-indukáií tnájkárosodás korai fázisai, % kezeséi követően 24 órán. beiül, nekrözisos gócok jellemzik. luílummaíitrikus sejtek feeszörőáését'séta Sgyeíjük meg. ebben a ssádiumbsn, de vérzés elölő?·· óulr. Az oltás utáni hetedik napra diffúz májkárosodás látható kifejezeti lebenyt eivóltozáso.kks.l, hep<U:oesiak. súlyos degenerációjával (szabúlytalssuí összecsapod»;:; eáoplzzmz) és nagy üres teí-üíeteRkel, és eromimms apoptózíssal és riskrózissas. Ezen fázis jellemző tülajdonsága a mtssouukleáris sejtek nagymértékű beszüródése. Ezen ísodméstyelí azt tnutatják, itogy a hutnáo TRA1L a. m.embrá.nkötött fermálábaa képes májkárosodást ludasától év vizű. zá humán TBA1E azon. hajlama ellenére, hogy súlyos Hepatitisz!: okoz egérben, sem okozott letáiís választ. Ezzel elletitétHes a Hasonló tetmeikiin-szabáSyozoít, Eas-ögandumot kódoló vektorokkal oltott egerekben heveny hepatitisz ajakul!: ki erőteljes epoptózissal és heputoclták neurózisával, amit súlyos vérzés és mortalitás kisárt a tetraeiklm dózisától függő utódon 72 órával az oltás után. A mortalitást arány 48 árán belől elérte a 10ö%-ot a 3 mádul vagy több tetmeikhm kopott alcsoportokban, Ezzel ellentétben az összes egér, amelynek ÁtWT&AlM adtunk - függetlenül a teimciRlHr dózisától - még Ottódig eietbeu vök négy héttel az oltás sután. Ebitói tehát az következik, Hogy át -Wc a TRAtL metrthráskSíött formája kevésbé hatásos indekálőszere a hepaíocelln.láris károsodásnak, mint a Eas-ligatidítm. Azt is sugallja, hogy' a TRAIE olyan, merhamztm-sos kérésztől indukálhat májkás'osodSst, amely különbözik a Fas-ligamimu taáoitásái okozó meehonizmustök
Π, példa. Az aktivált hőmén T-és δ-sejtdk megnővekeáett szintes espresszólnak l>R5-öf Ásnák meghatározására. hogy a DR5 szerepet játszik-e az aktivált T-és 8-sejtsk TSAIL-közv'strter?
spopiózlséban, megvizsgáljuk nyugalomban lévő és aktívák T- és B-sejtek felszító DEó-expressztéját. A BBh-ÍC-bao lévő síiísuiáladaft Humán T-seíSsk nem exprssszálnak szignifikáns szinten f>R5~öt {14. ábra). 4S órával an«-C.D3 vagy Con-.A sionüinctó után a sejtfelszini OSó-expresszid szignifikánsan növekszik, Hasonlóképpen, a stimulálatian E-sejtek nagyot· aktesony szinten expresszáltak öR5-öt. A stimoiáetó anti-g-vei LES nélkül DR5 tnegnüvekeáaít sejdéiszíni erpresszioiát eredményezte. Ezen eredmények azt jelzik, hogy mmd tsz. aktivált T-sejtek, mind az aktivált B-sejtek magasabb sziutets espsesseáluak sejtfelszíni T?RS-öt, A sejteket 2Ő tig.óoi TRA-S-eaf és EE-atsö-egér-lgG i-gyol felettük.
13, példa. Az aktivált T- és B-sejték érzékennyé válnak TRA-k-közvetítetf spoptóassr»
Anaak meghatározására, hogy Az aktíváit T- és B-scjíek érzékenyek-e 1 ΚΑ-8-közveíitefí apopiózlsta, termán EBMC-eredeSű T-sfeíekei: és 8-mjteket: stfmutámnk sotrendhen arsn-CElé vagy anii-p ellenanyaggal 48 órán. keresztül .<« »//«.>, Az életképes sejteket és prolsteráió bEasz&ejtekef gradiens eesbifhgáiásssl összegyűjtjük, és inkubátjuk TRA-8 különböző kotmimirációival. A nem stimulált T-sejtek és B-sejíek nem érzékenyek a TRA-S-közvetített apoptozism (15. ábra), Az összes stimuláií Γ-sejt és B-sejt közepesen megnövskeáett érzékenységet mutatott TRA-S-közvetíted apoptózisra. és a sejtek 2ö%-a elpusztult a TRA^S-iói éjszakáit kérésziül történd tenyésztés után,. Az erőset? proltféráló bfezísejiek még érzékenyebbek a TRA-S-közvetfiett apopíőzisrtz A blaszt T-sejtek több mint 7ö%-a elpusztítható a TRA-S-eal. A fessszt B-sejtek szintée étzekenyeobek a TRAS-közvetííett apootózism a többiekkel összehasouiltva. Ezen eredmények: azt jelzik, hogy az aktivált T-és: Esejtek érzékeny a DRó-közvetstett apoptózism,
14> példa, A TRA-8 kltneriií az aktivált T-soj leket busuás/SOB egerekébe»
A TRA-Ü őt vó-ű aoti-T-sejí hatékonyságának meghatározása érdekében NOD/SCID egereket oltunk tstósvénásas 1 x jö* humán PBMC-vel. hlonnálisan a hűmért T-sejtek a SCJD egerekben gyorsan aktiválódnak xetmgen síenoláfás hatására. A Humán PBMOSQD egereket iturapetíSnneáhsaís étijük 100 pg TRA-k-oal vagy kontroll Igö-vei azát visel napjától kezdve, naponta ismételve három napon keresztül. Ot tsappal az átvitel ídán
Izoláljak a rosnomádeáris -sejteket s légből, és festjük agakat sstt-htitttátt-CDS ellenanyaggal, és a hmieöitspopoláelöí kenuzzak áramlása eltometriás elemzésben, és elemezzük a CD3-pozitfv humán T-ssgtetó. őlegközeHíŐlsg a lép-hínfedták 3ö%-a humán T-sejt, anti-humán-CD3 festéssel meghatározva kontroll egerekbe®. Azonban csak néhány humán T-sejt (hevesebb, mint 3%) Egyelhető meg a iép-limfooíták között TRA-S-cai kezelt egerekben (lé, ábra). Aj sífe szövettani vizsgálat kimutatta, begy a kontroll egerek topébe®. a komán Tsejtek újra betelepedtek a lépbe, és csak néhány apoptőzásos sejt fisyolhotb .meg TŰNÉL festéssel kim-ntstv®. Ezzel ellentétben az életképes hamsa 1-ssjtek üjrafeeleiepedése oem ttgyelhetö meg a TRA-8-eal kezek egerek légébe, inkább sok aptsptőzisös sejt ügyelhető meg (Ί?. ábre). Ezen «redtnéayek «2» mutatják, kegy a TRA-Snak anti-T-sejí aktivitása van fe vó-o, és jelzik a találmány szerinti ellenanyagok hasznosságát GVE-betegseg kezelésében.
lő, példa, TfeA-S rákellenes terápiás ssktsvitssa
ISA ÖRS expresszié és fánkéi·:) hmnán rákos szövetekben és sejfvöaalakbaa ft ÖRS expresszié barnán rákos szövetekfreo TRA-8-at alkalmasé to sím festéssel.
Annak megltatésOzésám, hogy rákos sejtek ésszövetek differenciáiig}» DRS magasabb szintjét expresszálják-e, humán rákos szövetek panelját, benne több mint 20 emlőrákok & pefafeszekrákot. 5 vastagbélrákot és 5 prosztatarákot festünk TRA-8-oal iínmmfatszíökémks céljára, Ezen rákos szövetek többsége detektálható mennyiségű DRS-őt expresszálí. A ÖRS expmsszlős szintje- ezekben a rákos: szövetekbe» külSrsbÖzötí. Áltáléban a rákos szövetek magasabb szinten expresszáltak DRS-őt, mint a nem rákos szzöveísk, Ezenfelül a DKSexpresszié látszólag nem kosrelál s p:33 mutációjával.
ü) DRS expresszié ás fankelé kassán rákos sejtvonaiokban (2, táblázni).
Kilenc barnán emlőráhos sejtvonsist három petűfeszskrákos vonalat, három vastagbélrákos vonalat ás károm prosztatámkor vonalat vizsgálónk DRS sejtfelszíni expressztöjára és érzékenységére TRA-é-közvgEtett apoptózism óv vifeo, A 9 atniőráh közéi 7, a 3 petefészekrák kézül 3, éa 3 vastaubélrák közül 3 és 3 prosztatarák közül 3 exgrexszált változó színien sejtfelszíni DRS-öt A 9 emlőrákon vonal közül 3 nagyon érzékeny. három közepesen érzékeny és 3 rezssztms TRA-h-kÖzvetststt apopiozisra. Mindhárom psteíészeklmko» vonal nagyon érzékeny. A három vastagbéirákes vonal közül egy nagyon érzékeny, míg kettő közepesen érzékeny. A három p-osztaísmkos vonal közül kettő közepesen érzékeny és egy rezlszteas.
2. Táblázat. ÖRS espress-ziója és fnnkeiójss humán rákos sejtekben.
Sejtvomd Eredet Expresszié1 Érzékenység-5
2LMR emlő 4 ao-t-s
LCCb emlő 4-K-4
| MB4ÓS emlő 444 *·*
j MS23I em-ö 4-4 4-4
1 ZR-75-1 emlő 444 44
1 SKBK3 í emlő :
M8453 emlő 4
ST4T4 emlő -
DY36T2 emlő -- -
C&ov-j petefészek 4· <-4-4-4
öVCAR-3 pete leszek. m-
Skov-3 petefészek í +-4--··
%ife& vastagbél 4-4- ' λ·.·;- 4--L
HST29 vastagbél +·-í- í ··í->>
T84 vastagbél 4- ΐ -?-4-
RC3 prosztata -V-H- t -H*
LnCap prosztata Τ' í + j
fen-145 prosztata Ot-i- ! 2
--------,-ί-ί-!-Megjegyzések; ' áramlási citontetriával meghatározva, a sejteket 20 pv/ml TRA-s-cal festjük és kontrol? ellenanyaghoz hasonlítjuk. 2 -dTPLáte vizsgálati eljárással meghatározva.
; §g% fofep! sejrpntÍZíulás, -/;-!; 60-86% közötti seiípnsztulás, 40-06% közötti seltpusztülás, j·: 20-40% közöiti seitptetzíulóx, - nincs sejspusztulás.
Rt) TRA-8 kombinált citetosácitása «árSssaidwet Számos emlörsfcös vonalban megvizsgáljuk sz aáriatmesn hatását TRA-S-indukélt apoptőzism. Adrísmfom magas dózisa additív hatást matatott. Azonban bizonyos TRÁ-forezisztens vonalakban adri&mkin alacsony dózisa szmergetíkusan SAozza a TRA-Ő-Indüháit apoptözlst.
tv) TRA-8 ót vfíro ás á» v/zn kötött ki Móása hussás rákos sejtekhez,
Rsdkuzotóppai jelölt TRA-8-st aiksimsznok, Megvizsgáljuk a TRA-S kötoaktivitását emlörákos sejívoaslakhüz ót eimo és m v/w ő€ÍD egerekben, amelybe daganatot ültettünk be, Áz I» vfo-o köíősktivhás K.dérfekéi rákos sejtekhez 3 aM-fa becsültük, ami megfelel a korábbi, CUSA-vai becsült értőksek, és legalább 56szer inasasabb, mint az oldható TRAiL-ó. /» vivő a TRA-8· a beültetett dágarsatszövcfeen helyezkedett el,
15,2, Krótukns Rmfolltlküs leukőmRs terápiája NOBiSCIÖ egerekben TR.A-8-snl
Krónikus iknfeiitikns letötenua (CLL) a B-s^jtes rosszándnlatű elváltozások gyakori formája. A CLLfeen a fegtöbh romzindulatü B-sejt éred fenotipnsó, és rezisztens számos apoptözisos ingerre. Megvizsgáljuk a DR5 espresszlöját és fünkolóját öt CLL-es páelessbss. Az összes páciensnek magas volt s periferlűs 'B-sejtszáma, amint azt a több sünt 03% CDI 94- 8-sejt őmiatta a PBMC-bes. A normál elsődleges S-sejtskhez hasonlítva az összes sáelssshets a CLL 8-sejieksek magasabb volt a sejtfelszíni CRS-szmtie, és érzékenyebbek vidrák a TRA-8-íJsbíkáit apoptőzism ín νότο, Érdekes, hogy s CLL B-sejtek érzékenyek a blszindoltna.teimíd-VíB {BilsVHf) által indukált citetesűeüásrs is, TRA-8 és BísVÜ? együttes kezelését követőért a CLL δ-sejtek közei 30%-a elpusztul, tnig a nortnái B-sejtek érzéketlenek maradnak (18. ábra},. CLL B-sejtek átvitele NOD/hClD egerekbe azt eredményezte, hogy körülbelül 25-36% CEHfot- g-ssjt újra betelepült a befognád agarak lépőbe öt nappal az átvitel mán. Azonban 1 88 gg TKA-8 háront dózisával történő kezelés teljesen almnoáita a CLL Bsejteket öt közül négy páciens esetén a befogadó SC1D egerek. lépében. Ezáltal a. TRA-8 önmagában vagy más anyagokkal együít terápiás szerként hat htóoíkns lintfehbkus leskén-tiában.
18, pékfe, efeNB klónozás (J) A T8A-8 nehéz és könnyű tánc N-terahtáhs sori sósav-szekvencíájánali, meghatározása
Annak érdekében, hogy előállítsuk a TRA-S nehéz és könnyű lánc cfeNS-őt, meghatározzuk a TRA-8 és kidsozoh TRA-8-gének sebez és könnyű láne M-ter;n;náí;s sminosav-szekvencíálát ismert módszerek alkalmazásával.
-41lő ag TRA-8 an;i-hsmán-öR5 ellsnsnvagöt tartalmazó olslatot SÖS-pollákAfemiii-géleiktroforézissci yszsgálimx C'Sfbs-PAGE'’), i2% w/y géikoucenítáció és ióQ V állandó feszültség mellett, 120 percen kérésziül. Az elekboförézis «íás a gélt «-anszfét-putfetbc áztatjuk (25 asM Tris-HCi (pH 9,5), 29% metanol, 8,82% v/v S.1>S| 5 percen kcrsszdSl.. Ezen 145 lesiette után a gél fehétjcnsríaltnát előzetesen tz;mszafer-puffet'be áztatott, polivínilidén-dífluorld mambráftfa ('''PVöFszeembráa'’; 8,45 mn-os pórasméxet; Mlilipore, Japan) visszük áí, bloítoló készülék alkehnszásával (KS4451; kiszyso;) 10 V állastdé feszültség mellett 4*€-on 14 órán kérésztől,
Ezen kié letelte után a FVÖF-metrshrtót mossuk ínosöpuffertel {2S ®M HaCk 18 «Μ riátrlum-borát (pH 8,9)}, majd fe.stó oldatba» festjük (58% v/v metanol, 20% v/v «cetsav és 8,85% wfv Cncwasafe /?záf/íu«? é'fee) 5 percen keresztül a fehérjecslkok hetyések. meghatározására. Azután a PVDF-rsembránt ísstáktelenitjttk 98% vizes menmnllal, és a PVDF-memsráson korábban meghatározón: helyű nehéz láncnak, alacsonyabb mobilitásé kbsrsyf; láncnak és a magasabb mobllitásá könnyé láncnak megfelelő csíkokat kivágjuk, és ioncserélt vízzel mossak.
A nehéz éo könnyű lánc N-termínális arisfecsav-szckvcnciáját az Fdman-fefe automatizált módszerrel határozzuk meg (Edman, F. és mtsai., Eor. 1 Bseefeetn. 1, 80. old, f iké?)], gázíázásé tehérjeszekvenáló készülék alkalmazásával (FFSQ-iO; Sbhnadzu Seisakusyo, K. K.).
A nehéz láncnak megfelelő esik N-tersnlnáils ammosav-szekvcnciálá· az alábbinak határtsatuk meg:
Glu-yal-Mst-i,««-Val-öhS'Ser-C'ly-Gl.y-<31y-i,s«-Vai-Í,yS'krö-táiy-G;y-Ser-Leu-.Lys*í,ön (4, azonosítószámú szekvencia); és a könnyű iáaesak megfelelő N-terjninálls aminosav-szskvenciáját az alábbinak határoztuk meg.
Asp-lie-V3i-Meí-ThrCdR-Sí;r-H.ís-l..ys-Phe-hfes-Ser-Ihr-bar-Vai-Giy->ksp-Arg-Vái-Ser (5. azonosítószámú szekvencia).
Ezen aminosav-szekveneiák összehasonlítása sz. ellenanyagok aminosav-szekvencláit tadnimazó adatbázissal (Kábát B.A., és mtsai, Seqnences of Erőseim of ímmunokígíeal Interest Vei, H” kiad..: V, S. Department of Health and Humán Services (lüüljj feltárta, hogy a TRA-8 nehéz lánca (y l láne) és s kbnnytí lánca (n lánc) sorrendben a 34 és 1 altípusba tartozik.
(2) etflRS kíéssozás
A fenti eredmények alapján oligonnkleotid-láncmtihókat szlmatizálnnk, amelyektől az várható, hogy hlbridlzáinán&k ezen egér altípusokba tartozó gének 5* nem traoszlálódo régléinak részleteivel és a 3' irnnszlálodö régiók legvégévé;. Aztdása a TRA-8 nehéz és könnyé láncát kódoló· eöHS-skct klónozzuk rcverztranszkripció és FCR (RT-PCR) kombinációjává;;
a) Terápiát
A TRA-8 bibridéma (ATCC elérési szám: FTA-1428> ossz-RNS-ét extraháljuk TR'&o/ reagens (CISCO SRt) alkainsazésával. A FCR-reakclé femplárjsként alkaknazoS cDNS-4 Fmsí-ótrnnd cÖAA rynfeesA reagenskészlet (AmctSkasa Pharmacia Rietcch) alkalmazásával állítjuk elé, a reagensksszfetbez mellékelt kézikönyv «táskásai szerint..
b) FCR lánc Imi iték
Az alábbi oligÍmnkleoíiü-láncindhóksf szintetizáljuk meg a PCR-nez: é'-csgcaetgsa cacggaccee-3: (H5NCS1; é, azonosítószámú szekvencia); s'-naaggíaatS íaítgaguaz-j' (H5MCS2: ?, azonosítószámú szekvencia); á’-cotcaocsíg asettcggseC' (H5SS1: 8. azonosítás zárná szekvencia);
5’-mgííg-aíg csesígape-3'{HSSS2: 9. azonosítószámú szekvencia);
S'-gsagtgetgc tggiggagic-^ (H5CS i: ifi, azunösüőszómú szekvencia):
5’-3gígtga3gt.gaigetggtg’3' (H5CS2: 11. azttnosítószánsó szekvencia);
S’-tttaswagga gagtgggsgs g-3’(H3CK; 32, azwoslíészámü szekvencia);
S-tgcagagsea gtgaecagag-S' (R3VR: i 3, azonosítószámú szekvencia); é’-tgíresggac ezgcaigggcQ' (LSNCSk U, azöUösltéssá«3ú szekvencia);
S'-ssagaeatitíggaítclaactó' (L5NCS2: IS. aztmosltószsmüszekvencia);
S-tarcatgaag tctögtatg-S’fLSSSf: 16. azoncsítószámú szekvencia);
S’-gutggagaca caSetcagg-3’ (LSSS2.; 17. azonos hószúsnő szekvencia);
S'-gacaítgtgatgacecogtc-S' (L5CS: 18 azonasúőszámő szekvencia);
5-tta&caetca ttcctgbga-.T HJCk.: 19. az;mosMszám.ú szekvencia); és 5-gaclgggtea teaeaaiatc-3: (1,CSR; 20. az.o«ositószáínúszekvencia).
Hacsak másképpen sem adjuk meg, a példákban -szereplő összes ciigonukiaondeí a Pharmacia Blotsch céggel sziníedzálíatjok meg. Az összes oiigösukleobdot GO^C-ot/ tároljak, «nótán feloldottuk desztillált vízben.
e) FCB-reakelö
A EGR-reakckteiegy összetétele az alábbi; tetuplái eDHS, 5 μΐ a teljes 33 μΐ reakcióból
1. lánetndttó, lő pmel;
2, láncindító, lOpmul;
i-ÖX kösesötrálí PCR.-puffer (a rsagenskészlet része), ÍÖ pl; dNTP-k {mindegyik 2,5 mM), 4 tó; és Ttuppolhrteráz (Frtímega), 5 egység.
Sieti! desztillált vizet adtunk sz oldathoz összesei· löö gf-re, Hacsak inasképpen nern adjuk meg, a oNTP-k dATP, dCTF, őGTF és 4TTP ekvánoláris keveréke («Jtndegyik 2,5 mM).
A FCR-reakciór az alábbiak szerint végezzük. Az oldatot először 94*C-ra mtóegltjük 2 percre, ami «tán 94eC~en 38 másodperc, 52^C-cs 1 perc és 72°C-on 3 perc ciklust 40-szcr Ismételünk. Sztm eljárás befejezése után a reakciós elegyet 72''C-ra melegítsük 10 percre.
zkz így előállított smpbílkáh: LóRS-íragmenseke· 1% agarózgélen választjuk el, amely δ-,25 ug/tn! etidinriv-broroidot tartalmaz. Azokat a esfsokst, amelyekről megjoitároztuk, hogy a kívánt iíRS-fragtnensekei tarUdusazzák, kivágjuk borotvapengével, és a ÖKS-í visszanyerjük a öewe Cfea» reageuskészleíttó (B1GI0I), Á DNS-fcagsneast a/AíBátóFAösv vektor (Erouisga) alkalmazásával klónozzuk meg. Ezt. az alábbi, módon végez.zük.
A PCR reakció oldatából visszanyert DNS-íragmenst .30 ng pt'j'EAÍ-J' Aíoy vektorral együtt (amely a reagenssé szid része) összekeverjük 1 μί iös iigéz íeskcíőptsírerrei (b tnM Tds-HCI (pH 7,5), δ mM magnesi usn-kierid, 5 snM nátrlum-klorid, 7 mM S-iserkaptoetanol, 0,1 tnM ATP, 2 mM DTT, 1 r«M spermidin és 0,1 itígísrl szarvosn/srha-szérut/rslbumtsj, amelyhez 4 egység T4 ÖMS-ligázs (1 ni) adtunk. Az elegy őssztérfogatá? 1Ö μΙ-re állítsuk bs steril ioncserélt vízzel, és a kapott kgáz.-aldatót i 5 órán keresztül «/kubaijuk 14&C-os. Fzen idő letelte után 2 ul ligás reakeiőolőatot adnak: 58 pl kompetens £ utó.! 3M 189 törzshöz (ami a resgenskésziet része, és a besználati utasítás szerint tettük kompetenssé), amelyhez 2 pl 0,5 M p-merkaptoeíannli adtutík, és s kapott keveréket jégen tartjuk 38 percen keresztül, «/ajd 42’C-un 38 tnásrsdpercen keresztül, és ismét jégen o percen keresabb. Azt kővetően 500 :.te, 2% vte tnptont, 0,5% vv/v élesztökivonatot, 0,05% rt/v náírium-kíoridor, 2,5 mM kahísm-ktes'iáet, 1 mM nra^őzádra-kioritkrt és 20 mM. glukózt tartalmazó tspk&icgte (amit a leírásba» ezentúl „SOC” tápközégaek jövetetek) adunk a tenyészethez, és az elegyet «tetessétek ! órán kereszt»! 37*C-on marással. Ezen idő letelte után a tenyészet szélesztjSk L--tepitesi sgnrcsészéte (1% v/v bápten, 0,5% wá álesztökivoaat, 0,3% wv nártmm-kloftd, 0,1% w/v giokóz és 0,6% »7v bakto-agar (Dífco)j, amely 1.00 ggtesl asnpici'líiat tartalmaz, A csészéit nsggjstesRl amprcllíla-reziszterts kolóniákat kiválasztjuk: és platina tevivő kacs·csal lekaparjuk, és tenyésztjük 100 ggtei ampicíliÍRt tartalmazó L-tápközngbeu 3?;íC-o« éjszakás keresztel 20Ö rpm rázatással. Az tekssbálás teás a sejteket catsírlfegélássai feegyöjtj-ölc, és özekből plazmtd DNS-t állítunk «iö az a&abkus eljárás alkalmazásával. A kapott plazmádét pH62 plazmádnak oevezsB a. TRA-8 nehéz tene esetében, és pLRS-.rcte TRA.-8 könnyű lánc esetében. Az ezen plazmidokat hordozó £. coll trsrsszteíusánscteai ~ melyeket £· eoít JMi'S'ApHöS-nsk és £, rtei JM'lÖ$/pL28-*í3k nevezünk - letétbe helyeztük az „Intemaiienai Patent Organinm. Daposhary, National testessé of Ádvasceá InássRste Science and Technology'' iteézeteél <1-1, Higashi 1 ehetne rsukubs-shl, itevakitecís, 305-5466, Ispán} 2801. április 20-án a mikroorganizmusok isiéibe helyezéséről szélé Budapesti Szerződés szerint, és ezek sorrendbe» a FERM BP-75ŐO és FERM BP-.7S61 leteti számot kapták. A TRA-8 nehéz és köanyö láncát kódoló ezen DNS-ek uokleoiid-szekvencláját igazoljuk a dtdeoxr atódszsrrei (Sanger, F.S. és mtsai,, Proc, Nafe Aead, Sok USA 74, 5460-5467, old. (I9771j, 3766 ΟΛΟ doteteér - alkalmazásával (46/RR/SAé; Ptekte Elmer Applied Blosyssems, Japán).
A TRA-8 nehéz, és ktteyá láncának nsíkieotsd-szekvesosáisi sorrendbe» a 21. és 22. azoaosltőszémá szekvencián matatjuk be, A TRA-8 nehéz és köstoyá láncának ammosav-szekveHciáját sorresteben a 23, és 24. azrmositószámó szekvencián mutatjuk be. A TRA-8 nehéz és kíteuyü láncának fent megállapított N-tenainá&s amínomv-szakvencíájn tökéletesen illestkeáett, Ezenkívül araikor a nehéz és könrsyö lánc amínosavszékveneiált összehasonlítjuk az ellenanyagok aminosav-szekvenciámak adatbázisával, teegállapsteatö, hogy a nehéz, sánc esetében a .a 21. azoausltészáraS szekvencia 58-414. noklecddjai tekéitek s variábilis régiós, míg a 415-1302, ítekteísbdok aücotják az állandó régiós, A könnyű láfie esetében a 22, azonosítószámú szekvencia 64387. uokleotidjai alkotják a variábilis régiós, és a 22. eznooská&zátnó szekvencia 388-702. nnkleaikijai alkotják az áitetteő régiét. A Ci>R.-ek elhelyezkedését és .szekvenciák szintén meghatározzak a homo-lóglák adatbázissal törtéké összehasonlításával. Á TSA-8 nehéz láncának CDRi, CDR2 és CDR3 amrnosav-szekvenciáját sorrendben a 25,, 26, és 27, azonosítószámú szekvencián mutatjuk be. A TRA-8 könnyé láncteiak CDR1, CÖR2 és
CDR3 ammosav-szekvsneiáját sotremföea s28., 29. és 30. .azonosítószámú szekvencián mutatjuk. be.
17« példa, TRA-8 ellenanyag humanizált változatásak tervezése
0} A TRA-8 variábilis régiójának sueíeknláris raoddlezése
A TRA-8 variábilis régióitok molekuláris srsodsifezésél -az általánosan hemológla-rttodeilezés néven ismén ellátással végezzük iMeikctes la Enzytsoíogy 203, 121-154. éld. (1991)], a barnáé immunglobaii» variábilis régiójának „Protein Data Bankiban rtgiszlráli primer szekvenciáját [Mac. Acid Kés. 28, 235-242. old. (2000)1, amelynek röntgenriRTrakciós vizsgálatokból származó háromdimenziós szerkezete hozzáférhető, össze» hasonltaik a TRA-8 feat meghatározott vázróglóival. Ennek eredményeképpen az sNCte-tés lillLA váteijck: ki, sülte amelyeknek a legmagasabb a Mmteágiájs sorrendben a TRA-8 könnyű és nehéz, láncával. A vázrógiók háromdimenziós szserke-zetát ágy hozzak kte, lu?gy· kombináljuk az INCD-és 1 teli., koordinátáit, amelyek susgfcleínek a TRA-8 kötmyö ós aehóz Rntoak, a „vázrégió, modellt” létrehozva, A Chothia és ártsál. Bal definiált, osztályozás .alkalmazásával s TRA-8· €l>R-jert az teábbí módon osztályozzuk: a C13IU,., CTJRL;, CÖRH: έ»
CDRH? sorrendbeti a 2., L, 1., 3, kismrniktts osztályokba tartóznak, míg a CDRLj nem tartozik. semelyik specifikus kanonikus oszsáíybts sen;, A CDRL;, &>RX,;;, CDRHs, ODRIT CDR-imrksit rőgziíjük a megfelelő Ramoikns osztályok tsrherests kenibrmáciéjára, és integráljuk a váxrégió oxsdsfibs. A CDKLj-af a SA konforsnációs klaszterbe soroljuk be, Tbotntóa és tntsai, osztályozása alapján :f.l. Möl,. Bioi, 2$3« SÜO-SÍS. old. (i99ő)], és a CDRHrat a k(8)C-b« osztályozzuk a .í-fe-szabály «lapján (FESS Le«ers 455, 1SS-197. old. (1994)]. A CDRL, és CD.RH·! reprezentatív konformációit integráljuk a vázrégíó modellbe.
Végezetül «aargias&Wtásokat végzbsrk, hogy· elhmnáijuk a kedvezőtlen aíomok-kösStd érintkezéseket, annak érdekben, 'hogy a TRA-S variábilis régiójának vaiószáníi srtoiekul(:ris modelljét eiőáliitsyk az energia iakmíetében, A fsait eljárást kereskedelmi ferg&iombsn kapható reoiekaláris modellező rendszer, az ASM (Os.ford Mölecnlar i.öaíted, Inc.) alkaisRözásával hítjtjok végre. A kapott molekuláris modell pontosságát tovább elemezzük a PRÖCHSCR szoftver (.1. AppL Cryst. 2b, 2S3-29I, old. (1993)] alkábnazásávsii.
(2) Humtíuizáii TRA-S amlnesstv-szekveaeKunak megtervezése
A humanizált TRA-8 ellenanyagok előállítását az általánosan „CDR-gmRing néven ismer;, eljárással végezzük (Proc, Naá. Acad. Sói. USA SS, Iüő29-löő33. old. (19S9)]. Az akeepter ellenanyagé: a váxréglófesa felálbaíő homoiőgia alapján váslsztjuk ki, A TRA-S vózrégiéjának szekvenciáját összebasonlkjstk az eltenaayzgok ammosav-szekveseíájásrak Rabat-fele adatbázisában lévő összes humán vázrégíé-szekverseíávai (Náci, Add Rés. 29, 205-296. old. (2()01)]. Essek eredményeképpen a mÁUSRCl ellenanyagot választjuk ki akeepíornak, tőivel ennek vast a legmagasabb, SO% szekvenoia-botnológjája a vázrégioban, A tnAbők’CL váatógidjénak am.is.osuv-öktelkürcait egymás alá rs:sdezxök a TRA-S-év<d, ás azonosítjuk azokat a pozíciókat, ahol különböző omiuösavsk találbatők. Ezen oldailaneok elhelyezkedését eiemezzsik a TRA-8 lest létrehozott .háromáitn.enziős szerkezetének alkalmazásával, és azokat a donor oláailáocoksí, amelyeket az akcepSszrra át kell ültetni, kiválasztjuk a Queen és torsai,, által adod kibértamos alapján [Proe, Had. Acad. bei, VSA Só, 1()029-10033, old. (1989)].. A bamamzáli TRA-S szekvenciákat a következő példa szerint álliijnkeiő számos donor anrlstösav átvitelével a ntAbSS’CL akeeptor elíetssoyagso.
18, pákla, Rspresszíás vektor előállítása a baHtaaíx&k ellersatsvag nehéz láncával (1} Humanizált TRA-8 nehéz iáne.ánsk varié bilis régióját hordozd plazmid előállítása
Annak érdekében, hegy·· meghatározzék a humanizált TRA-8 aktivitását, a humanizált TRA-8 nehéz láncának variábilis régióját hordozó plazmiáot állhcttunk elő az alábbiak szerint. Azonban nyilvánvaló, hogy a TRÁ-8 immunizálása nem kor játszódik ezekre a példákra.
Amim a 31, azonositószámá szekvencián bemutatjuk, a TRÁ-3 egér anii-humán-DRí sllenanystg kősvnyíl lánca ammosav-szekveneiájásak s homanlzálása során a 13, tmdrtassvst (lizsn), a 19. amtnosavat (lizin), & 40. ammossvat (meontn), s 42, amhxtsavttt ígltssminsav), a 44, aminosavsí (argód»), & 84. anrsnesavat (szerit)), a SS. sminossvat (szeri)·:), a 93. amömsavat (metiottht) ésa 114. amínosavas {ireeom), a 115. smsnosavst (ieueirs) kicseréljük sorrendbet) gíutamm, arginin, alattia, glicsm gllcis, aszgatagm, alanin, vaku, lesein és valía ammossvakra.
A humanizált TRA-S nehéz láncának variábilis régióját (3 L azottosltószámü szekvencia) kódoló DNS-t hordozd piazmido; az alábbiak szerint állitjuk elő,
PCR-t alkalmazunk az alábbi DNS-szekvenelák előállítására, amelyek mindegyikét leni ssmerteyök:
Az alábbi 12 olign-mkleotídöt szintetizáljuk meg:
Ó'-ítggataagc bggcstgae ctcsceatgg gaxggagdg taloatcctc ttotiggíag caacagotac aggtgtecae-3'
-45(Α; 32. azöaositószfeoú szekvencia);
S’-tcigsagísa tgclggigga gtótggggga ggctmgtóc ageetggagg gtecetgaga ctctectgtg csgecíe^g-3’ (E; .33. azooosiíószá;né szekvencia);
S’-asteaatts agtagttsis: tsaigteSíg ggíteggeag gcsceaggga agggtcígga gtgggítgca accatmgta-3' (C; 34. aaonosftószfaé szekvencia);
S'-gWggiag bscaectae óateíagaca gtgtgaaggg ccgaítcaee aícwcagsg acaatgcesa gaaeaecc;g-3' (D; 35. aaonosltószámó szekvencia);
S’-tatetgeasa tgaaeagtct gagagcagag gscacggcig tttótóg ígcaagaasg gg;gae;cia ;gat;aegse-3! (E; 34, úzzíoosítószámn szekvencia);
S’-ggactaeigg ggccaanegs cectggtcac sgictceiea gecte caec aagggeccat eggte-3’ (F; 37. aaono<sitószámú szekvsneÍK);
S'-esaee&agaa. gag.gatga;a engotccatc ccstggtgag gtóaagccaa gettatccaa -3’ (<}; .34, azonosítószámú szeiívsnci.aj;
5‘-teícagggae eetccaggct gtaetaagec tcccccagác secaccagea ttaettcaga gtggscaect gUgctgUg-3’' (H; 39. azonosítószámú szekvencia);
S'-tccagacect tccctggtgc etgccgaacc caagacmtta cstaactaot gsaagígaat ecagaggem cacsggagag-3’ (I; 40, azonos Itószámú szekvencia);
S’-ctctggagai ggígsstegg cccíieacac igtctggata gtaggtgtsa ctaceaecae tactaatggt tgcaaccesc-S1 (3; 41. azonosítószásná szekvencia);
S'-ccttcítgea cagiaatósa cagsegtgíe cteígctóíc sgaetgttea fögcagata cagggjgstó öggmtgt-3’ (R; 42. azonosítószámú szekvencia); és
S'-.gaccgaíggg cccúggtgg aggcígagga gacígfgacc agggtecctt ggccccagta gtecgtegta atcatagagt cs.ec-3' (L; 43. azonosítószámú szekvencia).
Az alábbi 2 FCR-láncindítót msgszinietizáliuk a fentiek szerire a-tíggaíoago ü«gcfígae~3‘ (Rl; 44. aznnosliószáetó szekvencia); és á'-gaccgatgag ccctiggigg a-3' (P2; 4$. azcsositószámú szekvencia).
Szekréciós szignáiszekvenciát, TRA-8 nehéz iáne variábilis régióját és sx Igö-CHl régió Nterminálisán lévő & ásni nőse v-eldaliáncot tartalmazó polipeptidláncot kódoló DNS szintézisét KCR-ek kombinációjának aílíaimszásávsi hajijuk végre.,
A tíNS-Ragíoefist az alábbiak szerint állítsuk elő.
A FCE-rcakeióelcgy ósszetétsie az alábbi:
A jeló oligoríijkleoiid, 10 prnol;
B jeléi oilgmüikleoliá, 10 pmol;
C jelű cllgeunkieofed, 18 pmof;
D jeiíi oiignonk lentid, 18 pmnl;
Éjein oiigsitnldeoísd, 16 pmob
F' jelő olígonnkleotld, 10 pmol;
G jelű öiignnnkteötiil 10 pmol;
Kjein olignunídeoód, 18 pmol;
I jelé oligoonkleutsd, 18 pmol;
-<te1 felh shgssBixteöósk 10 p?»ok
KjelO öligösnkíeoíife 10 ptnol; ttel» öílgoriakíeöiíd, 10 pmol;
FI jelő niigsrmskleotsd-láocinéüő. 2 pM;
P2 jelS oiígöíitedeoitedtociítesíó, 2 pkf;
I 0x Prroóe» oipfeí- /.(, 10 pl; dNTP keverék, § pi;
Ayez;h«s? DN-S-parltaseráz, 0,3 pi; és deszöllák víz 30 ul végtérfogatra,
A FCR-reakciőt az alábbiak szári»· végezzük. Az oldatot először 04’C-ís melegítjük 5 percre, ami otáft .^C-βο 10 másodperc, 55’C-on 30 másodperc és 72*C-on 1 perc ciklust 2-szer teméseümk. Ezen eljárás befejezése utas a reakciós elegyet 72-C-ra melegítjük i$ perese,
Azonos íérfegatú ístscí-kloroform oldatot (50% v/v vízzel telített fenol, 4.8% v/v kloroform, 2% v/v ósoasul-alkohol) ao-sbk 200 pl PCR-fermékfez, és erátellesen keverlek I perce» keresztel. Ezen idő terelte urán a keveréket Seeenrrifügáíjpk 10000 :< g-vsl, és a vizes réteget visszanyerjük: és összekeverjük a&mos térfogaié kloromtm-izostsil-alkohtelnl (%% v/v klorofortn és 4% v/v ízojnml-alkohoi), ismét erőteljese», és centrifugáljak 10000 x g-vef és a vizes réteget visszanyerjük. Az abban a bekezdésben felsorolt lépéseket a leírásban ezentúl „fenolos extmkeiérak” nevezzük.
Azutéís e-aaísíos ksesapást hajtunk végre a visszanyert vizes réteggel, A le&ás szerinti értelemben az „eíanoíos kicsapás” soráss & kezeltmáö oldathoz sgytized íéríbgamyi 3 M sátrlran-aeetátot (pH S,2> és 2,5 térfogatává 101710 eíaiioti adunk, és lefagyasztjuk a keveréket szárazjég alkalmazásával. A kapott keveréket azután fecemrifegáljuk 1ÖOGO X g-veí a DNS csapadékban történő visszanyerése érdekébe»,
A loeolos extrakclö és etanoics kicsapás urán a kapott DNS-csapadékot vákuumban szárítjuk, feloldjuk minimális térfogatú desztillált vízben, és 3% agarózgéi-siektmíbrézlsssl elválasztják. Az elektroforézia utón a gélt I pg/ml gsídium-hromld vizes oldatával festjük, hogy' lehetővé tegyek a. DNS festését U V-fénybe». A humsrsizslt TRÁ-8 DNS-aek megfeielá DNS-csffart pengével kivágjuk, és sluáijnk a gélből C,e.neofeo« Spin O (BIO Ilii, CA, VSA.) alkalmazásával Feaolos extrákéin ctán az élűéit DNS-t cerstrifugálásssl koocentráljok 7500 x g-n, majd stsnolfei kicsapjuk, és végül feloldjuk 5 pl desztillált vízbe».
Az egyes kapott ÖNA-fragtueuse.ker a p6'£Af-T £bjy vektor (Promaga) alkalmazásával klónozzuk az alábbiak szerint:
A b'CR-teakeióbél kapott DKS-fragme»s,3 pb
I-Οχ Tatt-politeeiüz pulfer, 1 pl;: áN'TP keverék, I pl;
Taq-nobmeráz (5 egység/ud), l ph és dasztíílált víz 10 pl végtéribgslm.
Azután mindegyik fend oldatot 7feC-mt reagáltatok 30 pemeu keresztül, és mindegyik oldalét és ρίΑΑΑΑΓ&Ανν vektort ligáinak a .OA'A /.fgaííon .hír 1-^0/00 2.0í faktsra Süozo r.o., l.td.) aikaunazasavai a gyarló utas! sásait követve, óra Inkubálás után 15”C~ors, 2 td irskabált reakcióelegyet üss zeke verünk suü ni kompetens a, mm 3M100 törzzsel 1-2 x 10’ sejt/mi saitsürűssg mellett (aktira Shnzc Co,x híd.), és az elegyet jégen tartjuk 30 percen keresztül, azníán 42*C~on 38 másodperces keresztül, és ismét jégen I percen keressük Azután 500 pl SÖC-tápkőzeget (2% vfv triptoo, 0,5% svzv étessökivens, 8,03% w/v tsáirimn-kioríá, 2,5 mM kálluor-klorid, '1 mM msgsrézmtsr-klÍsrkl és 30 ®M glükóz) adunk s keverékhez, amelyet további egy órás keresztül Inkahátonk razatás mellett, Azután üaaszíormáns törzseket izolálunk, és plazmád DNS-t állitosrk elő a törzsekből, amint azt ''Möiecular Cktnfeg A Lafesratory Mianual előlit könyv tesz)a. A humanizált TRA-S nehéz láncát kódoló ezen DNS-ek nökleotld-mkvendáját igazoljuk a dideosi módszerrel [Ssnger, F.S- és snísat,, Frtm. Maik Acud, Ser. USA 74, 5463-5467. old. (1977)1, Jeted DA% .éotóyra?' alkahnazósávsf (.4x7/ .FRSök?) Ferktn Hinser Applied Eio.systems, l'apan),
A kapott piazrrédöí pBBl-lmek nevezzük (a hutnstsízáií TRA-R nehéz láncát kódoló cDNS-t hordozó plazmld). Az ezen glszmidot hordozó £ éré; toansztormánst - amelyet. £. co/í lM189/pjíB14mek nevezőnk ··· letétbe helyeztük az: „hstetnationa! Fatetű Örganistn Deposttury, National Insthate oí Advanced hsdosdlal Science and Technology'' mtézstssél (l-l, Hígítsál 1 choma Tsukuha-shi, ibaraki-ken,, 38S-549Ó, .fepats) 2ÜŐ1. április 2Ö-án a nrikroorgauiznsustsk letétbe helyezéséről szóló Budapesti Szerződés szerint,, és a F8RM' BF-7556 letéti számot kapta.
(2) Kamnfeá» TRA-8 nehéz láncának variábilis régiójáé hordozó expressziós pinzmldok előállb tásn
Állati sejtekben alkalmazható rekomhinázís expressziós vektorokat áll hónk eió a humanizált TRA-8 nehéz láncát kódoló DNS inzeríálásávai (asnit fent klőrtoztortk) az. alábbiak szerint.
pg pSRMRHS piazmldot (EF δ-989-Őlő-Al számú európai szabadaltol bejelentés), amely a .HFE7A Imtnanlzálí antl-Ftts monakionális ellenanyag variábilis régióját és hnznáo IgGI állandó régiójának genomiális DNS-éi tartalmazó, emlős sejtekben alkalmazható expressziós vektor, emésztünk Hindii! és Apai restrikciós enzimekkel, és elválasztjuk 3% agstóz-géletektrolörézissek Az eiektrotbrézls utóit a gélt 1 pgánl etldlumfcromid vizes oldatával festjük, hogy lehelévé tegyek a DNS festését HV-tersyhen. A humán IgGI állandó régiójának gatíotsiiáiis DblS-et a HFB7A hsmtanizá.11 aois-Fas monokktsális ellenanyag rtehéz lánc variábilis régiója nélkül tartalmazó vektort kivágjuk pesrgévai, és ehsáljuk a gélből a &a?«?zfcsn Spin Átf (810 101, CA, USA) alkalmazásával, Fenolos: extmkclő utásr az eluáif DNS-t azután centrifegálássai kotseeütráljuk 7508 χ g~n, majd etanollai kicsapjuk, és végöl feloldjuk 5 gl desztillált vízben, ás sszutát? deíosztorlláiiiík GIF alkalsnazásávái, A kapod emésztett, Őefezíórilált plazmidoí (100 ag) ligáitok I p.g pHB14 DNS-iragmenssel, amely tartalmazza a humanizált TRA-8 nehéz lánc variábilis régiót kódoló DNS-t, szlndte emésztve Fíindíll ás Apai restrikciós enzimekkel, a öréd lígastem A7f ifemtón 2,9 (Takara Shazo Co., Líá.) alkalmazásával. A llgáeiós elegyet azután £ cíto IMI09 sejtek frnoszformólására alkalmazzuk, amit azután 58 pg/ml smpseiíimt tnrmlmazö LR-ngar csészékre szélósztönk.
Az ezzel az eljárással előállított dsnsztormánsokat 2. mi, 50 pg/nd sttspjeolim tartalmazó folyékony LB-tápkbzeghea tenyésztjük éjszakán keresztül, és azt kővetően piazmid DNS-t ekíraháhsak a kapott tenyészetből az alksiskus-SDS eljárással.
A kapott ptezmid DNS-t emésztjük Hindi 11 ás Apai enzimekkel, és 3% agáréz-gételektrotorézissel «Iváksszttuk, hogy igazoljuk & humanizált TRA-8 nehéz lánc variábilis régióját kódoló DNS-snzerí jelenlétét vagy hiányát. A kívánt DNS-írégsuens vektorbell mzereiőját és irányítottságát DNS-szekvtmáláxsal igazoljuk gésszekveneía analizátor alkaimazsisőv&i (.,4Sf %%9á;t 57(19 DA/5 dnsfítoer: Apphed Dtosysíemsj, A kapott
-48expressaiös plazmák*, amely a humanizált TRA-8 ne ház láncát kódoló cBNS-t hordozza, pHRl4- 1-ock nevezzük,
Í9. példa- depressziós vektor előállítása * hnwalaáh ehensnysg köonyű láncával
ΟIA TRA-8 slknssyag lussnasúzáli változatásnak kössyb láncait kódoló vektorok előáiiltáss
Amint a 46. mmnosilészámú szekvencián fecmntaijak, a TRA-8 egér aníl-hu®éo-í>R5 ellenanyag köoysyu lánca iim'nösav-szekvencláíáosk aíuuonnizálása során a TRA-8 könnyű láncának N-tcfuiiuálisátől sz&sitva s 8. amisossval íblszíidio), a $, amincmvst (Hala), a lö, afnlnosavaí ffeojlálaeln'y all. armnossvaí (®súo?u»), a 13. aounosavat (treorun), a 20, autloosavai (szerin), a 4?.. amloosavet (glulamín), a 43, antlnosavas iszerln), a őö. aminnsava? laszperaglnsav), a 63, «nmesavat ílreonbi), a 77. amloesavat (aszsorsgin). a 78, amlnnssvat (vsiís), a 88, aminosavst (szerin.) a .83, aasÉaosawt (levőin), a 85, amlsosavat (aszparoginssv), a 87. wlnesav&t (feni.felajíin) és a 99. amfemsavat (giicfe), a 103. aminesevaí (lene®) ás a 108. aminosavat (alanin) helyettesiícSúlk sárrétidbe» prolin, szerin. szerin, leváló, alan®, sreonln, llzin, atenirs, széria, szersn, szer®, lene®, prolin, leriilsláaln, Irookin, tirozin, gldasKtí. valló és íreonin smátosavekkal. A kapott sKskveneiátLWradtsevmSL
A TRA-8 aod-bumáe-URS eileísanyag ilyen típusú bumauizúll. könnyű lánc asnlnosav-szekveríoiáit hordozó expressziéi vektorokat az alábbiak szerint állítsuk elő,
1$ hísmsslz-últ TRA-8 khaayS fáae variábilis és állandó régióinak előállítására alkalmas lásctadtlék szásr tézise
Az; LM2 polipepíláiánce; (46. aznaesÍtészé®ú szekvencia) - amely a TRA-8 hamanisált srút-DRS éllé nanyag variábilis régiói ónak és a barnán lg könnyű láncén ak (x lánc) túziúla - köúoié DhSS-t PCR-ek kontblnéeléjával szuddizátjuk meg,
A 7A11F-I (47. azonosítószámú szekvencia) és 7ÁLCN (48. zszonosítöszámú szekvencia) mellest az alábbi oligonúkleotid IsaemdlíöRat számsízáljöh meg a PCR-hez:
S-gsccccenea gaígcsgaca aagaacSígg: agsngggte ascacaasgt ceecagíggn -3! (HK.SFRH; 4$. azonosítószámú szekvencia);
S'-ccaagíteit Sdotgearc egtsggagac aggafeacca lcac«gc-3‘ í'HKCDFil; 59. azonosítószámú szekvencia);
5-agtgtgccgg etggatsecc agíaaateag tagtttagga geöfeocsg gittetg-3' (HKCOR12; 51, azonosítószámú szekvencia);
S'-ígggcsteca: cccggcacac tgggatccea ageaggiúa gtggcagt-3' (HKCÖF22; $2. azoacsítöszámö. szekvencia);
á'-aisaclaeta tabgctgae aetsaiaggt tgessaatcc tceggeigca gaciagagd ggí-3' (M&CÖ822; 53. axodísitósaámó szekvencia)', ás ö'-caoeeslata geagemtcg gaegöcggt caaggcacca agglggaaat caaacggaet gtg-3’ |)IKCr >2; 54. azonosítószámú szekvencia).
2) A pCRS,lzM2-.l ptoniá.elM8itá$a.(h8S»a«feá;tf TRA-8 könnyű lánc klónozás®)
Az 55, azonosítószámú szekvencia szédüli LM2 DNS-íragmenst, amely a 4&, aronesbószámú szekvencia szerinti anúnosav-szekvenesát kődolja, kétíápé.se.s FCR-rel állítjuk elő, pííunruú vektorba mzertájjuk, es £, Cí.bí-bsn klónozzak,
a) Első RCR-lepés
-49Az LM2-F1 DNS-Sngmessí, amely szekréciós szlguálszskveseiát és FEJL-régiós kskfel HirrdlH restrlkclós enzim basítási hellyel az 5’ véghez adva, az alább: kürülméuyek köz® állítjuk eló, A pHSGHM 17 és pSS.PDHH tcmpiát plaztsidot az EP 89ÖWÍÓ .A I. szárúé európai szabadalmi bejeimé» leírása alapján állítjuk db.
A reakeiéeiegy összetétele azalábbi:
pHSOHM 17 plazmái QMS (EF Ö900§i0 Al. számú európai szabadalmi bejelentés), 25 ng 7AL1P ol!§onuk5e'.oísd~iáncind!íé, 50 pmol HKSPRIí oligöjsikiéotid-láuciuditú, 50 patai dNTPkoktékSpi
JÖx :F€R-poílsr, 5 pl umpü'/bp ONS-poliaieráz (Perina Elmer), 2,5 egység.
A fenti Ssszelöteíü reakcíóelegyet 50 rsl végíéríasarra állítjuk be desztillált víz hsszzáadásávai, és ECSbes alkalmazzuk.
A PCR. temsális köröhnésyci; melegítés 94C-on 2 percig, ami után az alábbi ciklust ismételjük 3θ alkalommal: WC-cn 1 perc, 55’C-on. I pere és 72“C-ou 2 perc, majd melegítők 72*C-c» 10 peres» keresztül.
Az FíkLj egy részlesét, C13EL;-et, FKLyt és CDRLj-t kódoló LM2 D'NS-frrrgmeusl az alábbi körülmények kézbtt állítjuk elő.
A roakclöelegy összetétele az alábbi;
pt2S plazasid DNS, 25 ng
IIRCDEÜ ííligoouklerítíil-láncbulitó, 50 párul
HKCD.R12 uilgoaukleetid-láncjnáitá, SQ emel dNTP kökséi. 5 pl lös PCR-pnlíer, 5 pl máp/Dms' ÖNÉ-iXiitrsseráz, 2,5 egység
A fenti Osszeíételú reakclódegyst 50 pl végíérlbgatra állibuk be desztillált víz hozzáadásával, és PCRben alkalmazzuk.
A PCR. iermális körülményei: melegítés NDC-un 2 percig, ami után az alábbi ciklust ismételjük 30 alkalommal: foDC-rm 1 perc, SSAÍ-os 1 perc és ?2*C-m 2 p«rc, majd melegítjük 72':<l-rtu ló percet; kérésziül.
A CÍ}RL>~i, FRLj-aí és az FRi,s egy részletét kódoló LM2-F3 DNS-ffagmenst sz alábbi kbrtílmények közhit állítjuk elé.
A reakciéelegy összetétele az alábbi:
pSRPDiiH pí&atóí DNS (EP OEGPSlé Al, számé európai szabadalmi bejelentés), 25 ng HK.CDF22 oiigouukíeotiá-lásciudbö, 50 pmol HKCDR22 oilgounkleotládánciuábö, 50 pmol dNTF koktél, 5 pl
IOs FCR-puff® 5 ul «AepbTííp' DNS-polimeráz, 2,5 egység
A fonti összetételű reakcióelegye; 50 ul végtérfogaíta állítjuk be desztillált víz hozzáadásával, és PCRben alkaisnazzuk.
-50A K.R tetmaks körülményei: melegítés tefeC-crs 2 percig, ami uiáat az alábbi ciklust ismételjük 30 ab setemmal: Rteíxm 1 perc, ő.HC-ou 1 perc és 72*C-oí; c psrCi mtyd melegítjük ?2*C-on 10 perces keresztül.
A CDRLrat, FRfo-et és az állandó regiét a 3 véges egy beoRí testó&dós eszlm hasítási. hellyel együtt wtstezó LM2-F4 DNShjagmsnst az alábbi körülmények között állít luk elé.
A reakctőelesgy összetétele az alábbi: pSRFDHK ptszsskl DNS, 25 sg HKCF12 öilgonuklsotiiblácefeditó, 58 ptsol 7AI..CM oligonüklsotté-táncindsíó, 58 pmol ÓNT? köktéí, 5 μΐ IΟχ ECR-písRáf, 5 μ! rníím’iRíg DbS-polimeráz, 2,5 egység
A remi összetételé reakcióslegyet 58 μΐ érfogatra állítjuk be desztillált viz hozzáadásával, és PCR-ben alkalmazzuk.
A FCR termálls köíőituésyei: melegítés W*C-mt 2 percig, ami után az alábbi ciklust ismételjük 30 ab kakimmal; fefeC-on 1 perc, 55’C-on 1 pere és?24C~ss 2 pere, majd melegítjük 72°C-os 10 percen keresztéi.
Az amphtdkált DNS-fragmeoseket a PCR más; 5% polifeu-llantid-gélelektröferéztssei választjuk el. A gélt az elektreibrézís utas I pg/ml eticlímaAremtudai festjük sas előáliiiotí DNS OV-íésy alatti detektálásához. Az így detektált megfelelő DNS-cxíkokm pengével kivágjuk,
b) Második PCR-lépés
Az EM2-DNSfe antelybea a fent leírt LM2-RÍ-ONS, L.M2-F2-DNS, LM2-F3-DNS és LM2-R-DNS iregmensek fhziotfeltatvs. varnak, az alábbi körülmények között áliitjnk slő.
A rsakdóélegy Óv zetétsle az alábbi;
Az első FCR-íépésben eldáliKoit LM2-FÍ-DNS géifrsgmsfíse.
Az első FCR-iépésfem előállítóit LM2-F2-DNS gélíragmessa.
Az első PCKMépésbéü előállított tM2-FWNS gélímgmettss.
Az első PCS.-iépésbeaelöáliitott LM2-F4-DNS géltre.gmense
7AL1P oligostukleotid-iáscmdfed, SÖpmol
7A1.CN oligönukleotld-lásclttdiió, 50 pmol dblTP koktél, felfed lOx FCR-pnfier, 5.0 μ! í».«pi'í?feí iőNS-poímteíáz, 2>5 egység
A festi összetételé raakefeelegyeí 50 μ! végíérlbgatra állítjuk be őeszbiiáU viz bezzásdásával, és PCRben tsikaimazZuk.
A FCR rertrtális körülményei: melegítés fefeC-öo 2 petéig, attti után az alábbi ciklust Ismételjük 38 alkalommal; 94®C-en 1 pere, 55*'C-ots { perc és 72X'-í»b 2 perc, ntajd melegítjük ?2eC-o« 10 perces keresztül.
Az sav előállított Ι..Μ2 IJbiS-lragmen:;; a pCRÜl plaztaidbn inzertáljuk Satoyerfe' Dl tferemg Arf (Icvibugesj alkalmazásával a. gyártó umsiíásalt követve, és bejuttattuk a resgeasfeészlethen tévő kompetens £. refe TOR10F' sejtekbe. A humanizált TRA-S kősóvá iátteát kódoló ezen DNSrek uukfeotid-szskvenmáiát igazoljak a didsoxi módszerrel lőattgefe F.S. és retsak, Froc. Natl. Acad. Sci, USA 74. S4ó3<s4óí. eta (iS? Oj. 5.788 öbfe .-fenÁmv- alkalmazásával (Ab/feA/ó/A Fcrkm Elmer Applied Rsosymerns, Japan).
-51A kapott psszmldekat pCR3.I/M2-Hwk nevezzük (a humanizált TRA-S könnyű lánc variábilis régióját ős humán lg könnyű láne állandó sügióját kódoló c.DM$-i hordozó plazmád).
Az LM2 GNS-fr&gntensst rsrtaim;t.zö pCR3,8M2-t plazmittei esnésztjük Hindid és EeoRX restrikciós enzimekkel;
I p.g pMSCGM) klónozó plsznmi i>HS~t emésztünk Hindii I ás Eenfei restrikciós enzimekkel, és azután defeazforilábuk CtP-pel. A kapott defoszforilált pHSGW GHS-t és a Hindii! és ScotH restrikciós enzimekkel emésztett LM2 GNS-riagmenst ősszeligáljuk a £>M4 Isgizdös O Fémén 2.Ö (Takara Shazo Ce., Úti.) alkalmazásával, Azután £ oo/l GHoa sejteket transzformálunk a ligáit DNS-sel, ás 0,1 mM IFfC-t Ü,i% X-G&l-t és éö .ugónl kloraasfdmkölí tartalmazó LB-agar tápkőzegre szélesztjuk (végkoneeuttúeiók). A kapott fehér transzfermánsökat 50 pg/ml kkwnte&olt tertalmaző folyékony LB-tápközegbcn tenyésztjük, és plazmád öHS-t extranálunk a kapott tenyészetekből az alkatikus-SDS eljárás szerint. Az extrahált plazmád 8HS-t emésztjük Hindiit és Eeofol enzimekkel, ás azután ksváfcszmnfc agy LM2 DHS-foagmenst hordozó klóm 1% agarózgélelektreforézisse 1.
A fenti eljárás eredményeképpen előállítjuk a b.nimmizáit LM2 TRA-S könnyű lánc variábilis régióját és harsán igK lánc állandó régióját íarteimaző luziós tragroensi hordozó pHSöí'M2~l~4 plazmidot, Az ezen plsznddőt hordozó £1 coli tr&nssflormáost - amelyet £, ooó' í)H5m'pKSG/M2- I -4-nek nevezitek - letétbe helyeztük az „Intsrnatfostei Patent Grganisto De<xtsitary, Hatfonal testűmé ót Advanced Industrisi Science and Tecbsology'' fotézetuői (Hl, Hisaslti 1 ehetne Tsukabs-shi. ibaraki-ken, Sőó-Sáóő, Japaa) 2SŐ1, április 28-án a mikroorganizmusok letétbe helyezéséről szóló Budapesti Szerződés szerint, és a FERM SP-75S3 'letéti számot kapta.
2j A pS.R/;M2~l phizmid előállítása (humanizált LM2 T8A-8 könnyít láncot kódoló expressziős plazmád)
A humanizált LM2 TSA-8 könnyű lánc variábilis régióját és humán IgK lánc állandó régióját sarialsnttző fúziós tfagmeost hordozó pHSG/M2-M plazssídot emésztjük HisfoEl és EcoRl restrikciós ettzttttekkel, i ng pSREHHH plantid 8NS-t (EPtfoíriteiő Al. számú európai szabadalmi bejelentés} emésztünk MimilH és EceRI restrikciós «szintekkel, és azután deioszforiláljuk ClE-pei, A kapott daíoszibrilált pSRFDHH f>NS-t es a píiSGíhí'á-1-4 plazmfoixd előállítóit HlmdlI-batRl 8NS-lrag.mcts.xi összeilgáljek a DAzt óígwőon kit k't.vríöí? z.ő (Faterra Slmzo Co., Ltd.s alkalmazásával Azután A eoő OHóo sejteket temsxfoímáluak a ligáit í>NS-sel és LiBagarre sséfeszsjiík. A kapott irasszformáttsokte Idő pg/tsri smpieillisu tartalmazó folyékony L3~ íápközegbeo tenyésztjük, és piazsrdd DNS-l extrshátenk a kapott tenyészetekből az alkalikus-SDS eljárás szerint, A gSRPDHI 1 vektorban lévő kívánt ObíS-tbagmens irszerefoját és Irányítottságát öNS-szekvesálással igazoljak góoszekveoeia analizátor alkalmazásával (.48/ /UkjŐáf .Efod.ÖAvt Αηηρ,ζοη, Applied Biosystemsj.
A kapót: expresszáós plazmiáot. amely a hurtraóizált T.RA-8 könnyű iánoáí kódoló cDNS-t hordozza, pSIte'M 3-1 -nők nevezzük.
2lk példa. Humanizált eiiesstsyag előállítása
COS-? sejtek (ntafotnveséből származó rejtvonafo trsusziektálásáí a font előállított htttnnnizáh TRA-8 nehéz sáncot és humanizált TRA-8 kőssyü láncéi kódoló expresszlés vektorokkal a Afoö&Yrid trasszrekefos reagens eljárással (Boehrmgsr Masuhesm Biochetrsfoa) végezzük a raagessteiszlethez mellékelt kézikönyv utasításai szerint.
-52COS-7 sejteket (American Type Cultee Collecéio®, CKL-ÍÓ51) tóiig összefolyt állapotig növesztünk (3x10* sejl/csésxe) tenyésztő csészében (tenyésztési felület: 5? emJ; Samitomö Katóké}» ansely P&tóeeersk Atódétód Sögtó AWAw tápközeget tartalmaz (amit a leírásban ezentúl „D-MEM”-nek nevezünk: Gíboo 8R.L), kiegészítve 10% magzati feorj-ászénmml (amh a iciársbtm ezentúl „FCS”-nek nevezünk: Moregate).
Közben 10 pgíesésze (összesen 5 csésze) humanizált DR5 nehéz Isse expfesszíős plazmld DNS-t <pHÁÍ5-í) és 1.0 pg/esésze hnmamzáh DR5 könnyű tánc exprcsszíős plazmld DNS-t (amelyeket az ateílkasSDS eljárással ás cézimrs-klodd sürüséggísálens esmzitóígáiássai áliítottuak elő) összekeverünk, és szálán ctsnollal kiesapunk, majd tólsznszpejmálnnk 5 ukesésze desztillált vízben,
Móniin 15 gkesészé RSOT íraasztókeiös .reagenst összekeverünk 180 pl/csésze FCS nélküli ISMÉM íápközeggel, ezt a FCGCYíö-oldato· (185 pl/esésze) összekeverjük 5 μΙ/esésze DNS-oídsttal, amely 10 pgtósesze humanizált BR5 nehéz lánc expressziás plazmád í>NS~t és Ifi pg/esész,e fenmsnizáít DRS könnyű lánc expressziás plazmld DHS-t tartalmas, 15 pete szobahőmérsékleten tötldső tnkubáiás után a kapóit plazmldszuszpenziőt (200 pl) hozzáadjuk a korábban előkészíteti COS-7-lemszekhez. 24 érás 5% CO7.-ben 3?*C-w történő Inkőhslás után a tenyésztő lápközeget lecseréljük FCS nélküli D-MEM Sápköxegre, 72 órás 5% CQ>-feen 37':'C-on történő inknbáiás után a· tenyészet tólüibxzéjáí visszanyerjük a íelülószöban lévő expresszibe ísrmákekf tisztítása végeit. Ezzel a fent leírt módszerrel COS-? sejteket tmasziekfáltmk az alábbi plazmíd-kmesmhínácíbk mindegyiké vei:
(A) : nincs pfazrmd DNS (B) : pHS M-l és pSK/M2-í együttes transztóktálása
A tenyészetet azután lecentnfisgáíjuk (lööö rprm 5 pere), és a (élülúszól összegyűjtjük.. A íeiülúszót ismét centrifugáljuk (9800 rpm, 15 perc), és szűrjük (1,45 pm-es szűrön (ADVANTSC TÖYO DlSMlC-25es, Csín 25CS045 A:$)« A szfirietekból az. tgO tisztítását Froteín G-/YWa7 afímitási kre'maíográfía. (Applied Esosystems) alkalmazásával végezzük az alábbi körülmények között:
HRLC: BioCAD 7Ö0E (Applied Biosystems) oszlop: /Yoícú?O-7P serrst»- eavmtójje {oszlopmére!; 2,1 mm !D x 3Ö mm LD, tölíettérfogal: 0,1 ml; Catn 2-1OO2-OÖ, Applied Biosystems) elúelbs puttót: ö,l M Tris-HCl (pH 2,5) semlegesítő paltór: 1 M Trís-HCl (pH 0,5) detektálás: 280 ntn;
áramlási sebesség: 1 usbinin frskciöméret: 0,5 nti/0,5 perc gyűiiócsö; 1,5 ml-es polipropilén mlkroesö hőmérséklet: 4CC
Miután az összes s zúr letel felvittük az oszl opra, 31) nü EBS-t íS rgma, Caib 10ŐÖ-3 .! atzal mázunk az oszlop mosására, Amikor az elöclős pariért elkezdjük felvinni, elindítják a ítókciókollcktorL Mindegyik mikroesö korábban tartalmazott 55 pl 1 M NaCI-t, i IÖ pl semlegesítő puttórt és ?4 pl 2 rogiml szorvastnarhaszémmafbonbnf (Stigma, Csld A-703G) PBS-imn. A S-lü. frakciókat összegyüjtiük,. és dfaltzáljuk f liter PBS-ssi (pH ?J) szemben MC-on I napon keresztül ödm?-vi (mez (Píeree, Cet» óö45b) alkalmazásával, A dialízis paliért kétszer cseréljük.
A humanizált ellenanyagok expresszlőlársttk igazolását és az előállítód tenyészet-feldiüszőban található expreszsziós termékek mennyisei elemzését ELISÁ-vsl végezzük, anti-humán-lgö elleni elkmsnyag aikslmazásával.
86«mérőheíy«s mikrodterfemez (MasöSorp, Nunej mindegyik mérőhelyére 188 pl kecske snti-hutnánIgG-Fc-rs specifikus msiikkmáils ellenanyagot (Kaopel) adtaik, amely 8»5 ugónl végkoseentráclőra van feloldva abszorpciós ptdíérhen <8,85 M nátríum-nidrogénkatbisuát, 0,02% «átrium-tót, gli 0,6), és a mikroliserietnezt 37’C-os inkübáijuk 2 órás keresztül az ellenanyag adszarbeálása véged. Azután a mlkrodterlemsA öl alkafemmai mossuk 350 pl BBS-sei, amely 0,03% Tween-2ő-at (Biorad) tartalmaz (amit a leírásban ezentúl „PBS-T’sek nevezünk).. Mosás után a mérőhelyekbe adjuk a 18% FCő-i tartalmazó D-MEM sápközsggs! hígítód tényészet-feiüiúszókat, és 37°C-csn iakabáljuk 2 órán keresztül. Ismételt BBS-T mosás után IÖÖ gk PBS-T-ben löŐOO-szer hígított, alkaltkas íoszlátázzal jelölt anti-hamán-Igu-re specifikus poliktónálls ellenanyagot (lacksos Immuné Ressurcb Láb.) adnak mindegyik mérőhelybe, és 37°C-on Inkubáljuk 2 órán keresztül, ismétek FBS-T mosás után az dláolúít? Ftepőstee Reformé áíf-böl (Bio Rád) származó p-nílrofeml-feszmi szubsztráíot adunk a mérőhelyekhez a reagenskészlethez mellékeli kézikönyv utasításai szerint 3?aC-eu 0,5-1 órán keresztül történő ínkubálás után mérjük az abszorbsnclát 485 nm-en. Ezekben a kísérletekben 10% FCS-t tartalmasé D-MEM tápkőzegbén adott koncenírttetőkrít hígított barnán plazma irtunungtóbulin <3 i-es alosztályt (Igöl) (Blopure Aö) alkalmazunk k.uaeeniráeió referenciamintaként a tenyészet-feiillúszőkbats teíálhaió htömsrúzalt DR5 élteaaayagokhox
Éhnek eredményeképpen speelfíkusan detektáljuk a tenyészeí-felölúszóban található tisztítód termékek expresszióját és az ami-bumátí-IgG ellenanyaggal. A humán IgG ellenanyag mennyisége 06 gg (888 pl).
21. pélsfe. A humanizált ellenanyag apoplózb-lsrdnkálő aktivitása
Jurkai sajtókét (ATCC TtB-152) alkalmazunk a tisztított humanizált TRA-8 ellenanyag apoptózisisdukálo aktivitásának vizsgálatára,
10% FCS-t tartalmazó FEMI1Ő4Ö iápkösegbea (Glbcó BREj 37°C-oa 3 napon keresztül 5% €<% jelenlétében tenyészted Jurkai sejteket Oó-mérehelyes mlfeuilteílemez (Sumltomo Bakaike) mérőhelyeire osztunk szét mérőhelyenként 30 pl mennyiségben. A 28. példában előállítod hurnanizált. TRA-8 végköocsmráelőlát löö rtg'mi-re állítjuk be 10% FÜS-t tartolmaz &PMIIŐ48 tápkőzeggsk a 28- példában leírt utódon becsülve azok koncentrációját a folyadékokban.. Az axpressziós termékek ily módon 100 ag/rai-ra beállitóít oldatait aikaltnnzzsk sorozatbíaifások előállításra 18% FCS-í tartalmazó E.P.MI1Ő48 tápközeggel, 2-szercsrc hígítva sorozatosan, A tágított humanizált TRA-S-at adjuk az egyes mérőhelyekhez 58 μΙ/mérőhely mennyiségben. Miután reagáhatiuk 3?°€-öo 12 órán keresztül, 58 pl 2,5 M BMS~t (tenazin-metoszultat;: Slgma Chemical Co.) adunk hozzá, amely i mg/ml XTT-í tartalmaz í23-bisz(2-ntótóxM-nltro-5-szölfofenil)-2H-felrazőisms-S-k&rttosianirld belső só; Sigma Chemical Co.) (végkoneentrácló: 258 pgúnl X1T és 5 pM OMS). 3 órás ínkubálás után mérjük az egyes mérőhelyek abszorbaneiáját 450 nsn-en, hogy kiszámítsuk a sejtek életképességét, a mítókendrmmok redukciós képességét Indexként alkalmazva,
A sejtek életképességét az egyes mérőhelyen az alábbi képlet szerint számítjuk:
Életképesség (%) ~ 100 x (a-bMc-b) almi „a” jelentése a teszt mérőhely mérési értéke, ,,b” jelentése a sejteket nem tartalmazó mérőhely mérési érteke és „c* jelentése az ellenanyagét nem kapott mérőhely mérési érteke.
Ennek eredményeképpen s 28. példában előállított ejsprmziős terméktől (boroanizált TRA-S) kimutat? juk- hogy spoptözist indukál: humán l>R5-öt esptesszáló T-limféma sojívoo&i sejtjeiben.
22, példa, TRA-8 ceakrivhása különböző RRS-molekulák iránt
Annak érdekében, hogy meghatátozituk a TRA-8 reaktivitásét köíőrtbőzö DRS-möiekuiák iránt, meg· vizsgálok a TRA-8 reaktivitását -aktíváit iirafocMk alkalmazásával az alábbiak szerint.
Elősző? perifériás vérmintákat veszünk embertől (38 mii selytsranajtmtfól {3 ml) és GW-areígKs nmjomtól (28 ml). A vérrsiaíákhoz 1 mi heparint (Novobeparia; Növő) a-tek, és a mintákat azután lassan rárétegezzük azonos térfogaté- Ato(/-Pa<yue /77..% óidéira (Ametsham Pharmaeia Biotecb.) specifikus sűrűség? 1,077 a Cv«o.»íötgsáf majom kivételével, amelynek -a specifikus sűrűsége 1,072), és 38 percen- keresztül ceotritetgáliuk • 700 rpm-mel perifériás toonosmfcieám sejtek előállítása érdekében. Ezt a mononokleéris sejtteakciOt kétszer mossuk Banka-féle kiegyensúlyozott söoldsttsL ás azután felsznszpendáljuk 18% v/v FCS-t tartalmazó REMI IS40 tápközegben 1 x 18* sejtíml stótestűségre, Fitohemagglutsnia-P-t (FriÁ-F, Stgma Otentíeris·, Co.) adtmk a kapott szaszpermóhoz 5 g.g/ml végkoncmtháoiéhan, és a mintát 37’C-on inkuháljnk 5% CCC-bes 24 órán kérésztől, Ezer. idő letelte után a sejteket centrifugálissal visszanyerjük, mossak és éjr&lfelszuszpaadáljuk azokat 10% v/v FCS-t tartalmazó RFMI 1Ö48 tápközeghett. Azután a visszanyert sejtek akti válásához· ínterfeukia-2-í. (Ammham. Pbannacia Biotech.) adunk a kapod szaszpemhóhöz 19 egységűül végkoneenriáeiőbnn, és a mintát 3'7’C-tm mkubáljPk 5% v/vegyíilet COj-ben 72 órán keresztül.
A számításidé szerint 1. s Kf aktivált liu-tbcitát tartalmazó aktivált készítményt tesztcsőbe helyezzük, és fésszuszpendáíjuk 58 ui 8,5, 1, 5, 18 ug/tsl TRA-8-at tartalmazó PBS-ben, vagy 50 pl FBS-beu. A kapott szítszpeaziói hagyjak jégen állni 1 órán kérésziül, ami után a sejteket 3-ssor mossuk 588 pl PBS-sef, és azután felszuszpendálluk 50 pl FlTC-ecl jelölt anti-egér-lgfJ ellenanyag {Btoresomee) 28 pg/mi koseenb'áeiőjá FBS~es oldatában. 598 pl P8S-ben felszuszpendáít sejteket alkalmazva kontrollként, merjük a őuoreszcencraintenritásokat, áramlási eltométer alkalmazásával (TRCÓóIuííókí'; Bectoa Dsckisscn).
Megkapjuk a sejtszámok Baoreszcencia-istenzítás szerinti eloszlását, és kiszámítjuk s tested: sejtek számának arányát ez összes sejt szstnáhez viszonyítva, Ezeakivől kiszámítjuk sz egyes Kd-értékeket a TRA-dkoneeiOxáeiá és a lestek sejtek számának arányának az összes sejt szántához vimnyított arányának alkalmazásával. Az ember, selyemmajom ás Cynomo^as majom m-mdegyikének esetében, az aktívák hmfneiták reaktivitásának gyakorisága majdnem- megegyezik. Esnek megfelelően a TRA-S képes kötődni főemlős DR5-Ök széles köréhez, köztük az emberéhez, amely ellen a TRA-S-ateredhéleg tenmáiteKnk.
23, példa. TRA-S emelkedő dózist! vizsgálata selyemmejom-han
TRA-8 emelkedő- dózisa előzetes toxscitásí vizsgálatát végezzük el I htm és 1 nőstény selyemmajom alkalmazásával.. Három egyszeri intravénás adagolást hajtunk végre 7 napos vrsszsállási periódussal elválasztva. A TRA-S dózisát 58, 258 és 1250 gg/tesí teennyiségre állítjuk be. 48 érával az első kezelés után Véri gyájtünk a combvénábél, és plazmát állítunk sió.
Mérjük a plazma aszpartái-an-u-ötranszteráz és aisnln-nminnteínszTeráz aktivitását anabzátorrsl (TT-tíT DŐZ-CRCAí Fnü Film Mentesd Co., Ltd,). Az összes vérvételt érzéstelenítés nélkül végezzük. Eredményeként nem találunk tnájkárosátiásra. utaló- bizonyítékot a plazma biokémiát vizsgálatával az egyes kezelések után,
24, példa, TRA-8 /» rőro és őt teve farmakolőginl vizsgálata humán rákos sejtek, ellen
Annak meghatározása érdekében, hogy & TRA-S terápiásán batásos-z rákellenes terápiában, vizsgáljuk TRA-8 úr váró őiőafcfivbásáí különböző rákos sejívonafakban- az alábbiak szerint.
Különböze rákos sejteket (2-8 s lö3 sejb'50 pl) tenyésztünk RPM.IIŐ4Ö tápközsgben (Torkát sejtek «se» lében), DMEM tájfteghea (HCT-i l§ sejtek esetében), M£M-& íápközégben (WiDr sejtek esetében) -vagy DMBM-F12 tópközegben (COL2»J«k sejtek esetében), amelyeket a ölben ERI cégtől szereztünk be, 1Ö% FCSsel (Giheö BRL) 3TC«on 3 napost keresztül 5% CO> jelenlétében, majd ÖO-aaérőbelyes ntlkrntherlemez (Sumttomo Bakelité) mérőhelyeibe osztjuk szét azokat, A TRA-8 koncentrációját ágy állítjuk be, hogy a vég» koneentráclb ISO ag/jsl legyen 10% FCS-t tartalomé tápkbzegbea. A TRA-B oldatot (löö agrrnll sorezsthigitások előállításra alkaitnazzuk lő% FCS»t tartalmazd tápközeggel, 3-szeresre hígítva sorozatosan. Az egyes higjtóit TRA»b-oldstökat 50 pl mennyiségben hozzáadjuk a oróróhelyekhcs, és 3?°C~oa Inkuöáljnk. Mintán reagáltatjuk 72 érán kérésziül 3?°C-ö», 50 pl 25 g.M PMS-í (íenazla-metösznlSut; Sigma. Chemical: Co,> adunk hozzá,, amely I mg/mi XTT-t tartalmaz (végkoncenírseió: 25Ö pg/ml XTT és $ pM RMS), 3 órás inksbákí» után mérjük aa egyes mérőhelyek abszorbmtciáját 450 nm-sn, hogy kiszámítsuk: a sejtek életképességét, a mitökónörimnok redukciós képességét indexként alkalmam.
A sejtek életképességét az egyes mérőhelyen az alábbi képlet szerint számítjuk;
Életképesség(%)- ISO x ía-b}d>fe) ahol „a” jelentése a teszt mérőhely mérést értéke, „b' jelentése a sejteket nem tartalmazó mérőhely mérési értéke és „e jelentése az ellenanyagot nem kapott mérőhely mérési értéke.
Áz eredtttényekei ez alábbi 3. táblázatban matat juk be.
Sejtek Hö$f;
.torkai 0,001 Aöl
HCT-1 lé 0,004-0,02
WÍDr 0,007-0,Ő3
CÜL2-Jck 2.2S
A különböző rákos sejivnaalakbaa erősen indukálódik az apoptózis a T&A-8 hatására in rtn-n körülmények között, nzsnklvtii meghatározzuk a TRA-S m vóm daganatellenes aktivitását beültetett WiDr sejteket tartalmazó csupasz egerek alkalmazásával, mivel a TRA-S nem keresztreagál sz egér DR5-iel.
TRA-S antl-DRS ellenanyagot aduok be humán ÖRS molekttlát expresszálo hutnán xeaogtaftot hordozó csupasz egereknek. Az alkalmazoö egetek 6 hetes Baib/c esapasz/esupasz egerek (nőstény, Ctea .ispán, lítc), amelyekbe humán WIDr vastagbélrák sejteket Ültettünk be (5 ?»sn3). Egy nappal a daganat beültetés urán a transz-plantált egereket naponts kezeljük TRA-S íntrartikulárR Injekciójával (5 ggrtest) 14 alkalommak A WrDrdaganat növekedéséi, naponta meghatározzak a daganat méretének mérésével. Az eredményeket az alábht 4, táblázatban mutáljuk be.
-öó4. Táblázat
3 nap 11 nap 15 nap IS nap 22 nap 25 nap
Kontroll (FOS) 196 249 469 544 833 1193
SD *55 *7? *149 ±230 *374 *419
7X4-5 154 97 155 195 365 530
Sfe *78 *30 £60 £58 *91 *135
Míg ebben a modellben az összes kezekíílaa. állat látható dagjnnatnbvekedést mutatott, a daganat növekedése gátolt a í'RA-k-eai kezelt egerekben, asntnt ezt a daganat mérete mufesju. Ez az eredmény azt mutatta, hegy a TRA-8 hatásos a dsgznaísejt fi? vöm eliminálásában.
35. péfes. TRA-8 kombinációs vizsgálata
A PC-3 humán prosztatarák sejtvonalat sz „Ámenem Tissne Cttlttoe Coltecíioa’Mót (ATCC) szerezsfik he és F-/2Á' íY»Me?« togközegben (2 i 137-023, öihco BRL) tartjuk fenn, amely az alábbiakat tartalmazza; magzati marhaszémm (IBS, Kycione), 1% L-Cdrtonits~2ÖÖ tói (25030-149, öifeeo BRLj és 0,5% penícíllin-sxmíptomioin oldat (F-7S39, Slgma). 10% FSS-sel ás 0,5% penicifrla-sztreptotofeát oldattal kiegészített ΚΕΜΠ640 tápközegei (MED-O0S, i:WAK.I) a&ateazmk az alábbi kisérfetbes. Espoaeacíáhm növekvő EC-3 sejteket gyOjtlksk iriglszínlzádővai, és- kétszer mossuk azokat friss tápközeggel. Azután leszámoljuk a sejteket, őjrafrfezuszpendáíiok friss tápkőzegben 5 x t04 sejteni sűrűséggel, és egy nappal a kísérlet kezdete sieti szétosztjuk három párhuzamosban lapos fenekű 96-oaéröhelyes mikrodterlemezekben (3598, Coming-Coster) 100 abmérőhely összferfeg&tban. A dlrnetilsznlfoxklban feloldott (10 mg/ml) Pae/fraxe/ reprezentatív rákellenes drogot (169-18611, Wsko) friss tápközegben hígítjuk, és azután a sejteket tartalmazd 9&-mérohelyes mikrodterlstrtezskhez adjuk 50 μΙ/mérőhely mennyiségben, A dlmetilazulfexid végkoncentráeiéja kisebb, mim 0,1%. 24 órás 3'7’C-en 5% COj-ahnosifrérábsrs történi) Inkubálfrs után friss tápkózegben hígított TRA-R-trt adónk, a mérőhelyekhez. További '24 órás mkubálás után 50 μΙ, 1 mgfrnl XTT-t és 25 mM FMS-t tertalaaazá A/r»te Fusem/u/ Afertmm tápközegei (11095-098, ölben BAL) adunk a mérőhelyekhez, és a míktoiiterlemezeket 6 érán keresztül inkubáijnk. Áz.píán mérjük sz ÖD450-st SFCCT/bé ATAT 251? készülékkel (Moiceular Devices), ás a kiszámítjuk a .sejtek életképességét az alábbiak szerött.
Sejtek életképessége <%}« {a Tsxolial és/vagy TRA-S-szerteí (szerekkel) kezelt sejtek OD459-ériéke) - sem sejtet, sem szert nem tartalmazó mérőhelyek: OD45Ó-«rtók«) s löt) / (sejtet igen, de szert nem tartalmazó mérőhelyek 019459-értéke - sem sejtet, sent szert nem tartalmazó mérőhelyek OtXSO-értáke)
A reprezentatív rákellenes droggal, a F«e/.teeMei: kombinált TRA-b-at alkalmazó fenti vizsgálati eljárások eredménye a következű, A /Wkexe/ csökkentette a FC-3 sejtek életképességét, ás az életképes ráksejteket mutató jelnek több útim 40%-& megmaradt, akár 200 nfrí koncumrácíóig is. Eigyelemrersiéiló, hogy 0,1 ng/ml TRA-8 hozzáadása nagymértékben csökkentette a ráksejtek életképességét akár 1 0%-kaí is, még ha nem Is látszott a sejtek életképességének csökkenése TRA-S egyszeri beadása után ebben a koncentrációban. Ez az eredmény vllágossrt jelzi, hogy a TRA-8 szmerglktts rákellenes aktivitási mutatott más rákellenes szerekkel kombinálva.
28, póklm Más típusú Imsttanízáíí TRA-8 eifcwöyagek elemzése (1) HumasilzáJt eUsuaayagefc tervezése
TRA-8 humanizált verziójának előáílitását az általánosan „CBR-graftisg” néven ismert eljárással végezzük. nsAÖSS'CL ellenanyagot alkalmaznak akceptorként, assisi: azt a 2, reíeronolapéldábím leírjuk, és 3 TRA-8 ellenanyag CDR-réglórt ráültetjük aa akceptorra. A vázrégióbtm bizonyos amlnosuvskat vagy a TRA-8bői, vagy humán konszenzus szekvenciákból ráúltetíbA az akeeptossm, a Qasen. és nrtsai, által adott kriídotmmk alapján (Proc. biati, Aead, Sas, USA 8S, 18829-16033, old, {1938}}, és humán TRA-8 szekveoeiákst állítunk elő ax alábbi leírás szerint, (2) Más típusú humanizált vagy agár TRA-8 nehéz lánc variábilis régió öNS-ét hordoxá plazmái előállítása
Ámha az 58, azonosítószámú szekvencián bemutatjuk, a TRA-8 egér aníi-hamáu-DRÁ ellenanyag nehéz lánca sonstosav-szekvenciájánsk KI típusa humanizálása során helyettesítetídk a 3, aurorosavaí (metmma), a 13. aminosavat (Hm), a. 18. amisösavat (lízln), a 40. amhmav&í (íreottití), a 42, ammos&vaí (gJuíatninsavK a 44, aminosavat (arginln), a 84, smisesavat (szebít), a 88. amxoosavat· (szersn), a 93, amúíosavat (metiooia), a 114. arninesavst (rteonin). a 115, aminosavat (íeocins sorrendben gíníamio, giglamin, srglnirt, aianin, glicáp glíeirt, aszparagin, alsóin, válts, leuein és valin amlnosavákkal.
Amint az 59, azonosítószstnú szekvencián bemutatják, a TRA-8 egér auti-hmoáo-DRS ellenanyag nehéz lánca atninosav-szekversciálának: H3 típusú humanizálása során heiyeíiesltcrtúk a 13, antinosavat (lizin), a 19. -aminosavat íHzis), a 40, aminosavat ítt-öosín), s 42. aminosaval (glomminsav), a44, auúnosavat (arginsn), a 88. aminosavat (szerin), s 93, atninosavat (metioaln), a 114. aminosavat (treomo), & 115. aminosavat (Ionéin} anmndhen -glutatnin, arglnin, alauis, gliein, ghcm, alauin, vatta, lécein és valin atnt&osawkkal.
Andtd a óö. azonosköszámú szekvencián bemutatjuk, a TRÁ-8 egér atttl-kumátJ-DRÓ ellcnsnyag nehéz lánca asnlstossv-szekvenciájának H4 típust; hasnanizálása során helyettesítettük a 13, stnínossv&t (lizin}, a 19, aminosavat (lizin), 4 88, atninosavst tszertn}, a93. aminosavat (isetioninj, a 114, aminosavat (írecnúnj, a 115, mninosavai (lettéin) sorrendben ghnamso,. nrginin, alsrdn, valin., Ionéin és valin aminösavakksl.
Áísint a ők azonositöszássú szekvencián bemutatjuk, a kunéra TRÁ-8 nehéz lánc variábilis régióját hord»»» ptenidoí. „M-típosósak nevezzük, Ezenfelől a 17, és 18. példában bemutatott humán TRÁ-8-at ,,112tlpnsúnak” nevezzük,
A husnanizáh vagy kánéra TRA-8 nehéz lássa, variábilis régióját kódoló I3MS~t hordozó plazmidot ax alábbiak szerint állítják cíó.
PCR-t alkalmazunk: az alábbi Ö:MS-szekvcuciak előállítására::
Az alábbi 24 csligcsssukleubsíut szintetizáljuk meg:
ó'-úggtdasgc ttggettgae ctcaccatgg gatggagctg tatcatcetc ttctíggtag csacagcísc aggtgtccac-3’ (A; 32. azonosítószámú szekvenciái;
S'-tctgaagtaa. tgetggtgga gíctggggga ggeitagtae agcctggagg gíecctaaga otctcctgtg cagcctctgg-3’ (B; 33. azonosítószámú szekvencia);
S’-kngsagtae agetggtgga gíetgggggs ggcúagtsc agcctggagg gteeetgaga eiciecígíg eagcmetgg-3' <82; 57. azcsnösiíöszáirtú szekvencia);
ő’-tclgaagtas. tgctsgtgga gtcíggggga ggertagias agecíggagg gícectgaaa ctctcccgíg eagsctctgg-3’ (B3; 6ő. azonos kószámé szekvencia);
-585-st?eacttic agtastiatg iadgfctig. ggíré^cag gcaccttgsga sgggtstgga gtgggtigea accattagtttók (C; 34, azonosítószámúi szekvencia);
S'-atkscttíc sg&gBatg taatgiettg ggttcggcsg scMsagaga sgaggdgga gtgggögett aecaítagia-3' (CT; 64, azooosköszíimú szekvencia);
S’-gW&gW ttacacetaa tsleeasaea gigtgsaggg ecgatieace atctceag&g aeaatgccsa gsacacccíg-l’ (.!>; 38, azonosító:számú szekvencia);
óMaíctgesaa tgsae&gie-t: gsaagc-agag gaeaeggetg tttattscíg igc&sgsagg: ggigaetcís tgattacgae-3' (E; 3$, asönoskószámű szdívetteta);
5‘kaSctgcaaa igagesgtói asgagcagstg gacaeggctg wtactg sgeaagaagg ggtgactóts tgaöacgae-T (E2; 02, azoKOsltőszántti szekvetteta);
$*~tafetgesaa tgageagtct gagatdgag gaeaeggeta tgtafladg fgca&gaagg ggtgacida tgaöacgae-?’ (S3; $7. azonos&teteá szekvencia);
S'-ggsdadgg ggcca&ggga ecctggteae sgtdeeiea gcctccstx aagggeccat eggte-3' (F; 3/, nzonösliószátm) szekvencia);
5!-ggadadgg ggecaaggga ceacteteac agtctectcs gectócaec aagggcecai: cggte~3! (P2; 68, azcooskészántú szekvettda);
3‘-eíaecaagaa gagsaigata eagctceató ceatggtgag gtcaagccaa gctistccaa -3’ (ö; 38. ssxmösiíószátnü szekvencia);
S-tcísagggac cctceaggct gtactaagcs tceeccagae tseaceagca öackcaga giggacacct gtagci:gttg-3! (H; 39. asonmítószteú szakv&ada);
SMcte&gggae cetseaggcí gtóctasgcc teccccagsc teettceagcl: gtacticaga gtggsötcd gtsgctgítgCT (H2; 58, azötsosítószáístó szekvencia);
SMtíasgggae eeteeaggei ítsda&gcc ieccccagac focaecagea tt&dscaga gíggaaacct gtagctgítg-S' (H3; 60, gzttóodiöszátstő szekvencia);
5’-teeagaecci tcestggtgc cigccga&ce csagscafta eaisaetad gaaagigaat ceag&ggctg escaggagag-3' (í; 40, aaoooslíószámú szekvencia);
SMccagceíct tetetggagi ctgecgzacc csaagcatta cataaetaet gasagígaaí ccagaggctg cacaggagag-3' (12; 65, aaooositészánxá szekvencia);
S'-cfdggagai ggtgaaíegg cccftcacac Igtcíggaía gtaggtgíaa daccaccac tactaatggt l:geaaeccac-3< (3; 41, azonos Itószátnú szekvencia);
á'-ccttdtgca cagíaataaa eagtxgtgtc ctctgctetc agaeigtísa tlzgeagaía aagggígftc ttggeskgt-3' (K; 42. azotíöstíószátóú szckvst'ída);
S'-caíieíigest cagíaataita eagsegígíe ctcígctete agseígtiea tkgeagats esgggígttó ttggcattgt-S' (K2: 53. szónosítószteá .szekvencia);
S'-ccímúgea cagtaataca íagcegtgie dcagalctc agactgctca sítgeagata eagggtgttc ííggcaítgtO' (K.3; 78, azonos Hószátnú szekvencia);
S'-gaccgstggg emtggtgg aggcígagga gastgtgaec agggtocctt ggecceagta steegtegía atcatgagt caeo-3’ (k; 43. azonosítószámú szekvencia); ás
S’-gaccgatggg eccttgstgg aggetgagga gaetgígaga gtggtcccít ggecceagta gíccgtegia atedag&gt eaee-3’ (1,2; 7:1. azöítítsítósttátaú szék vend a).
59Az alábbi két FCK-láscíítsStót szintetizáljuk meg a festi leírás szerint:
5‘-tt«gaíttagc tíggcttgise-3' (Fi; 44, azoaosSósxámá szekvencia): és
5'-gaccgatggg cectíggtgg a-3* IF2; 45. azonosítószámú szekvencia).
Szefeéotős szlgsálszekvenciát, butnanizált T.RA-Ó nehéz lánc variábilis régióiát és azIgG-CHl régió W-ístr'Kimáísxán lévő 8 astinosav-öhla-llátteot tartalmazó polipepiiőláocot kódoló ril-ttpttsú DNS szintézisét PCR-ek kombínác sójának alkalmazásával hajtjuk végre,
A Hl-típtsstl DNS-íragmeast az alábbiak szerint sülijük elő,
A FCR-reakeióelegv összetétele az alábbi:
A jelű ökgmskleosld, lö pmol:
B2 jelé oÜgonskleobd, Ki páséi:
C lein oligonukleetső, 18 pmol;
D jelű öligonnkleníid, lő pmel;
EjelS eiigomddeolid, lö omol;
F lelő. oligonukieotld,. i 8 pmol;
G jelű ollgonnkleotid, 10 pmol;
H2 jaki ollgonnkleotisb 18 pmol;
jelű oligonokleond, 18 pmol;
.1 jelű obgonnkieotid. 18 pmol;
K jelS oiigööükieétiíl '18 pírtól;
L jelű oügotmkfeetid, 1.8 pmolFl jelű öligtmnklwid-láassridiíó, 2 ρ,Μ;
P2 jelű okgrsnukleóíid-láuclnditó. 2 pM; lOx Dyrnbest őrAfer·//., 10 pl; dNTF keverék, 8 pl;
/h'í'ööís'í ÖNS-pobmeraz, 8,5 pl; és desztillált víz 58 pl végtéribgatra.
A ECE-reakeió; az alábbiak sxennt. végezzük. Az oldatot először M’C-ra melegítjük 5 percre, mm ní;kt WC-on 18 másodperc, 55”'C-no 3ö másodperc és ?2öC-otJ 1 pere ciklust 7-sser Isttréteiilttk. Ezen eljárás befejezése alán a reakciós elegyet 72’KAra. melegítjük 15 percre,.
Feooios extrakelő és etamtlos kiesapás után a kapott DHS-esapaösfeot vákuumban. szárítják, feloldjuk tninmtáiis fertbgatá deszbilált vízben, és 3% agarozgél-esektroferézissel elválasztjuk. Az efekttoíotézis ntátí a géb 1 pg/ml etldiam-bromid vizes oldatával festjük, hogy lehetővé tegyük a DNS festését DV-fenybes. A Hltlpusó ONS-nek megfeleld DNS-csikokaí pengével kiváglak, és eltsáljuk a gélből öeaeerasm Spin Ab (BIO lőE CA, OS Aj sikál mázasával, renoios extrakeió után az eluált DNS-t azután censrllugslássai koncentráljuk 7588 x g-8, maid etanolis; kicsapjuk, és végül feloldjuk 5 pl őesztlllált vizben..
Szekréoiós szignsiszekvenclat, humanizált TRA-8 nehéz lánc variábilis régióját és az IgG-CH i régió H-terotmáiisáu lévő § amlnosav-oidalláítcot tartalmazó poiipeptidláoeot kódoló H3-típusú DNS szintézisét FCK-ek kombinációjának alkalmazásával hajtjuk végre,
A Hu-iipusö ONS-fragmenst az alábbiak szerint állítjuk elő.
A ECR-re&keióelegy összetétele az alábbi;
A jelű eMgemrkleödd, 10 pmol;
R jelű okgönukísotid, 10 pmci; ü jelé eligonakleotid, 10 p-ncl;
D jeiö oOgpsnkleístid, löpmol;
£2 jelű oHgonukleodá, 10 pmsrk f jeiü oilgönukleotid, 10 pmol; ö jelű oíigerrakleetid, 10 pmol;
K jelű oiig,cnnkleötid, 10 pmek I jelű oiigonukleodá, 10 pmol;
.1 jelű elígonukiectiá, I 0 pmol;
K2 jeli! eligonökleetld, 10 ptnci;
L jelé eligímuklentid, lö pmol;
Pl jeW oligonuidcötld-láneindité, 2 pád;
Pl jelű oligonakleotííi-lánemditó, 2 pM; iOx Arobasí ógObr/f, 10 μί; áMTP keverék, 8 pl;
Pvrifoes/ DNS-poíimeráz, 0,3 μί: ás desztillált víz 50 pl végáérlbgatm.
A PCR-s'eakelóí a® alábbiak szerint végszzSk. A® oldatot először 94®C-ra melegítjük 5 perere, tani után. WC-on 19 másodperc, 5$öC-oa 3ö másodpere és 72°C-ön 1 pere ciklust 7-szer ismételünk. Ezen eljárás befejezése után a reakciós eiegyet ?2wC-ra melegítjük 15 percre.
Fenolos extrakció és etanolos kíesapás után a kapott DNS-csapadéket vákuumban szárítjuk, feloldjuk mmimáits tetfogatü desztillált vízben, es 3% ag;trözgébelekh-oföréxZíssei elválasztjuk, Az eiektroibrézls után a gélt 1 ttgíml etidiasa-bromld vizes oldatával festjük, hogy lehetővé tegyük s DNS festését UV-iényhen. A 113tiposö DKS-nek megfelelő öNS-csikuk&t pengével kivágjak, és elnáljuk a gélből öeme/eoa Spin O alkalmazásával Feaoíos extrskdő után az eluáit DNS-t azután eentrilugálással koncentráljuk 7500 x g-u, majd etsnohai kicsapjuk, és végül feloldjuk 5 pl desztillált vízben.
Szekréciós sztgnálszckveneiáí, humanizált TRA-8 nehéz lánc variábilis régióját és az IgG-CHl régió N-lermittálisán levő 8 aminosav-oiátúláncot tartalmazó polipeptídláneot kódoló Hé-típnsú DNS szintézisét FOt-ek konmínáciéjának alkalmazásával hajijuk végre.
A BA-tSgíssá DNS-fragmenst az alábbiak szerint állítjuk éld,
A FCR-reakcióeiegy összetétele az alábbi:
A jelű olrgonokleoild, 10 pástól;.
R jelű eíigeuukieotiá, 1S pmol;
C2 jelű oligonuklecsld, 10 putul;
D jelft ollgonaklcotid, 10 pmol;
E2 jslő olígonakiootid, 10 pmol;
Fjeidolígoóukleotid, lö praoi;
G jelű ehgonukicoíid, 10 pmol:
Kjeid ollgonnkleotid, iőpmoi;
jelű oligomiklcotsd, 10 psnok
Jjeiű niigüttukiaoisd, ΪΟ pútól;
K2 jelű oiigomtkleotid, 10 pmol;
I, jelű oí igonukleeriö, 10 pmol;
fel jelű ölignnukleottá-láncipdíté, 2 μΜ;
Pl jelű oiígömsklemiádánetsditö, 2 μΜ; lOx FyrobiKU festfer ZE 10 pl; dNTE keverék, § μΙ;
Pprí’Zw ÖNS-poltmeráz, 8,5 td; és iiesztillák: víg.: 50 μΙ végtérfőgstra.
A PCR-reskeiót az aíábbbk szerint végezzük. Az oldatot először H’C-ra melegítjük 5 percre, anti után OjDC-on 10 másodperc. S5cC-on 30 tnáseépere és 72X’«on I perc ciklust 7-szer ismételünk, Ezen eljárás befejezése alán. a reakciós elegyet ?2;>C-r;t melegítjük 15 percre.
Fenolos extrakáő és etsuoíos kiesapás után s kapott DNS-esspsdéket vsktutmbttu szárítjuk, feloldjuk minttrtábs térfogatú desztillált vízben, és 3% ;sgarázgél-elektrt>feré:zíssel elválasztjuk. Az eiektroibrezis után a gélt 1 agául etidmm-hromid vizes oldatával Sestjök, hogy- lehetővé tegyük: a DNS festését üV-íénybeu, A H4típusú DNS-nek megfelelő DNS-csikekat pengével kivágjuk, és elt-áijük a gélből öe«ecfe«« áptu O alkalmazásával FcüöIös extrakciő után az akiéit DNS-t azután centrifugálással koncentráljuk 7501) x g-ri, majd etanollal kicsapjuk, és végül fejQídjuR 5 pl dssziilíáh vízben.
Szekréciós szlgratlszek vesse iát , kimér» TRA-8 nehéz lánc variábilis regiáját és az Igö-CH'l régié N« terminálisán lévő k aminosav-oidullátseot tsítalmazó polípaptiőlárssoi kódoló M-tiposü DNS szintézisét FCR-ek kosrtbinácíáj ástak alkalmazásával haltjuk végre,
Az M-tipuxú DNS-áagineusi az alábbiak szerint állítjuk elő.
A FCR-makcióelegy összetétele az alábbi :
A jelű tsligonukleotid, 1ö pmol;
jelű öbgoüükleatld, 10 pmol;
€2 jeíő öbgoísukleuítik 10 prűd;
DjelÜ öligonukfeötíd, ÍOpsuol;
E3 jelű ökgöísnkieotíd, 10 pmol;
P2 jelű öiigenukleetld, ÍÖ ptnol; ö jelű oagonukleutid, 10 pmol;
H3 jelű oÓgöÍSükleoíid, 10 pmot;
jelti eligontikleaiid, 10 pmol;
jelű ongtsonkleoíid, 10 pmok Nejeid öiigo-ankleoliá, 10 pmol;
L2 jsiö obgonakleoiid. 10 pm.nl;
Fi jelű öhgonukleurlá-láueínditő, 2 uM;
F2 teld oligíínukleeríá-iáneiridité, 2 u.M;
1ÖX igvöbmí ba/fer //, 10 al; dfeTF keverék, § gk
Xmíhí-H DNS-polimeráz, 0,5 pl; és desztillált víz 50 pl végferiéggtra.
A PCR-reakciót az aisbbisls szerint- végezzük. Az oldatot először 94-X-rs melegöjOk 5 percre, ami után 98®Oon 10 másodperc, 55%1-on 2d) másodpere és 72%~-öu 1 pere elklust ?-szer ismételünk. Ezen eljárás befejezése «ián a reakciós elegyet ?2*€«ra melegítjük 5 5 percre,
Fenolos extrakció- és -etaaöfes feiesapás után a kapott DNS-csapadekot vákuumban szárítjuk, feloldjuk minimális térfogatú desztillált vízben, és 3% agsrózgél-elektrofórézissel elválasztjuk, Az elsktroforézls után a gélt 1 pgAul etidlnm-bromld. vizes oldatával festjük, hogy lehetővé tegyük & DNS festését OV-fétrybett, As Mtípusú DNS-rtek megfelelő DNS-csikokut pengével kivágjak, és eiuáljuk a gélből Gatwfeon Stáb O alkalmazásával Fetrolos extrakció után az eluált DNS-t azután centrifogálással koncentráljuk 75ÖÓ x g-n, majd etano.llal kicsapjuk, és végál feloldjuk 5 pl desztillált vízben.
A kapott: extrahált D'NS-ekef (Η 1 -síposé, H3-típosú, H4~típusú és M-íipusü) klónozzuk a jáTEkÓ? &sy vektor (Promega) alkalmazásával az alábbiak szénát:
A PCR-reaksiából kapott DNS-íragtnens (Ri , 115,1-14 vagy M) 5 gh löx T-aq-poUmeráz puffer. 1 pl; dNTP keverék, 1 pl;
Taq-pohmeráz <5 egység/ml), 1 pl; és desztillált víz 18 pl végtérfbgarra.
Azután nóndegyik festi oldatot 7fr€-ött reagákatjuk 30 percen keresztül, és mindegyik vektort és g<iO/~'fe£oyv vektort ligáinak a D<VA Zdgasfe» Ari Nerrmri 2.0 (Takara Sbazn Co., Léd.) aikaltaazásával a gyártó utasításai szerint.
éra iukübáiás után 1 S*C-or, 2 gl tokúdéit reakeiöelegvel összekeverjük 100 pl kotspetens £ co/i .1141(19 törzzsel 1.-2 x 18* sejt/ml sejlsűrüség melleit (Takara Shu-zo Co„ Ltd,), és az elegyet jégen tartjuk 38 percen keresztül, azután 425£-οη 38 nrásadpercen keresztül, és satuét jégen 1 percen keresztül, Azután 500 pl SCC-tápfcözeget (2% v/v inpton, 0,5% Wv éleszíókivötiaü 05% w/v sátrin-n-klorid, 2,5 m,M kállssrt-klorIá, 1 tuM ruagnáziom-kloríd és 20 tsM glükóz) aduok a keverékhez, söreivel további egy órán keresztül Itíkubálunk rázafás mellett. Azután tmnszfotmátss törzseket izolálunk, és plazmád DNS-t preparálunk s törzsekből, amürt azt “Molecsda? Clortlng; A imboratory ManuaT című könyv leírja. A humanizált vagy egér TRA-8 nehéz láncát kódoló ezen DNS nukfeotíd-szekvencíéját igazoljuk a dídeoxi módszerrel [Ssnger, F.S. és mtsai.,, Ihoc. Öfetl, Acad, Sei. USA 74, 54Ó3-54Ó7, old, (1977)), 3W DAvl .Tnmkzer alkalmazásával (,W Refkltt Eltner
Applied ílioövsiems, ,1'apan).
A kapott plsztnidokst pHA 15-nek -fa humanizált TftÁ-8 Hl-típusú nehéz láncát hódoló cÖNS-t hordozó plazmid), pHC 115-nek (a humanizált- TRA-8 HS-ilpusó nehéz láncát kódoló cDNS-í hordozó piazmtd):, pHD2:1-nek (a -bum-anizáit TRA-8 H4-típusó nehéz láncát kódoló cDNS-t hordozó plazmid) és pM l l-rtek (a kimér» TRA-8 nehéz iásmát kódoló cDNS-t hordozó plazoód) nevezzük. Az szett piaztnidokai hordozó & cn/i transzformófisokal - amelyeket £. eo/i .i.k-íiö9óaHAi5~ne.k, £. ooó.kMIOdípHCló-nek, £. colt ,ih-f.it59/pHD21nek és & cou JMKhNpM l i-eek nevezőnk - letétbe helyeztük az „Intenustiotsal Estem Orgaoisítt Deposlisry, Matlösrai Insőtute of Advanced Indositisi Science and Technology'· intézettéi (1-1, Higashi l ehetne fsukuhashi, Ibaraki-kess, 385-5466, ispán) 2001, április 28-án a snikroorgítniztsmsok letétbe helyezéséről szóló Sudapesti Szerződés szerint, és ezek sorrendben a FERM SP-75S5, PEBM BF-7S57, FBRM 8P-7SS8 és FERM BF7559 letéti számot kapták..
(3) Különböző típusú humanizált vagy egér T.8A»« nehéz láste variábilis régié BKS-éi hordozó expjressziős plazmídoh előállítása
Áíiatl sejtekben működőképes rekombínáns expresszsós vektorokat állítunk elő a Hl -ligásé, H3-ttpusü ős H4-típuső humanizáíg vagy M-típusó egér kimére TM4 nehéz lánc variábilis régiót kódoló (lent klónozott) DNS Inzertálásával sz alábbiak szerint, pg pSEHHHÓ plazmidot (EPÖ9W$H> Ál, számé európai szabadalmi bejelentés), amely a HFE7Á humanizált artil-Fas tnonoklosáhs eltenanyag variábilis régióját ős humán IgGl állandó régiójának genoísiális DN'S-ét tartalmazó emlős sejtekben. alkalmazható es.pressziós vektor, emésztünk Híndlll és Apai restrikciós enzimekkel, és elválasztjuk 335 sgarőz-gélelektrofotézissel. .Az elekuoforétos úton a gélt i. pgóo! elkliam-ln-anud vizes oldatával restjük, hegy lehetővé tegyük s DNS festését UV-íőnyben. A humán IgGl állandó régiójának genornláiis DNS-ét a HFE7A humanizált: aoti-Fss monoklonális ellenanyag nehéz lánc variábilis régiója nélkül • tartalmazó vektort kivágjuk pengével, és ektáljuk a gélből a öe/wtoe £/?/» O alkalmazásával. Fenolos extrákéin után sz eluált DNS-t áznám censri&gálássai koncentráljak 7500 x g-n. majd etanolial kicsapjak, és végül feloldjuk 5 μΐ desztillált vízben, és azután defoszthríláltok. C1F alkalmazásával A kapott emésztett, defeszibrllált plazmidot.< lói) ng> iigáliuk I pg pHAIS, pHCIÖ, pH132l vagy p.Mli .DNS-fragmenssel, amely tartalmazza a humanizált vagy kimőra TRÁ-d nehéz lánc variábilis régiót kódoló DNS-t, amelyet szintén emésztettünk Hindii! és Apai restrikciós enzimekkel, a DAól Árgtoíoo O Fémion 2,ö (Takara Shuzo Co,, l-td,} alkalmazásával A hgáoiós -elegyet. azután £ unó JM109 bansztm-málására alkalmazzuk, amit: azután SÓ gg-ml ampioiiiint tartalmazó LB-agar csészékre széleszütok,
Aa ezzel sz eljárással előállított tomszánmánaokto 2 ml, 50 ggául ampieillint tartalmazó folyékony LB-tápkOzegben tenyésztjük éjszakán keresztül 3?·'€-οο, és azt kövelóe-n plazmid DNS-t estraháinnk a kapott tenyészetből az alksilkns-SDS eljárással.
Az extrahált plazmid DNS-t emésztjük Hindin és Apai enzimekkel, és 3% agaróz-gélelektroforézissel elválasztjuk, hogy igazoltok a humanizált vagy kiméra TRÁ-8 nehéz lánc variábilis régióját kódoló DHS-iazert jelenlétét vagy hiányát, A kívánt DNS-íragrnens vektorbeli mzerclelái és irányítottságát. DNS-szekvertálással Igazoljuk gőnszekvenola analizátor (,<$/ A/HőAÍ 37ÓÖ ÖXí ,<»e<yzer, Applied B-iosysíems) alkalmazásával. A kapóit expressziét; plazmtdnkát, amolyek a humanrzáit TRÁ-8 nehéz láncát kódoló cDNS-eket hordozzák, sorrendben pHA 15-1 -nek, pHC Ki-3-nak, nHD31-1 -nek ás pM 11-1 -nek nevezzük.
(4) Humanizált könnye láncokat kódoló vektorok előállítása (4,1) Bxpresszíős vektor előállítása a humanizált ellenanyag könnyű láncával (LMl-tlpusú)
Amint a 72, zzonosltószámó szekvencián bemutatjuk, a TRA-8 egér arái-lmmán-DRó ellenanyag kányává lánca amlnossv-szekvenelájáask: más ílpusá (LMl) humanizálása sortot a TKA-8 könnyű lánca am.inesavszekvenciájának, bí-temünáhsáíói számítva helyettesítettük a 3, amktosavar (v&hn), a 8. amínosavat (hístoídín), a 4, amlnosavat (bzin), a 10, amioosavaí (lenilalaulnj, s 11. ammosavat (metfoain), a 13. ammossvst (treomn), a. 28, amis-sósavat (szerin), a 4.2, ammessvst (gátiam:®), a 43. aminosavat (szerin), a óö, amlnosavat (aszparsgmssv), a 63. amlnoxavst (treoninj, a 77, anuoosavat (aszparagm), a 78. amlnosavat (valsa), a Só, ami«esavat (szerin), a 83. amlnosavat (leuoin), a 85. smtnossvat (aszparagínsav), a 87, amlnosavat (fönilalsum) és a 99, amlnosavat (ghcia), a 183. sniíaosavsi (leaoio) ős a KIS. amlnosavat (álanin) sorrendben giutamm, protm,
44szeri?,, »2«m, Isacis, alaaía, treoaio, ilzítí, alanín, szerio, széria, széria, leucla, prolin,· fe:aiiai;tnin, treonia, tírözia, giaáamía, valin és treosia ajttiaosavakkal. A kapott szekvenciát LM I -aek nevezzük.
A FRA-§ anb-feumán-DRS ellenanyag Ilyen típusú (LM1-típusú, 72, azonosítószámú szekvencia) hussaizált könnyű lánc amiansav-szekvenclált hordozó expresszíós vektorokat az alábbiak szerint állítjuk elő.
1) Ifetsumsxált TRA-S könnyű lánca variábilis és állandó régiósnak eSdállsiására alkalmas kóseiadítók szintézise (EMI -típusú)
Az L.MI polipspíldláocot (72. azonosítószámú szekvencia) kódoló DNS-t,. amely & TRA-S humanizált ami~DR5 ellenanyag könnyű lánc (LM 1-típusú) variábilis régiójának és a humán lg könnyú láncának <k lánc) feziója, FCR-ek kembmáóújásal szintetizáljuk meg.
A 7ALSP (47. azonosítószámú szekvencia), 7ALCN (48. azonosítószámú szekvencia), HKCBFl t <50. azonosítószámú szekvencia), ÍÍKCBR12 (Si. azonosítószámú szekvencia), HKCÖF22 (52- szenosttészácte szekvencia), HK.CDR22 <53, azonosítószámú szekvencia) és HKCF12 <54. azonosítószámú szekvencia) mellett oz alábbi oligennkísorió. lártciadhóí szintetizáljuk meg a FCR-hez:
á'-gteeceeaea gatgcagaea aagaacttgg agait,gggtc atcígaatgt eaeeaglgga-3' (HK&RR1.2: 77. azonosító» számú szekvencia),
2) A pORSJ/EM 1»2 ptaníá előállítása (humaaiaátt TRA-S EMI-típusú könnyű láncának kiónozáss)
A 72, azcmosítószámó szekvencián bemutatón aminnMv^tekvemdáí kódoló EMI DNS-frag^tenst kétlépéses PCR-rel állítjuk ciá, pbtassíd vektorba ísaeriáljük, és £, cí?(Aban klónozzak.
a) Első PCR-iúpés
Az LMi-Fl DriS-fragtnanst, amely a szekréció» szlgoálszefevenciát és FRLj-résúót kódol Hisdlii restrikciós enzim hasítási hellyel az 5’ véghez adva. állíteú;: etil az alábbi kőrőlmények kézéit. A pHSGRMd.7 és pSRFBHH templáí plazmídot az BP0W981Ú Al. számú, európai szabadalmi bejelentés leírása alapján állítják Hó.
A reakeiódegy összetétele sz alábbi: pHSGHMl? plazreíd DNS, 25 ng 7A.L1P íúlgoítsksetaid-láociadiió. SÖpusoi HK.SPR 12. oiígs>oukleotíd-i'áocínditö, 50 pmoi dRTF koktél, 5 pl ídx PCR-.po.ITer, 5 pl
ONS-polímeráz(Perklo Elmer), 2,5 egység
A fenti összetételű reakcióelegyet 50 pl végtérfegatra áilísjHk be desztillált víz hozzáadásával, és PCRben alkalmazzak.
A PCR tcrmális körülmények melegítés 'S^C-on 2 percig, ami után az alábbi 'ciklust RtrtHeljtík 30 alkalommal; OÓ^C-on I perc, $5*C-on 1 pere és 72sC-on 2 perc, majd melegítjük ?2X»oa 10 percen keresztül.
Az FRtj egy részletét, CBRLj-ct, FRErt és CDR.tr t kódoló LM1-F2 DNS-fr&gmenst az slúbbí kbrH menyek között állít jtsk elő.
A reakcióelegy összetétele az. alábbi:
pt28. plazmid BNs. 25 stg
HKCDFl 1 oligooukleotíd-lanoisváltó, Söpörni
HKCDRf 2 oltgouíádeotíd-lóoeináRó, 5íl pmol áNTP koktél, 5 μΐ I öx PCR-pnfSer, 5 p.1 stevy?í;Tí?p· DNS-pölimeráz, 2,5· egység ,A fenti: összetételű reakcióelegyet 58 μ! végtérfogaira állítjuk be desztillált viz hozzáadásával, és PCRben alkata asszuk,
A PCR termába körülményei: melegítés fertC-on 2 perig, süni utas az alábbi ciktes: ismételjük 30 alkalommal; fefeC-on 1 pere, 5:5öC-on 1 perc és 729C-or 2 perc, majd melegítjük ?2öC-on 18 percen keresztül,
A CÖRtj-t, FRiU-sl és a CDRU egy részletét kódoló LMi -F3 DNS-bagmessi as alábbi körStaényok között állítjuk elő.
A teofceíöelegy összetétele az alábbi:
pSRFDHH plazmád DNS,.25 ng
HKCDF22 oligímukieotid-láncladliö, Sű pjoof
HSCDR22 oligonukleoljd-iáneindltó, 58 pmol dNTP koktél, 5 μΐ iöx PCS-pa.l':fer, 5 gl íteípbTöí? DNS-poilmcráz, 2,5 egység
A fenti összetételű: reákeióelegyet 5Ö μΙ végtérfegatra állítjuk be desztillált víz hozzáadásával, és FCR'ben alkataaazuk,
A PCR termáíis körülményei: melegítés 84X-«r 2 percig, ami uláo az alábbi ciklust ismételjük 30 al·» kálómmal: 74ο€-οη 1 perc, 55 A>on 1 pere és ?2sC-on 2 perc, majd melegítjük 72’C-os IS percen keresztit!.
Á CI>RL;;~at, RRL.rst és zz állandó regiöt a 3’ végen egy EcoRl restrikciós enzim hasítási hellyel tartalmazó LM1 .-F4 DbiS-fetsgmeust az alábbi fcöhtaények között állítjuk elő,
A reakcióelegy összetétele az alábbi:
pSRPDHH plüzndd DNS, 25 ng 'HKCF12 öiigömikleoódXáacintfeó, 58 ptnól
7A1XN oisgonnkfeotid-iátsclttdííö, 51) praol dNTR ktskléL 5 pl ! 8x PCR-puffet, 5, pl
«.tepíí Pog DNR-poiirneráz, 2,5 egység
A festi összetételű reakcióelegyet 58 gl végtérfogstrs állítjuk be desztillált víz hozzáadásával, és PCRben átkelmázzuk,
A RCR termáíis körülményei; melegítés feTC-em 2 percig, ami után sz alábbi ciklust ismételjük 38 alkalommá!: feíe€~eo 1 perc, S5~C-en 1 perc és 72T-on 2 pere, majd melegítjük 72eC-on 18 perced keresztel..
Az ampliískáií DNS-rragmenseket a PCR után 5% poliükrílamld-géíclektroferézisscl választják el. A gélt az ele kiró ferézis utas 1 ag/ml etidinm-hromlédal festjük az előállított DNS UV-feoy alatti detektálásához. Az így detektált megfelel ó DNS-cslkokat pengével kivágjak.
b) Második POt-lépés
Az LMi-DNS-t, amelyben a fent leírt LM i'-Fl-DNS, tM.l~F2-.DNS, LMI-F3-DNS és LM1-P4-DNS iragmensek fezíonáltatva vannak, az alábbi körülmények között állítjuk elő.
-óöΛ reakclóelegy összetételé az alábbi:
Az ebi EGRAépésben előállkcü LMl-Fi-DNS gélfiragorense,
Az első PCR-lépésben előállíteö LMI-F2-DNS gél&ugewse,
Az első PCR-iépésbeo előállított LM1-F3-DHS gélftagusense,
Az első PCR-lépésbeo előállított LM I -.F4-DNS géllragínense
TAGIÉ öllgooukleotld-láscmdltó, 50 pmcl
7ALCN nligonukböíid-iánchtoltó, 50 psnol dNTP köktől· 5,8 μ!
Wx PC&-pu»er, 5 pl
DNS-poiimeráz, 2,5 egység
Á. fenti összetételi reakcióelegyet 50 μΐ végtérfósaíra álllijuk be desztillált víz hozzáadásával· és FCRben alkalmazzuk,
A PCR termális körülményei: melegítés 94*C-on 2 percig, ami után az alábbi ciklust ismételjük 38 alkalommal: toPC-on 1 pere, 55U3-öü 1 pere és 72eC-on 2 perc. majd melegítjük 727C-O» 18 perces kérésztől.
Az Így. előállított LM'l DNS-Sagmenst a pCR3,l ptozmiöba inzertáljuk £sí.£í?;y<üré £4 dWeg O (híVits'öges) alkalmazásával a gyártó utasításait követve, ős bejuttatjuk a reogcuskósztotbcn lévő kömpeiens £. «dl TÖFOT' sejtekbe, A humanizált TRA-8 könnyű lámát (LMlAípnsü) kódoló ezen DNS-ek nakleotiászek vem;iáját Igazoltok a dideoxi módszerrel (Sanger, F.S. ős mlaai., Ftoc. Natl· Aead. Sci, USA 74, 5403-5467. old. 0977$, 3700 ££4 ✓Ua/yser alkalmazásával (AB/ P&fSM Perkin Elmer Applied Biusystems, .Ispán).
A kapóst plazródötp€R3.i/LMt-2-nek nevezzük (a humanizált TRÁ-8 kősmyö. lánc (GNG-típusú} variábilis régióját és humán lg .könnyé lánc állandó régióját kódoló e:DNS-t hotdöző piazmid}.
Az LM! DNS-fragsneast tartalmazó pCfCviZLMi-2 piazmidot emőaztjük Hindii! és FcoRl restrikciós enzimekkel· gg pHSG388 klóntszó piazmid DNS-t emésztünk Hindin és EcoRI restrikciós enzimekkel, és azatán deíbszfaí látjuk ClP-pel, A kapott áefaztdriiáh pHS>G399 DNS-t és a Nindill és EcoEI restrikciós enzimekkel emésztett ENH DNS-lrasmtmsi összellgáljaR a ££4 Glgmlon Aú itofatm 2.7 (Takaró Shozo €o., kid.) alkalmazásával· Azután E, «dl DHétr sejteket transzformálunk a. ligáit DNS-sel, és 8,1 ®M ÍPTG-k 0,1% X-Cal-t és 50 pg/nd klorsmaemkölt tsrtu&naző LB-agar tápközegre szétoszt jük (végkotseentmctok}. A kapott fehér transzfermánsöfcat 58 ng/ml kíommíemkelt tartalmazó folyékony LB-tápkózegben lenyészíjbk, és piazmid DNS-t extraháltunk a kapott tenyészetekből az slkaltkus-SQS ellátás szerint Az extrahált piazmid DNS-t emésztjük Hindin es EecK! enzimekkel, ős azután kiválasatsnk egy LM! DNS-lragmenst hordozó kiónt 1% agarózgótolektrofórézlsse I,
A fenti eljárás eredményeképpen előállítjuk a humanizált TRÁ-8 LM1 könnyű lánc variábilis régióját és humán igK lánc állandó régióját tartalmazó ráziós rragmenst imrátmö pHSölM 1-2-2 ptehídot Az ezen ptaoidot hordozó £ col; Sranszfőrmánst --amelyet £ col; DH5u/pHSölMl-2-2~nsk nevezünk - létéibe helyeztük sz „International Patent Orgaaism Deposítary, National Instimte of Advanced Indnsiríal Science and Technology” tntézeíoál (1*1, Hígashi 1 choste Tstfehs-sht, Ihasukt-kes, 385-5408, Jspanj2ó8G aprítss ,20-aa a ínikröorganlzmusők letétbe helyezéséről szóló Budapesti Szcrzones szerint, és a FÉRNI BP-7s62 létéit számot kanta.
3) A pSR/LMÍ-2 piozsttid elöáiiitása (h»ma»izéM TRA-S Lőll könnyű lénaot kódoló espressxiós plazmiál
A Imsoonizált Tk.A-3 EMI könnyű lánc variábilis régióját és husnán lak lánc állandó régióját tartalmazó rézaós íragtnenst heréozé pHSG(M 1 -2-2 plszm.iáot emssztjills: iliítólll és EeoRi restrikciós enzimekkel.
pg pSRPDHH plarsid DNS-ι (EP 0 909 Sió Ál. számú európai szabadalmi bejelentás) emésréíMk Hindill és EcoRl restrikciós «szintekkel, és azután deiksszúnílá^nk ClR-pel, A kapott dcóíszforílált pSRPÖHH DNS-t és a pBSG/k-i I-2-2 prézsmóból előállítod Dindlll-EcoRi DőiS-Ragmesst összehgajrék a £kV.-i £^ariö« R7í fesííw? 2.8 (T&ksra Síuzo Co,; ktd.) alkalmazásával. Azután £. erét' DílSn sejteket transzformálunk a ligáit DNS-sel ás LB-agarr& szélesztiűk. A kapod ranszrérmánsokai 100 pg/ml atnpícillmt tartalmazó Rdyékony Llitápközegbes tenyéssíjilk, és píazmid DNS-l exíraháhmk a kapott tettyészsrékbői az aikalikas-SDS eljárás szerint A pSRPÖHH vektorban lévő kívánt Í>NS~írégmess inzercréláí ás Irányítottságát DNS-szokvenálással igazol jttk génszekvencsa analizátor alkalmazásával.
sk kapott exprcssslős piastnldot, amely a bnmaalzált TRA-8 EMI könnyű láncát kódoló cDNS-í hordozza. pSR/Lhil-2-nek nevezzük.
(4-2) Expressziós vektor előállítása a htsmanizált ellenanyag könnyű láncával (LM3~trp«ső) .Antim a 73. azonosítószámú szekvencián bemutatjuk, a TRA-8 egér aoíl-hvmán~DRS ellenanyag kör,νονό lárma arniöosav-szskvepeíálsísak más típusú (LM3) híimatiizálása során a TRA-8 könnyű lánca aminossvszekvetsciájánsk N-termlnállsatól számítva a S. stnlnosavat (hlsztldré), s 9. ísminosavat (kain), a 10. ammosavm (hmllalímin), all. aminoxsvat (yjaíionln), a 13. amisosavat (treonla), a 28. sminoszvat (széria), a 42. amlnosavat (glytamm), a 43, ammosa var (szedni, s 77. .aminosavat (a»zpsragiy), a 78. aminosav&t (valin), a 80, aminosavat (szerin)., a 33. aminosavat.(leacíp), a ÍS, aminosavat (aszpaj-aginsav), a §7. sminossvat (ienilalsoml, a 99. ntninosavoi (glícln), a 18.3. amim-soval (lenem) és a 18.3, atniatovak (alanre) hréystissdcdílk sorrendben prolin, szerré. széria, lesein, aitmln, treottré, lizln, alssré, szerré, leucin, poréin, rémlalaois, treonré,. Erózió, glrésmiy, v&lrn éstreonm amlnosavakkal. A kapott szekvenciát thö-nak nevezzük.
A TRA-S asti-humán-DRS ellenanysg ilyea tipysű humanizált könnyű lánc nariyossv-szckveneláit <LM3-tlpoxú, 73. azonsK'líász&nú szekvencia) hordozó expresszlós vektorokat az alábbiak szerint álliijyk elő.
1} Humanizált TRA-§ EMS körmyü láncásak variábilis és állandó régióinak előállítására alkalmas lásseinditök szintézise
Az EM3 pollpeptidkrécöt kódoló DNS (73. szunoslsöszárnó szekvencia), amely a TSÁ-S humanizált aati-DR5 eilemsmyag variábilis régiójának, és a insnán lg könnyű láncának (te lánc) fúziója, PCR-efe kotybínácréjávai szistréizáljtík meg,
A 7.A.LIP (47, yzooositőszámó szekvencia) és 7ALCN (48. azonosItószámú. szekvencia) mellett az alábbi ollgonukleodd lánernditökat szistetizáljyk meg a FCR-bez:
S-arétsgttct csgagaigga gacagaescs siceigetat ggglgrégct gete’gggtt eeagg-3’ (MÓDIÉI; ?í. azonosűőszúmű szekvencia):
á'-eageaoecat agcaggattg tgletgtcíe caíeíctgag aaetttgatga gaggstgréi cttaagctl-3* (MÖD1R1; 79. azonos ítószsms szekvencia):
E-réceaciggt gaesítgtga ígseccaaíc tceaagttet ttgtclgcal ctgtggggga cagggte-3' (MOD1E22; 30. azonosítószámú szekvencia):
-6 b5-aettggagst tgggteaíca castgtc&cc agiggagcot ggaacccaga gcag-3* (MÖD1K22; gl. szonosítöszámá szekvencia);
5’~accatcacct geaaggecag tesggségtg ggtsetgetg tagcctggta ccsac&gaaa ccaggaa«3! (MÖDIF3; 82, azonos (tőszánté szekvencia);
S’-tscsgcagta eccacafeeí gttcíggceti gcsggtgtüg gtgsceetg: cececacags tgcagaeaaa gs-3' (MOD1R3; 83. azortösóőszámó szekvencia};
S’-a&geacecaa aetcctcatc tsütgggeal: ecacccggca cactggggto ceagatsggt ttacaggeag t-31 (MÖD1F42; 84. azon osltoszá’ná szekvencia);:
S’-sccagtgtgc cgggtggaig cccaatagat gaggagtttg ggtsctttte ctggtttotg Aggtaceag gc-3* (MOD1R4; 85. azímoslíőszáinó szekvencia);
S’-gggmtggga cagaettcsc ectnaceatn tetagtcígc agccggagga ttttgcaacc íaí-3’ (M0D1F5; 86, sznnosRoszáma szekvencia);
S’-actagagatg gssaggstgs agtctgtccn agaoncaetg ectgsaaaec taíctgggac-3’ (MODIRS2; 87, azonosánszámó szekvencia);
SMaeígícage aatatagcag eíatcggacg öeggtcaag gcacoaaggt ggaaaíc-3' (MOD1FS; 88. szonosőőszásnö szekvencia);
5-sgfcegatag ctgcíaímt gstggcagis aísggíígca sastnctncg gn;geac-3’ (MÓD 1 RÓ; 89)
S’-saseggaetg íggetgcáec afetgtette atcöccegp cstctgatga g-3’ (M0D1F7; 9Ó, azonosílóezámó szekvencia);
S’-gaagaígaag acagasggtg cagccacagt ccgtttgaö mcancíígg tgeettgace gaa-3'' (MÓDIK.7; 91. azonösitészémó: szekvencia); és
5’~agartteaae tgctcatcüg atggcgggaa (ERI?; 101, azonostíőszmnó szekvencia).
2) A pGR3.VlM3~3-44 pbzmld előálbtása (bamaataáR TRA-8 EM3-tlpnst) koaayrt láneőnsk klónozása)
A 73, azonosítószámú szekvencián bemutatott ammösav-szekvenciát kódoló EM3 DKS-Daamesst kétlépésos RCR-reí állítjuk elő, plazmíd vektorba mzertáljuk, es £ cnA-ban klónozzuk.
a) Első FCR-lépés
Az 5' végen hozzáadott HináfH restrikciós enzim hasítási helyet tartalmazó szekréciós ssignslszekvem cíái, FRLret, CDRLs~«k FRErt és CÖRE24, FRl-s-ap CDRLj-at, FRU-et és az állandó régió egy részletét tartalmazó LM3-F31H ONS-ftagmenst az alábbi körülmények: között állítjuk eló.
A reakcsóeiegy összetétele az alábbi:
MDDIF1 öiígomiklsíAld-láncmáitó, 5 pmoi
MÓDI RÍ oiigoöukleotid-láncmáitó, S pmel
MÖD1F22 oíigonukleotid-iáneindiió, $ ρηχοί
MOD1R22 olignnokleotld-láncinditó, 5 ntnoi
M0D1F3 ohgomskieotld-láncináitö, 5 omol
MOD1R3 oiigönnkieoÖo-láöelndilb, 5 pmol
MOÖ1F42 öligönukieetld-láseindkó, 5 pótol
MÖDhRé oilgömikkötid-lánciodité, 5 ptnoi
-63MÖDIF5 cllgonakleotid-lármlndkő, 5 pmot
MOD1R52 oligonnkleetiá-láncmáite, 5 pntol
MÓDI Fő «Hgenokleötld-láncfeditá, 5 pmol
MÖDIRő obgonubfeodd-Íáscmdhó, 5 pmol
MODIF? ollgontfeleetid-láncmdité, Söpmel
MÖO1R? olígö$uikfesd<Másteítekót 5 pmoí '7ÁL1P oligonokleobd-taclnditö, 58 pmte
KI? obgonskteotid-láotenádá, $0 pmol áNTP koktél, S pl ;Öx FCR-pufter, 5 te ííííjteíTíS^ iöNS-pollmeráz, 2,5' egység
A festi összetételű maheiéelegyet 58 pl végtérfegaíra ádiíjuk be desztillált víz hozzáadásával, és PCRben alkalnsazzuk.
A PCP termőlis körülményei: melegítés $4®Ú«on 2 percig, ásni után az alábbi ciklust: ismételjük. 38 alkalommal: 94€-o« l pere, SS*C-ea í pere és 72®C-ea 2 perc, majd rstesgiijbk TS'^C-on 8 percen keresztül.
Az állandó régió egy részletét a 3’ véges egyJEcoRI resíríkciós enzim hasítási hellyel tartafnwA LM3F31C DNS-fragötenst az alábbi körülmények .között áldijtes elő,
A pSRPDHE tesnplár plazmádét az SP 0309816 Al, szánté enrópas szabadalmi bejelentés leírása -alapján állítjuk elő.
A reakcióé légy összetétele az alábbi:
pSRPDHH plazma! DNS, 25 ng
MÓD 1F7 olígonukleotíd-lánclmlüő, 50 pmol
7A.LCN oligonnklentid-lánclnditő,. 56 prnol dNTF koktél, 5 gl
8.x. PCR-puf&r, 5 pl omp&To? DNS-pnlimeráz, 2,5 egység
A fenti összetételű makelóelegyet 58 pl végtérfogatra áteijuk be. desztillált. víz hozzáadásával, és FCRbes alkalmazztár,
A PCR termális körülményei: melegítés §4*C-on 2 percig, ami «tán az alábbi ciklust ismételjük .38 alkalommal: 94uC-on 1 pere, 55®C-ön 1 perc és ?2s-C-<nt2 perc, majd melegítjük ?2CC~oo 18 percen keresztül.
Az amplífíkált DNS-ímgmeaseket a PCR teán 5% poliakritemid-gélefeteroferézssste választjuk te- A gélt az elektroförézis utáa 1 pg/ml etláintn-hromíddaí festjük az előállítóit DNS OV~feay alatti detektálásához. Az igy detektált megfelelő DNS-cs&okat pengével kivágjuk.
b) Második FCR-iépés
Az LMS-DNS-t, melyben a fent leírt LM3-F31B és LM3-F31C DNS-firagmensek íbzioná'katva vannak, az alábbi körülmények között állítjuk teó.
A reakciőélegy összetétele az alábbk
Az első FCR-íépésbea előállított LM3-F31S-DNS gél&agmensc,
Az első PCR-lépésben előállított LM3-.F3 IC-DNS gélftagmense, ?AC I P oiígrmukíeotid-láncíndíté,. 50 pmnl
7ALCN' ollgonokfemáí-lásefoditó, SŐ pmol dNTF koktél, 5,0 pl Í8x PCR-pnfihr, 5,0 pl ompöTág ÖNS-polimetáz, 2,5 egység
A fenti összetételű reakcióelegyet SŐ pl végtérfogztra állitiok be desztillált víz hozzándásávsl, és kükbe a alkalmazzuk,
A FCR termállá kbrühnésyeh melegítés 94sC-on 2 percig, ami atán az alábbi ciklust ismételjük 30 alkatommal: 94uC-on I pere, 35°ϋ-οη I pere és 72;'C-o« 2 perc, majd melegítjük 72-C-on lö perces keresztül
Az igy elöállslotí LM3 DNS-iragntenst a püfol! plaxandbe iszettúljök .bkwycáíe ΓΑ cámöíg O (tsvltrogeu) alkalmazásával a gyártó utasításait követve, és bejuttatjuk a reagenskésxleíbcn lévő kompetens: él ödí TORÖF' sej tekbe. A aomsnizált TRA-S LM3 könnyű láncát kódoló ezen DNS-ek mfeleot id-szek vese iáját Igazoljuk a dáleoxi módszerrel [Bangón, F.S. és mtsai,, Proc. Mari. Aead. Seb USA 74,5463-5467. ölő. (1977)], J/W jöAbí Armíyze?- alkalmazásával (,4S/ TRlSáá Porfel® Elmer Applied Biosysíems, éapan),
A kapod phtzmiőöi p€R3,!TLM3-44-nek nevezzük (a humanizált TRA-S LM3 könnyű lánc variábilis régióját és humán lg könnyű lánc állandó régióját kódoló eDN'S-t hordozó plazmid).
Az I..M3 DNS-iragmenst tartalmazó p€R3.ULM3-3-44 plazmídot emésztjük Hindiül és EcoRI restrikciós enzimekkel.
1: pg: pHS<53Ö§ klónozó plazmád DNS-t emésztünk Hindiül' és Eco'Rl restrikciós enzimekkel, és azután defoszferíláljukÜÜP-ptd. A kapott áefeszferllált «1180399 DNS-t és a Hindin és EcoRl restrikciós enzitnekkél ««észtéit LM3 DNS-fragmenst Összeiigábuk a DAO áigmfon O ífersfen 2.9 (lakúra Shuzo Co.x lód,) sikalmaznsával. Azután £. «>/? 13:115«. sejteket transzformálunk a ligáit DNS-sel, és 8,1 mM IFTO-t, 0,1% X-üál-t és 50 Ag/ml kíoramfenikolt tartalmazó LD-agar tánkőzegre széleszijük (végkonccntráelők), A kapott fehér transzformánsökat 5Ö pg/ml kloraínfenlkoh tartalmazó folyékony Τ,Β-tépkÖzegben tenyésztjük, és plazmid DNS-t extrabáhrnk a kapott tenyészetekből az sikaÜlkos-SDS eljárás szerint. Az extrahált: plazmid DNS-t emésztjük Hindii! és EeoRI enzimekkel, és azután kiválasztunk egy U43 DNS-tragntensi: hordozó klónt 1% agarózgélé isktroforézissel.
A fonti eljárás eredményeképpen előállítjuk a humanizált TRA-S LM3 könnyű lánc variábilis régióját és humán IgK lánc állandó régióját íartaknaző fúziós üragmenst hordozó pHSÖ/M3-3~22 plazmídot. Az ezen píazntldót hordozó £, «őr tesz&nmmt - amelyét & co/í DH5s/pHSü/M3-3-22~nek nevezünk - letétbe helyeztük sz .„imemational Patent Organism Depesitsry, National InsdtrUe ot Advanced Indnstrial Science and Technofogy” intézetnél (1-1, Higssbl I chonte Tsukuha-shk fosrakü-ken, 3Θ5-54§ό, Ispán) 2001. április 2foán a mikroorganizmusok letétbe helyezéséről szóló Budapesti Szerződés szerint, és a FERM BF-75Ó4 letéti számot kapta.
3) A pSE/tM3-3-44-IÖ plazmid előállítása (humanizált TRA-S L.MS kdnnyn láncot kódoló expressziós plazmid)
A hmnamzáit TRA-8 IMS könnyé lánc variábilis régióját és humán IgR lánc állandó régióját tartalmazó fúziós hágómmá hordozó pHSGZM3-d-22 plazmáid emésztjük Hindii! és BcoRl restrikciós enzimekkel,
I gg pSRPDHH plazmái DNS-t (SP 8909kló Al. számú európai szabadalmi bejelentés) emésztünk Hindi t! és BcoR.1 restrikciós enzimekkel, és azuatn dafossfoználjuk ClE-pel. A kapok defoszfordált pSRPÖBH DNS-t és a pHS<3/M3-3-22 plazrn.idbói előállított klindlll-BcoRl DNS-l'ragnteasi össze! igáljuk a .ŐA',4 Z,(g®tö»í
-71-A7?‘ 2.1? (Takara Shuzo Co., IM) alkalmazásával Azuíáa £, col? DHSa sejtekéi irassztorínálunk a ligáit
DMS-sei és LB-agarra szélesztjúk, A kapott imszfonaáasokat löd pg/ml smpieíniot tartalmazó folyékony L(3tápkössgbea tenyésztjük, és plazmld DNS-t exímhálunk a kapott tenyészetekből az atalikes-SDS eljárás szerint, A pSRFOHH vektorban lévő kívánt D'NS-íragwss iuzerciöíát é& irányítottságát DNS-szekvenálással igazoljuk gériszekvencia analizátor sikalmszásávai (.40/ /öTáRA) 3779 DM4 Λκφο; Applied Biosysíetns).
A kapott exgre&szíós plazmídot, antely a .tetnanizőit TRA-8 LM3 könnyít láncát kódold -cDNS-í hordozza, pSR/LM3-3-44-W-8«k nevezzük.
(4,3) Expressxiós vektor előállítás* a humanbált ellenanyag könnyű láncával (LM4-tipusú)
Amint a 74, azonosítószámú szekvencián hsnmtsiitsk, a TRA-8 egér snii-línnm-DRS ellenanyag köttynyü lánca amioosav-szckvenciájáuak naás (LM4 típusú) humanizálása során a TRA-8 könnyű lánca aminosayszekvenc Iájának híAsrmíoállsától számítva a 8. aminosavat (hisztióln), a 9, aminosavat (ilzlu), a 1Ö. aminosavat (tórribisnio), all, aroúnosavat (metiööb), a· 13. aminosavat (treonln), s 28. aminosavat (szerin), a 42, wincsavat (gltitamiu), a 43. aoritioxavat (szerin), a 77. amlsösavai (aszparsgls), a 78. amirmsavat (valirs), a '80. aminosavat (szerfn), a 83,. ammosavat (feassa), a 85, azotöosavat (aszparagmsav), a 99, aminosavat (altom), a 193. aminosavat (ieucí.n) ás a 108. aminosavat (alanin) helyettesítettük sorrendben prolin, szerfa, szerfa, lesein, alama, trsonin, ilzlu, alsóin, szerin, ienein, prolin, rcnllslamn, treonin, glotsmm, vall® és treosin aminosavakksi, A kapott szekvenciát i„M4-nsk nevezzük,
A TRA-8 ont!-btnnán-'DR.S ellenanyag ilyen típusú (1..M4) humanizált könnyű lánc aminosavazekvendást (74, azonos ítdszámó szekvencia) hordozd expresszios vektorokat sz alábbiak szerint állítjuk elő,
1) Hnnmnszáft TRA-8 LM4 könnyű láncának variábilis ás állandó régióinak előállítására alkalmas láncsodttók szmtáxiss
Az LM4 pokpeplidláncot (74, azonosítószámú szék verje la) kódoló DN'S-t. amely a TRA-8 humanizált sntl-DRS ellenanyag variábilis régiójának és a humán lg könnyű lármának (x lánc) fúziója, ECR-ek kombinációsával szintetizálunk,
A 7AL1R (47. azonosítószámú szekvencia), 7ALCN (48. azonosítószámú szekvencia), MÖD1FI (78, azonosítószámú szekvencia), MÖITIRI (79, azonosítószámú szekvencia), MODIF22 (Só. azonosítószámú szekvenciái, MÖD1.R22 (31, azonosítószámú szekvencia), MODIF3 (82, azonosítószámú szekvencia), M0DTR3 (83, azonosítószámú szekvencia), MÖD1F42 (84. azonosítószámú szekvencia), MÖD1R4 (35. az©~ oosttószámú szekvencia), MÓDI Tő (Só, azonosítószámú szekvencia), MOÖÍR52 (87, azonosítószámú szekvencia), MÓDIT? (90, azonosítószámú szekvencia) és MQD1R? (91. azonosítószámú szekvencia), ERI? (IÖ1, azonosítószámú szekvencia) mellett az alábbi oligenaklcotid láncmdúökat szistelizáljuk meg a TCR-hez:
ó'-űctgtcagc aatatagoag ctateggacg ttcggicaag gcaccaaggt ggaastc-3' ÓMÖBÍTŐ2; 92. azonosítószámú szekvencia)
S'-cgtcegaisg eiscűitatt gctgacagaa síaggítgca aa&teelccg getgcag-3y (MOD1RŐ2; 93, azonosítószámú szekvencia)
2) A p€R3>VkM'4-S-3 plazsnid előállítása (hurtmrírzáfl TRA-S LM4-típ«sű könnyű láncának klónozása)
A 74. szoöosiiószúmó szekvencián bemutatott andrmssvvszekvenclái kódoló LM3 DNS-Ragmenal kétlepéses PCR-rel áll ltjuk elő, plazmld vektorba hszertáljuk, ás .£, cmT-ban klónozzak.
a) Első PCR-lépést
Az 5’ végen hozzáadod Riadni restrikciós' enzim hasítási helyet tartalmazó szekréciós szigíteiazekvettcsa régiót, ERte-ei, CDRLs-et, PRLM és CDR.I..rt, FRLrat, CDRU-at, FRU-et és az folaadó régió egy résztelét tartalmazó LM4-F418 DNS-lhigmenst az alábbi körülmények között állipek alsl
A reakcióé légy összetétele az alábbi:
MÖD1FI eügmukleotid-fecsndlló, 5 pmol
MÖD1RI ni igotíaklmaíld-iánc indító, 5 pmol
MöEH F22 edigontikleotid-tetteindító, 5 pmol
MOD1R22 ongomíktentld-láscutditö, 5 pulcsi
MÖD1F3 öllgonukteníkl-láttcindkó, 5 psnoi
MOD1R3 oltgonakleottd-láscíndttó, 5 porol
MOD1F42 oligönuktemid-lánefedlíö, 5 porol
MÓDIRA oltgottökleeiid-iáítcmditó, 5 porol
M0D1F5 ctligcínaktecftiddánctnditö, 5 ptooi
MÖDIR52 öíígosnkteotid-lásdndlíó, 5 porol
MOD1F62 criigonttkleotiá-lánc indító, 5 pmol
MOO1RÓ2 öiígoonkteotid-iáítemdltő, 5 pírmi
MÖD1F7 niigonukleotid-láaclndltö, ód pmol
MÓD ÍR? ollgonukleotid-lánclnditó, 5 praoi
TÁLiF öbgCHíakíeotld-tencmtisó, 58 psnte
I..R i? oHgomtkieotid-láoetsdlló, 58 pmol é'N'I'F koktél, 5 ;al lOx PCR-paíter, 5 pl ízmpteFby DNS-pciismeráz, 2,5 egység
A fenti összetételi reakcíöetegyet 50 ni végtérfegatra telítjük be desztillált vte Imzztetdásávai, és Főkben alkalmazzuk.
A PCR tcrmálls körülményei:: melegítés teteC-on 2 percig, ami átért ez alábbi ciklust Ismételjdk 38 alkalommal: W’C-on 1 perc, 55*C-on 1 perc és 72’C-on 2 perc, majd melegítjük 72®Ο-οη 18 percen kérészeiül.
Az állandó régió agy részletét a 3' végen egy ScoRl restrikciós enzim hasítási hellyel tartalmazó LM4F4IC DNS-lragmcnst. az alábbi körülmények között álhitük aló.
A pSRPDHR tempiál plazmídot az. FF 89898ló Al. szánté európai szabadalmi bejelentés leírása alapján állítjuk sió,
Á retskcíöelsgy összetétela az alábbi:
pSRFDHH plazmíd .DNS, 25 ng
MÖD'IF? csiigonükleotid-lánclndtto, 58 pmol
TALON oligöítnkteoiid-láiíCmdiié, 59 pntel dN'FP koktél, 5 pl
I8x FCR-puffer, 5 ni mrízdD'ng lÓNS-peiimeráz, 2,5 egység
A tenii összetételit reakciéclegyet 50 pl végtérfegatra állítjuk be desztillált vtz hozzáadásával, és FCRItetí alkalmazzak,
A PCR te«&a-hs körttiménys!: melegítés: 84°C-e8 2 percig, ami után aa alábbi ciklust ismételjük 3fí alkatommal: 94®C-en I perc, 5FC-ou 1 nem és 'T2öC-en 2 pere, maid melegítjük 72öC*ea 10 percen keresztül,
Az amplnikátt DNS-Iragnmnseket a PCR ötén S'% poiiskriiasrtid-géleiekíroOrrézissei választjuk el. A gélt az eiektrtdbrézls mán 1 pg?ntl eddmm-brmniddsl festjük az előállítóit DNS VV-Fény afen? detektálásához. Az így detektált megfelelő DNS-csikokat pengével kivágjuk,
b) Második FCR-lépáa
Az LM4-£>NS”t, amelyben a feni leírt LM4-F4IB és .LM4-F41C DHS-fegsrsensek feziwákaíva vannak, az alábbi kdrdlufersyek között állítjuk elő.
A renkclóelcgy összetétele az alábbi:
Áz első FCR-fepésbeo előállítod LM4-F418-DNS géiiragtnesse.
Az első FCR-lŐpésimo előállított LM4-F41C-DNS géiiragmeuse,
7AL1F oügonukleotió-láncinditó, 58 gátol
7ALCN oiigonukfeotid-iáncindiíő, 50 pmoi dNTF koktél, 5,8 pl IOxFCR-pufier,S,öüI míspő'Tk^ UNS-poiimeráz, 2,5 egység
A fenti összetételű re&kcióelegyet 58 pi végtérfogatra állítjuk be desztillált víz hozzáadásával, és FCRben alkalmazzuk,
A FCR termáik körülményei: melegítés foCC-on 2 percig, ami után az alábbi ciklust ismételjük 30 síkidommal: feUC-on 1 perc, SS'C-on 1 pere és 72;;C-on 2 pere, majd melegítjük 72*€-o® 10 percen keresztül,
Áz így előállított LM4 DN:S-fragm«nst a. pCRS.l plazmidbs ínzerláliük Síárnyorto Út uümmg O (lovidugetrt aikakoazásávai a gyártó utasításait követve, és bejuttatjuk a reageoskészfetbes lévő kompetens £, uíjÁ TOF18F' sejtekbe, A humanizált TRA-S LM4 könnyű láncát kódoló ezen DNS-ek nukleotiá-szekvenoi^át igazoljuk a dideoxi: módszerrel [Sanger, F,S. és mtssi., Froc. Natl. Acad. Sci, USA 74,5463-5487., old. 1197711, 5788 UAU X««b-zíw alkalmazásával (48/ F/HSAí; Ferkkt kimer Applied Hiosvaiems, .lapun).
Á kapott plazmáiét pCR3,ULM4-3-2-nak nevezzük (a hunntmzáif TRA-0 tM4 könnyű lánc variábilis régióját és kantán lg könnyű lánc áüandó régióját kódoló cDNS-t hordozó plaztntd),
Az 044 DNS-fragmenst tartalmazó pCR3, VLM4-5-3 gktzmldot emésztjük Hindii! és EcoRi restrikciós enzimekkel, pg pHSGSŐü klónozó plszmid DNS-t emésztünk Hindiit es EcoRi restrikciós enzimekkel, és azután, defosztbriiáijyk CIF-pel. A kapott defoszibriiált pH3G39$ DNS-t és a Hindin és BcoRÍ restrikciós enzimekkel emésztett LM4 DNS-fósgmenst. összeligáijnk a ÖAU átgobon tód iz«rj?ö« 2.Ó (lakúra Shozo Co,, idd.) alkalmazásával, Azután A, col? Dl-Iáa sülteket transzformálunk a ligást DNS-sek és 8,1 mM IPTG-t, 8,1% X-Cai-t és 58 ug/ml kferamfeaikoit tartalmazó LR-agar tápkózegm széleszljnk fvégkoncentráeiők). A kapod fehér trasrszformánsokat 50 ggúul kioramíénikok tartalmazó folyékony EB-Iápkőzegbsn tenyésztjük, és plazmid DM$-t extraháltak a kapott tenyészetekből az alkui ikus-SDS eljárás szerint. Az extrahált plszznid DNS-t emésztjük Hindui és EcoRi enzimekkel, és azután kiválásiunk egy 1..M4 DNS-fesgmenst hordozó klánt 1% agarózgélelektroforézissei,
A fent? eljárás eredményeképpen előállítják a Immunizált TRA-S LM4 könnyű lánc variábilis régióját és humán IgK lánc állandó régióját tartalmazó fáziós tfagmeast borőozó pHSö/M4-S-3-s plazmidot, Az ezen piazmidot hordozó te eötí transzformánst: - amelyet £> co/f D'B5aíj>HSG''M4-5«3-l-nek sevezünk - letétbe feelyeztűk az „Intemarionai Patent örganisut Deposkary, Nadenal Institoíe of Advanced Isdtedriai Science and Teetosfegy' intézetnél (1-1, Rigsshs I chofoe. Tsukuba-sh.i. Ibstekl-líco., 305-5466, .ispau) 2801, április 20-án a mikrootganizm-nsok letétbe helyezéséről szóló Budapesti Szerződés szerint, és a FSRM BP-75Ó5 teleti számót kapta.
3) A .pBRZtM'4-S-3-3 piamid előállítása (humanizált 'TRA-8 LM4 köfusyó kínról: kódoló os p ressriós pinám td)
A. bum&nizáli. TRA-8 LM4 könnyű lánc variábilis régióját és humán IgK lánc állandó régióját tartalma.ző fúziós (ragu-este hordozó pH$'ö/M4-5-3-í piazandot eníészljük Hindii! és EcoR! restrikciós enzimekkel.
gg pSRRDHH platóid DNS-t (EP 090941 6 Ál. szátoö európai szabadalmi bejelentés) esuésztenk Hindii! és EcoRí restrikciós enzimekkel, és szstás deisszferiláíjtes CIP-pei. A kapott defoszforilált pSRPDHH DNS-t és a pHSG/M4-5-3-l ptezuteihöl előáll ltok Hindill-EcoRl DNS-fragmenst. ősszsl-igáljok a DXá Algtoteví tel? kers/oo 20 (Takara Shuzo Co., Ltd.) alkalmazásával. Azután £. cv?A DH5« sejteket transzformálunk a ligáit DNS-sel és LB-agarra széfeszíjlik. A kapott tramzformáosőkat ISO ng/ml ampícSíhd tartalmazó folyékony LEtápközegben tenyésztjük, és plazmid DNS-t extrahálutek a kapod tenyészetekből az alkalikas-SDS eljárás szerint, A pSRPD.HI-t vektorban lévő kívánt DNS-hagmens inzerelóját ds irányítottságát DNS-szekv«náiássai Igazoljuk génszekvencia analizátor alkalmazásával (,.4tef EteáW3/W tete-i AKteWííz: Applied Biosystems).
Á kapott expressziós plazmidot, amely a bísteaídzóll TSA--8 I..M4 kOnoyö láncát kódoló cDNS-t hordozza, pSR/LM4-5-3-3-nek nevezzük.
(4.4) Expressziós vektor előállítása a humanizált ellenanyag könnyű láncával (LMS-tlpssá)
Amint a 75, azonosítószámú szekvencián bemutatjuk, a TRA-8 egér anít-humáa-DRS ellenanyag köny:oy& lánca- atttisosav-szekvssteáíáosk más- (LM4 típusú) humanizálása során a TRA-8 könnyű lánca aminosavszekvenclájásísk N-termináBsátői számítva a te aminosavat (hisztidis), a 9. mmnosúvat (Itete). a '10. aminosavat (ihnilskmmk -a 11.. amiaosavat (metionin), s 13. ammosavat (treenin). a'20. aminosavat (szeri®), a42, aminosavat (giui&min), ·& 43. stninosavat (széria), a 77, aminosavat (aszparagin), a ?te aminosavat (válín), a 80. tauinosavat (szerte), a 83. asnteosavat (lenem)» a 103. aminosavat (lenem) és a 108. aminosavat (alanín) helyettesítettek sorrendben prolin, szerte, s-zeríh, ienc-in, teste®, teeonite lízin, aiante, .szerin, íeucíh, prolin, fenilatain, vaiin: és meonte aminosavakkal. A kapott szekvenciát LMS-nek nevezzük.
A TRA-8 aari~humán~DR5 ellenanyag ilyen típusú (LMS) humanizált könnyű lánc aminosavszekveoeiáit (75. azonosítószámú szekvencia) hordozó expressziós vektorokat az alábbiak szerűn állítjuk elő,
1) Mamanizálí TRÁ-8 1,M5 könnyű lánca variábilis és állandó régióteak előállítására alkalmas láocmdítók szintézise
Az LM5 pollpcptldbtecot (75. azonosítőszánsű szekvencia) kódoló DNS-t, amely a TRA-8 humanizált antj-DR5 ellenanyag variábilis régiójának és a .humán lg kőnnyö láncának (x.lánc) tezlőte, PCR-ek kombinációjával -szintetizáljuk meg.
A 7ALI8 (47, azonosítószámú szekvencia), 7ALCN (48. azonosítószámú szekvencia), MÖD1F? (78-, •azonosítószámú 'szekvencia), MÓDI RÍ (79.. azonosítószámú szekvencia), MÖD1F2:2 08. azonosftoszteoú szekvencia), NfÖDlR22 (81. -azonosítószámú szekvencia), MOD1F3 (82. azonosítószámú szekvencia), M0D.1R3 (83, azonosító-számú szekvencia), MODÍF42 (84. azonosítószámú szekvenciák M0D1R4 (85. azonesítószámó szekvencia), MODÍR52 (87, azonosítószámú szekvenciák MODIF? (90. azonosítószámú székvénéin) és ERI? (181. szoaositószámá. szekvencia) mellett az alábbi oligömikleotld láacmáiíókat szmletszályrk. meg a FCR-bez:
S’-gggictggga cngacUcac eetcaecatc totagtctge agccggagga ttttguagat tat-3' (MO171F52; 94. azonosítószárnó szekvencia)
SMtetgteagc aatatagsag etatcggaeg lieggtggag gcscesaggt ggaaatc-3* (MODIFŐ3; 95. azonosítószámú szekvencia)
S’-egtecgatsg ctgctalatt gutgscagaa atsatetgea aaatcctccg gctgcag-3’ (MODiRóó; 94, azonosítószámú szekvencia)
S’-ggagatgaag aeagatggtg eogosaoagt ecgtngatt tecaccttgg ígectccace gan-T (MODIR72; 182, azonosítószámú szekvencia)
2) A pCS3J/LMS-3-42 piazmíá· elsáiíirásst (Irama uízáh TRA-8 EM5-tlpasú RóoísyS láncának klónozása)
A 75, azonosítószámú szekvencián bemutatott asnixsosav-szekveneiát kódoló ΕΜ5 DNS~íragmessí kétlépéses PCR-xel állítjuk; elő, plazmrd. vektorba íjizertáljuk, és: ZE eofr-han klónozzuk,
a) Első FCR4épés .Az 5’ végen hozzáadott Hindii! restrikciós enzim hasítási helyet tartalmazó szekréciós szignátekvencia régiót, FREj-et, CDRI,r«i, FRLrí, CDREj-t FREj-at, CDRL3~at, FRL,-et és az állandó: régió egy részletét tartalmazó EMS-FSIB DNS-hsgmenat az alábbi körülmények között állójuk elő.
A reakcíbefcgy összetétele az alábbi:
MÓD IFI olígoouklectiá-láncíaditő, 5 pmol
MODIR! oligtmukfeotid-lásetoákő, 5 pmol
MODIF22 ollgoutikieotíd-láaeioáitó, 5 omol
MOD1R22 oligon^Ieotid-láncmdító, 5 pmol
MÓD IF3 ollgoméíleotid-íáncmdftó, 5 pmol
MÖDIR3 öligoouRleotíd-láocisdÓö, 5 pmol
MQDIF42 oiigonukleoúá-Iáncm^tó, 5 pmol
MÖD1R4 oligouaklositíd-láocsrdító, 5 pmol
MOD1F52 oligonüklcoííd-IáncmdM 5 pmol
MÓD 1.852 chgosokfeotid-iáttcindím, 5 pmol
MOD1PS3 olígöoakleötlá-láucmáitö, 5 pmol
MODiRóa ellgoanklsotíd-iáneindító, 5 omol
MÓDI F7 ougóuokleotid-iáoéjíidiíó, 50 pmol
MOD1R72 oligonukRotlá-láoeioöitó, 5 sorol
7AEIF oligohokleotld-láncúsditó, 58 porol
ERI? oligonuklsotíd-iáeeindlló, 5$ pmol áNTF koktél, 5 pl löx FCR-puí&t, 5 pl tsopöTíK) DNS-pölifseráz, 2,5 egység
A íeati összetételű reakcíóelegyet 58 ul végtérfegstra állítjuk be desztillált víz hozzáadásával, és Fölbe» alkalmazzuk.
A OCR termák» körülmények melegítés Rk'C-on 2 percig, ami után az alábbi ciklust ismételjük 30 sh kalommal: ΟΨ'Οοη 1 perc, 55aC-os I pere ős 72aC-oo 2 pere, majd melegítjük 72cC-oo 10 percen kérésziül.
Az állandó régió egy .részletet s 3’ végen egy ScoRí restrikciós enzim hásilási hellyel tartalmazó LM5F5IC BRS~iragmsnst az alábbi körülmények közöd áilltink elő. A pSRFÖHH terápiái plawsdot az £P 0909836 Ai, számú európai szabadalmi bejelentés leírása alapján állítjuk elé. A reakciőelegy összetétele az alábbi:
pSRPOHE pl.azmsd DNS, 25 ng
MÖD1F7 oilgonttkleotld-iáncindítö, 50 pmol
7ALCN oíigoaukleoíid-iátrclnditó, 5Ö pmol dNTP koktél, 5 pl lOx PCR-pulfor, 5 pi ίίίμηΟΤζκϊ DNS-poilmeráz, 2,5 egység:
A fenti összetételű reakcióelegyet 50 pl végtérfogatra állítják be desztillált viz hozzáadásával, és PCRben alkalmazzák.
A P€R trnnálís körülmények melegítés 94R>on 2 percig, ami után az alábbi ciklust ismételjük 30 aikálómmal; 94!>€-οη 1 pere, 55cC-on 1 pere és72°C-ö»2 perc,-majd melegítjük ?2*C-on 10 percen keresztül.
Az axnphííkáit. DNS-irsgmeaseket a PCS. után 5% poliakriiantlíi-gélelektrofbrézissel választjuk cl. A gélt az elektrofbrézis után 1 pg/ntl etídiom-bromidásl fostjük az előállítod DNS UV-fony alapi detektálásához. Áz igy detektál: megfelelő DNS-esíkckat pengével kivágjuk.
b) Második FCR-lépés
Az .LM5-DN$«t, amelyben a font leírt LM5-F51B es I..M5-F51C DNS-foagmensek fbzionáltslva vaasak, az alábbi körülmények között állítjuk elő.
A reakcióelegy összetétele az alábbi;
Aa első PCR-iépésben előállított LM5-5Í8-ÖNS gélbagmense,
Az alsó PCR-lépésben előállított UM5-.S1C-DNS géifragrnense,
7ALIF oilgsmsklentkMárísloddé, 50 pmoi
7At.CN eligorínkleötiá-láncindltö, 50 ptaol dNTP koktél, 5,0 pl íOx PCR-pnR'er, 3,0 pl irayAö'bíy DNS-poiimeráz, 2,5 egység
A fonti összetétele reakcióelegyet 50 pl végtérlbgatra állítjuk be desztillált víz hozzáadásával, ss PCRben aikabnazzok.
A OCR formális körülményei: melegítés 94<:C-mí 2 percig, ami után az alábbi ciklust ismételjük 30 aibalommal: 94β€-«β I perc, SóNAon 1 perc és 72ftC-oa 2 pere, majd melegítjük ?2*€-οη 10 percen keresztül.
Az Így előállítod i,M5 DRS-fosgmeort a pCk.3,1 glazmidba ínzcrtáíjak AáAmyfofo Rí isWteg folt {Invhrogen) alkalmazásával a gyártó utasításait követve, és bejuttatjuk a reagenskészlstben lévő kompetens £. co/f TORIOF sejtekbe, A humanizál! TRA-8 LM.S könnyű láncát kódoló ezen DNS-ck nykfoöód-szekvaneiájói Igazoljak a dideoxí módszerrel (Songét, F.S. és másai., Proe. Rali. Acad. Sci, USA 74, 54Ő3-S4Ö7. old. í.1977)] DN SAmalizátior a lka Imazásával.
A kapott plazmidos pCR3.1,dAdó-3-42mek nevezzük (a hamtmizáit 'FRÁ-8 LM5 kötmyő sánc variábilis régióját és immárs lg könayS lánc állandó régióját kódoló eDNS-t hordozó plazsná).
Az LM5 DNS-ftagmeast üutahnazó pCR3.DLM5-3»42 plazmitfot emésztjük Hindiül és BcoEI restrikciós enzimekkel.
I pg pHSG39$ klónozó plazmád DNS-· emésztünk HindiiI ás BcoRl restrikciós enzimekkel, és azután áctosztbniáliuk ÜlF-gei, Á kapott defbszforiiélt pH5G399 DNS-t ás a Hindii! és BcoRi restrikciós enzimekkel emésztett LM5 ONS-feignteasi összeligájjnk a &Y4 /ágsritm Art Ifenriöa Xó (Takara Shttzo Co., Ltd.j sikslmazásával. Azután S. DH5a sejteket traüszformálunk & ligáit DNS-sel, és Ö,l mM IPTö-í, 0,1% X-Gal-t és SÓ pg/mi kiommfemkoh Waimnzö IB-agar tápközegre széiesztjük (végköacefsttáeiök). A kapott fehér mmszformánsoksí 50 ggóul kloraiafonikolt tartalmazó folyékony LB-tapközegben tenyésztjük, és plazmád DNS-t exírahálüttk a kapott, tcayészetekból az aikalikus-SDS eljárás szerint. Az extrahált piazmlá DX5-I emésztjük Htnáili és BcoRÍ enzimekkel, és stzatán kfeálasztüsk egy LM5 DNS-fragmens: hordozó klóm 1% agaróa-géleiekiroíbrérissel.
A lenti eljárás eredményeképpen elóüllitluk a. humanizált TRA-8 IMS kötmyö láne variábilis régióját és humán IgK lám: állandó régióját ttetalmazé réziós ftagrnenst hordozó pHSG/M5-3-27 plszmldot.
3) A pS;R/LMS-3.2?-« plazmld alóálb'tása (humanizált TRA-8 LM5 könsyá láncot kóstoló expresszié» plazmád)
A humanizált TRA-8 IM5 könnyű lánc variábilis régióját és hómén IgX lánc állandó régióját tartalmazó fúziós ffagtnesrst hordozó pH$G/M:5-3-2? plazxmáot emészt jók Hindii.! és EeoRI restrikciós eozinaakkel, ps. ρβΓίΡΒΗΙΊ plsntlá DNS-t (EB t) 909 Sió Al számú európai szabadalmi bejelentés) emésztünk hlindlii és EcoRI restrikciós enzimekkel, és azután deibszior:látjuk CIB-pei. A kapott defoszíbriláit pSRPDHH DNS-t és a pKSG/MS-3-27 plazmádból előállítóit HiaáiH-EcaRI DNS-ftagmettst összeligáijuk s ÖAH Dgoriow Air kamion Xö (Takara Shuzo Co,, líd.) alkalmazásával Azután & coB DHSa sejteket transzformálunk a ligáit DXB-sel és LB-agarra széiasztjük. A kapott fehér íamszformárisrikat 100 gg/to! amplchlmt tartalmazó folyékony LB-íápkőzegben tenyésztjük, és piazntiá DNS-t extrahálunk s kapott tenyészetekből az alkelikus-EDS eljárás szerint. A pSRBDHH vektorban lévő kívánt ÖNS-fragntens ínzorelóját és irányhottságát DNSszekvesálással igazoljuk génssekveneia mudizófot alkalmazásával (db/ BBtó'á/ a 7W £W,4 Xímte?r; Applied Siosysrérns).
A kapott espressziós plsztnidot, amely a humanizált TR.A-8 IMS kőmryú láncát kódoló cDMS-t hordozza, pSR/i,M5-3-27-I-«es. nevezzük.
(4.3) Expresszié» vekfor előállításba hasmnizálí ellenanyag könnyű táncával(khuéra típusú)
A 76, azonosítószámú szekvenciáit bemutatod szekvetteiát, a kiméra típusú TRA-8 könnyű lánc arninoszv-szekveacknái: LMö-ttak nevezzök.
A TRA-d antlhutnán-ÖRS ellenanyag ilyen típusú (LM6) humsfozák könnyű lánc antlnosavszekvenciáit: (75. azonosítószámú szekvencia) hordozó espressziós vektorokat az alábbiak szemű áll ittak eió.
1) Hntnanrzált T8.A-S LM.ú könnyű láneáatsk variábilis és állandó régióinak előállitására alkalmas ióasrinditók szintézise
Az LM6 polipeptiülársem (?5. mouoshószámú szekvencia) kódoló ivNS-k amely a TRA-8· ituutamzaíí aaő~DR5 ellenanyag kőouyú lánc (LMl-tipusú) variábilis régiójának és a humán lg könnyít láncának <k lánc) fúziója,. BCR-ek kombi nációjával szintetizáljuk meg.
Á 7.ALIP (47, azonos itószámú szekvencia) és 7AECN (4S. azooosüósitámü szekvencia) mellett sz slábbí oligonekleotiá láncindítókat szintetizáljak meg s PCR-bez:
5'-igatgisgae atg&atttgt gtsgaetgggí csícscastg tcaecagtgg a-tk (HKSPRÍ3; 97, tezonositószóntú szekvencia):
5-tgggttecag geteeaetgg tgacattgtg stgaeocag) ctcacsasti c-3' {biV'FÜ;: 98, azonosisöszámú szekvencia);
ö’-aagacagság gtgcagccae ssccogdlg atpeeaget tggtgcctc-3’ (MVK11; $9, azonosítószámú szekvencia); és
5!-aagctggaa& teaasegggc tgtggctgea eealetgteí A:atc-T (MCF1k 180. azonosítás zárná szekvencia).
2) A pCRXi/tMő-Mó piazmid előállítása (humanizált TRA-8 LMó-típ«sű könnyű láncának klónozása)
A 75, azonosúőszátnú szekvencián bemutatod atnlnessv-szekveueiár kódoló LMS DN'S-íhtgmettst kétlépéséé PCR-reí áiíitjuk elő, plaztnid vektorba iazutláEnk, és ,£'. eo/r-ban ktönozzok.
áj IDsÓ PGR-lépss
Az EMó-Fl-DNS ÍTagmenst, amely szekréciós szignálszekvesciát és FRLi-régiót kódol Hindii! restrikciós enzim hasítási hellyel az 5' véghez adva, az alábbi körülmények között állítjuk elő. A pKSGHMÍ? és pSRFDHH templái: plasmkfet az EP üMMló Al. száatső európai szabadalmi bejelentés leírása alapján állítjuk elő.
Á reakciőelegy összetétele az alábbi: pHSGHMI? piazmiö DNS, 25 ng 7ALI P oiigoimkleofid-láncinditó, 58 pmol HNSPK.13 oligonakieotld-íáosindltó, 50 pmol dNTP koktél, 5 pl lOx PCR-puíTer, 5 pl «n?yjd7í?y DNS-politneráz, 2,5 egység
A fenti összetételű reukclőelegyet 50 pl végiérlhgatm állítjuk be desztillált viz hozzáadásával, és PCR.~ bem alkalmazzék.
A OCR tonális körülményei: oretegités 94R2-00 2 peréig, amit után az sióból ciklust ismételjük 38 alkakmunal: '94X-on I perc, SS*C-un 1 pete és ?2*ü-on 2 perc, majd melegítjük 72®C-on 18 percen keresztül.
Az FR.L· egy részleiét. CDSl.i-ef, FRL.~t, CDSlj-t, FRL-s-at, CDKL?~at, FRU-et és az állandó régió egy részletéi tartalmazó I,Mö-F2 DNS-ósgtsensi sz alábbi körülmények közölt állítjuk eló.
A reakciőelegy összetétele sz alábbi:
pL28 piazmid DNS, 25 ng
MVFll ollgosnkieotld-láneínditó, 59 pmos
MVRI.2 ollgöoukleoöá-lsneindiíó, 58 pmol dfeTP koktél, 5 pl itfe FCR-paíser, 5 pl íVíspnTby DNS-pöllmeráz, 2,5 egység
A lenti összetételű reakelóelsgyet Só pl végtértogatra állítjuk be desztillált viz hozzáadásával, és PCRbers alkalmazzak.
A POR termálls fesrRlmányei: melegítés 94eC-oa 2 percig, ami nőm az alábbi ciklust Isméreljök 38 alkalommal: W'Crcst 1 pete, 55*0-ο« 1 perces ?2'öC^mr 2 pere, majd melegítsük 72!>0-<m 18 percet? keresztül.
Az FRU egy részictát és az állandó regiét a 3’ végett egy EcoSI restrikciós enzim hasításé hellyel tartalmazó LM6-F3-ÖNS fragmenst az alábbi körülmények közöd állmuk éld.
A reakcléelegy összetétele az alábbi;
pSRPDHH piámmá DNS, 25 ng
ΜΟΒ 11 öligoaakleotid-iáacindltó, .58 pmol
7.ALCN oltgonuklsotíd-láncíodíté, 58 ptnol shfFT kőidéi, 5 μΐ lOx PCK-psííer, 5 ui í?í!yj«?öty DNS-pohítierás, 2,5 egység
A fend össseiételö fesse iódegyot 58 pl végtéríbgtrtrs állibuk be desztillált viz hozzáadásával, és POR* bet? alkalmazzak.
A POR termálig körülményei; melegítés OTO-es 2 percig, ami utát? sz alábbi ciklast ismételjük 38 alkalommal: 94cC-on 1 pere, S5-C-ou 1 pere és ?2*C-on 2 perc, majd melegítjük 72®€-o» 10 percen keresztül.
Az ampliíMt DNS-íragmenseket s POR «ián 5% gollaRdbmid-géieleldrc&rézjsseí vúlítsztluk el. A gélt az elekttxtlbtézés irtás 1 pgZsal etlálms-bromlddal festjük sz előállított DNS UV-íény alakié detektálásához. Az égy detektált megfelelő DNS-csikokat pengével kivágjuk,
b) Második FCR-lépés
Az LMó-DNS-t, amelyben a fest leírt 1..M6-F1, 1..M6-F2 és LMÓ-F3 ÖNS-fragrnessek fuzion&ltíáva vannak, az alábbi körclstényok között állítjuk «18,
A reaksíősfegy összetétele az- alábbi:
Az első RCR-lépésbe?? előállított LM6-F1-DNS gélérsgutense.
Az első RCR-iépésbet? előállított LM8-F2-DNS gélfegstense.
Az első RCR-lépésbet? előállított LM6-F3-DNS gélfrcgtuesse,
AL I P őligonskleotsd-láoclAártó, 58 ptttol
7ALCN ebgosukleotid-iáncsodkő, 50 psnoi ö'NTP koktél, 5,0 μί 1Ox FCR-pt.dfer, 5,8 μί aot;oíí7bi/ DNS-pol «seráz, 2,5 egység
A íertii összetételű reakciöeiegyet 58 pl: végiériogatta állítják be desztillált víz hozzáadásával, es PCRben alkaimazz«k.
A FCR termál Is körülínéstyes: melegítés 94°C-an 2 percig, attti «tán az alábbi ciklust Ismételjük 38 alkatommal: 94*£-η« 1 perc, 55*0-0?? 1 perc és ?2*C-ö« 2 perc, trsajá .melegítjük 72*0-os 18 perces kérésztől.
Az igy előállított LM6 DNS-tragtnsnst & pCRJ.l pl&zmídba luzertáljuk Aukrc-yrcrc FA síomng A'ir ilovétrcgett) alkalmazásával a gyártó utasításait követve, és bejsjttatjuk a rcagenskészletheo lévő kompeíeas & «8; TOPIOF sejtekbe, A husttttntzáli TRA-5 könnyű lásteát kódoló «zen DNS-ek ttukieotid-szekvetrciáiát igazolirtk a dideoxí módszerrel DNS-sstaltzálor alkalmazásával.
A kapott platódét pCR3,l/Lklő~l-?Ó-nak nevezzük (azegér TRA-8 könnyű lánc variábilis régióját és barnás lg könnyű lánc állandó régióját kódoló eDNS-t hordozó platód).
Az LMÓ DHS-fesgmenst tartalmazó pCR3,oLMó-l-:t? piazmlőes emésztjük Biaől?? és BeoRÍ restrikciós enzimekkel, pg 'pHSG389 klónozó platód DNS-í emésztünk Hindii? és BenR.I restrikciós enzimekkel, és azután defoszíorilálluk ClP-pel, A kapod deíbszforilált pHSG399 DNS-t és & Hindin és EeoRI restrikciós enzimekkel emésztett LMő DNS-Tragmenst ósszeligáljuk a /.tói óígm'üm O Ifemórn 2..Ó (Takara Shuzo Co,, Ltd.) alkalmazásával. Azután £ eoít DH5o sejteket transzídrmőluok a ligáit DNS-ssl, és 0.1 mM IPTC-t, 0, 1% X-Gal-t és 5Ö pgönl kicmmtfoüikoit tartalmazó LB-agar tápközegre szélesspjük (végkoaceshácíók), A kapott fehér transzferm&ösokat 58 gg/ml kloramfenikoit tartalmazó folyékony LíMápközegben tenyésztjük, és plazmád I>NS--t extraháhmk a kapott tenyészetekből az sikaiikus-SDS eljárás szerint. Az estralrált platód DHS-t emésztjük Hindin és EeoRI enzimekké?, és azután kiválasztunk egy LM6 DNS-Oagmeast hordozó kiónt 1% agarózgélolektroferézissei.
A fent? eljárás erateéayeképpea elősli.Stjnk a egér TRA-8 .könnyű lánc variábilis régióját és barnán IgX Iámé állandó régióját tartalmazó fáziós fragmemsí horöozó pl-ISO/Mő-1-4-1 plazmidoí. .Az ezen platódét hordozó .£, coÜ transzfonnánsí - amelyet R eo/l DILWpí-lSG/M.ő-Í-4-l-nak neveztak - letétbe helyeztük az „Intera&tion&l Patent örgsnism Deposltarjy Habosai. Instímte of Advanced Industrfel Scieoce and Technology” intézetnél <1-1, Higashi I chome Tsnknha-sh?, Ihsmki-ken, 30S-546Ö, lupán) 2ÖÖ1. április 2ő-án a mikroorganizmusok letétbe helyezéséről szóló Budapest? Szerződés szerint, és a FERxM BP-75ŐÖ letét? számot kapta.
A pSR/LMő-í-4-Ó pfezmtd előállítása (TRA-Ü bíróéra tipnsá LMó könnyé láncot kódoló expressziős phszmhl)
Az egér TRA-8 könnyű láne variábilis régióját és humán IgK. lánc állandó régióját tíotónaző ISzsós Iragmenst hordozó p?íSGlI,Mö- 1-4-1 plszmidot emésztjük Hinőlllés EcoRl restrikciós enzimekkel.
pg pSRRDHH klónozó platód ÖNS-t emésztünk Hiúd.® és EeoRI restrikciós enzimekkel, és azatán dsfdsztóriláljuk Clfe-pel. A kapott deföszforiláh pSRPDHH DHS-t és a p&SG/LMÓ-1-4-1 platódból előállított Hlndlll-BcoRl .ióNS-fengmesst üsszeligáijok a öböl Gyónón Kit l-tótó 2.8 (Takara Shuzo Go., Ltd.) alkalmazásával, Azután £ eoó DH5a sejteket transzformálunk a ligáit DXS-sel és LB-agsrm szélesztjűk. A kapott transzforsnánsokat löt) pgónl amplcslbat tartalmazó folyékony („S-lápközegbsm tenyésztjük, és plazmád ÖNS-t extraháltak a kapott tenyészetekből az alkallkss-SDS eljárás szerint. A. kívánt DNS-feagmens vektorban iozereiöját és iráoyiioitságáí OXS-szekvenálással igazoljuk génszekveneía analizátor alkalmazásával.
A. kapott esprexssióa plsasnidoí, amely a TRA-8 (kiméra tsposo) könnyű láncát kódoló- cDHS-í hordozza, pSB/LMóG-d-ő-rntk nevezzük, <51 Aaft'víődeó’ ry.m.rs tónomédü vagy á/aréro £R4-Ő elfeímrgmgox eíóáőó'tdro’
COS-? sejtek, Iranszlektálását & £GG£A£íl transzlekeiős reagenssel (Boehringer Mannhelm Bíoohemfea) végezzük a resgenskészlethez mellékeit kézikönyv utasításai szerint.
COS-? sejteket (American Typs Csdtcre Colleetfon CRL-ióSi) felig összefolyt állapotig nővesztőnk (3 x lö* sejtfosésze) tenyésztő csészében (tenyésztési felület: 5? cm.'; Sorolton» Bakelité) amely fbdó&mo'? Afezöned Aggá? ó-fotóm tágközeget tamil a ielráshstt ezentúl ,,l>-M£tó-nek nevezünk; öfoeo BRL) tartalmaz, kiegészítve lü% magzati botjászértsnamal (ami: a Idámban ezentúl ,,FCS’'-oek nevezünk; Meregale),
-31Közboa 16 pg /csésze (összesét; .5 csésze) humanizált DR5 rsehez Mnc expresszlés plazmiá DNS-t (pHAi5-l) és 16 pgtesésze humanizált DR5 könnyű lánc expresszlós plazmái D'NS-t (amelyeket tsz alkaukns5DS eljárással és eézlum-klorld söröséggradíeris eerrtrifugéíássaí állítottunk elő) összekeverünk, és ttxmán etanoHal kicsapunk, majd íelszoszpetsdálunk 5 pítesésze desztillált vízben.
Mintás 15 rtl/esésxe A7A3O2íé Iranszíékefős reagenst összekevertünk 186 pl/csészs FCS nélküli DMJBM tápkőzeggel, ezt & Fbv/AAE-oldatot (185' pi/esésze) összekeverjük 5 μΙ/csésze DN'S-öldaíta.l, amely 16 pg/esé.sze humanizált DR5 ssslséz lése espressziós píazmíd DNS-t és 10 pg/csésze humanizált DRS könnyű lánc expresszibe plazmld ÖNS-t tartalmaz. IS pere szobahőmérsékletem történő mkubálás után a kapott plazmáiszusspesziü? (206 pl) hozzáadtuk a korábban előkészített CO3-7~lemesekhez, 24 őrás 5% CÖz-ben M^C-ott történő iskabálás után a tenyésztő tápkőzeget lecseréljük FCS nélküli O-MBM tápközegre, 72 órás .5% CGj-feeu 37*03» történő tnkubálás után a tenyészet íelölöszőját visszanyerjük a lelűlűszőban lévő expnessziös termékek tisztítása végett. Ezzel a teát leírt módszerrel OOS-? sejteket Irsnsdéktáínnk az alábbi plazmíd-kisombtnáclók mindegyiké vek (A) : pH A15-1 és pSR/tMI?2 (Hl ff) együttes transzíektálása (B) : pHB14-l és pSR/M2-l (H2L2) együttes transzfektálása (C) : pl-ÍR14-l és pSR/LM3-3-44-16 (H2L3) együttes nunszfektálésa (D) ; gBB14-l és pSR/LM4-5-3-3 (H2L-4) együttes transztekiáláss <£)·: pHCIO-3 és pS.R/M2-l (1-131.2}-együttes transxíekíálása <F): pRC10-3 és pSiVLM3-3-44-16(Η3Ο)együttes transzfektálása (Q; pHCi8-3 és pBR/LM4-S-3~3-(H3L4) együttes transzfektálása (H): pBD21-l és pSR/LM5-3-27-l <H4L5) együttes transzíéktálása (i): pMll-i és pSR/LMb-:-4-ő (kunéra) együttes trauszfektálssa
A tenyészetet azután íecentrítügáljuk (35Ö0 rpm, 15 pere), és a feíüiúszót összegyöjtjük. A relülüszót szűrjük 0,45 prn-as szűrön (ADVAHTEC ΪΟΥΟ DlSMi€-25ns, Cate 25CS645 A$). A. szőrietekből az ígG tisztítását Proteó? ö-AŐMöd arlíuitásl kromsiográüa (Applied Biösystems) alkalmazásával végezzük az alábbi körülmények között:
HFLC rendszer: BioCAD 766S (Applied Bfosystems} oszlop: Arotemö-éö sexsor earfeh/gx (oszlopméreí: 2,1 mm ID x 30 mm LD, töísettértügat: 0,1 ml; Applied Biosysteíns) eiücíds pallér: 6,Ί M glsein-HCI (pH 2,5} semlegesítő pníTer: 1 M Tris-l-ICl (pl-l 8,5} detektálás: 2S6 am áramlási sebesség: 1 ml/miu
Irakclőtnéreí: 0,5 ml/ö,S pere) gyöjtőesö: 1,5 ml-es polipropilén mikrocsö hőmérséklet: 48C
Mintán az összes szurietet téivlüük az oszlopra, 56 tol ABS-t (Rigóm, Csőt 1,866-3) alkalmazónk az oszlop mosására. Amikor az eiúeiés pultért elkezdjük felvinni, elindítjuk a írakcsökohektort, Mindegyik mikrocsö korábban tartalmazott 55 pl 1 M NsCI-t, 116 pl semlegesítő puffért és 74 pl 2 mg/ml szurvastnarkaszétennalhummi'(Sígma, CaW A-7636) RBS-es oldatban. A 7-3. frakciókat összegyűjtjük.
-82A humanizált efaanyagok exprwteójtetteí igazolását -és az előállítod ttmyászeí-feiüiászőfa található expreszszlós termékek mennyiségi elemzését EUSA-vsí végezzük sotí-humán-lgG elleni ©faanyag alkalmazásával
9ő-mérőhélyes mikrotiterieínex (MaxiSerp, N'une) mindegyik mérőhelyére I 80 pl kecske antí-hamánIgG-Fc-re specifikus poliklsnáiís ellenanyagot (Kappe'rt adunk, amely 0,5 gghol végkonceníráteóra vas feloldva adszorpeíós puiferfeen <8,85 M .nátemm-hlártgénkarbőnát, 0,02%. ns8ium-aziá, pH 9,0), és a mrfatiterlem-ert 3?°€-o« Inkuháljuk 2 özén kérésztől az eltenaayag adszorbeáláss végen, Aznttes :a mikrotíterlemezt 5-szőr mossuk 358 μΙ FRS-T-vsl. Mosás tetet a mérőhelyekbe adjuk a 18% 'FCS-t tartalmazó D-MEM sápközeggel hígított tenyészet-felülászékat, és aT’-C-os ínkafeáljuk 2 érán keresztül. Ismételt FBS-T mosás tetet 1015 μΐ, PBS-T-bers I 0888-szer hígított, aíkallkus foszfatázzal jeléit antí-hnxnán-lgG-re: specifikus- poilklosáMs ellenanyagot (Jackson Immuno Research l.-ab.j adunk mindegyik mérőhelybe, és 37°C-on lakubáljuk 2 órán keresteől. Ismételt PBS-T mosás teán az AáGréréc Ffapketoe SsArtf-are ák-ből (Bio Sad) származó p-n-hrofen-íi-foszfát szubsztrátot adunk a mérőhelyekhez a reagenskészlethez mellékelt .kézikönyv utasításai szerint. 3?*C-on 8,5-1 árán keresztül történő .inkateáíás. teán mérjük az. abszerbanclát 405 run-en, Ezekben a kísérletekben 10% FCS-t tartalmazó D-MEM tápkőzegben meghatározott konnentráelákra higltoíi G 1-ss alosztályó (IgGl) humán plazma imjmmglobnlmt (Btopure Aö) alkalmaznak a tenyészet-felülúszákban található humanizált DR5 ellenanyagok korreeteráciá-íeferenefaintájaként.
Ennek eredményeképpen specifikusan detektáljuk a teavészet-iclülászöban található tisztitott termékek expreszsteójte az anti-hamán-IgG ellenanyaggal A humán IgG ellenanyag vág&oncentráciája sorrendben 44,03 jig/wl (HUJ), 39,8 ygfmi <H2E2'), 2é,7 ggóal (H2k-3k 41,8 pg/ml (H2Í..4), 39,3 pgAnl <H3L2), 24,7 pg/ml (H3L3), 21,5 ng/rel (H3X.A), lé,7 pg/ml <H4L5> ás 1.8,3 ugönl (kimére).
(ő) Különböző típusé humanizált ellenanyagok vagy kiméra· ellenanyagok a-poptózis-indoká'ló aktüvlása
Jnrkat sejteket (ATCC Tífí-152) alkalmazunk a tisztítod humanizált TRA-8 ellenanyag apoptózísindukáló aktivitásának vizsgálatéra.
10% FCS-t tartalmazó REMI 1Ő4Ö tápkOzagfa (Giheo BRL) 37eC-on 3 napon keresztül 5% CO2 jeleníétébea- tenyésztett Jutkái sejteket osztunk szét 96-mérőheíyes míkrotiterlemezre (Sumltomo Bakelité) mérőhelyenként 50 pl mennyiségben. Az ebben a 26. példában «lőálHtott humanizált TRA-S- végteseerteásióját 180 ng/ml-re állítjuk be 115% FCS-t tartalmaz RFM11Ő48 tápkőzeggd, a 2Ő. példában leírt módon becsülve azok koncsterációpít a folyadékokban. Az expressz-iós termékek Ily módon 100 ng/mí-re· beállított oldatait alkalmazzuk sorozathígítások előállításra 1056 FCS-t tartalmazó RPM 11640 tápköregsel, 2-szeresre hígítva serezatesan. Mindegyik hígított humanizált TRA-8-oldetot (1-HLl, 112L2, H2L3, B2L4, H3L3, H3L4 vagy 1141..5) 50 {dztnérőhely mennyiségben adjuk a mérőhelyekbe. 12 órás reagáltatás teán 3?*C-on 58 μ.Ι, 1 mgőnl XTT-t tartalmazd 25 μΜ PMS-t -adunk a mérőhelyekbe (végfcfaeetráctó: 2515 pg/tnl ITT és 5 p;M FMS). 3 órás ingvbálás után mérjük az egyes mérőhelyek abszsnfaeiájte 4515 nm-en, hogy kiszámítsuk s sejtek életképességét, a mttokondriumok rednkcíós képességét indexként alkalmazva.
A sejtek életképességét az egyes mérőhelyeken az alábbi képlet szedőt számítjuk;
Életképesség (%) ~ 188 s <a-b)/(o>b}· tetei „a” jelentése a teszt, mérőhely mérési értéke, „U jelentése a sejteket nem tartalmazó mérőhely mérési -értéke és ,,e” jelentése az ellenanyagot' nem kapott mérőhely mérési értéké.
-83Ennek- eredményeképpen kimu-síjfík, bogy a humanizált ellenanyagok apopíózlsl jndukáíb&k humán DR.S-ót eapresszáló T-í.imS5m& sejivorsal sejtjeiben.
Ezenkívül megvizsgáljuk a humanizált TRA-8 apoptőzis-indukáió aktivitását PC-3 sejtekben íaxoi hijzzáadásával, amint azt a 25. példába» leírjuk.
A FC-3 humán- prosztatarák sejtvonoht (ATCC CRJL- 1435) az „Amerlenn Tissue Cukoré Colleetlon”tól (ÁTCC) szerezzük he és f-JPA Absves? Aócrtare íápközegben (21127-922, Gibco BRL) tartjuk áss, amely az alábbiakat tartalmazza: 10% magzati marhaszéru-m. (EBS, Hvelone), 1% t-Giumsnm-209 ®M (25039-149. Gibeo BRL) és 0,5% penieiilin-sstreptontlein oldat (?5-?539, Slgma), 10% FBS-sei és 9,5% penicillinsztreptoruioitt oldattal kiegészített RPMÍ164O í&gkSzsgeí (MED-993, IWAKI) alkalmazunk az alábbi kisértstben. Esponensiáiisas- növekvő BC-3 sejteket gyűjtünk triplsxmizáciőval, és kétszer mossuk azokat friss tápközeggel.. Azután a sejteket leszámoljak, újrafelszuszpendáljuk friss tápközsgben 5 χ lö4 sejumi sűrűséggel, és egy nappal a kísértet kezdete előd szétosztjuk három párhuzamosbau lapos ieuekű 96-méröhelyes udkrotíterlemezekben (3598, Cömlng-Costar) 190 ukmí összíéríőgatban. A dimetilszalfoxldhan Moldott (19 mg/sni) reprezentatív rákellenes azért, a Fmdinzsíd-I (169-19611, Wako) friss tápkőizsghea- hígítjuk, és azután a sejteket tartalmazó- 9ő-mérőhelyes mikrotiteríemexekhez adjuk 59 pi/méröhely mennyiségben·. A áimeísfrzuifosid végkoncenlrációja kisebb, mint 9,1%. 24 órás STC-on és S% CÖ?-afetoszíérában történő infcubálás után humanizált TRA-S ellenanyagot (ilití, H2L2, H2L3, B2L4, H5L2, H3L3, H3.L4 vagy H4L5) hígítunk friss tápköze.gben, és hozzáadjuk a mérőhelyekhez. További 24 őrás inkubálás mán 50 pl, 1 -ng/mí XTT-t ás 25 nsM. PMS-t tartalmazó á/mrmm -.SkseHriui Médium fápkőzeget (11995-998, ölben Sitt) adunk a mérőhelyekhez, és a ímknrtiíeriemezeket 6 órás keresetül inteháljak. Azután mérjük az OD459-et.,4.RFÖ ATS 3á?ő íWh&áal Ccmmer készülékkel (Waltae Berthold), és a kiszámítjuk a sejtek életképességéi az alábbiak szerint.
Sejtok életképessége (%) «(a Taxoiiai és/vagy humanizált TRA-8-szerrel kenőst sejtek OD4Ső-ér;éke> sem sejtet, som szert sem tartalmazó mérőhelyek öDóSö-értéke x 199 ,( (sejtet igen, de szert nem tartaknazó mérőhelyek <)D45ö-értéke - sem sejtet, sem szert nem tartalmazó mérőhelyek ÖÖ45Ö--éríéke) bőnek eredményeképpen kimutatjuk, bogy a humanizált .eileuaoyugok. apeptózíst máukátok barnát; DRS-őí expresszálő humán prosztatarák sejtekben.
A leírásban említett bármely szabadalom vagy publikác ió jelzi az, azon a szakterületen jártas szakember íudásszintjét, amelyre a találmány vonatkozik. Ezen szabadalmak és publikációk hivatkozás útján oly mértekben a klíaniíss részét képezik, mintha minden egyes publikációról specifikusan és egyedileg jeleztük volna, bogy hivatkozás útján a klíaniíss részét képezi.
A találmány oltalmi körét nem korlátozzák a példákban fent említett letétek és megvalósítási módok, amelyeket a találmány néhány aspektusának szomlélsetéséuek szánunk, és bármely megvalósítást mód, amely mnkeiöoáiísan ekvivalens azokkal, a találmány oltalmi körébe tartozik, A Bírásban bemutatott és leltárt táiáln-Any különböző snédositásai nyilvánvalóvá válnak a szakember számára, és azok szándékunk szerint a mellékek igénypontok oltalmi körébe tartoznak.
-84Hivaskomok
1.. Wüey, s,R„ Sehooley, K., Smolsk, P,X, Dia, W.S., í-hmsg, C.P., NRhoU, XK,. Saíberiand, G.R., Smith, T)Ö,, Raack, C., Smlth, O.A., és mlsai,, immmrily 3, 673-682, old. (1993)
2. Pan, ö., O'Reorke, Cbhnaiysa, Ά.Μ., Gént?, R., Bbner, R.., Ni, X, Dádt, V.M., Seteace- 276, Π 1013. old. 0997)
3. Walezsk, H.} Öegll-Espesti, M.A., Jotesöa, R.S., Sasolak, P.X, Waugh, J.Y., Boiaaí, IX, Timoar, MS., Gerbad, M.X( SOmoísy, K.A.,.Smith, C.A., Goodwia, KG·., Raxcfc·, C.T., .EMBO X lő, 5386-5397, old. (1997)
4. MacFariane, M,, Ahmad, M, Smívasafe, S.M, Femaadss-Alnemri, T, Coben, GM, Ahtewi, E.S„ X Biot Chem., 2?2,25417-25420. old. (199?)
5. DegH-EsposK M,A, Dongád, W.C, Smoiak, P.X, Wsmgh, XV, South, C.A, Goedwla, KG,,. Immimiíy 7,813-820; old, (199?)
0. Chaudhary, P.M, Bby. ML, Jassúa, A., Bwkwate, A, Marray, X, Hood, L., íasahtnlty 7,. 821-838.. öld, 0 997)
7. Scbneldsr. P, Tkomé, M, Bsims, K, Bodsw, XL>, Hefmm. K, Rataoka, T, Hoíier, N,, Tschopp, X, immmdty 7, 831-835. old. (1997)
8.. Degii-Esposd, M.A, Somiak, P.X, Walesák, H, Wasgh, X, Oaaog, C.P, DuBose, R.F., Goodwin, KG., Smsik, C.A., X Exp. Med. 1M, 1165-1170. <M 099?)
9, Sherídao, XP., Mamers, S.A, Fiúi, HM, Görney, A, Sfehateh, M, Baldwio, IX, Ramakriateau, L.., Cray, C.L., Baker, K, Wöqö, W.t, Goddará, A.D., Göáöwskl, P., AshkensO, A,; Seieace 277. 818-821, óid. (199?)
18. Pás, G., Ki, )., Weí, Y.F., Va, G-, Geniz, R., Ölsll, V.M, Sciesoce 277:, 815-818. old.. (199?)
11. Msrsiers, S.A, SXerldsn, XP., Pld:.. R.M., Haasg, A, Sknbsleh, M, Baldwía, D., Yaaa, X, Gorsey, A, Goddard, A.D., Godowsks, P, Ashkeaszá, A, Cw. Biok 7, 1Ö03-1896. old. (1997)
12, Esnery. XG., MtDasaell, P, Berke, M.B., Deeo, &.C., Lyn, S, Silvanaaa, C,, Dob E, Appelbaaoa, E.R., Ekhmas, €,, DÍPtiszlo, K, Dodds, P.A., James, LE., Raseaberg, M, Lee, XC„ Youog, P.R., X Bioi, ae®. 273,14363-14367. öld, 0998)
13. Walezak, H, Miller, R.E., Arial!) K, Gllrnak, B, GrifSth, T.5., Rubin, M, Chio, W, Jones, X, Woödward, A., Le, T., Smirh, C., Sotolak, P„ Goodwio, KG., Rácok, C.T., Sdsnh, 5.C., Lyscö, D JT, Nak Med. 5, 157-163. old. (1999)
14. Ömdít, Y., Leukémia t.3, 1817-1824, old. (1999)
15, Rieger, 3., Namsaha, G., ölesen, T.x Askkeoaai, A., Weller, M·., PEBS Lett. 427, 1290 28. old.
(1998)
16, Jeremiás, X, Genr, 1,. Böebler, T., Bebatis, KM,,Eur. 3, lasmenol. 28, 1430 52. old. (1998)
17, Mariiöez-tomsze, M.J., Alava, M.A., Gamen, S., Kim, K.Xt. Qnsníharapai. A,, Phe lm, A.x Nsval, X, Aueb A., Xtif, X tewauml. 28,2714-2725. <dd. 0998)
18. Rdlkps, T,.A,( Ki, X: Pan, <)., Rabén, S.M), Wei, Y.F,X Paee, .1,1,., Hunt, J,S„ X Immanoi. 162, 6053-6039. old, (1999)
19, Kayagakt, X, Yamgttehi, X, Nskeyartts, 14,, Takeda, K,, Aktba, 1-L, Tsotstn, PL, Ökatnura, H,, Nateasfn, K.x Qkumura, K., Yaglta, IX, X bmsosol. 163,1986-1913, old. (1999) '20, Johnsen, A,C„ Fksux, l.< Stelnkler, 3., Nonslaá, U.. Egeberg, K„, Suodan, A,, Ashteazt, A., Rspcvlk, T., Cytokine 11,664-672. old, (1999)
21. Rajnai, L, Ahmed, M„ Benned, 1,14., Áznunk I,„ Alneínrk E.S., Rerossfe, 3., .1. Exp. Med. 188, 2375-2388. old. (1993)
22. Fsnger, XA„ Maliszewskk C.R., Scfexdey, K„ Öriffiíh, T.S., .1. Exp. M«á. 180, 1155-1164. -old.
(1999)
2-3. Grdllth, T.S., Wiiey, $,R„ Kabin, M1Z., Ssdger, t-M, Msisszewskk C.R., .Fanger, XA,, J, Exp. Med. 1 39, 1343-1354. old. (1999)
24. GrlRlíh, T.S., Raueh, C.T,, Snsolak, 3.1., Wangh, AY„ Bolant, N., Lynch, D,1I, Snnth, C.A., öoodwin, R.G., Rubin, M.-.Z., X Immusology 162. 2.597-2605. old,. (1999)
25. Albans, S, és Carsos, D.Á., „Arthritis and allfeá cöndiiions, e. tcxtbook <sf rheunxatology”, '13. kiadás, 2, kblefe 979-992, -old. (199?) '26. Fujissws, K,, As&hara, H., Gkassoto, K,, Auno, ?T, Hasuausaa, T,, Rőbats, T., Jwakura, Yonehara, S,, Sutniba, T. és Níshloka, K., 3. Cila. lövést. 9-8,271-278. old..-(1996)27. Zbang, IX, Yattg, Y., Börtön, J.L., Sasnoiluva, B.B., rodge, T.A., Tarka, L.A., Wllsö-o, 3.M. és Chen, Y„ X Clin, lövést 1-88, -1951-195.7. old. (1997)
28. Rotb, W., ísesman, S., Naumano, IX, Kugler, S., B&hr, M., Diebgttns, X, Ashkenazl, A., Webet, b-L, LoeoregsonaL Bt-ocbem. Ríophys, Rés. Cotnmt-n. 265,479-483. old, (1999)
29. Chktnaiyasr, A.M., Ernád, LL, Shankar, S,,. Bamstsa, D.A., Sbanalah, ML, Chenevert, T.l.„ Ross, BT)., Rehenrtsdla, A,, Proc. Hsai, Acad. Sei, 97,1754-1759. old. (2088)
38. Arai, T., Akiyasna, Y„ Okafee, S., Saito, R., fevaí, T., Yuasa, Y,„ Cancer Led, 132, 197-294, old.
(1998)
31, Lee, S.H., Sfeta, M.&., Kim, H.S., Lee, H.K., Fark, W.S., Kim, S.Y., Lee, AH,, lián, S.Y., M, J.Y., Oh, R.R., Jang, XX, Hun, J.Y., Lee, J.Y., Ve©, XI, Caneer Rés. 59,5683-5686. old. (1999)
32, P&i, S.I., Wu, O.S., Ozerea, N,, Wtp L., Jen, 1, Sidransky, D., BbDeiry, 1Y.S., Csneer Rés. 58, 3513-3513. old. (1998)
33, Mankdis és mtsai., „Mölseolar Cloning, a tsburatory 'Mama-Γ, kiad.: Célú Sprsng H&rbor Lahorstory, Cold Spring Hsrbor, NY' (1982)
34, Sebről?'és mtsai:, Caoeer Rés, 45, :879-885. old, (1985)
35, Yeköo, D.3. és mtsai., Currení Topfes fe. Mlcrobíology .astd Immmtology 81,1-7. old, (1978)
36, Kókler, G. és mtsai., Emopean X in-munology b, 511-5X9. old. (1976)
37, Sholsnan, Rt, és mtsai., Natúré 276,269-270. old. (1978)
38, Keatney, XF, és nttsai,, X Immmmlogy 123, 1543-15515. old, (5979)
39, Horibata, K. és Harris, A.W., Natúré 256,495-497. oki. (1975)
49, Sberidsn, AR, Marsíers, S.A., Peti, RM, Gusn-ey, A.,. Stefeatob, M., Raldwbt, D„, Rsmsta'shínan, Cray, C.L., Baker, K„ Wood, W.I, Goddard, A.IX, C-odo-Askk F. és Ashkeanxí, A., Science, 277, 818-821. old, ()997)
41, Chens, J. és mtsai,, S«fence263,1759-1762, old, (1994)
42, Bertótóe, A.M. és missé, Ch:s, Esp. Rhemnaíol 17, 533-558. alá. (1994)
43, Sherídas, 3.F., Marsters, A.B,, Fsttí, R.M., Guroey, A„ Skubsteh, M., Baidwfo, T>., F.w,2krishnjsi, L., Gr&y, C.3., Baker, K„ Wsoá, W.L, Gedáard, Á.D., Gedowski, F. és Ashkeoaak A., Belesee 277, 818-82 í. old. (1997)
44, Seteisfer, F„ Tfeoroe, M., Saras,. X., Boámét, 5.L., Hoinana, &., Xatssks, T., MoHsr. N., Tschopp, A femtmity 7, 831-835, tód. (1997)
45, Kennedy, M.A, X&psokss, T„ Tseitopp, 3. ds Baád, R.C., J. Bxp. Meg, 1891-1898, old. (1999)
46, Miífer-tadser, IJ,, Gay, R.B. és Cray, 8,, „Arthritis and alileá cosdidons, a texthook of rlreumatöiegy”, O. kiadás, I, kötet, 243-254. olá. (1997)

Claims (27)

  1. Szabadálmi igénypontok
    L DR5 TRAIL-mceptort speeiSkasso kötb tisztított' ellenanyag, amelynek másodlagos ksrmtkötés nélkül sejthalál-iudukáló aktivitása vas. és amely ellenanyag nem kötődik DR4, DcRI vagy DeR2 TRAILreccpíorokhos, és nehézláneot és kónnyőláacoi tartalmaz, áltól (a) & nehézlánc a PTA-142S ÁTCC elérést számú TRA.-8 egér-egér hibridóma által termelt rnonoklooélís ellenanyag CDR'-jett tartalmazó variábilis régiét tartalmaz; és (b) a kbsmyúiám: a TRA-S által lennek taottoklonálh ellenanyag Ci>R»jeii tartalmazó variábilis régiót tartalmaz, ahol a CDR-ekbeo «gy oldalién® hozzáadhasd, elhagyható vagy sznbsstiuíálfcató.
  2. 2, Az I. igénypont szerinti tisztított ellenanyag, amely monoklonálís ellenanyag.
  3. 3, Az 1. igénypont szerinti. tisztított ellenanyag, amely humán DRS-öt köt.
  4. 4,. Az 1, igénypont szerinti ellenanyag, amelyet a ETA-1428 AtCC elérési szánté. TRÁ-8 egér-egér hibridóma termek
  5. 5. ?kz 1, Igénypont szerinti ellenanyag, amely a FTA-Í428 ATCC elérési számú TRA-8 eger-egér hibridóma által termelt monoklonálís ellenanyag humanizált változata.
    ó. A?· I igénypont szerinti elbsanyag, amely sz alábbiakat tartalmazza:
    (a) nehéztáncot, amely az alábbi variábilis régiók bármelyikét tartalmazza; a 31. azonosítószámú szekvencia. 1-119. atmausav-eldaháncait vagy annak funkcionális ekvivalensét; az 56. azonosítószámú szekvencia I 119. amlnos&v-oidaiiánenk vagy annak hmkcionális ekvivalensét; az 59. azonosítószámú szekvencia 1-119. mnlnosav-o-Wlénoaít vagy annak funkcionális ekvivalensét; a 60. azonosítószámú- szekvencia 1-119. aminossY-oídaliáucait vagy annak fanfccionális ekvivalensét; vagy a 61. aznnosítószámú szekvencia 1-119. aminosavtriíteiiárecteí vagy annak fimkciosáiís .ekvivalensét; és (b) köooyöláscol, amely az alábbi variábilis régiók bármelyikét tartalmazza: a 4Ő. azonosítószámú szekvencia 1-198. aminom'-oklaliárscait vagy sónak funkcionális ekvivalensét; a 72, azonosítószámú szekvencia 1-10S. atnínösav-oldalláncalt vagy annak fekeionálfs ekvivalensét; a 73. azonosítószámú szekvencia 1-198, amisosav-oltfclláncak vagy annak funkcionális ekvivalensét; a 74. azonosítószásxú szekvencia 1-198, aminosav-okktlláncait vagy annak fonkciosálls ekvivalensét; a 75. azonosítószámú szekvencia 1-198, aminösavoldalllánealt vagy annak ümkeionáiis ekvivalensét; vagya 76, azonosítószámú szekvencia 1-108. aminosavoiáaíláncait vagy annak fankcionáhs ekvivalensét,
  6. 7. A 6. igénypont szerinti ellenanyag, amelyben á oohézlásc humán immunglobulin Cl nehézláne állandó rógiéjút tartalmazza és a könnyólánc humán immunglobulin kappa könnyútánc állmáé régióját tartalmazza.
  7. 8, Az 1. igénypont -szerinti tisztított ellenanyag, amely az. alábbiakat tartalmazza;
    (a) nobézláncnt, amely az alábbi variábilis régiók bármelyikét tartalmazza; az E. coli íMí99..pRS14 (FERM BF-75S6) által hordozott vektor inzertjének nukíeoiid-szekvenei<ía dltaí kódolt variábilis régió vagy annak bmkeianóiis· ekvivalense; az E. coli. 3M IWpKA 15 (FBRM B9-75S5) által hordozott vektor stszeslyonok uakleotid-szekveaciája állat kódolt variábilis régió vagy annak funkcionális ekvivalense; az E. coli .IMW9/pR€19 (FBRM SF-7557) által hordozod vektor inzertjének nukleotld-s^jkvencíája úlízl kódolt variúbi-88bs régió vagy annak tonkcionálb ekvlvalcsse; az E. -coli íM 189/pHO2l (FERM 8P-7558) által hordozott vektor inzertjének suklcothl-szekvcac^ja által kódolt variábilis régió vág;? mmnk funkcionális ekvivalense; vagy az E, «ói JMl-89/pHMi I <FEkó4 EF-7 559) által hordozott vektor rorertjónek nokleotid-szekvenciája által kódolt variábilis régió vagy anaak fonkcionáíis ekvivalense, és (b) kónnyalánoot. amely állandó régióhoz kapcsolódó alábbi variábilis régiók bármelyikét tartalmazza: az E. coll i-5l-15ívpHSG.''M2-í-4 (FSRM 8P-75Ó3) áltál hordozott vektor inzertjének. oukleottd-szekveaciéja által kódolt állandó régióhoz kapcsolódó variábilis régió vagy annak funkcionális ekvivalense; az B, coli DHSa^HSG/M 1-2-2 (FSRM BP-75é2) által hordozott vektor inzertjének nakleotld-szekvemiája által .kódolt állandó régióhoz kapcsolódó variábilis régió vagy annak ianketonális ekvivalense; sz F, coli DHSrépHSö/M33-22 (FERIM 8P-75Ó4) áltat hordozott vektor inzertjének nukleoiid-szekveaci^a által kódolt variábilis régió vagy annak funkcionális ekvivalense; az E. coli DOS«ípHSG/M4-5-3-t (FERM BF-758S) által hordozott vektor inzertjének nukleetsf-szekvenciája által kódolt állandó régióhoz kapcsolódó variábilis régió -vagy sónak fankeioaálts ekvivalense;, vagy az.E, etilt DH5a/pHSG/M&4-4-l (FERM BF-75ÓŐ) által hordozott: vektor inzertjének nakieréid-szekvonciája által kódolt állandó régióhoz kapcsolódó variábilis régió vagy annak fankciöaális ekvivalense..
  8. 9, A 8. igénypont szerinti tisztított ellenanyag, amelyben a ocbázlártc hantán itntntmglobrdín Gl nebézláoc állandó régióját tartalmazza és· a kbnnyúlánc humán itnrnanglebuiin κηρρο kSonyőiáne állandó régióját tartalmazza.
    18. Az 1. Igénypont szerinti dsztitott ellenanyag, amely az alábbiakat tartalmazza:
    (a) nehézáásre immnngtobnli.nl., amelynek a variábilis régtójónak az általános képlete:. 1-es vázrégió···.....
    CDRÍ — 2-es vázrégló ·—CDR2.—~ 3-as vteégíó — CGB2 —4-ss vázrégió, amelyben a CDR1 a 25, azonosítószámú szekvencia i -S- smtoosavsóból áll, a CÖR2 a 26. azonoshőszámó szekvencia 1-17. amiuosavsibói ált ós a CDR3 a 27, azonosítószámú szekvencia 1-1. Ö. smlnosavalból óik ós ib) kbottyöláse Immunglobulint, stnelyack a variábilis régiójának sz általános képletet 5-ós vázrégió ·— CDR4 ·— ó-os vázrégió — CDRS — ?-es vázrégló......CÖRó.....8-as vázrégi®, amelyben a CÖR4 a 22. azonosítószámú szekvencia 1-11. atntnesavaiból áll, a CDR5 a 29. azonosítószámú szekvencia 1-7, aminosavaiból áll és a CDRÓ a 38. azonosítószámú szekvoacia 1-8, ammosavaiból áll,
  9. 11. hr vltro eljárás DRS-bt expresszáió célsejt sejthalálénak szelektív todnkákfeárg. azzal jellemezve, hogy a célsejteket sdstkezésbo hozzak I. igénypont szerinti ellenanyag terápiás menny Bégével;
  10. 12, A 11. igénypont szerinti eljárás, azsaí jellemezve, hogy I>R5-Öí ezpresszáló ráksejtek sejthaláléi Ináakáljok, '
  11. 13- A 11 igénypont .szermii eljárás, azzal jellemezve, hogy DRS'-öt expresszáió íniíasmnarérikus szinovlális sejtek sejthalálát indukáltok,
  12. 14, A 11. igénypont szentül eljárás, azzal je llemezve, begy DR5-8t expresszáió aktivált T-sejtek vagy 8-sepek sejthalálát. Indukáljak.
  13. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aktivált T-sejlskkéni vagy B-sejtekkéní aktivált thntóollák sejthalálát indukáltok.
    ló, Részlsmény, .aíneiy 1. igéoypsnf szerinti ellenanyag gyOgyászatilag hatásos mennyiségét és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
    '89·*
    Π. Kereskedelmi reagenskészM apoptózis iadukáiására, amely 5, igénypont szerinti eileuanyasot íart&iraaz tartályban.
    IS. Az 1. igénypont szerimí ellenanyag alkalmazása célsejtek vagy hibás szabályozású sejtek szelektív sejthalálának terápiás «iősiiitására,
  14. 19. Az I, Igénypont szerinti elsé ellenanyag terápiás mennyiségének alkalmazása apoptózisssi kapcsolatos betegségbe® szenvedő személy kezelésére szolgáló készítmény előállítására.
    26, A.z 1. Igénypont szerinti ellenanyag alkalmazása rákos személy kezelésére szolgáló készítmény előállításra, ahol a készítmény az alanynak beadandó formában van, és ahol az ellenanyag, ráksejtek szelektív sejthalálát indukálja,
  15. 21. A 20. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a készítmény egy második ellenanyagot Is tartalmaz, amely fokozza s ráksejtek sejthalálát,
  16. 22. A 28. igénypont szerinti alkalmazás, tárol a készítmény terápiás szert is tartalmaz,
  17. 23. A 22. igénypont szerinti alkalmazás, aböl a terápiás szer kemoterápiás szer,
  18. 24. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a terápiás szer a bieomíein, karixtpiatín, klöfambnell, ctszpiadn, kolhiefo, eikfofosziámíd, dsnnorubíci®, aeíinomycin, disthylstilhestrol, dözöraoleis, etoposide, 5ífoörouracik ífoxorldro, méltóién, metotrexát, mltomicm, 6-merkaptopurin, pmditaxeh tenipozid, ó-tfoguamn, vinkrísztio vagy vfoblasztín bármelyike.
  19. 25. Az 1, ígéaypoat szerinti alleoaayag alkalmazása Inllammatorikas betegségben vagy autoimmun betegségben szenvedő személy kezelésére szolgáié készítmény előállítására, ahol a készítmény az alanynak beadandó formában van, és ahol az ellenanyag s DR5-receptort hordozó célsejtek szelektív sejthalálát indukálja.
  20. 26. A 25. igénypont szerinti, alkalmazás, ahol a célsejtek aktivált T-sejtek vagy B-sejtsk.
  21. 27. A 26. Igénypont szerinti alkalmazás, ahol az aktivált Τ-sejfok vagy B-sejtek aktivált ihnfocíták.
  22. 28. A 25.. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a célsejtek mRammatorjkna szmovísííssejtek,
  23. 29. Á 25, igénypont szerinti alkalmazás, amely továbbá magában foglalja a személynek egy második ellenanyag gyógyászatilag hatásos aseanyíségéoek a beadását Is, gtady fokozza a célsejtek sejthalálát.
    .36, A 2S, igénypont szerinti alkalmazás, amely továbbá magában foglalja a személynek, terápiás szer gyógyászatilag hatásos mennyiségének a beadását is,
  24. 31. A 36, igénypont szerinti alkalmazás, áltól a terápiás szer biszrndolílmeleímid vagy metotrexát,
  25. 32. A 25. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az intlammatorlkus betegség vsgy autoimmun betegség renmatotd artrítlsz.
  26. 33. Az 5. Igénypont szerinti ellenanyag alkalmazása rákos szentélyben a ráksejtek szelektív sejthalálának ísdukáiásávai történő kezelésére szolgáló készítmény előállítására.
  27. 34. Az 5. igénypont szerinti ellenanyag alkalmazása autoimmun betegségbe® szenvedő személy kezelésére szolgáló készítmény előállítására, almi az ellenanyag célsejtek szelektív sejthalálát indukálja.
    PCT/US01/14151
    1/38
HU0400951A 2000-05-02 2001-05-02 Egy tumornekrózis faktorral rokon apoptózis-indikáló ligandum receptorára specifikus antitest és alkalmazásai HU229417B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20134400P 2000-05-02 2000-05-02
PCT/US2001/014151 WO2001083560A1 (en) 2000-05-02 2001-05-02 An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0400951A2 HUP0400951A2 (hu) 2004-07-28
HUP0400951A3 HUP0400951A3 (en) 2012-09-28
HU229417B1 true HU229417B1 (hu) 2013-12-30

Family

ID=22745456

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0500800A HU230399B1 (hu) 2000-05-02 2001-05-02 Egy tumornekrózis-faktorral rokon apoptózis-indukáló ligandum receptorára specifikus antitest és alkalmazásai
HU0400951A HU229417B1 (hu) 2000-05-02 2001-05-02 Egy tumornekrózis faktorral rokon apoptózis-indikáló ligandum receptorára specifikus antitest és alkalmazásai

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0500800A HU230399B1 (hu) 2000-05-02 2001-05-02 Egy tumornekrózis-faktorral rokon apoptózis-indukáló ligandum receptorára specifikus antitest és alkalmazásai

Country Status (28)

Country Link
US (6) US7244429B2 (hu)
EP (4) EP2368910B1 (hu)
JP (4) JP4156238B2 (hu)
KR (2) KR100817967B1 (hu)
CN (2) CN101585881B (hu)
AT (1) ATE426615T1 (hu)
AU (2) AU5936601A (hu)
BG (3) BG65929B1 (hu)
BR (1) BR0110547A (hu)
CA (1) CA2407965C (hu)
CY (1) CY1109179T1 (hu)
CZ (2) CZ306996B6 (hu)
DE (1) DE60138097D1 (hu)
DK (1) DK1287035T3 (hu)
EE (1) EE05548B1 (hu)
ES (1) ES2323448T3 (hu)
HK (3) HK1050372A1 (hu)
HU (2) HU230399B1 (hu)
IL (1) IL152605A0 (hu)
MX (1) MXPA02010823A (hu)
NO (2) NO329843B1 (hu)
NZ (1) NZ522881A (hu)
PL (1) PL211733B1 (hu)
PT (1) PT1287035E (hu)
RU (1) RU2298013C2 (hu)
TW (1) TWI318983B (hu)
WO (1) WO2001083560A1 (hu)
ZA (1) ZA200209230B (hu)

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7528239B1 (en) 1997-02-13 2009-05-05 Immunex Corporation Receptor that binds trail
US6872568B1 (en) 1997-03-17 2005-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5 antibodies
CN1184315C (zh) 1997-03-17 2005-01-12 人类基因组科学公司 包含死亡结构域的受体－5
AU4817200A (en) * 1999-05-04 2000-11-17 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5
US7476383B2 (en) 2000-05-02 2009-01-13 The Uab Research Foundation Antibody selective for DR4 and uses thereof
TWI318983B (en) 2000-05-02 2010-01-01 Uab Research Foundation An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
US7279160B2 (en) 2000-05-02 2007-10-09 The Uab Research Foundation Combinations of DR5 antibodies and other therapeutic agents
US20060062786A1 (en) * 2000-11-08 2006-03-23 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US20030228309A1 (en) * 2000-11-08 2003-12-11 Theodora Salcedo Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
AU2003222427B8 (en) 2000-11-17 2010-04-29 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same
US8071740B2 (en) 2000-11-17 2011-12-06 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same for regulation of angiogenesis
CN100475848C (zh) 2001-05-18 2009-04-08 麒麟麦酒株式会社 抗trail-r抗体
US20050129616A1 (en) * 2001-05-25 2005-06-16 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US7348003B2 (en) 2001-05-25 2008-03-25 Human Genome Sciences, Inc. Methods of treating cancer using antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US20050214209A1 (en) * 2001-05-25 2005-09-29 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
NZ529359A (en) 2001-05-25 2007-04-27 Human Genome Sciences Inc Antibodies that immunospecifically bind to a TR4 polypeptide or polypeptide fragment or variant of TR4 and their use in a medicament for treating cancer
US7361341B2 (en) * 2001-05-25 2008-04-22 Human Genome Sciences, Inc. Methods of treating cancer using antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
US20090226429A1 (en) * 2001-05-25 2009-09-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies That Immunospecifically Bind to TRAIL Receptors
KR100866117B1 (ko) 2001-10-19 2008-10-31 바스큘라 바이오제닉스 리미티드 혈관형성의 표적화 억제조절 및 항암 치료를 위한폴리뉴클레오타이드 작제물, 약학적 조성물 및 방법
ES2357225T3 (es) * 2001-11-01 2011-04-20 Uab Research Foundation Combinaciones de anticuerpos anti-dr5 y anticuerpos anti-dr4 y otros agentes terapéuticos.
WO2003038043A2 (en) * 2001-11-01 2003-05-08 Uab Research Foundation Combinations of dr5 antibody and other therapeutic agents
EP1465925A4 (en) * 2001-12-20 2006-02-08 Human Genome Sciences Inc "ANTIBODIES THAT IMMUNE SPECIFICALLY TO TRAIL RECEPTORS"
US20050069549A1 (en) 2002-01-14 2005-03-31 William Herman Targeted ligands
DE10210427A1 (de) * 2002-03-09 2003-10-09 Hans Konrad Mueller-Hermelink Humaner monoklonaler Antikörper
EP1521776A2 (en) 2002-07-04 2005-04-13 Oncomab Gmbh Neoplasm specific antibodies and uses thereof
KR20090046973A (ko) * 2002-11-27 2009-05-11 아이알엠 엘엘씨 암세포에서 세포자멸사를 유도하기 위한 방법 및 조성물
AU2008201431B2 (en) * 2002-11-27 2011-11-24 Irm, Llc Methods and compositions for inducing Apoptosis in cancer cells
DE10311248A1 (de) 2003-03-14 2004-09-30 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper
EP1531162A1 (en) 2003-11-14 2005-05-18 Heinz Vollmers Adenocarcinoma specific antibody SAM-6, and uses thereof
DE10353175A1 (de) 2003-11-14 2005-06-16 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper mit fettsenkender Wirkung
JP2007530588A (ja) * 2004-03-23 2007-11-01 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド レセプターカップリング剤およびその治療用途
CN100427505C (zh) * 2004-08-19 2008-10-22 中国医学科学院基础医学研究所 抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的受体dr5单克隆抗体（ad5-10）及其制法与用途
WO2006063390A1 (en) * 2004-12-13 2006-06-22 Evogenix Ltd Osteoprotegerin variant proteins
EP1846034A4 (en) 2005-02-02 2010-11-10 Uab Research Foundation AGENTS AND METHODS OF REDUCING THE RESISTANCE TO APOPTOSIS INDUCING DEATH RECEPTOR AGONISTS
US8029783B2 (en) * 2005-02-02 2011-10-04 Genentech, Inc. DR5 antibodies and articles of manufacture containing same
JP5004154B2 (ja) * 2005-04-06 2012-08-22 一般財団法人化学及血清療法研究所 組換え抗ボツリヌス神経毒素抗体
WO2006138739A2 (en) 2005-06-17 2006-12-28 Tolerx, Inc. Ilt3 binding molecules and uses therefor
UA97096C2 (ru) * 2005-08-31 2012-01-10 Емджен Інк. Выделенное антитело, которое специфически связывает рецептор-2 trail (tr-2)
PE20071101A1 (es) * 2005-08-31 2007-12-21 Amgen Inc Polipeptidos y anticuerpos
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
CN101605887B (zh) 2006-05-16 2012-09-05 协和发酵麒麟株式会社 蛋白的高分泌生产方法
JP5597793B2 (ja) 2006-06-19 2014-10-01 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション Ｉｌｔ３結合分子およびその使用
KR100847010B1 (ko) * 2006-07-05 2008-07-17 아주대학교산학협력단 세포사멸 수용체 5 (ｄｒ5)에 특이적으로 결합하는 항체 및이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
KR100804126B1 (ko) 2007-02-09 2008-02-19 아주대학교산학협력단 종양 괴사 인자―관련 세포사멸―유도 리간드의 수용체에특이적으로 결합하는 1가의 인간 단일클론 항체 및 그의항원결합 단편
TW200911835A (en) * 2007-06-08 2009-03-16 Irm Llc Methods and compositions for inducing apoptosis in cancer cells
JPWO2009020094A1 (ja) * 2007-08-09 2010-11-04 第一三共株式会社 疎水性分子で修飾した抗体
US8409825B2 (en) 2007-10-31 2013-04-02 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Method for high-level secretory production of protein
WO2010047509A2 (ko) * 2008-10-24 2010-04-29 아주대학교 산학협력단 친화도와 안정성이 향상된 항 ｄｒ5 항체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
CA2775350A1 (en) * 2009-09-24 2011-03-31 Seattle Genetics, Inc. Dr5 ligand drug conjugates
KR101278690B1 (ko) * 2009-10-19 2013-06-24 한올바이오파마주식회사 변형된 인간 종양 괴사 인자 수용체-1 폴리펩티드 또는 그의 절편 및 그의 제조방법
CN102666588A (zh) 2009-11-05 2012-09-12 Uab研究基金会 治疗基底细胞样基因型癌症
US9238069B2 (en) 2009-12-16 2016-01-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method of sensitizing cancer cells to the cytotoxic effects of death receptor ligands in cancer treatment
US9120855B2 (en) 2010-02-10 2015-09-01 Novartis Ag Biologic compounds directed against death receptor 5
EP2534170B1 (en) 2010-02-12 2017-04-19 Pharmascience Inc. Iap bir domain binding compounds
US8703712B2 (en) 2010-03-18 2014-04-22 The Uab Research Foundation Targeting cancer stem cells with DR5 agonists
NZ610153A (en) * 2010-10-29 2014-07-25 Daiichi Sankyo Co Ltd Novel anti-dr5 antibody
JP6130307B2 (ja) 2011-03-17 2017-05-17 ザ ユニバーシティ オブ バーミンガム 再指向性免疫療法
WO2012151317A1 (en) * 2011-05-03 2012-11-08 Genentech, Inc. Vascular disruption agents and uses thereof
JP6268173B2 (ja) 2012-07-19 2018-01-24 第一三共株式会社 抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体
KR102268351B1 (ko) * 2012-07-25 2021-06-22 셀덱스 쎄라퓨틱스, 인크. 항-kit 항체 및 그의 용도
CN103074425B (zh) * 2012-12-29 2014-01-01 深圳市第三人民医院 Cd263基因的用途
WO2015051159A1 (en) * 2013-10-02 2015-04-09 The Rockefeller University Amyloid protofibril antibodies and methods of use thereof
CN104710533A (zh) * 2013-12-12 2015-06-17 中国科学院深圳先进技术研究院 sDR5-Fc融合蛋白及其用途
CN107207601A (zh) 2015-01-20 2017-09-26 Igm生物科学股份有限公司 肿瘤坏死因子(tnf)超家族受体结合分子及其应用
RU2017129236A (ru) 2015-01-26 2019-03-07 Макродженикс, Инк. Мультивалентные молекулы, содержащие dr5-связывающие домены
CN105061604B (zh) * 2015-08-19 2018-03-16 河南大学 sDR5‑Fc融合蛋白突变体及其应用
CN116333125A (zh) 2015-10-30 2023-06-27 银河生物技术有限责任公司 结合死亡受体4和死亡受体5的抗体
CN106924735A (zh) * 2015-12-29 2017-07-07 上海交通大学医学院附属瑞金医院 多巴胺1类受体激动剂在制备肿瘤治疗药物中的用途
US10849912B2 (en) 2016-02-09 2020-12-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method of sensitizing cancer cells to the cytotoxic effects of apoptosis inducing ligands in cancer treatment
MX2018010445A (es) 2016-03-01 2019-10-17 Yissum Res Dev Co Of Hebrew Univ Jerusalem Ltd Anticuerpos especificos del receptor de poliovirus humano (rvp).
KR101926166B1 (ko) * 2016-05-24 2018-12-06 재단법인 아산사회복지재단 수용체 시너지 활성을 이용한 nk 세포의 활성도 검사 방법 및 이를 이용한 nk 세포의 활성도가 관련된 질환의 진단 방법
US11680101B2 (en) 2017-01-27 2023-06-20 Kymab Limited Anti-OPG antibodies
KR101926834B1 (ko) 2017-03-21 2018-12-07 동아에스티 주식회사 항-dr5 항체 및 그의 용도
BR112019025328A2 (pt) 2017-06-07 2020-06-23 Genmab B.V. Composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, métodos para tratar um indivíduo tendo um câncer e para preparar uma composição farmacêutica, e, kit de partes.
EP3684409A4 (en) * 2017-09-22 2021-06-23 Immunogen, Inc. SEPARATION OF TRIPLE LIGHT CHAIN ANTIBODIES USING CATION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY
WO2019100193A1 (zh) * 2017-11-21 2019-05-31 深圳先进技术研究院 抗dr5的抗体及其制备方法和应用
WO2019100194A1 (zh) * 2017-11-21 2019-05-31 深圳先进技术研究院 抗dr5的抗体及其制备方法和应用
CN108251443A (zh) * 2018-01-23 2018-07-06 深圳市人民医院 一种tnfrsf10c重组质粒、制备方法及其应用
CN110305211A (zh) 2018-03-20 2019-10-08 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
US11702482B2 (en) 2018-12-17 2023-07-18 Revitope Limited Twin immune cell engager
EP4277706A1 (en) 2021-01-15 2023-11-22 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut- Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis Inducers of senescence, in combination with a selective death receptor 5 (dr5) agonist, for use in a method of treating cancer

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US6433147B1 (en) * 1997-01-28 2002-08-13 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor-4
JP4450870B2 (ja) * 1997-01-28 2010-04-14 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド 死ドメイン含有レセプター４（ｄｒ４：死レセプター４）、ｔｎｆ−レセプタースーパーファミリーのメンバーおよびｔｒａｉｌへの結合
US6072047A (en) * 1997-02-13 2000-06-06 Immunex Corporation Receptor that binds trail
US6313269B1 (en) * 1997-03-14 2001-11-06 Smithkline Beecham Corporation Tumor necrosis factor related receptor, TR6
US6872568B1 (en) * 1997-03-17 2005-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5 antibodies
CN1184315C (zh) * 1997-03-17 2005-01-12 人类基因组科学公司 包含死亡结构域的受体－5
AU734758B2 (en) 1997-04-01 2001-06-21 Sankyo Company Limited Anti-fas antibodies
AU7126498A (en) 1997-04-16 1998-11-11 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Tumor necrosis factor receptor related proteins tango-63d and tango-63e
JP2001511653A (ja) 1997-05-15 2001-08-14 ジェネンテク，インコーポレイテッド Ａｐｏ−２レセプター
US6342369B1 (en) * 1997-05-15 2002-01-29 Genentech, Inc. Apo-2-receptor
AU8400398A (en) 1997-07-11 1999-02-08 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Nucleic acid encoding a novel chemotherapy-induced protein, and methods of use
EP0998561A4 (en) * 1997-07-15 2004-08-18 Immunex Corp RECEPTOR DES TRAIL PROTEIN
WO1999007861A1 (en) 1997-08-06 1999-02-18 Laboratório Medinfar-Produtos Farmacêuticos, Lda. DNA INTEGRATION INTO 'MYCOBACTERIUM spp.' GENOME BY TRANS-COMPLEMENTATION USING A SITE-SPECIFIC INTEGRATION SYSTEM
ATE233887T1 (de) * 1997-08-13 2003-03-15 Sortech Ag Sorptionsspeicher, anordnung und verfahren zur speicherung von wärme
AU8784498A (en) * 1997-08-15 1999-03-08 Idun Pharmaceuticals, Inc. Trail receptors, nucleic acids encoding the same, and methods of use thereof
AU9376498A (en) 1997-09-05 1999-03-22 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
AU738688B2 (en) 1997-09-12 2001-09-27 Apoxis Sa Cysteine rich receptors-train
US7105640B2 (en) * 1997-10-17 2006-09-12 Genentech, Inc. Anti-pro792 antibodies
US20040120947A1 (en) 1998-01-26 2004-06-24 Genentech, Inc. DR4 antibodies and uses thereof
CA2318405C (en) 1998-01-26 2014-01-07 Genentech, Inc. Antibodies to death receptor 4(dr4) and uses thereof
US6252050B1 (en) * 1998-06-12 2001-06-26 Genentech, Inc. Method for making monoclonal antibodies and cross-reactive antibodies obtainable by the method
AU779402B2 (en) * 1999-04-12 2005-01-20 Genentech Inc. Tumor necrosis factor homologs and nucleic acids encoding the same
AU4817200A (en) 1999-05-04 2000-11-17 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5
AU4984300A (en) 1999-05-06 2000-11-21 Vishva M Dixit Death domain containing receptor 4
ES2325305T3 (es) 1999-05-28 2009-09-01 Genentech, Inc. Anticuerpos dr4 quimericos y usos de los mismos.
PT1192185E (pt) 1999-06-09 2006-11-30 Genentech Inc Sinergismo de agonista do receptor de apo-2l e cpt-11
US6294546B1 (en) 1999-08-30 2001-09-25 The Broad Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Uses of diterpenoid triepoxides as an anti-proliferative agent
EP1616882A3 (en) 1999-09-15 2007-02-28 Genentech, Inc. Apo-2 receptor antibodies
HUP0300369A2 (hu) 2000-04-11 2003-06-28 Genentech, Inc. Többértékű antitestek és alkalmazásuk
TWI318983B (en) 2000-05-02 2010-01-01 Uab Research Foundation An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
US7279160B2 (en) * 2000-05-02 2007-10-09 The Uab Research Foundation Combinations of DR5 antibodies and other therapeutic agents
US7476383B2 (en) * 2000-05-02 2009-01-13 The Uab Research Foundation Antibody selective for DR4 and uses thereof
EP1339426A4 (en) 2000-11-08 2004-06-30 Human Genome Sciences Inc ANTIBODIES WITH IMMUNOSPECIFIC BINDING TO TRAIL RECEPTORS
US20030228309A1 (en) * 2000-11-08 2003-12-11 Theodora Salcedo Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US6965023B2 (en) * 2000-11-17 2005-11-15 The Burnham Institute Death domain proteins
EP1409544B1 (en) 2001-07-03 2009-06-17 Genentech, Inc. Human dr4 antibodies and uses thereof
ES2357225T3 (es) 2001-11-01 2011-04-20 Uab Research Foundation Combinaciones de anticuerpos anti-dr5 y anticuerpos anti-dr4 y otros agentes terapéuticos.
WO2003038043A2 (en) 2001-11-01 2003-05-08 Uab Research Foundation Combinations of dr5 antibody and other therapeutic agents

Also Published As

Publication number Publication date
US20120076792A1 (en) 2012-03-29
BG66153B1 (bg) 2011-08-31
EP2065400A3 (en) 2009-07-22
US20130243780A1 (en) 2013-09-19
DK1287035T3 (da) 2009-06-15
BR0110547A (pt) 2004-06-22
JP4156238B2 (ja) 2008-09-24
HUP0400951A2 (hu) 2004-07-28
NO338228B1 (no) 2016-08-08
CN1440424A (zh) 2003-09-03
EP2368910B1 (en) 2016-02-10
ATE426615T1 (de) 2009-04-15
CN101585881A (zh) 2009-11-25
NO20054145L (no) 2002-12-18
EE200200621A (et) 2004-06-15
BG107275A (bg) 2004-09-30
EP2065401B1 (en) 2016-08-10
EP1287035B1 (en) 2009-03-25
CZ304614B6 (cs) 2014-08-06
RU2002132255A (ru) 2005-01-20
EE05548B1 (et) 2012-06-15
EP2065401A2 (en) 2009-06-03
JP2004502409A (ja) 2004-01-29
EP1287035A4 (en) 2004-09-29
JP3892466B2 (ja) 2007-03-14
KR20060092292A (ko) 2006-08-22
PL366195A1 (en) 2005-01-24
AU2001259366B2 (en) 2005-09-08
HK1162524A1 (zh) 2012-08-31
CN100497388C (zh) 2009-06-10
ZA200209230B (en) 2004-03-16
BG109275A (en) 2006-10-31
RU2298013C2 (ru) 2007-04-27
HK1050372A1 (en) 2003-06-20
TWI318983B (en) 2010-01-01
CN101585881B (zh) 2014-11-26
JP2007091749A (ja) 2007-04-12
PL211733B1 (pl) 2012-06-29
EP2368910A1 (en) 2011-09-28
ES2323448T3 (es) 2009-07-16
IL152605A0 (en) 2003-06-24
HUP0400951A3 (en) 2012-09-28
EP2065401A3 (en) 2009-07-22
US9700618B2 (en) 2017-07-11
DE60138097D1 (de) 2009-05-07
CY1109179T1 (el) 2014-07-02
CA2407965A1 (en) 2001-11-08
CZ2006291A3 (cs) 2017-11-01
KR20030055177A (ko) 2003-07-02
US8067001B2 (en) 2011-11-29
PT1287035E (pt) 2009-06-30
US7790165B2 (en) 2010-09-07
CZ306996B6 (cs) 2017-11-01
JP2005232187A (ja) 2005-09-02
KR100817967B1 (ko) 2008-03-31
CA2407965C (en) 2014-10-14
US20070298039A1 (en) 2007-12-27
BG65929B1 (bg) 2010-05-31
JP4575975B2 (ja) 2010-11-04
NO329843B1 (no) 2011-01-10
MXPA02010823A (es) 2004-05-05
JP2009005707A (ja) 2009-01-15
US20030190687A1 (en) 2003-10-09
NO20025253L (no) 2002-12-18
NO20025253D0 (no) 2002-11-01
HU0500800D0 (en) 2005-10-28
NZ522881A (en) 2005-05-27
US8715668B2 (en) 2014-05-06
EP2065400B1 (en) 2014-11-05
EP2065400A2 (en) 2009-06-03
US8329180B2 (en) 2012-12-11
EP1287035A1 (en) 2003-03-05
US20140308288A1 (en) 2014-10-16
US7244429B2 (en) 2007-07-17
AU5936601A (en) 2001-11-12
CZ20023917A3 (cs) 2003-05-14
HU230399B1 (hu) 2016-04-28
HK1126506A1 (zh) 2009-09-04
WO2001083560A1 (en) 2001-11-08
US20110008324A1 (en) 2011-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU229417B1 (hu) Egy tumornekrózis faktorral rokon apoptózis-indikáló ligandum receptorára specifikus antitest és alkalmazásai
AU2018241099B2 (en) Antibodies and vaccines for use in treating ROR1 cancers and inhibiting metastasis
HU230378B1 (hu) Anti-DR5 ellenanyagok és anti-DR4 ellenanyagok és más terápiás ágensek kombinációi
CA2798778C (en) Anti-human trop-2 antibody having anti-tumor activity in vivo
RU2573897C2 (ru) Антитела к cxcr4 и их применение для лечения рака
US20100330095A1 (en) Axl antibodies
CN100482276C (zh) 肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体受体的选择性抗体及其制备药物的用途
CN102939306B (zh) 用于治疗癌症的人源化抗cxcr4抗体
CN113164589A (zh) 用于调节单核细胞和巨噬细胞发炎表型的组合物和方法以及其免疫疗法用途
EP1981969A1 (en) Gitr antibodies for the treatment of cancer
HU230586B1 (hu) Anti-ErbB antitest/maytansinoid konjugátumok alkalmazása rákos betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására
KR20190015747A (ko) Baff-r 표적 키메라 항원 수용체-변형된 t 세포 및 그 용도
US20220396627A1 (en) Anti-siglec-9 compositions and methods for modulating myeloid cell inflammatory phenotypes and uses thereof
EA030182B1 (ru) Антитела, специфические для кадгерина-17
CN101389658A (zh) 显示cd59表面表达的细胞的细胞毒性介导
JP2010530215A (ja) 成長ホルモンおよび関連ホルモンの阻害剤、ならびにそれらの使用方法
CN102027014A (zh) 用于治疗癌症的新抗体
NZ544440A (en) Cancerous disease modifying antibodies
TW202031687A (zh) 一種融合蛋白及其用途
AU2004205435B2 (en) Cancerous disease modifying antibodies
TW526205B (en) Anti-Fas antibodies
CN115996953A (zh) 用于调节髓系细胞炎性表型的抗vsig4组合物和方法及其用途
KR20220042128A (ko) 골수성 세포 염증성 표현형을 조절하기 위한 항-cd53 조성물 및 방법, 그리고 이의 용도
CN114423452A (zh) 用于调节髓系细胞炎性表型的抗lrrc25组合物和方法及其用途
CN114401990A (zh) 用于调节髓系细胞炎性表型的抗psgl-1组合物和方法及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
RH9A Decision on the lapse of patent protection withdrawn