JP4575975B2 - 腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導性リガンドレセプターに対して選択的な抗体およびそれらの用途 - Google Patents
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Description
また、癌の発生および進行に対するレセプターエピトープのバリエーションの効果を決定するための癌研究における、抗DR5抗体についての必要性が存在する。さらに、TRAILレセプター変異の機能性は、癌の早期検出における他の生体マーカーと組み合されそして腫瘍攻撃性の予測物として使用される場合、有用な臨床的診断ツールであることが証明される。
標的細胞を、薬学的に有効な量のヒト化DR5抗体と接触する工程を包含する、細胞増殖を阻害するためのプロセスもまた記載される。
本発明の独特の特徴は、細胞表面DR5を結合する能力である。これは、DR5を発現する細胞のフローサイトメトリー分析によって実証される。最初に、DR5の特異的細胞表面結合が、ヒトDR5をコードする全長cDNAによってトランスフェクトされたCOS−7細胞によって確認される。特に、TRA−8のみが、DR5でトランスフェクトされたCOS−7細胞を認識し、空のコントロールベクターもDR4をコードするベクターもこの細胞を認識しない。第二に、3つの異なる起源:造血、神経膠腫および前立腺癌のヒト悪性腫瘍細胞が試験される。トランスフォームされたこれらの腫瘍細胞の大多数は、顕著なレベルの細胞表面DR5を発現したが、発現レベルは大いに変動した。第三に、RA患者およびOA患者由来のヒト原発性滑膜線維芽細胞の2つのパネルが調べられる。全てのRA滑膜細胞は、OA細胞と比較して有意により高いレベルのDR5を発現した。
本発明に従って惹起された抗体が、TRAILレセプターを認識し、そして悪性ヒト腫瘍細胞のアポトーシスを直接的に誘導する能力は、種々の濃度の抗体(特にTRA−8)を用いて、細胞のインビトロ培養の間に細胞生存率アッセイ(ATPLite)によって決定される。大多数の腫瘍細胞は、TRA−8誘導性アポトーシスに感受性である。いくつかの細胞については、TRA−8は、強力なアポトーシス誘導活性を示し、例えば、TRA−8は、pg/mlのレベルでヒトJurkat細胞のアポトーシスを誘導し得る。重要なことに、TRA−8誘導性アポトーシスは、架橋を必要とせず、そして大部分の細胞において、TRA−8は、エンハンサーの存在下で、組換え可溶性TRAILよりも強力なアポトーシス誘導活性を示した。
TRA−8の殺腫瘍活性は、2つのSCID/ヒト腫瘍細胞モデルにおいて評価される。第一に、SCIDマウスは、ヒト白血病Jurkat細胞が静脈内接種され、そして単回用量(100μg)のTRA−8で処理される。結果は、Jurkat細胞のフローサイトメトリー分析およびインサイチュ免疫組織化学的染色によって決定されるように、大多数の移植Jurkat細胞が、TRA−8を用いた処理によって末梢血および脾臓から除去されることを示す。第二に、ヒト星状細胞腫細胞1321N1は、SCIDマウスに皮下接種され、そして腫瘍保有マウスは、単回用量のTRA−8で処置される。腫瘍の大きさおよび組織学的分析によって決定されるように、移植された1321N1細胞の増殖は、TRA−8処置マウスにおいて顕著に阻害される。
8人のRA患者および4人のOA患者から単離された初代滑膜細胞は、DR5の細胞表面発現について試験される。TRA−8は、全てのRA細胞を正に染色(strain)し得るが、全てのOA細胞を負に染色し得る。従って、RAは、TRA−8によって検出されるように、DR5の表面発現によってOAから識別される。
TRA−8がRA滑膜細胞のアポトーシスを誘導する能力は、種々の濃度のTRA−8の存在下でのインビトロ培養の間の細胞生存率アッセイによって決定される。全てのRA細胞は、100ng/mlのTRA−8に対して高レベルから中間レベルの感受性を示した。対照的に、全てのOA細胞は、TRA−8誘導性アポトーシスに対して本質的に耐性である。重要なことに、TRA−8は、RA滑膜細胞に対して、エンハンサーを伴った可溶性TRAILよりも良好なアポトーシス誘導活性を示した。さらに、抗Fas抗体(CH−11)と比較して、TRA−8は、RA滑膜細胞に対して、より良好な選択性を示した。
TRA−8は、TNF−aとしてRA滑膜細胞におけるNF−kb活性化を誘導し得るので、滑膜細胞のMMP1およびMMP3の産生に対するTRA−8の効果が決定される。TNF−aはMMPの用量依存性増加を誘導したが、TRA−8は、MMPの産生を全く誘導できず、そしていくつかの濃度では、TRA−8は、RA滑膜細胞におけるMMPの産生をわずかに減少させた。
カスパーゼはアポトーシスの誘導において重大な役割を果たすので、TRA−8がカスパーゼ活性を誘導する能力は、ヒトJurkat細胞において決定される。Jurkat細胞が低用量(50ng/ml)のTRA−8とともにインキュベートされる場合、カスパーゼ8、カスパーゼ9およびカスパーゼ3の活性化は、Westernブロット分析およびカスパーゼ切断アッセイによって実証されるように、インキュベーションの15分後という早期に観察される。カスパーゼ活性化のタイミング、数および強さに関しては、例証となる抗体TRA−8を含めて本発明の抗体は、他のあらゆる公知のアポトーシス誘導抗体(例えば、抗ヒトFas抗体(CH−11))よりもずっと良好な活性を示した。
a)抗原として使用するための生体高分子の精製;
b)抗体産生細胞の調製であって、抗原の注射を用いた動物の最初の免疫後に、いつ脾臓を取り出すかを決定するために、動物を採血し、そして抗体力価をアッセイする;
c)骨髄腫細胞の調製;
d)抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させる;
e)所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択する;
f)単一細胞クローンを調製する(クローニング);
g)必要に応じて、モノクローナル抗体の大量調製のために、ハイブリドーマ細胞を培養するかまたはハイブリドーマ細胞が移植された動物を成長させる;そして
h)このようにして調製されるモノクローナル抗体の生物学的活性および特異性を試験するか、またはこの抗体の特性に対するマーカーをアッセイする。
抗原として有効な組換えタンパク質(本明細書において以下「組換えヒトDR5」という)は、QBI−293A細胞を、ヒトDR5の細胞外ドメインおよびヒトIgG1抗体(本明細書において以下「IgG」という)のFc領域を含む融合タンパク質についての発現ベクターpAdDR5−IgG(PTA−1428を参照のこと)でトランスフェクトし、ADENO−Questキット(Quantum Biotechnologies Inc.,Canada)を用いてこれを発現させ、そして発現産物を収集し、そして部分精製することによって入手される。プラスミドpAdDR5−IgGは、ヒトDR5およびヒトIgG融合タンパク質をコードするDNAをpAdCMV5(これは、動物細胞のための発現ベクターである)中に挿入することによって構築される。他の物質(例えば、DR5をコードするDNA、ベクターおよび宿主)は本明細書において有効である。
マウスは、アジュバント(例えば、Freund完全アジュバントもしくはFreund不完全アジュバントまたはミョウバン)と混合された、工程(a)において産生された免疫原で免疫される。他の適切な実験動物としては例示的に、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ニワトリ、ウマ、ブタ、ウシおよびヒツジが挙げられる。
確立されたマウス細胞株由来の細胞は、骨髄腫細胞の供給源として役立つ(例えば、8−アザグアニン耐性マウス、BALB/c骨髄腫株P3X63Ag8U.1(P3−U1)(非特許文献35)、P3/NSI/1−Ag4−1(NS−1)(非特許文献36)、Sp2/0−Ag14(SP−2)(非特許文献37)、P3X63Ag8.653(653)(非特許文献38)およびP3X63Ag8(X63)(非特許文献39)から誘導された)。選択される細胞株は、適切な培地(例えば、8−アザグアニン培地)中に逐次移される。8−アザグアニン培地としては、Iscove改変Dulbecco培地(本明細書において以下「IMDM」という)またはDulbecco改変Eagle培地(本明細書において以下「DMEM」という)が挙げられる。RPMI−1640培地には、グルタミン、2−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、ウシ胎児血清(本明細書において以下「FCS」という)および8−アザグアニンが補充される。次いで、細胞は、少なくとも2×107細胞が融合当日に利用可能であることを確実にするために、融合の3日前〜4日前に10% FCSを含む正常な培地(例えば、ASF104培地(Ajinomoto,K.K.)に移される。
使用される骨髄腫株が8−アザグアニンに対して耐性である場合、すなわち、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)酵素が欠損している場合、あらゆる未融合の骨髄腫細胞およびあらゆる骨髄腫−骨髄腫融合物は、HAT培地中で生存することができない。一方、抗体産生細胞の相互の融合物ならびに抗体産生細胞と骨髄腫細胞とのハイブリドーマは、生存し得、前者のみが限られた寿命を有する。従って、HAT培地中でのインキュベーションを続けると、所望のハイブリドーマのみが選択される。
抗体力価を決定するための工程b)において記載された方法と類似の方法を用いて特異抗体を産生することが示されたハイブリドーマは、次いで、クローニングのために別のプレートに移される。適切なクローニング方法としては以下が挙げられる:限界希釈法(ここでは、ハイブリドーマは、プレートの1ウェルあたり1細胞を含むように希釈され、次いで培養される);軟寒天培地中での培養後にコロニーが回収される、軟寒天法;培養のために単細胞を分離するためにマイクロマニピュレータを使用する方法;および「クローン選別」(ここでは、セルソータによって単細胞が分離される)。
次いで、クローニングによって得られるハイブリドーマは、HT培地中ではなく正常培地中で培養される。大規模培養は、回転瓶培養によって、大規模の瓶を用いて、または攪拌培養によって行われる。次いで、大規模培養からの上清は収集され、そして当業者に周知である適切な方法(例えば、ゲル濾過)によって精製されて、本発明の抗体の基礎である抗DR5モノクローナル抗体が得られる。このハイブリドーマはまた、同系マウス(例えば、BALB/cマウスまたはnu/nuマウス)において腹腔内で増殖されて、抗DR5モノクローナル抗体を大量に含む腹水が入手され得る。市販のモノクローナル抗体の精製キット(例えば、MAbTrap GII Kit;Pharmacia)は便利に使用されて、回収された抗体が精製される。
モノクローナル抗体のアイソタイプおよびサブクラスの適切な同定方法としては、Ouchterlony法、ELISAおよびRIAが挙げられる。好ましくは、商業的キット(例えば、Mouse Typer Kit(商標名;BioRad))が、同定のために用いられる。
タンパク質の定量は、Folin−Lowry法によって、または280nmでの吸光度(1.4(OD280)=免疫グロブリン1mg/ml)に基づく算出によって行われ得る。
市販のキット(例えば、SPOTs Kit(Genosys Biotechnologies,Inc.))およびマルチピン(multipin)合成法(Chiron Corp.)に基づく一連のマルチピンペプチド合成キットは便利に使用されて、広範な種々のオリゴペプチドが入手され得る。
<1.1 DR5 cDNAのクローニング>
以下を用いるRT−PCR方法によって、ヒトDR5タンパク質をコードするDNAをクローニングする:
a)テンプレート
TRIzol Reagent(GIBCO BRL)を用いて、HeLa細胞の総RNAを抽出する。PCR反応のためのテンプレートとしては、First−Strand cDNA合成キット(Amersham Pharmacia Biotech)とともに提供された指示マニュアルに従って、このキットを用いて得たcDNAを用いた。
以下のオリゴヌクレオチドプライマーをPCR用に合成する:
5’−gacgatgcccgatctactttaaggg−3’(DR5p1:配列番号1);
5’−ccactgggtgatgttggatggg−3’(DR5p2:配列番号2);
他に特定しない限り、これらの実施例における全てのオリゴヌクレオチドは、Lifetechnologiesによって合成される。蒸留水中に溶解した後、全てのオリゴヌクレオチドを−20℃で保存する。
PCR反応溶液の組成:
テンプレートcDNA、全量で33μlの反応物のうち5μl
プライマーDR5p1、10pmol
プライマーDR5p2、10pmol
10×濃縮PCR緩衝液(キットに添付)、10μl
dNTP(各2.5mM)、4μl;および
Taqポリメラーゼ(Promega)、5単位。
膜貫通ドメインを欠くヒトDR5の可溶性形態を得るために、発現プラスミドベクターを構築した。このベクターは、ヒトIgG1 Fc DNA(41)に融合されたヒトDR5の細胞外ドメインを含む融合タンパク質をコードするように設計される。膜貫通ドメインを欠くヒトDR5をコードするDNAは、以下のPCR反応によって得られる。
PCR反応の鋳型は、pcDNA3−DR5を使用した。
以下のオリゴヌクレオチドプライマーをPCRのために合成した:
5’−gacgatgcccgatctactttaaggg−3’(DR5p1:配列番号1);
5’−ggatccgtggacacattcgatgtc−3’(DR5p3:配列番号3);
他に特定されない限り、これらの実施例における全てのオリゴヌクレオチドは、Lifetechnologiesによって合成する。全てのオリゴヌクレオチドを、滅菌水に希釈後、−20℃で保存する。
実施例1.1(c)のように、PCR反応を行い、そして単離したDNAを増幅した。
QBI−293A細胞(ADENO−Quest Kitで提供される)を、取扱説明書に従って、ADENO−Questキット(Quantum Biotechnologies Inc.,Canada)を使用して、pAdΔDR5−FcおよびQBIウイルスDNA(ADENO−Quest Kitで提供される)を用いて同時トランスフェクトする。組換えウイルスプラークを培養し、そして、上清のELISA分析によってDR5−IgG融合タンパク質の発現についてスクリーニングする。陽性プラークを、QBI−293A細胞中で増殖し、そしてウイルスストックとして−80℃で保存する。50個のシャーレ(150mm)のQBI−293A細胞を、10m.o.i.(感染多重度)で、pAdΔDR5−Fc組換えウイルスを用いてトランスフェクトする。培養培地を、48時間のトランスフェクション後に収穫する。
カラム:プロテインA−セファロースCL−4Bカラム(カラムサイズ2ml;Pharmacia)
溶出緩衝液:0.1M グリシン(pH2.4)、0.15M NaCl
中和緩衝液:1M Tris−HCl(pH8.5)。
<2.1 免疫化>
6〜8週齢の雌性Balb/cマウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)を、アフィニティー精製したヒトDR5/hIgG1融合タンパク質を用いて免疫する。初回のフットパッド(foot−pad)免疫のために、融合タンパク質(50μg)を、フロイント完全アジュバント(Difco,Detroit,MI)中で乳化する。次いで、マウスを1日おきにアジュバントなしで投与された50μgの融合タンパク質の4回の注射で追加免疫する。最後の注射の3日後、局所的なリンパ節由来のリンパ球を、NS−1黒色腫細胞と融合させ、そしてハイブリドーマを、10%ウシ胎児血清を用いて補充したF104培地中で培養する。陽性のハイブリドーマを、プレートが1μg/ml DR5/hIgG1またはコントロールとして同じ量のFas/hIgG1のいずれかを用いてコーティングされた、ELISAによって選択する。ハイブリドーマのアイソタイプを、マウスIgアイソタイプ特異的ヤギ抗体(Southern Biotechnology,Birmingham,AL)のパネルを使用するELISAによって決定する。モノクローナル抗体を、免疫抗マウスIgG1またはプロテインG(Sigma)を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。
追加免疫注入後、3日目に、局所的リンパ節を、マウスから取り出し、50ユニット/ml ペニシリン、50μg/ml ストレプトマイシン、および300μg/ml L−グルタミン酸を含む10mlの無血清RPMI 1640培地(GIBCO BRL)に配置し、そしてスパチュラを使用して器官をメッシュ(Cell Strainer;Falcon)を通過させることによって破壊する。得られた細胞懸濁液を、遠心分離して局所的リンパ節細胞をペレット化し、次いで、これらの細胞を、無血清RPMI培地で2回洗浄する。次いで、洗浄した細胞を、無血清RPMI培地に再懸濁し、そしてカウントした。
4〜10週齢の雌性BALB/cマウス(Japan SLC,Inc.)由来の胸腺を取り出し、上記のようにメッシュ(Cell Strainer;Falcon)で破壊し、そして破壊された細胞を、10%(v/v)FCSを含むHT培地で2回洗浄する。1匹のマウスに由来する胸腺細胞の量に対応する量を、10%(v/v)FCSを含む30mlのHT培地中に懸濁し、フィーダー(feeder)細胞懸濁液を生成する。上の実施例2.2において得られた融合細胞調製物を、このフィーダー細胞懸濁液を用いて10〜100倍に希釈し、そして、フィーダー細胞懸濁液を用いてさらに連続希釈し、5細胞/ml、1細胞/mlおよび0.5細胞/mlの融合細胞密度を有する懸濁液を作製する。このようにして調製したサンプルを、100μl/ウェルで96ウェル細胞培養マイクロプレートのウェルに分配し、そして5%(v/v)CO2下37℃で5日間インキュベートする。
増殖するハイブリドーマ由来の培養物上清を、1μg/ml DR5/hIgG1またはコントロールとしての同じ量のFas/hIgG1(41)のいずれかでコーティングしたプレートを使用するELISAによってスクリーニングする。結合した抗体を、基質としてTMB(Sigma,St Louis,MI)を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合体化抗マウス免疫グロブリン(Southern Biotechnology.Bimingham,AL)を使用して検出する。1μg/mlの濃度の精製されたDR5−IgG1または同じ量のFas−hIgG1を、96ウェルELISA/RIA STRIP PLATE(Costar,NY)のウェルに導入する。プレートを、4℃で一晩静置させ、タンパク質のウェル表面への吸着を可能にする。この時間後、ウェル中の溶液を捨て、そして各ウェルを、PBS−Tweenを用いて3回洗浄する。次いで、1%(w/v)ウシ血清アルブミン(A3803;Sigma Chemicals Co.)を含む100μlのPBSを各ウェルに添加し、そしてプレートを、1時間37℃でインキュベートする。次いで、ウェルを、PBS−Tweenを用いてさらに3回洗浄し、次いで、増殖するハイブリドーマ由来の50μlの各培養物上清を、各ウェルに添加する。次いで、プレートを、1時間37℃でインキュベートし、そしてウェルを再び、PBS−Tweenを用いて4回洗浄する。洗浄後、50μlの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体(Southern Biotechnology.Birmingham,AL)(PBSで1,000倍希釈した)をウェル毎に添加し、そしてプレートを再び37℃で1時間インキュベートし、その後、ウェルをPBS−Tweenを用いて4回洗浄する。次いで、3,3’5,5’−テトラメチル−ベンジジン(TMB)液体基質系(Sigma)を、100μl/ウェルの量で添加し、そしてプレートを、5分間室温で静置し、次いで、100μl/ウェルの0.2N H2SO4を添加することによって反応を停止する。450nm(コントロール650nm)での各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して測定し、融合細胞を、融合細胞上清が添加されていないもの(OD値;約0.03)より明らかに高い吸光度(450nm−650nm、OD値;>0.5)を有したサンプルから選択する。さらに、増殖するハイブリドーマからの培養物上清はまた、Jurkat細胞を使用するアポトーシス誘導活性を測定することによって機能的にスクリーニングされる。Jurkat細胞(1ウェル当り1,000細胞)および5μM ビスインドリルマレイミドVIII(BisVIII,Alexis,San Diego,CA)を含む50μlのRPMI培地を、増殖するハイブリドーマ由来の50μlの培養物上清の存在下で、96ウェルプレートに添加する。細胞を、37℃の一晩加湿インキュベーター中で、インキュベートする。アポトーシスは、製造業者(Packard Instruments)によって指示されるようにATPLiteキットを使用する細胞生存率によって決定し、そしてサンプルを、TopCounter(Packard Instruments)を使用して計数する。
ELISAプレートを、2μg/mlのDR4−IgまたはDR5−Ig融合タンパク質を用いて一晩コーティングする。3%BSAを用いてブロッキングした後、可溶性TRAIL−FLAGまたはTRA−8を示された濃度で添加し、そして37℃で1時間インキュベートする。TRAILまたはTRA−8の結合を、それぞれ、HRP結合体化抗Flag抗体(Alexis)またはHRP結合体化抗マウスIgG1(Southern Biotechnology)によって検出する。反応は、TMB基質緩衝液によって発生し、そしてBenchmark Microplate Reader(BioRad)によって測定する。Kd値を、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software,San Diego,CA)を使用する、1部位結合モデルの非線形回帰によって推定する。競合的ELISAについて、100ng/ml TRAIL−FLAGを添加し、そして種々の濃度のTRA−8の存在下でインキュベートする。TRAILの結合を、上のように決定する。
上の実施例2.3および2.4に記載される工程を、2.4において選択される細胞について5回繰り返す。それにより、いくつかのハイブリドーマクローンの選択を可能にし、クローンの各々は、DR5−IgGに結合するがFas−IgGに結合しない単一抗体を産生した。この選択手順の結果として、マウス−マウスハイブリドーマ(TRA−8と命名され、DR5−IgGに結合するがFas−IgGに結合しない抗体を産生する)を得る。このハイブリドーマ(TRA−8)は、2000年3月1日にAmerican Type Culture Collectionに寄託され、そして登録番号PTA−1428が割り当てられている。
正常なヒト組織および癌組織のホモジネートのウエスタンブロット分析のためのフィルターを、Geno Technology(St Louis,MO)から購入する。各レーンを、抗β−アクチン抗体によって決定されるように、当量のタンパク質でロードする。ブロットを、1μg/ml TRA−8を用いて一晩プローブし、次いで室温で1時間、HRP結合体化ヤギ抗マウスIgG1(Southern Biotechnology)によってプローブし、そして化学発光によって現像した。
ヒト組織を、Tissue Procurement Center of UABから得る。凍結した切片を、70%エタノール中で固定し、PBS中の10%ウマ血清でブロックし、次いで室温で60分間、10μg/mlのアフィニティー精製TRA−8と共にインキュベートする。比色基質としてのジアミノベンジジン(Vector,Burlingame,CA)と共に、抗マウスIgG ABCキットを使用して、反応性を可視化する。
Jurkat細胞(1×106/ml)を、500ng/ml TRA−8と共にインキュベートする。細胞溶解物のアリコート(30μgのタンパク質)を、15% SDS−PAGEで分離し、ナイロン膜上にブロットし、そしてブロットを、抗カスパーゼ8抗体、抗カスパーゼ9抗体、および抗カスパーゼ3抗体(BD Pharmingen,San Diego,CA)を用いてプローブし、その後HRP結合体化二次抗体および切断産物の化学発光の可視化が続く。これらのカスパーゼインヒビターセットは、R&D Systems(Minneapolis,MN)から購入する。各カスパーゼインヒビターを、示された濃度で培養物に添加する。
マウス−マウスハイブリドーマ(TRA−8)を、5%(v/v)CO2下37℃で5日間、10%(v/v)FCSを含む500mlのASF培地中でのインキュベーションによって、1×106細胞/mlの細胞密度まで増殖する。次いで培養物を遠心分離し(1,000r.p.m.、5分)そして上清を回収する。上清からのTRA−8の精製は、以下の条件下で、プロテインG−セファロースCL−4Bアフィニティークロマトグラフィー(Pharmacia)を使用して達成する:
カラム:プロテインG−セファロースCL−4Bカラム(カラムサイズ2ml;Pharmacia);
溶出緩衝液:0.1M グリシン(pH2.4)、0.15M NaCl;
中和緩衝液:1M Tris−HCl(pH8.5)。
実施例1〜3の手順を、実施例1において詳細に説明されたものの代わりに、DR4鋳型cDNAおよびプライマーを用いて繰り返し、DR4抗原を得る。この抗原を、実施例1.2〜3に利用されるように利用して、DR4に特異的なモノクローナル抗体を得る。
モノクローナル抗体を、実施例1のようなそれぞれの抗原を作製するために対応するcDNAおよびプライマーを交換することによって、おとりレセプターDcR1およびDcR2に対して惹起する。免疫グロブリンGとのDcR1融合物またはDcR2融合物についての発現ベクターおよび得られた精製モノクローナル抗体を、実施例2および3のように作製する。
TRAILに対するレセプターの全てと、TNFRファミリーの他のタンパク質とは、有意な相同性を共有するので、DR5に対する例示的な抗体TRA−8の特異性は、2つの異なるヒトDR5−IgG融合タンパク質、および他の関連するタンパク質の可溶性組換え形態を使用する、ウェスタンブロット分析によって決定される。第1のDR5−Ig融合タンパク質は、DR5の細胞外部分の残基1〜180由来のcDNAと、ヒトIgG1の定常領域をコードするcDNAとを融合させることによって、構築される。融合cDNAを、組換えアデノウイルスベクター(Quantum Biotechnogies,Inc.,Montreal,Canada)にクローニングする。発現したDR5/hIgG1融合タンパク質(これは、50kDaの相対分子量を有した)を、抗ヒトIgGアフィニティーカラム(Sigma,St Louis,MO)を使用して精製する。特異性のウェスタンブロット分析のために、第2の組換えヒトDR5/IgG1融合タンパク質(アミノ酸52〜212)、ならびにTRAIL−R1融合タンパク質、TRAIL−R3融合タンパク質およびTRAIL−R4融合タンパク質を、Alexisから購入する。ヒトFasおよびTNFR1の可溶性形態は、Amgen,Inc.,Thousands Oaks,CA,USAのDr.Carl Edwardsから寄贈された。使用した可溶性の組換えヒトDR4分子、DcR1分子、DcR2分子、TNFR1分子、R4分子、およびFas分子は、ヒトIgG1融合タンパク質である。0.5μgの各タンパク質を、10%SDS−PAGEによって分離し、そしてニトロセルロース膜にブロットする。これらのブロットを、PBS中5%ドライミルクで室温で1時間ブロックし、そして1μg/mlの精製モノクローナル抗DR5抗体(クローン:TRA−8)または0.1μg/mlのHRP−結合体化ヤギ抗ヒトIgGで、4℃で一晩プローブする。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合体化ヤギ抗マウスIgGを、二次抗体として使用して、結合したTRA−8を検出する。これらのブロットを、化学発光によって現像する。
次いで、TRA−8が、細胞表面において発現されたDR5を結合する能力、およびこの反応の特異性を、全長ヒトDR5もしくはDR4 cDNAを含む発現ベクターまたはコントロールとして空のベクターでトランスフェクトされた、COS−7(American Type Culture Collection No.CRL−1651)細胞を使用して、評価する。フィコエリトリン(PE)結合体化抗マウスIgG1(Pharmingen)を、第2の抗体として使用して、結合したTRA−8を検出する。1×104の細胞の蛍光を、以下の条件下で、フローサイトメーター(FACSVantage)を使用して測定する:
励起波長:488nm;
検出波長:600nm。
励起波長:488nm;
検出波長:600nm。
TRA−8が形質転換された細胞においてインビトロでアポトーシスを誘導するか否かを決定するために、全てのDR5陽性腫瘍細胞を、TRA−8またはTRAILのいずれかによって誘導されるアポトーシスに対するこれらの感受性に関して試験した。
種々の理由のために、インビトロ研究において有望な多くの因子は、インビボにおいて効力を示さない。従って、インビトロ動物モデルにおいてTRA−8の効力を試験することが重要である。これを達成するために、このTRA−8抗ヒトDR5抗体を、ヒトDR5分子を発現するヒト異種移植片を有するマウスに投与する。使用するマウスは、6〜8週齢のNOD/SCIDマウス(Jackson Laboratory)であり、これらに、ヒト星状細胞腫1321N1細胞(1×107)を皮下接種するか、またはヒト白血病ジャーカット細胞(1×106)を静脈内接種する。腫瘍接種の2日後、マウスに、TRA−8(100μg)を静脈内接種する。TRA−8での処置の5日後、1321N1腫瘍増殖を、腫瘍塊のサイズおよび重量によって決定する。ジャーカット細胞の増殖を、脾臓の重量および接種した動物の脾臓中のヒトCD3陽性ジャーカット細胞の割合によって決定する。腫瘍組織の生検を採取し、組織学的に試験する。
TRAIL媒介性アポトーシスの先行技術の研究のほとんどは、悪性細胞に集中していた。本発明に従うTRAIL媒介性アポトーシスはまた、自己免疫状態および炎症状態(例えば、RA)において治療的である。
RAを有する患者由来の8個の一次培養滑膜細胞のパネルにおけるDR5の発現を、変形性関節症(本明細書において以下「OA」という)を有する患者由来の8個の一次培養滑膜細胞におけるDR5の発現と比較する。この8個のヒト一次RA滑膜細胞培養物、RA−1014、RA−1016、RA−1021、RA−512、RA−707、RA−811、RA−716、およびRA−929は、Dr.M.Ohtsuki(Sankyo Co.Ltd.,Tokyo,Japan)により心よく提供され、そして10%FCS、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびグルタミンを補充したDMEM中で培養する。7個のOA滑膜細胞の一次細胞培養物を、標準的なコラゲナーゼ法によってOA患者の滑膜組織から単離し、そして同じ条件下で培養する。全ての一次細胞の継代数は、10以下である。DR5の発現は、実施例5に記載されるように、FAC分析により決定する。
<10.2 TRA−8またはTRAILにより媒介されるアポトーシスに対するRA滑膜細胞の感受性>
一般的に、RA患者から単離した全ての滑膜細胞は、TRAIL誘導性アポトーシスおよび抗DR5抗体誘導性アポトーシスの両方に対して感受性であり、そして全てのOA細胞は、TRAIL誘導性アポトーシスおよび抗DR5抗体誘導性アポトーシスに対して抵抗性である(図8A、B)。これらの研究により、TRA−8抗体は、正常な細胞よりむしろ改変した細胞を標的化することが示される。さらに、TRAILにより誘導されるアポトーシスに対する感受性または抵抗性のパターンは、抗DR5抗体により誘導されるアポトーシスに対する感受性または抵抗性と相関し、このことは、この滑膜細胞が、主にDR5を使用してTRAILアポトーシスを誘導することを示す。
アポトーシスのシグナル伝達と増殖のシグナル伝達との間に密接な関連が存在するという概念を支持するためのかなりの証拠が存在する(非特許文献45)。DR5は、アポトーシスシグナル伝達に加えて、NF−κb経路を活性化し得、そしてNF−κbの活性化は、抗アポトーシスシグナルを伝達し得るということが、確立されている。従って、ゲルシフトアッセイが実行される。細胞を、指示時間の間、1mg/mlのエンハンサーまたは50ng/mlのTRA−8の存在下で、50ng/mlの組換え可溶性TRAIL(Fasリガンド)を用いて刺激する。この核抽出物を調製し、二重に染色した〔32P〕標識オリゴ−DNAプローブと共にインキュベートする。この結果を、サイクロンホスファ画像装置(phospha−imager)(TopCount NXT,Packard Instrument Company,CT)を使用して分析する。RA滑膜細胞を、TNF−αまたはTRAILと共にインキュベートして、NF−κbを、時間依存性様式で活性化した。TRA−8抗体は、NF−κbを強力に活性化し得る。対照的に、Fasリガンドは、図10Aに示されるように、NF−κb活性化を誘導し得ない。
24時間の細胞生存率アッセイのために、96ウェルプレート中の正常なヒトの新鮮な肝細胞を、In Vitro Technology(Baltimore,MD)から購入した。この肝細胞を、1μg/mlの可溶性のTRAILまたはTRA−8のいずれかを含む、Hepatocyte Culture Medium中で培養する。6時間の細胞生存率アッセイのために、正常な肝細胞または肝臓癌細胞を、UAB Tissue Procurement Centerから収集された新鮮な外科試料から単離する。ヒトの肝細胞の単離のための全ての試薬(肝細胞灌流緩衝液、消化培地、洗浄培地、および結合培地を含む)を、Gibcoから購入した。この組織スライドを、Hepatocyte Digest Medium(37℃)中で、振盪(50rpm)しながら1時間消化する。この単離した肝細胞を、低速遠心分離(50g、3分)により収集し、そしてHepatocyte Washing Mediumを用いて6回洗浄する。肝細胞の単一の細胞懸濁物を、96ウェルMatrigelプレート(BP)中に10%のFCSを含むAttachment Medium中で6時間培養する。結合されていない肝細胞を、予め温めた結合培地で2回洗浄することによって除去する。結合された肝細胞を、架橋剤の存在下で、種々の濃度の可溶性TRAILもしくはFasL、またはTRA−8もしくはCH11と共にさらに6時間インキュベートする。
8〜10週齢の雌性B6マウスに、109pfuのAd/hTRAILを同数のAd/Tet−onと共に静脈内注射する。マウスに、アデノウイルスベクターの接種直後に、マウスの飲料水中で異なる濃度のテトラサイクリンを与える。肝臓損傷を、AST診断キット(Sigma)を使用して、ASTの血清レベルによって決定する。TRAILの発現を、ノーザンブロット分析によって決定する。
DR5が活性化T細胞およびB細胞のTRAIL媒介アポトーシスにおいて役割を果たすか否かを決定するために、静止および活性化T細胞およびB細胞上でのDR5の表面発現を、TRA−8を使用して試験する。PBMCにおける未刺激ヒトT細胞は、有意なレベルのDR5を発現しなかった(図14)。抗CD3刺激またはCon−A刺激のいずれかの48時間後、細胞表面DR5発現は、有意に増加する。同様に、未刺激B細胞は、非常に低いレベルのDR5を発現した。抗μでの刺激は、DR5の細胞表面発現の増加を生じたが、LPSでの刺激では生じなかった。これらの結果は、活性化T細胞およびB細胞の両方が、より高いレベルの細胞表面DR5を発現することを示す。細胞を、20μg/mlのTRA−8およびPE抗マウスIgG1で染色する。
活性化T細胞およびB細胞がTRA−8媒介アポトーシスに対して感受性であるか否かを決定するために、ヒトPBMCのT細胞およびB細胞を、それぞれ、インビトロで48時間抗CD3または抗μで刺激する。生存細胞および増殖している芽細胞を、勾配遠心分離によって収集し、そして種々の濃度のTRA−8共にインキュベートする。未刺激T細胞およびB細胞は、TRA−8媒介アポトーシスに対して感受性ではない(図15)。刺激T細胞およびB細胞の全ては、TRA−8媒介アポトーシスに対する感受性の穏やかな増加を示し、20%の細胞が、一晩培養後にTRA−8によって殺傷された。高度に増殖している芽細胞T細胞は、TRA−8媒介アポトーシスに対してさらにより感受性である。70%より多い芽細胞性T細胞が、TRA−8によって殺傷され得る。芽細胞性B細胞もまた、他と比較して、TRA−8媒介アポトーシスに対してより感受性である。これらの結果は、活性化T細胞およびB細胞がDR5媒介アポトーシスに対して感受性であることを示す。
TRA−8のインビボ抗T細胞効力を決定するために、NOD/SCIDマウスに、1×108個のヒトPBMCを静脈内注射する。通常、SCIDマウスにおけるヒトT細胞は、異種刺激に応答して迅速に活性化される。ヒトPBMC/SCIDマウスに、移入の日から3日間毎日繰り返して、100μgのTRA−8またはコントロールIgG1を腹腔内注射する。移入後5日目に、単核細胞を、脾臓から単離し、そして抗ヒトCD3抗体で染色し、そしてリンパ球集団を、フローサイトメトリー分析によってゲート(gate)し、そしてCD3陽性ヒトT細胞を分析する。コントロールで処理したマウスにおける抗ヒトCD3染色によって決定されるように、約30%の脾臓リンパ球は、ヒトT細胞である。しかし、TRA−8処理したマウス中の脾臓リンパ球においては、わずかなヒトT細胞(3%未満)しか観察されなかった(図16)。インサイチュでの組織学的研究は、コントロールマウスの脾臓において、ヒトT細胞が脾臓において再増殖されることを明らかにし、TUNEL染色によって実証されるように、わずかなアポトーシス細胞のみが観察される。対照的に、生存ヒトT細胞を用いた再増殖は、TRA−8処置マウスの脾臓において観察されず、むしろ多くのアポトーシス細胞が観察される(図17)。これらの結果は、TRA−8がインビボで抗T細胞活性を有することを実証し、そしてGVH疾患の処置のための本発明の抗体の有用性を示す。
<15.1 ヒト癌組織および細胞株におけるDR5の発現および機能>
i)TRA−8でのインサイチュ染色によるヒト癌組織におけるDR5発現
癌細胞および癌組織がより高いレベルのDR5を差示的に発現するか否かを決定するために、20種を超える乳癌、6種の卵巣癌、5種の結腸癌および5種の前立腺癌を含むヒト癌組織のパネルを、免疫組織化学のためにTRA−8で染色する。これらの癌組織の大部分は、検出可能なDR5を発現した。これらの癌組織におけるDR5の発現レベルは、異なった。一般に、癌組織は、関与されない組織よりも高いレベルのDR5を発現した。さらに、DR5発現は、p53の変異と明らかに相関されない。
9種のヒト乳癌細胞株、3種の卵巣癌株、3種の結腸癌株および3種の前立腺癌株を、DR5の細胞表面発現およびTRA−8誘導性アポトーシスに対する感受性についてインビトロで試験する。9種の乳癌株のうちの7種、3種の卵巣癌株のうちの3種、3種の結腸癌株のうちの3種および3種の前立腺癌株のうちの3種が、種々のレベルで細胞表面DR5を発現した。9種の乳癌株のうち、3種がTRA−8媒介アポトーシスに対して非常に感受性であり、3種が中程度であり、そして3種が耐性である。3種の全ての卵巣癌株は、非常に感受性である。3種の結腸癌株のうち1種は、非常に感受性であるが、2種は、中程度の感受性を有する。3種の前立腺癌株のうち2種は、中程度の感受性を有し、そして1種が、耐性である。
いくつかの乳癌株において、TRA−8誘導性アポトーシスに対するアドリアマイシンの効果を試験する。高用量のアドリアマイシンは、相加効果を示した。しかし、TRA−8耐性株のいくつかにおいて、低用量のアドリアマイシンが、TRA−8誘導性アポトーシスを相乗的に増大する。
放射標識したTRA−8を使用する。乳癌株に対するTRA−8の結合活性を、腫瘍を移植したSCIDマウスにおいてインビトロおよびインビボで試験する。癌細胞に対するインビトロ結合活性は、3nMのKd値と推測され(これは、ELISAを使用する本発明者らの以前の推測と一致する)、そして可溶性TRAILよりも少なくとも50倍高い。インビボでは、TRA−8は、移植された腫瘍組織に局在した。
慢性リンパ球性白血病(CLL)は、B細胞の悪性疾患の一般的な形態である。CLLにおけるほとんどの悪性B細胞は、成熟表現型のB細胞であり、これは、多くのアポトーシス刺激に対して耐性である。CLLを患う5人の患者のB細胞におけるDR5の発現および機能を試験する。全ての患者は、PBMC中の95%を超えるCD19+B細胞によって示されるように、高い数値の末梢血B細胞を有した。正常な一次B細胞と比較して、全ての患者のCLL B細胞は、より高いレベルの細胞表面DR5を有し、そしてインビトロでのTRA−8誘導性アポトーシスにより感受性である。興味深いことに、CLL B細胞はまた、ビスインドールマレイミドVIII(BisVIII)誘導性細胞傷害性に対しても感受性である。TRA−8およびBisVIIIでの組み合わせの処理後、約50%のCLL B細胞が殺傷され、一方、正常B細胞は、非応答性のままであった(図18)。NOD/SCIDマウスへのCLL B細胞の移入は、移入後5日目で、レシピエントマウスの脾臓において再増殖された約25%〜30%のCD19+B細胞を生じた。しかし、3用量の100μg TRA−8の処理は、このレシピエントSCIDマウスの脾臓における5人の患者中の4人の患者のCLL B細胞を完全に排除した。従って、単独または他の物質との組み合わせたTRA−8は、慢性リンパ球性白血病のための治療薬剤として活性である。
(1)TRA−8の重鎖および軽鎖のN末端アミノ酸配列の決定
TRA−8の重鎖および軽鎖のcDNAを得るために、TRA−8の重鎖および軽鎖のN末端アミノ酸配列、ならびにクローニングしたTRA−8遺伝子を、公知の技術によって決定する。
Glu−Val−Met−Leu−Val−Glu−Ser−Gly−Gly−Gly−Leu−Val−Lys−Pro−Gly−Gly−Ser−Leu−Lys−Leu(配列表の配列番号4)
であると決定され、そして軽鎖に対応するバンドのN末端アミノ酸配列は、以下:
Asp−Ile−Val−Met−Thr−Gln−Ser−His−Lys−Phe−Met−Ser−Thr−Ser−Val−Gly−Asp−Arg−Val−Ser(配列表の配列番号5)
であると決定される。
上記の知見に基づき、これらのマウスサブタイプに属する遺伝子の5’非翻訳化領域の部分および3’翻訳領域の最末端とハイブリダイズすることが予測される、オリゴヌクレオチドプライマーを合成する。次いで、TRA−8の重鎖および軽鎖をコードするcDNAを、以下の逆転写およびPCRの組み合わせ(RT−PCR)によってクローニングする。
TRA−8ハイブリドーマ(ATCC番号PTA−1428)の総RNAを、TRIzol試薬(GIBCO BRL)を使用して抽出する。このPCR反応のためのテンプレートには、cDNAを使用し、このcDNAは、第1鎖cDNA合成キット(Amersham Pharmacia Biotech)を、そのキットと共に提供される手順マニュアルに従って使用することによって得られる。
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、PCRのために合成する:
5’−cagcactgaa cacggacccc−3’(H5NCS1:配列表の配列番号6);
5’−aaaggtaatt tattgagaag−3’(H5NCS2:配列表の配列番号7);
5’−cctcaccatg aacttcgggc−3’(H5SS1:配列表の配列番号8);
5’−ctgttgtatg cacatgagac−3’(H5SS2:配列表の配列番号9);
5’−gaagtgatgc tggtggagtc−3’(H5CS1:配列表の配列番号10);
5’−agtgtgaagt gatgctggtg−3’(H5CS2:配列表の配列番号11);
5’−tttaccagga gagtgggaga g−3’(H3CR:配列表の配列番号12);
5’−tgcagagaca gtgaccagag−3’(H3VR:配列表の配列番号13);
5’’−tgttcaggac cagcatgggc−3’(L5NCS1:配列表の配列番号14);
5’−aagacatttt ggattctaac−3’(L5NCS2:配列表の配列番号15);
5’−tatcatgaag tctttgtatg−3’(L5SS1:配列表の配列番号16) ;
5’−gatggagaca cattctcagg−3’(L5SS2:配列表の配列番号17);
5’−gacattgtga tgacccagtc−3’(L5CS:配列表の配列番号18);
5’’−ttaacactca ttcctgttga−3’(L3CR:配列表の配列番号19);および
5’−gactgggtca tcacaatgtc−3’(LCSR:配列表の配列番号20)。
PCR反応溶液の組成:
テンプレートcDNA、総量33μlの反応液の5μl
プライマー1、10pmol
プライマー2、10pmol
10×濃縮PCR緩衝液(キットと共に提供される)、10μl
dNTP(各2.5mM)、4μl;および
Taqポリメラーゼ(Promega)、5ユニット。
(1)TRA−8の可変領域の分子モデリング
TRA−8の可変領域の分子モデリングは、相同性モデリングとして一般的に公知の方法(Methods in Enzymology,203,121−153,(1991))によって実行される。Protein Data Bank(Nuc.Acid Res.28,235−242(2000))に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の1次配列(X線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である)を、上で決定されたTRA−8のフレームワーク領域と比較する。結果として、1NCDおよび1HILが、それぞれ、TRA−8の軽鎖および重鎖のフレームワーク領域に対して最も高い配列相同性を有するとして選択される。フレームワーク領域の三次元構造は、TRA−8の軽鎖および重鎖に対応する1NCDおよび1HILの座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製される。Chothiaらによって定義される分類を使用して、TRA−8のCDRが以下のように分類される;CDRL1、CDRL2、CDRH1およびCDRH2は、それぞれ標準的な(canonical)分類2、1、1、3に属するが、一方、CDRL3は、いずれの特定の標準的な分類にも属さない。CDRL1、CDRL2、CDRH1およびCDRH2のCDRループは、それらのそれぞれの標準的な分類に固有のコンホメーションに固定され、フレームワークモデルに組み込まれる。CDRL3は、Thornton et al.(J.Mol.Biol.,263,800−815,(1996))の分類に従って、クラスター8Aのコンホメーションが割り当てられ、そしてCDRH3は、H3ルール(FEBS letter 455,188−197(1999))を使用して、k(8)Cに分類される。次いで、CDRL3およびCDRH3についての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれる。
ヒト化TRA−8抗体の構築を、CDRグラフティング(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033(1989))として一般的に公知の方法によって行う。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸相同性に基づいて選択される。TRA−8のフレームワーク領域の配列を、抗体のアミノ酸配列のKabatデータベース(Nuc.Acid Res.29,205−206(2001))の全てのヒトフレームワークと比較する。結果として、mAB58’CL抗体を、フレームワーク領域についての80%の最も高い配列相同性に起因して、アクセプターとして選択する。mAB58’CLについてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、TRA−8についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定する。これらの残基の位置は、上で構築されるTRA−8の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033(1989))によって与えられる基準によって選択される。ヒト化TRA−8配列を、いくつかのドナー残基をアクセプター抗体mAB58’CLに移入することによって、以下の実施例に記載されるように構築する。
(1)ヒト化TRA−8の重鎖可変領域DNAを有するプラスミドの構築
ヒト化TRA−8の活性を決定するために、ヒト化TRA−8の重鎖を有するプラスミドを以下のように構築する。しかし、TRA−8のヒト化は、これらの実施例に限定されないことが理解される。
以下の12のオリゴヌクレオチドが合成される:
5’−ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtgtccac−3’(A;配列番号32);
5’−tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg−3’(B;配列番号33);
5’−attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga gtgggttgca accattagta−3’(C;配列番号34);
5’−gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg−3’(D;配列番号35);
5’−tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac−3’(E;配列番号36);
5’−ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctc cacc aagggcccat cggtc−3’(F;配列番号37);
5’−ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa−3’(G;配列番号38);
5’−tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg−3’(H;配列番号39);
5’−tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag−3’(I;配列番号40);
5’−ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt tgcaacccac−3’(J;配列番号41);
5’−ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt−3’(K;配列番号42);および
5’−gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc−3’(L;配列番号43)。
5’−ttggataagc ttggcttgac−3’(P1;配列番号44);および
5’−gaccgatggg cccttggtgg a−3’(P2;配列番号45)。
オリゴヌクレオチドA、10pmol
オリゴヌクレオチドB、10pmol
オリゴヌクレオチドC、10pmol
オリゴヌクレオチドD、10pmol
オリゴヌクレオチドE、10pmol
オリゴヌクレオチドF、10pmol
オリゴヌクレオチドG、10pmol
オリゴヌクレオチドH、10pmol
オリゴヌクレオチドI、10pmol
オリゴヌクレオチドJ、10pmol
オリゴヌクレオチドK、10pmol
オリゴヌクレオチドL、10pmol
オリゴヌクレオチドプライマーP1、2μM
オリゴヌクレオチドプライマーP2、2μM
10×Pyrobest緩衝液II、10μl
dNTPミックス、8μl
Pyrobest DNAポリメラーゼ、0.5μl;および
50μlの最終容量までの再蒸留水。
PCR反応から回収されたDNAフラグメント、5μl
10×Taqポリメラーゼ緩衝液、1μl
dNTP混合物、1μl
Taqポリメラーゼ(5単位/ml)、1μl;および
最終容量10μlまでの再蒸留した水。
動物細胞についての組換え発現ベクターを、以下のように、ヒト化TRA−8の重鎖をコードするDNA(上記においてクローン化された)を挿入することによって構築する。
(1)TRA−8抗体のヒト化バージョンの軽鎖についてベクターの構築
配列表の配列番号46に示されるように、マウス抗ヒトDR5抗体TRA−8の軽鎖のアミノ酸配列のヒト化において、TRA−8軽鎖のアミノ酸配列のN末端から第8番目のアミノ酸(ヒスチジン)、第9番目のアミノ酸(リジン)、第10番目のアミノ酸(フェニルアラニン)、第11番目のアミノ酸(メチオニン)、第13番目のアミノ酸(スレオニン)、第20番目のアミノ酸(セリン)、第42番目のアミノ酸(グルタミン)、第43番目(セリン)、第60番目のアミノ酸(アスパラギン酸)、第63番目のアミノ酸(スレオニン)、第77番目のアミノ酸(アスパラギン)、第78番目のアミノ酸(バリン)、第80番目のアミノ酸(セリン)、第83番目のアミノ酸(ロイシン)、第85番目のアミノ酸(アスパラギン酸)、第87番目のアミノ酸(フェニルアラニン)、および第99番目のアミノ酸(グリシン)、第103番目のアミノ酸(ロイシン)および第108番目のアミノ酸(アラニン)は、それぞれ、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、スレオニン、リジン、アラニン、セリン、セリン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、スレオニン、チロシン、グルタミン、バリンおよびスレオニンで置換される。得られる配列を、LM2と名付ける。
LM2ポリペプチド鎖(配列表の配列番号46)をコードするDNA(この各々は、ヒト化抗DR5抗体TRA−8軽鎖の可変領域とヒトIg軽鎖(κ鎖)の定常領域との融合物である)は、それぞれ、PCRの組み合わせを使用して合成される。
5’−gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atcacaatgt caccagtgga−3’(HKSPR11;配列番号49);
5’−ccaagttctt tgtctgcatc agtaggagac agggtcacca tcacctgc−3’(HKCDF11;配列番号50);
5’−agtgtgccgg gtggatgccc agtaaatcag tagtttagga gctttccctg gtttctg−3’(HKCDR12;配列番号51);
5’−tgggcatcca cccggcacac tggggtccca agcaggttta gtggcagt−3’(HKCDF22;配列番号52);
5’−ataactacta tattgctgac agtaataggt tgcaaaatcc tccggctgca gactagagat ggt−3’(HKCDR22;配列番号53);および
5’−cagcaatata gcagctatcg gacgttcggt caaggcacca aggtggaaat caaacggact gtg−3’(HKCF12;配列番号54)。
配列表の配列番号46に規定されるアミノ酸配列をコードする、配列表の配列番号55に記載されるLM2−DNAフラグメントを、2段階のPCRを行うことよって調製し、プラスミドベクターに挿入し、そしてE.coliにクローニングする。
分泌シグナル配列および5’末端に付加されたHindIII制限酵素切断部位を有するFRL1領域の一部をコードするLM2−F1−DNAフラグメントを、以下の条件下で調製する。テンプレートプラスミド、pHSGHM17およびpSRPDHHを、欧州特許出願EP 0 909 816 A1の記載に従って入手する。
プラスミドpHSGHM17 DNA(欧州特許出願EP 0 909 816 A1)、25ng
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーHKSPR11、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ(PerkinElmer)、2.5単位。
プラスミドpL28 DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマーHKCDF11、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーHKCDR12、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
プラスミドpSRPDHH DNA(欧州特許出願EP 0 909 816 A1)、25ng
オリゴヌクレオチドプライマーHKCDF22、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーHKCDR22、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
プラスミドpSRPDHH DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマーHKCF12、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
LM2−DNA(ここで、上記のLM2−F1−DNA、LM2−F2−DNA、LM2−F3−DNAおよびLM2−F4−DNAフラグメントは融合している)を、以下の条件下で調製する。
第1段階PCRで調製したLM2−F1−DNAのGelフラグメント
第1段階PCRで調製したLM2−F2−DNAのGelフラグメント
第1段階PCRで調製したLM2−F3−DNAのGelフラグメント
第1段階PCRで調製したLM2−F4−DNAのGelフラグメント
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5.0μl
10×PCR緩衝液、5.0μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
ヒト化LM2 TRA−8軽鎖の可変領域およびヒトIgκ鎖の定常領域の融合フラグメントを保有する得られたプラスミドpHSG/M2−1−4を、制限酵素HindIIIおよびEcoRIで消化する。
COS−7細胞(すなわち、サルの腎臓由来の細胞株)の、上記で得られたヒト化TRA−8重鎖およびヒト化TRA−8軽鎖についての発現プラスミドを用いるトランスフェクションを、FUGENE6トランスフェクション試薬法(Boehringer Mannheim Biochemica)によってこのキットと共に提供される取扱説明書に従って行う。
(A):プラスミドDNAなし
(B):pHB14−1およびpSR/M2−1の同時トランスフェクション。
HPLC:BioCAD 700E(Applied Biosystems)
カラム:ProteinG−IDセンサカートリッジ(カラムサイズ:2.1mmID×30mmLD、吸着床の容量:0.1ml;Cat#2−1002−00,Applied Biosystems)
溶出緩衝液:0.1Mグリシン−HCl(pH2.5)
中和緩衝液:1M Tris−HCl(pH8.5)
検出:280nm
流速:1ml/分
画分サイズ:0.5ml/0.5分
画分チューブ:1.5mlのポリプロピレンマイクロチューブ
温度:4℃。
Jurkat細胞(ATCC受託番号TIB−152)を使用して、精製ヒト化TRA−8抗体のアポトーシス誘導活性を試験する。
生存率(%)=100×(a−b)/(c−b)
ここで、「a」は、試験ウェルの測定値であり、「b」は、細胞のないウェルの測定値であり、そして「c」は、抗体が添加されていないウェルの測定値である。
種々のDR5分子に対するTRA−8の反応性を決定するために、TRA−8の反応性を、以下のように活性化リンパ球を使用して試験する。
TRA−8の漸増用量の予備的毒性研究を、1匹の雄性マーモセットおよび1匹の雌性マーモセットを使用して実施する。7日間の中断期間によって隔てられた3セットの単一の静脈内投与を実行する。TRA−8の用量は、一体当たり、50、250および1,250μgと設定される。各処置の48時間後、血液を大腿静脈から収集し、そして血漿を調製する。血漿のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼの活性を、分析器(FUJI DRI−CHEM:Fuji Film Medical Co.,Ltd.)を使用して測定する。全ての血液を麻酔なしで採取する。結果として、肝障害を示す証拠は、各処置後の血漿生化学的試験において見られない。
TRA−8が抗癌治療において治療的効力を有するか否かを決定するために、種々の癌細胞株を使用する、TRA−8のインビトロ殺傷活性を以下のように試験する。
生存率(%)=100×(a−b)/(c−b)
ここで、「a」は、試験ウェルの測定値であり、「b」は、細胞のないウェルの測定値であり、そして「c」は、抗体が添加されていないウェルの測定値である。
ヒト前立腺癌細胞株PC−3を、American Tissue Culture Collection(ATCC)から得て、10%ウシ胎仔血清(FBS、Hyclone)、1%L−グルタミン−200mM(25030−149、Gibco BRL)および0.5%ペニシリン ストレプトマイシン溶液(P−7539、Sigma)を含むF−12K栄養混合物(21127−022、Gibco BRL)中に維持する。10%FBSおよび0.5%ペニシリン ストレプトマイシン溶液を補充したRPMI1640培地(MED−008、IWAKI)を、以下の実験に使用する。指数関数的に増殖するPC−3細胞をトリプシン処理によって収集し、そして新鮮な培地で2回洗浄する。次いで、これらの細胞を計数し、5×104細胞/mlの密度で新鮮な培地に再懸濁し、そして実験開始の1日前に、100μl/ウェルの総容積で、平底の96ウェルプレート(3598、Corning−Coster)中に三連で分配する。ジメチルスルフォキシド(10mg/ml)中に溶解させた、代表的な抗癌薬物であるPaclitaxel(169−16811、Wako)を新鮮な培地で希釈し、次いで、50μl/ウェルで細胞を含む96ウェルのプレートに添加する。ジメチルスルフォキシドの最終濃度は、0.1%未満である。5%CO2雰囲気における37℃での24時間のインキュベーション後、新鮮な培地で希釈したTRA−8を、これらのウェルに添加する。さらに24時間のインキュベーション後、1mg/mlのXTTおよび25mMのPMSを含む最少必須培地(11095−098、Gibco BRL)の50μlをこれらのウェルに添加し、そしてこのプレートを6時間インキュベートする。次いで、OD450を、SPECTRA MAX250(Molecular Devices)によって測定し、そして細胞生存率を以下のように算定する。
(1)ヒト化抗体の設計
TRA−8のヒト化バージョンの構築を、CDRグラフト化として一般に公知の方法によって実施する。mAB58’CL抗体を、参照実施例2に記載のようにアクセプターとして使用し、そして、TRA−8抗体のCDR領域を、このアクセプター上にグラフト化する。フレームワーク領域において、いくつかのアミノ酸を、Queenら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86、10029−10033(1989))によって与えられた規準によって、TRA−8またはヒトコンセンサス配列のいずれか由来のアクセプター上にグラフト化し、そしてヒト化TRA−8配列を、本明細書中以下に記載のように構築する。
配列表の配列番号56に示すように、マウス抗ヒトDR5抗体TRA−8の重鎖のアミノ酸配列のH1型ヒト化は、3番目のアミノ酸(メチオニン)、13番目のアミノ酸(リジン)、19番目のアミノ酸(リジン)、40番目のアミノ酸(スレオニン)、42番目のアミノ酸(グルタミン酸)、44番目のアミノ酸(アルギニン)、84番目のアミノ酸(セリン)、88番目のアミノ酸(セリン)、93番目のアミノ酸(メチオニン)、114番目のアミノ酸(スレオニン)、115番目のアミノ酸(ロイシン)の、それぞれ、グルタミン、グルタミン、アルギニン、アラニン、グリシン、グリシン、アスパラギン、アラニン、バリン、ロイシンおよびバリンによる置換を伴った。
以下の24個のオリゴヌクレオチドを合成する:
5’−tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg−3’(B;配列番号33);
5’−tctgaagtac agctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg−3’(B2;配列番号57);
5’−tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtaa agcctggagg gtccctgaaa ctctcctgtg cagcctctgg−3’(B3;配列番号66);
5’−attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga gtgggttgca accattagta−3’(C;配列番号34);
5’−attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag actccagaga agaggctgga gtgggttgca accattagta−3’(C2;配列番号64);
5’−gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg−3’(D;配列番号35);
5’−tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac−3’(E;配列番号36);
5’−tatctgcaaa tgagcagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac−3’(E2;配列番号62);
5’−tatctgcaaa tgagcagtct gagatctgag gacacggcta tgtattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac−3’(E3;配列番号67);
5’−ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc−3’(F;配列番号37);
5’−ggactactgg ggccaaggga ccactctcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc−3’(F2;配列番号68);
5’−ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa−3’(G;配列番号38);
5’−tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg−3’(H;配列番号39);
5’−tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagct gtacttcaga gtggacacct gtagctgttg−3’(H2;配列番号58);
5’−tttcagggac cctccaggct ttactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg −3’(H3;配列番号69);
5’−tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag−3’(I;配列番号40);
5’−tccagcctct tctctggagt ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag−3’(I2;配列番号65);
5’−ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt tgcaacccac−3’(J;配列番号41);
5’−ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt−3’(K;配列番号42);
5’−ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt−3’(K2;配列番号63);
5’−ccttcttgca cagtaataca tagccgtgtc ctcagatctc agactgctca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt−3’(K3;配列番号70);
5’−gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc−3’(L;配列番号43)および
5’−gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgaga gtggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc−3’(L2;配列番号71)。
5’−gaccgatggg cccttggtgg a−3’(P2;配列番号45)。
PCR反応溶液の組成:
オリゴヌクレオチドA、10pmol
オリゴヌクレオチドB2、10pmol
オリゴヌクレオチドC、10pmol
オリゴヌクレオチドD、10pmol
オリゴヌクレオチドE、10pmol
オリゴヌクレオチドF、10pmol
オリゴヌクレオチドG、10pmol
オリゴヌクレオチドH2、10pmol
オリゴヌクレオチドI、10pmol
オリゴヌクレオチドJ、10pmol
オリゴヌクレオチドK、10pmol
オリゴヌクレオチドL、10pmol
オリゴヌクレオチドプライマーP1、2μM
オリゴヌクレオチドプライマーP2、2μM
10×Pyrobest緩衝液II、10μl
dNTPミックス、8μl
Pyrobest DNAポリメラーゼ、0.5μl;および
最終容積50μlまでの再蒸留水。
PCR反応溶液の組成:
オリゴヌクレオチドA、10pmol
オリゴヌクレオチドB、10pmol
オリゴヌクレオチドC、10pmol
オリゴヌクレオチドD、10pmol
オリゴヌクレオチドE2、10pmol
オリゴヌクレオチドF、10pmol
オリゴヌクレオチドG、10pmol
オリゴヌクレオチドH、10pmol
オリゴヌクレオチドI、10pmol
オリゴヌクレオチドJ、10pmol
オリゴヌクレオチドK2、10pmol
オリゴヌクレオチドL、10pmol
オリゴヌクレオチドプライマーP1、2μM
オリゴヌクレオチドプライマーP2、2μM
10×Pyrobest緩衝液II、10μl
dNTP mix、8μl
Pyrobest DNAポリメラーゼ、0.5μl;および
50μlの最終容積になるような再蒸留水。
PCR反応溶液の組成:
オリゴヌクレオチドA、10pmol
オリゴヌクレオチドB、10pmol
オリゴヌクレオチドC2、10pmol
オリゴヌクレオチドD、10pmol
オリゴヌクレオチドE2、10pmol
オリゴヌクレオチドF、10pmol
オリゴヌクレオチドG、10pmol
オリゴヌクレオチドH、10pmol
オリゴヌクレオチドI2、10pmol
オリゴヌクレオチドJ、10pmol
オリゴヌクレオチドK2、10pmol
オリゴヌクレオチドL、10pmol
オリゴヌクレオチドプライマーP1、2μM
オリゴヌクレオチドプライマーP2、2μM
10×Pyrobest緩衝液II、10μl
dNTP mix、8μl
Pyrobest DNAポリメラーゼ、0.5μl;および
50μlの最終容積になるような再蒸留水。
PCR反応溶液の組成:
オリゴヌクレオチドA、10pmol
オリゴヌクレオチドB3、10pmol
オリゴヌクレオチドC2、10pmol
オリゴヌクレオチドD、10pmol
オリゴヌクレオチドE3、10pmol
オリゴヌクレオチドF2、10pmol
オリゴヌクレオチドG、10pmol
オリゴヌクレオチドH3、10pmol
オリゴヌクレオチドI2、10pmol
オリゴヌクレオチドJ、10pmol
オリゴヌクレオチドK3、10pmol
オリゴヌクレオチドL2、10pmol
オリゴヌクレオチドプライマーP1、2μM
オリゴヌクレオチドプライマーP2、2μM
10×Pyrobest緩衝液II、10μl
dNTP mix、8μl
Pyrobest DNAポリメラーゼ、0.5μl;および
50μlの最終容積になるような再蒸留水。
PCR反応物から回収されたDNAフラグメント(H1、H3、H4またはM)、5μl;
10×Taq ポリメラーゼ緩衝液、1μl
dNTP混合物、1μl
Taqポリメラーゼ(5ユニット/ml)、1μl;および
10μlの最終容積になるような再蒸留水。
動物細胞のための組換え発現ベクターを、以下のようにH1型ヒト化TRA−8、H3型ヒト化TRA−8およびH4型ヒト化TRA−8またはM型キメラTRA−8(上でクローニングした)の重鎖をコードするDNAを挿入することによって構築する。
(4.1)ヒト化抗体(LM1型)の軽鎖に関する発現ベクターの構築
配列表の配列番号72に示されるように、TRA−8軽鎖のアミノ酸配列のN末端から、3番目のアミノ酸(バリン)、8番目のアミノ酸(ヒスチジン)、9番目のアミノ酸(リジン)、10番目のアミノ酸(フェニルアラニン)、11番目のアミノ酸(メチオニン)、13番目のアミノ酸(スレオニン)、20番目のアミノ酸(セリン)、42番目のアミノ酸(グルタミン)、43番目のアミノ酸(セリン)、60番目のアミノ酸(アルパラギン酸)、63番目のアミノ酸(スレオニン)、77番目のアミノ酸(アスパラギン)、78番目のアミノ酸(バリン)、80番目のアミノ酸(セリン)、83番目のアミノ酸(ロイシン)、85番目のアミノ酸(アスパラギン酸)、87番目のアミノ酸(フェニルアラニン)および99番目のアミノ酸(グリシン)、103番目のアミノ酸(ロイシン)ならびに108番目のアミノ酸(アラニン)の置換を必要としたマウス抗ヒトDR5抗体TRA−8の軽鎖のアミノ酸配列の他のヒト化(LM1型)は、それぞれ、グルタミン、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、スレオニン、リジン、アラニン、セリン、セリン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、スレオニン、チロシン、グルタミン、バリンおよびスレオニンで置換される。この得られた配列を、LM1と命名する。
LM1ポリペプチド鎖(配列表の配番号72)をコードするDNA(これらのそれぞれは、ヒト化抗DR5抗体TRA−8軽鎖(LM1型)の可変領域とヒトIg軽鎖(κ鎖)の定常領域との融合体である)を、それぞれ、PCRの組み合わせを使用して合成する。
5’−gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atctgaatgt caccagtgga−3’(HKSPR12;配列番号77)。
同一の配列番号72に定義されるようなアミノ酸をコードするLM1−DNAフラグメントを、2工程PCRを実施することによって調製し、プラスミドベクターに挿入し、そしてE.coliにクローニングする。
分泌シグナル配列をコードするLM1−F1−DNAフラグメントおよび5’末端に添加されたHindIII制限酵素切断部位を有するFRL1領域の一部をコードするLM1−F1−DNAフラグメントを、以下の条件下で調製する。テンプレートプラスミド、pHSGHM17およびpSRPDHHを、欧州特許出願番号EP 0 909 816 A1における説明に従って得る。
プラスミドpHSGHM17 DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマー 7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー HKSPR12 50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer)、2.5ユニット。
プラスミドpL28 DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマー HKCDF11、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー HKCDR12、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5ユニット。
プラスミドpSRPDHH DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマー HKCDF22、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー HKCDR22 50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5ユニット。
プラスミドpSRPDHH DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマーHKCF12、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
上記のLM1−F1−DNAフラグメント、LM1−F2−DNAフラグメント、LM1−F3−DNAフラグメントおよびLM1−F4−DNAフラグメントを融合したLM1−DNAを、以下の条件下で調製する。
第1工程のPCRで調製されたLM1−F1−DNAのゲルフラグメント
第1工程のPCRで調製されたLM1−F2−DNAのゲルフラグメント
第1工程のPCRで調製されたLM1−F3−DNAのゲルフラグメント
第1工程のPCRで調製されたLM1−F4−DNAのゲルフラグメント
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5.0μl
l0×PCR緩衝液、5.0μl
ampliTaq DNA ポリメラーゼ、2.5単位。
ヒト化LM1 TRA−8軽鎖の可変領域およびヒトIgκ鎖の定常領域の融合フラグメントを保持する、得られたプラスミドpHSG/M1−2−2を、制限酵素HindIIIおよびEcoRIで消化する。
配列表の配列番号73に示されているように、TRA−8軽鎖アミノ酸配列のN末端から、第8位アミノ酸(ヒスチジン)、第9位アミノ酸(リジン)、第10位アミノ酸(フェニルアラニン)、11位アミノ酸(メチオニン)、第13位アミノ酸(スレオニン)、第20位アミノ酸(セリン)、第42位アミノ酸(グルタミン)、第43位アミノ酸(セリン)、第77位アミノ酸(アスパラギン)、第78位アミノ酸(バリン)、第80位アミノ酸(セリン)、第83位アミノ酸(ロイシン)、第85位アミノ酸(アスパラギン酸)、第87位アミノ酸(フェニルアラニン)、第99位アミノ酸(グリシン)、第103位アミノ酸(ロイシン)および第108位アミノ酸(アラニン)を置きかえること伴った、マウス抗ヒトDR5抗体TRA−8の軽鎖のアミノ酸の他のヒト化(LM3タイプ)は、それぞれ、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、スレオニン、リジン、アラニン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、スレオニン、チロシン、グルタミン、バリンおよびスレオニンで置き換えられる。得られた配列を、LM3として表す。
LM3ポリペプチド鎖(配列表の配列番号73)をコードするDNA(各々は、ヒト化抗DR5 抗体TRA−8軽鎖の可変領域およびヒトIg軽鎖(κ鎖)の定常領域の融合である)を、PCRを組み合わせて使用してそれぞれ合成する。
5’−cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag aactagatga gaggatgctt cttaagctt−3’(MOD1R1;配列番号79);
5’−ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga cagggtc−3’(MOD1F22;配列番号80);
5’−acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag−3’(MOD1R22;配列番号81);
5’−accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta ccaacagaaa ccaggaa−3’(MOD1F3;配列番号82);
5’−tacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt cccccacaga tgcagacaaa ga−3’(MOD1R3;配列番号83);
5’−aagcacccaa actcctcatc tattgggcat ccacccggca cactggggtc ccagataggt ttacaggcag t−3’(MOD1F42;配列番号84);
5’−cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat gaggagtttg ggtgcttttc ctggtttctg ttggtaccag gc−3’(MOD1R4;配列番号85);
5’−gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcaacc tat−3’(MOD1F5;配列番号86);
5’−actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac−3’(MOD1R52;配列番号87);
5’−tactgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc−3’(MOD1F6;配列番号88);
5’−cgtccgatag ctgctatatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac−3’(MOD1R6;配列番号89);
5’−aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga g−3’(MOD1F7;配列番号90);
5’−gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgccttgacc gaa−3’(MOD1R7;配列番号91);および
5’−agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa(LR17; 配列番号101)。
配列表の配列番号73で定義されるアミノ酸配列をコードするLM3−DNAフラグメントを、2工程PCRを使用して調製し、プラスミドベクター中へ挿入し、そしてE.coliにクローニングする。
5’末端に付加されたHindIII制限酵素切断部位を有する分泌シグナル配列領域、FRL1、CDRL1、FRL2およびCDRL2、FRL3、CDRL3、FRL4ならびに定常領域部分をコードするLM3−F31B−DNAフラグメントを以下の条件で調製する。
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F1、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R1、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F22、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R22、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F3、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R3、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F42、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R4、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F5、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R52、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F6、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R6、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F7、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R7、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーLR17、50pmol
dNTPカクテル、5μl
l0×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNA ポリメラーゼ、2.5単位。
プラスミドpSRPDHH DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F7、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5μl
l0×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNA ポリメラーゼ、2.5単位。
上記のLM3−F31B−DNAフラグメント、およびLM3−F31C−DNAフラグメントを融合したLM3−DNAを、以下の条件で調製する:
第1工程のPCRで調製されたLM3−F31B−DNAのゲルフラグメント
第1工程のPCRで調製されたLM3−F31C−DNAのゲルフラグメント
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5.0μl
l0×PCR緩衝液、5.0μl
ampliTaq DNA ポリメラーゼ、2.5単位。
キットに含まれるコンピテントE.coli TOP10F’の中へ導入する。ヒト化LM3 TRA−8の軽鎖をコードしたこれらのDNAのヌクレオチド配列を、3700 DNA Analyzer(ABI PRISM;Perkin Elmer Applied Biosystems,Japan)を使用し、ジデオキシ法(Sanger,F.S.ら、(1977)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、74:5463〜5467)で確認する。
ヒト化LM1 TRA−8軽鎖の可変領域およびヒトIgκ鎖の定常領域の融合フラグメントを保持する、得られたプラスミドpHSG/M3−3−22を、制限酵素HindIIIおよびEcoRIで消化する。
配列表の配列番号74に示されるように、TRA−8軽鎖のアミノ酸配列のN末端から8番目のアミノ酸(ヒスチジン)、9番目のアミノ酸(リジン)、10番目のアミノ酸(フェニルアラニン)、11番目のアミノ酸(メチオニン)、13番目のアミノ酸(スレオニン)、20番目のアミノ酸(セリン)、42番目のアミノ酸(グルタミン)、43番目のアミノ酸(セリン)、77番目のアミノ酸(アスパラギン)、78番目のアミノ酸(バリン)、80番目のアミノ酸(セリン)、83番目のアミノ酸(ロイシン)、85番目のアミノ酸(アスパラギン酸)、99番目のアミノ酸(グリシン)、103番目のアミノ酸(ロイシン)および108番目のアミノ酸(アラニン)を置換する必要があるマウス抗ヒトDR5抗体TRA−8の軽鎖のアミノ酸配列の他のヒト化(LM4型)は、それぞれ、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、スレオニン、リジン、アラニン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、スレオニン、グルタミン、バリンおよびスレオニンで置換される。得られた配列を、LM4と表記する。
LM4ポリペプチド鎖(配列表の配列番号74)をコードするDNA(この各々は、ヒト化抗DR5抗体TRA−8軽鎖の可変領域とヒトIg軽鎖(κ鎖)の定常領域との融合である)を、各々、PCRの組合せを使用することによって合成する。
5’−cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg gctgcag−3’(MOD1R62;配列番号93)。
配列表の配列番号74に規定されるようなアミノ酸配列をコードするLM4−DNAフラグメントを、2工程PCRを実施することによって調製し、プラスミドべクターに挿入し、そしてE.coli中にクローニングする。
5’末端にHindIII制限酵素切断部位が付加された分泌シグナル配列領域、FRL1、CDRL1、FRL2、およびCDRL2、FRL3、CDRL3、FRL4、ならびに定常領域の一部分をコードするLM4−F41B−DNAフラグメントを、以下の条件下で調製する。
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F1、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R1、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F22、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R22、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F3、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R3、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F42、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R4、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F5、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R52、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F62、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R62、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F7、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R7、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーLR17、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
プラスドpSRPDHH DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F7、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
上記のLM4−F41B−DNAおよびLM4−F41C−DNAフラグメントが融合されたLM4−DNAを、以下の条件下で調製する。
第一工程のPCRで調製されたLM4−F41B−DNAのゲルフラグメント
第一工程のPCRで調製されたLM4−F41C−DNAのゲルフラグメント
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5.0μl
10×PCR緩衝液、5.0μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
ヒト化LM4 TRA−8軽鎖の可変領域とヒトIgκ鎖の定常領域との融合フラグメントを有する、得られたプラスミドpHSG/M4−5−3−1を、制限酵素HindIIIおよびEcoRIで消化する。
配列表の配列番号75に示されるように、TRA−8軽鎖のアミノ酸配列のN末端から8番目のアミノ酸(ヒスチジン)、9番目のアミノ酸(リジン)、10番目のアミノ酸(フェニルアラニン)、11番目のアミノ酸(メチオニン)、13番目のアミノ酸(スレオニン)、20番目のアミノ酸(セリン)、42番目のアミノ酸(グルタミン)、43番目のアミノ酸(セリン)、77番目のアミノ酸(アスパラギン)、78番目のアミノ酸(バリン)、80番目のアミノ酸(セリン)、83番目のアミノ酸(ロイシン)、103番目のアミノ酸(ロイシン)および108番目のアミノ酸(アラニン)を置換する必要があるマウス抗ヒトDR5抗体TRA−8の軽鎖のアミノ酸配列の他のヒト化(LM5型)は、各々、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、スレオニン、リジン、アラニン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、バリンおよびスレオニンで置換される。得られた配列をLM5と表記する。
LM5ポリペプチド鎖(配列表の配列番号75)をコードするDNA(その各々は、ヒト化抗DR5抗体TRA−8軽鎖の可変領域とヒトIg軽鎖(κ鎖)の定常領域との融合物である)を、それぞれPCRの組み合わせを用いて合成する。
5’−ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatc−3’(MOD1F63;配列番号95);
5’−cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gctgcag−3’(MOD1R63;配列番号96);
5’−gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcctccacc gaa−3’(MOD1R72;配列番号102)。
配列表の配列番号75に規定されたアミノ酸配列をコードするLM5−DNAフラグメントを、2工程PCRを行うことにより調製し、プラスミドベクターに挿入し、E.coliにクローニングする。
5’末端にHindIII制限酵素切断部位が付加された分泌シグナル配列領域、FRL1、CDRL1、FRL2、CDRL2、FRL3、CDRL3、FRL4および定常領域の一部分をコードするLM5−F51B−DNAフラグメントを以下の条件下で調製する。
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F1、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R1、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F22、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R22、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F3、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R3、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F42、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R4、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F52、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R52、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F63、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R63、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F7、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R72、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーLR17、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5ユニット。
プラスミドpSRPDHH DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F7、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5ユニット。
上記のLM5−F51B−DNAフラグメントおよびLM5−F51C−DNAフラグメントが融合したLM5−DNAを、以下の条件下で調製する。
第1工程PCRで調製したLM5−F51B−DNAのゲルフラグメント
第1工程PCRで調製したLM5−F51C−DNAのゲルフラグメント
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5.0μl
10×PCR緩衝液、5.0μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5ユニット
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することにより最終容量50μlに調節し、PCRで用いる。
ヒト化LM5 TRA−8軽鎖の可変領域とヒトIgκ鎖の定常領域との融合フラグメントを保有する得られたプラスミドpHSG/M5−3−27を、制限酵素HindIIIおよびEcoRIで消化する。
配列表の配列番号76に示される配列(キメラ型TRA−8の軽鎖のアミノ酸配列)を、LM6と名付ける。
LM6ポリペプチド鎖(配列表の配列番号75)をコードするDNA(その各々は、マウス抗DR5抗体TRA−8軽鎖(LM6型)の可変領域とヒトIg軽鎖(κ鎖)の定常領域との融合物である)を、それぞれ、PCRの組み合わせを用いることにより合成する。
5’−tgggttccag gctccactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c−3’(MVF11;配列番号98);
5’−aagacagatg gtgcagccac agcccgtttg atttccagct tggtgcctc−3’(MVR11;配列番号99);および
5’−aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcatc−3’(MCF11;配列番号100)。
配列表の配列番号75に規定されるアミノ酸配列をコードするLM6−DNAフラグメントを、2工程PCRを行うことにより調製し、プラスミドベクターに導入し、E.coli中にクローニングする。
分泌シグナル配列、および5’末端にHindIII制限酵素切断部位が付加されたFRL1領域の一部分をコードするLM6−F1−DNAフラグメントを、以下の条結下で調製する。テンプレートプラスミドpHSGHM17およびpSRPDHHを、欧州特許出願EP 0 909 816 A1における記載に従って得る。
プラスミドpHSGHM17 DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーHKSPR13、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ(PerkinElmer)、2.5ユニット。
プラスミドpL28 DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマーMVF11、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMVR12、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
プラスミドpSRPDHH DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマーMCF11、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
上記のLM6−F1−DNAフラグメント、LM6−F2−DNAフラグメント、およびLM6−F3−DNAフラグメントが融合された、LM6−DNAを、以下の条件下で調製する。
第1工程PCRにて調製されたLM6−F1−DNAのゲルフラグメント
第1工程PCRにて調製されたLM6−F2−DNAのゲルフラグメント
第1工程PCRにて調製されたLM6−F3−DNAのゲルフラグメント
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5.0μl
10×PCR緩衝液、5.0μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
マウスTRA−8軽鎖の可変領域とヒトIgκ鎖の定常領域との融合フラグメントを保有する、得られたプラスミドpHSG/LM6−1−4−1を、制限酵素HindIIIおよびEcoRIを用いて消化する。
COS−7細胞のトランスフェクションを、FUGENE6トランスフェクション試薬法(Boehringer Mannheim Biochemica)により、このキットに備え付けられた指示マニュアルに従って、行う。
(B):pHB14−1とpSR/LM2−1との同時トランスフェクション(H2L2)
(C):pHB14−1とpSR/LM3−3−44−10との同時トランスフェクション(H2L3)
(D):pHB14−1とpSR/LM4−5−3−3との同時トランスフェクション(H2L4)
(E):pHC10−3とpSR/LM2−1との同時トランスフェクション(H3L2)
(F):pHC10−3とpSR/LM3−3−44−10との同時トランスフェクション(H3L3)
(G):pHC10−3とpSR/LM4−5−3−3との同時トランスフェクション(H3L4)
(H):pHD21−1とpSR/LM5−3−27−1との同時トランスフェクション(H4L5)
(I):pM11−1とpSR/LM6−1−4−6との同時トランスフェクション(キメラ)。
HPLCシステム:BioCAD 700E(Applied Biosystems)
カラム:ProteinG−IDセンサーカートリッジ
(カラムサイズ:2.1mm ID×30mm LD、ベッド体積:0.1ml;Applied Biosystems)
溶出緩衝液:0.1M グリシン−HCl(pH2.5)
中和緩衝液:1M Tris−HCl(pH8.5)
検出:280nm
流量:1ml/分
フラクションサイズ:0.5ml/0.5分
フラクションチューブ:1.5mlポリプロピレンマイクロチューブ
温度:4℃。
Jurkat細胞(ATCC No.TIB−152)を使用して、精製されたヒト化TRA−8抗体のアポトーシス誘導活性を調べた。
生存率(%)=100×(a−b)/(c−b)
ここで、「a」は、試験ウェルの測定値、「b」は、細胞の入っていないウェルの測定値、そして「c」は、抗体が添加されていないウェルの測定値である。
Claims (18)
- TRAILレセプターDR5と特異的に結合し、TRAILレセプターDR4、DcR1およびDcR2のいずれとも結合しない精製抗体であって、
この抗体の重鎖免疫グロブリンが、重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3を有する可変領域を含み、前記重鎖CDR1は配列番号25のアミノ酸残基1〜5からなり、前記重鎖CDR2は配列番号26のアミノ酸残基1〜17からなり、前記重鎖CDR3は配列番号27のアミノ酸残基1〜10からなること;
この抗体の軽鎖免疫グロブリンが、軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3を有する可変領域を含み、前記軽鎖CDR1は配列番号28のアミノ酸残基1〜11からなり、前記軽鎖CDR2は配列番号29のアミノ酸残基1〜7からなり、前記軽鎖CDR3は配列番号30のアミノ酸残基1〜8からなること;および
この抗体が、
(a) インビトロにおいて、その可溶性形態で、DR5発現標的細胞に、2.5μg/mlの抗体濃度で70%以下の細胞生存率を示す細胞死誘導活性を有し、
(b) インビボにおいて、DR5を発現する腫瘍細胞に対して殺腫瘍活性を有すること
を特徴とする抗体。 - 正常肝細胞において有意な細胞死を誘導しない、請求項1記載の抗体。
- DR5が、ヒトDR5である、請求項1又は2記載の抗体。
- ヒト化されている、請求項1〜3のいずれか1項記載の抗体。
- 前記重鎖がヒト免疫グロブリンG1重鎖の定常領域を含み、前記軽鎖がヒト免疫グロブリンκ軽鎖の定常領域を含む、請求項1〜4のいずれか1項記載の抗体。
- DR5発現標的細胞が、炎症滑膜細胞、癌細胞および活性化された免疫細胞のいずれかである、請求項1〜5のいずれか1項記載の抗体。
- 細胞を有効量の抗体と接触させる工程を含む、細胞中のNFκBレベルを上昇させる方法において使用するための、請求項1〜6のいずれか1項記載の抗体。
- 標的細胞を治療量の抗体と接触させる工程を含む、DR5を発現する標的細胞の選択的な細胞死を誘導する方法において使用するための、請求項1〜6のいずれか1項記載の抗体。
- 標的細胞を治療量の抗体と接触させる工程を含む、DR5を発現する標的細胞の増殖を阻害する方法において使用するための、請求項1〜6のいずれか1項記載の抗体。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載の抗体を有効成分とする医薬組成物。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載の抗体を有効成分とする抗腫瘍剤。
- 容器内に請求項1〜6のいずれか1項記載の抗体を含む、アポトーシスを誘導するための商業的キット。
- 標的細胞において細胞死を選択的に誘導する方法であって、以下の工程:
(a)該標的細胞を、発現可能なTRAILレセプターDR5をコードする核酸を含むベクターでトランスフェクトする工程;
(b)TRAILレセプターDR5を該細胞上で発現させる工程;および
(c)該細胞を、請求項1〜6のいずれか1項記載の抗体と接触させる工程
を包含する、方法。 - 請求項1〜6のいずれか1項記載の抗体を産生する方法であって、以下の工程:
(a)前記抗体の軽鎖免疫グロブリン、前記抗体の重鎖免疫グロブリンまたはその両方をコードする第一ベクターで宿主細胞を形質転換する工程;
(b)いずれかが該第一ベクターに存在しない場合、工程(a)の前記軽鎖または前記重鎖をコードする第二ベクターで前記宿主細胞を形質転換する工程;
(c)前記形質転換された宿主細胞を、前記軽鎖免疫グロブリンおよび重鎖免疫グロブリンの発現を許容する条件下でインキュベートする工程;および
(d)前記宿主細胞または前記宿主細胞の培地から前記抗体を単離する工程
を包含する、方法。 - 請求項1〜6のいずれか1項記載の抗体をコードする単離された核酸。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載の抗体を製造するための、
重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3を有する可変領域を含み、前記重鎖CDR1は配列番号25のアミノ酸残基1〜5からなり、前記重鎖CDR2は配列番号26のアミノ酸残基1〜17からなり、前記重鎖CDR3は配列番号27のアミノ酸残基1〜10からなる、重鎖免疫グロブリン;および
軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3を有する可変領域を含み、前記軽鎖CDR1は配列番号28のアミノ酸残基1〜11からなり、前記軽鎖CDR2は配列番号29のアミノ酸残基1〜7からなり、前記軽鎖CDR3は配列番号30のアミノ酸残基1〜8からなる、軽鎖免疫グロブリン
をコードする単離された核酸。 - 請求項15又は16記載の核酸および前記核酸に作動可能に連結された調節エレメントを含む、ベクター。
- 請求項17記載のベクターを含む、培養細胞。
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