DE69838249T3

DE69838249T3 - Anti-apo-2 antikörper

Info

Publication number: DE69838249T3
Application number: DE69838249T
Authority: DE
Inventors: Avi Ashkenazi; Camellia ADAMS; Anan Chuntharapai; Kyung Kim
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-05-15
Filing date: 1998-05-14
Publication date: 2012-01-19
Anticipated expiration: 2018-05-15
Also published as: AU740858B2; ES2293682T3; ATE370232T1; PT1860187E; EP1860187A1; EP0981618B1; CA2287911C; PT981618E; EP1860187B1; ES2293682T5; EP0981618A1; DE69838249D1; WO1998051793A1; JP2008148695A; US20030017161A1; CY1106966T1; DE69838249T2; IL132067A0; JP2001511653A; ATE516354T1

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Anti-Apo-2-Antikörper, Zusammensetzungen, die diese umfassen, und deren Verwendungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Apoptose oder „programmierter Zelltod”
Die Steuerung der Zellzahlen bei Säugetieren soll zum Teil durch ein Gleichgewicht zwischen Zellproliferation und Zelltod bestimmt werden. Eine Form des Zelltods, manchmal nekrotischer Zelltod genannt, wird typischerweise als pathologische Form von Zelltod charakterisiert, der aus einem bestimmten Trauma oder einem Zellschaden resultiert. Hingegen gibt es eine andere „physiologische” Form von Zelltod, der für gewöhnlich in geordneter oder kontrollierter Form fortschreitet. Diese geordnete oder kontrollierte Form von Zelltod wird oft als „Apoptose” bezeichnet [siehe z. B. Barr et al., Bio/Technology 12, 487–493 (1994); Steller et al., Science 267, 1445–1449 (1995)]. Apoptotischer Zelltod tritt natürlich in vielen physiologischen Prozessen auf, einschließlich embryonaler Entwicklung und klonaler Selektion im Immunsystem [Itoh et al., Cell 66, 233–243 (1991)]. Geringere Ausmaße von apoptotischem Zelltod sind jedoch mit einer Reihe von pathologischen Erkrankungen assoziiert worden, einschließlich Krebs, Lupus und Herpes-Virus-Infektion [Thompson, Science 267, 1456–1462 (1995)]. Erhöhte Ausmaße von apoptotischem Zelltod können mit einer Reihe von anderen pathologischen Erkrankungen assoziiert sein, einschließlich AIDS, Alzheimer, Parkinson, amyotrophische Lateralsklerose, multiple Sklerose, Retinitis pigmentosa, Kleinhirndegeneration, aplastische Anämie, Myokardinfarkt, Schlaganfall, Reperfusionsschaden und toxininduzierte Lebererkrankung [siehe Thompson, siehe oben].
Apoptotischer Zelltod ist typischerweise von einer oder mehreren charakteristischen morphologischen und biochemischen Veränderungen in Zellen begleitet, wie z. B. Kondensation von Zytoplasma, Verlust von Plasmamembranmikrovilli, Segmentierung des Nucleus, Abbau von Chromosomen-DNA oder Verlust von Mitochondrienfunktion. Eine Reihe extrinsischer und intrinsischer Signale sollen solche morphologischen und biochemischen Zellveränderungen auslösen oder induzieren [Raff, Nature 356, 397–400 (1992); Steller, siehe oben; Sachs et al., Blood 82, 15 (1993)]. Zum Beispiel können sie durch Hormonreize, wie z. B. Glukokortikoidhormone für unreife Thymozyten, sowie durch Entzug bestimmter Wachstumsfaktoren ausgelöst werden [Watanabe-Fukunaga et al., Nature 356, 314–317 (1992)]. Es ist auch von einigen identifizierten Onkogenen, wie z. B. myc, rel und E1A, und Tumorsuppressoren, wie p53, berichtet worden, dass sie eine Rolle in der Induktion von Apoptose spielen. Ebenso ist von bestimmten chemotherapeutischen Arzneimitteln und einigen Formen von Bestrahlung beobachtet worden, dass sie apoptose-induzierende Aktivität haben [Thompson, siehe oben].
TNF-Familie von Cytokinen
Verschiedene Moleküle, wie z. B. Tumornekrosefaktor-α („TNF-α”), Tumornekrosefaktor-β („TNF-β” oder „Lymphotoxin”), CD30-Ligand, CD27-Ligand, CD40-Ligand, OX-40-Ligand, 4-1BB-Ligand, Apo-1-Ligand (auch Fas-Ligand oder CD95-Ligand genannt) und Apo-2-Ligand (auch TRAIL genannt), sind als Elemente der Tumornekrosefaktor-(„TNF”-)Familie von Cytokinen identifiziert worden [siehe z. B. Gruss und Dower, Blood 85, 3378–3404 (1995); Wiley et al., Immunity 3, 673–682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem. 271, 12687–12690 (1996); WO 97/01633 , veröffentlicht am 16. Jänner 1997]. Von diesen Molekülen ist von TNF-α, TNF-β, CD30-Ligand, 4-1BB-Ligand, Apo-1-Ligand und Apo-2-Ligand (TRAIL) berichtet worden, dass sie in apoptotischen Zelltod involviert sind. Sowohl TNF-α als auch TNF-β sollen apoptotischen Tod in empfindlichen Tumorzellen auslösen [Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol. 17, 689 (1987)]. Zheng et al. haben berichtet, dass TNF-α in Poststimulationsapoptose von CD8-positiven T-Zellen involviert ist [Zheng et al., Nature 377, 348–351 (1995)]. Andere Wissenschaftler haben berichtet, dass der CD30-Ligand in die Deletion von selbstreagierenden T-Zellen im Thymus involviert sein kann [Amakawa et al., Cold Spring Harbor Laborstory Symposium an Programmed Cell Death, Abstract Nr. 10 (1995)].
Mutationen im Maus-Fas/Apo-1-Rezeptor- oder -Ligandengenen (lpr bzw. gld genannt) sind mit einigen Autoimmunerkrankungen assoziiert worden, die anzeigen, dass Apo-1-Ligand eine Rolle in der Regulierung der klonalen Deletion von selbstreagierenden Lymphozyten in der Peripherie spielen kann [Krammer et al., Curr. Op. Immunol. 6, 279–289 (1994), Nagata et al., Science 267, 1449–1456 (1995)]. Vom Apo-1-Ligand wird auch berichtet, dass er Poststimulationsapoptose in CD4-positiven T-Lymphozyten und in B-Lymphozyten induziert und in die Elimination der aktivierten Lymphozyten involviert sein kann, wenn ihre Funktion nicht länger gebraucht wird [Krammer et al., siehe oben, Nagata et al., siehe oben]. Es ist von monoklonalen Agonistenmausantikörpern, die sich spezifisch an den Apo-1-Rezeptor binden, berichtet worden, dass sie Zelltötungsaktivität zeigen, die mit jener von TNF-α vergleichbar ist oder dieser ähnlich ist [Yonehara et al., J. Exp. Med. 169, 1747–1756 (1989)].
TNF-Familie von Rezeptoren
Es wird angenommen, dass Induktion verschiedener Zellantworten, die von solchen TNF-Familie-Cytokinen vermittelt werden, durch ihre Bindung an spezifische Zellrezeptoren initiiert werden. Es sind zwei verschiedene TNF-Rezeptoren von etwa 55 kDa (TNFR1) und 75 kDa (TNFR2) identifiziert worden [Hohman et al., J. Biol. Chem. 264, 14927–14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 3127–3131 (1990), EP 417.563 , veröffentlicht am 20. März 1991], und menschliche und MauscDNAs, die beiden Rezeptortypen entsprechen, sind isoliert und charakterisiert worden [Loetscher et al., Cell 61, 351 (1990); Schall et al., Cell 61, 361 (1990); Smith et al., Science 248, 1019–1023 (1990), Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 2830–2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol. 11, 3020–3026 (1991)]. Umfassende Polymorphismen sind mit beiden TNF-Rezeptorgenen assoziiert worden [siehe z. B. Takao et al., Immunogenetics 37, 199–203 (1993)]. Beide TNFRs zeigen die typische Struktur von Zelloberflächenrezeptoren, die extrazelluläre, Transmembran- und intrazelluläre Regionen umfassen. Die extrazellulären Abschnitte beider Rezeptoren werden natürlich als lösliche TNF-Bindungsproteine nachgewiesen [Y. Nophar et al., EMBO J. 9, 3269 (1990); und T. Kohno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8331 (1990)]. Von Hale et al. [J. Cell. Biochem., Beilage 15F, 113 (P424) (1991)] wurde vom Klonieren rekombinanter löslicher TNF-Rezeptoren berichtet.
Der extrazelluläre Abschnitt von Typ-1- und Typ-2-TNFRs (TNFR1 und TNFR2) enthält ein sich wiederholendes Aminosäuresequenzmuster von vier cysteinreichen Domänen (CRDs), die 1 bis 4 genannt werden, beginnend beim NH₂-Terminus. Jede CRD ist etwa 40 Aminosäuren lang und enthält 4 bis 6 Cysteinreste an Positionen, die gut konserviert sind [Schall et al., siehe oben, Loetscher et al., siehe oben; Smith et al., siehe oben, Nophar et al., siehe oben; Kohono et al., siehe oben]. In TNFR1 sind die ungefähren Grenzen der vier CRDs wie folgt: CRD1-Aminosäuren 14 bis etwa 53, CRD2-Aminosäuren von etwa 54 bis etwa 97, CRD3-Aminosäuren von etwa 98 bis etwa 138; CDR4-Aminosöuren von etwa 139 bis etwa 167. In TNFR2 umfasst CRD1 Aminosäuren 17 bis etwa 54; CDR2 Aminosäuren von etwa 55 bis etwa 97; CRD3 Aminosäuren von etwa 98 bis etwa 140; und CRD4 Aminosäuren von etwa 141 bis etwa 179 [Banner et al., Cell 73, 431–435 (1993)]. Die potenzielle Rolle der CRDs in Ligandenbindung ist auch von Banner et al., siehe oben, beschrieben.
Ein ähnliches sich wiederholendes Muster von CRDs besteht in mehreren anderen Zelloberflächenproteinen, einschließlich des p75-Nervenwachstumsfaktorrezeptors (NGFR) [Johnson et al., Cell 47, 545 (1986); Radeke et al., Nature 325, 593 (1987)], des B-Zellantigens CD40 [Stamenkovic et al., EMBO J. 8, 1403 (1989)], des T-Zellantigens OX40 [Mallet et al., EMBO J. 9, 1063 (1990)] und des Fas-Antigens [Yonehara et al., siehe oben, und Itoh et al., siehe oben]. CRDs sind auch in löslichen TNFR-(sTNFR)-ähnlichen T2-Proteinen der Shope- und Myxompockenviren zu finden [Upton et al., Virology 160, 20–29 (1987); Smith et al., Biochem. Biophys Res. Commun. 176, 335 (1991); Upton et al., Virology 184, 370 (1991)]. Eine optimale Anordnung dieser Sequenzen zeigt an, dass die Positionen der Cysteinreste gut erhalten sind. Diese Rezeptoren werden manchmal kollektiv als Elemente der TNF/NGF-Rezeptorüberfamilie bezeichnet. Jüngste Studien über p75NGFR zeigten, dass die Deletion von CRD1 [A. A. Welcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 159–163 (1991)] oder eine 5-Aminosäureninsertion in diese Domäne [H. Yan und M. V. Chao, J. Biol. Chem. 266, 12099–12104 (1991)] wenig oder keine Wirkung auf NGF-Bindung zeigte [H. Yan und M. V. Chao, siehe oben]. p75NGFR enthält einen prolinreichen Abschnitt von etwa 60 Aminosäuren, zwischen seiner CRD4- und Transmembranregion, der nicht in NGF-Bindung involviert ist [C. Peetre et al., Eur. J. Hematol. 41, 414–419 (1988); P. Seckinger et al., J. Biol. Chem. 264, 11966–11973 (1989), H. Yan und M. V. Chao, siehe oben]. Eine ähnliche prolinreiche Region ist in TNFR2, aber nicht in TNFR1 zu finden.
Itoh et al. offenbaren, dass der Apo-1-Rezeptor einen apoptotischen Zelltod signalisieren kann, der jenem ähnlich ist, der vom 55-kDa-TNFR1 signalisiert wird [Itoh et al., siehe oben]. Es ist auch von einer Expression des Apo-1-Antigens berichtet worden, dass sie gemeinsam mit jener von TNFR1 herabreguliert wird, wenn Zellen entweder mit TNF-α oder monoklonalem Anti-Apo-1-Maus-Antikörper behandelt werden [Krammer et al., siehe oben, Nagata et al., siehe oben]. Dementsprechend haben einige Wissenschaftler die Hypothese aufgestellt, dass Zelllinien, die sowohl Apo-1- als auch TNFR1-Rezeptoren co-exprimieren, Zelltötung über gemeinsame Signalisierungswege vermitteln können [ld.].
Die TNF-Familie-Liganden, die bisher identifiziert worden sind, mit der Ausnahme von Lymphotoxin-α, sind Typ-II-Transmembranproteine, deren C-Terminus extrazellulär ist. Hingegen sind die Rezeptoren in der TNF-Rezeptor-(TNFR-)Familie, die bisher identifiziert worden sind, Typ-I-Transmembranproteine. In sowohl den TNF-Liganden- als auch den Rezeptorenfamilien ist die Homologie, die zwischen den Elementen einer Familie identifiziert worden ist, jedoch hauptsächlich in der extrazellulären Domäne („ECD”) zu finden gewesen. Verschiedene Cytokine der TNF-Familie, einschließlich TNF-α, Apo-1-Ligand und CD40-Ligand, werden proteolytisch an der Zelloberfläche gespalten; das resultierende Protein bildet in jedem Fall typischerweise ein homotrimeres Molekül, das als lösliches Cytokin funktioniert. Die TNF-Rezeptorfamilienproteine werden üblicherweise proteolytisch gespalten, um lösliche Rezeptor-ECDs freizusetzen, die als Inhibitoren von zugehörigen Cytokinen wirken können.
Vor kurzem sind andere Elemente der Säugetier-TNFR-Familie identifiziert worden. In Marsters et al., Curr. Biol. 6, 750 (1996), beschreiben Wissenschafter eine native Volllängen-Sequenz eines menschlichen Polypeptids, Apo-3 genannt, das Ähnlichkeit zur TNFR-Familie in ihren extrazellulären cysteinreichen Wiederholungen zeigt und TNFR1 und CD95 ähnelt, insofern, als dass es eine zytoplasmatische Todesdomänensequenz enthält [siehe auch Marsters et al., Curr. Biol. 6, 1669 (1996)]. Apo-3 ist auch von anderen Wissenschaftern als DR3, wsl-1 und TRAMP bezeichnet worden [Chinnaiyan et al., Science 174, 990 (1996); Kitson et al., Nature 384, 372 (1996); Bodmer et al., Immunity 6, 79 (1997)].
Pan et al. haben ein anderes TNF-Rezeptorfamilienelement offenbart, das „DR4” genannt wird [Pan et al., Science 276, 111–113 (1997)]. Vom DR4 wurde berichtet, dass es eine zytoplasmatische Todesdomäne enthält, die in der Lage ist, in die Zellsuizidvorrichtung einzugreifen. Pan et al. offenbaren, dass DR4 ein Rezeptor für den Liganden sein soll, der Apo-2-Ligand oder TRAIL genannt wird.
Der Apoptose-induzierende Signalkomplex
Wie derzeit bekannt ist, enthält das Zelltodprogramm zumindest drei wichtige Elemente-Aktivatoren, Inhibitoren und Effektoren; in C. elegans sind diese Elemente durch 3 Gene kodiert, Ced-4, Ced-9 bzw. Ced-3 [Steller, Science 267, 1445 (1995); Chinnaiyan et al., Science 275, 1122–1126 (1997)]. Zwei der TNFR-Familienelemente, TNFR1 und Fas/Apo1 (CD95), können apoptotischen Zelltod aktivieren (Chinnaiyan und Dixit, Current Biology 6, 555–562 (1996); Fraser und Evan, Cell 85, 781–784 (1996)]. Von TNFR1 ist auch bekannt, dass es die Aktivierung des Transkriptionsfaktors, NF-κB, vermittelt [Tartaglia et al., Cell 74, 845–853 (1993); Hsu et al., Cell 84, 299–308 (1996)]. Zusätzlich zu gewisser ECD-Homologie teilen diese zwei Rezeptoren Homologie in ihrer intrazellulären Domäne (ICD) in einer Oligomerisierungsschnittstelle, die als Todesdomäne bekannt ist [Tartaglia et al., siehe oben, Nagata, Cell 88, 355 (1997)]. Todesdomänen sind auch in mehreren Metazoenproteinen zu finden, die Apoptose steuern, nämlich dem Drosophilaprotein, den Reaper- und Säugetierproteinen, die als FADD/MORT1, TRADD und RIP bezeichnet werden [Cleaveland und Ihle, Cell 81, 479–482 (1995)]. Unter Verwendung des Hefe-Zweihybridsystems berichten Raven et al. von der Identifikation des Protein wsl-1, das sich an die TNFR1-Todesdomäne bindet (Raven et al., Programmed Cell Death Meeting, 20.–24. September 1995, Abstract auf Seite 127; Raven et al., European Cytokine Network 7, Abstr. 82 auf Seite 210 (April-Juni 1996)]. Das wsl-1-Protein wird als homolog zu TNFR1 (48% Identität) beschrieben und verfügt über eine eingeschränkte Gewebsverteilung. Gemäß Raven et al. unterscheidet sich die Gewebsverteilung von wsl-1 signifikant vom TNFR1-Bindungsprotein TRADD.
Von TNFR1 und CD95 wird nach Ligandenbindung und Rezeptorenclustering angenommen, dass sie FADD in einen todinduzierenden Signalgebungskomplex rekrutieren. CD95 bindet FADD angeblich direkt, während TNFR1 FADD indirekt über TRADD bindet [Chinnaiyan et al., Cell 81, 505–512 (1995); Boldin et al., J. Biol. Chem. 270, 387–391 (1995); Hsu et al., siehe oben, Chinnaiyan et al., J. Biol. Chem. 271, 4961–4965 (1996)]. Es ist berichtet worden, dass FADD als Adaptorprotein dient, das die Ced-3-verwandte Protease MACHα/FLICE (Caspase 8) in den Todsignalgebungskomplex rekrutiert [Boldin et al., Cell 85, 803–815 (1996); Muzio et al., Cell 85, 817–827 (1996)]. MACHα/FLICE scheint der Trigger zu sein, der eine Kaskade von apoptotischen Proteasen, einschließlich des interleukin-1β-konvertierenden Enzyms (ICE) und CPP32/Yama, initiiert, die einige kritische Aspekte des Zelltodprogramms ausführen können [Fraser und Evan, siehe oben].
Es wurde kürzlich offenbart, dass programmierter Zelltod die Aktivität von Elementen einer Familie von Cysteinproteasen umfasst, die mit dem C.-elegans-Zelltodgen, ced-3, und mit dem Säugetier-IL-1-konvertierendem Enzym ICE verwandt sind. Die Aktivität von ICE- und CPP32/Yama-Proteasen kann durch das Produkt des Kuhpockenvirusgens crmA gehemmt werden [Ray et al., Cell 69, 597–604 (1992); Tewari et al., Cell 81, 801–809 (1995)]. Jüngste Studien zeigen, dass CrmA TNFR1- und CD95-induzierten Zelltod hemmen können [Enari et a]., Nature 375, 78–81 (1995), Tewari et al., J. Biol. Chem. 270, 3255–3260 (1995)].
Wie kürzlich von Tewari et al. diskutiert, modulieren TNFR1, TNFR2 und CD40 die Expression von proentzündlichen und costimulierenden Cytokinen, Cytokinrezeptoren und Zelladhäsionsmolekülen durch Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB [Tewari et al., Curr. Op. Genet. Develop. 6, 39–44 (1996)]. NF-κB ist der Prototyp einer Familie von dimeren Transkriptionsfaktoren, deren Untereinheiten konservierte Rel-Regionen enthalten [Verma et al., Genes Develop. 9, 2723–2735 (1996); Baldwin, Ann. Rev. Immunol. 14, 649–681 (1996)]. In ihrer latenten Form wird NF-κB mit Mitgliedern der IκB-Inhibitorfamilie komplexiert. Nach Inaktivierung von IκB als Reaktion auf bestimmte Reize transloziert NF-κB auf den Nucleus, wo er sich an spezifische DNA-Sequenzen bindet, und aktiviert Gentranskription.
Für einen Überblick über die TNF-Familie von Cytokinen und deren Rezeptoren siehe Gruss und Dower, siehe oben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Patentanmelder haben cDNA-Klone identifiziert, die für die Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Anmeldung „Apo-2-Ligand” genannt werden. Es wird derzeit davon ausgegangen, dass Apo-2-Ligand ein Element der TNFR-Familie ist; die native Volllängensequenz des menschlichen Apo-2-Polypeptids zeigt gewisse Ähnlichkeiten mit einigen bekannten TNFRs, einschließlich einer zytoplasmatischen Todesdomänenregion. Eine native Volllängensequenz von menschlichem Apo-2 zeigt auch Ähnlichkeit mit der TNFR-Familie in ihren extrazellulären cysteinreichen Widerholungen. Es ist festgestellt worden, dass Apo-2-Polypeptid in der Lage ist, caspaseabhängige Apoptose auszulösen und NF-κB zu aktivieren. Die Anmelder stellten jedoch überraschenderweise fest, dass eine lösliche extrazelluläre Domäne von Apo-2 Apo-2-Ligand („Apo-2L”) bindet und Apo-2-Ligandenfunktion hemmen kann. Es wird derzeit davon ausgegangen, dass Apo-2-Ligand über zumindest zwei verschiedene Rezeptoren, DR4 und das hierin neu beschriebene Apo-2, signalisieren kann.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen monoklonalen Antikörper bereit, der (a) sich an das Apo-2-Polypeptid bindet, das aus den Aminosäureresten 1 bis 411 der Seq.-1D Nr. 1 besteht, und (b) Apoptose in zumindest einer Form von Säugetierzelle in vivo oder ex vivo induziert, die das Apo-2-Polypeptid exprimiert.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung umfasst.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung stellt die vorliegende Erfindung einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in Therapie, genauer zur Behandlung von Krebs, bereit.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Apo-2-Antikörpers der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Induktion von Apoptose in Säugetierkrebszellen bereit, die den Apo-2-Rezeptor exprimieren. In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Apo-2-Antikörpers der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs bereit.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein In-vitro-Verfahren zur Induktion von Apoptose in Säugetierzellen bereit, die den Apo-2-Rezeptor exprimieren, umfassend die Exposition von Säugetierzellen, die Apo-2-Rezeptor exprimieren, gegenüber einem Apo-2-Antikörper der vorliegenden Erfindung.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Nucleotidsequenz von menschlicher Nativsequenz-Apo-2-cDNA (Seq.-ID Nr. 2) und ihre abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 1).
2A zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz eines menschlichen nativsequenz-Apo-2 – wobei die vermeintliche Signalsequenz unterstrichen ist, die vermeintliche Transmembrandomäne von einem Kästchen umgeben ist und die vermeintliche Todesdomänensequenz mit einer unterbrochenen Linie unterstrichen ist. Die Cysteine der zwei cysteinreichen Domänen sind jeweils unterstrichen.
2B zeigt eine Anordnung und einen Vergleich der Todesdomänensequenzen eines menschlichen Nativsequenz-Apo-2, DR4, Apo-3/DR3, TNFR1 und Fas/Apo-1 (CD95). Die Sternchen zeigen Reste, die für Todessignalgebung durch TFNR1 essentiell sind [Tartaglia et al., siehe oben].
3 zeigt die Wechselwirkung von Apo-2-ECD mit Apo-2L. Überstände von scheintransfizierten 293-Zellen oder von 293-Zellen, die mit Flag-Epitop markierten Apo-2-ECD transfiziert waren, wurden mit poly-His-markiertem Apo-2L inkubiert und Immunausfällung mit anti-Flag-konjugierten oder nickelkonjugierten Agarosekügelchen unterworfen. Die ausgefällten Proteine wurden durch Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen gelöst und durch Immunoblot mit Anti-Apo-2L- oder Anti-Flag-Antikörper detektiert.
4 zeigt die Induktion von Apoptose durch Apo-2 und die Inhibition der Apo-2L-Aktivität durch lösliche Apo-2-ECD. Menschliche 293-Zellen (A, B) oder HeLa-Zellen (C) wurden durch pRK5-Vektor oder durch pRK-5-basierte Plasmide transfiziert, die für Apo-2 und/oder CrmA kodieren. Apoptose wurde durch Morphologie (A), DNA-Fragmentierung (B) oder durch FACS (C-E) beurteilt. Lösliches Apo-2L wurde mit Puffer oder affinitätsgereinigter Apo-2-ECD gemeinsam mit Anti-Flag-Antikörper oder Apo-2-ECD-Immunadhäsin oder DR4- oder TFNR1-Immunadhäsinen vorinkubiert und zu HeLa-Zellen zugegeben. Die Zeilen wurden später auf Apoptose (D) analysiert. Dosis-Reaktionsanalyse unter Einsatz von Apo-2L mit Apo-2-ECD-Immunadhösin wurde ebenfalls bestimmt (E).
5. zeigt eine Aktivierung von NF-κB durch Apo-2, DR4 und Apo-2L. (A) HeLa-Zellen wurden mit Expressionsplasmiden transfiziert, die für die angegebenen Proteine kodieren. Es wurden Nuklearextrakte hergestellt und durch Gel-Retentionsanalyse analysiert. (B) HeLa-Zellen oder MCF7-Zellen wurden mit Puffer, Apo-2L oder TNF-alpha behandelt und auf NF-κB-Aktivität getestet. (C) HeLa-Zellen wurden mit Puffer, ALLN oder Cyclohexamid vor Hinzufügung von Apo-2L vorinkubiert. Apoptose wurde später durch FACS analysiert.
6A zeigt die Expression von Apo-2-mRNA in menschlichen Geweben wie durch Northern-Hybridisierung von polyA-RNA-Blots aus menschlichem Gewebe analysiert wurde.
6B zeigt die Expression von Apo-2-mRNA in menschlichen Krebszelllinien wie durch Northern-Hybridisierung von menschlichen Krebszelllinien-polyA-RNA-Blots analysiert wurde.
7 zeigt die FACS-Analyse eines Apa-2-Antikörpers 3F11.39.7 (durch fettgedruckte Linien dargestellt) im Vergleich zu IgG-Kontrollen (punktierte Linien). Der 3F11.39.7-Antikörper erkannte den Apo-2-Rezeptor, der in menschlichen 9D-Zellen exprimiert wurde.
8 ist ein Diagramm, welches die prozentuelle (%) Apoptose zeigt, die in 9D-Zellen durch Apa-2-Antikörper 3F11.39.7 induziert wird, in Abwesenheit von Ziegen-Anti-Maus-IgG-Fc.
9 ist ein Balkendiagramm, das die prozentuelle (%) Apoptose in 9D-Zellen durch Apo-2-Antikörper 3F11.39.7 in Gegenwart oder Abwesenheit von Ziegen-Anti-Maus-IgG-Fc im Vergleich zu Apo-2L zeigt.
10 ist ein Balkendiagramm, das die Fähigkeit von Apo-2-Antikörper 3F11.39.7 zeigt, Apoptose zu blockieren, die durch Apo-2L in 9D-Zellen induziert wird.
11 ist ein Diagramm, welches die Ergebnisse einer ELISA-Testbindung von Apo-2-Antikörper 3F11.39.7 an Apo-2 und andere bekannte Apo-2L-Rezeptoren zeigt, die als DR4, DcR1 und DcR2 bezeichnet werden.
12A ist ein Diagramm, welches die Ergebnisse eines ELISA-Tests zeigt, welcher die Bindung des 16E2-Antikörpers an Apo-2, DR4, DcR1, DcR2 und CD4-Ig zeigt.
12B ist ein Diagramm, welches die Ergebnisse eines ELISA-Tests zeigt, welcher die Bindung des 20E6-Antikörpers an Apo-2, DR4, DcR1, DcR2 und CD4-Ig beurteilt.
12C ist ein Diagramm, welches die Ergebnisse eines ELISA-Tests zeigt, der die Bindung des 24C4-Antikörpers an Apo-2, DR4, DcR1, DcR2 und CD4-Ig zeigt.
13A ist ein Diagramm, welches die agonistische Aktivität des 16E2-Antikörpers im Vergleich zu Apo-21 in einem Apoptose-Test (kristallviolette Färbung) unter Einsatz von SK-MES-1-Zellen zeigt.
13B ist ein Balkendiagramm, das agonistische Aktivität des 16E2-Antikörpers im Vergleich zum 7D5-scFv-Antikörper (einem Antigewebsfaktorantikörper) in einem Apoptosetest (kristallviolette Färbung) unter Einsatz von SK-MES-1-Zellen zeigt.
13C ist ein Balkendiagramm, das agonistische Aktivität des 16E2-Antikörpers im Vergleich zum 7D5-scFv-Antikörper in einem Apoptosetest (Annexin-V-Biotin/Streptavidin-[S³⁵]) unter Einsatz von SK-MES-1-Zellen zeigt.
14A ist ein Diagramm, welches die agonistische Aktivität des 20E6-Antikörpers im Vergleich zu Apo-21 in einem Apoptosetest (kristallviolette Färbung) unter Einsatz von SK-MES-1-Zellen zeigt.
14B ist ein Diagramm, welches die agonistische Aktivität des 20E6-Antikörpers durch einen Vergleich zwischen Ergebnissen zeigt, die in den Kristallviolett- und Annexin-V-Biotin(Streptavidin-[S35]-Apoptosetests erhalten wurden.
14C ist ein Diagramm, welches die agonistische Aktivität des gD-markierten 16E2-Antikörpers im Vergleich zu Apo-2L in einem Apoptosetest (kristallviolette Färbung) unter Einsatz von SK-MES-1-Zellen zeigt.
15A zeigt die Nucleotidsequenz des einkettigen Antikörper-(scFv-)Fragments, das als 16E2 bezeichnet wird (Seq.-ID Nr. 6).
15B zeigt die Nucleotidsequenz des einkettigen Antikörper-(scFv-)Fragments, das als 20E6 bezeichnet wird (Seq.-ID Nr. 7).
15C zeigt die Nucleotidsequenz des einkettigen Antikörper-(scFv-)Fragments, das als 24C4 bezeichnet wird (Seq.-ID Nr. 8).
16 zeigt die einkettigen Antikörper-(scFv-)Fragmente, die als 16E2, 20E6 und 24C4 bezeichnet werden, mit den jeweiligen Aminosäuresequenzen für die Signalsequenz und die identifizierten Schwer- und Leichtketten-CDR-Regionen (die CDR1-, CDR2- und CDR3-Regionen sind unterstrichen).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
I. Definitionen
Die Begriffe „Apo-2-Polypeptid” und „Apo-2” umfassen bei Verwendung hierin Nativsequenz-Apo-2 und Apo-2-Varianten (die hierin weiter definiert sind). Diese Begriffe umfassen Apo-2 aus einer Vielzahl von Säugetieren, einschließlich Menschen. Das Apo-2 kann aus einer Vielzahl von Quellen isoliert werden, wie z. B. aus menschlichen Gewebsformen oder aus einer anderen Quelle, oder kann durch Rekombinations- oder synthetische Verfahren hergestellt werden.
Ein „Nativsequenz-Apo-2” umfasst ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie ein Apo-2, das aus der Natur stammt. Daher kann ein Nativsequenz-Apo-2 die Aminosäuresequenz von natürlich auftretendem Apo-2 aus einem beliebigen Säugetier aufweisen. Eine solches Nativsequenz-Apo-2 kann aus der Natur isoliert werden oder mithilfe von Rekombinations- oder synthetischen Mitteln produziert werden. Der Begriff „Nativsequenz-Apo-2” umfasst insbesondere natürlich auftretende trunkierte oder sekretierte Formen von Apo-2 (z. B. eine extrazelluläre Domänensequenz), natürlich auftretende Variantenformen (z. B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich auftretende Allelvarianten von Apo-2. Eine natürlich auftretende Variantenform von Apo-2 umfasst ein Apo-2 mit einer Aminosäuresubstitution an Rest 410 in der Aminosäuresequenz, die in 1 dargestellt ist (Seq.-ID Nr. 1). In einer Ausführungsform einer solchen natürlich auftretenden Variantenform ist der Leucinrest an Position 410 durch einen Methioninrest substituiert. In 1 (Seq.-ID Nr. 1) wird der Aminosäurerest an Position 410 als „Xaa” identifiziert, um zu zeigen, dass die Aminosäure gegebenenfalls entweder Leucin oder Methionin sein kann. In 1 (Seq.-ID Nr. 2) wird das Nucleotid an Position 1367 als „W” identifiziert, um zu zeigen, dass das Nucleotid entweder Adenin (A) oder Thymin (T) oder Uracil (U) sein kann. In einer Ausführungsform der Offenbarung ist das Nativsequenz-Apo-2 ein reifes oder Volllängen-Nativsequenz-Apo-2, welche die Aminosäuren 1 bis 411 von 1 (Seq.-ID Nr. 1) umfasst. Gegebenfalls wird das Apo-2 durch Expression des Polypeptids, für welches das cDNA-Insert des Vektors, als ATCC 209021 hinterlegt, kodiert, erhalten oder ist dadurch erhältlich.
Die „extrazelluläre Apo-2-Domäne” oder „Apo-2-ECD” bezeichnet eine Form von Apo-2 die im Wesentlichen frei von Transmembran- und zytoplasmatischen Domänen von Apo-2 ist. Für gewöhnlich weist Apo-2-ECD weniger als 1% solcher Transmembran- und/oder zytoplasmatischen Domänen und vorzugsweise weniger als 0,5% solcher Domänen auf. Gegebenenfalls umfasst Apo-2-ECD Aminosäurereste 54 bis 182 von 1 (Seq.-ID Nr. 1) oder die Aminosäurereste 1 bis 182 von 1 (Seq.-ID Nr. 1). Gegebenenfalls umfasst Apo-2-ECD eine oder mehrere cysteinreiche Domänen und vorzugsweise eine oder beide der cysteinreichen Domänen, die hierin identifiziert sind (siehe 2A). Für einen Fachmann ist offensichtlich, dass die hierin für das Apo-2-Polypeptid identifizierte Transmembrandomäne nach routinemäßig auf dem Fachgebiet verwendeten Kriterien identifiziert wird, um diese Form von hydrophober Domäne zu identifizieren. Die exakten Grenzen einer Transmembrandomäne können variieren, aber am wahrscheinlichsten um nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren an jedem Ende der Domäne, die hierin speziell genannt wird.
„Apo-2-Variante” steht für ein wie nachstehend definiertes biologisch aktives Apo-2 mit zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentität mit dem Apo-2 mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz, die in 1 dargestellt ist (Seq.-ID Nr. 1), für ein menschliches Volllängen-Nativsequenz-Apo-2 oder den hierin identifizierten Sequenzen für Apo-2-ECD oder Todesdomäne. Solche Apo-2-Varianten umfassen z. B. Apo-2-Polypeptide, worin ein oder mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus der Sequenz von 1 (Seq.-ID Nr. 1) oder den hierin identifizierten Sequenzen für Apo-2-ECD oder Todesdomäne hinzugefügt oder deletiert sind. Üblicherweise hat eine Apo-2-Variante zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90% Aminosäuresequenzidentität und noch bevorzugter zumindest etwa 95% Aminosäuresequenzidentität, mit der Aminosäuresequenz von 1 (Seq.-ID Nr. 1) oder den hierin identifizierten Sequenzen für Apo-2-ECD oder Todesdomäne.
Die „prozentuelle (%) Aminosäuresequenzidentität” in Bezug auf die Apo-2-Sequenzen, die hierin identifiziert sind, wird als Prozentsatz der Aminosäurereste in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Aminosäureresten in der Apo-2-Sequenz identisch sind, nach Anordnung der Sequenzen und Einführung von Lücken, wenn notwendig, um maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erreichen, und ohne Berücksichtigung irgendwelcher konservativen Substitutionen als Teil der Sequenzidentität. Eine Anordnung für Zwecke zur Bestimmung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Wege erreicht werden, die innerhalb eines Fachgebiets liegen, z. B. unter Einsatz öffentlich verfügbarer Computersoftware wie z. B. ALIGN^TM- oder Megalign-(DNASTAR-)Software. Fachleute können geeignete Parameter zur Messung von Anordnungen bestimmen, einschließlich beliebiger Algorithmen, die zur Erreichung einer maximalen Anordnung über die volle Länge der Sequenzen, die zu vergleichen sind, erforderlich sind.
Der Begriff „epitopmarkiert” bezieht sich wie hierin verwendet auf ein chimäres Polypeptid, das ein Apo-2 oder einen Apo-2-Antikörper umfasst, oder eine Domänensequenz davon, fusioniert an ein „Markierungspolypeptid”. Das Markierungspolypeptid hat genug Reste, um ein Epitop bereitzustellen, gegen welches ein Antikörper hergestellt werden kann, es ist jedoch kurz genug, sodass es die Aktivität des Apo-2 oder Apo-2-Antikörpers nicht beeinflusst. Das Markierungspolypeptid ist vorzugsweise auch ziemlich einzigartig, sodass der Antikörper mit anderen Epitopen im Wesentlichen nicht kreuzreagiert. Geeignete Markierungspolypeptide haben im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurereste und für gewöhnlich zwischen etwa 8 bis etwa 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen etwa 10 bis etwa 20 Resten).
„Isoliert”, wenn es zur Beschreibung der verschiedenen hierin offenbarten Polypeptide verwendet wird, beschreibt ein Protein, das identifiziert und getrennt worden ist und/oder aus einer Komponente seiner natürlichen Umwelt gewonnen wurde. Kontaminierende Komponenten ihrer natürlichen Umwelt sind Materialien, die typischerweise in diagnostischen oder therapeutischen Anwendungen des Proteins eingreifen würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nicht-proteinartige gelöste Stoffe enthalten. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid (1) auf einen Grad, der ausreichend ist, um zumindest 15 Reste von N-terminaler oder interner Aminosäuresequenz zu erhalten, durch Verwendung eines Zentrifugenröhrchensequenzierers gereinigt oder (2) durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Einsatz von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfärbung zu Homogenität gereinigt. Isoliertes Polypeptid umfasst Polypeptid in situ innerhalb rekombinanter Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umwelt des Apo-2 nicht gegenwärtig ist. Üblicherweise wird das isolierte Protein jedoch mithilfe von zumindest einem Reinigungsschritt hergestellt.
Ein „isoliertes” Apo-2-Nucleinsäuremolekül ist ein Nucleinsäuremolekül, das identifiziert und von zumindest einem kontaminierenden Nucleinsäuremolekül, mit welchem es üblicherweise in der natürlichen Quelle der Apo-2-Nucleinsäure assoziiert ist, getrennt ist. Ein isoliertes Apo-2-Nucleinsäuremolekül ist in einer anderen Form oder Umgebung, in welcher es in der Natur zu finden ist. Isolierte Apo-2-Nucleinsäuremoleküle werden daher vom Apo-2-Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen besteht, unterschieden. Jedoch umfasst ein isoliertes Apo-2-Nucleinsäuremolekül Apo-2-Nucleinsäuremoleküle, die in Zellen enthalten sind, die Apo-2 gewöhnlich exprimieren, wo sich z. B. das Nucleinsäuremolekül an einem Chromosomenort befindet, der anders als jener natürlicher Zellen ist.
Die Bezeichnung „Kontrollsequenzen” bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer operabel gebundenen Kodiersequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryoten geeignet sind, umfassen zum Beispiel einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, und eine Ribosombindungsstelle. Eukaryotische Zellen sind dafür bekannt, Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer zu verwenden.
Nucleinsäure ist „operabel gebunden”, wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn es als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn sie so angeordnet ist, dass sie Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet „operabel gebunden”, dass die gebundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und, im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend sind und in Lesephase stehen. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Bindung erfolgt durch Ligation an passenden Restriktionsstellen. Sind solche Stellen nicht vorhanden, so werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder -linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
Der Begriff „Antikörper” wird im weitesten Sinn verwendet und deckt speziell einzelne monoklonale Anti-Apo-2-Antikörper (einschließlich Agonisten-, Antagonisten- und blockierende oder neutralisierende Antikörper) und Anti-Apo-2-Antikörperzusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität ab.
Der Begriff „monoklonaler Antikörper”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Antikörper aus einer Population im Wesentlichen homogener Antikörper, d. h. die einzelnen Antikörper der Population sind identisch bis auf mögliche natürlich vorkommende Mutationen, die in geringfügigem Ausmaß vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind hochspezifisch, da sie gegen eine einzige Antigenstelle gerichtet sind. Weiters ist im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, die typischerweise verschiedene Antikörper umfassen, die gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtet sind, jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzige Determinante auf dem Antigen gerichtet.
Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen hybride und rekombinante Antikörper, die durch Spleißen einer variablen (einschließlich hypervariablen) Domäne eines Ani-Apo-2-Ligandenantikörpers mit einer konstanten Domäne oder einer Leichtkette mit einer Schwerkette oder einer Kette einer Spezies mit einer Kette einer anderen Spezies produziert werden können, oder Fusionen mit heterologen Proteinen unabhängig von den Ursprungs-Spezies oder Immunglobulinklassen- oder -Unterklassenbezeichnung sowie Antikörperfragmente (z. B. Fab, F(ab')₂ und Fv), solange sie die gewünschte Aktivität zeigen. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4.816.567 und Mage et al., in: Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker Inc., New York, 79–97 (1987).
Der Modifikator „monoklonal” beschreibt daher die Art des Antikörpers, der aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten wird, und sollte nicht so ausgelegt werden, als wäre eine Antikörperproduktion durch ein bestimmtes Verfahren erforderlich. Die monoklonalen Antikörper etwa, die gemäß vorliegender Erfindung zu verwenden sind, können beispielsweise durch das zuerst von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschriebene Hybridomverfahren oder durch DNA-Rekombinationsverfahren (siehe z. B. US-Patent Nr. 4.816.567 ) hergestellt werden. Die „monoklonalen Antikörper” können etwa auch aus Phagen-Bibliotheken isoliert werden, die unter Anwendung der in McCafferty et al., Nature 348, 552–554 (1990), beschriebenen Verfahren hergestellt wurden.
„Einkettige Fv-” oder „scFv”-Antikorperfragmente umfassen die V_H- und V_L-Domänen des Antikörpers, worin diese Domänen in einer einzelnen Polypeptidkette vorliegen. Im Allgemeinen umfasst das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptidlinker zwischen den V_H- und V_L-Domänen, was dem scFv ermöglicht, die gewünschte Struktur zur Antigenbindung zu bilden. Für einen Bericht über scFv siehe z. B. Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Band 113, Rosenburg und Moore, Hrsg., Springer-Verlag, New York, 269–315 (1994). Die scFv-Antikörperfragmente der vorliegenden Erfindungen umfassen unter anderem 16E2-, 20E6-, und 24C4-Antikörper, die nachstehend im Detail beschrieben sind. Innerhalb des Schutzumfangs der scFv-Antikörper der Erfindung liegen scFv-Antikörper, die VH und VL-Domänen umfassen, die eine oder mehrere der CDR-Regionen umfassen, die für die 16E2-, 20E6- und 24C4-Antikörper identifiziert worden sind.
„Humanisierte” Formen nichtmenschlicher (z. B. muriner) Antikörper sind spezifische chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (z. B. Fv, Fab, Fab', F(ab)₂ oder andere antigenbindende Untersequenzen von Antikörpern), die von nichtmenschlichem Immunglobulin abstammende Minimalsequenzen enthalten. Humanisierte Antikörper sind größtenteils menschliche Immunglobuline (Empfängerantikörper), in denen Reste einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Empfängers durch Reste einer CDR einer nichtmenschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie z. B. Mäusen, Ratten oder Kaninchen, ersetzt sind, welche die gewünschte Spezifität, Affinität und Kapazität aufweisen. In einigen Fallen sind Reste der Fv-Gerüstregion (Fv-FR-Reste) des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nichtmenschliche Reste ersetzt. Weiters können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die weder im Empfängerantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind. Diese Modifikationen werden vorgenommen, um die Antikörperleistung weiter zu verbessern und zu optimieren. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen die Gesamtheit zumindest einer und typischerweise zweier variabler Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen jenen eines nichtmenschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alte FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Consensus-Sequenz sind. Im Optimalfall umfasst der humanisierte Antikörper zumindest einen Teil einer konstanten Immunglobulin-Region (Fc), typischerweise eines menschlichen Immunglobulins.
„Biologisch aktiv” und „gewünschte biologische Aktivität” bedeutet für die hierin beschriebenen Zwecke, (1) die Fähigkeit zu haben, in zumindest einem Typ von Säugetierzellen in vivo oder ex vivo Apoptose zu modulieren (entweder auf agonistische oder stimulierende Art oder in einer antagonistischen oder blockierenden Art); (2) die Fähigkeit aufzuweisen, den Apo-2-Liganden zu binden, oder (3) die Fähigkeit zu haben, die Apo-2-Ligandensignalgebung und Apo-2-Ligandenaktivität zu modulieren.
Die Begriffe „Apoptose” und „apoptotische Aktivität” werden in weiterem Sinne verwendet und beziehen sich auf die planmäßige oder kontrollierte Form des Zelltods in Säugetieren, die typischerweise von einer oder mehreren charakteristischen Zellveränderungen, unter anderem Kondensation von Zytoplasma, Verlust von Plasmamembran-Mikrovilli, Segmentierung des Nucleus, Abbau chromosomaler DNA oder Verlust von Michtochondrienfunktionen, begleitet wird. Diese Aktivität kann zum Beispiel durch Zell-Lebensfähigkeitstests, FACS-Analyse oder DNA-Elektrophorese, alles fachbekannte Tests, bestimmt und gemessen werden.
Die Begriffe „behandeln”, „Behandlung” oder „Therapie” beziehen sich wie hierin verwendet sowohl auf therapeutische Behandlung als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen.
Die Begriffe „Krebs” und „krebsartig” bezeichnen oder beschreiben den physiologischen Zustand in Säugetieren, der typischerweise durch unreguliertes Zellwachstum gekennzeichnet ist. Beispiele für Krebsarten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Karzinome, Lymphome, Leukämie, Blastome, Sarkome und Leukämien. Speziellere Beispiele für solche Krebsarten sind Plattenepithelkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom, Blastom, Magen-Darmkrebs, Nierenkrebs, Bauspeicheldrüsenkrebs, Glioblastom, Neuroblastom, Zervixkarzinom, Ovarialkrebs, Leberkrebs, Magenkrebs, Blasenkrebs, Hepatom, Brustkrebs, Dickdarmkarzinom, kolorektales Karzinom, Endometriumkarzinom, Speicheldrüsenkarzinom, Nierenkrebs, Leberkrebs, Prostatakrebs, Vulvakarzinom, Schilddrüsenkarzinom, Leberkarzinom und verschiedene Krebsarten im Hals- und Kopfbereich.
Der Begriff „Säugetier” bezieht sich wie hierin verwendet auf ein beliebiges Säugetier, unter anderem Menschen, Kühe, Pferde, Hunde und Katzen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich beim Säugetier um einen Menschen.
II. Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Apo-2-Antikörper bereit. Insbesondere haben die Anmelder verschiedene menschliche Apo-2-Polypeptide identifiziert und isoliert. Die Eigenschaften und Charakteristika einiger dieser Apo-2-Polypeptide und Anti-Apo-2-Antikörper sind in den Beispielen nachstehend im Detail beschrieben. Basierend auf den Eigenschaften und Charakteristika der Apo-2-Polypeptide, die hierin offenbart sind, geht der Anmelder derzeit davon aus, dass Apo-2 ein Mitglied der TNFR-Familie ist.
Es folgt eine Beschreibung, wie Apo-2 sowie chimäre Apo-2-Moleküle und Anti-Apo-2-Antikörper hergestellt werden können.
A. Herstellung von Apo-2
Die nachstehende Beschreibung betrifft primär die Produktion von Apo-2 durch Kultivieren von Zellen, die mit einem Vektor transformiert oder transfiziert wurden, der Apo-2-Nucleinsäure enthält. Es ist natürlich beabsichtigt, dass alternative fachbekannte Verfahren verwendet werden können, um Apo-2 herzustellen.
1. Isolierung von DNA, die für Apo-2 kodiert
Die DNA, die für Apo-2 kodiert, kann aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus Gewebe hergestellt wird, das die Apo-2-mRNA besitzen und in detektierbarem Ausmaß exprimieren soll. Dementsprechend kann menschliche Apo-2-DNA in geeigneter Weise aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus menschlichen Geweben hergestellt wird, wie z. B. die Bakteriophagenbibliotheken von menschlicher Pankreas- und Nieren-cDNA, die in Beispiel 1 beschrieben ist. Das für Apo-2 kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder durch Oligonucleotidsynthese erhalten werden.
Bibliotheken können mit Sonden gescreent werden (wie z. B. Antikörpern zum Apo-2 oder Oligonucleotiden von zumindest etwa 20–80 Basen), die entworfen sind, um das Gen von Interesse oder das Protein, für welches es kodiert, zu identifizieren. Screening der cDNA oder genomischen Bibliothek mit der ausgewählten Sonde kann unter Einsatz von Standardverfahren durchgeführt werden, wie z. B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), beschrieben. Ein alternatives Mittel zur Isolierung des Gens, das für Apo-2 kodiert, ist es, PCR-Verfahren zu verwenden [Sambrook et al., siehe oben, Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995)].
Ein bevorzugtes Screeningverfahren verwendet ausgewählte Oligonucleotidsequenzen, um cDNA-Bibliotheken aus verschiedenen menschlichen Geweben zu screenen. Das nachstehende Beispiel 1 beschreibt Verfahren zum Screening einer cDNA-Bibliothek. Die Oligonucleotidsequenzen, die als Sonden ausgewählt werden, sollen ausreichend lang sein und ausreichend eindeutig sein, sodass falsche Positive minimiert werden. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise so markiert, dass es nach Hybridisierung an DNA in der zu screenenden Bibiothek detektiert werden kann. Verfahren zur Markierung sind fachbekannt und umfassen die Verwendung von Radiomarkierungen wie ³²P-markiertes ATP, Biotinylierung oder Enzymmarkierung. Hybridisierungsbedingungen, einschließlich moderater Stringenz und hoher Stringenz, sind in Sambrook et al., siehe oben, bereitgestellt.
Nucleinsäure mit der gesamten für das Protein kodierenden Sequenz kann durch Screening der ausgewählten cDNA oder genomischen Bibliotheken unter Einsatz von hierin zum ersten Mal offenbarten abgeleiteter Aminosäuresequenz und wenn nötig unter Einsatz herkömmlicher Primerextensionsverfahren, wie in Sambrook et al., siehe oben, beschrieben, erhalten werden, um Vorläufer und Verarbeitungszwischenprodukte von mRNA zu detektieren, die nicht in cDNA revers transkribiert wurden.
Apo-2-Varianten können durch Einführung von geeigneten Nucleotidveränderungen in die Apo-2-DNA oder durch Synthese des gewünschten Apo-2-Polypeptids hergestellt werden. Für Fachleute versteht es sich, dass Aminosäureänderungen Posttranslationsprozesse von Apo-2 ändern können, wie z. B. die Veränderung der Zahl oder Position von Glykosylierungsstellen oder Veränderung der Membranverankerungseigenschaften.
Variationen im Volllängen-Nativsequenz-Apo-2 oder in verschiedenen Domänen des hierin beschriebenen Apo-2 können zum Beispiel unter Einsatz beliebiger Verfahren und Richtlinien für konservative und nicht-konservative Mutationen, die z. B. in US-Patent Nr. 5.364.934 dargelegt sind, durchgeführt werden. Variationen können eine Substitution, Deletion oder Insertion eines oder mehrere Codons sein, die für Apo-2 kodieren, was in einer Veränderung der Aminosäuresequenz von Apo-2 im Vergleich zur Nativsequenz-Apo-2 resultiert. Gegebenenfalls erfolgt die Substitution von zumindest einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure in einer oder mehreren der Domänen des Apo-2-Moleküls. Die Variationen können unter Einsatz fachbekannter Verfahren, wie z. B. oligonucleotidvermittelter (ortsgerichteter) Mutagenese, Alaninscanning, und PCR-Mutagenese, erfolgen. Ortsgerichtete Mutagenese [Carter et al., Nucl. Acids. Res. 13, 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res 10, 6487 (1987)], Kassettenmutagenese [Wells et al., Gene 34, 315 (1985)], Restriktionsselektionsmutagenese [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)] oder andere bekannte Verfahren können auf der klonierten DNA durchgeführt werden, um die Apo-2-Varianten-DNA zu produzieren.
Eine Scanning-Aminosäureanalyse kann ebenfalls verwendet werden, um eine oder mehrere Aminosäuren entlang einer zusammenhängen Sequenz zu identifizieren, die in die Wechselwirkung mit einem bestimmten Liganden oder Rezeptor involviert sind. Unter den bevorzugten Scanning-Aminosäuren sind relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Solche Aminosäuren umfassen Alanin, Glycin, Serin und Cystein. Alanin ist die bevorzugte Scanningaminosäure in dieser Gruppe, weil sie die Seitenkette über den Beta-Kohlenstoff hinaus eliminiert und weniger wahrscheinlich die Hauptkettenkonformation der Variante ändert. Alanin ist ebenfalls bevorzugt, weil es die häufigste Aminosäure ist. Weiters ist es häufig sowohl an verborgenen als auch exponierten Positionen zu finden [Creighton, The Proteins, W. H. Freeman & Co. N. Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150, 1 (1976)]. Wenn eine Alaninsubstitution keine adäquaten Mengen der Variante erbringt, kann eine isoterische Aminosäure verwendet werden.
Sobald ausgewählte Apo-2-Varianten produziert werden, können sie z. B. mit Apo-2L kontaktiert werden und die Wechselwirkung, wenn eine vorliegt, bestimmt werden. Die Wechselwirkung zwischen der Apo-2-Variante und Apo-2L kann durch einen In-vitro-Test gemessen werden, wie z. B. in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Während eine beliebige Zahl an analytischen Messungen verwendet werden kann, um Aktivitäten und Eigenschaften zwischen Nativsequenz-Apo-2 und einer Apo-2-Variante zu vergleichen, ist eine geeignete Zahl für die Bindung die Dissoziationskonstante K_d des Komplexes, der zwischen der Apo-2-Variante und Apo-2L gebildet wird, im Vergleich zu K_d für Nativsequenz-Apo-2. Im Allgemeinen zeigt ein ≥ 3facher Anstieg oder Rückgang in K_d pro substituiertem Rest, dass der/die substituierte(n) Rest(e) aktiv in der Wechselwirkung des Nativesequenz-Apo-2 mit dem Apo-2L ist/sind.
Gegebenenfalls umfassen repräsentative Stellen in der Apo-2-Sequenz, die für Mutagenese geeignet sind, Stellen innerhalb der extrazellulären Domäne und insbesondere innerhalb einer oder beider cysteinreicher Domänen. Solche Variationen können unter Einsatz der oben beschriebenen Verfahren erreicht werden.
2. Insertion von Nucleinsäure in einen replizierbaren Vektor
Die Nucleinsäure (z. B. cDNA oder genomische DNA), die für Apo-2 kodiert, kann zum weiteren Klonieren (Amplifikation der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor eingeführt werden. Mehrere Vektoren sind öffentlich erhältlich. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen unter anderem eine oder mehrere der Folgenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz, wobei jede nachstehend beschrieben ist.
(i) Signalsequenzkomponente
Das Apo-2 kann rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid, das vorzugsweise eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids ist, produziert werden. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein oder Teil der Apo-2-DNA, die in den Vektor insertiert wird. Die ausgewählte heterologe Signalsequenz ist vorzugsweise eine, die von der Wirtszelle erkannt und prozessiert (d. h. durch eine Signalpeptidase gespalten) wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz sein, die beispielsweise aus der Gruppe der alkalischen Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder der wärmestabilen Enterotoxin-II-Leader ausgewählt ist Zur Hefesekretion kann die Signalsequenz beispielsweise der Hefe-Invertase-Leader, der α-Faktor-Leader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader, Letzterer ist in US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben) oder saure-Phosphatase-Leader, der C.-albicans-Glucoamylase-Leader ( EP 362.179 , veröfentlicht am 4. April 1990) oder das in der WO 90/13646 , veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal sein. Bei Säugetierzellexpression ist die native Apo-2-Präsequenz, die normalerweise die Insertion von Apo-2 in die Zellmembran menschlicher Zellen in vivo lenkt, zufrieden stellend, obwohl andere Säugetiersignalsequenzen dazu verwendet werden können, die Sekretion des Proteins zu steuern, wie z. B. Signalsequenzen aus sezernierten Polypeptiden derselben oder verwandter Spezies sowie virale sekretorische Leader, z. B. das Herpes-simplex-Glypoprotein-D-Signal.
Die DNA für diese Vorläuferregion wird vorzugsweise im Leseraster an DNA, die für den Apo-2-Liganden kodiert, ligiert.
(ii) Replikationsstartpunktkomponente
Sowohl die Expressions- als auch die Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, sich in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist diese Sequenz bei Klonierungsvektoren eine, die es dem Vektor ermöglicht, sich unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA zu replizieren, und umfasst Replikationsstartpunkte oder sich autonom replizierende Sequenzen. Solche Sequenzen sind für eine Reihe von Bakterien, Hefe und Viren gut bekannt. Der Replikationsstartpunkt aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten gramnegativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind zum Klonieren von Vektoren in Säugetierzellen nützlich. Im Allgemeinen ist die Replikationsstartpunktkomponente für Säugetierexpressionsvektoren nicht notwendig (der SV40-Ursprung kann typischerweise verwendet werden, da er den frühen Promotor enthält).
Die meisten Expressionsvektoren sind „Shuttle-Vektoren”, d. h. sie sind zu Replikation in zumindest einer Klasse von Organismen in der Lage, können aber in einen anderen Organismus zur Expression transfiziert werden. Zum Beispiel wird ein Vektor in E. coli kloniert, und dann wird derselbe Vektor in Hefe oder Säugetierzellen zur Expression transfiziert, obwohl er nicht in der Lage ist, sich unabhängig vom Wirtszellchromosom zu replizieren.
DNA kann auch durch Insertion in das Wirtsgenom amplifiziert werden. Dies wird einfach unter Einsatz von Bacillus-Spezies als Wirte erreicht, zum Beispiel durch Einführung des Vektors einer DNA-Sequenz, die zu einer Sequenz komplementär ist, die in genomischer Bacillus-DNA zu finden ist. Transfektion von Bacillus mit diesem Vektor resultiert in homologer Rekombination mit dem Genom und Insertion von Apo-2-DNA. Jedoch ist die Gewinnung von genomischer DNA, die für Apo-2 kodiert, komplexer als jene eines exogen replizierten Vektors, da Restriktionsenzymverdau erforderlich ist, um die Apo-2-DNA zu exzidieren.
(iii) Selektionsgenkomponente
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten typischerweise ein Selektionsgen, das auch selektierbarer Marker genannt wird. Dieses Gen kodiert für ein Protein, des zum Überleben oder für das Wachstum von transformierten Wirtszellen notwendig ist, die in einem selektiven Kulturmedium gezüchtet werden. Wirtszellen, die nicht mit dem Vektor transformiert wurden, der das Selektionsgen enthielt, überleben im Kulturmedium nicht. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Defizienzen komplementieren oder (c) entscheidende Nährstoffe liefern, die in komplexen Medien nicht vorhanden sind, z. B. das Gen, das für D-Alanin-Racemase für Bacilli kodiert.
Ein Beispiel für ein Selektionsschema verwendet ein Arzneimittel, um das Wachstum einer Wirtszelle zum Stillstand zu bringen. Jene Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert wurden, produzieren ein Protein, das Arzneimittelresistenz verleiht, und überleben daher das Selektionsregime. In Beispielen für solch dominante Selektionen werden die Arzneimittel Neomycin [Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1, 327 (1982)], Mycophenolsäure [Mulligan et al., Science 209, 1422 (1980)] oder Hygromycin [Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5, 410–413 (1985)] verwendet. Die drei obigen Beispiele verwenden bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle, um Resistenz gegenüber geeignetem Arzneimittel G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) oder Hygromycin zu verleihen.
Ein weiteres Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind jene, welche die Identifizierung von Zellen ermöglichen, die fähig sind, die Apo-2-Nucleinsäure aufzunehmen, wie z. B. DHFR oder Thymidin-Kinase. Die Säugetierzelltransformanten werden unter Selektionsdruck gesetzt, sodass nur die Transformanten durch Aufnahme des Markers einzigartig angepasst werden, um zu überleben. Selektionsdruck wird durch Kultivieren der Transformanten unter Bedingungen auferlegt, unter welchen die Konzentration des Selektionsmittels im Medium in der Folge geändert wird, wodurch Amplifikation sowohl des Selektionsgens als auch der DNA verursacht wird, die für Apo-2 kodiert. Amplifikation ist der Prozess, durch welchen Gene, an denen zur Produktion eines Proteins, das für das Wachstum entscheidend ist, großer Bedarf herrscht, in Tandem innerhalb der Chromosome nachfolgender Generationen von rekombinanten Zellen oft wiederholt sind. Erhöhte Mengen von Apo-2 werden aus der amplifizierten DNA synthetisiert. Andere Beispiele für amplifizierbare Gene umfassen Metallothionein-I und -II, Adenosin-Desaminase und Ornithin-Decarboxylase.
Zellen, die mit dem DHFR-Selektionsgen transformiert wurden, werden beispielsweise zuerst durch Züchten aller Transformanten in einem Kulturmedium, das Methotrexat (Mtx), einen kompetitiven Antagonisten von DHFR, enthält, identifiziert. Eine geeignete Wirtszelle ist im Fall der Anwendung von Wildtyp-DHFR die Chinahamster-Eierstockzelllinie (CHO-Linie), die bezüglich DHFR-Aktivität defizient ist, die wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wurde. Die transformierten Zellen werden erhöhten Spiegeln von Methotrexat ausgesetzt. Dies führt zur Synthese von Mehrfachkopien des DHFR-Gens und gleichzeitig zu mehreren Kopien anderer DNA, welche die Expressionsvektoren umfasst, wie z. B. DNA, die für Apo-2 kodiert. Dieses Amplifikationsverfahren kann mit einem anderen geeigneten Wirt verwendet werden, z. B. ATCC Nr. CCL61 CHO-K1, trotz der Gegenwart von endogenem DHFR, wenn zum Beispiel ein mutantes DHFR-Gen, das höchst resistent gegenüber Mix ist, verwendet wird ( EP 117.060 ).
Alternativ dazu können Wirtszellen (vor allem Wildtyp-Wirte, die endogene DHFR enthalten), die mit DNA-Sequenzen transformiert oder co-transformiert sind, welche für Apo-2, Wildtyp-DHFR-Protein und einen anderen selektierbaren Marker, wie z. B. Aminoglykosid-3'-Phosphotransferase (APH), kodieren, durch Zellwachstum in einem Medium mit einem Selektionsmittel für den selektierbaren Marker, wie z. B. ein Aminoglykosid-Antibiotikum, etwa Kanamycin, Neomycin oder G418, selektiert werden. Siehe US-Patent Nr. 4.965.199 .
Ein für die Verwendung in Hefe geeignetes Selektionsgen ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 enthalten ist [Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)]. Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen Hefe-Mutantenstamm bereit, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, z. B. ATCC-Nr. 44076 oder PEP4-1 [Jones, Genetics 85, 12 (1977)]. Die Gegenwart der trp1-Läsion im Hefe-Wirtszellengenom bietet dann eine effiziente Umgebung, um Transformation anhand von Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan zu detektieren. In ähnlicher Weise werden Leu2-defiziente Hefestämme (ATCC 20.622 oder 38.626) durch bekannte Plasmide, die das Leu2-Gen in sich tragen, komplementiert.
Zusätzlich dazu können von dem ringförmigen 1,6-μm-Plasmid pKD1 stammende Vektoren für die Transformation von Kluyveromyces-Hefen verwendet werden [Bianchi et al., Curr. Genet. 12, 185 (1987)]. Jüngst wurde für K. Lactis von einem Expressionssystem für die Produktion von rekombinantem Kalbs-Chymosin in großem Maßstab berichtet [Van den Berg, Bio/Technology 8, 135 (1990)]. Stabile Multikopie-Expressionsvektoren für die Sekretion von reifem, rekombinantem Humanserumalbumin durch industrielle Stämme von Kluyveromyces wurden ebenso offenbart [Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991)].
(iv) Promotorkomponente
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten normalerweise einen Promotor, der vom Wirtsorganismus erkannt wird und mit der Apo-2-Ligandennucleinsäuresequenz operabel verbunden ist. Promotoren sind nicht-translatierte Sequenzen, die sich stromauf (5') des Startcodons eines strukturellen Gens befinden (im Allgemeinen innerhalb von etwa 100 bis 1000 bp) und die Transkription und Translation einer besonderen Nucleinsäuresequenz kontrollieren, wie z. B. die Apo-2-Nucleinsäuresequenz, an welche sie operabel gebunden sind. Solche Promotoren fallen typischerweise in zwei Klassen, induzierbar und konstitutiv Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die unter deren Kontrolle als Antwort auf eine gewisse Änderung der Kulturbedingungen, z. B. die Gegenwart oder das Fehlen eines Nährstoffs oder einer Temperaturveränderung, erhöhte Ausmaße von Transkription aus DNA beginnen. Derzeit ist eine große Zahl von Promotoren bekannt, die durch eine Vielzahl von potenziellen Wirtszellen erkannt wird. Diese Promotoren sind operabel an Apo-2 gebunden, das für DNA kodiert, indem der Promotor aus der Quellen-DNA durch Restriktionsenzymverdau und Insertion der isolierten Promotorsequenz in den Vektor entfernt wird. Sowohl die native Apo-2-Promotorsequenz als auch viele heterologe Promotoren können dazu verwendet werden, Amplifikation und/oder Expression der Apo-2-DNA zu steuern.
Für die Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignete Promotoren umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme [Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)], alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776] und Hybridpromotoren wie z. B. den tac-Promotor [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)]. Es sind jedoch auch andere bekannte bakterielle Promotoren geeignet. Ihre Nucleotidsequenzen sind veröffentlicht worden, wodurch einem Fachmann ermöglicht wird, sie operabel an DNA zu ligieren, die für Apo-2 kodiert [Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)], unter Einsatz von Linker oder Adaptoren, um beliebige erforderliche Restriktionsstellen bereitzustellen. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgamo-(SD-)Sequenz, die mit der für Apo-2 kodierenden DNA operabel verbunden ist.
Promotorsequenzen für Eukaryoten sind bekannt. Nahezu alle eukaryotischen Gene haben eine AT-reiche Region, die etwa 25 bis 30 Basen stromauf von jener Stelle liegt, an der die Transkription initiiert wird. Eine weitere Sequenz, die 70 bis 80 Basen stromauf vom Start der Transkription vieler Genen zu finden ist, ist eine CXCAAT-Region, in der X ein beliebiges Nucleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Hinzufügung des Poly-A-Schwanzes an das 3'-Ende der kodierenden Sequenz sein kann. Alle diese Sequenzen sind in geeigneter Weise in eukarotische Expressionsvektoren insertiert.
Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-Kinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)] oder andere glykolytische Enzyme [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)], wie z. B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil einer durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription sind, sind die Promotorregionen für Alkohol-Dehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit Stickstoffmetabolismus assoziierte abbauende Enzyme, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortliche Enzyme. Für die Verwendung bei der Hefeexpression geeignete Vektoren und Promotoren werden ausführlicher in EP-A-73.657 beschrieben. Hefe-Enhancer werden auch vorteilhaft zusammen mit Hefepromotoren verwendet.
Die Apo-2-Transkription von Vektoren in Säugetierwirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren, die aus den Genomen von Viren, wie etwa dem Polyomavirus, dem Geflügelpockenvirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), dem Adenovirus (z. B. Adenovirus 2), dem Rinderpapillomvirus, dem Vogelsarkomvirus, dem Zytomegalievirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und am bevorzugtesten Simian-Virus-40 (SV40), aus heterologen Säugetierpromotoren, z. B. dem Actin-Promotor oder einem Immunglobulinpromotor, aus Hitzeschockpromotoren und aus dem Promotor, der normalerweise mit der Apo-2-Sequenz assoziiert ist, erhalten werden, kontrolliert, vorausgesetzt, solche Promotoren sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel.
Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus sind leicht als SV40-Restriktionsfragment, das auch den viralen SV40-Replikationsstartpunkt enthält, zu erhalten [Fiers et al., Nature 273, 113 (1978); Mulligan und Berg, Science 209, 1422–1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398–7402 (1981)]. Der unmittelbare frühe Promotor des menschlichen Zytomegalie-Virus ist leicht als HindIII-E-Restriktionsfragment zu erhalten [Greenaway et el., Gene 18, 355–360 (1982)]. Ein System zur Expression von DNA in Säugetierwirten unter Verwendung des Rinderpapillomvirus als Vektor wird im US-Patent Nr. 4.419.446 offenbart. Eine Modifikation dieses Systems ist in US-Patent Nr. 4.601.978 beschrieben [siehe auch Gray et al., Nature 295, 503–508 (1982), bezüglich der Expression von cDNA, die für Immuninterferon kodiert, in Affenzellen; Reyes et al., Nature 297, 598–601 (1982), bezüglich der Expression menschlicher β-Interferon-cDNA in Mauszellen unter der Kontrolle eines Thymidinkinase-Promotors aus dem Herpes-Simplex-Virus; Canaani und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5166–5170 (1982), bezüglich der Expression des menschlichen Interferon-Gens in gezüchteten Maus- und Kaninchenzellen; und Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777–6781 (1982), bezüglich der Expression von bakteriellen CAT-Sequenzen in CV-1-Affennierenzellen, Huhnembryofibroblasten, Chinahamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen und Maus-NIH-3T3-Zellen unter Einsatz der langen terminalen Wiederholung des Rous-Sarkoma-Virus als Promotor].
(v) Enhancerelementkomponente
Die Transkription einer für Apo-2 kodierenden DNA durch höhere Eukaryoten wird oft durch Einfügen einer Enhancer-Sequenz in den Vektor gesteigert. Enhancer sind ciswirkende Elemente von DNA, für gewöhnlich von 10 bis 300 bp lang, die auf einen Promotor einwirken, um seine Transkription zu erhöhen. Enhancer sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig, sie sind 5' [Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)] und 3' [Lusky et al., Mol. Cell Bio. 3, 1108 (1983)] zur Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns [Banerji et al., Cell 33, 729 (1983)] sowie innerhalb der kodierenden Sequenz selbst [Osborne et al., Mol. Cell Bio. 4, 1293 (1984)] gefunden worden. Viele Enhancer-Sequenzen sind nun aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100–270), den frühen Promotor-Enhancer von Zytomegalie-Virus, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch Yaniv, Nature 297, 17–18 (1982), bezüglich Enhancerelemente zur Aktivierung eukaryotischer Promotoren. Der Enhancer kann in 5'- oder 3'-Position zu der für Apo-2 kodierenden Sequenz in den Vektor gespleißt werden, liegt jedoch vorzugsweise in 5'-Position vom Promotor.
(vi) Transkriptionsterminationskomponente
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, Human- oder kernhaltige Zellen von anderen mehrzelligen Organismen) verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die für die Termination der Transkription und für die Stabilisierung der mRNA notwendig sind. Solche Sequenzen sind üblicherweise aus der untranslatierten 5'- und manchmal untranslatierten 3'-Region eukaryotischer oder viraler DNA oder cDNA zu erhalten. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Teil der für Apo-2 kodierenden mRNA transkribiert werden.
(vii) Herstellung und Analyse von Vektoren
Die Herstellung geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der oben angeführten Komponenten enthalten, verwendet Standardligationsverfahren. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zugeschnitten und in der gewünschten Form religiert, um die erforderlichen Plasmide zu erzeugen.
Zur Analyse zum Nachweis korrekter Sequenzen in den hergestellten Plasmiden können die Ligationsgemische zur Transformation von E.-coli-K12, Stamm 294 (ATCC 31.446), verwendet werden, und erfolgreiche Transformanten können durch Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz ausgewählt werden, wo diese geeignet sind. Es werden Plasmide aus den Transformanten hergestellt, durch Restriktionsendonucleaseverdau analysiert und/oder durch das Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder durch das Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
(viii) Vektoren zur vorübergehenden Expression
Es können Expressionsvektoren, welche die vorübergehende Expression von DNA, die für Apo-2 kodiert, in Säugetierzellen bereitstellen, verwendet werden. Im Allgemeinen umfasst die vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der in der Lage ist, sich wirksam in einer Wirtszelle zu replizieren, sodass die Wirtszelle viele Kopien des Expressionsvektors akkumuliert und wiederum hohe Spiegel des gewünschten Polypeptids synthetisiert, für welches der Expressionsvektor kodiert [Sambrook et al., siehe oben]. Vorübergehende Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen die geeignete positive Identifikation von Polypeptiden, für welche klonierte DNAs kodieren, sowie das rasche Screening solcher Polypeptide für gewünschte biologische oder physiologische Eigenschaften. Daher sind Systeme zur vorübergehenden Expression besonders für Zwecke der Identifizierung von Apo-2-Varianten nützlich.
(ix) Geeignete exemplarische Wirbeltierzellvektoren
Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Anpassung an die Synthese von Apo-2-Ligand in rekombinanter Wirbeltierzellkultur geeignet sind, sind in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981), Mantel et al., Nature 281, 40–46 (1979), EP 117.060 und EP 117.058 beschrieben.
3. Selektion und Transformation von Wirtszellen
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in den hierin beschriebenen Vektoren sind Prokaryoten-, Hefe- oder höhere Eukaryotenzellen, wie oben beschrieben. Für diesen Zweck geeignete Prokaryoten umfassen unter anderem Eubakterien, wie z. B. gramnegative oder grampositive Organismen, z. B. Enterobacteriaceae, wie etwa Escherichia, z. B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z. B. Salmonella typhimurium, Serratia, z. B. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli, wie z. B. B. subtilis und B. licheniformis (z. B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z. B. P. Aeruginosa, und Streptomyces. Vorzugsweise soll die Wirtszelle minimale Mengen von proteolytischen Enzymen sekretieren.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben, wie z. B. Fadenpilze oder Hefe, geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für für Apo-2-Liganden kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae, oder gemeine Bäckerhefe, ist unter den niederen eukaryotischen Wirtsmikroorganismen am häufigsten verwendet. Eine Reihe anderer Genera, Spezies und Stämme sind jedoch leicht erhältlich und hierin nützlich.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von glykosyliertem Apo-2 werden von mehrzelligen Organismen abgeleitet. Solche Wirtszellen sind zu komplexer Prozessierung und Glykosylierungsaktivität in der Lage. Im Prinzip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur bearbeitbar, ob aus einer Vertebraten- oder Invertebraten-Kultur. Beispiele für Invertebraten-Zellen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche baculovirale Stämme und Varianten und entsprechende permissive Insektenwirtszellen von Wirten, wie z. B. Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Moskito), Aedes albopictus (Moskito), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori, sind identifiziert worden [siehe z. B. Luckow et al., Bio/Technology 6, 47–55 (1988); Miller et al., in: Genetic Engineering, Setlow et al., Hrsg., Plenum Publishing, Band 8, 277–279 (1986); und Maeda et al., Nature 315, 592–594 (1985)]. Eine Reihe viraler Stämme für die Transfektion sind öffentlich erhältlich, z. B. die L-1-Variante von Autographe californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV.
Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Kukuruz (Mais), Erdapfel (Kartoffel), Sojabohne, Petunie, Paradeiser (Tomate) und Tabak können ebenfalls als Wirte verwendet werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen durch Inkubation mit bestimmten Stämmen des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens transfiziert. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die DNA, die für Apo-2 kodiert, auf den Pflanzenzellwirt transferiert, sodass er transfiziert wird und unter geeigneten Bedingungen die für Apo-2 kodierende DNA exprimiert. Zusätzlich dazu sind Regulations- und Signalsequenzen, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, verfügbar, wie z. B. der Nopalinsynthasepromotor und Polyadenylierungssignalsequenzen [Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982)]. Zusätzlich dazu sind DNA-Segmente, die aus der Stromauf-Region des T-DNA-780-Gens isoliert werden, in der Lage, die Transkriptionsspiegel von pflanzenexprimierenden Genen in rekombinante DNA enthaltendem Pflanzengewebe zu aktivieren oder zu erhöhen [ EP 321.196 , veröffentlicht am 21. Juni 1989].
Das Vermehren von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) ist ebenfalls fachbekannt [siehe z. B. Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, Hrsg. (1973)]. Beispiele für nützliche Säugetierwirtszelllinien sind die Affennieren-CV1-Linie, die mit SV40 transformiert wurde (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche Embryonierenlinie (293- oder 293-Zellen, die auf Wachstum in Suspensionskultur subkloniert wurden, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamsternierenzellen (BHK; ATCC CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO; Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Mäuse-Sertoli-Zellen (TM 4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); AGMK-Zellen (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Cervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2; HB 8065); Mäuse-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383, 44–68 (1982)); MRC-5-Zellen und FS4-Zellen.
Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren für die Apo-2-Produktion transformiert und vorzugsweise transformiert und in herkömmlichen Nährmedien, die wie notwendig modifiziert wurden, gezüchtet, um Promotoren zu induzieren, Transformanten zu selektieren oder die Gene, die für die gewünschten Sequenzen kodieren, zu amplifizieren.
Transfektion bezeichnet die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, ob beliebige kodierende Sequenzen tatsächlich exprimiert werden oder nicht. Zahlreiche Verfahren zur Transfektion sind Fachleuten bekannt, zum Beispiel CaPO₄ und Elektroporation. Erfolgreiche Transfektion wird im Allgemeinen erkannt, wenn ein Anzeichen für ein Wirken dieses Vektors innerhalb der Wirtszelle auftritt.
Transformation steht für die Einführung von DNA in einen Organismus, sodass die DNA replizierbar ist, entweder als extrachromosomales Element oder durch einen Chromosomenintegranten. Abhängig von der verwendeten Wirtszelle wird Transformation unter Einsatz von Standardverfahren, die für solche Zellen geeignet sind, durchgeführt. Die Calciumbehandlung, die Calciumchlorid verwendet, wie in Sambrook et al., siehe oben, beschrieben ist, oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation von bestimmten Pflanzenzellen wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und WO 89/05859 , veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben verwendet. Zusätzlich dazu können Pflanzen unter Einsatz von Ultraschallbehandlung wie in WO 91/00358 , veröffentlicht am 10. Jänner 1991, beschrieben transfiziert werden.
Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände ist das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham und van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), bevorzugt. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellwirtssystemtransformationen sind in US-Patent Nr. 4.399216 beschrieben worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979), durchgeführt. Jedoch können auch andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, wie z. B. durch nukleare Mikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen, oder Polykationen, z. B. Polybren, Polyornithin, verwendet werden. Für verschiedene Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
4. Züchten der Wirtszellen
Prokaryotische Zellen, die verwendet werden, um Apo-2 zu produzieren, können in geeignetem Medium, wie in Sambrook et al., siehe oben, beschrieben, gezüchtet werden.
Die Säugetierwirtszellen, die verwendet werden, um Apo-2 zu produzieren, können in einer Reihe von Medien gezüchtet werden. Beispiele für im Handel erhältliche Medien umfassen Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium („MEM”, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbeccos Modifiziertes Eagle-Medium („DMEM”, Sigma). Jedes dieser Medien kann je nach Notwendigkeit mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z. B. Insulin, Transferrin oder Epidermiswachstumsfaktor), Salzen (wie z. B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z. B. HEPES), Nucleosiden (wie z. B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z. B. Gentamycin^TM), Spurenelementen (als anorganische Verbindungen definiert, die normalerweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich enthalten sind) und Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt sein. Alle weiteren notwendigen Zusätze können ebenfalls in geeigneten Konzentrationen, die dem Fachmann bekannt sind, miteinbezogen werden. Die Kulturbedingungen, wie z. B. Temperatur, pH und dergleichen, sind jene, die bereits zuvor bei der auf Expression selektierten Zelle verwendet wurden, und sind dem durchschnittlichen Fachmann bekannt.
Im Allgemeinen sind Prinzipien, Protokolle und praktische Verfahren zur Maximierung der Produktivität von Säugetierzellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, Hrsg., IRL Press (1991), zu finden.
Die Wirtszellen, auf die in dieser Offenbarung Bezug genommen wird, umfassen Zellen in Kultur sowie Zellen, die sich innerhalb eines Wirtstiers befinden.
5. Detektion von Genamplifikation/-expression
Genamplifikation und/oder -expression kann direkt in einer Probe gemessen werden, zum Beispiel durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)], Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung, wobei eine geeignet markierte Sonde verwendet wird, basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen. Es können verschiedene Markierungen verwendet werden, am häufigsten Radioisotope und insbesondere ³²P. Jedoch können auch andere Verfahren verwendet werden, wie z. B. die Verwendung von biotinmodifizierten Nucleotiden zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als Stelle zur Bindung an Avidin oder Antikörper, die dann mit einer großen Vielzahl von Markierungen, wie z. B. Radionucleotiden, Fluoreszenzmitteln oder Enzymen, markiert werden können. Alternativ dazu können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplexe erkennen können, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe. Die Antikörper können hingegen markiert werden und der Test dort ausgeführt werden, wo der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, sodass nach Bildung des Duplexes an der Oberfläche die Gegenwart von einem Antikörper, der an den Duplex gebunden ist, detektiert werden kann.
Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren getestet werden, wie z. B. immunhistochemische Färbung von Zellen oder Gewebeschnitten und Test von Zellkultur oder Körperfluiden, um direkt die Expression des Genprodukts zu quantifizieren. Mit immunhistochemischen Färbeverfahren wird eine Zellprobe hergestellt, typischerweise durch Dehydrierung und Fixierung, gefolgt von Reaktion mit markierten Antikörpern, die für das gebundene Genprodukt spezifisch sind, wo die Markierungen für gewöhnlich visuell detektierbar sind, wie z. B. enzymatische Markierungen, Fluoreszenzmarkierungen oder Lumineszenzmarkierungen.
Antikörper, die zur immunhistochemischen Färbung und/oder zum Testen von Probefluiden nützlich sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und in einem Säugetier hergestellt werden. Üblicherweise können die Antikörper gegen ein Apo-2-Polypeptid mit nativer Sequenz oder gegen ein synthetisches Peptid basierend auf den hierin offenbarten DNA-Sequenzen oder gegen eine exogene Sequenz hergestellt werden, die an die Apo-2-DNA fusioniert ist und für ein spezifisches Antikörperepitop kodiert.
6. Reinigung von Apo-2-Polypeptid
Formen von Apo-2 können aus Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Wenn Apo-2 membrangebunden ist, kann er aus der Membran unter Einsatz einer geeigneten Detergenslösung (z. B. Triton-X-100) freigesetzt werden, oder seine extrazelluläre Domäne kann durch Enzymspaltung freigesetzt werden.
Wenn Apo-2 in einer rekombinanten Zelle produziert wird, die nicht menschlichen Ursprungs ist, ist Apo-2 frei von Proteinen oder Polypeptiden menschlichen Ursprungs. Jedoch ist es für gewöhnlich notwendig, Apo-2 von rekombinanten Zellproteinen oder -Polypeptiden zu reinigen, um Formulierungen zu erhalten, die im Wesentlichen mit Apo-2 homogen sind. Als erster Schritt kann das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert werden, um teilchenförmige Zelltrümmer zu entfernen. Apo-2 wird danach mit den folgenden Verfahren, die Beispiele für ein geeignetes Reinigungsverfahren sind, von kontaminierenden Löslichen Proteinen und Polypeptiden gereinigt: durch Fraktionierung auf einer Ionenaustauschsäule, Ethanolpräzipitation, Umkehrphasen-HPLC, Chromatographie auf Silica oder auf einem Kationenaustauschharz wie z. B. DEAE, Chromatofokussierung, SDS-PAGE, Ammoniumsulfatpräzipitation, Gelfiltration unter Einsatz von z. B. Sephadex G-75 und Protein-A-Sepharose-Säulen zur Entfernung von Kontaminanten wie z. B. IgG.
Apo-2-Varianten, in welchen Reste deletiert, insertiert oder substituiert wurden, werden auf dieselbe Art und Weise gewonnen wie Nativsequenz Apo-2, wobei Veränderungen in Eigenschaften berücksichtigt werden, die durch die Variation verursacht werden. Zum Beispiel kann die Herstellung einer Apo-2-Fusion mit einem anderen Protein oder Polypeptid, z. B. einem bakteriellen oder viralen Antigen, einer Immunglobulinsequenz oder Rezeptorsequenz, die Reinigung erleichtern; eine Immunoaffinitätssäule, die den Antikörper zur Sequenz enthält, kann zur Adsorption des Fusionspolypeptids verwendet werden. Andere Arten von Affinitätsmatrizen können ebenfalls verwendet werden.
Ein Proteaseinhibitor wie z. B. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) kann auch nützlich sein, um proteolytischen Abbau während Reinigung zu hemmen, und es können Antibiotika enthalten sein, um das Wachstum von zufälligen Kontaminanten zu vermeiden. Ein Fachmann wird feststellen, dass die Reinigungsverfahren, die für Nativsequenz-Apo-2 geeignet sind, Modifikation erfordern können, um Veränderungen im Wesen eines Apo-2-Liganden oder seiner Varianten nach Expression in rekombinanter Zellkultur Rechnung zu tragen.
7. Kovalente Modifikationen von Apo-2-Polypeptiden
Kovalente Modifikationen von Apo-2 sind möglich. Eine Form von kovalenter Modifikation von Apo-2 wird in das Molekül eingeführt, und zwar durch Umsetzung von Aminosäureresten, auf die abgezielt wird, des Apo-2-Liganden mit einem organischen derivatisierenden Mittel, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten des Apo-2-Liganden zu reagieren.
Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist zur Vernetzung von Apo-2 mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-Apo-2-Antikörpern und vice versa nützlich. Derivatisierung mit einem oder mehreren bifunktionalen Mitteln dient auch zur Vernetzung von Apo-2-Molekülen, um Apo-2-Dimere zu erzeugen. Solche Dimere können Bindungsavidität erhöhen und die Halbwertszeit des Moleküls in vivo ausdehnen. Häufig verwendete Vernetzungsmittel umfassen z. B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, zum Beispiel Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie z. B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), und bifunktionelle Maleinimide, wie z. B. Bis-N-maleinimido-1,8-oktan. Derivatisierende Mittel, z. B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat, ergeben photoaktivierbare Zwischenprodukte, die in der Lage sind, Vernetzungen in Gegenwart von Licht zu verursachen. Alternativ dazu werden reaktive wasserunlösliche Matrizen, wie z. B. cyanogenbromidaktivierte Kohlenhydrate, und die reaktiven Substrate, die in US-Patent Nr. 3.969.287 ; 3.691.016 ; 4.195.128 ; 4.247.642 ; 4.229.537 und 4.330.440 beschrieben sind, zur Proteinimmobilisierung verwendet.
Andere Modifikationen umfassen Desamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 79–86 (1983)], Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung einer beliebigen C-terminalen Carboxylgruppe. Die modifizierten Formen der Reste fallen in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
Eine andere Form von kovalenter Modifikation des Apo-2-Polypeptids umfasst die Änderung des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. Die „Änderung des nativen Glykosylierungsmusters” soll für die hierin angeführten Zwecke für Deletion einer oder mehrerer Kohlenhydratgruppierungen, die in Nativsequenz-Apo-2 zu finden sind, und/oder Addition einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen stehen, die in Nativsequenz-Apo-2 nicht vorhanden sind.
Glykosylierung von Polypeptiden ist typischerweise entweder N-gebunden oder O-gebunden. N-gebunden betrifft die Anheftung der Kohlenhydratgruppierung an die Seitenkette eines Asparaginrests. Die Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin, wo X eine Aminosäure mit Ausnahme von Prolin ist, sind die Erkennungssequenzen für enzymatische Anheftung der Kohlenhydratgruppierung an die Asparaginseitenkette. Daher schafft die Gegenwart von einer dieser Tripeptidsequenzen in einem Polypeptid eine potenzielle Glykosylierungsstelle. O-gebundene Glykosylierung bezeichnet die Anheftung eines der Zucker N-Acetylgalactosamin, Galactose oder Xylose an eine Hydroxylaminosäure, am häufigsten Serin oder Threonin, obwohl 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxylysin auch verwendet werden kann.
Die Hinzufügung von Glykosylierungsstellen an das Apo-2-Polypeptid kann durch Änderung der Aminosäuresequenz erreicht werden, sodass sie eine oder mehrere der oben beschriebenen Tripeptidsequenzen enthält (für N-gebundene Glykosylierungsstellen). Die Änderung kann auch durch die Addition von, oder Substitution durch, einem/einen oder mehrere/n Serin- oder Threoninresten zu Nativsequenz-Apo-2 (für O-gebundene Glykosylierungsstellen) hergestellt werden. Die Apo-2-Aminosäuresequenz kann gegebenenfalls durch Veränderungen auf DNA-Ebene geändert werden, insbesondere durch Mutation der DNA, die für ein Apo-2-Polypeptid kodiert, an vorausgewählten Basen, sodass Codons erzeugt werden, die in die gewünschten Aminosäuren translatieren. Die DNA-Mutation(en) kann/können unter Einsatz der oben und in US-Patent Nr. 5.364.934 , siehe oben, beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Ein anderes Mittel zur Steigerung der Zahl von Kohlenhydratgruppierungen auf dem Apo-2-Polypeptid erfolgt durch chemische oder enzymatische Bindung von Glykosiden an das Polypeptid. Abhängig vom verwendeten Bindungsmodus kann/können Zucker an (a) ein Arginin und Histidin, (b) freie Carboxylgruppen, (c) freie Sulfhydrylgruppen, wie z. B. jene von Cystein, (d) freie Hydroxylgruppen, wie z. B. jene von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatische Reste, wie z. B. jene von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan, oder (f) die Amidgruppe von Glutamin angeheftet werden. Diese Verfahren sind in WO 87/05330 , veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259–306 (1981), beschrieben.
Die Entfernung von Kohlenhydratgruppierungen, die auf dem Apo-2-Polypeptid gegenwärtig sind, kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutationsubstitution von Codons, die für Aminosäurereste kodieren, die als Targets für Glykosylierung dienen, erreicht werden. Zum Beispiel kann die chemische Deglykosylierung durch Exposition des Polypeptids gegenüber der Verbindung Trifluormethasulfonsäure oder einer äquivalenten Verbindung zur Spaltung der meisten oder aller Zucker mit Ausnahme des verbindenden Zuckers (N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin) führen, während das Polypeptid intakt bleibt. Chemische Deglykosylierung ist in Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen auf Polypeptiden kann durch Verwendung einer Vielzahl von Endo- und Exoglycosidasen wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987) beschrieben, erreicht werden.
Die Glykosylierung an potenziellen Glykosylierungsstellen kann durch die Verwendung der Verbindung Tunicamycin wie von Duskin et al., J. Biol. Chem. 257, 3105 (1982), beschrieben, vermieden werden. Tunicamycin blockiert die Bildung von Protein-N-Glycosidbindungen.
Eine andere Form von kovalenter Modifikation von Apo-2 umfasst die Bindung des Apo-2-Polypeptids an eines einer Reihe von nicht-proteinartigen Polymeren, z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylenen, in der z. B. in den US-Patenten Nr. 4.640.835 ; 4.496.689 ; 4.301.144 ; 4.670.417 ; 4.791.192 oder 4.179.337 dargestellten Art und Weise.
8. Apo-2-Chimären
Es können chimäre Moleküle hergestellt werden, die Apo-2 an ein anderes heterologes Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz fusioniert umfassen.
Das chimäre Molekül kann eine Fusion von Apo-2 mit einem Markierungspolypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an welches ein Anti-Markierungsantikörper selektiv binden kann, umfassen. Die Epitopmarkierung wird im Allgemeinen an den Amino- oder Carboxyterminus von Apo-2 gebunden. Die Gegenwart solcher epitopmarkierter Formen von Apo-2 kann unter Einsatz eines Antikörpers gegen das Markierungspolypeptid detektiert werden. Die Bereitstellung der Epitopmarkierung ermöglicht dem Apo-2 auch, einfach durch Affinitätsreinigung unter Einsatz eines Antimarkierungsantikörpers oder einer anderen Form von Affinitätsmatrix, der/die sich an die Epitopmarkierung bindet, leicht gereinigt zu werden.
Verschiedene Markierungspolypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind fachbekannt. Beispiele umfassen das flu-HA-Markierungspolypeptid und seinen Antikörper 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)], die c-myc-Markierung und die Antikörper 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 und 9E10 dagegen [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610–3616 (1985)] und die Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D-(gD-)Markierung und ihren Antikörper [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547–553 (1990)]. Andere Markierungspolypeptide umfassen das Flag-Peptid [Hopp et al., BioTechnology 6, 1204–1210 (1988)], das KT3-Epitoppeptid [Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)], ein α-Tubulinepitoppeptid [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)] und die T7-Gen-10-Proteinpeptidmarkierung [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990)]. Sobald das Markierungspolypeptid ausgewählt worden ist, kann ein Antikörper dazu unter Einsatz der hierin offenbarten Verfahren erzeugt werden.
Im Allgemeinen kann ein epitopmarkiertes Apo-2 gemäß den oben beschriebenen Verfahren hergestellt und produziert werden. Epitopmarkiertes Apo-2 ist auch in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Apo-2-Markierungspolypeptidfusionen werden vorzugsweise durch Fusion der cDNA-Sequenz, die für den Apo-2-Abschnitt in-Frame kodiert, an die Markierungspolypeptid-DNA-Sequenz und Exprimieren des resultierenden DNA-Fusionskonstrukts in geeigneten Wirtszellen hergestellt. Bei der Herstellung der Apo-2-Markierungspolypeptidchimäre der vorliegenden Erfindung fusioniert Nucleinsäure, die für Apo-2 kodiert, an ihrem 3'-Ende üblicherweise an Nucleinsäure, die für den N-Terminus des Markierungspolypeptids kodiert, es sind jedoch auch 5'-Fusionen möglich. Zum Beispiel wird eine Polyhistidinsequenz von etwa 5 bis etwa 10 Histidinresten an den N-Terminus oder C-Terminus fusioniert und als Reinigungshenkel in Affinitätschromatographie verwendet.
Epitopmarkiertes Apo-2 kann durch Affinitätschromatographie unter Einsatz des Anti-Markierungsantikörpers gereinigt werden. Die Matrix, an welche der Affinitätsantikörper angeheftet ist, umfasst z. B. Agarose, Controlled Pore Glass oder Poly(styroldivinyl)benzol. Das epitopmarkierte Apo-2 kann dann aus der Affinitätssäule unter Einsatz fachbekannter Verfahren eluiert werden.
Die chimären Moleküle können ein Apo-2-Polypeptid, fusioniert an eine Immunglobulinsequenz, umfassen. Das chimäre Molekül kann auch eine spezielle Domänensequenz von Apo-2 umfassen, wie z. B. eine extrazelluläre Domänensequenz von Apo-2, fusioniert an eine Immunglobulinsequenz. Dies umfasst Chimären in monomeren, homo- oder heteromultimeren und insbesondere homo- oder heterodimeren oder -tetrameren Formen, optional können die Chimären in dimeren Formen oder homodimeren Schwerkettenformen vorliegen. Im Allgemeinen haben diese assemblierten Immunglobuline bekannte Einheitsstrukturen, wie durch die folgenden Diagramme veranschaulicht wird.
Eine Vierketten-Grundstruktureinheit ist die Form, in welcher IgG, IgD und IgE vorkommen. Eine Vierketteneinheit wird in Immunglobulinen mit höherem Molekulargewicht wiederholt; IgM besteht im Allgemeinen als Pentamer von Vierketten-Grundeinheiten, die durch Disulfidbindungen zusammengehalten werden. IgA-Globulin und gelegentlich IgG-Globulin können ebenfalls in einer multimeren Form in Serum vorliegen. Im Fall von Multimeren kann jede Vierketteneinheit gleich oder anders sein.
Die folgenden Diagramme zeigen einige exemplarische Monomer-, Homodimer- und Heterodimer- und Homo- und Heteromultimerstrukturen. Diese Diagramme sind rein illustrativ, und die Ketten der Multimere sollen auf dieselbe Art und Weise wie native Immunglobuline disulfidgebunden sein. Monomer:
Homodimer:
Heterodimer:
Homotetramer:
Heterotetramer:
und
In den vorangegangen Diagrammen steht „A” für eine Apo-2-Sequenz oder eine Apo-2-Sequenz fusioniert an eine heterologe Sequenz; K ist ein weiteres Mittel, welches dasselbe wie A oder ein anderes, ein Abschnitt eines Immunglobulinüberfamilienmitglieds, wie z. B. eine variable Region oder eine variable regionähnliche Domäne, einschließlich eine native oder chimäre variable Immunglobulinregton, ein Toxin, wie z. B. Pseudomonas-Exotoxin oder Ricin oder eine Sequenz, die funktional ein anderes Protein bindet, wie z. B. andere Cytokine (d. h. IL-4, Interferon-γ) oder Zelloberflächenmoleküle (d. h. NGF, CD40, CD40, Fas-Antigen, T2-Proteine von Shope- und Myxompockenviren), oder ein therapeutisches Polypeptidmittel sein kann, das wiederum normalerweise mit einer konstanten Domäne assoziiert ist; Y ist ein Linker oder eine andere Rezeptorsequenz; und V_L, V_H, C_L und C_H repräsentieren variable oder konstante Leicht- oder Schwerkettendomänen eines Immunglobulins. Speziell sind Strukturen enthalten, die zumindest eine CRD einer Apo-2-Sequenz als „A” und ein anderes Zelloberflächenprotein mit einem sich wiederholenden Muster von CRDs (wie z. B. TNFR) als „X” umfassen.
Es versteht sich, dass die obigen Diagramme rein exemplarisch für die möglichen Strukturen der Chimären der vorliegenden Erfindung sind und nicht alle Möglichkeiten umfassen. Zum Beispiel bestehen wünschenswerterweise mehrere verschiedene „A”s, „X”s oder „Y”s in beliebigen dieser Konstrukte. Es kann auch die konstanten Schwer- und Leichtkettendomänen aus denselben oder anderen Immunglobulinen entspringen. Alle möglichen Permutationen der veranschaulichten und ähnlichen Strukturen liegen im Schutzumfang der Verbindung hierin.
Im Allgemeinen können die chimären Moleküle auf ähnliche Art und Weise hergestellt werden wie chimäre Antikörper, in welchen eine variable Domäne aus einem Antikörper einer Spezies für die variable Domäne einer anderen Spezies subsituiert wird. Siehe z. B. EP 0 125 023 ; EP 173.494 ; Munro, Nature 312, 597 (13. Dezember 1984); Neuberger et al., Nature 312, 604–608 (13. Dezember 1984); Sharon et al., Nature 309, 364–367 (24. Mai 1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984); Morrison et al., Science 229, 1202–1207 (1985), Boulianne et al., Nature 312, 643–646 (13. Dezember 1984); Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989); Traunecker et al., Nature 339, 68–70 (1989).
Alternativ dazu können die chimären Moleküle wie folgt hergestellt werden. Die DNA, welche eine Region umfast, die für die gewünschte Sequenz kodiert, wie z. B. eine Apo-2- und/oder TNFR-Sequenz, wird durch ein Restriktionsenzym an oder nahe dem 3'-Ende der DNA, die für die immunglobulinähnliche Domäne(n) kodiert, und bei einem Punkt an oder nahe der DNA, die für das N-terminale Ende von Apo-2 oder TNFR-Polypeptid kodiert (wo die Verwendung eines anderes Leaders beabsichtigt ist), oder an oder nahe der N-terminalen Kodierregion für TNFR (wo das native Signal verwendet wird) gespalten. Dieses DNA-Fragment wird dann einfach nahe der DNA, die für eine konstante Immunglobulin-Leicht- oder -Schwerkettenregion kodiert, insertiert und, wenn notwendig, das resultierende Konstrukt durch Deletionsmutagenese zugeschnitten. Vorzugsweise ist das Ig ein menschliches Immunglobulin, wenn das chimäre Molekül für In-vivo-Therapie für Menschen gedacht ist. DNA, die für konstante Immunglobulin-Leicht- oder -Schwerkettenregionen kodiert, ist bekannt oder einfach aus cDNA-Bibliotheken erhältlich oder wird synthetisiert. Siehe zum Beispiel Adams et al., Biochemistry 19, 2711–2719 (1980); Gough et al., Biochemistry 19, 2702–2710 (1980); Dolby et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 6027–6031 (1980); Rice et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 79, 7862–7865 (1982); Falkner et al., Nature 298, 286–288 (1982), und Morrison et al., Ann. Rev. Immunol 2, 239–256 (1984).
Weitere Details darüber, wie solche Fusionen herzustellen sind, sind in Publikationen zu finden, welche die Herstellung von Immunadhäsinen betreffen. Immunadhäsine im Allgemeinen und speziell CD4-Ig-Fusionsmoleküle sind in WO 89/02922 , veröffentlicht am 6. April 1989, offenbart. Moleküle, welche den extrazellulären Abschnitt von CD4, den Rezeptor für menschliches Immundefizienzvirus (HIV), gebunden an konstante IgG-Schwerkettenregion, umfassen, sind fachbekannt, und es ist festgestellt worden, dass sie eine deutlich längere Halbwertszeit und geringere Clearance als der lösliche extrazelluläre Abschnitt von CD4 aufweisen [Capon et al., siehe oben; Byrn et al., Nature 344, 667 (1990)]. Die Herstellung spezifischer chimärer TNFR-IgG-Moleküle ist auch in Ashkenazi et al., Proc. Natl Acad. Sci. 88, 10535–10539 (1991); Lesslauer et al., J. Cell. Biochem. Supplement 15F, 115 (P432) (1991), und Peppel und Beutler, J. Cell. Biochem., Supplement 15F, 118 (P439) (1991), beschrieben.
B. Therapeutische und nicht-therapeutische Anwendungen für Apo-2
Ein wie in der vorliegenden Beschreibung offenbartes Apo-2 kann therapeutisch verwendet werden, um Apoptose in Säugetierzellen zu induzieren. Diese Therapie kann z. B. unter Einsatz von In-vivo- oder Ex-vivo-Gentherapie erreicht werden und umfasst die Verwendung der hierin offenbarten Todesdomänensequenz. Die chimären Apo-2-Moleküle (einschließlich chimäre Moleküle, die eine extrazelluläre Domänensequenz von Apo-2 enthalten), die Immunglobulinsequenzen enthalten, können ebenfalls therapeutisch verwendet werden, um Apoptose oder NF-κB-Induktion durch Apa-2L oder durch einen anderen Liganden, an den sich Apo-2 bindet, zu hemmen.
Nucleinsäuresequenzen, die für Apo-2 kodieren, können als Diagnostikum für gewebsspezifische Typisierung verwendet werden. Zum Beispiel können Verfahren wie In-situ-Hybridisierung, Northern- und Southern-Blotting und PCR-Analyse dazu verwendet werden, zu bestimmen, ob DNA und/oder RNA, die für Apa-2 kodiert, im/in den Zelltyp(en), die evaluiert werden, gegenwärtig sind. Apo-2-Nucleinsäure ist auch zur Herstellung von Apo-2 durch die hierin beschriebenen Rekombinationsverfahren nützlich.
Das isolierte Apo-2 kann in quantitativen diagnostischen Tests als Kontrolle verwendet werden, gegen welche Proben mit unbekannten Mengen von Apo-2 hergestellt werden können. Apo-2-Formulierungen sind auch in der Erzeugung von Antikörpern, als Standards in Tests auf Apo-2 (z. B. durch Markierung von Apo-2 zur Verwendung als Standard in einem Radioimmuntest, Radiorezeptortest, oder enzymgebundenen Immuntest), in Affinitätsreinigungsverfahren und in Rezeptorbindungstests kompetitiver Art nützlich, wenn sie z. B. mit Radioiod, Enzymen oder Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden.
Modifizierte Formen von Apo-2, wie z. B. die chimären Apo-2-IgG-Moleküle (Immunadhäsine), die oben beschrieben sind, können als Immunogene zur Produktion von Ante-Apo-2-Antikörpern verwendet werden.
Nucleinsäuren, die für Apo-2 kodieren, oder ihre modifizierten Formen können auch zur Erzeugung von entweder transgenen Tieren oder „Knock-out”-Tieren verwendet werden, die wiederum zur Entwicklung und zum Screening von therapeutisch nützlichen Reagenzien nützlich sind. Ein transgenes Tier (z. B. eine Maus oder Ratte) ist ein Tier, das über Zellen verfügt, die ein Transgen enthalten, wobei das Transgen in das Tier oder einen Vorfahren des Tiers in einem pränatalenn z. B. embryonale, Stadium eingeführt wurde. Ein Transgen ist eine DNA, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus welcher sich ein transgenes Tier entwickelt. cDNA, die für Apo-2 kodiert, oder eine geeignete Sequenz davon (wie z. B. Apo-2-IgG) kann zum Klonieren von genomischer DNA, die für Apo-2 kodiert, nach etablierten Verfahren verwendet werden, und genomischen Sequenzen, die zur Erzeugung von transgenen Tieren verwendet werden, die Zellen enthalten, die DNA exprimieren, die für Apo-2 kodiert. Verfahren zur Erzeugung transgener Tiere, insbesondere von Tieren, wie z. B. Mäusen oder Ratten, sind fachüblich geworden und sind z. B. in US-Patent Nr. 4.736.866 und 4.870.009 beschrieben. Typischerweise wird auf bestimmte Zellen auf Apo-2-Transgeninkorporation mit gewebsspezifischen Enhancern abgezielt. Transgene Tiere, die eine Kopie eines Transgens umfassen, das für Apo-2 kodiert, das in die Keimbahn des Tiers in einem embryonalen Stadium eingeführt wurde, kann zur Untersuchung der Wirkung von erhöhter Expression von DNA, die für Apo-2 kodiert, verwendet werden. Solche Tiere können als Versuchstiere für Reagenzien verwendet werden, von denen angenommen wird, dass sie Schutz vor z. B. pathologischen Leiden verleihen, die mit übermäßiger Apoptose verbunden sind. Transgene Tiere, die eine lösliche Form von Apo-2, wie z. B. eine Apo-2-ECD, oder eine Immunglobulinchimäre einer solchen Form tragen, können so beschaffen sein, um die Wirkung von chronischer Neutralisierung von Apo-2L, einem Liganden von Apo-2, zu testen.
Alternativ dazu können nicht-menschliche Homologe von Apo-2 verwendet werden, um ein Apo-2-„Knock-out”-Tier zu schaffen, das ein defektes oder geändertes Gen besitzt, das für Apo-2 kodiert, als Folge von homologer Rekombination zwischen dem endogenen Gen, das für Apo-2 kodiert, und der geänderten genomischen DNA, die für Apo-2 kodiert, die in eine Embryozelle des Tiers eingeführt wurde. Zum Beispiel kann cDNA, die für Apo-2 kodiert, gemäß etablierten Verfahren zum Klonieren von genomischer DNA, die für Apo-2 kodiert, verwendet werden. Ein Abschnitt der genomischen DNA, die für Apo-2 kodiert, kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt werden, wie z. B. ein Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert, der dann zur Überwachung der Integration verwendet werden kann. Typischerweise sind in dem Vektor mehrere Kilobasen von ungeänderter flankierender DNA enthalten (sowohl an den 5'- als auch 3'-Enden) [siehe z. B. Thomas und Capecchi, Cell 51, 503 (1987), für eine Beschreibung homologer Rekombinationsvektoren]. Der Vektor wird dann in eine embryonale Stammzellenlinie (z. B. durch Elektroporation) eingeführt, und es werden Zellen, in welchen sich die eingeführte DNA homolog mit der endogenen DNA rekombiniert hat, ausgewählt [siehe z. B. Li et al., Cell 69, 915 (1992)]. Die ausgewählten Zellen werden dann in eine Blastozyste eines Tiers injiziert (z. B. eine Maus oder eine Ratte), um Aggregationschimären zu binden [siehe z. B. Bradley, in: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells. A Practical Approach, E. J. Robertson, Hrsg. (IRL, Oxford, 1987), 113–152]. Ein chimärer Embryo kann dann in ein geeignetes pseudoschwangeres weibliches Pflegetier implantiert werden und der Embryo ausgetragen werden, um ein „Knock-out”-Tier zu schaffen. Nachkommen, welche die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen beherbergen, können durch Standardverfahren identifiziert werden und zur Züchtung von Tieren verwendet werden, in welchen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knockout-Tiere können zum Beispiel auf ihre Fähigkeit, sich selbst gegen bestimmte pathologische Leiden zu verteidigen, und ihre Entwicklung von pathologischen Leiden aufgrund des Fehlens des Apo-2-Polypeptids, einschließlich z. B. der Entwicklung von Tumoren, charakterisiert werden.
C. Anti-Apo-2-Antikörperherstellung
Die vorliegende Erfindung stellt weiters Anti-Apa-2-Antikörper bereit, wie in den Ansprüchen dargelegt. Antikörper gegen Apo-2 können wie folgt hergestellt werden. Exemplarische Antikörper umfassen monoklonale, humanisierte, bispezifische und Heterokonjugatantikörper.
1. Polyklonale Antikörper
Die Apo-2-Antikörper der Erfindung können polyklonale Antikörper umfassen. Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt. Polyklonale Antikörper können in Säugetieren gezüchtet werden, z. B. durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Mittels und, falls gewünscht, eines Adjuvans. Typischerweise wird das immunisierende Mittel und/oder Adjuvans durch mehrere subkutane oder intraperitoneale Injektionen in das Säugetier injiziert. Das immunisierende Mittel kann das Apo-2-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Ein Beispiel für ein geeignetes immunisierendes Mittel ist ein Apo-2-IgG-Fusionsprotein, wie z. B. ein Apo-2-ECD-IgG-Fusionsprotein. Es können ebenfalls Zellen, die Apo-2 auf ihrer Oberfläche exprimieren, verwendet werden. Es könnte nützlich sein, das immunisierende Mittel an ein Protein, das bekannterweise in dem Säugetier, das immunisiert wird, immunogen ist, zu konjugieren. Beispiele für solche immunogenen Proteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyreoglobulin und Sojabohnen-Trypsinhemmer. Ein Aggregationsmittel, wie z. B. Alaun, kann ebenfalls verwendet werden, um die Immunantwort des Säugetiers zu verstärken. Beispiele für Adjuvanzien, die verwendet werden können, umfassen komplettes Freundsches Adjuvans und das MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid-A/synthetisches Trehalosedicorynomycolat). Das Immunisierungsprotokoll kann vom Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden. Dem Säugetier wird dann Blut abgenommen und das Serum auf Antikörper-Titer getestet. Falls gewünscht kann das Säugetier Boosts erhalten, bis der Antikörper-Titer steigt oder einen konstanten Wert erreicht.
2. Monoklonale Antikörper
Die Apo-2-Antikörper der Erfindung können alternativ dazu auch monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter Anwendung von Hybridomverfahren, wie z. B. von Kohler & Milstein, siehe oben, beschrieben, hergestellt werden. In einem Hybridomverfahren wird typischerweise eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirtstier mit einem immunisierenden Mittel immunisiert (wie oben beschrieben), um Lymphozyten zu erzeugen, die Antikörper produzieren, die das immunisierende Mittel spezifisch binden, oder fähig sind, diese zu produzieren. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
Das immunisierende Mittel umfasst typischerweise das Apo-2-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon. Ein Beispiel für ein geeignetes Mittel ist ein Apo-2-IgG-Fusionsprotein oder chimäres Molekül. Ein besonderes Beispiel für ein Apo-2-ECD-IgG-Immunogen ist in Beispiel 9 nachstehend beschrieben. Zellen, die Apo-2 an deren Oberfläche exprimieren, können ebenfalls verwendet werden. Im Allgemeinen werden entweder periphere Blutlymphozyten („PBLs”) verwendet, falls Zellen menschlichen Ursprungs gewünscht sind, oder Milzzellen oder Lymphknotenzellen, falls nichtmenschliche Säugetierquellen gewünscht sind. Die Lymphozyten werden dann mit einer sich unbegrenzt vermehrenden Zelllinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie z. B. Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden [Goding, Monoclonal Antibodies, Principles and Practice, 59–103, Academic Press (1986)]. Sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind meist transformierte Säugetierzellen, besonders Myelomzellen von Nagetieren, Rindern oder menschlichen Ursprungs. Normalerweise werden Ratten- oder Mäusemyelomzelllinien verwendet. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der nichtfusionierten immortalisierten Zellen hemmt, gezüchtet werden. Wenn etwa den transformierten Ursprungszellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin („HAT-Medium”), Substanzen, die das Wachstum der HGPRT-defizienten Zellen verhindern.
Bevorzugte sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind jene, die effizient fusionieren, stabile Expression von Antikörpern durch die ausgewählten antikörperproduzierenden Zellen in hohem Ausmaß unterstützen und auf ein Medium, wie z. B. HAT-Medium, empfindlich reagieren. Noch bevorzugtere, sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind murine Myelomlinien, die beispielsweise vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, und von der American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, erhalten werden können. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzellinien wurden ebenfalls für die Produktion von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben [Kotbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51–63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987)].
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen gezüchtet werden, kann dann auf die Anwesenheit monoklonaler Antikörper, die gegen den Apo-2 gerichtet sind, getestet werden. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität monoklonaler Antikörper, die von den Hybridomzellen produziert werden, durch Immunpräzipitation oder durch einen In-vitro-Bindungs-Test wie z. B. einen Radioimmuntest (RIA) oder eine enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) bestimmt. Solche Verfahren und Tests sind nach dem Stand der Technik bekannt. Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann, z. B., durch die Scatchard-Analyse von Munson & Rodbard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nachdem die gewünschten Hybridomzellen identifiziert wurden, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels Standardverfahren vermehrt werden [Goding, s. o.]. Für diesen Zweck geeignete Kulturmedien umfassen, z. B., Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium oder RPMI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in vivo als Ascites in einem Säugetier gezüchtet werden.
Die von den Subklonen sezernierten monoklonalen Antikörper können aus dem Kulturmedium oder dem Ascites-Fluid durch herkömmliche Immunglobulin-Reinigungsverfahren, wie z. B. Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, isoliert oder gereinigt werden.
Die monoklonalen Antikörper können auch durch DNA-Rekombinationsverfahren, wie z. B. jene, die im US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben sind, hergestellt werden. Die für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodierende DNA kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren leicht isoliert und sequenziert werden (z. B. mittels Oligonucleotidsonden, die fähig sind, spezifisch an Gene zu binden, die für die schweren und leichten Ketten von murinen Antikörpern kodieren). Die Hybridomzellen dienen als bevorzugte Quelle solcher DNA. Einmal isoliert, kann die DNA in Expressionsvektoren platziert werden, die dann in Wirtszellen, wie z. B. Affen-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstockzellen (CHO-Zellen) oder Myelomzellen, die sonst keinerlei Immunglobulinprotein produzieren, transfiziert werden, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erzielen. Die DNA kann etwa auch durch Substituieren der für menschliche konstante Schwer- und Leichtkettendomänen kodierenden Sequenz anstelle der homologen murinen Sequenzen modifiziert werden [ US-Patent Nr. 4.816.567 ; Morrison et al., s. o.] oder durch kovalentes Binden der ganzen oder eines Teils der kodierenden Sequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid an die Immunglobulin-Kodiersequenz. Solch ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kann durch die konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung substituiert werden oder kann durch die variablen Domänen einer Antigenbindungsstelle eines Antikörpers der Erfindung substituiert werden, um einen chimären, bivalenten Antikörper zu erzeugen.
Wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben sind monoklonale Anti-Apo-2-Antikörper hergestellt worden. Einer dieser Antikörper, 3F11.39.7, ist bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer HB-12456 hinterlegt worden. In einer Ausführungsform haben die monoklonalen Antikörper der Erfindung dieselben biologischen Eigenschaften wie die monoklonalen Antikörper, die von (der) Hybridomzelllinie(n), die unter der Hinterlegungsnummer HB-12456 hinterlegt wurden, sezerniert wurden. Der Begriff „biologische Eigenschaften” bezeichnet die In-vitro- oder In-vivo-Aktivitäten oder -Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers, wie z. B. die Fähigkeit, das Apo-2 spezifisch zu binden oder Apo-2-Aktivierung im Wesentlichen zu blockieren, induzieren oder zu verstärken. Wie in der vorliegenden Beschreibung offenbart wird der monoklonale 3F11.39.7-Antikörper (HB-12456) so charakterisiert, dass er über agonistische Aktivität zur Induktion von Apoptose verfügt, an den Apo-2-Rezeptor bindet und wie in den Beispielen nachstehend beschrieben über Blockierungsaktivität und über eine gewisse Kreuzreaktivität zu DR4, aber nicht zu DcR1 oder DcR2 verfügt. Gegebenenfalls bindet der monoklonale Antikörper dasselbe Epitop wie der hierin offenbarte 3F11.39.7-Antikörper. Dies kann durch Durchführung verschiedener Tests wie hierin und in den Beispielen beschrieben bestimmt werden. Zum Beispiel um zu bestimmen, ob ein monoklonaler Antikörper dieselbe Spezifität wie der spezifisch offenbarte 3F11.39.7-Antikörper hat, können Aktivität in Apo-2-Blockierungs- und Apoptoseinduktionstests, wie sie in den nachstehenden Beispielen beschrieben sind, verglichen werden.
Die Antikörper der Erfindung können auch monovalente Antikörper umfassen. Verfahren zur Herstellung monovalenter Antikörper sind nach dem Stand der Technik gut bekannt. Ein Verfahren umfasst beispielsweise die rekombinante Expression von Immunglobulin-Leichtketten und modifizierten schweren Ketten. Die schwere Kette ist generell an beliebiger Stelle in der Fc-Region trunkiert, um ein Vernetzen der schweren Ketten zu verhindern. Alternativ dazu sind die relevanten Cysteinreste durch einen anderen Aminosäurerest substituiert oder deletiert, um ein Vernetzen zu verhindern.
In-vitro-Verfahren sind ebenfalls für die Herstellung monovalenter Antikörper geeignet. Ein Verdau der Antikörper, um Fragmente davon zu produzieren, im Besonderen Fab-Fragmente, kann unter Verwendung von nach dem Stand der Technik bekannten Routineverfahren erreicht werden. Der Verdau kann etwa mittels Papain durchgeführt werden. Beispiele für Papain-Verdau werden in der WO 94/29348 , veröffentlicht am 22. Dezember 1994, und im US-Patent Nr. 4.342.566 beschrieben. Ein Papainverdau von Antikörpern erzeugt typischerweise zwei identische Antigen-Bindungsfragmente, genannt Fab-Fragmente, jedes mit einer einzigen Antigenbindungsstelle, und ein Rest-Fc-Fragment. Pepsinbehandlung ergibt ein F(ab')₂-Fragment, das zwei Antigenbindungsstellen aufweist und immer noch fähig ist, Antigene zu vernetzen.
Die Fab-Fragmente, die während des Antikörperverdaus produziert werden, enthalten auch die konstanten Domänen der leichten Kette und die erste konstante Domäne (CH₁) der schweren Kette. Fab'-Fragmente unterscheiden sich von Fab-Fragmenten durch den Zusatz einiger Reste am Carboxy-Terminus der CH₁-Domäne der schweren Kette, einschließlich eines oder mehrerer Cysteine aus der Antikörper-Gelenkregion. Fab'-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab', worin der/die Cysteinrest(e) der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe trägt/tragen. F(ab')₂-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten, die Gelenk-Cysteine dazwischen tragen, erzeugt. Es sind auch andere chemische Verbindungen von Antikörperfragmenten bekannt.
3. Humanisierte Antikörper
Die Apo-2-Antikörper der Erfindung können weiters humanisierte Antikörper oder Humanantikörper umfassen. Humanisierte Formen nichtmenschlicher (z. B. muriner) Antikörper sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (z. B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere antigenbindende Untersequenzen von Antikörpern), die minimale, von nichtmenschlichem Immunglobulin stammende Sequenzen enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen Humanimmunglobuline (Empfängerantikörper), in denen Reste einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Empfängers durch Reste einer CDR einer nichtmenschlichen Spezies (Spenderantikörper) ersetzt sind, z. B. von Maus, Ratte oder Kaninchen, die die gewünschte Spezifität, Affinität und Kapazität aufweisen. In einigen Fällen werden Fv-Gerüstreste des Humanimmunglobulins durch entsprechende nichtmenschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die weder in dem Empfängerantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen die Gesamtheit zumindest einer und typischerweise zweier variabler Domänen, in denen die Gesamtheit oder nahezu die Gesamtheit der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und die Gesamtheit oder nahezu die Gesamtheit der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Consensussequenz sind. Im Optimalfall umfasst der humanisierte Antikörper auch zumindest einen Teil einer konstanten Region eines Immunglobulins (Fc), typischerweise von einem menschlichen Immunglobulin [Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992)].
Verfahren zur Humanisierung nichtmenschlicher Antikörper sind nach dem Stand der Technik gut bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die in ihn aus nichtmenschlicher Quelle eingeführt wurden. Diese nichtmenschlichen Aminosäurereste werden oftmals als „Import”-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen „Import”-Domäne entnommen werden. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter & Mitarbeitern [Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)] durch Substituieren von Nagetier-CDRs oder -CDR-Sequenzen für die entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durchgeführt werden. Demnach sind solche „humanisierte” Antikörper chimäre Antikörper ( US-Patent Nr. 4.816.567 ), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz einer nichtmenschlichen Spezies ersetzt wurde. in der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste von analogen Stellen in Nagetier-Antikörpern ersetzt sind.
Die Auswahl menschlicher variabler Domänen, sowohl leicht als auch schwer, die für die Herstellung humanisierter Antikörper verwendet werden können, ist sehr wichtig, um die Antigenität zu reduzieren. Nach der Methode der optimalen Anpassung wird die Sequenz der variablen Domäne eines Nagetierantikörpers gegen die gesamte Bibliothek der bekannten menschlichen variablen Domänensequenzen gescreent. Die menschliche Sequenz, die der des Nagetiers am ähnlichsten ist, wird dann als menschliches Gerüst (FR) für den humanisierten Antikörper angenommen [Sims et al., J. Immunol. 151, 2296 (1993); Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)]. Ein weiteres Verfahren verwendet ein besonderes Gerüst, das von der Consensus-Sequenz aller Humanantikörper einer bestimmten Untergruppe leichter oder schwerer Ketten abstammt. Dasselbe Gerüst kann für mehrere verschiedene humanisierte Antikörper verwendet werden [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151, 2623 (1993)].
Weiters ist es wichtig, dass die Antikörper unter Beibehaltung hoher Affinität für das Antigen und anderer vorteilhafter biologischer Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden humanisierte Antikörper, gemäß einem bevorzugten Verfahren, durch ein Analyseverfahren der Stammsequenzen und verschiedener konzeptioneller humanisierter Produkte unter Verwendung dreidimensionaler Modelle der Stamm- und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulinmodelle sind allgemein erhältlich und dem Fachmann bekannt. Es sind Computerprogramme verfügbar, die mögliche dreidimensionale Konformationsstrukturen ausgewählter Kandidaten-Immunglobulinsequenzen abbilden und anzeigen.
Untersuchungen dieser Abbildungen ermöglichen eine Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste bei der Funktionsfähigkeit der Kandidaten-Immunglobulinsequenz, d. h. die Analyse von Resten, die die Fähigkeit des Kandidaten-Immunglobulins, sein Antigen zu binden, beeinflussen. Auf diese Art und Weise können FR-Reste aus der Consensus- und Importsequenz so ausgewählt und kombiniert werden, dass die gewünschte Antikörpercharakteristik, wie z. B. erhöhte Affinität für das/die Target-Antigen(e), erreicht wird. Im Allgemeinen sind die CDR-Reste direkt und in wesentlichem Ausmaß an der Beeinflussung der Antigenbindung beteiligt [siehe die WO 94104679 , veröffentlicht am 3. März 1994].
Es können transgene Tiere (z. B. Mäuse) verwendet werden, die fähig sind, nach Immunisierung ein vollständiges Repertoire an Humanantikörpern ohne Produktion von endogenem Immunglobulin zu produzieren. Ein Transfer der menschlichen Keimbahn-Immunglobulin-Genanordnung in solche keimbahnmutierte Mäuse führt nach einem Antigen-Immunitätstest zur Produktion von Humanantikörpern [siehe z. B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551–255 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255–258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7, 33 (1993)].
Humantikörper können auch in Phagendisplaybibliotheken produziert werden [Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)]. Die Verfahren von Cole et al. und Boerner et al. sind ebenfalls zur Herstellung der menschlichen monoklonalen Antikörper verfügbar (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 77 (1985), und Boerner et al., J. Immunol. 147 (1), 86–95 (1991)]. Geeignete Verfahren zur Herstellung von Phagenbibliotheken wurden zusammengefasst und sind in Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433–55 (1994); Soderlind et al., Immunological Reviews 130, 109–123 (1992); Hoogenboom, Tibtech, Februar 1997, Band 15, Neri et al., Cell Biophysics 27, 47–61 (1995), beschrieben worden. Es können ebenfalls Bibliotheken von einkettigen Antikörpern durch die in WO 92/01047 , WO 92/20791 , WO 93/06213 , WO 93/11236 , WO 93/19172 , WO 95/01438 und WO 95/15388 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Antikörperbibliotheken sind im Handel erhältlich, zum Beispiel von Cambridge Antibody Technologies (CAT), Cambridge, UK. Bindungsselektion gegen ein Antigen, in diesem Fall Apo-2, kann wie genauer in den nachstehenden Beispielen beschrieben durchgeführt werden.
Wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben sind einkettige Anti-Apo-2-Fv-(Anti-Apo-2-scFv-) Antikörper unter Verwendung einer Phagendisplaybibliothek identifiziert worden. Drei dieser Antikörper, die hierin 16E2, 24C4 und 20E6 genannt werden, sind sequenziert und charakterisiert worden. Die jeweiligen DNA- und Aminosäuresequenzen und komplementaritätsbestimmenden Regionen dieser Antikörper sind in den 15A–15C und 16 dargestellt. In einer Ausführungsform der Erfindung haben scFv-Apo-2-Antikörper dieselben biologischen Eigenschaften wie 16E2-, 24C4- oder 20E6-Antikörper, die hierin identifiziert sind. Der Begriff „biologische Eigenschaften” wird dazu verwendet, In-vitro- oder In-vivo-Aktivitäten oder -Eigenschaften des scFv-Antikörpers zu benennen, wie z. B. die Fähigkeit, sich spezifisch an Apo-2 zu binden oder Apo-2-Aktivierung im Wesentlichen zu induzieren oder zu verstärken. Wie in der vorliegenden Beschreibung offenbart sind die 16E2-, 24C4 und 20E6-Antikörper so charakterisiert, dass sie sich an Apo-2 binden und über agonistische Aktivität für die Induktion von Apoptose und über keine Kreuzreaktivität zu DR4 oder mehrere andere bekannter Moleküle verfügen, die vom Apo-2-Ligand erkannt werden. Gegebenenfalls bindet sich der scFv-Apo-2-Antikörper an dasselbe Epitop oder Epitope, die von 16E2-, 24C4-, oder 20E6-Antikörpern, die hierin offenbart sind, erkannt werden. Dies kann durch die Durchführung mehrerer Tests wie den hierin und in den Beispielen beschriebenen bestimmt werden. Zum Beispiel kann zur Bestimmung, ob ein scFv-Antikörper dieselbe Spezifität wie die 16E2-, 24C4- oder 20E6-Antikörper, die speziell offenbart sind, aufweist, die Aktivität in Apoptoseinduktionstests verglichen werden, wie z. B. jene, die in den nachstehenden Beispielen beschrieben sind.
Gegebenenfalls können die scFv-Antikörper zu Apo-2 Antikörper umfassen, die eine VH- und VL-Kette enthalten, die eine oder mehrere Aminosäuresequenzen einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) umfasst, die in 16 für die 16E2-, 20E6- oder 24C4-Antikörper identifiziert sind.
4. Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise Human- oder humanisierte, Antikörper, die für zumindest zwei verschiedene Antigene Bindungsspezifitäten aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für Apo-2 und die andere für ein beliebiges anderes Antigen, vorzugsweise für ein Zelloberflächenprotein oder einen -Rezeptor oder eine -Rezeptoruntereinheit.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind nach dem Stand der Technik bekannt. Traditionell basiert die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren, wobei die beiden schweren Ketten unterschiedliche Spezifität aufweisen [Millstein & Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)]. Durch die Zufallsverteilung der schweren und leichten Immunglobulinketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potentielles Gemisch aus zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls wird normalerweise durch Affinitätschromatographieschritte erzielt. Ähnliche Verfahren werden in der WO 93/08829 , veröffentlicht am 13. Mai 1993, und von Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
Variable Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigenbindungsstellen) können gemäß einem anderen und bevorzugteren Ansatz an Immunglobulin-Konstantdomänensequenzen fusioniert werden. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer Immunglobulin-Schwerkettenkonstantdomäne, die zumindest einen Teil der Gelenks-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Bevorzugterweise befindet sich die erste konstante Region der schweren Kette (CH1), welche die für das Binden der leichten Kette notwendige Stelle enthält, in zumindest einer der Fusionen. DNAs, die für die Fusionen der schweren Ketten des Immunglobulins kodieren und, falls gewünscht, für die leichte Kette des Immunglobulins, werden in eigene Expressionsvektoren eingeführt und in einen geeigneten Wirtsorganismus co-transfiziert. Dies stellt große Flexibilität in der Anpassung der wechselseitigen Anteile der drei Polypeptidfragmente in Ausführungsformen bereit, wenn ungleiche Verhältnisse von drei Polypeptidketten, die in der Herstellung verwendet wurden, die optimalen Ausbeuten ergeben. Es ist jedoch möglich, die kodierenden Sequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor zu insertieren, wenn die Expression von zumindest zwei Polypeptidketten in gleichen Verhältnissen zu hohen Ausbeuten führt oder wenn die Verhältnisse von keiner besonderen Bedeutung sind. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes bestehen die bispezifischen Antikörper aus einer hybriden Immunglobulinschwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem hybriden Immunglobulin-Schwerketten/Leichtkettenpaar (wobei eine zweite Bindungsspezifität bereitgestellt wird) im anderen Arm. Es wurde festgestellt, dass diese asymmetrische Struktur die Trennung der gewünschten bispezifischen Verbindung aus unerwünschten Immunglobulinkettenkombinationen erleichtert, da die Gegenwart einer Immunglobulin-Leichtkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls eine einfache Art der Trennung bereitstellt. Dieser Ansatz ist in WO 94/04690 offenbart, veröffentlicht am 3. März 1994. Für weitere Details über die Erzeugung bispezifischer Antikörper siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
5. Heterokonjugat-Antikörper
Heterokonjugat-Antikörper liegen ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugat-Antikörper bestehen aus zwei kovalent gebundenen Antikörpern. Solche Antikörper wurden beispielsweise vorgeschlagen, um Immunsystemzellen auf ungewünschte Zellen abzuzielen [ US-Patent Nr. 4.676.980 ], und zur Behandlung von HIV-Infektion [ WO 91/00360 ; WO 92/200373 ; EP-A-03089 ]. Es wird überlegt, die Antikörper in vitro unter Anwendung bekannter Verfahren der synthetischen Proteinchemie, einschließlich unter Einbeziehung jener Verfahren, die Vernetzungsmittel umfassen, zu produzieren. Immuntoxine können etwa unter Verwendung einer Disulfidaustauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele für die dafür geeigneten Reagenzien umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat sowie jene, die etwa in US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart sind.
6. Triakörper
Triakörper sind ebenfalls im Schutzumfang der Erfindung enthalten. Solche Antikörper sind z. B. in Iliades et al., FEBS Letters 409, 437–441 (1997), und Korrt et al., Protein Engineering 10, 423–433 (1997), beschrieben.
7. Andere Modifikationen
Andere Modifikationen der Apo-2-Antikörper werden in Erwägung gezogen. Zum Beispiel kann es wünschenswert sein, die Antikörper der Erfindung hinsichtlich der Effektorfunktionen zu modifizieren, um die therapeutische Wirksamkeit der Antikörper zu verstärken. Alternativ dazu können die Antikörper hergestellt werden, sodass sie über duale Fc-Regionen verfügen [siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3, 219–230 (1989)].
Es kann wünschenswert sein, die Aminosäuresequenzen der hierin offenbarten Antikörper zu modifizieren. Sequenzen innerhalb der komplementaritätsbestimmenden scFv- oder Linkerregionen (wie in 16 dargestellt) können zum Beispiel modifiziert werden, um die biologischen Aktivitäten dieser Antikörper zu modulieren. Variationen in der Volllängen-scFv-Sequenz oder in verschiedenen Domänen der hierin beschriebenen scFv-Moleküle können zum Beispiel unter Verwendung beliebiger Verfahren und Richtlinien für konservative und nicht-konservative Mutationen, wie z. B. in US-Patent-Nr. 5.364.934 dargelegt, hergestellt werden. Variationen können eine Substitution, Deletion oder Insertion einer oder mehrerer Codons sein, die für ein scFv kodieren, die zu einer Veränderung der Aminosäuresequenz von scFv im Vergleich zu Nativsequenz-scFv führt. Gegebenenfalls erfolgt die Variation durch Substitution von zumindest einer Aminosäure mit einer beliebigen Aminosäure in einer oder mehreren der Domänen des scFv-Moleküls. Die Variationen können unter Verwendung von fachbekannten Verfahren, wie oligonucleotidvermittelter (ortsgerichteter) Mutagenese, Alaninscanning und PCR-Mutagenese, erfolgen. Ortsgerichtete Mutagenese [Carter et al., Nucl. Acids. Res. 13, 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)], Kassettenmutagenese [Wells et al., Gene 34, 315 (1985)], Restriktionsselektionsmutagenese [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)] oder andere bekannte Verfahren können auf der klonierten DNA durchgeführt werden, um die scFv-Varianten-DNA zu produzieren.
Die Antikörper können gegebenenfalls kovalent an eine oder mehrere chemische Gruppen angeheftet oder konjugiert sein. Ein Polyol kann z. B. an ein Antikörpermolekül an einen oder mehrere Aminosäurereste angeheftet sein, einschließlich Lysinreste, wie in WO 93/00109 offenbart. Gegebenenfalls ist das Polyol ein Poly(alkylenglykol), wie z. B. Poly(ethylenglykol) (PEG), jedoch erkennen Fachleute, dass andere Polyole, wie z. B. Poly(propylenglykol) und Polyethylenpolypropylenglykolcopolymere, unter Verwendung von Verfahren zur Konjugation von PEG an Polypeptide verwendet werden können. Es ist eine Vielzahl von Verfahren zum Pegylieren von Polypeptiden beschrieben worden. Siehe z. B. US-Patent-Nr. 4.179.337 , das die Konjugation einer Zahl von Hormonen und Enzymen an PEG und Polypropylenglykol offenbart, um physiologisch aktive Zusammensetzungen zu produzieren, die über reduzierte Immunogenitäten verfügen.
Die Antikörper können ebenfalls an ein anderes heterologes Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz, wie z. B. eine Epitopmarkierung, fusioniert oder gebunden werden. Epitopmarkierungspolypeptide und Verfahren für deren Anwendung sind oben in Abschnitt A, Absatz 8, beschrieben. Jegliche der hierin beschriebenen Markierungen können mit den Antikörpern verbunden werden. Die nachstehenden Beispiele beschreiben zum Beispiel His-markierte und gD-markierte einkettige Antikörper.
D. Therapeutische Anwendungen für Apo-2-Antikörper
Die Apo-2-Antikörper der Erfindung haben einen therapeutischen Nutzen. Agonistische Apo-2-Antikörper können zum Beispiel zur Aktivierung oder Stimulation von Apoptose in Krebszellen verwendet werden. Dementsprechend stellt die Erfindung Verfahren zur Behandlung von Krebs unter Verwendung von Apo-2-Antikörpern bereit. Es wird natürlich erwartet, dass die Verfahren der Erfindung in Kombination mit anderen therapeutischen Techniken, wie z. B. Chirurgie, verwendet werden können.
Der Agonist wird vorzugsweise an das Säugetier in einem Träger verabreicht. Geeignete Träger und deren Formulierungen sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, 1980, Mack Publishing Co., herausgegeben von Oslo et al., beschrieben. Typischerweise wird eine geeignete Menge eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes in der Formulierung verwendet, um die Formulierung isotonisch zu machen. Beispiele für einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen Kochsalzlösung, Ringer-Lösung und Dextrose-Lösung. Der pH der Lösung reicht vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 8, und noch bevorzugter von etwa 7 bis etwa 7,5. Weitere Träger umfassen Retard-Formulierungen, wie z. B. halbdurchlässige Matrizen fester hydrophober Polymere, die den Agonisten enthalten, wobei die Matrizen in Form von Formteilen vorliegen, z. B. Filmen, Liposomen oder Mikropartikeln. Es wird Fachleuten klar sein, dass bestimmte Träger noch bevorzugter z. B. vom Verabreichungsweg und der Konzentration des zu verabreichenden Agonisten abhängen.
Der Agonistenantikörper kann durch Injektion (z. B. intravenös, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär) an das Säugetier verabreicht werden oder durch andere Verfahren, wie z. B. Infusion, welche seine Lieferung an den Blutstrom in einer wirksamen Form sichern. Der Agonist kann auch über intratumorale, peritumorale, intraläsionale oder periläsionale Wege verabreicht werden, um lokale sowie systemische therapeutische Wirkungen auszuüben. Lokale oder intravenöse Injektion ist bevorzugt.
Wirksame Dosierungen und Pläne zur Verabreichung des Agonistenantikörpers können empirisch bestimmt werden, und das Durchführen solcher Bestimmungen liegt im Fachgebiet. Fachleuten ist klar, dass die Dosierung des Agonisten, der verabreicht werden muss, z. B. vom Säugetier, das den Agonisten erhält, vom Verabreichungsweg, vom besonderen Typ des verwendeten Agonisten und anderen an das Säugetier zu verabreichende Arzneimittel abhängt. Anleitungen zur Auswahl von geeigneten Dosen für Antikörperagonisten sind in der Literatur über therapeutische Anwendungen von Antikörpern zu finden, z. B. Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., Hrsg., Noges Publications, Park Ridge, N. J., Kapitel 22, 303–357 (1985); Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., Hrsg., Rauen Press, New York, 365–389 (1977). Eine typische tägliche Dosis des allein verwendeten Agonisten kann von etwa 1 μg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht oder mehr pro Tag reichen, abhängig von den oben genannten Faktoren.
Der Agonistenantikörper kann auch in Kombination mit wirksamen Mengen eines oder mehrerer therapeutischer Mittel oder gemeinsam mit Strahlenbehandlung verabreicht werden. Therapeutische Mittel, die in Erwägung gezogen werden, umfassen Chemotherapeutika sowie Immunadjuvanzien und Cytokine. Chemotherapien, die von der Erfindung vorgesehen sind, umfassen chemische Substanzen oder Arzneimittel, die fachbekannt sind und im Handel verfügbar sind, wie z. B. Doxorubicin, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid („Ara-C”), Cyclophosphamid, Thiotepa, Busulfan, Cytoxin, Taxol, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin und Carboplatin. Der Agonist kann nach oder gleichzeitig mit einem oder mehreren anderen therapeutischen Mitteln verabreicht werden. Die Mengen des Agonisten und therapeutischen Mittels hängen zum Beispiel davon ab, welche Art von Arzneimitteln verwendet wird, welcher Art von Krebs zu behandeln ist, sowie von Verabreichungsplänen und -wegen, sind aber im Allgemeinen geringer als würde jeder einzeln verwendet werden.
Nach Verabreichung des Agonisten an das Säugetier kann der Krebs und das physiologische Leiden des Säugetiers auf verschiedenste, dem Fachmann bekannte Arten überwacht werden. Zum Beispiel kann die Tumormasse physikalisch oder durch Standard-Röntgenbildgebungsverfahren beobachtet werden.
Die Apo-2-Antikörper der Erfindung können auch zur Verstärkung des immunvermittelten Zelltods in Zellen nützlich sein, die Apo-2 exprimieren, z. B. durch Komplementfixierung oder ADCC. Alternativ dazu können antagonistische Antikörper verwendet werden, um übermäßige Apoptose zu blockieren (z. B. bei einer neurodegenerativen Erkrankung) oder um potenzielle Autoimmun-/Entzündungswirkungen von Apo-2 zu blockieren, die aus NF-κB-Aktivierung herrühren. Solche antagonistische Antikörper können gemäß therapeutischer Verfahren und oben beschriebener Verfahren verwendet werden.
E. Nicht-therapeutische Anwendungen für Apo-2-Antikörper
Apo-2-Antikörper können weiters in diagnostischen Tests auf Apo-2 verwendet werden, z. B. Detektion ihrer Expression in spezifischen Zellen, Geweben oder Serum. Es können verschiedene fachbekannte diagnostische Testverfahren verwendet werden, wie z. B. kompetitive Bindungstests, direkte oder indirekte Sandwichtests und Immunpräzipitationstests, die entweder in heterogenen oder homogenen Phasen durchgeführt werden [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. 147–158 (1987)]. Die in den diagnostischen Tests verwendeten Antikörper können mit einer detektierbaren Gruppierung markiert werden. Die detektierbare Gruppierung soll in der Lage sein, entweder direkt oder indirekt ein detektierbares Signal zu produzieren. Zum Beispiel kann die detektierbare Gruppierung ein Radioisotop sein, wie z. B. ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I, eine Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzverbindung, wie z. B. Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin, oder ein Enzym, wie z. B. alkalische Phosphatase, Beta-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase. Ein anderes fachbekanntes Verfahren zur Konjugation des Antikörpers an die detektierbare Gruppierung kann verwendet werden, einschließlich jene Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben werden.
Apo-2-Antikörper sind auch zur Afffinitätsreinigung von Apo-2 aus rekombinanter Zellkultur oder natürlichen Quellen zweckdienlich. In diesem Verfahren werden die Antikörper gegen Apo-2 unter Einsatz fachbekannter Verfahren auf einem geeigneten Träger immobilisiert, wie z. B. Sephadex-Harz oder Filterpapier. Der immobilisierte Antikörper wird dann mit einer Probe kontaktiert, die Apo-2 enthält, die gereinigt werden soll, und danach wird der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das im Wesentlichen das gesamte Material in der Probe entfernt, mit Ausnahme von Apo-2, das an den immobilisierten Antikörper gebunden ist. Letztlich wird der Träger mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das Apo-2 aus dem Antikörper freisetzt.
F. Sets, die Apo-2 oder Apo-2-Antikörper enthalten
Es sind Herstellungsartikel und Sets bereitgestellt, welche Apo-2 oder Apo-2-Antikörper enthalten, die z. B. für die oben beschriebenen therapeutischen oder nicht-therapeutischen Anwendungen verwendet werden können. Der Herstellungsartikel umfasst einen Behälter mit einer Markierung. Geeignete Behälter umfassen z. B. Flaschen, Phiolen und Teströhrchen. Die Behälter können aus einer Vielzahl von Materialien gebildet werden, wie z. B. Glas oder Kunststoff. Der Behälter enthält eine Zusammensetzung, die ein aktives Mittel umfasst, das für oben beschriebene therapeutische oder nicht-therapeutische Anwendungen wirksam ist. Das aktive Mittel in der Zusammensetzung ist Apo-2 oder ein Apo-2-Antikörper. Die Markierung auf dem Behälter zeigt an, dass die Zusammensetzung für eine spezifische Therapie oder nichttherapeutische Anwendung verwendet wird, und kann auch Anleitungen angeben, entweder für die In-vivo- oder In-vitro-Verwendung, wie z. B. die oben beschriebenen.
Das Set umfasst typischerweise den oben beschriebenen Behälter und einen oder mehrere andere Behälter, die Materialien umfassen, die vom kommerziellen und Benutzerstandpunkt wünschenswert sind, einschließlich Puffer, Verdünnungsmittel, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Gebrauchsanweisungen.
Die folgenden Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in keinster Weise einschränken.
BEISPIELE
Alle Restriktionsenzyme, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird, wurden von New England Biolabs erworben und gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Alle anderen im Handel erhältlichen Reagenzien, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird, wurden, wenn nicht anders angegeben, gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die Quelle dieser Zellen, die in den folgenden Beispielen und in der gesamten Beschreibung durch ATCC-Zugangsnummern identifiziert sind, ist die American Type Culture Collection, Rockville, Manassas, VA.
BEISPIEL 1
Isolierung von cDNA-Klonen, die für menschliches Apo-2 kodieren
Es wurden DNA-Datenbanken mit exprimierten sequenzmarkierten Stellen (EST) (LIFESEQ^TM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) durchsucht, und eine EST wurde identifiziert, die Homologie zur Todesdomäne des Apo-3-Rezeptors zeigte [Marsters et al., Curr. Biol. 6, 750 (1996)]. Menschliche Pankreas- und Nieren-Igt10-Bakteriophagen-cDNA-Bibliotheken, beide von Clontech erworben, wurden wie folgt in pRKS-Vektoren ligiert. Es wurden Reagenzien zusammengefügt und bei 16°C 16 Stunden lang inkubiert: 5 × T4-Ligasepuffer (3 ml), pRK5, Xho1-, Not1-verdauter Vektor, 0,5 mg, 1 ml, cDNA (5 ml) und destilliertes Wasser (6 ml). In der Folge wurde zusätzliches destilliertes Wasser (70 ml) und 10 mg/ml tRNA (0,1 ml) hinzugefügt und die gesamte Reaktion durch Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert. Die wässrige Phase wurde entfernt, gewonnen und in 5 M NaCl (10 ml) und absoluten Ethanol (–20°C, 250 ml) verdünnt. Dies wurde dann 20 Minuten lang bei 14.000 × g zentrifugiert, dekantiert und das Pellet in 70% Ethanol (0,5 ml) resupendiert und wieder 2 Minuten lang bei 14.000 × g zentrifugiert. Das DNA-Pellet wird dann in einem Speedvac getrocknet und in destilliertem Wasser (3 ml) zur Verwendung im nachfolgenden Verfahren eluiert.
Die ligierte cDNA/pRK5-Vektor-DNA, die zuvor hergestellt wurde, wurde auf Eis abgekühlt, zu welchem elektrokompetente DH10B-Bakterien zugegeben wurden (Life Tech., 20 ml). Das Bakterienvektorgemisch wurde dann nach den Empfehlungen des Herstellers elektroporiert. In der Folge wurde SOC-Medium (1 ml) zugegeben und das Gemisch bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert. Die Transformanten wurden dann auf 20 150-mm-Standard-LB-Platten ausplattiert, die Ampicillin enthielten, und 16 Stunden lang inkubiert (37°C), um den Kolonien zu ermöglichen, zu wachsen. Positive Kolonien wurden dann abgeschabt und die DNA aus dem Bakterienpellet unter Einsatz von Standard-CsCl-Gradientenprotokollen isoliert.
Eine angereicherte 5'-cDNA-Bibliothek wurde dann hergestellt, um eine Beeinflussung von cDNA-Fragmenten zu erhalten, die vorzugsweise die 5'-Enden von cDNAs repräsentiert, die in der Bibliothek enthalten sind. 10 mg der gepoolten isolierten Volllängen-Bibliothek-Plasmid-DNA (41 ml) wurde mit Not1-Restriktionspuffer (New England Biolabs, 5 ml) und Not1 (New England Biolabs, 4 ml) kombiniert und bei 37°C eine Stunde lang inkubiert. Die Reaktion wurde durch Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, 50 ml) extrahiert, die wässrige Phase entfernt, gesammelt und in 5 M NaCl (5 ml) und absolutem Ethanol (–20°C, 150 ml) resuspendiert. Dies wurde dann 20 Minuten lang bei 14.000 × g zentrifugiert, dekantiert, in 70% Ethanol (0,5 ml) resuspendiert und wieder 2 Miunten lang bei 14.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde dann entfernt, das Pellet in einem Speedvac getrocknet und in destilliertem Wasser resuspendiert (10 ml).
Die folgenden Reagenzien wurden zusammengegeben und bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert: destilliertes Wasser (3 ml); linearisierte DNA-Bibliothek (1 mg, 1 ml), Ribonucleotidgemisch (Invitrogen, 10 ml), Transkriptionspuffer (Invitrogen, 2 ml) und Sp6-Enzymgemisch. Die Reaktion wurde dann durch Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, 50 ml) extrahiert und die wässrige Phase entfernt, gesammelt und in 5 M NaCl (5 ml) und absolutem Ethanol (–20°C, 150 ml) resuspendiert und 20 Miunten lang bei 14.000 × g zentrifugiert. Das Pellet wurde dann dekantiert und in 70% Ethanol resupendiert (0,5 ml), wieder 2 min lang bei 14.000 × g zentrifugiert, dekantiert, in einem Speedvac getrocknet und in destilliertem Wasser (10 ml) resuspendiert.
Die folgenden Reagenzien wurden gemeinsam hinzugefügt und bei 16°C 16 Stunden lang inkubiert: 5 × T4-Ligasepuffer (Life Tech., 3 ml); Cla-Sal-verdauter pRK5-Vektor, 0,5 mg, 1 ml, cDNA (5 ml), destilliertes Wasser (6 ml). In der Folge wurde zusätzliches destilliertes Wasser (70 ml) und 10 mg/ml tRNA (0,1 ml) hinzugefügt, und die gesamte Reaktion wurde durch Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, 100 ml) extrahiert. Die wässrige Phase wurde entfernt, gesammelt und durch 5 M NaCl (10 ml) und absolutes Ethanol (–20°C, 250 ml) verdünnt und 20 Minuten lang bei 14.000 × g zentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde dekantiert, in 70% Ethanol (0,5 ml) resuspendiert und wieder 2 Minuten lang bei 14.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das restliche Pellet in einem Speedvac getrocknet und in destilliertem Wasser (3 ml) resuspendiert. Die ligierte cDNA/pSST-amy.1-Vektor-DNA wurde auf Eis gekühlt, zu welchem elektrokompetente DH10B-Bakterien hinzugegeben worden waren (Life Tech., 20 ml). Das Bakterien-Vektorgemisch wurde dann wie vom Hersteller empfohlen elektroporiert. In der Folge wurde SOC-Medium (Life Tech., 1 ml) hinzugegeben und das Aminosäuregemisch bei 37°C Minuten lang inkubiert. Die Transformanten wurden dann auf 20 150-mm-Standard-LB-Platten, die Ampicillin enthielten, ausplattiert und 16 Stunden lang inkubiert (37°C). Positive Kolonien wurden von den Platten abgekratzt, und die DNA wurde aus dem Bakterienpellet unter Einsatz von Standardprotokollen, z. B. CsCl-Gradient, isoliert.
Die cDNA-Bibliotheken wurden durch Hybridisierung mit einer synthetischen Oligonucleotidsonde gescreent:
GGGAGCCGCTCATGAGGAAGTTGGGCCTCATGGACAATGAGATAAAGGTGGCTAAAGCTGAGGCAGCGGG (Seq-ID Nr. 3), basierend auf dem EST.
Drei cDNA-Klone wurden in ihrer Gesamtheit sequenziert. Die überlappenden Kodierregionen der cDNAs waren identisch, mit Ausnahme von Codon 410 (unter Verwendung des Nummerierungssystems für 1); diese Position kodierte für einen Leucinrest (TTG) in beiden Pankreas-cDNAs und einen Methioninrest (ATG) in der Nieren-cDNA, möglicherweise aufgrund von Polymorphismus.
Die gesamte Nucleotidsequenz von Apo-2 ist in 1 (Seq.-ID Nr. 2) dargestellt. Klon 27868 (auch als pRK5-Apo-2 bezeichnet, wie nachstehend angegeben als ATCC 209021 hinterlegt) enthält einen einzelnen offenen Leseraster mit einer offensichtlichen Translationsinitiationsstelle an den Nucleotidpositionen 140–142 [Kozak et al., siehe oben] und endet am Stopcodon, das an Nucleotidpositionen 1373–1375 zu finden ist (1, Seq.-ID Nr. 2). Der prognostizierte Polypeptidvorläufer ist 411 Aminosäuren lang, ein Typ-1-Transmembranprotein und hat ein berechnetes Molekulargewicht von etwa 45 kDa. Hydropathieanalyse (nicht dargestellt) lässt die Gegenwart einer Signalsequenz vermuten (Reste 1–53), gefolgt von einer extrazellulären Domäne (Reste 54–182), einer Transmembrandomäne (Reste 183–208) und einer intrazellulären Domäne (Reste 209–411) (2A, Seq.-ID Nr. 1). Eine N-terminale Aminosäuresequenzanalyse von Apo-2-IgG, das in 293-Zellen exprimiert wurde, zeigte, dass das reife Polypeptid an Aminosäurerest 54 beginnt, was zeigt, dass die tatsächliche Signalsequenz die Reste 1–53 umfasst. Apo-2-Polypeptid wird durch Expression des Moleküls, das vom cDNA-Insert des hinterlegten ATCC-209021-Vektors kodiert wird, erhalten oder ist dadurch erhältlich.
TNF-Rezeptorfamilienproteine sind typischerweise durch die Gegenwart von mehreren (für gewöhnlich vier) cysteinreichen Domänen in ihren extrazellulären Regionen charakterisiert – wobei jede cysteinreiche Domäne etwa 45 Aminosäuren lang ist und etwa 6 regelmäßig angeordnete Cysteinreste umfasst. Basierend auf der Kristallstruktur von Typ-1-TNF-Rezeptoren bilden die Cysteine in jeder Domäne typischerweise drei Disulfidbindungen, in welchen für gewöhnlich Cysteine 1 und 2, 3 und 5, und 4 und 6 zusammen ein Paar bilden. Wie DR4 enthält Apo-2 zwei extrazelluläre cysteinreiche Pseudowiederholungen (2A), während andere identifizierte Säugetier-TNFR-Familienelemente drei oder mehrere solcher Domänen umfassen [Smith et al., Cell 76, 959 (1994)].
Die zytoplasmatische Region von Apo-2 enthält eine Todesdomäne (Aminosäurereste 324–391, die in 1 dargestellt sind, siehe auch 2A), die signifikant mehr Aminosäuresequenzidentität mit der Todesdomäne von DR4 zeigt (64%) als mit der Todesdomäne von TNFR1 (30%), CD95 (19%) oder Apo-3/DR3 (29%) (2B). Vier von sechs Todesdomänenaminosäuren, die zur Signalgebung durch TNFR1 erforderlich sind [Tartaglia et al., siehe oben], sind in Apo-2 konserviert, während die anderen zwei Reste halb konserviert sind (siehe 2B).
Basierend auf einer Anordnungsanalyse (unter Einsatz des ALIGN^TM-Computerprogramms) der Vollängensequenz zeigt Apo-2 mehr Sequenzidentität mit DR4 (55%) als mit anderen apoptosegebundenen Rezeptoren, wie z. B. TFNR1 (19%), CD95 (17%) oder Apo-3 (auch als DR3, WSL1 oder TRAMP bezeichnet) (29%).
BEISPIEL 2
A. Expression von Apo-2-ECD
Es wurde ein Fusionskonstrukt einer löslichen extrazellulären Domäne (ECD) hergestellt. Eine Apo-2-ECD (Aminosäurereste 1–184, die in 1 dargestellt sind) wurde durch PCR erhalten und an eine C-terminale Flag-Epitopmarkierung (Sigma) fusioniert. (Das Apo-2-ECD-Konstrukt umfasste Reste 183 und 184, die in 1 dargestellt sind, um Flexibilität am Gelenk bereitzustellen, obwohl Reste 183 und 184 in der Transmembranregion sein sollen.) Die flag-epitopmarkierten Moleküle wurden dann in PRK5 insertiert und durch vorübergehende Transfektion in menschliche 293-Zellen exprimiert (ATCC CRL 1573).
Nach 48 Stunden Inkubation wurden die Zellüberstände gewonnen und entweder direkt für Co-Präzipitationsstudien (siehe Beispiel 3) verwendet oder gemäß den Anweisungen des Herstellers (Sigma) einer Reinigung von Apo-2-ECD-Flag durch Affinitätschromatographie auf Anti-Flag-Agarosekügelchen unterworfen.
B. Expression von Apo-2-ECD als Immunadhäsin
Ein lösliches Apo-2-ECD-Immunadhäsinkonstrukt wurde hergestellt. Die Apo-2-ECD (Aminosäuren 1–184, die in 1 dargestellt sind) wurde wie zuvor beschrieben an die Gelenks- und Fc-Region einer menschlichen Immunglobulin-G₁-Schwerkette in pRK5 fusioniert [Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 10535–10539 (1991)]. Das Immunadhäsin wurde durch vorübergehende Transfektion in menschliche 293-Zellen exprimiert und aus Zellüberständen durch Protein-A-Affinitätschromatographie wie von Ashkenazi et al., siehe oben, beschrieben gereinigt.
BEISPIEL 3
Immunpräzipitionstest, der Bindungswechselwirkung zwischen Apo-2 und dem Apo-2-Liganden zeigt
Zur Bestimmung, ob Apo-2 und Apo-2L wechselwirken oder miteinander assoziiert sind, wurden Überstände von scheintransfizierten 293-Zellen oder aus 293-Zellen, die mit Apo-2-ECD-Flag transfiziert waren (in Beispiel 2 oben beschrieben) (5 ml), mit 5 μg von löslichem, mit Poly-Histidin markiertem Apa-2L [Pitti et al., siehe oben] 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann mithilfe eines Copräzipitationstests auf Komplexbildung analysiert.
Die Proben wurden dann unter Einsatz von 25 μl von Anti-Flag-konjugierten Agarosekügelchen (Sigma) oder nickelkonjugierten Agarosekügelchen (Qiagen) Immunpräzipitaion unterworfen. Nach 1,5 Stunden Inkubation bei 4°C wurden die Kügelchen abzentrifugiert und vier Mal in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Unter Verwendung von Anti-Flag-Agarose wurde Apo-2L durch die flag-markierte ECD gefällt, unter Verwendung von Nickelagarose wurde die Apo-2-ECD durch das His-markierte Apo-2L gefällt. Die präzipitierten Proteine wurden durch Sieden der Kügelchen 5 Minuten lang in SDS-PAGE-Puffer freigesetzt, durch Elektrophorese auf 12% Polyacrylamidgelen aufgelöst und dann durch Immunblot mit Anti-Apo-2L- oder Anti-Flag-Antikörper (2 μg/ml) wie in Marsters et al., J. Biol. Chem. (1997), beschrieben detektiert.
Die Ergebnisse, die in 3 dargestellt sind, zeigen, dass Apo-2-ECD und Apo-2L sich miteinander assoziieren können.
Die Bindungswechselwirkung wurde weiters durch Reinigung von Apo-2-ECD aus den transfizierten 293-Zellüberständen mit Anti-Flag-Kügelchen (siehe Beispiel 2) analysiert und durch Analyse der Proben auf einem BIACORE^TM-Instrument analysiert. Die BIACORE^TM-Analyse zeigte eine Dissoiationskonstante (K_d) von etwa 1 nM. BIACORE^TM-Analyse zeigte auch, dass die Apo-2-ECD nicht in der Lage ist, andere apoptoseinduzierende TNF-Familienelemente zu binden, nämlich TNF-alpha (Genentech, Inc., Pennica et al., Nature 312, 712 (1984)), Lymphotoxin-alpha (Genentech, Inc.) oder Fas/Apo-1-Ligand (Alexis Biochemicals). Die Daten zeigen daher, dass Apa-2 ein spezifischer Rezeptor für Apo-2L ist.
BEISPIEL 4
Induktion von Apoptose durch Apo-2
Da Todesdomänen als Oligomerisierungsschnittstellen wirken können, kann die Überexpression von Rezeptoren, die Todesdomänen enthalten, zur Aktivierung von Signalgebung in Abwesenheit des Liganden führen [Fazeter et al., siehe oben, Nagata et al., siehe oben]. Zur Bestimmung, ob Apo-2 in der Lage war, Zelltod zu induzieren, wurden menschliche 293-Zellen oder HeLa-Zellen (ATCC CCL 2.2) vorübergehend durch Kalziumphosphatpräzipitation (293-Zellen) oder Elektroporation (HeLa-Zellen) mit einem pRK5-Vektor oder pRK5-basierten Plasmiden transfiziert, die für Apo-2 und/oder CrmA kodierten. Wenn anwendbar, wurde die Gesamtmenge von Plasmid-DNA angepasst, indem Vektor-DNA hinzugegeben wurde. Apoptose wurde 24 Stunden nach Transfektion durch Morphologie (4A); DNA-Fragmentierung (4B) oder durch FACS-Analyse von Phosphatydilserinexposition (4C) wie in Marsters et al., Curr. Biol. 6, 1669 (1996), beschrieben beurteilt. Wie in den 4A und 4B beschrieben, wurden die Apo-2-transfizierten 293-Zellen deutlicher Apoptose unterworfen.
Für Proben, die durch FACS analysiert wurden, wurden die HeLa-Zellen mit pRK5-CD4 als Marker zur Transfektion transfiziert, und Apoptose wurde in CD4-exprimierenden Zellen bestimmt; FADD wurde mit dem Apo-2-Plasmid co-transfiziert, die Daten sind Mittelwerte ± SEM von zumindest drei Versuchen, wie in Marsters et al., Curr. Biol. 6, 1669 (1996), beschrieben. Die Caspase-Inhibitoren, DEVD-fmk (Enzyme Systems) oder z-VAD-fmk (Research Biochemicals Intl.), wurden bei 200 μM zum Zeitpunkt der Transfektion hinzugegeben. Wie in 4C dargestellt blockierten die Caspase-Inhibitoren CrmA, DEVD-fmk und z-VAD-fmk Apoptoseinduktion durch Apo-2, was die Involvierung von Ced-3-ähnlichen Proteasen in dieser Antwort anzeigte.
FADD ist ein Adaptorprotein, das Apoptoseaktivierung durch CD95, TNFR1 und Apo-3/DR3 vermittelte [Nagata et al., siehe oben], aber für Apoptoseinduktion durch Apo-2L [Marsters et al., siehe oben] oder durch DR4 [Pan et al., siehe oben] nicht notwendig erschien. Eine dominant-negative Form von FADD, die Apoptoseinduktion durch CD95, TNFR1 oder Apo-3/DR3 blockiert [Frazer et al., siehe oben; Nagata et al., siehe oben, Chinnayian et al., siehe oben] hemmte die Apoptoseinduktion durch Apo-2 nicht, wenn sie in HeLa-Zellen mit Apo-2 cotransfiziert wurde (4C). Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Apo-2 unabhängig von FADD Apoptose signalisiert. In Übereinstimmung mit dieser Schlussfolgerung band sich ein Glutathion-S-Transferasefusionsprotein, das eine zytoplasmatische Apo-2-Region enthielt, nicht an in vitro transkribiertes und translatiertes FADD (Daten nicht dargestellt).
BEISPIEL 5
Inhibition von Apo-2L-Aktivität durch eine lösliche Apo-2-ECD
Löslicher Apo-2L (0,5 μg/ml, das wie in Pitti et al., siehe oben, beschrieben hergestellt wurde) wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit PBS-Puffer oder affinitätsgereinigtem Apo-2-ECD (5 μg/ml) gemeinsam mit Anti-Flag-Antikörper (Sigma) (1 μg/ml) vorinkubiert und zu HeLa-Zellen hinzugegeben. Nach einer 5-stündigen Inkubation wurden die Zellen mithilfe von FACS auf Apoptose analysiert (wie oben) (4D).
Apo-2L induzierte merkliche Apoptose in HeLa-Zellen, und die lösliche Apo-2-ECD war in der Lage, die Wirkung von Apo-2L zu blockieren (4D), was eine spezifische Wechselwirkung zwischen Apo-2L und Apo-2 zeigte. Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem Apo-2-ECD-Immunadhäsin erhalten (4D). Eine Dosis-Reaktionsanalyse zeigte eine halbmaximale Inhibition bei etwa 0,3 nM Apo-2-Immunadhäsin (4E).
BEISPIEL 6
Aktivierung von NF-κB durch Apo-2
Es wurde ein Test durchgeführt, um zu bestimmen, ob Apo-2 NF-κB aktiviert.
HeLa-Zellen wurden mit pRK5-Expressionsplasmiden transfiziert, die für ein Volllängen-Nativsequenz-Apo-2, -DR4 oder -Apo-3 kodierten, und 24 Stunden nach Transfektion geerntet. Nuklearextrakte wurden hergestellt, und 1 μg von Kern-Protein wurde mit einer ³²P-markierten NF-κB-spezifischen synthetischen Oligonucleotidsonde ATCAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCG (Seq.-ID Nr. 4) [siehe auch MacKay et al., J. Immunol. 153, 5274–5284 (1994)], alleine oder gemeinsam mit einem 50fachen Überschuss einer unmarkierten Sonde oder mit einem irrelevanten ³²P-markiertem synthetischen Oligonucleotid AGGATGGGAAGTGTGTGATATATCCTTGAT (Seq.-ID Nr. 5) umgesetzt. In manchen Proben wurde ein Antikörper gegen p65/RelA-Untereinheiten von NF-κB (1 μg/ml; Santa Cruz Biotechnology) hinzugefügt. DNA-Bindung wurde durch elektrophoretische Gel-Retentionsanalyse wie von Hsu et al., siehe oben; Marsters et al., siehe oben, und MacKay et al., siehe oben, beschrieben analysiert.
Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. Wie in 5A dargestellt induzierten sowohl Apo-2 als auch DR4 bei Transfektion in HeLa-Zellen signifikante NF-κB-Aktivierung wie durch elektrophoretische Gelretentionsanalyse gemessen, der Aktivierungsgrad war mit der Aktivierung vergleichbar, die für Apo-3/DR3 beobachtet wurde. Antikörper gegen p65/RelA-Untereinheit von NF-κB hemmte die Mobilität der NF-κB-Sonde, was p65 in der Reaktion auf alle 3 Rezeptoren implizierte.
Es wurde auch ein Test durchgeführt, um zu bestimmen, ob Apo-2L selbst NF-κB-Aktivität regulieren kann. HeLa-Zellen oder MCF7-Zellen (menschliche Brustadenokarzinomzelllinie, ATCC HTB 22) wurden mit PBS-Puffer, löslichem Apo-2L (Pitti et al., siehe oben) oder TNF-alpha (Genentech, Inc., siehe Pennica et al., Nature 312, 721 (1984)) (1 μg/ml) behandelt und wie oben beschrieben auf NF-κB-Aktivität getestet. Die Ergebnisse sind in 5B dargestellt. Der Apo-2L induzierte eine signifikante NF-κB-Aktivierung in den behandelten HeLa-Zellen, aber nicht in den behandelten MCF7-Zellen; TNF-alpha induzierte eine ausgeprägtere Aktivierung in beiden Zelllinien. Mehrere Studien haben offenbart, dass NF-κB-Aktivierung durch TNF Zellen gegen TNF-induzierte Apoptose schützen kann [Nagata, siehe oben].
Die Wirkungen eines NF-κB-Inhibitors, ALLN (N-Acetyl-Leu-Leu-Norleucinal), und eines Transkriptionsinhibitors, Cyclohexamid, wurden ebenfalls getestet. Die HeLa-Zellen (in 6-Well-Schalen ausplattiert) wurden mit PBS-Puffer, ALLN (Calbiochem) (40 μg/ml) oder Cyclohexamid (Sigma) (50 μg/ml) 1 Stunde vor Hinzufügung von Apo-2L (1 μg/ml) vorinkubiert. Nach einer 5-stündigen Inkubation wurde Apoptose durch FACS analysiert (siehe 5C).
Die Ergebnisse sind in 5C dargestellt. Sowohl ALLN als auch Cyclohexamid erhöhten das Ausmaß von Apo-2L-induzierter Apoptose in den HeLa-Zellen. Die Daten zeigen, dass Apo-2L schützende NF-κB-abhängige Gene induzieren können. Die Daten zeigen auch, dass Apo-2L in der Lage ist, NF-κB in bestimmten Zelllinien zu aktivieren, und dass sowohl Apo-2 als auch DR4 diese Funktion vermitteln können.
BEISPIEL 7
Expression von Apo-2 in Säugetiergeweben
A. Northern-Blot-Analyse
Expression von Apo-2-mRNA in menschlichen Geweben wurde mittels Northern-Blot-Analyse untersucht. Menschliche RNA-Blots wurden an eine 4,6 Kilobasen große, ³²P-markierte DNA-Sonde, basierend auf der Volllängen-Apo-2-cDNA, hybridisiert; die Sonde wurde durch Verdau des pRK5-Apo-2-Plasmids mit EcoRI erzeugt. Menschliche-fötale-RNA-MTN-Blot (Clontech), menschliche-erwachsene-RNA-MTN-II-Blot (Clontech) und menschliche-Krebszelllinien-RNA-Blot (Clontech) wurden mit den DNA-Sonden inkubiert. Blots wurden mit den Sonden in Hybridisierungspuffer (5 × SSPE; 2 × Denhardt-Lösung, 100 mg/ml denaturierte gescherte Lachsspermien-DNA, 50% Formamid, 2% SDS) 60 Stunden lang bei 42°C inkubiert. Die Blots wurden mehrere Male in 2 × SSC, 0,05% SDS, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von einer 30-minütigen Waschung in 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C. Die Blots wurden nach Exposition über Nacht entwickelt.
Wie in 6A dargestellt wurde in mehreren Geweben ein vorherrschendes mRNA-Transkript von etwa 4,6 kb detektiert. Die Expression war in fötaler und erwachsener Leber und Lunge und in erwachsenenen Ovarial- und peripheren Blutleukozyten (PBL) relativ hoch, während im fötalen und erwachsenen Gehirn keine mRNA-Expression detektiert wurde. Zwischenexpressionsgrade waren in erwachsenem Colon, Dünndarm, Hoden, Prostata, Thymus, Pankreas, Niere, Skelettmuskel, Plazenta und Herz zu beobachten. Von mehreren erwachsenen Geweben, die Apo-2 exprimieren, z. B. PBL, Eierstock und Milz, ist zuvor gezeigt worden, dass sie DR4 exprimieren [Pan et al., siehe oben], jedoch scheinen die relativen Expressionsgrade jeder Rezeptor-mRNA anders zu sein.
Wie in 6B dargestellt wurde Apo-2-mRNA in 6 von 8 menschlichen Krebszelllinien relativ hoch exprimiert, nämlich HL60-Promyelozytenleukämie, HeLa-S3-Zervixkarzinom, chronische myelogene K562-Leukämie, kolorektales SW480-Adenokarzinom, A549-Lungenkarzinom und G361-Melanom. Es gab auch detektierbare Expression in Burkitt-Lymphom-(Raji-)Zellen. Daher war Apo-2 als Target zur Induktion von Apoptose in Krebszellen aus Lymphoid- sowie auch Nicht-Lymphoidtumoren nützlich.
B. In-situ-Hybridisierung
Expression von Apo-2 in normalen und kanzerösen menschlichen Geweben wurde durch In-situ-Hybridisierung untersucht. Zusätzlich dazu wurden verschiedene Schimpansen- und Rhesusaffengewebe auf Apo-2-Expression untersucht. Diese Gewebe umfassten: menschliches fötales Gewebe (E12–E16 Wochen)-Placenta, Nabelschnur, Leber, Niere, Nebenniere, Schilddrüse, Lunge, Herz, große Gefäße, Ösophagus, Magen, Dünndarm, Milz, Thymus, Pankreas, Gehirn, Auge, Rückenmark, Körperwand, Pelvis und untere Gliedmaße; erwachsenes menschliches Gewebe – Niere, Blase, Nebenniere, Milz, Lymphknoten, Pankreas, Lunge, Haut, Retina, Leber; Schimpansengewebe-Speicheldrüse, Magen, Schilddrüse, Nebenschilddrüse, Zunge, Thymus, Eierstock, Lymphknoten und peripherer Nerv; Rhesusaffengewebe-Großhirnrinde, Hippokampus, Cerebellum und Penis; menschliches Tumorgewebe-Lungenadenokarzinom, Hoden, Lungenkarzinom, Brustkarzinom, Fibroadenom, Weichteilsarkom.
Gewebsproben wurden in Paraffin eingebettet und geschnitten. Später wurden die geschnittenen Gewebe entparaffiniert und die Objektträger in Wasser platziert. Die Objektträger wurden zweimal fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in 2 × SSC gespült. Nach Spülung wurden die Objektträger in 20 g/ml Proteinase-K (in Rnasefreiem Puffer) 15 Minuten lang bei 37°C (für fötale Gewebe) oder 8 × Proteinase-K 30 Minuten lang bei 37°C (für Formalingewebe) platziert. Die Objektträger wurden dann wieder in 0,5 × SSC gespült und dehydriert. Vor Hybridisierung wurden die Objektträger in eine Kunststoffbox platziert, die mit Puffer ausgefüllt war(4 × SSC, 50% Formamid)-gesättigtes Filterpapier. Die Gewebe wurden mit 50 μl Hybridisierungspuffer (3,75 g Dextransulfat plus 6 ml Wasser, 2 Minuten lang verwirbelt und erwärmt, auf Eis gekühlt, und 18,75 ml Formamid, 3,75 ml 20 × SSC und 9 ml Wasser wurden hinzugegeben) bedeckt und bei 42°C 1 bis 4 Stunden lang inkubiert.
Die Hybridisierung wurde unter Verwendung einer ³³P-markierten Sonde bestehend aus den Nucleotiden 706–1259 der Seq-ID Nr. 2 durchgeführt. Diese Sonde wurde zu den Objektträgern in Hybridisierungspuffer hinzugegeben und über Nacht bei 55°C inkubiert. Mehrere Waschschritte wurden dann hintereinander wie folgt durchgeführt: zweimal 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 2 × SSC, EDTA-Puffer (400 ml 20 × SSC, 16 ml 0,25 M EDTA), einmal 30 Minuten lang bei 37°C in 20 μg/ml RNase-A, zweimal 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 2 × SSC, EDTA-Puffer, einmal 2 Stunden lang bei 55°C in 0,1 × SSC, EDTA-Puffer, zweimal 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 0,5 × SSC. Dehydrierung wurde 2 Minuten lang jeweils in 50%, 70%, 90% EtOH durchgeführt, das 0,3 M NH₄Ac enthielt. Letztlich wurden die Objektträger 2 Stunden lang luftgetrocknet und gegenüber Film exponiert.
Die Expression von Apo-2 in fötalen Geweben schien über Hepatozyten in der Leber am stärksten zu sein, wodurch sich Glomeruli in Niere, Nebennierenrinde und dem Epithel des Magen-Darmtrakts entwickelten. Gemäßigte Expression wurde über Epithelzellen in Lunge und an Vaskularisierungsstellen einer Knochenwachstumsplatte beobachtet. Eine relativ geringgradige Expression wurde über Schilddrüsenepithelzellen und Zellen in Herzventrikeln beobachtet. Expression über Lymphoidzellen in der Thymusmedulla wurde beobachtet, wodurch sich Lymphdrüsen und Placentazytotrophoblastenzellen entwickelten.
Die Expression von Apo-2 in erwachsenen Geweben wurde über ruhenden Oozyten in Primordialfollikeln und geringen Ausmaßen über Granulosezellen von sich entwickelnden Follikeln in Schimpanseneierstock beobachtet. Die Expression wurde in zirrhotischen Lebern über Hepatozyten am Rand der Knötchen beobachtet (d. h. Schadensbereich, eine normale erwachsene Leber war negativ). Andere Gewebe waren für Expression negativ.
In den untersuchten Krebsgeweben war die Apo-2-Expression in zwei Lungenadenokarzinomen und zwei Keimzelltumoren des Hodens zu finden. Zwei weitere Lungenkarzinome (ein Plattenepithel-)waren negativ. Eines von fünf Brustkarzinomen war positiv (es gab Expression in normalem Brustgewebe). In einem Fibroadenom erschien die Expression über zwei Epithel- und Stromaelementen. Ein Weichteilsarkom war ebenfalls positiv. Andere untersuchte Gewebe waren negativ.
BEISPIEL 8
Chromosomenlokalisierung des Apo-2-Gens
Chromosomenlokalisierung des menschlichen Apo-2-Gens wurde durch Strahlungshybrid-(RH-)Bewertungsanalyse untersucht. RH-Kartierung wurde durch PCR unter Einsatz eines Human-Mauszellen-Strahlungshybrid-Bewertung (Research Genetics) und Primern basierend auf der kodierenden Region der Apo-2-cDNA durchgeführt [Gelb et al., Hum. Genet. 98, 141 (1996)]. Analyse der PCR-Daten unter Verwendung der Stanford Human Genome Center Database zeigt, dass Apo-2 mit dem Marker D8S481 verbunden ist, mit einem LOD von 11,05; D8S481 ist hingegen mit D8S2055 verbunden, das zum menschlichen Chromosom 8p21 zugeordnet wird. Eine ähnliche Analyse von DR4 zeigte, dass DR4 mit dem Marker D8S2127 verbunden ist (mit einem LOD von 13,00), das auch zum menschlichen Chromosom 8p21 zugeordnet wird.
Nach dem vorliegenden Wissen des Anmelders ist bisher kein anderes Mitglied der TNFR-Genfamilie auf Chromosom 8 lokalisiert worden.
BEISPIEL 9
Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die für Apo-2 spezifisch sind
Balb/c-Mäuse (von Charles River Laboratories erhalten) wurden durch 11-malige Injektion von 0,5 μg/50 μL eines Apo-2-ECD-Immunadhäsinproteins (verdünnt in MPL-TDM-Adjuvans, bezogen von Ribi Immunochemical Research Inc., Hamilton, MT) in jede Hinterpfote in Intervallen von 3–4 Tagen immunisiert. Das Apo-2-ECD-Immunadhäsinprotein wurde durch Fusion einer extrazellulären Domänensequenz von Apo-2 (Aminosäuren 1–184, in 1 dargestellt), an die Gelenks- und Fc-Region einer menschlichen Immunglobulin-G₁-Schwerkette in pRK5 wie zuvor beschrieben erzeugt [Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 10535–10539 (1991)]. Das Immunadhäsinprotein wurde durch vorübergehende Transfektion in menschlichen 293-Zellen exprimiert und aus Zellüberständen durch Protein-A-Affinitätschromatographie wie von Ashkenazi et al., siehe oben, beschrieben gereinigt (siehe auch Beispiel 2B oben).
Drei Tage nach dem letzten Boost wurden die Nodi lymphoidei poplitei aus den Mäusen entfernt, und eine einzelne Zellsuspension wurde in DMEM-Medium (von Biowhitakker Corp. erhalten), ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin, hergestellt. Die Lymphknotenzellen wurden dann mit murinen Myelomzellen P3X63AgU.1 (ATCC CRL 1597) unter Einsatz von 35% Polyethylenglykol fusioniert und in 96-Well-Kulturplatten kultiviert. Hybridome, die aus der Fusion resultierten, wurden in HAT-Medium ausgewählt. Zehn Tage nach der Fusion wurden Hybridomkulturüberstände in einem ELISA gescreent, um auf die Gegenwart von monoklonaler Antikörperbindung an das Apo-2-ECD-Immunadhäsinprotein zu testen.
Im ELISA wurden 96-Well-Mikrotiterplatten (Maxisorb, Nunc, Kampstrup, Dänemark) durch Hinzufügung von 50 μl von 2 μg/ml Ziegen-Anti-Human-IgG-Fc (von Cappel Laborstories bezogen) in PBS zu jedem Well und Inkubation bei 4°C über Nacht beschichtet. Die Platten wurden dann dreimal mit Waschpuffer gewaschen (PBS, das 0,05% Tween 20 enthielt). Die Wells in den Mikrotiterplatten wurden dann mit 50 μl von 2,0% Rinderserumalbumin in PBS blockiert und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert. Die Platten wurden dann wieder dreimal mit Waschpuffer gewaschen.
Nach dem Waschschritt wurden 50 μl von 0,4 μg/ml Apo-2-ECD-Immunadhäsinprotein (wie oben beschrieben) in Testpuffer zu jedem Well hinzugegeben. Die Platten wurden 2 Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert, gefolgt von dreimaliger Waschung mit Waschpuffer.
Nach den Waschschritten wurden 100 μl der Hybridomüberstände oder des gereinigten Antikörpers (unter Verwendung von Protein-A-Sepharosesäulen) (1 μg/ml) zu den genannten Wells in Gegenwart von CD4-IgG hinzugegeben. 100 μl von mit P3X63AgU.1-Myelomzelle konditioniertem Medium wurden zu anderen genannten Wells als Kontrolle hinzugegeben. Die Platten wurden dann bei Raumtemperatur 2 Stunden lang auf einem Schüttler inkubiert und dann dreimal mit Waschpuffer gewaschen.
Als Nächstes wurden 50 μl von HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG-Fc (von Cappel Laborstories bezogen), 1:1000 in Testpuffer (0,5% Rinderserumalbumin, 0,05% Tween-20, 0,01% Thimersol in PBS) verdünnt, zu jedem Well hinzugegeben und die Platten 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Die Platten wurden dann dreimal mit Waschpuffer gewaschen, gefolgt von Hinzufügung von 50 μl Substrat (TMB-Mikrowellperoxidasesubstrat, Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) zu jedem Well und 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde durch Hinzufügung von 50 μl von TMB-1-Komponentenstopplösung (Diethylglykol, Kirkegaard & Perry) zu jedem Well, und Absorption bei 450 nm wurde in einem automatisierten Mikrotiterplattenlesegerät abgelesen.
Von den Hybridomüberständen, die im ELISA gescreent wurden, wurden 22 Überstände positiv getestet (berechnet als etwa 4-mal über dem Hintergrund). Die im ELISA positiv getesteten Überstände wurden weiters durch FACS-Analyse unter Verwendung von 9D-Zellen (eine menschliche B-Lymphoidzelllinie, die Apo-2 exprimiert; Genentech, Inc.) und FITC-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG getestet. Für diese Analyse wurden 25 μl von in einem Zellsortierpuffer (PBS, die 1% FCS und 0,02% NaN₃ enthielt) suspendierten Zellen (zu 4 × 10⁶ Zellen/ml) zu Mikrotiterwells mit U-förmigem Boden hinzugegeben, mit 100 μl Kulturüberstand oder gereinigtem Antikörper (auf Protein-A-Sepharosesäulen gereinigt) (10 μg/ml) in Zellsortierpuffer gemischt und 30 min lang auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit 100 μl FITC-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG 30 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal gewaschen, in 150 μl des Zellsortierpuffers resuspendiert und dann durch FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) analysiert. FACS-Analyse zeigte, dass 8/22 Überstände für Anti-Apo-2-Antikörper positiv waren.
7 zeigt die FACS-Färbung von 9D-Zellen, die mit einem der Apo-2-Antikörper inkubiert wurden, die als 3F11.39.7 bezeichnet werden. Wie in 7 dargestellt erkennt der 3F11.39.7.-Antikörper den Apo-2-Rezeptor, der in 9D-Zellen exprimiert wurde.
BEISPIEL 10
Test auf die Fähigkeit von Apo-2-Abs, agonistisch Apoptose zu induzieren
Hybridomüberstände und gereinigte Antikörper (wie in Beispiel 9 oben beschrieben) wurden auf Aktivität getestet, Apo-2-vermittelte 9D-Zellapoptose zu induzieren. Die 9D-Zellen (5 × 10⁵ Zellen/0,1 ml) wurden mit variierenden Konzentrationen von Antikörpern in 100 μl von komplettem RPMI-Medium bei 4°C 15 min lang inkubiert. Die Zellen wurden dann 5 min lang bei 37°C inkubiert, und 10 μg von Ziegen-Anti-Maus-IgG-Fc-Antikörper (Cappel Laborstories) in 300 μl von komplettem RPMI wurden zu einigen der Zellproben hinzugegeben. An diesem Punkt wurden die Zellen über Nacht bei 37°C und in Gegenwart von 7% CO₂ inkubiert. Die Zellen wurden dann geerntet und einmal mit PBS gewaschen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Färbung von FITC-Annexin-V-Bindung an Phosphatidylserin gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Clontech) bestimmt. Die Zellen wurden dann in PBS gewaschen und in 200 μl Bindungspuffer resuspendiert. 10 μl von Annexin-V-FITC (1 μg/ml) und 10 μl Propidiumiodid wurden zu den Zellen hinzugegeben. Nach 15-minütiger Inkubation im Dunkeln wurden die 9D-Zellen durch FACS analysiert.
Wie in 8 dargestellt induzierte der 3F11.39.7-Antikörper (in Abwesenheit von Ziegen-Anti-Maus-IgG-Fc) Apoptose in den 9D-Zellen im Vergleich zu Kontrollantikörpern. Agonistische Aktivität wurde jedoch durch Apo-2-Rezeptorvernetzung in Anwesenheit des Ziegen-Anti-Maus-IgG-Fc (siehe 9) verstärkt. Diese verstärkte Apoptose (9) durch die Kombination von Antikörpern ist mit der apoptotischen Aktivität von Apo-2L in 9D-Zellen vergleichbar (Daten nicht dargestellt).
BEISPIEL 11
Test auf die Fähigkeit eines Antikörpers, Apo-2-ligandeninduzierte Apoptose zu blockieren
Hybridomüberstände und gereinigte Antikörper (wie in Beispiel 9 oben beschrieben) wurden auf die Aktivität, Apo-2-ligandeninduzierte 9D-Zellapoptose zu blockieren, getestet. Die 9D-Zellen (5 × 10⁵ Zellen/0,1 ml) wurden in komplettem RPMI-Medium (RPMI plus 10% FCS, Glutamin, nicht-essentielle Aminosäuren, Penicillin, Streptomycin, Natriumpyruvat) suspendiert und in individuelle Falcon-2052-Röhrchen platziert. Die Zellen wurden dann mit 10 μg Antikörpern in 200 μl Medium 15 min lang auf Eis inkubiert. 0,2 ml von Apo-2-Ligand (2, 5 μg/ml) (löslicher His-markierter Apo-2L, der wie in WO 97/25428 beschrieben hergestellt wurde; siehe auch Pitti et al., siehe oben) wurde in komplettem RPMI-Medium suspendiert und dann in die Röhrchen hinzugefügt, welche die 9D-Zellen enthielten. Die 9D-Zellen wurden über Nacht bei 37°C und in Gegenwart von 7% CO₂ inkubiert. Die inkubierten Zellen wurden dann geerntet und einmal mit PBS gewaschen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Färbung von FITC-Annexin-V-Bindung an Phospatidylserin gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Clontech) bestimmt. Insbesondere wurden die Zellen in PBS gewaschen und in 200 μl Bindungspuffer resuspendiert. 10 μl Annexin-V-FITC (1 μg/ml) und 10 μl Propidiumiodid wurden zu den Zellen hinzugegeben. Nach 15-minütiger Inkubation im Dunkeln wurden die 9D-Zellen durch FACS analysiert.
Die Ergebnisse sind in 10 dargestellt. Da 9D-Zellen mehr als einen Rezeptor für Apo-2L exprimieren, kann Apo-2L in den 9D-Zellen durch Wechselwirkung entweder mit Apo-2 oder dem DR4-Rezeptor Apoptose induzieren. Daher musste zur Detektion einer beliebigen Blockierungsaktivität der Apo-2-Antikörper die Wechselwirkung zwischen DR4 und Apo-2L blockiert werden. In Kombination mit dem Ante-DR4-Antikörper, 4H6.17.8 (ATCC HB-12455), war der Apo-2-Antikörper 3F11.39.7 in der Lage, etwa 50% der Apoptose, die durch Apo-2L induziert ist, zu blockieren. Die übrigen etwa 50% von apoptotischer Aktivität sollen auf die agonistischen Aktivitäten dieser zwei Antikörper selbst zurückzuführen sein, wie in 10 dargestellt ist. Dementsprechend wird davon ausgegangen, dass der 3F11.39.7-Antikörper ein blockierender Apo-2-Antikärger oder ein Antikörper ist, der Apo-2 in einem Modus bindet, welcher mit der Bindung von Apo-2-Ligand an Apo-2 konkurriert.
BEISPIEL 12
ELISA-Test zur Testbindung von Apo-2-Antikörpern an andere Apo-2-Ligandenrezeptoren
Es wurde ein ELISA durchgeführt, um zu bestimmen, ob der in Beispiel 8 beschriebene monoklonale Antikörper in der Lage war, andere bekannte Apo-2L-Rezeptoren neben Apo-2 zu binden. Insbesondere wurde der 3F11.39.7-Antikörper auf Bindung an DR4 [Pan et al., siehe oben], DcR1 [Sheridan et al., siehe oben] und DcR2 [Marsters et al., Curr. Biol. 7, 1003–1006 (1997)] getestet. Der ELISA wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 9 oben beschrieben durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 11 dargestellt. Der Apo-2-Antikörper 3F11.39.7 band sich an Apo-2. Der 3F11.39.7-Antikörper zeigte auch eine gewisse Kreuzreaktivität zu DR4, aber nicht zu DcR1 oder DcR2.
BEISPIEL 13
Antikörperisotypisierung
Der Isotyp des 3F11.39.7-Antikörpers (wie oben beschrieben) wurde durch Beschichtung von Mikrotiterplatten mit isotypspezifischem Ziegen-Anti-Maus-Ig (Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) über Nacht bei 4°C bestimmt. Die Platten wurden dann mit Waschpuffer gewaschen (wie in Beispiel 9 oben beschrieben). Die Wells in den Mikrotiterplatten wurden dann mit 200 μl von 2% Rinderserumalbumin (BSA) blockiert und dann bei Raumtemperatur eine Stunde lang inkubiert. Die Platten wurden dann wieder dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Als Nächstes werden 100 μl von 5 μg/ml von gereinigtem 3F11.39.7-Antikörper zu den genannten Wells hinzugegeben. Die Platten wurden bei Raumtemperatur 30 min lang inkubiert, und dann wurden 50 μl HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (wie oben beschrieben) zu jedem Well hinzugegeben. Die Platten wurden 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Ausmaß von HRP, das an die Platte gebunden wurde, wurde unter Verwendung von HRP-Substrat wie oben beschrieben detektiert.
Die Isotypisierungsanalyse zeigt, dass der 3F11.39.-7-Antikörper ein IgG1-Antikörper ist.
BEISPIEL 14
Einkettige Apo-2-Antikörper
A. Antikörperphagenselektion unter Verwendung von streptavidinbeschichteten paramagnetischen Kügelchen
Eine Phagenbibliothek wurde unter Verwendung von löslichem biotinyliertem Antigen und streptavidinbeschichteten paramagnetischen Kügelchen ausgewählt. Das Antigen, ein Apo-2-ECD-Immunadhäsin, das wie in Beispiel 2B oben beschrieben hergestellt wurde, wurde unter Verwendung von IMMUNOPURE-NHS-Biotin (Biotinyl-N-hydroxysuccinimid, Pierce) gemäß den Anweisungen des Herstellers biotinyliert.
Es wurden zwei Panningversuche durchgeführt. Der erste Versch war zur Isolierung von Phagenklonen entworfen, die für Apo-2 spezifisch waren und die nicht mit DR4 oder DcR1 kreuzreagierten. Es wurden drei Panning-Runden durchgeführt. Für die erste Runde wurden 10 μl der Phagenbibliothek von Cambridge Antibody Technologies mit 1 ml MPBST (3% Trockenmilchpulver, 1 × PBS, 0,2% TWEEN), das 800 μg CD4-Ig, 300 μg DR4-Ig und 200 μg DcR1-Ig enthielt, 1 Stunde lang auf einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur blockiert (CD4-Ig, DR4 und DcR1 sind in Capon et al., Nature 337, 525 (1989), Pan et al., siehe oben, und Sheridan et al., siehe oben, beschrieben). Biotinyliertes Apo-2-ECD-Immunadhäsin wurde dann in einer Endkonzentration von 100 nM hinzugegeben, und dem Phagen wurde 1 h lange bei 37°C ermöglicht, sich an Antigen zu binden. Inzwischen werden 300 μl von DYNABEADS M-280, beschichtet mit Streptavidin (DYNAL), 3-mal mit 1 ml MPBST (unter Verwendung eines DYNAL Magnetic Particle Concentrators) gewaschen und dann 2 Stunden lang bei 37°C mit 1 ml frischem MPB ST auf einem Rotor blockiert. Die Kügelchen wurden mit dem MPC gewonnen, in 50 μl MPBST resuspendiert und zu Phage-plus-Antigenlösung hinzugefügt. Die Mischung wurde auf einem Rad bei Raumtemperatur 15 min lang fortgesetzt. Die DYNABEADS und der angeheftete Phage wurden dann gewaschen, insgesamt 7-mal: 3-mal mit 1 ml PBS-TWEEN, einmal mit MPBS, gefolgt von dreimal mit PBS.
Der Phage wurde durch 5-minütige Inkubation bei Raumtemperatur mit 300 μl 100 mM Triethylamin aus den Kügelchen eluiert. Der phagenenthaltende Überstand wurde entfernt und mit 150 μl von 1 M Tris-HCl (pH 7,4) neutralisiert. Der neutralisierte Phage wurde dazu verwendet, TG1-Wirtszellen in der Mitte der log-Phase zu infizieren, und auf 2YT-Agar ausplattiert, das mit 2% Glucose und 100 μg/ml Carbenicillin ergänzt war. Nach Wachstum über Nacht bei 30°C wurden die Kolonien in 10 ml 2YT abgeschabt. 50 μl dieser Lösung wurden zum Inokulieren von 25 ml von 2YT mit Carbenicillin und Glucose verwendet und unter Schütteln 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Helferphage M13K07 (Pharmacia) wurde bei einem M. O. I. von 10 hinzugefügt. Nach Adsorption wurden die Zellen pelletiert und in 25 ml von 2YT mit Carbenicillin (100 μg/ml) und Kanamycin (50 μg/ml) resuspendiert, und das Wachstum wurde bei 30°C 4 Stunden lang fortgesetzt. E. coli wurden durch Zentrifugation aus dem Phagen entfernt, und 1 ml dieser Phagen (etwa 10¹² c. f. u.) wurden in nachfolgenden Selektionsrunden verwendet.
Für die zweite Selektionsrunde wurden 1 ml vom geernteten Phagen auf 3% Trockenmilch, 1 × PBS, 0,2% TWEEN angepasst, und dann wurden 100 μg DR4-Ig, 65 μg DcR1-Ig und 500 μg CD4-Ig zum Blockieren hinzugegeben. Zur Selektion wurde biotinyliertes Apo-2 mit 10 nM hinzugegeben. Die Waschstringenz wurde auf zwei Zyklen mit 7 Waschungen erhöht.
Für die dritte Selektionsrunde wurde der Phage nur mit MPBST blockiert. Biotinyliertes Apo-2 wurde auf 1 nM hinzugegeben, und die Waschstringenz wurde auf drei Zyklen mit 7 Waschungen erhöht. In dieser Runde wurden relativ wenige Klone erhalten, deshalb wurde Pan 2B, Runde 3, unter Einsatz von 5 nM biotinyliertem Apo-2 unter allen anderen zuvor erwähnten Bedingungen durchgeführt.
Ein zweiter Panning-Versuch wurde auf ähnliche Weise wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass in den Runden 1 und 2 eine Blockade von Phagenlösungen mit MPBST durchgeführt wurde, das 1,0 mg/ml CD4-Ig (keine anderen Immunadhäsine) enthielt, und Runde 3 wurde nur mit MPBST blockiert. Biotinyliertes Apo-2 wurde mit 200 nM in Runde 1, 60 nM in Runde 2 und 12 nM in Runde 3 hinzugegeben. In jeder Runde wurde der Phage aus den magnetischen Kügelchen mit 300 μl von 100 nM Triethylamin, dann mit 300 μl 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) und dann mit 300 μl Glycin-0,1 M HCl (pH 2,2), das 1 mg/ml BSA enthielt, eluiert. Die Phagen, die von den drei sequentiellen Elutionen erhalten wurden, wurden gepoolt und zur Infektion von Wirtsstamm-TG1 wie oben beschrieben verwendet.
B. ELISA-Screening von ausgewählten Klonen
Nach jeder Selektionsrunde wurden individuelle carbenicillinresistente Kolonien durch ELISA gescreent, um jene zu identifizieren, die Apo-2-Bindungsphagen produzieren. Nur jene Kolonien, die in zwei oder mehreren Testformaten positiv waren, wurden weiter studiert.
Individuelle Klone wurden mit 2% Glucose und 100 μg/ml Carbenicillin in 96-Well-Gewebskulturplatten zu 2TY inokuliert und gezüchtet, bis sie trüb waren. Die Kulturen wurden dann bei einem M. O. I. von 10 mit M12K07-Helferphagen infiziert, und die infizierten Zellen wurden zum Wachstum über Nacht bei 30°C mit leichtem Schütteln auf 2YT-Medium transferiert, das Carbenicillin (100 μg/ml) und Kanamycin (50 μg/ml) enthielt.
NUNC-MAXISORP-Mikrotiterplatten wurden mit 50 μl pro Well von Apo-2-ECD-Immunadhäsin oder CD4-IgG bei 2 μg/ml in 50 mM Carbonatpuffer (pH 9,6) bei 4°C über Nacht beschichtet. Nach Entfernung des Antigens wurden die Platten mit 3% Trockenmilch in PBS (MPBS) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur blockiert.
Phagenkulturen wurden zentrifugiert, und 100 μl von phagenenthaltenden Überständen wurden mit 20 μl von 6 × PBS/18% Trockenmilch 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. Die Blockade wurde aus den Titerplatten entfernt und der blockierte Phage hinzugefügt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur binden gelassen. Nach der Waschung wurde der Phage mit einer 1:5000-Verdünnung von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Anti-M13-Antikörper (Pharmacia) in MPBS gefolgt von 3',3',5',5'-Tetramethylbenzidin (TMB) detektiert. Reaktionen wurden durch die Hinzufügung von H₂SO₄ gestoppt und die Werte abgelesen, indem A_405nm von A_450nm subtrahiert wurde.
C. DNA-Fingerprinting von Klonen

Die Diversität von Apo-2-Bindungsklonen wurde durch PCR-Amplifikation des scFv-Inserts unter Verwendung der Primer pUC19R (5' AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GG 3') (Seq.-ID Nr. 12), der stromauf der Leader-Sequenz anelliert, und fdtetseq (5' GTC GTC TTT CCA GAC GGT AGT 3') (Seq.-ID Nr. 13), der im 5'-Ende von Gen III anelliert, gefolgt von Verdau mit dem häufig schneidenden Restriktionsenyzm BstNI bestimmt.

DNA-Fingerprinting: Protokoll
Gemisch A:	dH20	67 μl
	10 × ampliTaq-Puffer	10
	25 mM MgCl₂	10
	DMSO, 50%	2
	Vorwärtsprimer	1
Gemisch B:	2,5 mM dNTPs	8 μl
	AMPLITAQ	0,5
	Rückwärtsprimer	1,0

90 μl von Gemisch A wurden in ein Reaktionsröhrchen platziert und dann mit einem sehr kleinen Teil einer E.-coli-Kolonie unter Verwendung einer gelben Spitze inokuliert. Das Reaktionsgemisch wurde dann in einem PCR-Block auf 98°C erhitzt, 3 min lang, entfernt und auf Eis platziert. 10 μl von Gemisch B wurden dann hinzugegeben und das Reaktionsgemisch bei 95°C, 30 s, 55°C 30 s, 72°C 1 min 20 s 25 Zyklen lang in einem Perkin-Elmer-2400-Thermozyklierer thermozykliert. 10 μl des resultierenden Reaktionsprodukts wurden dann entfernt und auf einem 1% Agarose-Gel laufen gelassen, um auf eine 1-kb-Bande zu testen. Das übrige Gemisch wurde auf 1 × BstNI-Reaktionspuffer gebracht, 5 Einheiten BstNI wurden hinzugegeben, und die DNA wurde 2 Stunden lang bei 60°C verdauen gelasse n. Die resultierenden Proben wurden dann auf einem GeneGel Excel 12,5% Acrylamidgel (Pharmacia Biotech) Elektrophorese unterworfen.
D. Sequenzierung von Klonen
Es wurde die Nucleotidsequenz von repräsentativen Klonen jedes Fingerprint-Musters erhalten. Die Kolonien wurden in 50 ml LB-Medium inokuliert, das mit 2% Glucose und 100 μg/ml Carbenicillin ergänzt war, und über Nacht bei 30°C gezüchtet. DNA wurde unter Verwendung von Qiagen-Tip-100s und dem Protokoll des Herstellers isoliert und mit fluoreszierenden Didesoxykettenterminatoren (Applied Biosystems) zyklussequenziert. Die Proben wurden auf einem automatisierten Applied-Biosystems-373A-DNA-Sequenzierer laufen gelassen und die Sequenzen unter Verwendung des Programms „Sequencher” (Gene Codes Corporation) analysiert. Die Nucleotidsequenzen von ausgewählten Antikörpern 16E2, 20E6 und 24C4 sind in Seq.-ID Nr. 6, Seq.-ID Nr. 7 bzw. Seq.-ID Nr. 8 (in 15A, 15B bzw. 15C) dargestellt. Die entsprechenden Aminosäuresequenzen von Antikörpern 16E2, 20E6 und 24C4 sind in Seq.-ID Nr. 9, Seq.-ID Nr. 10 bzw. Seq.-ID Nr. 11 (und in 16) dargestellt. Zusätzlich dazu identifiziert 16 die Signalregion und schwer- und leichtkettenkomplementaritätsbestimmenden Regionen (unterstrichen) dieser scFv-Moleküle. Die CDR-Regionen, die in 16 dargestellt sind, wurden gemäß den Verfahren von Kabat et al., „Sequences of Proteins of Immunological Interest”, NIH, Publ. Nr. 91–3242, 5. Auflage, zugeordnet.
E. Reinigung von scFvs mit (his)₆
Zur Proteinreinigung von löslichem Antikörper wurde der E.-coli-Stamm 33D3 mit Phagemid-DNA transformiert. Fünf ml von 2YT mit Carbenicillin und Glucose wurden verwendet, um Übernacht-Kulturen bei 30°C zu züchten. 2,5 ml dieser Kulturen wurden in 250 ml desselben Mediums verdünnt und auf eine OD₆₀₀ von etwa 1,2 gezüchtet. Die Zellen wurden pelletiert und in 500 ml 2YT resuspendiert, das IPTG (1 mM) und Carbenicillin (100 μg/ml) enthielt, um Expression zu induzieren, und weitere 16 Stunden bei 22°C gezüchtet. Zellpellets wurden geerntet und bei –20°C gefroren.
Die Antikörper wurden durch immobilisierte Metallchelataffinitätschromatographie (IMAC) gereinigt. Gefrorene Pellets wurden in 10 ml von eiskaltem Shockate-Puffer (25 mM TRIS-HCl, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl, 20% Saccharose, 1 mM PMSF) durch Schütteln auf Eis 1 Stunde lang resuspendiert. Imidazol wurde auf 20 mM hinzugegeben, und Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt. Die Überstände wurden auf 1 mM MgCl₂ und 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, angepasst. Ni-NTA-Agaroseharz von Qiagen wurde nach den Anweisungen des Herstellers verwendet. Das Harz wurde mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol äquilibriert, und Shockate wurde hinzugegeben. Bindung trat entweder in einem Chargenmodus oder auf einer Schwerkraftdurchflusssäule auf. Das Harz wurde dann zweimal mit 10 Bettvolumina von Äquilibrationspuffer gewaschen und zweimal mit Puffer, der Imidazol enthielt, das auf 50 mM erhöht war. Elution von Proteinen erfolgte mit 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, 500 mM NaCl und 250 mM Imidazol. Überschüssiges Salz und Imidazol wurden auf einer PD-10-Säule (Pharmacia) entfernt, und Proteine wurden unter Verwendung eines Centricom 10 auf ein Volumen von etwa 1 ml eingeengt.
Die Konzentration wurde unter Annahme eines A280 nm von 1,0 = 0,6 mg/ml spektrophotometrisch geschätzt.
F. Tests zur Bestimmung der Bindungsspezifität von Anti-Apo-2-scFvs
Zur Beurteilung der Spezifität jedes der scFv-Klone wurden ELISA-Tests durchgeführt, um die Bindung von 16E2, 20E6 und 24C4 an Apo-2-ECD-Ig, -DR4-Ig, -DcR1-Ig, -DcR2-Ig und -CD4-Ig (wie oben und in Beispiel 12 beschrieben) zu beurteilen.
Kurs gesagt wurden NUNC-ELISA-Platten mit 50 μl eines 1 μg/ml Rezeptor-Ig-Immunadhäsinmoleküls in 0,05 M Natriumkarbonatpuffer, pH 9,5, beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubieren gelassen. Die Platten wurden dann zumindest eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 285 μl ELISA-Verdünnungsmittel blockiert (PBS ergänzt mit 0,5% BSA, 0,05% Tween 20, pH 7,4). 50 μl der scFvs wurden zu den Platten in einer 1:5-Reihenverdünnung hinzugegeben und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Nach dieser 1 Stunde Verdünnung wurden die Platten 6-mal mit PBS/0,05% Tween gewaschen. Nach Bindung an antigenbeschichtete Platten wurde lösliches scFv durch Hinzufügung von 50 μl von 1 μg/ml Mab 9E10 (einem Anti-c-myc-Antikörper, ATCC CRL 1729) pro Well und einstündiges Inkubieren der Platten bei Raumtemperatur detektiert. Nach Waschung der Platten 6-mal mit PBS/0,05% Tween wurden 50 μl einer 1:5000-Verdünnung von meerrettichperoxidasekonjugiertem Anti-Maus-IgG-Antikörper (Cappel-Katalog: 55569) in MPBS zu den Platten hinzugegeben und 1 Stunde lang inkubieren gelassen. Ein zu beobachtendes Signal wurde durch Hinzufügung von 50 μl von 3',3',5',5'-Tetramethylbenzidin-(TMB-)peroxidasesubstrat (KPL-Katalog Nr. 50-76-00) erzeugt. Reaktionen wurden durch die Hinzufügung von H₂SO₄ gestoppt und Werte durch die Subtraktion von A_405nm von A_450nm erhalten.
Wie in den 12A, 12B und 12C veranschaulicht zeigten die ELISA-Tests, dass jeder dieser Antikörper einen relativ hohen Grad an Spezifität für Apo-2 zeigte.
Weitere Tests, die transfizierte Zellen verwendeten, zeigten auch Spezifität von 16E2-Antikörper für Apo-2. Insbesondere wurden Immunhistochemieversuche durchgeführt, um die Bindungsspezifität des 16E2-Antikörpers an Apo-2- und DR4-transfizierte CHO-Zellen zu zeigen. CHO-Zellen wurden mit einem Vektor alleine oder mit einem Vektor transfiziert, der das Gen für Apo-2 oder DR4 enthielt. Die transfizierten Zellen wurden von Kulturplatten entfernt, pelletiert und zweimal mit PBS gewaschen. Die Pellets wurden dann in O. C. T. (Fisher) resuspendiert, in Isopentain und LN₂ blitzgefroren und später unter Verwendung von Standardprotokollen sektioniert. Färbung der sektionierten Zellen wurde unter Verwendung des Vectastain-Elite-ABC-Sets durchgeführt. Die Sektionen wurden entweder mit Anti-Apo-2-Antikörper 16E2 oder einem einkettigen Negativkontroll-Antikörper inkubiert. Der verwendete sekundäre Antikörper war entweder ein biotinylierter Anti-c-myc-9E10-Antikörper oder Anti-penta-His-Antikörper (Qiagen), gefolgt von biotinyliertem Anti-Maus-IgG.
Dieser Immunhistochemietest zeigte spezifische Färbung der Apo-2-transfizierten Zellen, aber nicht der DR4-transfizierten Zellen. Die zelluläre Färbung war hauptsächlich zytoplasmatisch.
BEISPIEL 15
Tests auf die Fähigkeit von His-markierten scFvs, agonistisch Apoptose zu induzieren
A. Annexin-V-Biotip/Streptavidin-[S-35]-96-Well-Tests
Gereinigte scFv-Antikörper (wie in Beispiel 14 oben beschrieben) wurden auf die Fähigkeit, Apo-2-vermittelte Apoptose zu induzieren, getestet.
Kurz gesagt wurden SK-MES-1-Zellen (menschliche Lungenkarzinomzelllinie, ATCC HTB 58) oder HCT-116-Zellen (menschliche Colonkarzinomzelllinie, ATCC CCL 247) (4 × 10⁴ Zellen/Well) in 96-Well-Platten in Testmedium (1:1-Gemisch aus Phenolrotfreiem Dulbecco-Modified-Eagle-Medium und Phenolrot-freiem Harn-F-12-Nährstoffgemisch, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) aliquotiert und über Nacht bei 37°C anheften gelassen. Das Medium wurde dann entfernt, und 0,1 ml Testmedium, das scFv in einer Endkonzentration von 50 μg/ml (16E2 oder 20E6) enthielt, wurde zu den Wells hinzugefügt (Reihenverdünnungen von 1:2, die in den Platten durchgeführt wurden) und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Andere einkettige Antikörper wurden als negative Kontrollen verwendet: ein Antigewebsfaktor-scFv-Klon 7D5 oder ein scFv, das als 1968 bezeichnet wurde. Nach 1 Stunde Inkubation mit scFv-Antikörper wurden 0,1 ml von 10 μg/ml Anti-His (Qiagen, Kat.-Nr. 1007671) oder Anti-c-myc-Antikörper zu den geeigneten Wells hinzugegeben. Wells, die keinen vernetzenden Antikörper erhielten, erhielten das Medium alleine. Die Platten wurden dann 30 min lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Nach der 30-minütigen Inkubation wurden 0,1 ml von 10 μg/ml Ziege-Anti-Maus-IgG (ICN-cst-Nr. 67-029) zu den geeigneten Wells hinzugegeben. Wells, die keinen Anti-IgG-Antikörper erhielten, erhielten das Medium alleine. Die Platten wurden dann 15 min lang in einem Inkubator platziert, um dem pH zu ermöglichen, auf 7,0 zurückzukehren. Für positive Kontrollen wurde eine 2-μg/ml-Lösung von Apo-2-Ligarad (Apo-2L) (wie in Beispiel 11 beschrieben hergestellt) in Kaliumphosphatpuffer bei pH 7,0 zu den geeigneten Wells hinzugegeben, wobei in der Platte 2fache Reihenverdünnungen ausgeführt wurden. Die negativen Kontroll-Wells erhielten nur das Medium. Die Zellen wurden dann über Nacht bei 37°C in Gegenwart von 5% CO₂ inkubiert. 0,05 ml von Annexin-V-Biotin (1 μg/ml) in 2 × Ca²⁺-Bindungspuffer (NeXins B. V.) wurden dann zu den Wells hinzugegeben und dann auf einem Schüttler 30 min lang mischen gelassen. 0,05 ml von Streptavidin-[S-35] (Endkonzentration von 2,5 × 10⁴ cpm/Well)(Amersham) in 2 × Ca²⁺-Bindungspuffer wurden dann zu den Wells hinzugegeben und auf einem Schüttler 20 min lang mischen gelassen. Die Platten wurden dann versiegelt und 4 min lang bei 1500 U/min zentrifugiert. Zur Beurteilung des Ausmaßes der Apoptose wurden die Platten auf einem Trialux-Microbeta-Counter (Wallace) gezählt, um cpm-Werte zu erhalten, die der Annexin-V-Bindung entsprachen.
Wie in 13C und 14B dargestellt, induzierten die 16E2- und 20E6-Antikörper agonistisch Apoptose in SK-MES-1-Zellen.
B. Kristallvioletttests
Zusätzlich zu dem Annexin-V-Biotin/Streptavidin-[S-35]-Test, der oben beschrieben wurde, wurden scFv-Antikörper (wie in Beispiel 14 beschrieben) auf Aktivität getestet, Apo-2-vermittelte Apoptose über Tests zu induzieren, die Kristallviolett verwendeten.
Kurz gesagt, die SK-MES-1-Zellen wurden zu 4 × 10⁴ Zellen/Well in Testmedium (in Abschnitt A oben beschrieben) ausplattiert und über Nacht bei 37°C anheften gelassen. Das Medium wurde entfernt, und 0,1 ml Testmedium, das scFv enthielt (wie in Abschnitt A oben beschrieben), wurde in einer Endkonzentration von 50 μg/ml zu den geeigneten Wells hinzugegeben (Wells ohne hinzugefügtem scFv erhalten eine Medienänderung). Ausgewählte Wells erhielten „vorkomplexierte” Proben, in welchen 10 μg/ml scFv 16E2 mit 100 μg/ml Anti-His-Antikörper 5 Stunden lang bei 4°C mit kontinuierlicher Mischung vor Hinzufügung zur Platte kombiniert wurden. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen.
Das scFv-Medium wurde entfernt, und 0,1 ml von 10 μg/ml Anti-His (Qiagen, Kat.-Nr. 1007671) oder Anti-c-myc-Antikbrper, die in Testmedium verdünnt wurden, wurden zu den Wells hinzugegeben (Wells ohne Vernetzer enthalten eine Medienänderung). Die Platten wurden dann 30 min lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen.
Das Medium wurde dann entfernt, und 0,1 ml von 10 μg/ml Ziegen-Anti-Maus-IgG (Fc-Fragment-spezifisch, ICN-cst.-Nr. 67-029), verdünnt in Testmedium, wurde zu den geeigneten Wells hinzugegeben (Wells ohne Anti-Fc erhalten eine Medienänderung). Die Platten wurden dann 15 min lang in den Inkubator platziert, um dem pH zu ermöglichen, wieder auf 7,0 zurückzukehren.
Apo-2L (Stammlösung mit 100 μg/ml in Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0) wurde auf 2 μg/ml verdünnt, und 0,1 ml wurden zu den geeigneten Wells hinzugegeben. Serielle 2fach-Verdünnungen wurden auf der Platte durchgeführt. Die Platten wurden dann über Nacht bei 37°C inkubiert.
Das gesamte Medium wurde von den Wells entfernt, und die Platten wurden dann mit Kristallviolettlösung geflutet. Die Platten wurden 15 min lang färben gelassen. Das Kristallviolett wurde durch Fluten der Platten mit fließendem Leitungswasser entfernt. Die Platten wurden dann über Nacht trocknen gelassen.
Die Platten wurden auf einem SLT-Plattenlesegerät bei 540 nm abgelesen und die Daten unter Verwendung eines Excel-Makro und 4p-fit analysiert.
Wie in 13A, 13B, 14A und 14B dargestellt, induzierten die 16E2- und 20E6-Antikörper agonistisch Apoptose in SK-MES-1-Zellen.
BEISPIEL 16
Tests auf die Fähigkeit von gD-markierten scFvs, agonistisch Apoptose zu induzieren
Eine gereinigte gD-markierte Form von 16E2-scFv wurde in einem Kristallvioletttest wie in Beispiel 15 oben beschrieben auf die Fähigkeit getestet, Apo-2-vermittelte Apoptose zu induzieren.
A. Herstellung von scFv mit gD-Markierung
Das Sfi-l-zu-Not-1-Fragment der scFv-Form von 16E2 wurde in ein Derivat von pAK19 subkloniert (Carter et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 3, 183–192 (1991)), das den phoA-Promotor und die stlI-Signalsequenz anstelle eines lacZ-Promotors und einer Hybridsignalsequenz der ursprünglichen Bibliothek enthält. Zur leichteren Reinigung wurden ein DNA-Fragment, das für 12 Aminosäuren (met-ala-asp-pro-asn-arg-phe-arg-gly-lys-asp-leu, Seq.-ID Nr. 14) kodiert, das vom Herpes-simplex-Virus-Typ-1-Glykoprotein-D stammt (Lasky et al., DNA 3, 23–29 (1984)), synthetisch hergestellt und am 3'-Ende der VL-Domäne anstelle des (his)₆- und c-myc-Epitops insertiert, die ursprünglich in den Klonen der Bibliotheken von Cambridge Antibody Technologies gegenwärtig sind.
B. Expression in E. coli
Das Plasmid, welches das Gen für scFv-16E2-gD enthielt, wurde in E.-coli-Stamm 33D3 zur Expression in Schüttelkolbenkulturen transformiert. 5 ml von 2YT mit Carbenicillin und Glucose wurden dazu verwendet, bei 30°C Übernacht-Kulturen zu züchten. 2,5 ml dieser Kulturen wurden in 250 ml desselben Mediums verdünnt und auf OD₆₀₀ von etwa 1,0 gezüchtet. Die Zellen wurden pelletiert und in 500 ml von Modified-AP-5-Minimai-Medium resuspendiert, das Carbenicillin enthielt (100 μg/ml), und weitere 16 Stunden lang bei 30°C gezüchtet. Die Zellen wurden dann pelletiert und gefroren.
C. Reinigung von scFv mit gD-Markierung
Gefrorene Zellpaste wurde bei 1 gm/10 ml von Shockate-Puffer (25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl, 20% Saccharose, 1 mM PMSF, pH 7,2) resuspendiert und 4 Stunden auf Eis sanft geschüttelt. Die Zellsuspension wurde dann durch einen Polytron-Microverflüssiger (Brinkman) verarbeitet. Zelltrümmer wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 10.000 × g entfernt. Nach Filtration durch einen 0,22-μm-Filter wurde der Überstand auf eine Affinitätssäule geladen (2,5 × 9,0 cm), die aus einem Anti-gD-Antikörper 5B6 besteht (Paborsky et al., Protein Engineering 3, 547–553 (1990)), gebunden an CNBr-Sepharose, die mit PBS äquilibriert worden ist. Die Säule wurde dann 18 Stunden lang mit PBS gewaschen, bis die Absorption des Säulenausflusses mit der Grundlinie äquivalent war. Alle Schritte wurden bei 4°C bei einer linearen Durchflussgeschwindigkeit von 25 cm/Stunde durchgeführt. Elution wurde mit 0,1 M Essigsäure, 0,5 M NaCl, pH 2,9, durchgeführt. Säulenfraktionen wurden durch Absorption bei 280 nm überwacht, und es wurden Peakfraktionen gepoolt, mit 1,0 M Tris, pH 8,0, neutralisiert, gegen PBS dialysiert und sterilfiltriert. Die resultierenden Proteinformulierungen wurden durch nicht-reduzierende SDS-PAGE analysiert.
D. Kristallvioletttest
Der Apoptosetest wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 15(B) oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass Proben hintereinander in den Platten 1:3 verdünnt wurden, und der gD-markierte 16E2-Antikörper wurde zusätzlich zu zwei anderen Formulierungen von 16E2-scFv getestet (in 14C als Form. A und Form. B bezeichnet). Die Ergebnisse des Tests, die Apoptoseinduktion in SK-MES-1-Zellen durch 16E2-gD-Antikörper zeigen, sind in 14C veranschaulicht.
Hinterlegung von Material
Die folgenden Materialien sind bei der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, USA (ATCC), hinterlegt worden.

Material ATCC-Hinterlegungsnummer Hinterlegungsdatum

pRK5-Apo-2 209021 8. Mai 1997

3F11.39.7 HB-12456 13. Jänner 1998
Die Hinterlegung erfolgte gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags betreffend die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und die zugrundeliegenden Regelungen (Budapester Vertrag). Dies sichert die Aufrechterhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung für einen Zeitraum von 30 Jahren ab dem Datum der Hinterlegung. Die Hinterlegung wird von der ATCC unter den Bedingungen des Budapester Vertrages verfügbar gemacht und unterliegt einem Abkommen zwischen Genentech, Inc., und ATCC, das die permanente und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung gegenüber der Öffentlichkeit nach Veröffentlichung eines passenden US-Patents oder nach Offenlegung einer beliebigen US-Patentanmeldung oder einer Patentanmeldung eines anderen Landes gegenüber der Öffentlichkeit sichert, abhängig davon, was zuerst eintritt, und sichert die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für eine Person, die vom Präsidenten des Patentamtes der Vereinigten Staaten als anspruchsberechtigte Person gemäß 35 USC § 122 und den darauf anzuwendenden Regelungen des Präsidenten (einschließlich 37 CFR § 1.14 mit besonderem Verweis auf 886 OG 638) bestimmt wird.
Der Zessionar der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass bei Meldung die Materialien sofort durch andere desselben Materials ersetzt werden, wenn eine Kultur der Materialien bei der Hinterlegung getötet, verloren oder zerstört wird. Die Verfügbarkeit des hinterlegten Materials ist nicht als Lizenz zur Umsetzung der Erfindung entgegen den Rechten, die unter der Amtsgewalt einer beliebigen Regierung gemäß ihrer Patentrechte erteilt werden, anzusehen.
Die vorangegangene schriftliche Beschreibung wird als ausreichend empfunden, um einem Fachmann die Umsetzung der Erfindung zu ermöglichen. Die vorliegende Erfindung soll durch das hinterlegte Konstrukt im Schutzumfang nicht eingeschränkt sein, da die hinterlegte Ausführungsform als einzelne Veranschaulichung bestimmter Aspekte der Erfindung gedacht ist. Die Hinterlegung des hierin angeführten Materials ist kein Eingeständnis, dass die hierin angeführte schriftliche Beschreibung unpassend ist, um die Umsetzung eines beliebigen Aspekts der Erfindung, einschließlich ihres besten Modus, zu ermöglichen, noch soll sie den Schutzumfang der Ansprüche auf die spezifischen Veranschaulichungen, die sie repräsentiert, einschränken. Tatsächlich werden Fachleuten aus der vorangegangenen Beschreibung verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den angeführten und hierin beschriebenen offensichtlich sein.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Monoklonaler Antikörper, der (a) sich an Apo-2-Polypeptid bindet, das aus Aminosäureresten 1 bis 411 der Seq.-ID Nr. 1 besteht, und (b) in zumindest einem Typ von Säugetierzelle, die das Apo-2-Polypeptid exprimiert, in vivo oder ex vivo Apoptose induziert.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, der sich an eine extrazelluläre Domänensequenz eines Apo-2-Polypeptids bindet, die aus Aminosäuren 54 bis 182 der Seq.-ID Nr. 1 besteht.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, der sich an eine extrazelluläre Domänensequenz eines Apo-2-Polypeptids bindet, die aus Aminosäuren 1 bis 182 der Seq.-ID Nr. 1 besteht.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, der (a) sich an eine extrazelluläre Domänensequenz des Apo-2-Polypeptids bindet, die aus Aminosäuren 54 bis 182 der Seq.-ID Nr. 1 besteht, und (b) in zumindest einem Typ von Säugetierkrebszelle in vivo oder ex vivo Apoptose induziert.
Monoklonaler Antikörper nach einem beliebigen der vorangegangenen Ansprüche, worin der Antikörper ein chimärer Antikörper ist.
Monoklonaler Antiköper nach Anspruch 5, worin der Antikörper an eine heterologe Aminosäuresequenz fusioniert ist.
Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.
Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Antikörper ein menschlicher Antikörper ist.
Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der zumindest eine Typ von Säugetierzelle eine Krebszelle ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfasst.
Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur therapeutischen Verwendung.
Verwendung eines Apo-2-Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Medikaments zur Induktion von Apoptose in Säugetierzellen, die Apo-2-Rezeptor exprimieren.
Verwendung eines Apo-2-Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs.
In-vitro-Verfahren zur Induktion von Apoptose in Säugetierzellen, die Apo-2-Rezeptor exprimieren, umfassend die Exposition von Säugetierzellen, die Apo-2-Rezeptor exprimieren, gegenüber einem Apo-2-Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Säugetierzellen, die Apo-2-Rezeptor exprimieren, Krebszellen sind.