KR20210074341A - 고밀도 생물 반응기 배양에서 막 기체 전달을 위한 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 단클론 항체 또는 이중특이성 항체의 생산을 위한 개선된 생물 반응기, 예를 들면, 유가식 또는 관류 생물 반응기 세포 배양 시스템을 사용하는 세포 배양을 위한 개선된 생물 공정 시스템 및 생물 공정 방법으로서, 스파저- 또는 마이크로스파저-기반 폭기 시스템 대신에 하나 이상의 막 기체 전달 모듈을 포함하도록 개질되어, 세포가 버블 분출 관련 세포 사멸을 겪지 않고, 심지어 높은 세포 밀도에서도, 생물 반응기 세포 배양에서 중요 기체들의 수준들, 예를 들면, 용존 O₂ 수준 및 CO₂ 수준을 보다 우수하게 조절하는, 상기 시스템 및 방법을 제공한다.

Description

고밀도 생물 반응기 배양에서 막 기체 전달을 위한 방법

본 발명은 일반적으로, 생물 공정 분야, 예를 들면, 단클론 항체 또는 이중특이성 항체 또는 기타 관심 단백질의 생물 반응기 세포 배양 생산 분야에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 고밀도 세포 배양을 달성하기 위해 생물 반응기 세포 배양 조건을 개선하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 생물 반응기 세포 배양에서 개선된 기체 교환 조건을 달성하여 세포 배양 밀도 및 생성물 역가를 증가시키기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.

최근의 기술 개발로 인해 세포 배양이 매우 높은 세포 밀도를 달성할 수 있게 되었으며, 이는 예를 들면 단클론 항체 또는 이중특이성 항체와 같은 생물학적 제제(biologic)의 높은 생산성을 가져온다.[1] 그러나, 이러한 생물 공정에서 용존 산소(DO)를 제어하는 것은, 고밀도 배양물을 지원하기 위한 높은 수준의 산소 및 이산화탄소의 전달을 필요로 하기 때문에 여전히 어려운 과제이다. 높은 수준의 기체 전달을 달성하기 위해, 마이크론 크기의 버블이 반응기 내로 방출되는 마이크로스파징(microsparging)과 같은 방법이 사용된다.[2] 그러나, 마이크로스파징의 사용은 버블 분출 관련 세포 사멸 및 생물 반응기의 포움 발생(foam-out) 위험을 증가시켜, 조기 런 종료 및 생성물의 손실로 이어질 수 있다.[3,4] 또한, 포움 발생 및 버블 분출(bubble-burst) 관련 세포 사멸을 방지하기 위한 소포제 및 전단 보호제의 추가는, 극단적인 경우, 세포에 대해 독성일 수 있는 수준으로 추가해야 한다.[5]

마이크로스파징과 관련된 과제를 제거하기 위해, 다공성 및 비-다공성 막을 사용하는 버블 없는 통기법이 세포 배양 응용 분야에 대해 조사되었다. 예를 들면, 마이크론 크기의 공극이 있는 중합체 다공성 막은 버블 없는 통기법으로 설명되어 있으며, 여기서, 배양과 기체 사이의 압력의 균형은 버블 없는 전달이 막의 공극을 통해 기체-액체 계면에서 이루어지게 한다.[6 내지 8] 또 다른 예에서, 소수성 막(공극 습윤화 문제를 방지함)의 사용은, 공극 내에 포획된 액체가 배양물로의 기체 전달에 대한 추가의 장벽을 생성하기 때문에, 친수성 막에 비해 더 향상된 기체 전달을 보여주었다.[9] 비-다공성 실리콘 중합체 기반 막(예를 들면, 폴리디메틸실록산, PDMS)도 버블 없는 기체 전달에 사용되어 왔으며, 여기서, 기체 분자는 치밀한 중합체를 통해 확산되어 막-배양 접촉 표면에서 배양으로 전달된다.[10 내지 12]

다공성 막과 비-다공성 막이 세포 배양에 적용되었지만, 막 디자인의 한계 및 막 작동과 관련된 과제로 인해, 낮은 밀도(즉, <20e6cell/mL)만 달성되었다.[13] 예를 들면, 다공성 막의 경우, 기체 압력과 배양 압력이 서로 부적절하게 균형을 이루는 경우에 나타날 수 있는 마이크론 크기의 버블이 형성되기 때문에, 세포 배양이 손상될 수 있다. 반대로, 비-다공성 막의 경우, 통과하는 기체 분자의 물질 전달이 느려 고밀도 배양을 지원하기에 충분한 기체 교환을 방해한다.

고밀도 세포 배양에서의 스파징 기반 기체 교환 과정과 관련된 많은 문제점들을 극복하기 위해, 버블 없는 기체 교환을 위한 대체 방법 및 재료가 필요하다.

일반적으로, 본 발명은 생물 반응기, 및 생물 반응기를 사용하는 생물 공정 방법에 관한 것이다. 본 발명은 부분적으로, 고밀도 세포 배양 생물 반응기의 (예를 들면, 산소화 및/또는 세포 배양물 내로의 기체의 도입에 사용되는) 스파저를 하나 이상의 중공 섬유 막 모듈로 대체함으로써, 작동 동안 배양물 활력에 심각한 영향을 미치지 않고, 높은 세포 밀도(예를 들면, 적어도 120X10⁶cell/mL)에서 지속되는 용존 산소 수준(예를 들면, 60% DO)이 달성될 수 있다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 그 결과, 생물 공정에 사용되는 세포는 공정 전반에 걸쳐 생존 가능한 상태로 유지되므로, 생물 반응기의 생산성이 증가된다.

일 측면에서, 본 발명은, 생물 반응기에서 세포를 배양하는 방법으로서, 생물 반응기 내부에 버블을 발생시키기 않고 생물 반응기로/생물 반응기로부터 기체의 물질 전달을 제공하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명의 생물 반응기는 관류 생물 반응기이다. 본 발명의 생물 반응기는 유가식 생물 반응기일 수도 있다.

특정 양태에서, 생물 반응기로의/생물 반응기로부터의 기체의 물질 전달은 기체 전달 모듈에 의해 제공된다. 다양한 양태에서, 기체 전달 모듈은 비-다공성 막을 포함하며, 상기 비-다공성 막은 예를 들면, 중합체, 금속 또는 세라믹일 수 있다. 중합체는 실리콘 검 단독 중합체, 폴리디메틸실록산(PDMS) 또는 실리콘-폴리카보네이트 공중합체를 포함할 수 있다. 다양한 양태에서, 비-다공성 막은 복수의 중공 섬유들을 포함한다.

다양한 양태에서, 본 발명의 기체 전달 모듈은 하나 이상의 기체를 통과시키기 위한 중공 섬유들을 통하는 제1 유동 경로 및 세포 배양 배지 및/또는 세포들을 유동시키기 위한 중공 섬유들 주위의 제2 유동 경로를 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명의 기체 전달 모듈은 생물 반응기의 외부에 위치한다.

특정 양태에서, 본 발명의 복수의 중공 섬유들은 배양 배지 및 세포들이 중공 섬유들을 분리하는 공간들을 통해 주행(travel)하는 유동 경로를 제공한다. 본 발명의 공간은 균질하거나 불균질할 수 있다. 본 발명의 공간들은 세포에 대한 전단력을 일으키지 않고 세포가 통과하기에 충분한 크기일 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 공간들은 약 15 내지 약 2,000㎛의 거리를 포함한다. 다른 특정 양태에서, 본 발명의 공간들은 15 내지 30㎛, 20 내지 40㎛, 30 내지 60㎛, 40 내지 80㎛, 60 내지 120㎛, 80 내지 160㎛, 100 내지 200㎛, 150 내지 300㎛, 200 내지 400㎛, 200 내지 500㎛, 200 내지 600㎛, 200 내지 700㎛, 200 내지 800㎛, 200 내지 900㎛, 200 내지 1,000㎛ 또는 500 내지 2,000㎛의 거리, 또는 이들 거리의 조합을 포함한다.

다양한 양태에서, 세포 배양 배지 및/또는 세포의 유동은 접선 유동, 축 유동 또는 이들 유동의 조합을 포함한다. 세포 배양 배지 및/또는 세포의 유동은 상기 세포에 대한 전단력을 유발하지 않으면서 배양 균질성을 유지하기에 충분한 속도일 수 있다.

다양한 양태에서, 본 발명의 기체는 이산화탄소, 산소 또는 질소 또는 다른 기체 또는 심지어 공기일 수 있다.

다양한 양태에서, 본 발명의 생물 반응기의 세포 밀도는 약 20x10⁶cell/ml, 약 30x10⁶cell/ml, 약 40x10⁶cell/ml, 약 50x10⁶cell/ml, 약 60x10⁶cell/ml, 약 70x10⁶cell/ml, 약 80x10⁶cell/ml, 약 90x10⁶cell/ml, 약 100x10⁶cell/ml, 약 110x10⁶cell/ml, 약 120x10⁶cell/ml, 약 130x10⁶cell/ml, 약 140x10⁶cell/ml, 약 150x10⁶cell/ml, 약 160x10⁶cell/ml, 약 170x10⁶cell/ml, 약 180x10⁶cell/ml, 약 190x10⁶cell/ml, 약 200x10⁶cell/ml, 약 210x10⁶cell/ml, 약 220x10⁶cell/ml, 약 230x10⁶cell/ml, 약 240x10⁶cell/ml 또는 약 250x10⁶cell/ml이다.

다양한 양태에서, 본 발명의 방법은 포움 생성을 방지하고/방지하거나 세포 배양 동안 소포제를 필요로 하지 않는다.

다른 양태에서, 본 발명의 생물 반응기는 헤드스페이스를 포함하지 않거나 헤드스페이스를 실질적으로 포함하지 않는다.

다양한 양태에서, 본 발명의 생물 반응기는 둘 이상의 기체 전달 모듈들을 포함한다. 본 발명의 둘 이상의 기체 전달 모듈들은 산소, 이산화탄소 또는 질소 기체를 포함하는 다양한 기체 및 심지어 공기의 물질 전달을 제공할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은, 고밀도 세포 배양용 생물 반응기 시스템으로서, 세포 배양 배지에서 세포를 성장시키기 위한 생물 반응기 용기 및 상기 생물 반응기 용기와 유체 통신(fluid communication)하는 액체 유동 경로를 포함하고, 상기 액체 유동 경로는 상기 생물 반응기 용기의 외부에, 제1 막 기체 전달 모듈 및 제2 막 기체 전달 모듈을 통하여 세포 배양 배지를 전위(translocating)시키기 위한 회로를 형성하는, 생물 반응기 시스템을 제공한다.

다양한 양태에서, 본 발명의 제1 막 기체 전달 모듈은, 본 발명의 세포 배양 배지에 산소를 첨가하기 위한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명의 제2 막 기체 전달 모듈은, 본 발명의 세포 배양 배지로부터 이산화탄소를 스트리핑(stripping)하기 위한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 제1 막 기체 전달 모듈은 산소 유동 경로 및 세포 배양 배지 유동 경로를 포함하고, 상기 기체 유동 경로와 세포 배양 유동 경로는 기체 투과성 막에 의해 분리된다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 제1 막 기체 전달 모듈은 공기/이산화탄소 유동 경로 및 세포 배양 배지 유동 경로를 포함하고, 상기 공기/이산화탄소 유동 경로와 세포 배양 유동 경로는 기체 투과성 막에 의해 분리된다.

본원에 기술된 생물 반응기의 액체 유동 경로는 하나 이상의 추가의 요소(element)를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 요소는 세포 수확 필터, 관류 펌프, 산소 공급원, 공기/이산화탄소 공급원, 산소 센서 및/또는 pH 센서를 포함할 수 있다.

본원에 기술된 생물 반응기의 다양한 양태에서, 고밀도 세포 배양의 세포 밀도는 약 20x10⁶cell/ml, 약 30x10⁶cell/ml, 약 40x10⁶cell/ml, 약 50x10⁶cell/ml, 약 60x10⁶cell/ml, 약 70x10⁶cell/ml, 약 80x10⁶cell/ml, 약 90x10⁶cell/ml, 약 100x10⁶cell/ml, 약 110x10⁶cell/ml, 약 120x10⁶cell/ml, 약 130x10⁶cell/ml, 약 140x10⁶cell/ml, 약 150x10⁶cell/ml, 약 160x10⁶cell/ml, 약 170x10⁶cell/ml, 약 180x10⁶cell/ml, 약 190x10⁶cell/ml, 약 200x10⁶cell/ml, 약 210x10⁶cell/ml, 약 220x10⁶cell/ml, 약 230x10⁶cell/ml, 약 240x10⁶cell/ml 또는 약 250x10⁶cell/ml이다.

다양한 양태에서, 본 발명의 제1 막 기체 전달 모듈 및 제2 막 기체 전달 모듈은, 버블을 형성하지 않으면서 본 발명의 세포 배양 배지로/본 발명의 세포 배양 배지로부터 기체를 첨가하고/첨가하거나 제거한다.

본원 명세서의 하나 이상의 양태들의 세부 사항은 하기 설명에서 설명된다. 본원 명세서의 다른 특징적인 구성 또는 이점은 이하의 도면 및 여러 양태들의 상세한 설명, 또한 첨부되는 청구범위로부터 명백해질 것이다.

이하의 도면들은 본 발명의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 측면들을 추가로 입증하기 위해 포함되며, 이러한 도면들 중 하나 이상을 참조하여 본원에 제시된 특정 양태들의 상세한 설명과 함께 보다 더 잘 이해될 수 있다.
도 1a는 세포 배양(103)으로 기체 전달하기 위한 스파저(또는 마이크로스파저)(106) 및 산소/공기/이산화탄소 또는 기타 기체(110)의 공급원을 포함하는 당업계에 공지된 생물 반응기(100)의 개략도를 제공한다. 최신 기술의 생물 반응기(100)는 기체 전달 과정 동안 버블 또는 마이크로버블(107)을 형성 또는 생성하며, 이는 배양 세포에 대해 해로우며 포움을 형성할 수 있어, 낮은 세포 밀도 및/또는 세포 배양 생성물 수율을 초래할 수 있다.
도 1b는 본원에 개시된 생물 반응기의 양태의 개략도를 도시한다. 상기 양태에서, 개선된 생물 반응기(300)는 하나 이상의 외부에 위치한 막 기체 전달 모듈(309)을 포함하며, 상기 모듈은 펌프(312)에 의해 일련의 생물 반응기로부터의/반응기로의 유동 경로(314)를 따라 세포 배양물이 공급된다. 제1 막 기체 전달 모듈(309b)은 기체 유입구(310b) 및 기체 배출부(311b)를 갖는다. 제2 막 기체 전달 모듈(309a)도 기체 유입구(310a) 및 기체 배출부(311a)를 갖는다. 펌프(312)는, 세포 배양을, 생물 반응기(300)로부터 유동 경로(314)(즉, 재순환 루프)를 따라 제1 막 기체 전달 모듈(309b)을 통한 다음 제2 막 기체 전달 모듈(309a)을 통해 이동시켜, 세포 배양이 기체와 상호 작용하고 막 모듈을 통해 유동할 수 있게 하며, 기체는 기체 유입구에서 유입되고 유출구 포트에서 배출된다. 기체는 모듈의 기체 투과성 막을 통과하여 세포 배양과 상호 작용하며, 상기 모듈은 기체 유동 구역을 세포 배양 유동 경로로부터 분리한다. 모듈은 버블의 발생 없이 생물 반응기 세포 배양으로부터 특정 기체(예를 들면, 산소)를 첨가하고/첨가하거나 다른 기체(예를 들면, CO₂)를 제거할 수 있게 한다. 유동 경로(314)를 따라 모듈에 의해 처리된 세포 배양은 생물 반응기(300)로 되돌려진다. 도 1b에 도시된 정밀한 구성은 본 발명에서 고려되는 다른 사용 가능한 구성을 제한하고자 하는 것이 아니다. 막에 대한 O₂, CO₂, N₂, 공기 또는 기타 기체 유동을 블렌딩하여 용존 O₂ 및 CO₂를 생물 반응기에서 바람직한 농도로 유지하기 위해 컴퓨터 컨트롤러를 포함할 수 있다.
도 1c는, 펌프(415), 필터(410), 및 고밀도 배양을 위한 마이크로스파저를 대체하는 버블 없는 막 기체 전달 모듈(412)을 포함하는 TFF 재순환 루프(409 및 411)가 있는 일반적인 2리터(2L) 작업 용적 유리 교반 탱크 생물 반응기 시스템(400)을 도시한다. 컴퓨터 컨트롤러(405 및 407)는 용액 중에 용존 O₂를 유지하기 위해 막(412)으로의 O₂ 기체 유동(401)을 조절한다. 이산화탄소 유동(402) 및 공기 유동(403)은 성장 용기(408)에 직접 공급될 수 있다. pH 센서(404)는 CO₂ 유동과 통신하며, CO₂ 유동은 세포 배양의 pH 수준을 조절한다. 작동시, 세포 배양은 관류 펌프(415)에 의해 유동 1(409)에 의해 제거되고, 필터(410)(TFF 모듈)를 통해 공급되고, 임의로 수확된다. 유동의 일부는 필터(410)를 빠져나가 유동 2(411)를 통해 세포 배양 용기로 되돌려질 수 있다. 유동의 제2 부분은 필터(410)를 빠져나가 막 기체 전달 모듈(412)로 들어갈 수 있으며, 이는 산소 유동(401)과의 상호 작용에 의해 산소화될 수 있고, 공기(403)와 임의로 블렌딩될 수 있다. 이산화탄소는 배출부(414)를 통해 스트리핑될 수 있다. 이산화탄소는 헤드스페이스 배출부(413)를 통해 방출될 수도 있다.
도 1d는, TFF 재순환 루프(509 및 511 유동 경로), TFF 필터(510), 펌프(515), 및 버블의 추가 없이 고밀도 세포 배양으로부터 기체를 첨가하고 빼기 위한 일련의 막 기체 전달 모듈(512a 및 512b)을 포함하는 2리터(2L) 버블 없는 고밀도 생물 반응기 시스템(500)을 도시한다. 제1 모듈(512a)은 세포 배양 배지를 산소화하여, 지속되는 용존 산소("DO") 함량 또는 바람직한 농도를 유지하는 기능을 한다. 제1 모듈(512a)은 산소(503)의 유동에 의해 공급된다. 세포 배양의 산소 수준은 용존 산소 센서(505)에 의해 계측된다. 제2 막 기체 전달 모듈(512b)은 세포 배양으로부터 이산화탄소를 스트리핑하는 기능을 한다. 제2 막 기체 전달 모듈(512b)은 공기의 유동(501)(이산화탄소의 스트리핑에 필요한 질소 기체를 함유함) 및 이산화탄소의 유동(502)에 의해 공급된다. 이후, 501 및 502의 유동 수준은 pH 센서(504) 및 컴퓨터(506)에 의해 제어된다.
도 1e는, 본 발명의 개선된 생물 반응기와 관련하여 사용될 수 있는 막 기체 전달 모듈(600)의 일반화된 개략도를 도시한다. 일반적이지만 비제한적인 구성으로서, 본 발명의 막 모듈은 기체 투과성 중공 섬유 튜브(609)의 중공 섬유 번들(601)을 포함할 수 있으며, 상기 튜브들은 포팅 또는 씰(603)(도시되지 않음)로 함께 고정된 후 하우징 또는 쉘(605)(도시되지 않음) 내부에 넣어지고 각각의 단부에 유입구 캡(604)으로 피팅되어, 각각의 중공 섬유의 내부를 통해 하나 이상의 기체의 유동이 도입되게 한다. 하우징은 세포 배양물의 유동 경로를 위한 하나 이상의 유입구/유출구 포트(605 및 608)도 포함할 수 있으며, 상기 경로는 하나의 포트로 들어가, 중공 섬유를 둘러싼 공간에서 하우징을 통해 유동한 다음 유출구 포트 밖으로 빠져나간다. 하우징은, 각각의 기체 투과성 중공 섬유 튜브의 내부 루멘을 통한 하나 이상의 기체의 유동을 위한 하나 이상의 유입구/유출구 포트(606 및 607)도 포함할 수 있다. 실제로, 세포 배양물의 유동 경로는 하우징 상의 유입구(605) 내로 펌핑되고 중공 섬유 번들의 각각의 중공 섬유 주위의 외부 공간을 통해 하우징을 통해 유동하고 유출구 포트(608)를 통해 배출된다. 동시에 하우징 내부에서는, 세포 배양은 중공 섬유 번들의 기체 투과성 막과 접촉하며, 상기 막은 루멘 공간에서 하나 이상의 기체의 유동을 운반한다. 사용시, 기체의 "공급" 혼합물은 유입구 포트를 통해 들어가 중공 섬유(609)의 내부 내로 유동할 수 있다. 기체는 중공 섬유의 내부로부터 기체 투과성 막 벽(610)을 통해 세포 배양 유동 경로(중공 섬유에 대해 외부에 있음) 내로 전달된다. 막을 통과하는 기체는 "투과물"이고, 중공 섬유 내부에 남아있는 기체는 "보유물"이다.
도 2는 본원에 기술된 개선된 생물 반응기와 관련하여 사용될 수 있는 막 기체 전달 모듈(800)의 양태를 도시한다. 본 발명의 모듈은 세포 배양 배지를 수용하기 위한 "쉘 사이드 인(shell side in)" 유입구(801)를 포함하며, 이는 중공 섬유 번들의 중공 섬유 각각을 둘러싸는 공간에서 하우징 또는 쉘 전체를 가로지른다. 배양 배지는 결국 "쉘 사이드 아웃(shell side out)" 유출구 포트(802)를 통해 하우징을 빠져나간다. 상기 예에서, 2개의 유출구 포트가 있지만; 그러나 임의의 수의 유출구 포트를 사용할 수 있다. 본 발명의 모듈은 하나 이상의 기체 또는 기체 혼합물을 수용하기 위한 하나 이상의 "튜브(루멘) 사이드 인" 유입구 포트(804)도 포함하며, 상기 포트는 중공 섬유 번들의 각각의 중공 섬유의 루멘 또는 내부 공간으로 들어간다. 이후, 기체는 중공 섬유의 길이를 가로질러 하나 이상의 "튜브(루멘) 사이드 아웃" 유출구 포트(803)를 빠져나간다. 이러한 구성은 중공 섬유의 루멘의 내부 공간에 있는 "기체 유동 구역" 및 쉘 또는 하우스 내부로 국한되지만 중공 섬유의 외부에 있는 공간인 "배지 또는 세포 배양 유동 구역" 둘 다를 확립한다. 기체 유동 구역의 기체는 막을 투과하여 배지 유동 구역 내로 전달될 수 있다. 다르게는, 용존 기체(예를 들면, CO₂)는 중공 섬유 막을 투과하여 기체 유동 구역 내로 전달되고 기체 유출구 포트를 통해 "배출" 상태로 모듈을 빠져나갈 수 있다.
도 3a, 3b 및 3c는 일반적인 막 기체 전달 모듈에서의 기체의 유동 경로("*"로 표시된 화살표) 및 세포 배양 배지의 유동 경로("**"로 표시된 화살표)의 다양한 구성을 도시한다. "x"로 표시된 포트는 차단된다. 기체 전달 효율은, 동일한 유속이 주어진 도 3a 및 도 3b의 구성에 비해 도 3c의 구성에서 가장 높다. 도 3d에 나타낸 표는 기체 전달에 대해 표면적이 2,500cm²인 막 기체 전달 모듈을 통한 산소 전달에 대해 계측된 kLa(액상 물질 전달 계수)의 예를 제공한다. 유동 경로의 제한인 도 3a 및 도 3c는 0.5LPM(1분당 리터) 초과의 유동을 달성하는 능력을 방해한다. 보다 더 큰 생물 반응기 및 보다 더 작은 생물 반응기를 지원하기 위한 상이한 kLa에 대해 다른 막 크기를 사용할 수 있다.
도 4a 내지 4c는, 예를 들면 도 1b, 도 1c 또는 도 1d의 생물 반응기 시스템을 사용하여, 마이크로스파저를 대체하는 막 기체 교환에 의해 정상 내지 비정상 상태 작동에서 배양된 전용 CHO 세포주(CHO1)의 생존 세포 밀도(VCD), 생존률 및 LDH를 도시한다. 도 4a는, 스파저를 사용하는 관류 배양에서 40e6cell/mL의 정상 상태 VCD가 달성되었음을 도시한다. 정상 상태 작동 4일 후, 반응기들 중 하나의 마이크로스파저를 끄고 막을 통해 O₂를 첨가하여, 설정점(*)에서 필요한 DO(용존 산소)를 지속하고 정상 상태에서 3일 동안 작동했다. 정상 상태 작동 후, 세포 방출이 낮아졌고(**), 막을 통해 공급된 O₂를 사용하여 DO를 제어하여 120e6cell의 밀도를 달성했다. 도 4b는 막 및 통상적인 스파징을 사용하는 생존률(%)이 배양 과정 동안 유사하다는 것을 도시한다. 도 4c는, 막 기체 교환에 의해 작동되는 생물 반응기의 LDH(락테이트 데하이드로게나제 활성 검정)가 통상적인 스파징으로 작동되는 생물 반응기의 LDH와 일치함을 도시한다. 13일 후 막 배양에 대한 LDH의 증가는 증가된 세포 밀도에 기인할 수 있다.
도 5a 내지 5c는, 예를 들면 도 1b, 도 1c 또는 도 1d의 생물 반응기 시스템을 사용하여 정상 상태 및 비정상 상태 작동 동안 막 기체 교환으로 배양하는 동안의 DO(용존 산소) 수준을 도시한다. 도 5a는 정상 상태 밀도로 램프-업(ramp-up)하는 동안 수립되는 기저선 DO 프로파일을 도시한다. 마이크로스파징은 1 내지 2일(*)에 개시되었고, 2 내지 3일에 40e6cell/mL의 밀도가 달성되었을 때 안정화되었다. 도 5b는 O₂ 라인이 7일(*)에 막으로 전환되었음을 도시한다. 변동은 게인 및 적분(* 내지 **)을 조정하여 제어했고, 0.5LPM O₂가 아닌 공기(0.25LPM)와 O₂(0.25LPM)의 혼합물의 천공 구멍 스파저를 통한 스파징은, 막이 배양에 대해 매우 많은 산소를 제공하므로(**), DO의 변동이 더욱 안정화되었다. 도 5c는 세포 방출이 11일에 감소되었고 밀도가 120e6cell/mL로 증가되었음을 도시한다. DO의 변동은 섬유 및 기체 유출구 벤트 필터의 습윤화로 인해 발생되었을 수 있으며, 이로 인해 작동 동안 기체 전달이 차단 및 손실될 수 있다.
도 6a 내지 6c는, 예를 들면 도 1b, 도 1c 또는 도 1d의 생물 반응기 시스템을 사용하여 높은 세포 밀도로 램프-업되는 동안 배양되는 CHO1 세포의 VCD(생존 세포 밀도), 생존률 및 LDH(락테이트 데하이드로게나제 활성 검정)를 도시한다. 도 6a는, 전통적인 스파징으로 높은 세포 밀도로 램프-업되는 동안 ~130e6cell/mL의 밀도에 도달하는 반면, 막 기체 교환으로는 ~100X106cell/mL의 밀도에 도달함을 도시한다. 막으로부터의 전단은 높은 밀도로의 램프-업 동안 배양물 활력에 영향을 미칠 수 있다. 도 6b는, 배양 과정 동안 세포가 막 및 스파저 통기 둘 다에 대해 유사한 생존률(>85%)을 가짐을 도시한다. 도 6c는, LDH가 막 기체 교환 및 통상적인 스파징 둘 다에서 비슷하다는 것을 도시한다. 더 높은 LDH는, 더 높은 세포 밀도로 인해 통상적인 스파징을 사용하는 배양에 대해 예상되며, 이는 막 교환기가 작동 동안 세포에 대해 전단 및 손상을 일으킬 수 있음을 나타낸다.
도 7a 내지 7c는, 도 1b, 도 1c 또는 도 1d의 생물 반응기 시스템을 사용하여 높은 세포 밀도로 램프-업되는 동안의 DO의 제어를 도시한다. 도 7a는 초기에 DO가 천공 구멍 스파저를 통한 스파징으로 제어됨을 도시한다. 밀도가 증가하면 추가의 O₂가 막을 통해 전송되어 DO를 60%(*)로 유지한다. MFC 기능 정지로 인해 막 시작 단계에서 DO를 제어하는 데 폭넓은 변동 및 문제가 발생되었다. 제어가 MFC로 복원되면, DO는 설정점 주변에서 변동하여 결국 6 내지 7일에 약 80e6cell/mL의 세포 밀도에서 정상 작동에 도달했다. 도 7b는, 피크 밀도에서, 막을 통한 DO의 제어가 안정적으로 유지되었고 몇 가지 변동이 일시적인 MFC 기능 정지 동안 발생했음을 도시한다. 도 7c는 전체 배양 기간 동안 오프라인으로 모니터링된 일일 pO₂ 판독값을 도시하며, 스파징 또는 막 기체 교환에 의해 제어된 배양물에서와 비슷한 수준의 용존 산소를 보여준다.
도 8a 내지 8c는, 예를 들면 도 1b, 도 1c 또는 도 1d의 생물 반응기 시스템을 사용하여 버블 없는 통기에 대해 막으로 작동되는 생물 반응기에서 배양된 CHO2 세포의 VCD(생존 세포 밀도), 생존률 및 LDH(락테이트 데하이드로게나제 활성 검정)를 도시한다. 도 8a는 배양에서 25 내지 30e6cell/mL의 생존 세포 밀도가 수 주 동안 달성되었음을 도시한다. 막 배양은 정상 상태 작동 밀도에 도달하는 데 추가의 일(day)이 걸렸으며, 이는 막이 배양물 활력에 대해 약간의 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다. 도 8b는, 막 배양물의 생존률이 통상적인 스파징보다는 약간 낮았지만, 세포에 대한 막의 효과를 추가로 나타내는 것을 도시한다. 도 8c는, 막 배양의 LDH가 버블-스파징된 생물 반응기보다 높았음을 도시하며, 이는 현재의 막 유닛 디자인에서 치밀하게 패킹된 섬유로 인해 세포 전단 및 용해가 발생할 수 있음을 나타낸다.
도 9a 및 9b는, 예를 들면 도 1b, 도 1c 또는 도 1d의 생물 반응기 시스템을 사용하여 실리콘 기반 막을 통한 버블 없는 기체 교환에 의한 DO(용존 산소)의 제어를 도시한다. 도 9a는 25 내지 30e6cell/mL의 CHO2 밀도를 지원하는 배양 동안 약 60%의 제어된 DO를 도시한다. 7일에는 높은 세포 밀도(*)에서의 산소 요구량을 지원하기 위해 재순환을 증가시켰다. 9일에는 DO의 변동(**)을 보다 더 잘 제어하기 위해 제어를 수동으로 전환했다. 도 9b는 전체 배양 기간 동안 오프라인으로 모니터링된 일일 pO₂ 및 pCO₂ 판독값을 도시하며, 스파징 또는 막 기체 교환에 의해 제어된 배양물에서 비슷한 수준의 용존 산소를 보여준다. 6일의 pCO₂의 증가는 막 둘 다에 대한 100% 순수 O₂ 유동 때문일 가능성이 높다. 높은 pCO₂를 해결하기 위해, 공기가 제1 스파저를 통해 O₂와 혼합되었고, pCO₂는 스파저 배양물과 비슷한 수준으로 되돌려졌다.
도 10은, 도 1a의 최신 기술의 생물 반응기에 비하여 65L의 물로 충전된 100L 용적으로 구성된 도 1b, 도 1c 또는 도 1d의 생물 반응기 시스템을 사용한 O₂ 전달에 대한 초기 시험을 도시한다. 빌트-인 스파저 시스템에 비해 막 기반 생물 반응기에서 보다 더 빠른 기체 전달이 관찰되었다.
도 11은, 도 3b에 도시된 유동 경로에서와 유사한 유속 런을 달성하기 위해, 도 3c에 도시된 유동 경로의 경우 펌프 속도가 더 높다는 것을 도시하며, 이는 유동 경로 C의 제한을 나타낸다(상단 그래프). 이러한 제한으로 인해 유동 경로 C에서 보다 더 높은 압력이 관찰된다(하단 그래프).

산소 공급은, 에너지 합성 동안의 1차 전자 수용체이기 때문에 세포 호기성 대사 과정의 핵심 요소이다. 용존 산소의 효율적인 공급의 보장은, 특히 상업적 생산 시나리오, 예를 들면, 단클론 항체 또는 이중특이성 항체의 임상 생산에서 일반적인 고밀도 세포 배양 생물 공정을 위한 세포 배양 생물 반응기의 작동이 직면하는 가장 큰 과제이다. 세포에 산소를 공급하는 것 이외에도 용존 이산화탄소의 농도도 제어되는 변수의 역할을 한다.

생물 반응기의 헤드스페이스 폭기 및 폭기 링을 통한 기체의 직접 주입의 두 가지의 통상적인 폭기 방법이 있다. 이러한 장치들은 기체 개방 공극 크기에 따라 "스파저" 또는 "마이크로스파저"로 보다 일반적으로 알려져 있다. 천공 구멍 또는 개방 파이프 스파저를 포함하는 스파저는 일반적으로, 예를 들면, 0.8mm의 기체 유출구 개구를 갖는 반면, 일반적으로 소결된 플라스틱 또는 금속으로 제조된 마이크로스파저는, 예를 들면, 15 내지 45㎛의 공극 크기를 갖는다. 두 종류 모두 구체적인 이점과 단점이 있다. 스파저는 보다 더 큰 버블을 생성하며, 이는 동일한 "산소 전달 속도"를 달성하기 위해 보다 더 높은 기체 쓰루풋(throughput) 속도를 필요로 한다. 그러나, 스파저는 버블이 세포 배양을 통과할 때 세포에 대한 전단력을 도입하여 버블 유발 세포 독성을 유발할 수 있다. 그러나, 스파저의 한 가지 이점은 보다 더 큰 크기의 버블로 인해 CO₂를 스트리핑하거나 소출(sweeping out)하는 데 적합하다는 것이다. 마이크로스파저는 주로 세포 배양물 내로 도입된 버블의 크기를 감소시켜 배양물에 대한 기체 전달을 개선하기 위해 개발되었다. 그러나, 마이크로스파저는 세포 배양물 내의 단백질과 상호 작용하는 마이크로버블의 결과로 포움을 생성하는 경향이 있으며, 이는 조기 런 종료 및 생성물의 손실을 초래할 수 있다. 스파저와 유사하게, 마이크로스파저에 의해 생성된 마이크로버블도 배양 중인 세포에 대한 전단력을 유발한다. 특히, 이러한 전단력은 세포 근처에의 버블 분출로 인해 막 손상 및 세포 사멸을 초래할 수 있다.

본 발명은 부분적으로, 고밀도 세포 배양 생물 반응기의 맥락에서 스파저 또는 마이크로스파저를 하나 이상의 중공 섬유 막 모듈로 대체함으로써, 작동 동안 배양물 활력에 대해 심각한 영향을 미치지 않고 높은 세포 밀도에서 용존 산소의 지속된 수준을 달성할 수 있다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은, 개선된 생물 반응기, 예를 들면, 단클론 항체 또는 이중특이성 항체의 생산을 위한 유가식 또는 관류 생물 반응기 세포 배양 시스템을 사용하는 세포 배양을 위한 개선된 생물 공정 시스템 및 생물 공정 방법에 관한 것으로서, 스파저- 또는 마이크로스파저-기반 폭기 시스템 대신에 하나 이상의 막 기체 전달 모듈을 포함하여, 세포가 전단 및 버블 분출 관련 세포 사멸을 겪지 않고, 심지어 높은 세포 밀도에서도, 생물 반응기 세포 배양에서 중요 기체들의 수준을, 예를 들면, 용존 O₂ 수준 및 CO₂ 수준을 보다 더 잘 조절하도록 개질된다. 비제한적 측면 및 양태는 본원의 실시예 및 도면 및 하기 설명에 제공된다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 다음 참고 문헌들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에게 본 발명에 사용되는 많은 용어의 일반적인 정의를 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2d ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991); and Lackie et al., The Dictionary of Cell & Molecular Biology (3d ed. 1999); and Cellular and Molecular Immunology, Eds. Abbas, Lichtman and Pober, 2nd Edition, W.B. Saunders Company. 본 발명의 목적을 위해, 다음 용어들이 추가로 정의된다.

본원 및 청구범위에서 사용되는 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 단수 및 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "제제"에 대한 언급은 단일 제제 및 복수의 이러한 제제를 포함한다.

본원 및 특히 청구범위 및/또는 단락에서, "포함하다(comprise)", "포함되는(comprised)", "포함하는(comprising)" 등과 같은 용어는 미국 특허법에 기인한 의미를 가질 수 있음, 예를 들면, "포함하다(incluide)", "포함되는(included)", "포함하는(including)" 등을 의미할 수 있음에 유의하며; "본질적으로 구성되다" 및 "본질적으로 구성되는"과 같은 용어는 미국 특허법에서 정의된 의미를 가지며, 예를 들면, 명시적으로 언급되지 않은 요소를 허용하지만 선행 기술에서 발견되었거나 본 발명의 기본 또는 새로운 특성에 영향을 미치는 요소는 제외한다.

"아포 관련 단백질 획득"에서와 같은 용어 "획득"은 아포 관련 단백질(또는 지시된 물질 또는 재료)을 구매, 합성 또는 다르게는 획득함을 포함하고자 한다.

"단리된 세포"는 다른 성분으로부터 단리된 세포 및/또는 조직 또는 포유 동물에서 단리된 세포를 천연적으로 동반하는 세포를 나타낸다.

본원에 사용되는 "샘플"은 생물학적 재료, 예를 들면 (이에 제한되지는 않음) 생물 반응기 세포 배양 샘플을 포함하는 조성물을 나타낸다.

"세포 배양" 또는 "배양"은 다세포 유기체 또는 조직 외부의 세포의 성장 및 증식을 의미한다. 포유 동물 세포에 적합한 배양 조건은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992)] 참조. 포유 동물 세포는 현탁액에서 또는 고체 기질에 부착된 상태에서 배양될 수 있다. 마이크로캐리어가 있거나 없는 유동층 생물 반응기, 중공 섬유 생물 반응기, 롤러 병, 진탕 플라스크 또는 교반 탱크 생물 반응기가 사용될 수 있다. 일 양태에서, 500 내지 2,000L 생물 반응기가 사용된다. 바람직한 양태에서, 1,000L 내지 2,000L 생물 반응기가 사용된다. 본 발명의 목적을 위해, 세포 배양 배지는 시험관내 세포 배양에서 포유 동물 세포와 같은 동물 세포의 성장에 적합한 배지이다. 세포 배양 배지 제형은 당업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로 세포 배양 배지는 완충액, 염, 탄수화물, 아미노산, 비타민 및 미량 필수 원소로 구성된다. "무혈청"은 소 태아 혈청과 같은 동물 혈청을 함유하지 않는 세포 배양 배지에 적용된다. 한정된 배양 배지를 포함하는 다양한 조직 배양 배지가 상업적으로 입수 가능하며, 예를 들면, 다음의 세포 배양 배지들 중 어느 하나 또는 조합이 사용될 수 있다: 다른 것들 중 RPMI-1640 배지, RPMI-1641 배지, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지 Eagle, F-12K 배지, 함(Ham) F12 배지, 이스코브(Iscove) 변형 둘베코 배지, 맥코이(McCoy) 5A 배지, 레보비츠(Leibovitz) L-15 배지, 무혈청 배지, 예를 들면, EX-CELL™ 300 시리즈(JRH Biosciences, Lenexa, Kansas). 이러한 배양 배지들의 무혈청 버전도 사용할 수 있다. 세포 배양 배지는 배양되는 세포의 요구 사항 및/또는 원하는 세포 배양 파라미터에 따라, 추가의 또는 증가된 농도의 성분, 예를 들면, 아미노산, 염, 당, 비타민, 호르몬, 성장 인자, 완충액, 항생제, 지질, 미량 원소 등으로 보충될 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "저밀도 세포 배양"은 세포 농도가 1ml당 20x10⁶cell 미만인 세포 배양을 나타낸다.

본원에 사용되는 어구 "고밀도 세포 배양"은 세포 농도가 1ml당 20x10⁶cell 이상인 세포 배양을 나타낸다. 고밀도 세포 배양은, 농도가 1ml당 약 25x10⁶cell, 1ml당 약 35x10⁶cell, 1ml당 약 45x10⁶cell, 1ml당 약 55x10⁶cell, 1ml당 약 65x10⁶cell, 1ml당 약 75x10⁶cell, 1ml당 약 85x10⁶cell, 1ml당 약 95x10⁶cell, 1ml당 약 100x10⁶cell, 1ml당 약 110x10⁶cell, 1ml당 약 120x10⁶cell, 1ml당 약 130x10⁶cell, 1ml당 약 140x10⁶cell, 1ml당 약 150x10⁶cell, 1ml당 약 160x10⁶cell, 1ml당 약 170x10⁶cell, 1ml당 약 180x10⁶cell, 1ml당 약 190x10⁶cell, 1ml당 약 200x10⁶cell, 1ml당 약 210x10⁶cell, 1ml당 약 220x10⁶cell, 1ml당 약 230x10⁶cell, 1ml당 약 240x10⁶cell, 1ml당 약 250x10⁶cell, 1ml당 약 260x10⁶cell, 1ml당 약 270x10⁶cell, 1ml당 약 280x10⁶cell, 1ml당 약 290x10⁶cell 및 1ml당 약 300x10⁶cell인 세포 배양을 포함한다.

생물 반응기

본원에 기술되는 개선된 생물 반응기는 공지된 생물 반응기 시스템, 특히 배양 폭기를 수행하기 위한 스파저 또는 마이크로스파저 시스템을 포함하는 생물 반응기로부터 유래할 수 있다. 생물 반응기는 일반적으로 생물 공정에 사용된다. 본원에 사용되는 "생물 반응기"는 생물학적 활성 환경을 지원하는 임의의 제작되거나 공작된 장치 또는 시스템을 나타낼 수 있다. 하나의 경우에, 생물 반응기는 유기체 또는 이러한 유기체로부터 유래된 생화학적 활성 물질을 포함하는 화학 공정이 수행되는 용기이다. 이 과정은 호기성 또는 혐기성일 수 있다. 이러한 생물 반응기는 일반적으로 리터에서 입방 미터에 이르는 크기의 원통형이며, 종종 스테인리스 강 또는 기타 재료로 만들어진다. 생물 반응기는 또한, 원하는 생물학적으로 생산된 생성물, 예를 들면, 단클론 항체 또는 이중특이성 항체를 생산하는 것을 목표로 종종 세포 배양의 맥락에서 세포 또는 조직을 성장시키기 위한 장치 또는 시스템을 의미할 수 있다. "생물 공정"은 성장 배지 내의 세포를 포함하는 호기성 및 혐기성 과정을 나타내며, 상기 세포는 (자연적으로 또는 유전 공학을 통해) 하나 이상의 유용한 생물학적 생성물 또는 예를 들면, 단클론 항체, 이중특이성 항체 및 효소를 포함하는 물질을 생성한다. 생물 공정의 예는 효모 발효, 박테리아 발효, 포유 동물 세포 배양, 박테리아 배양 및 세포를 사용하는, 예를 들면 단백질, 예를 들면 치료 단백질 또는 효소를 발현시키기 위한 CHO 세포와 같은 포유 동물 세포를 사용하는 생성물의 생성을 포함한다.

생물 반응기는 일반적으로 생물 공정이 수행되는 용기, 및 공정의 파라미터를 모니터링 및 제어할 수 있게 하는 센서 및 공정 제어를 포함한다. 생물 반응기는 또한 일반적으로 생물 공정 동안 용기 내용물을 혼합하는 진탕기, 예를 들면, Rushton 또는 마린 임펠러를 포함한다. 일반적으로 생물 공정 동안 공정 파라미터, 예를 들면, 기체 유속, 온도, pH, 용존 산소 수준, 진탕 속도 및 조건을 신중하게 제어하는 것이 중요하다. 용존 산소 수준은 기체상으로부터 액상으로의 산소 전달의 계측값으로, 많은 생물 공정에서 중요하며 달성하기 어려울 수 있다. 산소 전달은 일반적으로 진탕에 의해 도움을 받지만, 진탕 속도는 종종 전력 소비 및 경우에 따라 미생물에 대한 손상 위험에 의해 제한된다. 일부 경우, 예를 들면, 포유 동물 세포의 경우, 미생물은 취약하고, 열, 전단 및/또는 기타 공정 조건에 민감할 수 있다.

본원에서 사용되는 생물 반응기는 영구적(예를 들면, 스테인리스 강 또는 유리 생물 반응기) 또는 일회용(예를 들면, 플라스틱 플라스크 또는 백)일 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 반응기의 예는, 요동, 흔들림 동작 또는 교반에 의해 혼합될 수 있는 교반 탱크 용기, 공수(airlift) 용기 및 일회용 백을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 일회용 (생물) 반응기는, 상대적으로 낮은 투자 비용이 필요하고 운영 유연성이 우수하고 처리 시간이 짧으며 공정에 대해 쉽게 구성할 수 있기 때문에 유리하기 때문에 사용된다. 일회용 (생물) 반응기는 상업적으로 입수 가능하다.

본 발명에서 사용될 수 있는 생물 반응기는 관심 있는 생물 공정의 유형에 따라 선택될 수도 있다. 예를 들면, 포유 동물 세포 생물 공정은 일반적으로 배취 배양, 유가식 배양 및 관류 배양의 세 가지 주요 형식에서 발생한다. 배취 배양은, 짧은 시간 동안 고정된 용적의 배양 배지에서 세포를 성장시킨 후 완전히 수확하는 불연속적인 방법이다. 배취 방법을 사용하여 성장된 배양물은 최대 세포 밀도에 도달할 때까지 세포 밀도가 증가된 다음, 배지 성분이 소비되고 대사 부산물(예를 들면, 락테이트 및 암모니아) 수준이 축적됨에 따라 생존 세포 밀도가 감소된다. 수확은 일반적으로 최대 세포 밀도가 달성되는 시점에 발생한다(예를 들면, 배지 제형, 세포주 등에 따라 일반적으로 5 내지 10x10⁶cell/mL). 배취 생물 공정은 가장 간단한 배양 방법이지만, 생존 세포 밀도가 영양분 가용성에 의해 제한되어, 세포가 최대 밀도에 도달하면 배양이 감소되고 생산이 감소된다. 폐기물 생성물의 축적과 및 영양분 고갈로 인해 배양이 빠르게 감소되기 때문에(예를 들면, 일반적으로 약 3 내지 7일), 생산 단계를 연장할 수 있는 능력이 없다. 유가식 배양은 소비된 배지 구성 요소를 보충하기 위해 볼루스 또는 연속 배지 공급물을 제공함으로써 배취 공정을 개선한다. 유가식 배양은 런 내내 추가의 영양분을 수용하기 때문에, 배취 방법과 비교할 때 보다 더 높은 세포 밀도(>20x10⁶cell/ml, 배지 제형, 세포주 등에 따름) 및 증가된 생성물 역가를 달성할 가능성이 있다.

배취 가공과 달리, 2상(biphasic) 배양은, 중단된 기간 또는 느린 세포 성장 기간(생산 단계)으로부터 원하는 세포 밀도(성장 단계)를 달성하기 위한 세포 증식 기간을 구별하기 위해, 공급 전략 및 배지 제형을 조작함으로써 생산되고 유지될 수 있다. 따라서, 유가식 배양은 배취 배양에 비해 더 높은 생성물 역가를 달성할 가능성이 있다. 일반적으로 배취 방법은 성장 단계에 사용되고, 유가식 방법은 생산 단계 동안 사용되지만, 유가식 공급 전략은 전체 공정에서 사용될 수 있다. 그러나, 배취 공정과 달리, 생물 반응기 용적은 공급의 양을 제한하는 제한 요소이다. 또한 배취 방법과 마찬가지로, 대사 부산물 축적은 배양 감소로 이어져 생산 단계의 기간을 약 1.5 내지 3주로 제한한다. 유가식 배양은 불연속적이며, 수확은 일반적으로 대사 부산물 수준 또는 배양 생존률이 미리 측정된 수준에 도달할 때 발생한다.

관류 방법은 새로운 배지를 첨가하고 동시에 사용된 배지를 제거함으로써, 배취 및 유가식 방법에 비해 유망한 개선을 제공한다. 일반적인 대규모 상업적 세포 배양 전략은 높은 세포 밀도(20e106cell/mL 초과)에 도달하기 위해 노력하며, 이때 반응기 용적의 거의 1/3 내지 절반 초과가 바이오매스이다. 관류 배양으로 >1x10⁸cell/mL의 극단적인 세포 밀도가 달성되었으며 보다 더 높은 밀도가 예측된다. 일반적인 관류 배양물은 1 내지 2일 동안 지속되는 배취 배양 시작으로 개시되어, 배양의 성장 및 생산 단계 전반에 걸쳐 새로운 공급 배지를 배양에 지속적, 단계식 및/또는 간헐적으로 추가하고, 세포의 유지로 소비된 배지 및 추가의 고분자량 화합물, 예를 들면, 단백질(필터 분자량 컷오프에 따름)을 동시에 제거한다. 다양한 방법, 예를 들면, 침전, 원심 분리 또는 여과를 사용하여 세포 밀도를 유지하는 동시에 소비된 배지를 제거할 수 있다. 1일 작업 용적의 일부 내지 1일 작업 용적의 수 배의 관류 유속이 보고되어 있다.

관류 방법의 이점은 생산 배양이 배취식 또는 유가식 배양 방법보다 더 긴 기간 동안 유지될 수 있다는 것이다. 그러나, 특히 높은 세포 밀도로 장기 관류 배양을 지원하기 위해서는 증가된 배지의 제조, 사용, 보관 및 폐기를 필요로 하고, 더 많은 영양분도 필요로 하며, 이 모든 것이 배취식 및 유가식 방법에 비해 생산 비용을 훨씬 더 높게 만든다. 또한, 더 높은 세포 밀도는 생산 동안의 문제, 예를 들면, 용존 산소 수준의 유지, 더 많은 산소의 공급 및 더 많은 이산화탄소의 제거를 포함하는 증가된 기체 발생(gassing)의 문제를 일으킬 수 있으며, 이로 인해 더 많은 포움이 발생하고 소포제 전략을 변경할 필요가 있으며, 또한 수확 및 다운스트림 처리 동안 과도한 세포 물질을 제거하는 데 필요한 노력으로 인해 생성물이 손실될 수 있고, 증가된 세포 질량으로 인해 증가된 역가의 이익이 무효화될 수 있다.

본 발명은, 스파저/마이크로스파저가 본원에 기재된 하나 이상의 막 기체 전달 모듈로 대체된, 상기 나타낸 임의의 유형의 생물 반응기를 포함하는 개선된 생물 반응기에 관한 것이다. 본 발명은 부분적으로는, 고밀도 세포 배양 생물 반응기의 맥락에서 스파저 또는 마이크로스파저를 생물 반응기 자체 내부의 또는 외부의 하나 이상의 중공 섬유 막 모듈로 대체함으로써, 작동 동안 배양물 활력에 심각한 영향을 미치지 않고 높은 세포 밀도에서 지속적인 용존 산소 수준이 달성된다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은, 개선된 생물 반응기, 예를 들면, 단클론 항체 또는 이중특이성 항체를 생산하기 위한 유가식 또는 관류 생물 반응기 세포 배양 시스템을 사용하는 세포 배양을 위한 개선된 생물 공정 시스템 및 생물 공정 방법으로서, 스파저- 또는 마이크로스파저-기반 폭기 시스템 대신에 하나 이상의 막 기체 전달 모듈을 포함하여, 세포가 버블 분출 관련 세포 사멸을 겪지 않고, 심지어 높은 세포 밀도에서도, 생물 반응기 세포 배양에서 중요 기체들의 수준을, 예를 들면, 용존 O₂ 수준 및 용존 CO₂ 수준을 더 잘 조절하도록 개질된 시스템 및 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 본 발명의 생물 반응기는 생물 공정이 발생하는 용기를 포함할 수 있다. 용기, 예를 들면, 도 1a의 용기(101) 또는 도 1b의 용기(302)는 일반적으로 오토 클레이브 가능하고 불활성인 재료, 예를 들면, 유리, 플라스틱 또는 스테인리스 강으로 되어 있으며, 자켓팅될 수 있거나 자켓팅되지 않을 수 있다. 일부 경우에, 용기는 비교적 작은 용적, 예를 들면, 약 0.5L, 1L, 2L, 4L, 10L, 20L, 40L 또는 100L 미만일 수 있다. 경우에 따라, 용기는 비교적 큰 용적, 예를 들면, 100L, 200L, 300L, 500L, 1,000L, 5,000L, 10,000L 또는 30,000L 초과일 수 있다. 적합한 저용적 용기의 총 용량은 예를 들면, 약 0.5 내지 5L, 예를 들면, 0.5L, 1L, 2L, 4L, 10L, 20L, 40L 또는 50L일 수 있다. 예를 들면, 용기의 총 용량은 75L, 150L, 300L, 500L, 1,000L, 1,500L, 3,000L 또는 5,000L일 수 있다. 용기의 종횡비(직경:높이)는 예를 들면, 약 0.5:1 내지 약 4:1 또는 약 0.5:1 내지 2:1, 예를 들면, 약 0.5:1 내지 1:1인 것이 바람직할 수 있다. 본 발명은 임의의 적합한 생물 반응기 용적 또는 종횡비의 사용을 고려하며, 이는 상기 나타낸 것들로 제한되지 않는다.

샤프트(예를 들면, 도 1a의 샤프트(104))가 용기 내로 연장되고, 임펠러(예를 들면, 도 1a의 임펠러(104))가 샤프트의 원위 단부에 마운팅된다. 하기에 상세히 논의되는 바와 같이, 임펠러는 임펠러를 둘러싼 화살표로 표시되는 바와 같이 용기 내의 액체(예를 들면, 세포 배양 배지)에 순환 유동을 생성한다. 일반적으로, 샤프트는 모터로 구동된다.

생물 반응기는 펌프, 대체 성장 배지용 컨테이너, 영양분용 컨테이너, 수집 또는 수확 모듈(예를 들면, 도 1b의 수확 모듈(313)) 및 기체 공급원 또는 다수의 기체 공급원 및 적절한 밸빙, 튜빙 및 혼합 장치를 포함하는 임의의 다른 바람직한 생물 반응기 구성 요소 및 피처(feature)를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 생물 반응기는 이들 파라미터를 모니터링하기 위한 용존 산소 프로브, 용존 이산화탄소 프로브, pH 프로브 및 산화환원(ORP) 프로브(도 1c 및 1d 참조), 및 용기 내용물을 샘플링 또는 수확하기 위한 샘플링 프로브를 포함할 수 있다. 휘발물의 응축을 위한 응축기가 제공될 수도 있다.

본원에서 고려되는 생물 반응기는 일반적으로, 다양한 모니터링 장치(예를 들면, 도 1c 및 1d에 도시된 프로브)로부터 신호를 수신하고 이러한 데이터에 기초하여 공정 파라미터를 조정함으로써 공정 파라미터를 제어하도록 구성된 컨트롤러를 포함한다. 컨트롤러는 예를 들면, 오퍼레이터 인터페이스가 있는 프로그래밍 가능한 로직 컨트롤러(PLC)일 수 있다. 컨트롤러는 임의로 여러 용기를 제어하도록 구성될 수 있다.

일부 구현에서, 기체 전달은 임펠러의 샤프트를 통해 이루어진다. 예를 들면, 샤프트는 기체가 전달되는 보어 및 기체가 용기 내로 빠져나가는 하나 이상의 오리피스를 포함할 수 있다.

본원에서 고려되는 생물 반응기는 생물 공정을 향상시키기 위한 다수의 기타 피처도 포함할 수 있다. 예를 들면, 용기는 원하는 공정 온도를 유지하기 위해 예를 들면, 워터 재킷 또는 기타 냉각/가열 시스템으로 냉각(또는 가열)될 수 있다. 용기는, 성장 용기의 외부에 구성되거나 성장 용기 내에 배치된 것을 포함하는 임의의 적절한 가열 시스템으로 가열될 수도 있다. 포움 탐지기가 제공될 수 있으며, 과도한 포움 생성시 소포제를 용기에 전달하기 위한 소포제 전달 시스템이 포함될 수 있다. 일부 구현에서, 생물 반응기는 예를 들면, 자동 스팀 주입 시스템으로 제자리에서 살균될 수 있다. 다양한 접근 포트가 용기에 제공될 수 있다.

본원에서 고려되는 생물 반응기는 하나 이상의 막 기체 전달 모듈도 포함할 수 있으며, 상기 모듈은 생물 반응기 용기 내에 위치할 수 있거나 용기 외부에 위치할 수 있지만, 세포 배양 배지의 유동 경로와 통신한다. 예를 들면, 도 1b의 유동 경로(314)는 기체 교환을 위한 2-모듈 시스템(309a 및 309b)을 제공한다. 양태가 도 1b에 도시된다.

도 1b는 본원에 개시된 생물 반응기의 양태의 개략도를 도시한다. 상기 양태에서, 개선된 생물 반응기(300)는 외부에 위치한 하나 이상의 막 기체 전달 모듈(309)을 포함하며, 상기 모듈은 펌프(312)에 의해 일련의 생물 반응기로부터의/반응기로의 유동 경로(314)를 따라 세포 배양물이 공급된다. 제1 막 기체 전달 모듈(309b)은 기체 유입구(310b) 및 기체 배출부(311b)를 갖는다. 제2 막 기체 전달 모듈(309a)도 기체 유입구(310a) 및 기체 배출부(311a)를 갖는다. 펌프(312)는, 세포 배양을, 생물 반응기(300)로부터 유동 경로(314)(즉, 재순환 루프)를 따라 제1 막 기체 전달 모듈(309b)을 통한 다음 제2 막 기체 전달 모듈(309a)을 통해 이동시켜, 세포 배양물이 기체 유입구에서 도입되고 유출구 포트를 빠져나가는 막 모듈을 통해 유동하는 기체와 상호 작용할 수 있게 한다. 기체는, 기체 유동 구역을 세포 배양 유동 경로로부터 분리하는 모듈의 기체 투과성 막을 통과하여 세포 배양물과 상호 작용한다. 이러한 모듈은, 버블 발생 없이 특정 기체(예를 들면, 산소)를 첨가할 수 있고/있거나 생물 반응기 세포 배양물로부터 다른 기체(예를 들면, CO₂)를 제거할 수 있다. 유동 경로(314)를 따라 모듈에 의해 처리된 세포 배양물은 생물 반응기(300)로 되돌려진다. 도 1b에 도시된 정밀한 구성은 본 발명에서 고려되는 다른 사용 가능한 구성을 제한하고자 하는 것이 아니다. 막으로의 O₂ 기체 유동 및 CO₂ 기체 유동을 조절하여 용존 O₂ 및 CO₂를 생물 반응기에서 바람직한 농도로 유지하기 위한 컴퓨터 컨트롤러를 포함할 수 있다.

작동 동안, 온도는 세포 배양물 활력을 유지하는 데 중요한 요소일 수도 있다. 온도는 상이한 생물학적 재료들이 상이한 온도에서 최적으로 작동하기 때문에 배양물 및 발현되는 생성물의 특성에 따른다 온도는 생물 반응기 작동 동안 약간 달라질 수 있다. 온도는 약 -5 내지 120℃, -5 내지 0℃, 약 0 내지 100℃, 약 0 내지 50℃, 약 0 내지 20℃, 약 20 내지 120℃, 약 50 내지 120℃, 약 90 내지 120℃, 약 10 내지 45℃, 약 10 내지 35℃, 약 10 내지 25℃, 약 20 내지 55℃, 약 30 내지 55℃, 약 40 내지 55℃, 약 15 내지 45℃, 약 17 내지 42℃, 약 20 내지 40℃, 약 20 내지 30℃ 또는 약 30 내지 40℃일 수 있고, 약 -5℃, 0℃, 5℃, 10℃, 15℃, 17℃, 20℃, 25℃, 28℃, 30℃, 35℃, 37℃, 40℃, 42℃, 45℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 90℃, 100℃, 110℃ 또는 120℃일 수 있다.

생물 반응기의 세포는 적절한 세포 밀도로 성장할 수 있다. 본원에서 사용되는 "세포 밀도"는 주어진 용적의 배양 배지 내의 세포의 수를 나타낸다. "생존 세포 밀도"는 표준 생존률 검정(예를 들면, 트립판 블루 염료 배제 방법)에 의해 측정되는, 주어진 용적의 배양 배지 내의 살아있는 세포의 수를 나타낸다. 트립판 블루 염료 배제 시험은 세포 현탁액에 존재하는 생존 세포의 수를 측정하기 위해 사용된다. 이것은 살아있는 세포가 트립판 블루와 같은 특정 염료를 배제하는 온전한 세포막을 가지고 있는 반면, 죽은 세포는 그렇지 않다는 원칙에 근거한다. 이 시험에서는 세포 현탁액을 염료와 단순히 혼합한 다음, 육안으로 검사(또는 자동화된 이미징 기반 장비)하여 세포가 염료를 흡수하는지 또는 배제하는지 측정한다.

성장 단계와 생산 단계 사이의 전이에서 그리고 생산 단계 동안 유지되는 바람직한 생존 세포 밀도는 35% 이하의 패킹된 세포 용적을 제공하는 것이다. 일 양태에서, 생존 세포 밀도는 적어도 약 10x10⁶ 생존 세포/mL이다. 다른 양태에서, 생존 세포 밀도는 20x10⁶ 생존 세포/mL, 30x10⁶ 생존 세포/mL, 40x10⁶ 생존 세포/mL, 50x10⁶ 생존 세포/mL, 60x10⁶ 생존 세포/mL, 70x10⁶ 생존 세포/mL, 80x10⁶ 생존 세포/mL, 90x10⁶ 생존 세포/mL, 100x10⁶ 생존 세포/mL, 110x10⁶ 생존 세포/mL, 120x10⁶ 생존 세포/mL, 130x10⁶ 생존 세포/mL, 140x10⁶ 생존 세포/mL, 150x10⁶ 생존 세포/mL, 160x10⁶ 생존 세포/mL, 170x10⁶ 생존 세포/mL, 180x10⁶ 생존 세포/mL, 190x10⁶ 생존 세포/mL, 200x10⁶ 생존 세포/mL, 210x10⁶ 생존 세포/mL, 220x10⁶ 생존 세포/mL, 230x10⁶ 생존 세포/mL, 240x10⁶ 생존 세포/mL 또는 250x10⁶ 생존 세포/mL에 도달할 수 있다. 일 양태에서, 생존 세포 밀도는 적어도 약 10x10⁶ 내지 70x10⁶ 생존 세포/mL이다. 일 양태에서, 생존 세포 밀도는 적어도 약 10x10⁶ 내지 60x10⁶ 생존 세포/mL이다. 일 양태에서, 생존 세포 밀도는 적어도 약 10x10⁶ 내지 50x10⁶ 생존 세포/mL이다. 일 양태에서, 생존 세포 밀도는 적어도 약 10x10⁶ 내지 40x10⁶ 생존 세포/mL이다. 바람직한 양태에서, 생존 세포 밀도는 적어도 약 10x10⁶ 내지 30x10⁶ 생존 세포/mL이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 생존 세포 밀도는 적어도 약 10x10⁶ 내지 20x10⁶ 생존 세포/mL이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 생존 세포 밀도는 적어도 약 20x10⁶ 내지 30x10⁶ 생존 세포/mL이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 생존 세포 밀도는 적어도 약 20x10⁶ 내지 적어도 약 25x10⁶ 생존 세포/mL, 보다 바람직하게 적어도 약 20x10⁶ 생존 세포/mL이다. 또 다른 양태에서, 생존 세포 밀도는 적어도 약 20x10⁶ 내지 120x10⁶ 생존 세포/mL, 적어도 약 40x10⁶ 내지 140x10⁶ 생존 세포/mL, 적어도 약 60x10⁶ 내지 160x10⁶ 생존 세포/mL, 적어도 약 80x10⁶ 내지 180x10⁶ 생존 세포/mL 또는 적어도 약 100x10⁶ 내지 200x10⁶ 생존 세포/mL이다.

막 모듈

본 발명은, 생물 반응기, 예를 들면, 관류 또는 유가식 생물 반응기의 작동 동안 포함되거나 요구되는 기체 교환 과정을 조절, 제어 또는 다르게는 수행하기 위한 하나 이상의 막 기체 전달 모듈을 포함하는 생물 반응기에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 생물 반응기는 막 기반 물질 전달 과정의 결과로 버블을 세포 배지 내로 도입하지 않는다. 본 발명의 생물 반응기는 고밀도 배양물, 예를 들면, 세포 밀도가 적어도 약 20x10⁶ 내지 120x10⁶ 생존 세포/mL, 적어도 약 40x10⁶ 내지 140x10⁶ 생존 세포/mL, 적어도 약 60x10⁶ 내지 160x10⁶ 생존 세포/mL, 적어도 약 80x10⁶ 내지 180x10⁶ 생존 세포/mL 또는 적어도 약 100x10⁶ 내지 200x10⁶ 생존 세포/mL인 배양물의 성장에 적합하다. 기체 교환 공정은 바람직하게는 배양 배지 내로 버블을 도입하지 않는, 세포 배양물에 대한 기체의 첨가(예를 들면, O₂의 첨가) 및 세포 배양물로부터의 기체의 제거(예를 들면, CO₂의 스트리핑)를 포함한다.

또한, 본 발명은, 하나 이상의 막 기체 전달 모듈을 사용하여 고밀도 세포 배양 생물 반응기, 예를 들면, 관류 또는 유가식 생물 반응기의 조작 동안 포함되거나 요구되는 기체 교환 과정을 조절, 제어 또는 다르게는 수행함을 포함하는 고밀도 세포 배양 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 생물 반응기는 막 기반 물질 전달 과정의 결과로 버블을 세포 배지 내로 도입하지 않는다. 본 발명의 세포 배양 방법은 고밀도 배양물, 예를 들면, 세포 밀도가 적어도 약 20x10⁶ 내지 120x10⁶ 생존 세포/mL, 적어도 약 40x10⁶ 내지 140x10⁶ 생존 세포/mL, 적어도 약 60x10⁶ 내지 160x10⁶ 생존 세포/mL, 적어도 약 80x10⁶ 내지 180x10⁶ 생존 세포/mL 또는 적어도 약 100x10⁶ 내지 200x10⁶ 생존 세포/mL인 배양물의 성장에 적합하다. 기체 교환 공정은 바람직하게는 배양 배지 내로 버블을 도입하지 않는 세포 배양에 대한 기체의 첨가(예를 들면, O₂의 첨가) 및 세포 배양물로부터의 기체의 제거(예를 들면, CO₂의 스트리핑)를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "막 기체 전달 모듈"은, 제1 유입구 및 제1 유출구를 가지며 제1 유동 경로를 한정하는 씰링된 하우징 및 적어도 제2 유입구 및 제2 유출구와 연결되고 제2 유동 경로를 한정하는 상기 하우징 내에 포함된 적어도 하나의 막을 포함하는 장치를 나타내며, 상기 제1 유동 경로 및 제2 유동 경로는 막에 의해 분리된다. 예시적인 막 기체 전달 모듈이 도 1e에 도시되어 있으며, 이는 본 발명의 개선된 생물 반응기와 관련하여 사용될 수 있는 막 기체 전달 모듈(600)의 일반화된 개략도를 도시한다. 일반적이지만 비제한적인 구성으로서, 본 발명의 막 모듈은 기체 투과성 중공 섬유 튜브(602)의 중공 섬유 번들(601)을 포함할 수 있으며, 상기 튜브들은 포팅 또는 씰(603)로 함께 고정된 후 하우징 또는 쉘(605) 내부에 넣어지고 각각의 단부에서 유입구 캡(604)이 장착되어, 각각의 중공 섬유의 내부를 통해 하나 이상의 기체의 유동이 도입되게 한다. 본 발명의 하우징은 세포 배양물의 유동 경로를 위한 하나 이상의 유입구/유출구 포트(606 및 607)도 포함할 수 있으며, 상기 유동 경로는 하나의 포트로 들어가 중공 섬유를 둘러싼 공간 내의 하우징을 통해 유동한 다음 유출구 포트 밖으로 빠져나간다. 실제로, 세포 배양물의 유동 경로는 하우징 상의 하나의 유입구 내로 펌핑되고 중공 섬유 번들의 각각의 중공 섬유 주위의 외부 공간 주위의 하우징을 통해 유동하고 유출구 포트를 통해 빠져나간다. 동시에 하우징 내부에서, 세포 배양물은 중공 섬유 번들의 기체 투과성 막의 외부와 접촉한다.

일 양태에서, 막 모듈은 제1 유동 경로를 포함할 수 있으며, 상기 경로는 세포 배양 배지용일 수 있고, 상기 배지는 제1 유동 경로를 가로지르는 제1 유입구로 들어가 제1 유출구를 빠져나간다. 본 발명의 막 모듈은 하나 이상의 기체 또는 기체 혼합물을 위한 제2 유동 경로를 포함할 수 있다. 기체는 제2 유입구로 들어가 제2 유동 경로를 통과한 다음 제2 유출구를 빠져나간다. 기체가 제2 유동 경로를 가로지르는 동안, 기체는 제2 유동 경로로부터 막을 통해 제1 유동 경로의 세포 배양물 내로 투과할 수 있다. 또한, 제1 유동 경로의 세포 배양물에 용존 기체가 막을 투과하여 제2 유동 경로 내로 통과할 수 있다. 제2 유동 경로의 유출구는 기체 "배출부" 포트로 나타낼 수도 있다.

도 2는 본원에서 사용되는 막 모듈의 유동 경로의 또 다른 양태를 도시한다. 본 도면은 본원에 기술된 개선된 생물 반응기와 관련하여 사용될 수 있는 막 기체 전달 모듈(800)의 양태를 도시한다. 본 발명의 모듈은 세포 배양 배지를 수용하기 위한 "쉘 사이드 인" 유입구(801)를 포함하며, 상기 배지는 중공 섬유 번들의 중공 섬유 각각을 둘러싸는 공간의 하우징 또는 쉘 전체를 가로지른다. 배양 배지는 결국 "쉘 사이드 아웃" 유출구 포트(802)를 통해 하우징을 빠져나간다. 이러한 예에는 2개의 유출구 포트가 있지만; 그러나 임의의 수의 유출구 포트가 사용될 수 있다. 본 발명의 모듈은 하나 이상의 기체 또는 기체 혼합물을 수용하기 위한 하나 이상의 "튜브(루멘) 사이드 인" 유입구 포트(804)를 포함하며, 상기 기체 또는 기체 혼합물은 중공 섬유 번들의 중공 섬유 각각의 루멘 또는 내부 공간 내로 들어간다. 이후, 기체는 중공 섬유의 길이를 가로질러 하나 이상의 "튜브(루멘) 사이드 아웃" 유출구 포트(803)를 빠져나간다. 이러한 구성은 중공 섬유의 루멘의 내부 공간에 있는 "기체 유동 구역" 및 쉘 또는 하우스 내부에 국한되지만 중공 섬유 외부에 있는 공간인 "배지 또는 세포 배양 유동 구역" 둘 다를 확립한다. 기체 유동 구역의 기체는 막을 투과하여 배지 유동 구역 내로 이동할 수 있다. 다르게는, 용존 기체(예를 들면, CO₂)는 중공 섬유 막을 투과하여 기체 유동 구역 내로 이동하고 기체 유출구 포트를 통해 "배출부"로 모듈을 빠져나갈 수 있다.

도 3은 기체 전달 모듈에 사용되는 유동 경로의 예시적인 형태도 제공한다. 특히, 도면은 구성 A, B 및 C의 일반적인 막 기체 전달 모듈에서의 기체의 유동 경로("*"로 표시된 화살표) 및 세포 배양 배지의 유동 경로("**"로 표시된 화살표)의 다양한 구성을 도시한다. "x"로 표시된 포트는 차단된다. 본원에 사용되는 용어 "막"은 하나의 물질(예를 들면, 기체)이 통과하는 반면 또 다른 물질(예를 들면, 액체)은 차단하는 재료 층을 나타낸다. 이의 선택성은 입자 크기, 재료의 상태(액체 vs. 기체) 또는 용해도에 따를 수 있다. 또한, 분리는 추진력, 예를 들면, 막의 일측과 다른측 사이의 압력, 온도 또는 농도 차이가 있는 경우에 발생한다. 막은 "치밀한 또는 비-다공성 막" 및 "다공성 막"을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "치밀한 막" 또는 "비-다공성 막"은 공극 또는 동공이 없는 고체 재료를 나타낸다. 예로는 중합체(예를 들면, 실리콘 또는 폴리디메틸실록산(PDMS)), 금속(예를 들면, 팔라듐) 및 세라믹을 포함한다. 치밀한 막은 물질이 용액 및 확산 과정을 통해 막을 통과하고, 물질이 막 내로 용해되어 반대쪽으로 통과하게 한다. 예를 들면, 실리콘은 치밀한 막을 형성할 수 있다. 실리콘은 치밀하고(다공성이 아님) 액체는 막을 통해 전체적으로 이동할 수 없기 때문에, 표면 장력에 관계 없이 모든 호환 가능한 액체와의 액체 접촉 응용 분야에서 사용할 수 있다. 또한, 치밀한 막은 실리콘의 기체간 투과성 차이로 인해 기체를 분리하는 수단을 제공한다.

본원에 사용되는 용어 "다공성 막"은 다르게는 특정 크기 또는 크기 범위의 공극 또는 구멍을 갖는 고체 재료이다. 이러한 막은 크기 배제에 따라 분리된다: 공극보다 큰 물질은 통과하지 않는 반면, 공극보다 작은 물질은 통과한다.

본원에 사용되는 용어 "비대칭성 막"은 일측으로부터 다른측으로 상이한 특성(예를 들면, 공극 크기)을 갖는 종종 다공성인 단일 재료로 구성된다. 이러한 피처는 재료가 막 매트릭스를 통과할 때 표면에서 "보다 더 좁은" 선택성을 발생시키고 제한을 감소시킨다.

본원에서 사용되는 용어 "복합 막"은 하나 이상의 재료로 구성되며, 종종 다공성 지지층에 적용되는 치밀한 재료의 얇은 선택성 층으로 구성된다.

본원에 사용되는 막과 관련된 용어 "투과성 계수"는 단위 막 두께당 단위 막 관통 구동력당 기체의 수송 플럭스(단위 면적당 기체 투과율)로 정의되는 파라미터이다.

다양한 양태에서, 본 발명의 막 기체 전달 모듈은 하나 이상의 실리콘 막을 포함한다. 폴리디메틸실록산(PDMS)으로도 알려진 실리콘은 사용 가능한 가장 기체 투과성인 치밀한 중합체성 막 재료 중 하나이다. 기체는 용액/확산 메커니즘에 의해 실리콘을 투과하며, 기체 투과율은 기체 용해도와 실리콘에 용존 기체의 확산 속도의 곱에 정비례한다. 투과성 계수는 단위 막 두께당 단위 막 관통 구동력당 기체의 수송 플럭스(단위 면적당 기체 투과율)로 정의된 파라미터이다. 실리콘에서의 다양한 기체 및 증기에 대한 투과성 계수는 아래 표에 나타낸다.

[표 1]

막을 가로지르는 기체 전달 속도는, 기체 투과성 계수, 막 표면적, 투과성 막 기체 분압 차이에 비례하고 막 두께에 반비례한다는 것을 알 수 있을 것이다. 따라서, 막을 통과하는 기체 전달은 기체 투과성 계수의 증가, 표면적의 증가, 투과성 막 기체 분압의 증가 및 막 두께의 감소에 따라 증가한다.

특정 양태에서, 본원에 사용되는 막은 다공성, 예를 들면, 나노 다공성, 메소 극성 또는 마이크로 다공성일 수 있거나, 나노 규모 및/또는 메소 규모 및/또는 마이크로 규모 공극의 조합을 가질 수 있다. 나노 다공성 고체 또는 겔의 다공도(porosity)는 약 40 내지 90%, 약 40 내지 75%, 약 40 내지 60%, 약 50 내지 90%, 약 60 내지 90%, 약 70 내지 90%, 약 50 내지 80% 또는 약 60 내지 70%일 수 있고, 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90%일 수 있다. 공극의 평균 직경은 약 1nm 내지 10㎛, 약 1nm 내지 1㎛, 약 1 내지 500nm, 약 1 내지 100nm, 약 1 내지 50nm, 약 1 내지 10nm, 약 100nm 내지 10㎛, 약 500nm 내지 10㎛, 약 1 내지 10㎛, 약 10nm 내지 1㎛, 약 50 내지 500nm 또는 약 100 내지 200nm일 수 있고, 약 1nm, 5nm, 10nm, 15nm, 20nm, 25nm, 30nm, 35nm, 40nm, 45nm, 50nm, 75nm, 100nm, 150nm, 200nm, 250nm, 300nm, 350nm, 400nm, 450nm, 500nm, 600nm, 700nm, 800nm 또는 900nm 또는 약 1㎛, 2㎛, 3㎛, 4㎛, 5㎛, 6㎛, 7㎛, 8㎛, 9㎛ 또는 10㎛일 수 있다.

본원에서 사용되는 막의 두께는 임의의 적절한 두께일 수 있다. 다양한 양태에서, 두께는 약 0.1 내지 10mm 두께일 수 있고, 약 0.1 내지 5mm 두께, 약 0.1 내지 2mm 두께, 약 0.1 내지 1mm 두께, 약 1 내지 10mm 두께, 약 5 내지 1.0mm 두께, 약 0.5 내지 5mm 두께, 약 1 내지 5mm 두께 또는 약 1 내지 2mm 두께일 수 있고, 약 0.1mm, 0.2mm, 0.3mm, 0.4mm, 0.5mm, 0.6mm, 0.7mm, 0.8mm, 0.9mm, 1mm, 1.5mm, 2mm, 2.5mm, 3mm, 3.5mm, 4mm, 4.5mm, 5mm, 6mm, 7mm, 8mm, 9mm 또는 10mm 두께일 수 있다. 막의 제작시, 나노 다공성 재료 내의 세포의 분포는 대략 균질할 수 있거나 불균질할 수 있다. 또한, 막은 크기가 상이한 공극들의 혼합물을 함유할 수 있다.

일 양태에서, 본 발명의 생물 반응기는 중공 섬유 기체 전달 모듈, 예를 들면, PERMSELECT® 실리콘 중공 섬유 막 모듈 또는 유사하거나 동등한 성질을 갖는 모듈로서 구성될 수 있다. 중공 섬유는 중공 섬유 막의 내부와 외부 사이의 높은 압력 차이를 견딜 수 있는 자체 지지되고 본질적으로 안정한 막 구조를 구성한다. 중공 섬유 막은 일반적으로 막 모듈에 패키징되며, 상기 모듈에서 수천 개의 중공 섬유가 매우 콤팩트한 용적으로 번들링되어 있고 이하의 도면에 도시되는 바와 같이 하우징 내에 씰링되거나 포팅된다. 예시적인 중공 섬유 모듈이 도 1e 및 도 2에 도시되어 있다. 결과적으로, 각각의 개별 중공 섬유 막의 표면적의 합이 모듈의 총 막 면적을 구성하고 있으며, 이는 중공 섬유 막으로 높은 막 표면 밀도를 달성하는 것이 어떻게 가능한지를 분명하게 한다.

막 모듈은 일반적으로 섬유 번들의 양 단부에서 매니폴딩된 모든 중공 섬유(튜브 사이드로도 알려짐)의 내부와 유체 통신하는 유입구 및 유출구 포트를 가질 것이다. 예를 들면, 도 1e 참조. 유사하게는, 막 모듈은 중공 섬유의 외부 또는 쉘 측면과 유체 통신하는 하나 이상의 포트를 가질 것이다. 작동시, 도 2에 예시된 바와 같이, 기체 또는 액체가 유동해야 하는 중공 섬유(쉘 또는 튜브)의 측면은 막 모듈에 대한 특정 응용 분야에 따를 것이며, 이는 막 모듈 성능을 최대화하도록 선택된다. 예를 들면, 도 2에 도시된 바와 같이, 막 기체 분리에서 기체들의 공급 혼합물은 막 모듈로 유입구 포트를 통해 튜브 측면으로 들어가 중공 섬유 막 내부를 통해 유동한다. 보다 더 높은 투과성을 가진 혼합물의 기체 종은 중공 섬유 막의 벽을 가로질러 더 빠른 속도로 전달되어 덜 투과성인 종을 남긴다. 전달된 기체를 투과물로 나타낸다. 쉘 측면에서는, 진공이 적용될 수 있거나 스윕 기체(또는 액체)가 내부로 유동하여 투과물을 운반할 수 있다. 튜브 측면의 유출구를 빠져나가는 것은, 더 높은 농도의 덜 투과성 기체 종을 가진 기체 혼합물을 구성하는 잔류물이다.

다양한 양태에서, 본 발명의 모듈은 액체로의/액체로부터의 용존 기체의 첨가하고/첨가하거나 제거에 사용될 수 있다. 작동시, 액체 스트림은 막의 일측으로부터 유동하고 기체 혼합물은 막의 다른 측에서 유동한다(또는 진공이 적용된다). 각각의 기체 종은 분압이 높은 막 측으로부터 분압이 낮은 측으로 유동하므로 양측이 평형을 이루는 경향이 있다. 따라서, 적용된 기체 혼합물(또는 진공)을 제어하여 모듈을 통해 유동하는 액체 스트림의 용존 기체를 제어할 수 있다. 이러한 원리는 세포 배양에서 용존 산소 및 이산화탄소의 수준을 조절하기 위해 사용될 수 있다.

세포

본원에 기술된 개선된 생물 반응기는 다양한 미생물 및 세포 유형을 사용하는 미생물 발효 및/또는 세포 배양 생물 공정에 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 세포는 원칙적으로 당업자에게 공지된 모든 세포이며, 생물학적 생성물을 생산할 수 있는 능력을 갖고 있다. 세포는 진핵 세포, 예를 들면, 사상 진균, 예를 들면, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei), 페니실리우미 크리소게눔(Penicilliumi chrysogenum), 효모, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 피치아(Pichia) 속의 효모, 예를 들면, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 원핵 생물, 예를 들면, 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 바실루스(Bacillus) sp, 예를 들면, 비. 리체니포르미스(B. licheniformis), 비. 섭틸리스(B. subtilis), 비. 아밀로리케파시엔스(B. amyloliquefaciens), 비. 아이칼로필루스(B. aikalophilus), 스트렙토마이세스(Streptomyces) sp., 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 슈도모나스(Pseudomonas) sp.일 수 있다. 진핵 세포의 예는, 예를 들면, 문헌[Chu, L., Robinson, D. K., (2001) Curr. Opinion Biotechn., vol. 12, p. 180-187]에 기재되어 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용되는 세포는 동물 세포, 특히 포유 동물 세포이다. 포유 동물 세포의 예는 CHO(중국 햄스터 난소) 세포, 하이브리도마, BHK(어린 햄스터 신장) 세포, 골수종 세포, 인간 세포, 예를 들면, HEK-293 세포, 인간 림프모구 세포, E1 무한 증식 HER 세포, 마우스 세포, 예를 들면, NS0 세포이다.

본 발명의 생물 반응기를 사용하는 배양 및 수확을 위한 세포 유형의 예는 의료, 연구 또는 상업적 목적을 위한 마우스, 래트, 토끼 또는 인간으로부터 유래된 단클론 항체-분비 하이브리도마 세포, 진핵 세포, 생화학적 마커, 관심 서열의 재조합 펩티드 또는 뉴클레오티드, 단백질, 효모, 곤충 세포, 안정한 또는 바이러스 감염된 조류 세포 또는 포유 동물 세포, 예를 들면, CHO 세포, 원숭이 세포, 용해 생성물 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

배지

본원에 기술된 개선된 생물 반응기는 임의의 적합한 세포 배양 또는 미생물 성장 배지와 함께 사용될 수 있다. 적절한 세포 배양 배지 또는 미생물 배지를 선택하고 최적화하기 위한 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 바이오 프로세서의 유형(예를 들면, 유가식, 관류, 연속 유동), 사용되는 세포주 또는 미생물 세포의 유형 및 발현하려는 특정한 생물학적 생성물을 포함하는 많은 요소들에 따라 달라질 수 있다.

세포 배양에서 중요한 단계는 시험관내 배양을 위한 적절한 성장 배지를 선택하는 단계이다. 성장 배지 또는 배양 배지는 미생물, 세포 또는 소형 식물의 성장을 지원하도록 디자인된 액체 또는 겔이다. 세포 배양 배지는 일반적으로 적절한 에너지원 및 세포 주기를 조절하는 화합물을 포함한다. 일반적인 배양 배지는 성장 인자, 호르몬 및 부착 인자의 공급원으로서 아미노산, 비타민, 무기 염, 포도당 및 혈청의 보완물로 구성된다. 영양분 이외에도 pH 및 삼투압을 유지하는 것도 돕는다.

생물 공정은 일반적으로 수성 성장 배지에서 수행되며, 상기 배지는 질소 공급원 또는 기타 영양 공급원, 예를 들면, 요소를, 비타민 및 미량 무기질 및 금속과 함께 함유할 수 있다. 일반적으로, 성장 배지는 무균이거나 또는 적어도 낮은 미생물 부하, 예를 들면, 세균 수를 갖는 것이 바람직하다. 성장 배지의 살균은 임의의 원하는 방식으로 수행될 수 있다. 그러나, 바람직한 구현에서, 살균은 혼합 전에 성장 배지 또는 성장 배지의 개별 성분들을 조사함으로써 달성된다. 방사선의 선량은, 에너지 소비 및 이에 따른 비용을 최소화하기 위해, 일반적으로 가능한 한 낮은 동시에 적절한 결과를 얻는다.

동물 세포는 완전 천연 배지 또는 인공/합성 배지를 사용하여 일부 천연 생성물과 함께 배양할 수 있다. 천연 배지는 자연적으로 발생하는 생물학적 유체로만 구성된다. 천연 배지는 폭넓은 범위의 동물 세포 배양에 매우 유용하고 편리하다. 천연 배지의 가장 큰 단점은 이러한 천연 배지의 정확한 구성에 대한 지식이 부족하기 때문에 재현성이 낮다는 것이다. 인공 또는 합성 배지는 영양분(유기 및 무기 둘 다), 비타민, 염, O₂ 기체상 및 CO₂ 기체상, 혈청 단백질, 탄수화물, 보조 인자를 추가하여 제조된다. 다음 목적들 중 하나 이상을 제공하기 위해 상이한 인공 배지가 고안되었다: 1) 즉각적인 생존(특정 pH 및 삼투압을 갖는 균형 잡힌 염 용액); 2) 연장된 생존(다양한 유기 화합물 및/또는 혈청 제형이 보충된 균형 잡힌 염 용액); 3) 무한한 성장; 4) 특화된 기능.

인공 배지는 일반적으로 네 가지 범주로 그룹화된다: (1) 혈청 함유 배지; (2) 무혈청 배지; (3) 화학적으로 한정된 배지; 및 (4) 무단백질 배지.

혈청 함유 배지에서, 소 태아 혈청은 동물 세포 배양 배지에서 가장 일반적인 보충제이다. 소 태아 혈청은 최적의 배양 배지를 제공하기 위해 비용이 저렴한 보충제로서 사용된다. 혈청은 불안정한 또는 수-불용성인 영양분, 호르몬 및 성장 인자, 프로테아제 억제제를 위한 담체 또는 킬레이터를 제공하고, 독성 모이어티와 결합하고 중화시킨다.

무혈청 배지의 경우, 배지 중 혈청의 존재는 많은 단점들과 관련될 수 있으며, 면역학 연구에서 심각한 오해로 이어질 수 있다. 많은 무혈청 배지가 개발되어 왔다. 이러한 배지는 일반적으로 단일 세포 유형의 배양을 지원하도록 특별히 제형화되고, 예를 들면 줄기 세포용 Thermo Fisher Scientific의 Knockout Serum Replacement 및 Knockout DMEM이고, 한정된 양의 정제된 성장 인자, 지단백질 및 다르게는 일반적으로 혈청에 의해 제공되는 기타 단백질을 포함한다. 이러한 배지는 이러한 배지의 구성 요소가 알려져 있기 때문에 '한정된 배양 배지'로도 나타낸다.

화학적으로 한정된 배지에서, 이러한 배지는 오염이 없는 초순수 무기 및 유기 성분을 함유하며, 성장 인자와 같은 순수 단백질 첨가제도 함유할 수 있다. 이들의 구성 성분은 비타민, 콜레스테롤, 특정 아미노산 및 지방산을 첨가하여 유전 공학에 의해 박테리아 또는 효모에서 생산된다.

무단백질 배지에는 단백질이 부재한다. 혈청 보충된 배지와 비교하여 무단백질 배지를 사용하면, 경우에 따라 우수한 세포 성장 및 단백질 발현을 촉진할 수 있고, 모든 발현된 생성물의 다운스트림 정제를 촉진할 수 있다. MEM, RPMI-1640과 같은 제형은 무단백질이며, 필요에 따라 단백질 보충제가 제공된다.

또한, 배양 배지는 아미노산, 포도당, 염, 비타민 및 기타 영양분의 혼합물을 함유하고, 상업적 공급 업체로부터 분말 형태로 또는 액체 형태로 입수할 수 있음을 인식할 것이다. 이러한 구성 요소에 대한 요구 사항은 세포주마다 다르며, 이러한 차이는 부분적으로는 광범위한 수의 배지 제형의 원인이 된다. 각각의 구성 요소는 다음을 포함하는 특정 기능을 수행한다:

완충 시스템: pH의 조절은 최적의 배양 조건에 있어 중요하며, 일반적으로는 천연 완충 시스템 또는 화학적 완충 시스템을 사용하여 달성된다. 천연 완충 시스템에서, 기체성 CO₂는 배양 배지의 CO₃/HCO₃ 함량과 균형을 이룬다. 천연 완충 시스템이 있는 배양물은 일반적으로 CO₂ 항온 배양기에 의해 유지되는 5 내지 10% CO₂가 있는 공기 대기에서 유지되어야 한다. 천연 완충 시스템은 비용이 저렴하고 비독성이다.

화학적 완충 시스템도 사용된다. 쯔비터 이온인 HEPES를 사용하는 화학적 완충은 pH 7.2 내지 7.4 범위에서 우수한 완충 용량을 가지며, 제어된 기체 분위기를 필요로 하지 않는다. HEPES는 일부 세포 유형의 경우 상대적으로 값비싸고 높은 농도에서 독성이다. HEPES는 또한 형광 광에 대한 노출로 인한 광독성 효과에 대한 배지의 민감도를 크게 증가시키는 것으로 나타났다.

세포 배양은 페놀 레드와 같은 pH 지시약도 포함할 수 있다. 대부분의 상업적으로 입수 가능한 배양 배지는 pH 지시약으로 페놀 레드를 포함하여, pH를 지속적으로 모니터링할 수 있다. 세포의 성장 동안, 세포에서 방출되는 대사물로 인해 pH가 변함에 따라 배지의 색이 변한다. 낮은 pH 수준에서, 페놀 레드는 중간 황색으로 바뀌는 반면, 높은 pH 수준에서는 중간 자색으로 바뀐다. 배지는 세포 배양을 위한 최적의 pH 값인 pH 7.4의 경우 밝은 적색이다.

본원에서 사용되는 세포 배양 배지는 무기 염도 함유할 수 있다. 배지 내의 무기 염은 삼투 균형을 유지하는 것을 돕고, 나트륨, 칼륨 및 칼슘 이온을 제공하여 막 능력을 조절하는 데 도움이 된다. 배양은 아미노산의 존재로부터 이익을 얻을 수도 있다. 특히, 필수 아미노산은 세포가 스스로 합성할 수 없기 때문에 배양 배지에 포함되어야 한다. 필수 아미노산은 세포 증식에 필요하며 이의 농도는 달성 가능한 최대 세포 밀도를 측정한다. 필수 아미노산인 L-글루타민이 특히 중요하다. L-글루타민은 NAD, NADPH 및 뉴클레오타이드에 질소를 제공하며, 대사를 위한 2차 에너지원의 역할을 한다. L-글루타민은 불안정한 아미노산으로, 시간이 지남에 따라 세포에서 사용할 수 없는 형태로 전환되기 때문에, 사용 직전에 배지에 첨가될 수 있다. L-글루타민의 분해로 인해 암모니아가 축적되고 암모니아는 일부 세포주에 해로운 영향을 미칠 수 있기 때문에, 원래 배지 제형에서 요구되는 것보다 더 많은 L-글루타민을 첨가할 때에는 주의해야 한다. 포유 동물 세포 배양 배지의 L-글루타민 농도는 배지 199의 0.68mM부터 둘베코 변형 이글 배지의 4mM까지 다양하다. 무척추 동물 세포 배양 배지는 12.3mM의 높은 L-글루타민을 함유할 수 있다. 글루타멕스와 같은 보충제는 보다 더 안정적이며 느린 세포의 장기 배양을 위해 글루타민을 대체할 수 있다.

비필수 아미노산은 성장 동안 고갈된 아미노산을 대체하기 위해 배지에 첨가될 수도 있다. 비필수 아미노산으로 배지를 보충하면 성장을 촉진하고 세포의 생존률을 연장한다.

탄수화물도 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 당 형태의 탄수화물은 주요 에너지원이다. 대부분의 배지는 포도당 및 갈락토스를 함유하지만, 일부는 말토스 및 과당을 함유한다.

본원에 사용되는 세포 배양 배지는 단백질 및 펩티드도 포함할 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 단백질 및 펩티드는 알부민, 트랜스페린 및 피브로넥틴이다. 이들은 무혈청 배지에서 특히 중요하다. 혈청은 풍부한 단백질 공급원이며 알부민, 트랜스페린, 아프로티닌, 페투인 및 피브로넥틴을 포함한다. 알부민은 혈액에서 물, 염, 유리 지방산, 호르몬 및 비타민을 결합하여 이들을 조직과 세포 사이로 전송시키는 주요 단백질이다. 알부민의 결합능은 세포 배양 배지로부터 독성 물질을 제거하는 데 적합하다.

본원에서 사용되는 세포 배양 배지는 아프로티닌과 같은 보호제도 포함할 수 있다. 아프로티닌은 중성 및 산성 pH에서 안정하고, 고온 및 단백질 분해 효소에 의한 분해에 대해 저항성이다. 아프로티닌은 트립신과 같은 여러 세린 프로테아제에 대한 억제능도 있다. 페투인은 성인 혈청에서보다 더 높은 농도로 태아 및 신생아 혈청에서 발견되는 당단백질이다. 페투인은 또한 세린 프로테아제의 억제제이다. 피브로넥틴은 세포 부착의 핵심 역할을 한다. 트랜스페린은 세포막에 철을 공급하는 역할을 하는 철 수송 단백질이다.

본원에서 사용되는 세포 배양 배지는 비타민 및 미량 원소도 포함할 수 있다. 많은 비타민은 세포의 성장 및 증식에 필수적이다. 비타민은 세포에 의해 충분한 양으로 합성될 수 없으므로 조직 배양에 필요한 중요한 보충제이다. 다시 말하지만 혈청은 세포 배양에서 비타민의 주요 공급원이지만, 배지는 상이한 비타민들도 풍부하여 특정 세포주에 대해 적합하게 만든다. B 그룹 비타민은 성장 촉진을 위해 가장 일반적으로 첨가된다. 미량 원소는 종종 혈청에서 일반적으로 발견되는 것을 대체하기 위해 무혈청 배지에 보충된다. 구리, 아연, 셀레늄 및 트리카복실산 중간체와 같은 미량 원소는 적절한 세포 성장을 위해 소량으로 필요한 화학 원소이다. 이러한 미량 영양분은 많은 생물학적 과정, 예를 들면 효소의 기능 유지에서 필수적이다.

특정 세포주에 권장되는 완전 성장 배지는 기본 배지 및 혈청에 존재하지 않는 추가의 성분을 필요로 할 수도 있다. 보충제인 이러한 구성 요소는 증식을 유지하고 호르몬, 성장 인자 및 신호 전달 물질과 같은 정상적인 세포 대사를 유지하는 데 도움이 된다.

성장 배지는 항생제도 포함할 수 있다. 항생제는 세포 성장에 필수적이지는 않지만, 종종 박테리아 및 진균 오염물의 성장을 제어하기 위해 사용된다. 항생제는 마이코플라스마 및 내성 박테리아에 의한 오염을 차폐할 수 있으므로, 세포 배양을 위한 항생제의 일상적인 사용은 권장되지 않는다. 또한, 항생제는 민감한 세포의 대사를 방해할 수도 있다.

배지의 선택은 배양되는 세포의 유형 및 배양 목적 및 실험실에서 사용 가능한 자원에 따를 수 있다. 상이한 세포 유형은 매우 특정한 성장 요구 사항을 가지기 때문에, 각각의 세포 유형에 가장 적합한 배지를 실험적으로 측정해야 한다. 일반적으로, 부착 세포의 경우 MEM으로 개시하고 부유 세포의 경우 RPMI-1640으로 개시하는 것이 좋다. 일반적인 세포 배양 배지의 예는 상업적으로(SIGMA®, ATCC®, LIFE TECHNOLOGIES®) 찾을 수 있으며. 다음과 같다:

이글 최소 필수 배지(EMEM): EMEM은 최초로 널리 사용된 배지들 중 하나였으며, 해리 이글(Harry Eagle)에 의해 간단한 기본 배지(BME)로부터 제형화되었다. EMEM은 균형 잡힌 염 용액, 비필수 아미노산 및 나트륨 피루베이트를 함유한다. 이는 5% CO₂와 함께 사용하기 위해 감소된 중탄산나트륨 농도(1,500mg/l)로 제형화된다. EMEM은 비-복합 배지이기 때문에, 일반적으로 추가의 보충제 또는 더 높은 수준의 혈청으로 강화되어 폭넓은 범위의 포유 동물 세포에 대해 적합하게 만든다.

둘베코 변형 이글 배지(DMEM). DMEM은 EMEM에 비해 거의 2배의 아미노산 농도 및 4배의 비타민 양을 가지고 있으며, 페릭 나트레이트, 나트륨 피루베이트 및 일부 보조 아미노산도 갖는다. 원래의 제형은 1,000mg/L의 포도당을 함유하고 있으며, 배아 마우스 세포를 배양하기 위해 처음 보고되었다. 4,500mg/L의 포도당으로의 추가의 개질은 다양한 유형의 세포 배양에 대해 최적인 것으로 입증되었다. DMEM은 기본 배지이며 단백질 또는 성장 촉진제를 함유하지 않는다. 따라서, "완전" 배지가 되기 위해서는 보충제를 필요로 한다. 가장 일반적으로 5 내지 10% 소 태아 혈청(FBS)으로 보충된다. DMEM은 중탄산나트륨 완충 시스템(3.7g/L)을 사용하므로, 필요한 pH를 유지하기 위해 인공적인 수준의 CO₂를 필요로 한다. 분말화 배지는 분말화 상태에서 기체가 배출되는 경향이 있기 때문에 중탄산나트륨 없이 제형화된다. 분말화 배지는 물에 용해시 3.7g/L의 중탄산나트륨을 첨가해야 한다. DMEM은 처음에는 마우스 배아 줄기 세포의 배양에 사용되었다. DMEM은 1차 마우스 및 닭 세포, 바이러스 플라크 형성 및 접촉 억제 연구에 폭넓게 적용 가능한 것으로 밝혀졌다.

RPMI-1640. RPMI-1640은 포유 동물 세포, 특히 조혈 세포에 대한 광범위한 응용 분야를 가진 범용 배지이다. RPMI-1640은 뉴욕 버팔로 소재의 Roswell Park Memorial Institute(RPMI)에서 개발되었다. RPMI-1640은 맥코이 5A의 변형으로, 말초 혈액 림프구의 장기 배양을 위해 개발되었다. RPMI-1640은 중탄산염 완충 시스템을 사용하며, 일반적인 pH 8 제형인 대부분의 포유 동물 세포 배양 배지와 상이하다. RPMI-1640은 현탁액에서 폭넓게 다양한 세포의 성장을 지원하고 단층으로 성장한다. 혈청 또는 적절한 혈청 대체물로 적절하게 보충되는 경우, RPMI-1640은 새로운 인간 림프구 배양, 융합 프로토콜 및 하이브리드 세포의 성장을 포함하여 포유 동물 세포에 대한 광범위한 응용 분야를 갖는다.

상기 기재된 세포 배양 배지 및 미생물 성장 배지는 본 발명에 사용될 수 있는 사용 가능한 배지의 영역 및 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 숙련가는 상황의 전반에 따른 적절한 배지 옵션을 고려하고 적절한 선택을 할 수 있다.

또한, 생물 공정 시스템은 유형에 따라 생물 공정을 용이하게 하는 기타 구성 요소를 포함할 수도 있다. 예를 들면, 다양한 효소 및 계면활성제가 첨가될 수 있다.

예를 들면, 효소, 예를 들면, 셀로비아제 및 셀룰라제가 일부 생물 공정에서 사용된다. 셀로비아제는 상품명 NOVOZYME 188™으로 판매되는 아스페르길루스 니게르로부터의 셀로비아제를 포함한다. 셀룰라제는 진균 또는 박테리아 기원일 수 있다. 셀룰라제는 바실루스, 슈도모나스, 후미콜라(Humicola), 푸사리움(Fusarium), 티엘라비아(Thielavia), 아크레모니움(Acremonium), 크리소스포리움(Chrysosporium) 및 트리코데르마(Trichoderma) 속으로부터의 셀룰라제를 포함하며, 후미콜라, 코프리누스(Coprinus), 티엘라비아, 푸사리움, 마이셀리오프토라(Myceliophthora), 아크레모니움, 체팔로스포리움(Cephalosporium), 사이탈리디움(Scytalidium), 페니실리움(Penicillium) 또는 아스페르길루스의 종으로부터의 셀룰라제(예를 들면, EP 458162 참조), 특히 종 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens)(사이탈리디움 테르모필룸(Scytallidium thermophilum)으로 재분류됨, 예를 들면, 미국 특허 제4,435,307호 참조), 코프리누스 시네레우스(Coprinus cinereus), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 마이셀리오프토라 테르모필리아(Myceliophthora thermophila), 메리필루스 기간테우스(Meripilus giganteus), 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 아크레모니움(Acremonium) sp., 아크레모니움 페르시치눔(Acremonium persicinum), 아크레모니움 아크레모니움(Acremonium acremonium), 아크레모니움 브라차이페니움(Acremonium brachypenium), 아크레모니움 디크로모스포룸(Acremonium dichromosporum), 아크레모니움 옵클라바툼(Acremonium obclavatum), 아크레모니움 핀케르토니아에(Acremonium pinkertoniae), 아크레모니움 로세오그리세움(Acremonium roseogriseum), 아크레모니움 인콜로라툼(Acremonium incoloratum) 및 아크레모니움 푸라툼(Acremonium furatum)으로부터 선택된 균주에 의해 생성된 셀룰라제; 바람직하게는 종 후미콜라 인솔렌스 DSM 1800, 푸사리움 옥시스포룸 DSM 2672, 마이셀리오프토라 테르모필리아 CBS117.65, 체팔로스포리움 sp. RYM-202, 아크레모니움 sp. CBS 478.94, 아크레모니움 sp. CBS 265.95, 아크레모니움 페르시치눔 CBS169.65, 아크레모니움 아크레모니움 AHU 9519, 체팔로스포리움 sp. CBS 535.71, 아크레모니움 브라차이페니움 CBS 866.73, 아크레모니움 디크로모스포룸 CBS 683.73, 아크레모니움 옵클라바툼 CBS 311.74, 아크레모니움 핀케르토니아에 CBS157.70, 아크레모니움 로세오그리세움 CBS134.56, 아크레모니움 인콜로라툼 CBS146.62 및 아크레모니움 인콜로라툼 CBS146.62으로부터 선택되는 셀룰라제를 포함한다. 셀룰로스 분해 효소는 크리소스포리움, 바람직하게는 크리소스포리움 루크노웬세(Chrysosporium lucknowense) 균주로부터 얻을 수도 있다. 또한, 트리코데르마(특히 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride), 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) 및 트리코데르마 코닝이(Trichoderma koningii)), 알칼리친화성 바실루스(예를 들면, 미국 특허 제3,844,890호 및 EP 458162 참조) 및 스트렙토마이세스(예를 들면, EP 458162 참조)가 사용될 수 있다.

효소 복합체, 예를 들면, 상표명 ACCELLERASE®로 Genencore로부터 입수 가능한 효소 복합체, 예를 들면, Accellerase® 1500 효소 복합체가 사용될 수 있다. Accellerase 1500 효소 복합체는 주로 엑소글루카나제(exoglucanase), 엔도글루카나제(endoglucanase)(2,200 내지 2,800CMC U/g), 반-셀룰라제(hemi-cellulase) 및 베타-글루코시다제(beta-glucosidase)(525 내지 775pNPG U/g)와 같은 여러 효소 활성을 포함하며, pH는 4.6 내지 5.0이다. 효소 복합체의 엔도글루카나제 활성은 카복시메틸셀룰로스 활성 유닛(CMC U)으로 표현되는 반면, 베타-글루코시다제 활성은 pNP-글루코사이드 활성 유닛(pNPG U)으로 보고된다. 일 양태에서, Accellerase® 1500 효소 복합체와 NOVOZYME™ 188 셀로비아제의 블렌드가 사용된다.

계면활성제의 첨가는 일부 생물 공정의 속도를 향상시킬 수 있다. 계면활성제의 예는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, Tween® 20 또는 Tween® 80 폴리에틸렌 글리콜 계면활성제, 이온성 계면활성제 또는 양쪽성 계면활성제를 포함한다. 다른 적합한 계면활성제는 옥틸페놀 에톡실레이트, 예를 들면, Dow Chemical로부터 상업적으로 입수 가능한 TRITON™ X 시리즈 비이온성 계면활성제를 포함한다. 용액, 특히 고농도 용액으로 생성되는 생성물을 유지하기 위해 계면활성제를 첨가할 수도 있다.

생물 반응기 생성물 및 정제

본원에 기술된 생물 반응기는 백신, 혈액 및 혈액 성분, 알레르기 유발 물질, 유전자 치료 성분, 조직 및 재조합 치료 단백질을 포함하는 임의의 유형의 생물학적 생성물을 생산하는 데 사용될 수 있다. 생물학적 제제는 당, 단백질 또는 핵산 또는 이러한 물질들의 복잡한 조합으로 구성될 수 있거나, 세포 및 조직과 같은 살아있는 개체일 수 있다. 치료 단백질은 단클론 항체, 이중특이성 항체, 효소, 사이토카인, 호르몬 및 융합 단백질을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

단백질의 대규모의 경제적 정제는 생명 공학 산업에서 점점 더 중요한 문제가 되어가고 있다. 일반적으로 단백질은, 상기 단백질에 대한 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드를 삽입함으로써 관심 단백질을 생산하도록 조작된 포유 동물 또는 박테리아 세포주를 사용하는 세포 배양에 의해 생산된다. 사용되는 세포주는 살아있는 유기체이기 때문에, 일반적으로 동물 혈청 제제로부터 공급되는 당, 아미노산 및 성장 인자를 함유하는 복합적인 성장 배지가 공급되어야 한다. 세포에 공급된 화합물들의 혼합물 및 세포 자체의 부산물로부터, 원하는 단백질을 인간 치료법으로 사용하기에 충분한 순도로 분리하는 것은 엄청난 과제를 제기한다.

다양한 양태에서, 본원에 기재된 생물 반응기는 항체 치료제를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 범위 내의 항체는, 트라스투주맙(HERCEPTIN®)을 포함하는 항-HER2 항체(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), 미국 특허 제5,725,856호); 항-CD20 항체, 예를 들면, 미국 특허 제5,736,137호에서와 같은 키메라 항-CD20 "C2B8"(RITUXAN®), 미국 특허 제5,721,108호에서와 같은 2H7 항체의 키메라 또는 인간화 변이체, B1 또는 토시투모맙(BEXXAR®); 항-IL-8(St John et al., Chest, 103:932 (1993) 및 국제 공개공보 제WO 95/23865호); 인간화 및/또는 친화성 성숙된 항-VEGF 항체를 포함하는 항-VEGF 항체, 예를 들면, 인간화 항-VEGF 항체 huA4.6.1 AVASTIN®(Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992), 국제 공개공보 제WO 96/30046호 및 제WO 98/45331호, 1998년 10월 15일 공개됨); 항-PSCA 항체(WO01/40309); S2C6 및 이의 인간화 변이체를 포함하는 항-CD40 항체(WO00/75348); 항-CD11a(미국 특허 제5,622,700호, WO 98/23761, Steppe et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), 및 Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)); 항-IgE(Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993) 및 국제 공개 제WO 95/19181호); 항-CD18(1997년 4월 22일에 발행된 미국 특허 제5,622,700호, 또는 1997년 7월 31일 공개된 WO 97/26912); 항-IgE(E25, E26 및 E27 포함; 1998년 2월 3일에 발행된 미국 특허 제5,714,338호 또는 1992년 2월 25일에 발행된 미국 특허 제5,091,313호, 1993년 3월 4일에 발행된 WO 93/04173 또는 1998년 6월 30일에 출원된 국제 출원 제PCT/US98/13410호, 미국 특허 제5,714,338호); 항-Apo-2 수용체 항체(1998년 11월 19일에 공개된 WO 98/51793); cA2(REMICADE®), CDP571 및 MAK-195를 포함하는 항-TNF-α 항체(1997년 9월 30일에 발행된 미국 특허 제5,672,347호, Lorenz et al. J. Immunol. 156 (4):1646-1653 (1996) 및 Dhainaut et al. Crit. Care Med. 23 (9):1461-1469 (1995) 참조); 항-조직 인자(TF)(1994년 11월 9일에 부여된 유럽 특허 제0420937 B1호); 항-인간 α4β7 인테그린(1998년 2월 19일에 공개된 WO 98/06248); 항-EGFR(1996년 12월 19일에 공개된 WO 96/40210에서와 같은 키메라화 또는 인간화 225 항체); 항-CD3 항체, 예를 들면, OKT3(1985년 5월 7일에 발행된 미국 특허 제4,515,893호); 항-CD25 또는 항-tac 항체, 예를 들면, CHI-621(SIMULECT®) 및 (ZENAPAX®)(1997년 12월 2일에 발행된 미국 특허 제5,693,762호 참조); 항-CD4 항체, 예를 들면, cM-7412 항체(Choy et al. Arthritis Rheum 39 (1):52-56 (1996)); 항-CD52 항체, 예를 들면, CAMPATH-1H(Riechmann et al. Nature 332:323-337 (1988)); 항-Fc 수용체 항체, 예를 들면, Graziano et al. J. Immunol. 155 (10):4996-5002 (1995)에서와 같이 FcγRI에 대한 M22 항체; 항암 배아 항원(CEA) 항체, 예를 들면, hMN-14(Sharkey et al. Cancer Res. 55 (23Suppl):5935s-5945s (1995); huBrE-3, hu-Mc 3 및 CHL6을 포함하는 유방 상피 세포에 대한 항체(Ceriani et al. Cancer Res. 55 (23):5852s-5856s (1995); 및 Richman et al. Cancer Res. 55 (23 Supp):5916s-5920s (1995)); 대장 암종 세포에 결합하는 항체, 예를 들면 C242(Litton et al. Eur J. Immunol. 26 (1):1-9 (1996)); 항-CD38 항체, 예를 들면, AT 13/5(Ellis et al. J. Immunol. 155 (2):925-937 (1995)); 항-CD33 항체, 예를 들면, Hu M195(Jurcic et al. Cancer Res 55 (23 Suppl):5908s-5910s (1995) 및 CMA-676 또는 CDP771); 항-CD22 항체, 예를 들면, LL2 또는 LymphoCide(Juweid et al. Cancer Res 55 (23 Suppl):5899s-5907s (1995)); 항-EpCAM 항체, 예를 들면, 17-1a (PANOREX®); 항-GpIIb/IIIa 항체, 예를 들면, 압식시맙 또는 c7E3 Fab(REOPRO®); 항-RSV 항체, 예를 들면, MEDI-493(SYNAGIS®); 항-CMV 항체, 예를 들면, PROTOVIR®; 항-HIV 항체, 예를 들면, PRO542; 항-간염 항체, 예를 들면, 항-Hep B 항체 OSTAVIR®; 항-CA 125 항체 OvaRex; 항-이디오타입 GD3 에피토프 항체 BEC2; 항-αvβ3 항체 VITAXIN®; 항-인간 신장 세포 암종 항체, 예를 들면, ch-G250; ING-1; 항-인간 17-1A 항체(3622W94); 항-인간 결장 직장 종양 항체(A33); GD3 강글리오사이드에 대한 항-인간 흑색종 항체 R24; 항-인간 편평 세포 암종(SF-25); 및 항-인간 백혈구 항원(HLA) 항체, 예를 들면, Smart ID10 및 항-HLA DR 항체 Oncolym(Lym-1)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원의 항체에 대한 바람직한 표적 항원은 HER2 수용체, VEGF, IgE, CD20, CD11a 및 CD40이다.

생물 반응기 생성물을 정제하기 위한 임의의 적합한 방법이 고려된다. 일부 단백질은 세포로부터 주변 성장 배지로 직접 분비될 수 있고, 다른 것들은 세포내에서 만들어진다. 후자의 단백질의 경우, 정제 과정의 첫 번째 단계는 세포의 용해를 포함하며, 이는 기계적 전단, 삼투압 충격 또는 효소 처리를 포함하는 다양한 방법으로 수행할 수 있다. 이러한 파괴는 세포의 전체 내용물을 균질물로 방출하고, 또한 이의 작은 크기로 인해 제거하기 어려운 세포 미만 단편들을 생성한다. 이들은 일반적으로 차등 원심 분리 또는 여과에 의해 제거된다. 작은 규모에서도, 단백질 생성 런 과정에서 세포의 자연사 및 세포내 숙주 세포 단백질의 방출로 인해 직접 분비되는 단백질로 동일한 문제가 발생한다.

관심 단백질을 함유하는 정제된 용액이 수득되면, 세포에 의해 생성된 다른 단백질로부터의 분리가 일반적으로 상이한 크로마토그래피 기술들의 조합을 사용하여 시도된다. 이러한 기술은 항체/항원 친화성, 전하, 소수성 정도 또는 크기를 기준으로 하여 단백질 혼합물을 분리한다. 이러한 기술들 각각에 대해 여러 가지 상이한 크로마토그래피 수지를 사용할 수 있으므로, 관련된 특정 단백질에 대한 정제 스킴(scheme)을 정확하게 맞출 수 있다. 이러한 각각의 분리 방법의 핵심은, 단백질을 긴 컬럼 아래로 상이한 속도로 이동시켜 컬럼을 더 아래로 통과할 때 증가하는 물리적 분리를 달성하거나, 분리 배지에 임의로 부착되게 하여 상이한 용매들에 의해 차등적으로 용출되게 할 수 있다. 일부 경우에, 불순물이 컬럼에 특이적으로 부착시, 원하는 단백질이 불순물로부터 분리되고, 관심 단백질이 분리되지 않는 경우, 즉, 관심 단백질이 "플로우-스루"에 존재하지 않는다.

정제될 단백질과 고정화된 포획제 사이의 특정한 상호 작용을 이용하는 친화성 크로마토그래피도 일부 단백질에 대한 옵션일 수 있다. 단백질 A는 단백질의 친화성 크로마토그래피에 유용한 흡착제, 예를 들면, Fc 영역을 함유하는 항체이다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 대해 높은 친화성(인간 IgG에 대해 약 10 내지 8M)으로 결합하는 황색 포도상구균으로부터의 41kD 세포벽 단백질이다.

단백질은 제어된 공극 유리(Sulkowski, E. Protein Purification: Micro to Macro, pgs 177-195 (1987); Chadha et al. Preparative Biochemistry 11 (4):467-482 (1981)) 또는 유도화되지 않은 실리카(Reifsnyder et al. J. Chromatography 753:73-80 (1996))를 사용하여 정제할 수 있다.

본원에 기술된 방법을 사용하여 정제되는 단백질은 일반적으로 재조합 기술을 사용하여 생산된다. 재조합 단백질을 생성하는 방법은 예를 들면, 미국 특허 제5,534,615호 및 제4,816,567호에 설명되어 있으며, 특히 인용에 의해 본원에 포함된다. 바람직한 양태에서, 관심 단백질은 CHO 세포에서 생성된다(예를 들면, WO 94/11026 참조). 본원에 기술된 공정을 사용하여 정제될 수 있는 단백질의 예는 위에 기술되어 있다.

특정 양태(예를 들면, 항체 생산)에서, 단백질 A 기반 수단을 사용하여 정제를 달성할 수 있다. 고체상에 고정된 단백질 A는 CH₂/CH₃ 영역 함유 단백질을 정제하기 위해 사용된다. 고체상은 바람직하게는 단백질 A를 고정하기 위한 유리, 실리카, 아가로스 또는 폴리스티렌 표면을 포함하는 컬럼이다. 바람직하게는, 고체상은 제어된 공극 유리 컬럼 또는 규산 컬럼이다. 종종, 컬럼은 컬럼에 대한 비특이적 부착을 방지하기 위해 글리세롤과 같은 시약으로 코팅된다. Bioprocessing Limited로부터 상업적으로 입수 가능한 PROSEP A™ 컬럼은 글리세롤로 코팅된 단백질 A 제어된 공극 유리 컬럼의 예이다. 본원에서 고려되는 컬럼의 다른 예는 POROS 50 A™(폴리스티렌) 컬럼 또는 rProtein A SEPHAROSE FAST FLOW™(아가로스) 컬럼을 포함한다.

단백질 A 크로마토그래피를 위한 고체상은 적합한 완충액으로 평형을 이룬다. 예를 들면, 평형화 완충액은 25mM Tris, 25mM NaCl, 5mM EDTA, pH 7.1일 수 있다.

재조합 숙주 세포로부터 유래된 오염된 제제는 평형 완충액과 동일할 수 있는 로딩 완충액을 사용하여 평형화된 고체상에 로딩된다. 오염된 제제가 고체상을 통해 유동할 때, 단백질은 고정된 단백질 A에 흡착되고 다른 오염물(예를 들면, 단백질이 CHO 세포에서 생산되는 중국 햄스터 난소 단백질, CHOP)은 고체상에 대해 비특이적으로 결합할 수 있다.

순차적으로 수행되는 다음 단계는 중간 세척 단계에서 고체상을 세척함으로써 고체상, 항체 및/또는 단백질 A에 결합된 오염물을 제거함을 수반할 수 있다. 로딩 후, 고체상은 중간 세척 단계를 개시하기 전에 평형화 완충액으로 평형화될 수 있다. 중간 세척 완충액은 염 및 추가의 화합물을 포함할 수 있으며, 상기 추가의 화합물은 (a) 세제(바람직하게는 폴리소르베이트, 예를 들면, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80); (b) 용매(바람직하게는 헥실렌 글리콜); 및 (c) 중합체(바람직하게는 PEG)이다. 사용되는 염은 관심 단백질에 따라 선택될 수 있지만, 바람직하게는 특히 항체가 트라스투주맙과 같은 항-HER2 항체인 아세테이트(예를 들면, 아세트산나트륨); 또는 특히 항체가 E26과 같은 항-IgE 항체인 시트레이트(예를 들면, 시트르산나트륨)이다. 상기 조성물 중의 염 양 및 추가의 화합물의 양은, 조합된 양이 관심 단백질을 실질적으로 제거하지 않으면서 오염물(들)을 용리시키게 하는 양이다. 이러한 세척 완충액에서 바람직한 염 농도는 약 0.1 내지 약 2M, 보다 바람직하게는 약 0.2 내지 약 0.6M이다. 유용한 세제 농도는 예를 들면, 세제가 폴리소르베이트인 경우, 약 0.01 내지 약 5%, 보다 바람직하게는 약 0.1 내지 1%, 가장 바람직하게는 약 0.5%이다. 예시적인 용매의 농도는 약 1 내지 40%, 바람직하게는 약 5 내지 약 25%이다. 예를 들면, 본원의 예에서 E26에 대한 용매(헥실렌 글리콜)의 바람직한 농도는 약 20%인 반면, 트라스투주맙의 경우 용매(다시 헥실렌 글리콜)의 바람직한 농도는 약 10%였다. 추가의 화합물이 중합체(예를 들면, PEG 400 또는 PEG 8000)인 경우, 이의 농도는 예를 들면, 약 1 내지 약 20%, 바람직하게는 약 5 내지 약 15%일 수 있다.

용출된 단백질 제제는 단백질 A 크로마토그래피 단계 이전에 또는 이후에 추가의 정제 단계를 거칠 수 있다. 예시적인 추가의 정제 단계는 하이드록실아파타이트 크로마토그래피; 투석; 항체를 사용하여 단백질을 포획하는 친화성 크로마토그래피; 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC); 황산암모늄 침전; 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; 및 겔 여과를 포함한다. 본원의 예에서, 단백질 A 크로마토그래피 단계는 다운스트림 양이온 교환(SP-세파로스) 및 음이온 교환(Q-세파로스) 정제 단계가 이어진다.

이렇게 회수된 단백질은 약제학적으로 허용되는 담체로 제형화될 수 있으며, 이러한 분자에 대해 알려진 다양한 진단, 치료 또는 기타 용도에 사용된다.

생물 반응기 생성물의 약제학적 조성물

본 발명의 생물 반응기에 의해 생성된 생성물은 완충액을 포함하는 약제학적으로 허용되는 담체(부형제)와 혼합되어, 질환 또는 장애를 완화시키는 데 사용하기 위한 약제학적 조성물을 형성할 수 있다. "허용 가능한"은 담체가 조성물의 활성 성분과 상용성(및 바람직하게는 활성 성분을 안정화할 수 있음)이어야 하고 치료되는 대상체에게 해롭지 않아야함을 의미한다. 완충액을 포함하는 약제학적으로 허용되는 부형제(담체)의 예는 당업자에게 명백할 것이며 이전에 기술되어 있다. 예를 들면, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover] 참조. 하나의 예에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은, 표적 항원의 상이한 에피토프들/잔기들을 인식하는 하나 이상의 항-HLA-DQ8 항체들을 함유한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 동결 건조된 제형 또는 수용액 형태의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다(Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 완충액, 예를 들면, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들면, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(잔기 약 10개 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 포도당, 만노스 또는 덱스트란을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 짝이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 본원에 추가로 설명된다.

일부 예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 생물 반응기 생성물을 함유하는 리포좀을 포함하며, 이는 임의의 적합한 방법, 예를 들면, 문헌[Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호]에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 순환 시간이 향상된 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 기재되어 있다. 특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물로의 역상 증발 방법에 의해 발생될 수 있다. 리포좀은 한정된 공극 크기의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경의 리포좀이 수득된다.

생물 반응기 생성물은, 예를 들면, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노 입자 및 나노 캡슐)에 또는 매크로 에멀젼에 포획될 수 있다. 예시적인 기술은 이전에 설명되었으며, 예를 들면, 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]을 참조한다.

다른 예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 지속 방출 형식으로 제형화될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 상기 매트릭스는 예를 들면, 성형된 물품, 예를 들면 필름 또는 마이크로캡슐 형태로 존재한다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들면, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면, LUPRON DEPOT™(락트산-글리콜 산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 마이크로스피어), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.

생체내 투여에 사용되는 약제학적 조성물은 멸균되어야 한다. 이는 예를 들면, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다. 치료 항체 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트가 있는 컨테이너, 예를 들면, 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 스톱퍼가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 배치된다.

본원에 기재된 약제학적 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여 또는 흡입 또는 취입에 의한 투여를 위한 단위 투여 형태, 예를 들면, 정제, 환제, 캡슐제, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액 또는 좌약일 수 있다.

정제와 같은 고체 조성물을 제조하기 위해, 주요 활성 성분은 약제학적 담체, 예를 들면, 통상적인 정제화 성분, 예를 들면, 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 마그네슘 스테아레가트, 인산이칼슘 또는 검, 및 기타 약제학적 희석제, 예를 들면, 물과 혼합되어, 본원 명세서의 화합물 또는 이의 비독성의 약제학적으로 허용되는 염의 균질 혼합물을 함유하는 고체 예비 제형 조성물을 형성할 수 있다. 이러한 예비 제형 조성물을 균질한 것으로 나타내는 경우, 활성 성분이 조성물 전체에 고르게 분산되어 조성물이 정제, 환제 및 캡슐제와 같은 동일하게 효과적인 단위 투여 형태로 쉽게 세분될 수 있음을 의미한다. 이후 이러한 고체 예비 제형 조성물은 0.1 내지 약 500mg의 본 발명의 활성 성분을 함유하는 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분된다. 신규한 조성물의 정제 또는 환제는 코팅될 수 있거나 그렇지 않으면 배합되어, 연장된 작용의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들면, 정제 또는 환제는 내부 투여 및 외부 투여 성분을 포함할 수 있으며, 후자는 전자를 덮는 외피 형태이다. 두 성분은, 위에서 붕해에 저항하는 역할을 하고 내부 성분이 십이지장 내로 온전히 통과하거나 방출이 지연되게 하는 장용 층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질이 이러한 장용 층 또는 코팅에 사용될 수 있으며, 이러한 물질은 다수의 중합체 산 및 중합체 산과 셸락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한다.

적합한 표면활성제는 특히 비이온성 제제, 예를 들면, 폴리옥시에틸렌소르비탄(예를 들면, Tween™ 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 기타 소르비탄(예를 들면, Span™ 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 표면활성제를 포함하는 조성물은 편리하게는 0.05 내지 5%의 표면활성제를 포함할 것이며, 이는 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 필요에 따라 기타 성분, 예를 들면, 만니톨 또는 다른 약제학적으로 허용되는 비히클이 첨가될 수 있음이 이해될 것이다.

적합한 에멀젼은 상업적으로 입수 가능한 지방 에멀젼, 예를 들면, Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™, Lipofundin™ 및 Lipiphysan™을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 미리 혼합된 에멀젼 조성물에 용해될 수 있거나 또는 다르게는 오일(예를 들면, 대두유, 잇꽃유, 면실유, 참기름, 옥수수유 또는 아몬드유) 및 인지질(예를 들면, 계란 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과 혼합시 형성되는 에멀젼에 용해될 수 있다. 에멀젼의 긴장성을 조정하기 위해 기타 성분, 예를 들면, 글리세롤 또는 포도당이 첨가될 수 있음이 이해될 것이다. 적합한 에멀젼은 일반적으로 최대 20%, 예를 들면, 5 내지 20%의 오일을 함유한다.

에멀젼 조성물은 생물 반응기 생성물(예를 들면, 항체)을 Intralipid™ 또는 이의 성분(대두유, 계란 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합하여 제조되는 것일 수 있다.

흡입 또는 통기를 위한 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 수성 또는 유기 용매 또는 이들의 혼합물 중의 용액 및 현탁액 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 언급한 바와 같이 적합한 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 조성물은 국소 또는 전신 효과를 위해 경구 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여된다.

바람직하게는 멸균된 약제학적으로 허용되는 용매 중의 조성물은 기체를 사용하여 분무될 수 있다. 분무 용액은 분무 장치로부터 직접 호흡될 수 있거나, 분무 장치가 안면 마스크, 텐트 또는 간헐적 양압 호흡 기기에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은 적절한 방식으로 제형을 전달하는 장치로부터 바람직하게는 경구 또는 비강으로 투여될 수 있다.

실시예

실시예 1. 고밀도 생물 반응기 배양물에 버블 없이 기체 전달하기 위한 실리콘 기반 막

최근의 기술 개발로 인해 세포 배양이 매우 높은 세포 밀도를 달성할 수 있게 되었으며, 이는 단클론 항체의 높은 생산성을 가져온다.[1] 그러나, 이러한 생물 공정에서 용존 산소(DO)를 제어하는 것은, 고밀도 배양물을 지원하기 위한 높은 수준의 산소 및 이산화탄소의 전달을 필요로 하기 때문에 여전히 어려운 과제이다. 높은 전달을 달성하기 위해, 마이크론 크기의 버블이 반응기 내로 방출되는 마이크로스파징과 같은 방법이 사용된다.[2] 그러나, 마이크로스파징의 사용은 버블 분출 관련 세포 사멸 및 생물 반응기의 포움 발생 위험을 증가시켜, 조기 런 종료 및 생성물의 손실로 이어질 수 있다.[3,4] 또한, 포움 발생 및 버블 분출 관련 세포 사멸을 방지하기 위한 소포제 및 전단 보호제의 첨가는, 극단적인 경우, 세포에 대해 독성일 수 있는 수준으로 첨가해야 한다.[5]

버블 스파징과 관련된 과제를 제거하기 위해, 다공성 및 비-다공성 막을 사용하는 버블 없는 통기법이 세포 배양 응용 분야에 대해 조사되었다. 예를 들면, 마이크론 크기의 공극이 있는 중합체 막은 버블 없는 통기법으로 설명되어 있으며, 여기서, 배양과 기체 사이의 압력의 균형은 버블 없는 전달이 막의 공극을 통해 기체-액체 계면에서 이루어지게 한다.[6 내지 8] 또한, 공극 습윤화 문제를 방지하는 소수성 막의 사용은, 공극 내에 포획된 액체가 배양물로의 기체 전달에 대한 추가의 장벽을 생성하기 때문에, 친수성 막에 비해 더 향상된 전달을 보여주었다.[9] 비-다공성 실리콘 중합체 기반 막(예를 들면, 폴리디메틸실록산, PDMS)은 버블 없는 기체 전달에도 사용되어 왔으며, 여기서, 기체 분자는 치밀한 중합체를 통해 확산되고 막-배양 접촉 표면에서 배양으로 전달된다.[10 내지 12] 다공성 막 및 비-다공성 막이 세포 배양에 적용되었지만, 막 디자인의 한계 및 막 작동과 관련된 과제로 인해 낮은 밀도(<20e6cell/mL)로만 달성되었다.[13] 특히, 기체 및 배양 압력이 다공성 막에서 부적절하게 균형을 이루는 경우, 마이크론 크기의 버블이 형성되어 버블 분출 세포 사멸 및 생물 반응기 포움 발생이 형성되고 이의 위험이 생길 수 있다. 비-다공성 막에서, 사용되는 실리콘 기반 튜빙은 두껍기 때문에 중합체를 통한 기체 분자의 전달이 느려, 고밀도 배양물을 지원하기에 충분한 기체 교환을 방해한다. 버블 스파징과 관련된 과제를 극복하고 고밀도 배양물을 지원하기 위해, 버블 없는 기체 교환을 위한 대체 방법과 재료가 필요하다.

고밀도 배양물을 지원하기 위해 향상된 기체 전달을 허용할 수 있는 성질을 가진 새로운 유형의 막이 개발되었다.[14] 상기 막은, 번들로 패키징되고 기체 전달을 위해 외부 재순환 루프를 통해 생물 반응기에 부착될 수 있는 유닛 내부에 포팅된 소형(ID 190um, OD 300um), 얇은 벽(55um) PDMS 중공 섬유를 함유한다. 기체는 중공 섬유 루멘을 통해 보내지고 배양액은 막 유닛의 쉘측을 통과하며 기체 전달은 PDMS-액체 접촉 표면에서 발생한다. 여기서, 고밀도 관류 배양물(>20e6cell/mL)에서의 기체 전달을 위한 이러한 막의 사용이 설명된다.

kLa(물질 전달 계수)를 측정하기 위한 연구는, 2리터(L) 생물 반응기에서 표면적이 2,500cm²인 막과 마이크로스파저 사이에서 유사한 산소(O₂)의 물질 전달 효율을 보였다. 재순환 유속을 증가시킴으로써 향상된 물질 전달이 달성되었으며, 이는 상기 막의 능력을 추가로 밝히기 위해 최적화 작업을 수행할 수 있음을 시사한다. O₂ 전달 이외에도, 막의 루멘을 통과한 공기는 천공 구멍 스파징과 비슷한 속도로 이산화탄소(CO₂)를 제거하여, 생물 반응기에서 모든 스파징을 제거하기 위한 막의 잠재적인 사용을 나타낸다. 이러한 막이 고밀도 CHO 세포 배양을 지속하기에 충분한 DO를 제공하는지 측정하기 위해, 여러 세포 배양 실험을 수행했다. 첫 번째 실험에서는 O₂ 첨가를 위한 마이크로스파징을 대체하기 위해 단일 막을 생물 반응기에 부착했다(CO₂를 스트리핑하기 위해 천공 구멍 스파징을 사용함). DO는 수 주의 과정 동안 60%로 유지되었고, 40e6 내지 120e6cell/mL의 배양 밀도를 지원했다. 후속적인 실험에서 버블 없는 생물 반응기 설정을 시험했으며, 여기서 2개의 막을 일련으로 배치했으며 하나는 CO₂ 스트리핑용이고 다른 하나는 산소화용이다. 충분한 산소 전달 및 120mmHg 미만의 pCO₂로의 배양에서 수 주의 과정 동안 20 내지 30e6cell/mL의 세포 밀도가 유지되었다. 상기 기술을 사용하면 배양물에 해로운 영향을 미칠 수 있는 전단 보호제 및 소포제를 첨가할 필요를 제거하여 고밀도 생물 반응기 배양물이 개선될 수 있다. 또한, 스파징을 대체하는 데 성공한 것으로 간주되면, 상기 막은 관류 및 유가식 시스템 둘 다에서 높은 세포 밀도 배양을 가능하게 하는 혁신적인 방식이 될 것이다.

방법/실험

실리콘 막과의 기체 교환에 대한 초기 시험을 100L SUB에서 수행했다.

65L의 물로 충전된 생물 반응기 백(SUB)을 사용한다. 2.1m² PDMS 막(PermSelect® 실리콘 중공 섬유 모듈)을 SUB의 재순환 루프에 부착했다. 5LPM의 물이 막 쉘 측면을 통해 재순환되었다. 산소 전달을 모니터링하기 위해 DO 프로브를 SUB 내로 삽입했다. O₂ 첨가를 계측하기 전에 N2를 막 루멘을 통해 유동하게 하여 반응기로부터 O₂를 제거했다(%DO<20%). 이후, O₂는 상이한 속도(0.1LPM, 1LPM)로 막을 통해 유동되었다. 비교를 위해, 0.1LPM 및 1LPM의 O₂도 SUB에서 다공성 스파저(15㎛)를 통해 유동되었다.

kLa 연구를 위해, 2,500cm² PDMS 막(PermSelect® 실리콘 중공 섬유 모듈)을 2L 유리 생물 반응기의 재순환 루프에 부착했다. 1g/L 폴록사머 188(pluronic)이 포함된 2L의 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 37로 가열하고 원심 펌프(Levitronix)를 상이한 유속으로 사용하여 막의 쉘 측면을 통해 재순환시켰다(표 1). DO 프로브(Hamilton Visiferm) 및 CO₂ 프로브(Mettler Toledo)를 생물 반응기에 부착하여 기체 전달을 모니터링했다. O₂ 첨가를 계측하기 전에 N2를 막을 통해 유동시켜 반응기로부터 O₂를 제거했다(%DO<10%). O₂ 첨가의 경우, 공기는 포화될 때까지 상이한 속도로 막을 통해 유동됐다(%DO 수준이 벗어남, ~100%). 막 기체 교환을 기존의 스파징과 비교하기 위해, 천공 구멍 스파저 및 마이크로다공성 스파저(15um 공극)를 통해 공기도 상이한 유속으로 유동시켰다. CO₂ 제거 전에 공기와 혼합된 10% CO₂가 막을 통해 유동되었다(pCO₂>55mmHg). CO₂ 스트리핑의 경우, CO₂의 안정화에 도달할 때까지(pCO₂ 수준 벗어남, ~1 내지 2mmHg) 공기가 막을 통해 상이한 속도로 유동되었다. 기존의 CO₂ 제거 방법과 비교하기 위해, kLa를 측정하기 위해 천공 구멍 스파저를 통해 공기를 상이한 속도로 유동시켰다. kLa는 다음과 같이 시험된 상이한 조건들에 대해 측정되었다:

세포가 부재하는 경우,

이후,

따라서, 기울기

이다.

여기서, C^*는 포화 상태의 기체 농도(%DO 또는 mmHg)이고 (포화 상태에서 마지막 10개 계측 포인트들의 평균), C₀는 초기 기체 농도이고, C_t는 시간 t에서의 기체 농도이다.

정상 상태로부터 비정상 상태로의 작동.

실리콘 기반 막이 마이크로스파징에 대한 대체물로 사용될 수 있는지 측정하기 위해, 2,500cm² 막(PermSelect® 실리콘 중공 섬유 모듈)을 관류 배양 생물 반응기의 재순환 루프에 중공 섬유 이후에 부착했다(도 1c). 10e6cell/mL로 씨딩된 전용 CHO 세포주(CHO1)를 40e6cell/mL로 성장시키고(3일) 세포 방출이 40e6cell/mL의 밀도를 유지하기 시작했다. 막에 대한 y-off는 밀도까지 램프-업하는 동안 및 정상 상태 작동의 첫 4일 동안 폐쇄된 상태로 유지되었으며, %DO는 마이크로스파징 및 천공 구멍 스파징으로 60%로 유지되었다. 정상 상태 작동 4일 후, 재순환의 50%(총 0.8LPM, 0.4LPM = 50%)가 막을 통해 보내졌다. 또한, 마이크로스파저를 끄고 O₂ 기체 라인을 막으로 전환하여 0 내지 0.1LPM 산소를 제공하여 %DO를 60%로 유지했다. 마지막으로, (CO₂ 스트리핑용) 천공 구멍 스파저는 켜진 채로 유지되었지만 기체 혼합물은 0.5LPM O₂에서 0.25LPM O₂ + 0.25LPM 공기로 전환되었다. 세포는, 배양 동안 DO를 유지하고 세포에 미치는 영향을 최소화할 수 있는지를 측정하기 위해, 막을 사용하여 40X10⁶cell/mL에서 상기 설정으로 3일 동안 배양되었다. 정상 상태 작동 3일 후, 세포 방출을 낮추고 세포 밀도를 120X10⁶cell/mL로 증가시켜 막이 고밀도 배양물을 지원할 수 있는지 확인했다. 작동 동안 배양물 활력을 측정하기 위해 생존률 및 LDH를 모니터링했다. %DO(용존 산소)를 모니터링하여 막 기체 교환을 통해 세포에 충분한 O₂가 공급되었는지 확인했다.

높은 세포 밀도에서의 램프-업 및 작동.

높은 세포 밀도로 램프-업하는 동안의 배양물에 대한 막의 영향을 측정하기 위한 두 번째 시험으로서, 2,500cm² 막(PermSelect® 실리콘 중공 섬유 모듈)을 관류 배양 생물 반응기의 재순환 루프에 중공 섬유 이후에 부착했다. 전체 재순환의 절반(총 0.8LPM, 0.4LPM = 50%)이 배양 0일부터 막을 통해 전달되었다. CHO1은 10e6로 씨딩되었고, 비정상 상태 작동에서 성장되어 막에 의해 지원되는 밀도 및 최대 밀도로의 램프-업 동안의 막의 효과를 측정했다. 0.25LPM 공기 + 0.25LPM O₂의 혼합물이 (CO₂ 제거용) 천공 구멍 스파저를 통해 보내졌다. 배양 동안 %DO를 60%로 유지하기 위해 0 내지 0.1LPM의 O₂가 O₂를 공급하기 위한 막을 통해 보내졌다. 작동 동안의 배양물 활력을 측정하기 위해 생존률 및 LDH를 모니터링했다. %DO를 모니터링하여 막 기체 교환을 통해 세포에 충분한 O₂가 공급되었는지 측정했다.

고밀도 관류 배양에서 버블 없는 폭기

고밀도 배양에서의 O₂ 첨가 및 CO₂ 스트리핑 및 마이크로스파저 교체에 대한 kLa 실험에 기초하여, 스파징 없이 작동할 수 있는지를 측정하기 위해 버블 없는 설정(도 1d)을 시험했다. 2개의 2,500cm² 막(PermSelect® 실리콘 중공 섬유 모듈)을 관류 배양 반응기의 재순환 루프에 중공 섬유 이후에 부착했다. 제1 막은 CO₂ 스트리핑 및 pH 제어를 위해 사용했으며, 저밀도 배양 동안 pH를 제어하기 위해 공기, O₂ 및 CO₂의 혼합물이 유동되고 이후에 고밀도 배양 동안 CO₂를 스트리핑하기 위해 공기와 O₂의 혼합물로 전환되었다. 제2 막은 배양 동안 DO를 60%로 지원하기 위해 보충 O₂ 첨가를 위해 사용했다. 0.1LPM 공기를 반응기의 헤드스페이스로 유동하게 하여 생물 반응기에 양압을 제공했다. 표 4는 각각의 막에서의 배양 동안 매일 사용된 기체 유동 목록을 포함한다. 2L 생물 반응기에 1e6cell/mL로 씨딩된 전용 CHO 세포주(CHO2)를 30e6cell/mL로 성장시키고, 세포 방출와 함께 25e6 내지 30e6cell/mL로 유지했다. 밀도를 램프-업하는 동안 첫 6일 동안 재순환 유동의 절반(총 0.8LPM, 0.4LPM = 50%)이 막을 통해 전달되었다. 7일에 0.4LPM 재순환 유동에 의해 DO가 지속되지 않았으므로, 100%의 재순환(0.8LPM)이 막을 통해 보내져 CO₂를 스트리핑하고 O₂를 첨가했다. 작동 동안의 배양물 활력을 측정하기 위해 생존률 및 LDH를 모니터링했다. %DO를 모니터링하여 막 기체 교환을 통해 세포에 충분한 O₂가 공급되었는지 측정했다.

결과 및 논의

막 기체 교환을 통한 O ₂ 첨가의 측정

우선 비다공성 PDMS 막을 사용하는 기체 전달을 시험하기 위해, 전달 표면적이 2.1m²인 막을 100L SUB의 재순환 루프에 부착했다. SUB는 65L의 물로 충전되었고 5LPM으로 막을 통해 재순환되었다. 빌트-인 스파저에 비해 막에서 더 빠른 기체 전달이 관찰되었으며(도 10), 이는 막 유닛 내에서 섬유의 넓은 표면적(2.1m²)에 기인할 수 있다. 이러한 결과는 기존의 스파징 방법에 비해 막을 사용한 O₂ 첨가 및 기체 전달 계수(kLa)의 측정에 대한 추가의 조사를 독려했다.

천공 구멍 및 마이크로다공성 스파징은 충분한 DO를 제공하기 위해 일반적으로 고밀도 배양에 사용되지만, 버블-분출 관련 세포 사멸 및 반응기 포움 형성이 조기 런 종료 및 생성물 손실을 유발할 수 있다. 버블 없는 막 기체 교환이 이러한 스파징 방법과 견줄만한 지 측정하기 위해, 소규모 2L 생물 반응기를 모델 유체(PBS + 1g/L Pluronic)로 설정하고, 산소 첨가를 유속 경로 "B"를 통한 상이한 공기 유속 및 일정한 재순환 유속(0.8 LPM)에 대해 모니터링했다(도 3). kLa는 마이크로스파징에서 가장 높았지만, 막 기체 전달은 마이크로스파징과 동일한 오더의 규모로 전달 계수를 달성했다. 천공 구멍 스파징은 가장 느린 O₂ 첨가 및 가장 낮은 kLa와 관련이 있다. 그러나, 천공 구멍 스파징은 산소 첨가에 사용될 수 있지만 이의 기능은 주로 다음 섹션에서 논의되는 CO₂ 스트리핑을 위한 것이다.

[표 1]

단일 재순환 유속(0.8LPM) 및 유동 경로를 사용하여 스파징에 대한 막 기체 전달의 초기 비교를 수행했다. 상이한 유동 경로(도 3) 및 재순환 속도가 이전에 설명된 2L 모델 생물 반응기 설정(2,500cm² 막)에서의 마이크로스파징에 필적하도록 막 기체 전달을 향상시킬 수 있는지를 측정하기 위해, 추가의 연구를 수행했다. 유동 경로 "A"의 경우, 재순환 속도의 변화로 kLa에서의 차이가 관찰되지 않았다. 이는 액체가 유닛 중앙에 있는 치밀하게 패킹된 고밀도 PDMS 막 섬유 번들로 유동할 수 없기 때문에 전달이 덜 발생하기 때문일 수 있다(표 2). 유동 경로 "B"에서는, 유속이 증가함에 따라 kLa가 증가되어 더 빠른 유동이 더 빠른 기체 교환을 허용함을 나타낸다. 또한, 높은 유속에서 마이크로스파징에 필적하는 kLa가 관찰되었다. 마지막으로, 유동 경로 "B"에 비해 유동 경로 "C"에서의 더 낮은 유속에 대해 더 높은 kLa가 달성되었다. 이러한 결과는 "B"의 쉘 측면 유동의 대부분이 제1 유출구 포트를 떠나 액체가 섬유와 접촉하는 시간을 감소시키고 기체 전달을 낮출 수 있음을 나타낸다.

유동 경로 "C"가 막에서의 기체 교환에 최적인 것처럼 보이지만, 재순환 유동은 경로 "A" 및 "C" 둘 다에서 제한되었다. 증가된 펌프 속도 및 압력 강하로 인한 막 손상 및 파열(도 11)이 0.5LPM 초과의 재순환 유동에 대해 관찰되었다. 막을 사용하여 전달을 개선하려면, 압력 강하 및 막 파열 가능성을 최소화하는 다른 막 디자인 및 유동 경로를 조사해야 한다. 또한, 높은 유속은 배양 중인 세포에 전단을 유발할 수 있으므로, 높은 kLa를 제공하면서 전단을 감소시키는 추가의 디자인을 측정할 필요가 있다.

[표 2]

막 기체 교환에 의한 CO ₂ 스트리핑의 계측

높은 세포 밀도에서 버블 없는 기체 교환에 의해 생물 반응기를 작동하기 위해서는 막을 통한 CO₂ 제거가 필요하다. 여기서, 막을 통한 상이한 유속의 공기들로의 CO₂ 스트리핑을 천공 구멍 스파징을 사용한 스트리핑과 비교했다(표 3). 2L 모델 생물 반응기 시스템에서, 스트리핑 전에 공기와 혼합된 10% CO₂를 생물 반응기에 첨가했다. 후속적으로, 재순환 속도를 일정하게 유지하면서(0.4LPM) 막 또는 천공 구멍 스파저를 통해 100% 공기를 상이한 유속으로 스파징하여 CO₂를 제거했다. 천공 구멍 스파징에 비해 막에서 더 빠른 CO₂ 제거가 관찰되었다. 이는 막의 향상된 N2 전달(공기 중 ~78% N2) 및 전달을 위한 넓은 표면적에 기인할 수 있다. 이러한 결과는 버블 없는 생물 반응기 작동에 향후 적용될 가능성이 높다. O₂ 전달과 마찬가지로, 낮은 전단을 유지하면서 기체 전달을 개선하기 위해 재순환 유속을 증가시키기 위한 최적의 막 디자인을 측정할 필요가 있다.

[표 3]

마이크로스파저를 막 기체 교환으로 교체

버블 스파징은 배양물 활력에 부정적인 영향을 미치는 동시에 포움 발생 및 생물 반응기 손실의 위험을 증가시킬 수도 있다. 특히, 마이크로다공성 스파저에 의해 형성된 마이크론 크기의 버블은 버블이 분출되는 동안 방출된 에너지가 주변 세포를 용해시키는 세포 사멸의 주요 원인으로 간주된다. 또한 이러한 버블에 의해 발생된 포움은 제거하기 어렵고, 종종 배양 동안 생물 반응기에 많은 양의 소포제를 추가할 필요가 있다. 또한, 고밀도에서는 더 많은 마이크로스파징이 필요하므로 더 많은 용해 및 포움이 발생된다. 배양으로부터 마이크로스파징을 제거하면 배양을 개선하고 생물 반응기 작동을 연장하는 데 도움이 될 수 있다. 여기에서는 정상 상태 생물 반응기 작동 동안 및 높은 세포 밀도로 램프-업되는 동안 마이크로스파징 대신 실리콘 기반 막의 사용에 대한 조사가 설명된다.

정상 상태로부터 비정상 상태로의 작동.

기체 교환을 위한 마이크로스파저의 실리콘 막으로의 교체 가능성을 측정하기 위한 초기 시험을 높은 세포 밀도에서의 정상 상태 배양에서 수행했다. 전용 CHO 세포주(CHO1)를, %DO를 60%로 유지하기 위한 천공 구멍 스파징(CO₂ 스트리핑 + O₂ 첨가) 및 마이크로스파징(보충 O₂ 첨가)으로 관류 생물 반응기에서 40e6cell/mL의 밀도로 배양했다(도 4a 및 5a 내지 5c). 밀도가 40e6에 도달하면, 배양을 표준 스파징으로 60% DO로 4일 동안 유지하여, 기저선 %DO 프로파일을 확립했다(도 5a). 4일 후, 0.8LPM 배양 재순환 유동의 절반(0.4 LPM)이 막을 통해 되돌려보내지고, 마이크로스파저로부터의 O₂가 막 기체 교환기에 부착되었으며, 0.25LPM 공기와 0.25LPM O₂ 혼합물이 천공 구멍 스파저를 통해 보내졌다(도 5b). DO는 막을 통한 O₂ 유동의 증가 또는 감소(0 내지 0.1LPM)에 의해 제어되어 60% DO를 유지했다. 막의 개시 동안, 마이크로버블과 달리 막을 사용하는 반응 시간의 변화로 인해 DO가 변동했기 때문에, 변동에 대한 제어를 개선하기 위해 게인이 감소되고 적분이 증가되었다(도 5b). 막으로 3일 동안 정상 상태로 작동한 후, 세포 방출을 감소시켜 밀도를 높이고 막이 더 높은 밀도에서 DO를 유지할 수 있는지 측정했다. 120e6의 밀도가 달성되었지만, 더 높은 밀도로 램프-업하는 동안 DO의 변동이 있었다(도 4a 및 4c). 이러한 막을 통과할 수도 있는 물은 작동 동안 기체 유출구에서 섬유와 필터를 차단할 수 있고 더 높은 기체 유동이 섬유로부터 물을 밀어낼 때까지 기체 전달을 감소시킬 수 있다는 가설을 세웠다. 기체 유동 경로의 물 차단으로 인해 작동 동안 이러한 전달 기간이 감소되는지 또는 비정상 상태 작동 동안 막이 제어될 수 없는지 측정하기 위해 추가의 연구가 필요하다. 작동 동안 %DO를 지속하는 것 이외에도, 대조군에 필적하는 생존률 및 락테이트 데하이드로게나제(LDH)로, 배양물 활력에 대한 막의 명백한 영향이 없었다(도 4b 및 4c). LDH는 세포 밀도가 증가되는 경우에 증가했으며, 이는 주로 배양물에 대한 막의 영향이 아니라 더 높은 세포 밀도의 존재로 인한 것으로 여겨진다. 이러한 결과는 고밀도 배양물에서 마이크로스파징을 대체하기 위한 막의 적용에 대한 가능성을 보장하는 것이다. 앞으로 고밀도로의 램프-업 동안 막의 영향을 이해하기 위한 추가의 연구가 수행되어 배양에 대한 막의 영향을 더 잘 이해하게 되었다.

높은 세포 밀도에서의 램프-업 및 작동.

높은 세포 밀도로 램프-업하는 동안 DO를 제어하기 위해 막이 사용될 수 있는지 측정하기 위해, 막을 배양 재순환 루프에 중공 섬유의 다운스트림에 배치하였다. 또한, 작동 동안 섬유 및 기체 유출구 필터가 물로 차단되는 것을 방지하기 위해, 멸균 배출 병을 막 유닛의 기체 유출구에 부착했다. 세포를 접종하기 전에 0.8LPM 재순환 유동의 절반(0.4LPM)을 막을 통해 전달했다. 세포를 10e6cell/mL로 접종하고 세포 방출 없이 고밀도로 배양하였다. 막을 사용한 생존률은 통상적인 스파징으로의 대조군 반응기와 비슷했다(도 6b). 그러나, 밀도는 통상적인 스파징으로의 ~130e6cell/mL에 비해 ~100e6cell/mL에만 도달했으며, 이는 막이 밀도로 램프-업하는 동안 세포에 약간의 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다(도 6a). 더 높은 세포 밀도는 더 높은 LDH와 관련이 있지만, 생물 반응기의 LDH는 비슷했으며, 이는 작동 동안 배양물 활력에 대한 막의 일부 부정적인 영향을 나타낼 수 있다(도 6c). 치밀하게 패킹된 섬유를 포함하는 현재의 막 디자인은 세포 막에 전단 또는 손상을 일으켜 성장을 늦출 수 있다고 가정된다. 유동 경로가 개선되고 섬유들 사이가 보다 이격된 대체 막 디자인이 구현되면, 막 작동 동안 전단 및 세포 손상을 감소시키고 더 높은 밀도를 달성할 수 있다.

배양 동안, 천공 구멍 스파징 및 막 기체 교환으로 DO가 60%로 제어되었다. 처음에는 천공 구멍 스파저를 통하는 0.25LPM 공기가 O₂로 0.5LPM으로 대체되었다. 천공 구멍 스파저를 통한 O₂가 최대치(0.5LPM)가 되면, 필요에 따라 막을 통해 0에서 0.1LPM O₂로 추가의 O₂가 공급되었다. DO 제어가, 추가의 O₂가 막 교환을 통해 첨가되게 한 후, DO는 60% 설정값 부근에서 변동했다(도 7). PID 제어 루프 게인 및 적분을 변경해도 이러한 변동이 감소되지 않았는데, 이는 막이 초기에 낮은 밀도에 대해 크기가 과잉해졌음을 나타낸다. 밀도가 증가함에 따라 O₂ 수요가 증가되고, 변동이 5일에 안정화되었다(도 7a). 낮은 밀도에서 이러한 변동을 감소시키기 위해 대체 제어 파라미터를 구현할 수 있다. 런 동안 물질 유동 컨트롤러(MFC) 기능 정지가 발생하여 DO 프로파일 및 제어에 영향을 미친다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 특히, 2 내지 4일부터는 천공 구멍 스파저를 통한 산소가 주기적으로 중단되고, 막이 유일한 O₂ 공급원이 되었다. 3일에는 천공 구멍 스파저를 통한 O₂ 공급이 중단되고, DO가 0%로 강하되었기 때문에 기체 공급이 초기의 MFC로 수리하기 위해 일시적으로 또 다른 MFC(수동 DO 제어)로 전환되었다(도 7a, 적색). 대조군은 4 내지 5일에 원래의 MFC로 되돌려으나, MFC가 작동 동안 잠시 중단되면서 런 중간에 몇 가지 추가의 변동이 발생했다(도 7b, 적색). 이전에 논의한 바와 같이 막으로부터의 전단 또는 오작동 MFC로 인한 DO 제어의 손실이 배양물 활력에 부정적인 영향을 미칠 수 있고 대조군에 비해 밀도가 낮아졌는지 평가하기 위해 추가의 연구가 필요하다. 막 기체 유출구의 배기 병이 섬유에서 물이 유동 배출되게 하여 DO 변동을 방지하는 동시에 필터 습윤화를 방지하는 데 도움이 되는지 측정하기 위한 추가의 시험이 필요하다. MFC 기능 정지로 인한 과제에도 불구하고, 막을 통한 O₂ 유동은 최대 유동(0.1LPM)에 도달하지 않았고 매우 높은 세포 밀도(최대 ~100e6cell/mL)를 유지하기에 충분했으며, 이는 고밀도 배양에서 마이크로스파징을 대체하기 위한 막 적용에 대한 가능성을 보장한다.

버블 없는 생물 반응기 작동

생물 반응기로부터 스파징의 제거는 고밀도 배양물을 개선할 수 있으며, 버블의 제거는 버블-분출 관련 세포 사멸을 감소시키고 소포제 추가의 필요성을 제거한다. 여기서, 2개의 막이 중공 섬유의 다운스트림에 배치되었다(예를 들면, 관류 생물 반응기의 재순환 루프에서의 도 1d의 "TFF(접선 유동 여과) 모듈"(예를 들면, 도 1d에 도시됨)). 제1 막이 CO₂ 스트리핑 및 약간의 산소 첨가를 위해 천공 구멍 스파저를 대체하기 위해 사용되었으며, 여기서 산소와 공기의 혼합물이 막 유닛의 루멘을 통해 보내졌다. 또한, 제1 막은 배양 초기에 저밀도 작동 동안 CO₂를 공급하여 pH를 제어한다. 제2 막은 이전에 입증된 바와 같이 마이크로스파저를 대체하기 위해 산소 첨가에만 사용되었다. 버블 없는 생물 반응기 작동을 위한 막에 도전하기 위해 더 높은 전단 감도 및 더 높은 산소 요구량을 가진 제2 전용 CHO 세포주(CHO2)를 사용했다. 세포 방출을 적용하여 25e6 내지 30e6cells/mL의 정상 작동 상태를 유지하는 경우 세포를 1e6cells/mL로 접종하고 30e6cells/mL의 밀도로 배양하였다. 반응기를 작동 동안 소포제를 첨가하지 않고 17일 동안 버블 없이 작동했다. 또한, DO는 전체 작동 기간 동안 60%에 가깝게 유지되었으며, 0%에 도달하지 않았고, 이는 막이 배양을 지속하기에 충분한 O₂를 제공했음을 나타낸다.

버블 없는 반응기에서 밀도로의 램프-업은 대조군 반응기(천공 구멍 스파징 + 마이크로스파징으로의 ATF)보다 1일 더 느렸고, LDH가 더 높았으며, 이는 막으로부터의 전단이 배양물 활력에 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다(도 8). DO는 대체로 60%로 유지되었지만, 대조군은 최적이 아니었으며 동안 상이한 상태들에서 변동이 발생했다(도 9). CHO2 세포주의 O₂ 요구량은 CHO1보다 상당히 높았으며, DO를 지속하기 위해 작업 동안 많은 O₂의 유동을 첨가해야 했다(표 4). 특히, O₂ 요구량은 정상 상태 작동에도 불구하고 지속적으로 증가되었으며, 운영 과정 전반에 걸쳐 더 높은 O₂ 유동을 적용해야 했다. 따라서, DO의 변동은 MFC 및 산소 유동을 조정하는 동안 발생했다. 또한, 시작시 재순환 유동의 절반(0.4LPM)이 막을 통해 전달되었다. 그러나, 높은 산소 요구량을 지원하기 위해 7일에 모든 재순환 유동(0.8LPM)이 막을 통해 전달되었다. 마지막으로, CO₂를 스트리핑하기 위해 공기가 필요하다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 배양 동안 한 번에 충분한 O₂를 공급할 수 있도록 5 내지 6일 사이에 공기를 중단했지만 이에 대응하여 CO₂가 증가했다. 공기 중의 N2의 존재가 스트리핑시 효율을 높여, 버블 없는 작동 동안 CO₂ 제거에 공기 또는 N2가 필요해진다는 가설이 있다. 향후의 버블 없는 런에서, 더 높은 산소 유동을 허용하는 MFC가 막 유닛의 작동의 최적화에 대해 조사될 것이다.

[표 4]

결론

얇은 벽 중공 섬유들의 패킹된 번들을 포함하는 실리콘 기반 막 유닛을 사용하는 버블 없는 기체 전달 방법을 개시했다. 이러한 막을 통한 O₂의 전달은 작동 동안 배양물 활력에 심각한 영향을 미치지 않고 높은 세포 밀도(100 내지 120e6cell/mL)에서 60% DO를 지속하기에 충분했다. 버블 없는 기체 전달은 2개의 막 장치, 즉, CO₂ 스트리핑을 위한 제1 장치 및 O₂ 첨가를 위한 제2 장치로 달성되었다. 세포는 높은 세포 밀도(25 내지 30e6cell/mL)의 배양에서 수 주 동안 생존할 수 있었고, DO는 버블 없는 배양 동안 60%에 가깝게 유지되었다. 또한, 배양 동안 용기 벽 및 중공 섬유에 종종 달라 붙어 층을 형성하는 버블 없는 배양에서는 소포제가 필요하지 않았다. 향후 연구에서, DO 제어는 작동 동안 변동을 감소 및 방지하기 위해 최적화될 것이다. 또한, 이러한 막의 전단 효과에 대한 추가의 조사가 필요하며 전단을 감소시키기 위한 추가의 디자인이 확인될 것이다. 이러한 연구는 고밀도 세포 배양(>20e6cell/mL)에서 기체 전달을 위한 실리콘 기반 막의 사용에 대한 1차 조사이며, 유가식 공정 및 관류 공정 둘 다에서의 적용에 대한 잠재력이 있다. 이러한 막의 구현은 통상적인 스파징과 관련된 많은 문제를 완화하여 고밀도에서 작동하는 동안 조기 런 종료 가능성을 감소시킨다.

참고 문헌

본 출원에는 다음 참고 문헌들이 인용되어 있다. 이들 각각은 이들의 전문이 인용에 의해 본원에 포함된다.

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기타 양태

본원에 개시된 모든 특징적인 구성들은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본원에 개시된 각각의 특징적인 구성은 동일하거나, 동등하거나, 유사한 목적을 제공하는 다른 특징적인 구성으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급하지 않는 한, 개시된 각각의 특징적인 구성은 일반적인 일련의 동등하거나 유사한 특징적인 구성의 예일 뿐이다.

상기 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 용이하게 확인할 수 있으며, 이의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 개시의 다양한 변경 및 변형을 가하여 다양한 용도 및 조건에 적응시킬 수 있다. 따라서, 다른 양태도 청구범위 내에 있다.

Claims (36)

1. 생물 반응기에서 세포를 배양하는 방법으로서, 상기 생물 반응기 내부에 버블(bubble)을 발생시키지 않고 상기 생물 반응기로의/상기 생물 반응기로부터의 기체의 물질 전달(mass transfer)을 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 생물 반응기가 관류 생물 반응기인, 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 생물 반응기가 유가식 생물 반응기인, 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 생물 반응기로의/상기 생물 반응기로부터의 기체의 물질 전달이 기체 전달 모듈에 의해 제공되는, 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 기체 전달 모듈이 비-다공성 막을 포함하는, 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 비-다공성 막이 중합체, 금속 또는 세라믹인, 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 중합체가, 실리콘 검 단독 중합체, 폴리디메틸실록산(PDMS) 또는 실리콘-폴리카보네이트 공중합체를 포함하는, 방법. 제5항에 있어서, 상기 비-다공성 막이 복수의 중공 섬유들을 포함하는, 방법.
8. 제8항에 있어서, 상기 기체 전달 모듈이, 하나 이상의 기체를 통과시키기 위한 상기 중공 섬유들을 통하는 제1 유동 경로 및 세포 배양 배지 및/또는 세포들을 유동시키기 위한 상기 중공 섬유들 주위의 제2 유동 경로를 포함하는, 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 기체 전달 모듈이 상기 생물 반응기의 외부에 위치하는, 방법.
10. 제8항에 있어서, 상기 복수의 중공 섬유들이, 배양 배지 및 세포들이 상기 중공 섬유들을 분리하는 공간들을 통해 주행(travel)하는 유동 경로를 제공하는, 방법.
11. 제12항에 있어서, 상기 공간들이 균질하거나 불균질한, 방법.
12. 제10항에 있어서, 상기 공간들이, 세포에 대한 전단력을 유발하지 않고 상기 세포를 통과시키기에 충분한 크기인, 방법.
13. 제10항에 있어서, 상기 공간들이 약 15 내지 약 2,000㎛의 거리를 포함하는, 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 공간들이 15 내지 30㎛, 20 내지 40㎛, 30 내지 60㎛, 40 내지 80㎛, 60 내지 120㎛, 80 내지 160㎛, 100 내지 200㎛, 150 내지 300㎛, 200 내지 400㎛, 200 내지 500㎛, 200 내지 600㎛, 200 내지 700㎛, 200 내지 800㎛, 200 내지 900㎛, 200 내지 1,000㎛, 500 내지 2,000㎛의 거리, 또는 이들 거리의 조합을 포함하는, 방법.
15. 제9항에 있어서, 세포 배양 배지 및/또는 세포들의 상기 유동이 접선 유동, 축 유동 또는 이들 유동의 조합을 포함하는, 방법.
16. 제9항에 있어서, 세포 배양 배지 및/또는 세포의 상기 유동이, 상기 세포에 대한 전단력을 유발하지 않고 배양 균질성을 유지하기에 충분한 속도인, 방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 기체가 공기, 이산화탄소, 산소 및/또는 질소, 또는 이들의 혼합물인, 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 생물 반응기의 세포 밀도가, 약 20x10⁶cell/ml, 약 30x10⁶cell/ml, 약 40x10⁶cell/ml, 약 50x10⁶cell/ml, 약 60x10⁶cell/ml, 약 70x10⁶cell/ml, 약 80x10⁶cell/ml, 약 90x10⁶cell/ml, 약 100x10⁶cell/ml, 약 110x10⁶cell/ml, 약 120x10⁶cell/ml, 약 130x10⁶cell/ml, 약 140x10⁶cell/ml, 약 150x10⁶cell/ml, 약 160x10⁶cell/ml, 약 170x10⁶cell/ml 또는 약 180x10⁶cell/ml인, 방법.
19. 제1항에 있어서, 상기 방법이 포움(foam)의 생성을 방지하는, 방법.
20. 제1항에 있어서, 상기 생물 반응기가 헤드스페이스(headspace)를 포함하지 않거나 헤드스페이스를 실질적으로 포함하지 않는, 방법. 제1항에 있어서, 상기 방법이 세포 배양 동안 소포제를 필요로 하지 않는, 방법.
21. 제4항에 있어서, 상기 생물 반응기가 둘 이상의 기체 전달 모듈들을 포함하는, 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 둘 이상의 기체 전달 모듈들이, 공기, 산소, 이산화탄소 또는 질소 기체를 포함하는 상이한 기체들의 물질 전달을 제공하는, 방법.
23. 고밀도 세포 배양용 생물 반응기 시스템으로서, 세포 배양 배지에서 세포들을 성장시키기 위한 생물 반응기 용기 및 상기 생물 반응기 용기와 유체 통신(fluid communication)하는 액체 유동 경로를 포함하고, 상기 액체 유동 경로는 상기 생물 반응기 용기의 외부에, 제1 막 기체 전달 모듈 및 제2 막 기체 전달 모듈을 통하여 세포 배양 배지를 전위(translocating)시키기 위한 회로를 형성하는, 생물 반응기 시스템.
24. 제23항에 있어서, 상기 제1 막 기체 전달 모듈은, 상기 세포 배양 배지에 산소를 첨가하기 위한 것인, 생물 반응기 시스템.
25. 제23항에 있어서, 상기 제2 막 기체 전달 모듈은, 상기 세포 배양 배지로부터 이산화탄소를 스트리핑(stripping)하기 위한 것인, 생물 반응기 시스템.
26. 제24항에 있어서, 상기 제1 막 기체 전달 모듈이 산소 유동 경로 및 세포 배양 배지 유동 경로를 포함하고, 상기 기체 유동 경로와 세포 배양 유동 경로는 기체 투과성 막에 의해 분리되는, 생물 반응기 시스템.
27. 제25항에 있어서, 상기 제1 막 기체 전달 모듈이 공기/이산화탄소 유동 경로 및 세포 배양 배지 유동 경로를 포함하고, 상기 공기/이산화탄소 유동 경로와 세포 배양 유동 경로는 기체 투과성 막에 의해 분리되는, 생물 반응기 시스템.
28. 제23항에 있어서, 회로를 형성하는 상기 액체 유동 경로가 하나 이상의 추가의 요소(element)를 추가로 포함하는, 생물 반응기 시스템.
29. 제28항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가의 요소가 세포 수확 필터인, 생물 반응기 시스템.
30. 제28항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가의 요소가 관류 펌프인, 생물 반응기 시스템.
31. 제23항에 있어서, 산소 공급원을 추가로 포함하는, 생물 반응기 시스템.
32. 제23항에 있어서, 공기/이산화탄소 혼합물의 공급원을 추가로 포함하는, 생물 반응기 시스템.
33. 제24항에 있어서, 상기 제1 막 기체 전달 모듈을 통해 상기 세포 배양 배지 내로 도입되는 산소의 수준을 조절하는 산소 센서를 추가로 포함하는, 생물 반응기 시스템.
34. 제25항에 있어서, 상기 제2 막 기체 전달 모듈을 통해 상기 세포 배양 배지 내로 도입되는 이산화탄소의 수준을 조절하는 pH 센서를 추가로 포함하는, 생물 반응기 시스템.
35. 제23항에 있어서, 상기 고밀도 세포 배양의 세포 밀도가 약 20x10⁶cell/ml, 약 30x10⁶cell/ml, 약 40x10⁶cell/ml, 약 50x10⁶cell/ml, 약 60x10⁶cell/ml, 약 70x10⁶cell/ml, 약 80x10⁶cell/ml, 약 90x10⁶cell/ml, 약 100x10⁶cell/ml, 약 110x10⁶cell/ml, 약 120x10⁶cell/ml, 약 130x10⁶cell/ml, 약 140x10⁶cell/ml, 약 150x10⁶cell/ml, 약 160x10⁶cell/ml, 약 170x10⁶cell/ml 또는 약 180x10⁶cell/ml인, 생물 반응기 시스템.
36. 제23항에 있어서, 상기 제1 막 기체 전달 모듈 및 제2 막 기체 전달 모듈이, 버블을 형성하지 않으면서 상기 세포 배양 배지로/상기 세포 배양 배지로부터 기체들을 첨가하고/첨가하거나 제거하는, 생물 반응기 시스템.

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