JP6869423B2 - 生産物の製造方法 - Google Patents

Description

本開示は、細胞によって生産される生産物の製造方法に関する。

バイオ医薬品等の製造のために、細胞培養液に含まれる培養産生物を濾過により回収する方法が知られている。

培養産生物の濾過に関する技術として、例えば、特開２０１６−５４６８６号公報には、培養産生物を産生する細胞の培養において、培養液に含まれる培養産生物を回収する方法であって、Ｂ．培養液を濾過膜に送液する工程、Ｃ．培養液の流れを、濾過膜表面に平行な方向に往復運動させるように変化させつつ濾過して透過液を得る交互流濾過工程、Ｄ．濾過膜を透過せずに残った残培養液を返液する工程、及びＧ．透過液から培養産生物を回収する工程、を含み、Ｂ工程に用いる濾過膜として、培養液側表面の平均孔径が２０μｍ以上１００μｍ以下の多孔膜又は培養液側表面の直径２０μｍ未満となる孔の割合が培養液側表面の孔全体の５０％以下である多孔膜を用いる、培養産生物の回収方法が開示されている。

また、特開２００９−４５０１９号公報には、タンパク質を培養液中に生産する動物細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物であるタンパク質を回収するとともに、未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、新鮮培地を培養液に追加する連続濾過培養によりタンパク質を製造する方法であって、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１ｋＰａから２０ｋＰａの範囲で濾過処理するタンパク質の製造方法が開示されている。

また、細胞培養において高い生細胞密度を得る方法として、特開２０１６−３９８１７号公報には、細胞培養培地および細胞を含む細胞培養物の連続的灌流培養による細胞の培養のための方法であって、細胞培養培地が例えば０．０１〜０．３ｎＬ／細胞／日の割合で細胞培養物に添加され、細胞培養物が、中空繊維を含むフィルタモジュールにわたって循環され、結果として細胞培養物よりも低い細胞密度を有する液体の流出が生じ、かつフィルタモジュール内の流れが交互接線流である方法が開示されている。

バイオ医薬品等の細胞生産物の製造において、生産物の生産効率を向上するため、培養液を連続的に濾過及び排出し、一方で栄養成分を含む新鮮な培地を連続的に培養槽に供給する、灌流培養方法が用いられている。
灌流培養方法では高濃度に細胞を培養することが可能になるが、一方で細胞濃度を高濃度にすると培養を継続するに従って分離膜を通しての生産物透過率が低下し、生産物回収量が減少する問題があった。特開２０１６−５４６８６号公報、特開２００９−４５０１９号公報及び特開２０１６−３９８１７号公報に記載の技術は、いずれも、このような問題に対処するものではなかった。

本開示に係る実施形態が解決しようとする課題は、細胞培養により生産物を生産し分離膜を用いて生産物を培養液から分離する生産物の製造方法において、特に高濃度で細胞を培養する場合であっても、分離膜を通しての生産物透過率を高く保つことができる生産物の製造方法を提供することである。

上記課題を解決するための手段には、以下の態様が含まれる。
＜１＞ 培養容器中に収容された細胞懸濁液中に含まれる、生産物を生産する細胞を培養する工程と、
培養容器から細胞懸濁液を抜き出して、分離膜を用いて、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有し生産物を含む透過液とにタンジェンシャルフィルトレーション方式で分離する分離処理工程と、
戻り液を培養容器に戻す工程と、
培養容器内に新鮮培地を供給する工程と、
生産物を回収する工程と、
を含み、
細胞懸濁液中のｃｅｌｌｓ／ｍＬを単位として表される生細胞濃度をＮｃ、分離膜のｍを単位として表される孔径をＤｐ、分離膜のｍ^２を単位として表される濾過面積をＳ、ｃｍ^３を単位として表される分離膜１次側流路体積をＶｆとしたときに、細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度Ｎｄが以下の式（１）を満たす、生産物の製造方法。
Ｎｃ≦Ｎｄ≦Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２） 式（１）

＜２＞ 式（１）を満たす培養の継続日数が１０日以上である、＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞ 式（１）を満たす培養の継続日数が１０日以上４０日以下である、＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞ 生細胞濃度Ｎｃが以下の式（２）を満たす、＜１＞から＜３＞のいずれか１つに記載の製造方法。
２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ≦Ｎｃ≦２０×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ 式（２）
＜５＞ 培養容器から細胞懸濁液を抜き出し、抜き出した量と同量の新鮮培地を培養容器内に添加するブリーディング工程をさらに含み、ブリーディング工程は、細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個数密度Ｎｄを測定すること、及びＮｄが式（１）を満たすようにブリーディング量を調整することを含む、＜１＞から＜４＞のいずれか１つに記載の製造方法。

＜６＞ 細胞懸濁液の１日あたりのブリーディング回数Ｎｂが１回以上であり、且つ培養容器中の細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃ、Ｎｄの個／ｍＬを単位として表される目標値をＮｄ’、Ｎｂ以下の任意の自然数ｎについてｎ回目のブリーディング前の細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度をＮｄｎとしたときに、Ｌを単位として表されるｎ回目のブリーディング量Ｖｂｎが以下の式（３）及び式（４）を満たす、＜５＞に記載の製造方法。
Ｖｂｎ＝Ｖｃ×（Ｎｄｎ−Ｎｄ’）／Ｎｄｎ 式（３）
Ｎｃ≦Ｎｄ’≦Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２） 式（４）

＜７＞ 細胞懸濁液の１日あたりのブリーディング回数Ｎｂが１回以上であり、且つ培養容器中の細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃ、Ｎｄの個／ｍＬを単位として表される目標値をＮｄ’、Ｎｂ以下の任意の自然数ｎについてｎ回目のブリーディング前の細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度をＮｄｎとしたときに、Ｌを単位として表されるｎ回目のブリーディング量Ｖｂｎが以下の式（３）及び式（５）を満たす、＜５＞又は＜６＞に記載の製造方法。
Ｖｂｎ＝Ｖｃ×（Ｎｄｎ−Ｎｄ’）／Ｎｄｎ 式（３）
２×１０^７個／ｍＬ≦Ｎｄ’≦２×１０^９個／ｍＬ 式（５）

＜８＞ 生産物を生産する細胞を培養する工程は、培養容器中の細胞培養液を撹拌翼により撹拌することを含み、
撹拌翼の動力係数をＮｐ、撹拌翼のｍを単位として表される翼径をＤｉ、撹拌翼のｓ^−１を単位として表される回転数をＲｏ、細胞懸濁液のｋｇ／ｍ^３を単位として表される密度をρ、培養容器中の細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃとしたときに、以下の式（６）にて定義される撹拌翼のＷ／ｍ^３を単位として表される撹拌動力Ｐｖが１０Ｗ／ｍ^３以上１５０Ｗ／ｍ^３以下の範囲内において撹拌を行い、且つ培養容器の底面を基準として細胞懸濁液のｍを単位として表される液面高さをＨｃとしたときのブリーディング抜き出し位置のｍを単位として表される高さＨｂが１／２×Ｈｃ以下である、＜１＞から＜７＞のいずれか１つに記載の製造方法。
Ｐｖ＝Ｎｐ×ρ×Ｒｏ^３×Ｄｉ^５／（Ｖｃ×１０^−３） 式（６）

＜９＞ 生産物を生産する細胞を培養する工程は、細胞懸濁液にスパージャーによりガス通気することを含み、
細胞懸濁液のＮ／ｍを単位として表される界面張力をσ、スパージャーのμｍを単位として表される孔直径をＤｓ、スパージャーから発生する単一ガスのｍＬを単位として表される体積をＶｇ、スパージャーのｍＬ／分を単位として表されるガス通気流量をＱ、培養容器中の細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃ、細胞懸濁液のｋｇ／ｍ^３を単位として表される密度をρ、ｍ／ｓ^２を単位として表される重力加速度をｇとしたときに、以下の式（７）及び式（８）によりに定義されｓ^−１・Ｌ^−１を単位とする単位容量及び単位時間当たりの通気ガス個数Ｎｇが以下の式（９）を満たす、＜１＞から＜８＞のいずれか１つに記載の製造方法。
Ｎｇ＝Ｑ／（Ｖｇ×Ｖｃ×６０） 式（７）
Ｖｇ＝π×Ｄｓ×σ／（ρ×ｇ） 式（８）
１００ｓ^−１・Ｌ^−１≦Ｎｇ≦５０００ｓ^−１・Ｌ^−１ 式（９）

＜１０＞ 細胞懸濁液の界面張力σ及びスパージャーの孔直径Ｄｓがそれぞれ以下の式（１０）及び式（１１）を満たす、＜９＞に記載の製造方法。
１０ｍＮ／ｍ≦σ≦１００ｍＮ／ｍ 式（１０）
０．１μｍ≦Ｄｓ≦２００μｍ 式（１１）
＜１１＞ 細胞がＣＨＯ細胞である、＜１＞から＜１０＞のいずれか１つに記載の製造方法。
＜１２＞ 分離膜の孔径Ｄｐが０．１μｍ以上１μｍ以下であり、
生細胞濃度が最大または設定生細胞濃度に達した後の培養期間中常に、Ｎｄが以下の式（１２）を満たす、＜１＞から＜１１＞のいずれか１つに記載の製造方法。
２×１０^７≦Ｎｄ≦２×１０^９ 式（１２）
＜１３＞ 細胞懸濁液に含まれる生産物の濃度に対する、透過液に含まれる生産物の濃度の比として算出される、分離膜を通しての生産物の透過率が５５％以上である、＜１＞から＜１２＞のいずれか１つに記載の製造方法。

本開示に係る実施形態によれば、細胞培養により生産物を生産し分離膜を用いて生産物を培養液から分離する生産物の製造方法において、特に高濃度で細胞を培養する場合であっても、分離膜を通しての生産物透過率を高く保つことが可能な生産物の製造方法が提供される。

本開示に係る生産物の製造方法の実施に適用可能な細胞培養装置の構成の一例を示す図である。 中空糸フィルタの濾過面積Ｓ及び１次側流路体積Ｖｆを説明するための図である。 平膜フィルタの濾過面積Ｓを説明するための図である。 平膜フィルタの１次側流路体積Ｖｆを説明するための図である。 生産物の一例としての抗体が分離膜を通過する様子を模式的に示した図である。 スパージャーの孔直径Ｄｓ及びスパージャーから発生する単一ガスの体積Ｖｇを説明するための図である。 実施例及び比較例における培養日数と粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下となる生細胞以外の微粒子の個数密度Ｎｄとの関係を示すグラフである。 実施例及び比較例における培養日数とブリーディング量との関係を示すグラフである。 実施例及び比較例における培養日数と分離膜を通しての抗体透過率との関係を示すグラフである。 分画分子量と限外濾過膜の平均孔径との関係を表わすグラフである。

以下、本開示に係る生産物の製造方法について説明する。但し、本開示に係る実施形態は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、適宜、変更を加えて実施することができる。

本開示において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。
本開示に段階的に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示において、２以上の好ましい態様の組み合わせは、より好ましい態様である。
本開示において、各成分の量は、各成分に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、複数種の物質の合計量を意味する。
本開示において、「工程」との語は、独立した工程だけではなく、工程の所期の目的が達成される限りは、他の工程と明確に区別できない工程をも含む。
各図面において同一の符号を用いて示される構成要素は、同一の構成要素であることを意味する。

本開示に係る生産物の製造方法は、
培養容器中に収容された細胞懸濁液中に含まれる、生産物を生産する細胞を培養する工程と、
培養容器から細胞懸濁液を抜き出して、分離膜を用いて、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有し生産物を含む透過液とにタンジェンシャルフィルトレーション方式で分離する分離処理工程と、
戻り液を培養容器に戻す工程と、
培養容器内に新鮮培地を供給する工程と、
生産物を回収する工程と、
を含み、
細胞懸濁液中のｃｅｌｌｓ／ｍＬを単位として表される生細胞濃度をＮｃ、分離膜のｍを単位として表される孔径をＤｐ、分離膜のｍ^２を単位として表される濾過面積をＳ、ｃｍ^３を単位として表される分離膜１次側流路体積をＶｆとしたときに、細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度Ｎｄが以下の式（１）を満たす、生産物の製造方法である。
Ｎｃ≦Ｎｄ≦Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２） 式（１）

生産物を生産する細胞として用いられる細胞は、特に限定されないが、動物細胞、植物細胞、酵母などの真核細胞、枯草菌などの原核細胞及び大腸菌などが挙げられる。ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、Ｃ１２７細胞、ＮＳ０細胞及びＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞などの動物細胞が好ましく、解析が多数行われ、遺伝子工学的な手法が確立している点でＣＨＯ細胞がより好ましい。所望の生産物を細胞が元々生産しない又は生産量が少ない場合であっても、例えば、生産物を生産するのに必要な蛋白質をコードするプラスミドなどの発現ベクターを細胞に導入することで、所望の生産物を効率よく生産させることができる。 本開示における細胞によって生産される生産物は、上記の細胞が培養液中に生産する物質であれば、特に限定されず、例えば、アルコール、酵素、抗生物質、組換えタンパク質、抗体などの物質が挙げられる。中でも生産物として、好ましくは、組み換えタンパク質又は抗体であり、より好ましくは抗体である。

生産物が例えば抗体である場合、ＣＨＯ細胞などの動物細胞に抗体を生産させてもよい。動物細胞に生産させる抗体としては、特に限定されないが、例えば、抗ＩＬ−６レセプター抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗グリピカン−３抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＬＡ４抗体などが挙げられる。抗体としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル等の動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体）など人為的に改変した抗体も含まれる。

生産物を生産する細胞を培養することにより、目的とする生産物を生産することができる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。
生産物を生産する細胞の培養に用いる培地としては、細胞の培養に通常使用されている液体培地を用いることができる。例えば、ＯｐｔｉＣＨＯ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、１２６８１０１１）培地、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＲＰＭＩ−１６４１培地、Ｆ−１２Ｋ培地、ハムＦ１２培地、イスコブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ−１５培地、およびＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３００シリーズ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＣＨＯ−ＳＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ＣＤ−ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、 ＩＳ ＣＨＯ−Ｖ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＰＦ−ＡＣＦ−ＣＨＯ （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）などの培地を使用することができる。

培地には牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清を添加してもよい。あるいは、培地は無血清培地、例えば完全合成培地であってもよい。
培地には、アミノ酸、塩、糖類、ビタミン、ホルモン、増殖因子、緩衝液、抗生物質、脂質、微量元素、植物タンパク質の加水分解物などの追加成分を補充してもよい。

培地のｐＨは培養する細胞により異なるが、一般的にはｐＨ６．０〜８．０であり、好ましくはｐＨ６．８〜７．６であり、より好ましくはｐＨ７．０〜７．４である。
培養温度は、一般的には３０℃〜４０℃であり、好ましくは３２℃〜３７℃であり、より好ましくは３６℃〜３７℃である。培養中に培養温度を変更してもよい。

培養は、ＣＯ_２濃度が０〜４０％、好ましくは２〜１０％の雰囲気下で行うことが好ましい。
培養においては、必要に応じて、培地の交換、通気、及び／又は攪拌を加えることができる。

生産物を生産する細胞の培養は、培養装置（バイオリアクターとも言う）、又は、それ以外の好適な容器内で行うことができる。培養装置としては、発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、カルチャーフラスコ型培養装置、スピナーフラスコ型培養装置、マイクロキャリアー型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ローラーボトル型培養装置、充填槽型培養装置等が挙げられる。

培養スケールは、後述のとおり、０．１Ｌ以上５０００Ｌ以下が好ましく、０．５Ｌ以上３０００Ｌ以下がより好ましく、１Ｌ以上２０００Ｌ以下がさらに好ましい。

本開示に係る生産物の製造方法に含まれる工程の中には、培養容器から細胞懸濁液を抜き出して、分離膜を用いて、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有し生産物を含む透過液とにタンジェンシャルフィルトレーション方式で分離する分離処理工程、戻り液を培養容器に戻す工程、及び培養容器内に新鮮培地を供給する工程が含まれている。
少なくとも透過液として失われる培養液を補うために新鮮培地を供給することから、本開示に係る生産物の製造方法は灌流培養を用いているといえる。

灌流培養は、新鮮な培地を添加し、同時に使用済み培地を除去する培養法である。灌流培養によれば、１×１０^８細胞／ｍＬを超える高い細胞濃度を達成することが可能である。典型的な灌流培養は、１日間または２日間続くバッチ培養スタートアップで始まり、その後、培養物に新鮮な供給培地を連続的、段階的、及び／又は断続的に添加し、使用済み培地を同時に除去する。灌流培養においては、沈降、遠心分離または濾過などの方法を用いて、細胞濃度を維持しながら使用済み培地を除去することができる。

灌流培養の利点は、目的とする生産物が生産される培養が、バッチ培養法又はフェドバッチ培養よりも長期間維持されることである。また、分離膜の膜孔径の選択により、生産物を系外へ回収しながら培養を継続することが可能であるため、生産物の培養液中での滞留時間を短くし、化学的変化を減らすことで生産物の品質を高く保つことが可能である。

フェドバッチ培養又は灌流培養を組み合わせた培養を行うことも可能である。組み合わせの一例としては、ボーラス供給を伴うフェドバッチ培養を、増殖期の細胞の培養を維持するために使用し、次いで、灌流培養を目的とする生産物の産生のために使用することが挙げられる。

灌流は、連続的、段階的、断続的、又は、これらの組み合わせの何れの形態でもよい。分離膜の孔径が生産物を生産する細胞と比較して小さいことにより、生産物を生産する細胞は、培養液としての細胞懸濁液中に保持され、透過液は、細胞を実質的に含まないか、又は、細胞懸濁液よりもはるかに低濃度で細胞を含んでいる。細胞培養によって発現される目的とする生産物が膜孔径と比較して小さいことにより、生産物を透過液側に移行させ、回収することができる。

生産物を生産する細胞の培養において、播種細胞濃度は、一般的には、０．２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上３×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、好ましくは０．５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である。
生産物を生産する細胞の培養において、培養期間中の生細胞率は全期間において、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは９０％以上である。生細胞率が上記範囲内であれば、生産物の生産効率が高く、また、細胞懸濁液中の不要物を低減させることができる。

生産物を生産する細胞の培養において、最大生細胞濃度（最高到達生細胞濃度）は、好ましくは２×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、より好ましくは１．５×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは１．２×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である。
最大生細胞濃度が上記範囲内であれば、分離膜を通しての生産物透過率の低下をより効果的に抑制することができる。生産物の生産効率向上の観点からは、最大生細胞濃度は、好ましくは２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であり、より好ましくは３×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは４×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である。
本開示において、各パラメータについて上限値の記載及び下限値の記載を自由に組み合わせることにより規定される範囲についても、本開示に開示されている事項の範囲内にある。

生産物を生産する細胞の培養における灌流比としては、好ましくは０．３ｖｖｄ以上５．０ｖｖｄ以下であり、より好ましくは０．３ｖｖｄ以上３．０ｖｖｄ以下である。但し、ｖｖｄは以下を表す。
ｖｖｄ＝（volume of fresh medium/working volume of reactor/day，１日当たりの供給培養液量／培養液量）

播種細胞濃度、及び、培養における最大細胞濃度は、細胞数を常法により測定し、細胞数を培養液量で割ることにより求めることができる。最大生細胞濃度は培養期間中における生細胞濃度の最大値であり、培養条件により異なる。
培養期間中の生細胞率（生存率）は、生細胞数を（生細胞数＋死細胞数）で除算することで求められる。例えば、生細胞数及び死細胞数の測定は、トリパンブルー染色法による生死判定を用いている商品名Ｖｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いて測定することができる。

本開示に係る生産物の製造方法における分離処理工程では、培養容器から細胞懸濁液を抜き出して、分離膜を用いて、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有し生産物を含む透過液とにタンジェンシャルフィルトレーション方式により分離する。
タンジェンシャルフィルトレーション方式とは、膜分離処理の対象となる液体を分離膜の膜面に沿って流すことにより、サイズの小さい成分を液体成分と共に分離膜の透過側へと移動させ、サイズの大きい成分及び残りの液体成分を分離膜の未透過側に保持する方式である。
本開示においては、分離膜の未透過側、つまり供給側を１次側と、分離膜の透過側を２次側とも称する。
本開示においては、タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理は、培養容器から抜き出された細胞懸濁液が分離膜の膜面に沿って平行な一方向の流れを形成してもよいし、培養容器から抜き出された細胞懸濁液の流れの方向を所定の時間毎に逆転させて、往復する流れを形成してもよい。

本開示に係る生産物の製造方法において、細胞を培養する工程、分離処理工程、戻り液を培養容器に戻す工程、培養容器内に新鮮培地を供給する工程、生産物を回収する工程、後述するブリーディング工程などにおける「工程」の語は、一つの処理が完了したら次の処理を開始するといったバッチで順次行われる処理を意味するものではなく、時間的に並行して行われる処理を意味している。このため、例えば培養工程を行いながら、培養容器からの細胞懸濁液を抜き出して分離処理工程が行われる。また、戻り液の培養容器への送液、培養容器内への新鮮培地の供給、及び生産物の回収も培養工程及び分離処理工程と時間的に並行して行われる。各工程を時間的に並行して行うことにより、生産された生産物を効率よく分離及び回収することができる。なお、各工程は連続して行うようにしてもよいが、例えば分離処理工程におけるタンジェンシャルフィルトレーションの流れ方向の切り替えなどのために一時的な停止時間が存在していてもよい。

培養容器からの細胞懸濁液の抜き出しは、通常、ポンプを用いて行うことができるが、利用可能な他の送液手段を用いてもよい。培養容器から抜き出された細胞懸濁液は、フィルタ部へと送液される。培養容器からフィルタ部への細胞懸濁液の抜き出しは、間欠的に行っても連続的に行ってもよいが、系の状態を安定に保つ観点からは連続的に行うことが好ましい。

フィルタ部は、例えば、容器と、容器内の空間を供給側と透過側とに隔て、培養容器から抜き出された細胞懸濁液に対して膜分離処理を施す分離膜とを備える。分離膜の供給側においては、フィルタ部は配管にそれぞれ接続された流入口及び流出口とを有する。タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理において、培養容器から抜き出された細胞懸濁液の流れの方向を所定の時間毎に逆転させる場合は、流入口と流出口とは流れの方向の逆転により入れ替わることになる。

分離膜として、繊維状部材を網目状に織ることにより構成されるメッシュフィルタを用いることが可能である。メッシュフィルタを用いることで、中空糸膜を用いる場合と比較して、細胞の死骸及び細胞の破砕物を含む細胞培養に不要な成分の透過側への排出を促進させることができる。これにより、培養容器内から細胞培養に不要な成分を効果的に除去することができ、培養容器内における細胞の増殖性を高めることができる。

また、分離膜として、中空糸膜を用いることができる。中空糸膜を用いることで、メッシュフィルタを用いる場合と比較して、細胞が透過側に透過するリスクを低減できる。また、分離膜に細胞が入り込むことによる目詰まりの発生のリスクを低減できる。これらにより、細胞のロスを低減できる。この場合、中空糸膜として精密濾過膜（ＭＦ膜）あるいは限外濾過膜（ＵＦ膜）を用いることができる。

分離膜は、細胞懸濁液中の生細胞は透過させないが、細胞懸濁液中の目的とする生産物は透過させる。生細胞と生産物とで透過性に違いが生じる理由は、生細胞のサイズと目的とする生産物のサイズとの間に差異があるためである。例えば、抗体を動物細胞に生産させる場合、抗体のサイズが１ｎｍ〜５ｎｍ程度であるのに対して、動物細胞の大きさは１０μｍオーダー程度であるため、例えば分離膜としての精密濾過膜や限外濾過膜を用いることで、生細胞を１次側に留めつつ、抗体を分離膜を通して２次側に移行させることができる。また、液体成分、例えば水分子の大きさは微小であるため、液体成分も一部の量が抗体と共に２次側に移行する。この結果、１次側に残った液体中における細胞濃度は上昇する。このように、タンジェンシャルフィルトレーション方式による分離を行うことにより、フィルタ部に送液された細胞懸濁液は、分離膜を透過せずに１次側に留まり、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、分離膜を透過して２次側に移行した、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有する透過液とに分離される。透過液には目的とする生産物が含まれる。
なお、ここでいう細胞懸濁液中の細胞濃度とは、培養容器内の細胞懸濁液中の生細胞の濃度を意味する。
また、本開示において「細胞濃度」とは特段の断りが無い限り「生細胞濃度」を指す。

１次側に留まった戻り液は、フィルタ部から流出して培養容器に戻る。
例えば、タンジェンシャルフィルトレーションにおけるフィルタ部供給側空間中の流れの向きを一方向に固定する場合には、細胞懸濁液を、培養容器からフィルタ部に供給したのと同じポンプによる送液圧力により流出口から流出させ、流出口と培養容器とを連絡する配管を通して培養容器に戻してもよい。この場合は、戻り液は、培養容器中の細胞懸濁液がフィルタ部の流入口に移動する際に通った配管とは異なる配管を通って、培養容器に戻ることとなり、循環する流れが形成される。

一方、タンジェンシャルフィルトレーションにおけるフィルタ部供給側空間中の流れの向きを、時間の経過と共に逆転させる、つまり流れを往復させる場合には、例えば、吸込口と吐出口が兼用となっているダイアフラムポンプなどを用いてダイアフラムの移動方向に応じて流れを往復させてもよい。この場合、戻り液は、培養容器中の細胞懸濁液がフィルタ部の流入口に移動する際に通った配管と同じ配管を通して、培養容器に戻ることとなり、また、流れの向きの逆転と共に、流入口と流出口は逆転する。

循環する流れを形成する場合、例えばスペクトラムラボラトリーズ社のＫｒｏｓＦｌｏ灌流培養フローパス装置（ＫＭＬ−１００、ＫＰＳ−２００、ＫＰＳ−６００）又はＬｅｖｉｔｒｏｎｉｘ製のＰｕｒａＬｅｖシリーズを好適に用いることができる。また往復する流れを形成する場合、ＲＥＰＬＩＧＥＮ社のＡＴＦｓｙｓｔｅｍを好適に用いることができる。

分離膜を透過した透過液中には、目的とする生産物が含まれている。透過液中の生産物を回収して、医薬品の製造及び食品の製造など様々な用途に用いることができる。
生産物の回収は、単に透過液の回収、例えば透過液をタンク中に回収することであってもかまわない。生産物の純度を向上したり、溶媒を変更したり、例えば粉末状にするなど形態を変更したい場合には、透過液をさらなる処理に供することができる。

例えば、分離膜を透過した透過液に含まれる生産物は、精製処理により精製することができる。得られた生産物は、高い純度にまで精製することができる。
生産物が抗体又はその断片などのポリペプチドである場合、生産物の分離及び精製は通常のポリペプチドで使用されている分離及び精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルタ、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及び等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、ポリペプチドを分離及び精製することができるが、これらに限定されるものではない。得られたポリペプチドの濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。

アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；高速液体クロマトグラフィー）またはＦＰＬＣ（ｆａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。

培養容器からフィルタ部に送液された細胞懸濁液は透過液と戻り液とに分離されるため、戻り液の量は、フィルタ部に送液された細胞懸濁液の量よりも少なくなる。
フィルタ部に送液された細胞懸濁液量と戻り液量との差を少なくとも補うために、新鮮培地を培養容器内に供給する。新鮮培地を培養容器内に供給することで、培養容器内の細胞濃度が過剰に上昇することを抑えることができ、また、培養容器内の細胞の状態を健康な状態に保つことができる。つまり、灌流培養による利益が得られる。

後述するブリーディング工程における抜き取り操作よりフィルタ部への送液とは別に培養容器から失われる細胞懸濁液が存在する場合には、新鮮培地の培養容器内への供給はブリーディング工程における抜き取り操作より失われる細胞懸濁液量をも補うように、つまり培養容器内の細胞懸濁液量を略一定に保つように行われる。つまり、ブリーディング工程を行う場合には、新鮮培地の培養容器内への供給はブリーディング工程における新鮮培地添加操作も含むものである。ブリーディング工程における新鮮培地の培養容器内への添加は、新鮮培地の培養容器内への供給の一部として行われるともいえる。

透過液として失われた液量を補うための新鮮培地の添加と、ブリーディング工程において抜き出された細胞懸濁液の液量を補うための新鮮培地の添加は、同一の配管を通じて行ってもよく、それぞれ別々の配管を通じて行ってもかまわない。
なお、新鮮培地の培養容器内への供給は、間欠的に行っても連続的に行ってもよい。また、培養容器内の細胞懸濁液量は常時完全に一定である必要はなく、略一定、例えば±１０％、又は±５％、又は±１％程度の変動が生じるものであってもよい。
培養容器内の細胞懸濁液量の測定も、常時行う必要は必ずしもなく、間欠的に行うものであってもよい。
細胞懸濁液量に若干の変動があっても、灌流培養による利益を得ることができる。

本開示に係る生産物の製造方法においては、細胞懸濁液中のｃｅｌｌｓ／ｍＬを単位として表される生細胞濃度をＮｃ、分離膜のｍを単位として表される孔径をＤｐ、分離膜のｍ^２を単位として表される濾過面積をＳ、ｃｍ^３を単位として表される分離膜１次側流路体積をＶｆとしたときに、細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度Ｎｄが以下の式（１）を満たす。
Ｎｃ≦Ｎｄ≦Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２） 式（１）

細胞懸濁液中の生細胞濃度Ｎｃは、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社のＣｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｖｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ（商品名）を用いて求めることができる。

分離膜の孔径Ｄｐは、分離膜が精密濾過膜もしくは限外濾過膜の場合、水銀圧入法により平均孔径として測定することができる。例えば、株式会社島津製作所製のオートポアIV９５２０を用いて、分離膜に高圧で水銀を圧入することで孔径Ｄｐを測定することができる。
なお、限外濾過膜（ＵＦ膜：Ultrafiltration Membraneとも称することがある）とは、精密濾過膜（ＭＦ膜：Microfiltration Membraneとも称することがある）より平均孔径が小さく、平均孔径が０．００１μｍ〜０．０１μｍであり、その分離性能が分画分子量で定義される濾過膜である。

孔径が小さい限外濾過膜においては、水銀圧入法では、平均孔径の測定が難しい場合がある。その場合、限外濾過膜の平均孔径は、分画分子量に基づいて推算することができる。具体的には、http://chemeng.in.coocan.jp/memb/m_mb4.htmlに記載されているように、既知の分子量を有する複数種類の標準物質を、対象となる限外濾過膜に透過させ、阻止率が９０％となるときの標準物質の分子量を、当該限外濾過膜の分画分子量とする。
阻止率とは、濾過前の溶液における対象とする物質の濃度をＣｂ、濾液（透過液）における対象とする物質の濃度をＣｐとした場合に、１−（Ｃｐ／Ｃｂ）により与えられる値である。

標準物質の分子量から分子径を推算することができるため、限外濾過膜の平均孔径は、分画分子量に基づいて推算することができる。具体的には、表１に記載のように、分画分子量から平均孔径を推算する。分画分子量が標準物質の分子量と一致しない場合には、分画分子量と平均孔径をプロットし、線形補間等により内挿することによって、平均孔径を推算することができる。一例として、表１の分画分子量とをプロットして内挿を行ったときの例を図１０に示す。このように得られた推算値を、限外濾過膜の平均孔径として用いることができる。

生産物を生産する細胞の透過を抑制しつつ、生産物を効率よく透過させる観点からは、分離膜の孔径Ｄｐは０．１μｍ以上１μｍ以下であることが好ましく、０．１５μｍ以上０．８μｍ以下であることがさらに好ましく、０．１７μｍ〜０．２３μｍがより更に好ましく、０．２μｍであることが最も好ましい。

粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である微粒子の個数密度は、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社の商品名Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４ｅを用いて測定できる。つまり、本開示における粒子サイズとは、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社の商品名Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４ｅによる、コールター原理により求めた粒子サイズである。粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個数密度Ｎｄは、粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である微粒子の個数密度から粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞の濃度を減算することで求めることができる。

濾過面積Ｓは、分離膜の１次側膜面積である。
例えば、分離膜が図２に示すような形状の中空糸膜である場合、一本当たりの濾過面積は、直径Ｄｆ及び長さＬを基にしてπ×Ｄｆ×Ｌとして求められる。中空糸膜が全部でＮ本存在する場合には、全体の濾過面積ＳはＳ＝π×Ｄｆ×Ｌ×Ｎとして求められる。
あるいは、分離膜が図３に示すような形状の平膜であり、上側が１次側、下側が２次側である場合には、濾過面積Ｓは図３中の点描部で表される面積として求められる。なお、図３において、１次側には分離膜を含むフィルタ部への流入口３０ａ及び流出口３０ｂが設けられている。

分離膜１次側流路体積Ｖｆは、フィルタ部内の空間のうち分離膜に接して存在する空間の体積であり、フィルタ部内の空間のうち分離膜の膜面に対し鉛直方向一次側に存在する空間の体積であるともいえる。
例えば、分離膜が図２に示すような形状の中空糸膜であり、中空糸膜の内側が一次側であり、中空糸膜が全部でＮ本存在する場合、分離膜１次側流路体積Ｖｆは、直径Ｄｆ及び長さＬを基にしてπ×（Ｄｆ^２／４）×Ｌ×Ｎとして求められる。
逆に、中空糸膜の外側が一次側であり、中空糸膜が全部でＮ本存在する場合は、分離膜１次側流路体積Ｖｆは、中空糸膜を格納する容器（非図示）と中空糸膜との間の空間の体積となり、中空糸膜を格納する容器の内容積からπ×（Ｄｆ^２／４）×Ｌ×Ｎを減算したものとして求められる。
あるいは、分離膜が図４に示すような形状の平膜であり、上側が１次側、下側が２次側である場合、分離膜１次側流路体積Ｖｆは、図４中の点描部で表される体積として求められる。

本開示に係る生産物の製造方法では、細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である微粒子であって生細胞以外である微粒子（以下、「特定微粒子」とも称する）の個数密度Ｎｄを、式（１）で表される範囲内に制御する。
本開示に係る生産物の製造方法によってれば、高濃度で細胞を培養した場合でも分離膜を通しての生産物透過率を高く保つことが可能である理由は、完全には明らかではないものの、以下に述べるような理由によるものと推定される。

Ｎｄが、細胞懸濁液中の生細胞濃度Ｎｃ以上であることにより、細胞が分離膜の膜壁に衝突または潜り込むことで受けるダメージが緩和される効果を効果的に得ることができる。つまり、特定微粒子は細胞へのダメージ緩和のためにある程度の量は存在した方が効果的である。このため、本開示に係る生産物の製造方法は、細胞懸濁液内の微粒子を老廃物と捉えて単に排出することを目的とした技術とは大きく異なる。

また、Ｎｄが、Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２）以下であることにより、生産物が分離膜を透過する際の透過率（以下、生産物透過率とも称する）が低下することを抑制する効果を効果的に得ることができる。

タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理は、細胞へのダメージを低減し、生産物透過率の低下を抑制するための有効な手段である。タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理を採用することにより、デッドエンド方式による膜分離処理を行うのに比べて細胞が膜に強く押しつけられることによるダメージを低減し、微粒子によって生産物の透過が阻害されることを低減することができる。しかし、タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理を採用しても、何らの方策も採らなければ培養時間が長くなると共に生産物透過率の低下は生じる。これまで分離膜を通じての生産物透過率の低下に関する詳細なメカニズムは解明されていなかった。

本開示に係る生産物の製造方法では、細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である微粒子であって生細胞以外である微粒子（特定微粒子）の個数密度Ｎｄは式（１）の範囲内である。生産物透過率の低下において、粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子は大きな役割を果たす。８Ｄｐ未満の粒子サイズの粒子は、分離膜の孔径と比較した粒子サイズが小さく、生産物透過率の低下における寄与は小さい。３０Ｄｐ超の粒子サイズの粒子は、粒子間の間隙を生産物がすり抜けることが可能なため、やはり生産物透過率の低下における寄与が小さい。このため、特定微粒子は、生産物透過率の低下において主要な役割を果たしていると考えられる。このような特定微粒子は、例えば、死細胞や傷害を受けた細胞の破片などとして生じる。

Ｓ／Ｖｆの値が小さくなるほど、分離膜の膜面の単位面積に対する分離膜一次側流路体積が大きくなる。特定微粒子の個数密度が同じであれば、分離膜の膜面の単位面積に対する分離膜一次側流路体積が大きくなることは、分離膜の膜面の単位面積に対して生産物の透過を阻害する可能性がある特定微粒子の数が増加することを意味する。
また、Ｄｐが大きくなれば、特定微粒子のサイズも増大するため、特定微粒子１個あたりの断面積はＤｐ^２に概ね比例するものと考えられる。分離膜の膜面の面積に対する特定微粒子の断面積の割合が増大すれば、分離膜を通しての生産物の透過はその分阻害されやすくなると考えられる。
Ｓは、例えば培養容器中の細胞懸濁液体積が１Ｌのときは、０．００５ｍ^２以上１ｍ^２以下が好ましく、０．００７ｍ^２以上０．５ｍ^２以下がより好ましく、０．０１ｍ^２以上０．３ｍ^２以下がさらに好ましい。ここで、Ｓの好ましい範囲は細胞懸濁液体積に対し通常比例する。つまり、これらの好ましい範囲は、細胞懸濁液体積１ＬあたりのＳの好ましい範囲と解釈することができる。
また、Ｖｆは、例えば細胞懸濁液体積が１Ｌのときは、１０ｃｍ^３以上５０ｃｍ^３以下が好ましく、２０ｃｍ^３以上４０ｃｍ^３以下がより好ましく、２５ｃｍ^３以上３５ｃｍ^３以下がさらに好ましい。ここで、Ｖｆの好ましい範囲は細胞懸濁液体積に対し通常比例する。つまり、これらの好ましい範囲は、細胞懸濁液体積１ＬあたりのＶｆの好ましい範囲と解釈することができる。

このため、式（１）では、特定微粒子の個数密度Ｎｄが、生細胞濃度Ｎｃ、濾過面積Ｓ、分離膜一次側流路体積Ｖｆ及び分離膜の孔径Ｄｐに基づいて求められる特定の範囲内になるように制御している。式（１）においては、ＮｄはＮｃ以上Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２）以下と規定されているが、Ｎｄは、１．１×Ｎｃ以上Ｓ／（４８×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２以下であることが好ましく、１．２×Ｎｃ以上Ｓ／（６４×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２）以下であることがより好ましく、１．３×Ｎｃ以上Ｓ／（９６×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２）個／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。

培養容器内において分離膜を通しての生産物透過を阻害する、生細胞以外の特定微粒子の個数密度を式（１）の範囲内に制御することで、高い生産物透過率を達成できる。このような制御を行うための手段として、特定微粒子の個数密度を上記範囲内に制御するような適切な条件で培養を行うことが挙げられる。

しかし、一般的には、培養時間が長くなると共に、特定微粒子の個数密度は増大する傾向にある。このため、式（１）を満たす状態を維持するための制御は、特定微粒子を培養容器内から除去する処理により行ってもよい。

例えば、遠心分離法により、細胞懸濁液に含まれる特定微粒子を除去する処理を行ってもよい。例えば、培養容器から細胞懸濁液の一部を遠心分離器に送液し、特定微粒子を沈降させて除去し、上澄み液を培養容器に戻す処理を行ってもよい。

あるいは、式（１）を満たす状態を維持するための制御は、培養容器から細胞懸濁液を抜き出し、抜き出した量と同量の新鮮培地を培養容器内に添加するブリーディング工程（以下、単に「ブリーディング」とも称する）により行ってもよい。
ブリーディング工程で抜き出された細胞懸濁液中に含まれていた特定微粒子は、培養容器からは除去されるため、ブリーディング工程により特定微粒子の数を減少させることができる。
ブリーディング工程において、「抜き出した量と同量の新鮮培地を培養容器内に添加する」とは、上記のとおりに培養容器内の細胞懸濁液量を略一定に保つことを意味する。
特にタンジェンシャルフィルトレーション方式による分離操作のための細胞懸濁液の抜き出しが連続的に行われている場合は、培養容器内に供給される新鮮培地の量は透過液として失われる液体量も補うものであるため、ブリーディング工程における抜き出しを行っている際に添加される新鮮培地の量は必ずしもブリーディング工程において抜き出される細胞懸濁液の量（以下、ブリーディング量とも称する）と同一ではない。

ブリーディング工程における「抜き出した量と同量の新鮮培地を培養容器内に添加する」ことは、培養容器から細胞培養液を抜き出すのと同時並行で行ってもよく、培養容器から細胞培養液を抜き出してから所定の時間内に行ってもよい。
所定の時間としては、例えば１０時間以内、又は１時間以内、又は１０分以内、又は１分以内であってもよい。
ブリーディング工程における細胞培養液の抜き出しの直後に、一時的に培養容器内の細胞懸濁液の量が減少したとしても、所定の時間内に培養容器内の細胞懸濁液量が抜き出し前の細胞懸濁液量と比較して略一定の量まで回復していれば、「抜き出した量と同量の新鮮培地を培養容器内に添加する」ことがなされたものとする。
ブリーディング工程における抜き出しは、培養容器中の、細胞懸濁液の液面よりも下部に設けられた配管（以後、排出管とも称する）から、単に排出管の途中に設けられたバルブを開くことにより行ってもよいし、細胞懸濁液の液面よりも下部に設けられた排出管をポンプに接続してポンプを作動させることにより行っても構わない。

培養期間中におけるブリーディング量は、一定であっても、培養期間の途中で変化させても構わない。
変化させる場合は、各回のブリーディング毎にブリーディング量を設定し直しても構わないし、一定期間毎、例えば１日１回ブリーディング量を設定し直しても構わない。また、ブリーディング工程は間欠的に行っても、連続的に行っても構わない。
連続的に行う場合には、例えば、単位時間当たりのブリーディング量を一定にしても、培養期間の途中で変化させてもよく、各回のブリーディング毎に単位時間当たりのブリーディング量を設定し直しても構わないし、一定期間毎、例えば１日１回、単位時間当たりのブリーディング量を設定し直しても構わない。
ブリーディング工程を間欠的に行う場合であっても、１日につき１回以上はブリーディング工程を行うことが好ましい。ブリーディング工程の間の間隔を１日以内とすることで、特定微粒子の個数密度をより精度良く制御でき、生産物透過率の低下をより効果的に抑制できる。

ブリーディング量又は単位時間当たりのブリーディング量を変化させる場合には、特定微粒子の個数密度を測定し、その結果に基づいてブリーディング量又は単位時間当たりのブリーディング量を決定する、つまりフィードバック制御することが、式（１）を満たす状態を長く維持するためには好ましいが、特定微粒子の個数密度の測定は必須ではない。培養条件を適切に設定することにより、フィードバック制御を行わなくても、培養期間中の少なくともある程度の期間、式（１）が満たされる状態が維持されるようにすることは可能である。
つまり、本開示において、式（１）を満たす状態を維持するための制御は、培養期間中においてブリーディングなどの条件を特定微粒子数に応じて変化させることを必ずしも必要とするものではない。

ただし、ブリーディング量又は単位時間当たりのブリーディング量の初期設定のみによって、式（１）が満たされる状態が長く維持されるように適切なブリーディング量又は単位時間当たりのブリーディング量を設定することが常に可能であるとはいえない。例えば、培養期間が長くなると共に特定微粒子数が増加又は減少して式（１）の範囲を外れてしまうことがありうる。このため、培養期間中においては、特定微粒子の個数密度の測定値に基づいてフィードバック制御を行った方が好ましい。

このように、式（１）を満たす状態を維持する観点からは、遠心分離又はブリーディングなどの特定微粒子を培養容器内から除去する処理は、特定微粒子の個数密度をモニタリングしながら、適切な条件にて行うことが好ましい。モニタリングは常時に行う必要はなく、例えば各回の特定微粒子の除去処理の直前に行ってもよい。
また、特定微粒子の除去処理は連続的に行ってもよく、この場合、モニタリングは所定のタイミングで行えばよい。
一般に、培養を行う場合には細胞濃度を測定することがよく行われるが、特定微粒子の増加量は細胞の増殖に比例するものではないため、細胞濃度を測定するだけでは特定微粒子の個数密度を知ることはできない。したがって、特定微粒子の個数密度をモニタリングしてその結果に基づいて特定微粒子を培養容器から除去する処理、つまりフィードバック処理を行うことによって、特定微粒子の個数密度を式（１）の範囲内により確実に維持することができる。

本開示に係る生産物の製造方法において、当初の播種からの全培養期間に渡って式（１）が満たされた状態が維持されることは必要ない。つまり、本開示に係る生産物の製造方法は、培養期間の一部において、式（１）が満たされた状態が維持される実施形態をも含む。式（１）が満たされていない期間が存在する場合は、生産物を生産する細胞を培養する工程、分離処理工程、戻り液を培養容器に戻す工程、培養容器内に新鮮培地を供給する工程及び生産物を回収する工程が行われており、且つ式（１）が満たされている期間について、本開示に係る生産物の製造方法が行われていることになる。
ただし、培養期間のうち、少なくとも生産物の主要な生産期間においては式（１）が満たされた状態が維持されることが好ましい。
このため、少なくとも、細胞懸濁液中の細胞濃度が最大生細胞濃度又は設定生細胞濃度に達した後の培養期間中において、式（１）が満たされた状態が維持されることが好ましい。最大生細胞濃度は培養期間中における生細胞濃度の最大値であり、培養条件により異なる。設定生細胞濃度とは、ブリーディングなど式（１）を満たす状態を維持するための特定微粒子を培養容器内から除去する処理による特定微粒子数制御操作を開始する開始点を定めるための、任意に設定した生細胞濃度である。

本開示に係る生産物の製造方法による生産物透過率低下の抑制効果は、細胞を高密度培養する場合により顕著であるため、設定生細胞濃度は、例えば、２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上２０×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲内の値であってもよい。設定生細胞濃度は、３×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１５×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることがより好ましく、４×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。生細胞濃度が２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上にまで増加した以降の時期では、特定微粒子の生成速度も早くなる。このため、設定生細胞濃度が２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上２０×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下の場合、設定生細胞濃度に到達した後の培養において特定微粒子数を式（１）を満たすように制御することによる生産物透過率低下抑制効果がより顕著である。
細胞懸濁液中の細胞濃度が最大生細胞濃度又は設定生細胞濃度に達した後の培養期間中は培養を終了するまで常に式（１）が満たされた状態が維持されることがさらに好ましい。また、細胞の播種後、培養期間中常に式（１）が満たされた状態が維持されることが一層好ましい。

式（１）を満たす状態を維持するための制御は、例えば、細胞懸濁液中における生細胞の濃度又は生細胞の割合を一定にするための制御とは大きく異なる。例えば、特定微粒子は死細胞から放出された細胞内容物などでありうるため、生細胞濃度が減少している時期、又は生細胞の割合が低下している時期であっても、特定微粒子の個数密度は増加しうる。このように、式（１）を満たす状態を維持するための制御は、生細胞の濃度又は生細胞の割合を一定にするための制御とは異なる技術思想であり、式（１）を満たす状態を維持するための制御において、生細胞の濃度は通常は変動する。

このように、特定微粒子の個数密度は、生細胞の濃度に比例するものではないため、式（１）を満たす状態を維持するための制御は、灌流培養において生細胞１個あたりに供給される新鮮培地量を一定にするための制御とも明らかに異なる。灌流培養において生細胞１個あたりに供給される新鮮培地量を一定にするための制御を行えば、生細胞の状態を安定させることはできるが、特定微粒子の個数密度を式（１）の範囲内に維持することはできない。

上記のとおり、生産物を生産する細胞を培養する工程、分離処理工程、戻り液を培養容器に戻す工程、培養容器内に新鮮培地を供給する工程及び生産物を回収する工程が行われており、且つ式（１）が満たされている期間について、本開示に係る生産物の製造方法が行われていることになる。
上記各工程が行われている期間においては、式（１）を満たす状態はなるべく長く維持されることが好ましい。式（１）を満たす状態が長く維持されることで、分離膜を通しての生産物透過率の低下をより長期間抑制することができる。

このため、式（１）を満たす培養の継続日数は、好ましくは３日以上であり、より好ましくは１０日以上である。３日以上継続することで、生産物透過率低下を抑制する効果がより顕著になる。式（１）を満たす培養の継続日数が長くなるほど、生産物を効率よく長期間製造することができる。式（１）を満たす培養の継続日数の上限は特に無いが、培養期間が非常に長くなると細胞の生産物生産活性の低下などが生じることがある。このため、式（１）を満たす培養の継続日数は、より好ましくは３日以上９０日以下であり、さらに好ましくは１０日以上６０日以下であり、一層好ましくは１０日以上４０日以下であり、さらに一層好ましくは１５日以上３０日以下である。

なお、本開示において各パラメータについて記載される複数の範囲について、一つの範囲の上限値と別の範囲の下限値とを矛盾の生じない限り自由に組み合わせることにより規定される新たな範囲についても、本開示に開示されている事項の範囲内にある。なお、播種後に、本開示に係る生産物の製造方法が行われている以外の期間が存在してもよく、例えば、播種後しばらくの期間（例えば１日間〜５日間）、分離処理工程、戻り液を培養容器に戻す工程、及び培養容器内に新鮮培地を供給する工程を行わない期間が存在してもよい。

式（１）を満たす状態にあるかどうかは、培養容器から細胞培養液をサンプリングして特定微粒子の個数密度を測定することにより確認することができる。
式（１）を満たす培養の継続日数は、例えば、培地への細胞の播種後、分離処理工程の開始時から特定微粒子の個数密度を測定して式（１）を満たす状態にあるかどうか確認することにより行ってもよい。
本開示に係る生産物の製造方法がさらにブリーディング工程を含む場合には、初回のブリーディング工程の開始時から特定微粒子の個数密度を測定して式（１）を満たす状態にあるかどうか確認することにより行ってもよい。特定微粒子の個数密度が式（１）の範囲を外れてしまった場合には、たとえ培養操作自体を終了させなくても、式（１）の範囲を外れた時点で式（１）を満たす培養の継続期間が終了したこととなる。

式（１）を満たす状態は、分離処理工程の開始時から３日以上、例えば１０日以上継続してもよい。式（１）を満たす状態は、分離処理工程の開始時から、例えば３日以上９０日以下、又は１０日以上６０日以下、又は１０日以上４０日以下又は１５日以上３０日以下継続してもよい。分離処理の開始後にブリーディング工程を（間欠的又は連続的に）開始する場合は、式（１）を満たす状態は、初回のブリーディング工程の開始時から３日以上、例えば１０日以上継続してもよい。式（１）を満たす状態は、初回のブリーディング工程の開始時から、例えば３日以上９０日以下、又は１０日以上６０日以下、又は１０日以上４０日以下又は１５日以上３０日以下継続してもよい。

上記のとおり本開示に係る生産物の製造方法による生産物透過率低下の抑制効果は、細胞を高密度培養する場合により顕著である。このため、細胞懸濁液中の生細胞濃度Ｎｃは以下の式（２）を満たすことが好ましい。
２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ≦Ｎｃ≦２０×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ 式（２）
細胞懸濁液中の生細胞濃度Ｎｃは、３×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１５×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることがより好ましく、４×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。生細胞濃度Ｎｃが２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上２０×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下の場合、特定微粒子数を式（１）を満たすように制御しなければ生産物透過率が低下しやすいが、生細胞濃度Ｎｃが特定微粒子数を式（１）を満たす本開示に係る生産物の製造方法によれば、生産物透過率低下に対する抑制効果を十分に得ることができる。

本開示に係る生産物の製造方法は、培養容器から細胞懸濁液を抜き出し、抜き出した量と同量の新鮮培地を培養容器内に添加するブリーディング工程をさらに含み、ブリーディング工程が、細胞懸濁液中の特定微粒子の個数密度Ｎｄを測定すること、及びＮｄが式（１）を満たすようにブリーディング量を調整することを含む製造方法であることが好ましい。ここでの細胞懸濁液の抜き出しは、培養容器中の細胞懸濁液の一部の抜き出しである。特定微粒子の個数密度Ｎｄの測定は、例えば、培養容器から細胞懸濁液をサンプリングして、細胞懸濁液中の特定微粒子の個数密度を測定することにより行うことができる。特定微粒子の個数密度Ｎｄの測定値に基づいて、Ｎｄが式（１）を満たすようにブリーディング量を調整する、いわゆるフィードバック制御を行うことにより、式（１）が確実に満たされるように培養を継続することができる。

例えば、細胞懸濁液の１日あたりのブリーディング回数Ｎｂが１回以上であり、且つ培養容器中の細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃ、Ｎｄの個／ｍＬを単位として表される目標値をＮｄ’、Ｎｂ以下の任意の自然数ｎについてｎ回目のブリーディング前の細胞懸濁液中における特定微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度をＮｄｎとしたときに、Ｌを単位として表されるｎ回目のブリーディング量Ｖｂｎが以下の式（３）及び式（４）を満たすようにすることが好ましい。
Ｖｂｎ＝Ｖｃ×（Ｎｄｎ−Ｎｄ’）／Ｎｄｎ 式（３）
Ｎｃ≦Ｎｄ’≦Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２） 式（４）

Ｎｄの目標値Ｎｄ’とは、ブリーディングを行うことにより達成しようとする特定微粒子の個数密度であり、式（４）を満たす範囲で任意に設定することができる。ｎ回目のブリーディング量を式（３）により決定されるブリーディング量Ｖｂｎに設定することで、ｎ回目のブリーディング後のＮｄの値をＮｄ’に調整することができる。Ｎｄ’は毎日同じ値であっても、日毎に設定し直してもよい。なお、式（３）ではＮｄ’と変数ｎとの関係は記載していないが、特定微粒子の個数密度の目標値Ｎｄ’は各ｎ毎に設定してもよく、その場合、Ｎｄ’はＮｄ’ｎと記載することもできる。例えば、前回のブリーディング後のＮｄの値がＮｃ以上（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２）以下の値である場合は、前回のブリーディング後のＮｄ値をＮｄ’ｎとして用いてもよい。また、Ｎｂは１回以上であればよく、例えば１回以上１０回以内、又は２回以上５回以内であってもよい。ブリーディング頻度は高い方が特定微粒子の個数密度をより精密に制御できる傾向にある。
ブリーディングを連続的に行う場合には、ブリーディング速度を変化させた時点から、ブリーディング速度を次に変化させた時点までを１回のブリーディングとして式（３）及び式（４）を適用すればよい。言い換えれば、ブリーディングを連続的に行う場合、ブリーディング速度を変化させた時点から、ブリーディング速度を次に変化させた時点までのブリーディングが１回のブリーディングを構成する。

ブリーディング量は、ブリーディングが排出管に設けられたバルブの開閉により行っている場合はバルブの開度及びバルブの開放時間のうち少なくとも一方により調節することができ、また、ブリーディングが排出管に設けられたポンプにより行われる場合にはポンプの出力及びポンプの運転時間のうち少なくとも一方により調節することができる。

式（４）においてＮｄ’は、Ｎｃ以上Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２）以下と規定されているが、Ｎｄ’は、Ｎｃ×１．１以上Ｓ／（４８×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２）以下であることが好ましく、Ｎｃ×１．２以上Ｓ／（６４×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２）以下であるがより好ましく、Ｎｃ×１．３以上Ｓ／（９６×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２）以下であることがさらに好ましい。Ｎｄ’をＮｃ個／ｍＬ以上とすることで細胞が分離膜の膜壁に衝突または潜り込むことにより受けるダメージを緩和する効果を効果的に得ることができ、Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２） 個／ｍＬ以下とすることで分離膜を通しての生産物透過率の低下を抑制する効果を効果的に得ることができる。

本開示に係る生産物の製造方法は、細胞懸濁液の１日あたりのブリーディング回数Ｎｂが１回以上であり、且つ培養容器中の細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃ、Ｎｄの個／ｍＬを単位として表される目標値をＮｄ’、Ｎｂ以下の任意の自然数ｎについてｎ回目のブリーディング前の細胞懸濁液中における特定微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度をＮｄｎとしたときに、Ｌを単位として表されるｎ回目のブリーディング量Ｖｂｎが以下の式（３）及び式（５）を満たす製造方法であることが好ましい。
Ｖｂｎ＝Ｖｃ×（Ｎｄｎ−Ｎｄ’）／Ｎｄｎ 式（３）
２×１０^７個／ｍＬ≦Ｎｄ’≦２×１０^９個／ｍＬ 式（５）
ブリーディングを連続的に行う場合には、ブリーディング速度を変化させた時点から、ブリーディング速度を次に変化させた時点までを１回のブリーディングとして式（３）及び式（５）を適用すればよい。言い換えれば、ブリーディングを連続的に行う場合、ブリーディング速度を変化させた時点から、ブリーディング速度を次に変化させた時点までのブリーディングが１回のブリーディングを構成する。Ｖｃは、０．１Ｌ以上５０００Ｌ以下が好ましく、０．５Ｌ以上３０００Ｌ以下がより好ましく、１Ｌ以上２０００Ｌ以下がさらに好ましい。

Ｎｄ’は、特に式（５）で規定される範囲内に設定することが好ましい。Ｎｄ’を式（５）で規定される範囲内にすることで、細胞へのダメージ緩和効果、生産物透過率の低下の抑制効果をより効果的に得ることができる。Ｎｄ’は２．２×１０^７個／ｍＬ≦Ｎｄ’≦１．５×１０^９個／ｍＬが好ましく、２．４×１０^７個／ｍＬ≦Ｎｄ’≦１×１０^９個／ｍＬがより好ましい。

本開示に係る生産物の製造方法における生産物を生産する細胞を培養する工程は、培養容器内の細胞培養液を撹拌翼により撹拌することを含んでいてもよい。生産物を生産する細胞を培養する工程は、
培養容器中の細胞培養液を撹拌翼により撹拌することを含み、
撹拌翼の動力係数をＮｐ、撹拌翼のｍを単位として表される翼径をＤｉ、撹拌翼のｓ^−１を単位として表される回転数をＲｏ、細胞懸濁液のｋｇ／ｍ^３を単位として表される密度をρ、培養容器中の細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃとしたときに、以下の式（６）にて定義される撹拌翼のＷ／ｍ^３を単位として表される撹拌動力Ｐｖが１０Ｗ／ｍ^３以上１５０Ｗ／ｍ^３以下の範囲内において撹拌を行い、且つ培養容器の底面を基準として細胞懸濁液のｍを単位として表される液面高さをＨｃとしたときのブリーディング抜き出し位置のｍを単位として表される高さＨｂが１／２×Ｈｃ以下である工程であることが好ましい。Ｎｐは、０．１以上２以下が好ましく、０．３以上１．５以下がより好ましく、０．５以上１．２以下がさらに好ましい。Ｒｏは、１．３ｓ^−１以上６．７ｓ^−１以下が好ましく、２ｓ^−１以上５ｓ^−１以下がより好ましく、３ｓ^−１以上４ｓ^−１以下がさらに好ましい。
Ｐｖ＝Ｎｐ×ρ×Ｒｏ^３×Ｄｉ^５／（Ｖｃ×１０^−３） 式（６）

翼径Ｄｉとは、撹拌翼の回転中心から、回転中心から最も遠い撹拌翼上の点までの距離を２倍した値である。液面高さＨｃとは、培養容器中における細胞懸濁液の最下点から最上点までの距離を意味し、培養容器の形状、細胞懸濁液の液量、及びデッドボリュームにより決まる値である。また、ブリーディング抜き出し位置の高さＨｂとは、培養容器から細胞懸濁液を抜き出す高さであり、細胞懸濁液の最下点からブリーディングを行うための配管吸入口までの垂直距離として求められる。配管吸入口の開口面が水平で無い場合には、Ｈｂの測定は、配管吸入口の開口面の中心までの距離として行う。

撹拌翼を回転させることで、培養容器の内部に収容された細胞懸濁液が撹拌され、細胞懸濁液の均質性が向上する。ここで、撹拌動力Ｐｖは細胞懸濁液の混合度合いを表す指標であり、撹拌動力Ｐｖを１０ Ｗ／ｍ^３以上とすることで細胞と培地との間の物質移動の促進効果が効果的に得られる傾向があり、撹拌動力Ｐｖを１５０ Ｗ／ｍ^３以下とすることで、ブリーディングによる特定微粒子の除去をより効果的に行うことができる。

撹拌動力Ｐｖは１０Ｗ／ｍ^３以上１５０Ｗ／ｍ^３以下が好ましく、１５Ｗ／ｍ^３以上１５０Ｗ／ｍ^３以下がより好ましく、２０Ｗ／ｍ^３以上１００Ｗ／ｍ^３以下がさらに好ましい。
ブリーディング抜き出し位置の高さＨｂは１／２×Ｈｃ以下が好ましく、１／３×Ｈｃ以下がより好ましく、１／４×Ｈｃ以下がさらに好ましい。
撹拌動力を上記範囲内に制御しつつＨｂを１／２×Ｈｃ以下とすることで、ブリーディングによる特定微粒子の除去をより効果的に行うことができる。上記範囲内の撹拌動力であれば、撹拌を行っていても特定微粒子は培養容器内で適度に沈降するため、Ｈｂが上記範囲内となるように設置されたブリーディングを行うための配管を通して特定微粒子を効率よく抜き出せるからである。

本開示に係る生産物の製造方法において、生産物を生産する細胞を培養する工程は、細胞懸濁液にスパージャーによりガス通気することを含んでいてもよい。
生産物を生産する細胞を培養する工程は、
細胞懸濁液にスパージャーによりガス通気することを含み、
細胞懸濁液のＮ／ｍを単位として表される界面張力をσ、スパージャーのμｍを単位として表される孔直径をＤｓ、スパージャーから発生する単一ガスのｍＬを単位として表される体積をＶｇ、スパージャーのｍＬ／分を単位として表されるガス通気流量をＱ、培養容器中の細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃ、細胞懸濁液のｋｇ／ｍ^３を単位として表される密度をρ、ｍ／ｓ^２を単位として表される重力加速度をｇとしたときに、以下の式（７）及び式（８）によりに定義されｓ^−１・Ｌ^−１を単位とする単位容量及び単位時間当たりの通気ガス個数Ｎｇが以下の式（９）を満たす工程であることが好ましい。
Ｎｇ＝Ｑ／（Ｖｇ×Ｖｃ×６０） 式（７）
Ｖｇ＝π×Ｄｓ×σ／（ρ×ｇ） 式（８）
１００ｓ^−１・Ｌ^−１≦Ｎｇ≦５０００ｓ^−１・Ｌ^−１ 式（９）

細胞懸濁液の界面張力σは、自動表面張力計ＣＢＶＰ−Ｚ（協和界面化学社製）を用いてプレート法により測定できる。スパージャーから発生する単一ガスの体積Ｖｇとは、図６に示されるように、スパージャーの孔から細胞懸濁液へと放出された気泡１個当たりの体積である。Ｖｇは、式（８）に従って、計算により求めることができる理論値である。
したがって、式中の各記号は実際の細胞懸濁液における特性を表すものであって、例えば、界面張力σは細胞懸濁液の液温における界面張力を表し、密度ρも細胞懸濁液の液温における密度を表す。通気ガス個数Ｎｇとは、上記計算により求めた体積Ｖｇを有する気泡が、細胞懸濁液１Ｌ当たり１秒間に何個供給されるかを示した値である。通気ガス個数Ｎｇが１００ ｓ^−１・Ｌ^−１以上であると、スパージャーからの通気ガスによって細胞と培地との間の物質移動の促進効果を効果的に得ることができ、通気ガス個数Ｎｇが３０００ｓ^−１・Ｌ^−１以下であると、ガスの破泡による細胞へのダメージが小さく、特定微粒子の個数密度を抑制する効果が効率よく得られる。スパージャーから発生するガスは、単位体積および単位時間あたりに発生する個数である通気ガス個数Ｎｇが多いほど周囲の細胞を巻きこみ、破泡することにより特定微粒子の増加を促進する。そのため通気ガス個数Ｎｇを上記範囲に制御することで特定微粒子の発生を抑制することができる。

通気ガス個数Ｎｇは１００ｓ^−１・Ｌ^−１以上５０００ｓ^−１・Ｌ^−１以下であることが好ましく、２００ｓ^−１・Ｌ^−１以上３５００ｓ^−１・Ｌ^−１以下であることがより好ましく、３００ｓ^−１・Ｌ^−１以上２０００ｓ^−１・Ｌ^−１以下であることが最も好ましい。

細胞懸濁液の界面張力σ及びスパージャーの孔直径Ｄｓは、それぞれ以下の範囲にあることが好ましい。
σは、１０ｍＮ／ｍ以上１００ｍＮ／ｍ以下が好ましく、２０ｍＮ／ｍ以上８０ｍＮ／ｍ以下がより好ましく、３０ｍＮ／ｍ以上６０ｍＮ／ｍ以下がさらに好ましい。
Ｄｓは、０．１μｍ以上２００μｍ以下が好ましく、０．２μｍ以上１００μｍ以下がより好ましく、０．５μｍ以上５０μｍ以下がさらに好ましい。

σが１０ｍＮ／ｍ以上であると、またＤｓが０．１μｍ以上であると、細胞と培地との間の物質移動の促進効果を効果的に生み出すことができる。σが１０．０×１０^−２Ｎ／ｍ以下であると、またＤｓが２００μｍ以下であると、通気ガスによる細胞へのダメージを抑えることができ、また十分な個数の通気ガス気泡を発生させることができる。

本開示に係る生産物の製造方法は、
分離膜の孔径Ｄｐが０．１μｍ以上１μｍ以下であり、
生細胞濃度が最大または設定生細胞濃度に達した後の培養期間中常に、Ｎｄが以下の式（１２）を満たす製造方法であることが好ましい。
２×１０^７≦Ｎｄ≦２×１０^９ 式（１２）
Ｎｄは、より好ましくは、２．２×１０^７≦Ｎｄ≦１．５×１０^９を満たし、さらに好ましくは、２．４×１０^７≦Ｎｄ≦１×１０^９を満たす。

分離膜の孔径Ｄｐが０．１μｍ以上であると、生産物を効率よく透過することができ、分離膜の孔径Ｄｐが１μｍ以下であると、細胞の透過を効率よく防ぐことができる。
また、生産物の生産が行われる主要な期間である生細胞濃度が最大または設定生細胞濃度に達した後の培養期間中、Ｎｄは特に式（１２）で規定される範囲内に設定することが好ましい。Ｎｄを式（１２）の範囲内にすることで、細胞へのダメージ緩和効果、生産物透過率の低下の抑制効果をより効果的に得ることができる。Ｄｐは、０．１μｍ以上１μｍ以下であることが好ましく、０．１５μｍ以上０．８μｍ以下であることがさらに好ましく、０．１７μｍ〜０．２３μｍがより更に好ましく、０．２μｍであることが最も好ましい。

本開示に係る生産物の製造方法においては、細胞懸濁液に含まれる生産物の濃度に対する、透過液に含まれる生産物の濃度の比として算出される、分離膜を通しての生産物の透過率が５５％以上であることが好ましい。本開示に係る生産物の製造方法によれば、分離膜を通しての生産物透過率の低下が効果的に抑制できるため、生産物透過率を５５％以上に維持することが可能である。特に、生産物の生産が行われる主要な期間である生細胞濃度が最大または設定生細胞濃度に達した後の培養期間中、常に、分離膜を通しての生産物透過率が５５％以上であることがより好ましい。分離膜を通しての生産物透過率は、より好ましくは６０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上であり、一層好ましくは８０％以上である。

以降、図面を参照しながら、本開示に係る生産物の製造方法をさらに詳しく説明する。 図４には平膜型の分離膜を備えるフィルタ部の一例を示し、図５には、図４に示すような平膜型の分離膜を用いた場合のタンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理の一例の様子が模式的に示されている。この例では、生産物を生産する細胞により生産される目的の生産物は抗体である。

図４に示す平膜型の分離膜を有するフィルタ部の流入口３０ａから細胞懸濁液を流入させ、流出口３０ｂから細胞懸濁液を流出させた場合、細胞懸濁液は流入口３０ａから流出口３０ｂへと向かって、分離膜の膜面に平行に流れる。図５に示すように、フィルタ部の１次側には細胞懸濁液に含まれる細胞（図中の白丸）、抗体（図中のＹ字）、及び特定微粒子（図中のドットで塗られた丸）などが存在する。図５においては分離膜２４の上側が１次側、下側が２次側である。
細胞は分離膜の孔径Ｄｐよりも大きいサイズを有するため、分離膜を透過することができず、分離膜の１次側に留まる。抗体は分離膜の孔径Ｄｐよりも小さいサイズを有するため、分離膜の孔を通って２次側へと移行する。特定微粒子は、その一部が細胞と分離膜との間に位置することによって、細胞が分離膜の膜壁に衝突または潜り込むことで受けるダメージを緩和している。
一方で、特定微粒子は抗体が分離膜の孔に接近することも妨げるため、抗体が分離膜を透過することを妨げ、抗体透過率を低下させる。抗体透過率の低下は分離膜の膜面面積である濾過面積Ｓに対して、特定微粒子の数が多い場合に特に顕著となるが、一方で細胞保護のために一定数の特定微粒子の存在は好ましい。
これらのことから、式（１）を満たすように特定微粒子の個数密度を制御することにより、細胞へのダメージを抑えつつ、抗体透過性の低下を抑えることができることが理解される。

なお、タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理において、タンジェンシャルフィルトレーションにおけるフィルタ部供給側空間中の流れの向きを、時間の経過と共に逆転させる、つまり流れを往復させる場合には、図４における流出口３０ｂと流入口３０ａは流れの向きを逆転するたびに逆転することになる。

図１は、本開示に係る生産物の製造方法の実施に適用可能な細胞培養装置１００の構成の一例を示す図である。

細胞培養装置１００は、生産物の一例としての抗体を生産する細胞を培地とともに収容し培養する培養容器１０と、培養容器１０に収容されている細胞懸濁液を抜き出して、フィルタ部２０に送る流路５２と、培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液に対してタンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理を施す分離膜２４を有するフィルタ部２０と、分離膜２４によって阻止された成分をフィルタ部２０から排出する流路５１と、分離膜２４を透過した成分（透過液）を回収するための流路５３とを有する。

培養容器１０の内部には、撹拌翼１１を有する撹拌装置が設けられている。撹拌翼１１を回転させることで、培養容器１０の内部に収容された培地が撹拌され、培地の均質性が保たれる。

流路５１は、一端がフィルタ部２０の流出／流入口２０ａに接続され、他端がポンプＰＵ１に接続している。ポンプＰＵ１により、流路５１を通しての液体の流れが生じ、培養容器１０中の細胞懸濁液の流路５２を通しての抜き出し、又はその逆方向の流れが形成される。流路５１における送液圧力はポンプＰＵ１とフィルタ部２０との間に設置された圧力計６０によって測定することが可能であり、流路５２における送液圧力は流路５２上に設けられたピンチバルブＶとフィルタ部２０との間に設置された圧力計６１によって測定することが可能である。ポンプＰＵ１の送液圧力Ｐは、ピンチバルブＶの開度によって調整することが可能である。

フィルタ部２０は、容器２１と、容器２１内の空間を供給側２２と透過側２３とに隔て、培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液に対して膜分離処理を施す分離膜２４と、を備える。また、フィルタ部２０は、供給側２２において、細胞懸濁液が流出又は流入する流出／流入口２０ａと細胞懸濁液が流入又は流出する流入／流出口２０ｂとを有する。培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液は、流入／流出口２０ｂから容器２１の内部に流入して流出／流入口２０ａから容器２１の外部に流出する間に分離膜２４上を通過する。フィルタ部２０は、膜分離処理の対象となる液体を分離膜２４の膜面に沿って（膜面と平行な方向に）流しながら、サイズの小さい成分を透過側２３に送るタンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理を行う。タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理は、培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液が分離膜２４の膜面に沿って平行に一方向に循環する流れを形成するものであってもよいし、細胞懸濁液が分離膜２４の膜面に沿って往復する流れを形成するものであってもよいが、ここでは往復する流れを形成する場合について主に説明する。

細胞懸濁液に含まれる細胞は、分離膜２４を透過せず、流出／流入口２０ａから容器２１の外部に流出し、細胞を含む液体は流路５１を介してポンプＰＵ１へと一旦送られる。ポンプＰＵ１はダイアフラムポンプであって、ダイアフラムの移動によって生じた空間にこの液体は一時的に貯留される。ポンプＰＵ１は吸込口と吐出口が兼用となっているため、ダイアフラムの移動によって往復する流れが形成できるポンプである。一方、細胞懸濁液に含まれる抗体は、分離膜２４を透過して、透過側２３に設けられた排出口２０ｃから容器２１の外部に排出される。透過側２３には、ポンプＰＵ２が設けられた流路５３が接続されており、透過側２３に透過した抗体を含む透過液は、流路５３を介して回収される（回収工程）。流路５３における送液圧力はフィルタ部２０とポンプＰＵ２との間に設けられた圧力計６２によって測定することが可能である。細胞は分離膜２４を透過しないが抗体は分離膜２４を透過するため、透過液は細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有し且つ抗体を含む。

分離膜２４を透過し、回収された透過液に含まれる抗体は、流路５３を介して、抗体の精製を行う精製処理部（図示せず）に送られる。

タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理において、培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液が分離膜２４の膜面に沿って往復する流れを形成する場合は、ポンプＰＵ１の送液方向を時間経過と共に逆転させる。ポンプＰＵ１の送液方向を逆転させた場合、流路５１を介してポンプＰＵ１から細胞懸濁液が抜き出されてフィルタ部２０に送られ、分離膜２４によって阻止された成分はフィルタ部２０から流路５２を介して培養容器１０の内部へと戻り液として戻される。細胞は分離膜２４を透過しないため、戻り液は細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する。なお、ここではポンプＰＵ１の内部空間を利用して往復する流れを形成する実施形態について説明したが、本開示に係る実施形態はこれに限定されない。例えば、ポンプＰＵ１と培養容器１０とを連絡するさらなる流路（図示せず）を設けることにより、流出／流入口２０ａから流出した液体を培養容器１０に戻り液として戻してもよい。この場合は、流れの方向は一方向とすることができるが、必要であればポンプＰＵ１の送液方向を時間の経過と共に逆転させることも可能である。

細胞培養装置１００は、新鮮な培地を培養容器１０に供給するための流路５４と、流路５４の途中に設けられたポンプＰＵ３を有する。ポンプＰＵ３を作動させることにより、透過液として失われた液体量に加えて、ブリーディングにより失われた液体量も補うように、流路５４を通じて培養容器１０内に新鮮培地が添加される。

培養容器１０内の特定微粒子の割合を式（１）の範囲内に制御するために、培養容器内の下部に一端が開口した流路４１から培養容器内の細胞懸濁液を抜き出し、流路５４から細胞懸濁液の減少分を補うための新鮮な培地を供給するブリーディングが行われる。ブリーディングは間欠的に行っても連続的に行ってもよい。流路４１の途中にはポンプＰＵ４が設けられ、細胞懸濁液の最下点からの高さがＨｂである位置に開口した流路４１を介して細胞懸濁液を培養容器１０から抜き出す。抜き出されたブリード液は、廃棄してもよいし、膜処理などをおこなって生産物を回収してもよい。また、培養容器１０は、特定微粒子の個数密度を測定するためのサンプルを採取するための図示しないサンプリング口を備えていてもよい。

以上説明したように、本開示によれば、高濃度で細胞を培養する場合であっても、分離膜を通しての生産物透過率を高く保つことができる生産物の製造方法を提供される。製造された生産物は、例えばバイオ医薬品及び再生医療等において用いることができる。

以下、実施例により本開示の実施形態を更に具体的に説明するが、本開示の実施形態は以下の実施例に限定されるものではない。

図１に示す細胞培養装置を用いて、生産物の製造の実験を行った。
まず、培養容器に培地（商品名ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）０．８Ｌを入れ３７℃で保持し、培養容器上面から空気を３８ｍＬ／分、ＣＯ_２を２ｍＬ／で通気し１日間放置した。次に、生産物としての抗体を生産する細胞を培養容器内の細胞濃度が２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、培養容器内の液量が１．０Ｌになるように播種した。播種から３日後にポンプによる細胞懸濁液の連続的な抜き出し及びタンジェンシャルフィルトレーション方式による濾過（分離処理工程）、及び新鮮培地（商品名ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、および商品名Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａ及び７ｂ、ＧＥヘルスケア製の混合物）の供給（新鮮培地を供給する工程）を１．２Ｌ／日の割合で行った。タンジェンシャルフィルトレーション方式による濾過においては、細胞懸濁液を、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有し生産物としての抗体を含む透過液とに分離し、戻り液は培養容器に戻した（戻り液を培養液に戻す工程）。また、透過液を回収することにより、生産物としての抗体を回収した。

この状態のまま、所定の設定生細胞濃度になるまで培養を続けた。設定生細胞濃度は、実施例１及び４〜１２並びに比較例１〜６については８×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、実施例２については１２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、実施例３については１４×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。所定の設定生細胞濃度になった日を１日目とし、１日目より表２及び表３に記載のプロトコールに従い１日１回ブリーディング操作（ブリーディング工程）を行いながら培養を続けた（培養工程）。

１日目より、ブリーディング前後に培養容器内および分離膜２次側からそれぞれ液をサンプリングし、培養容器内の特定微粒子の個数密度および培養容器内と分離膜２次側の抗体濃度をそれぞれ定量した。日毎の特定微粒子の個数密度および抗体透過率はブリーディング前後の値の算術平均とした。ただし培養最終日のみ前日のブリーディング後と当日のブリーディング前の値の算術平均とした。また日毎の抗体透過率（生産物の透過率）を分離膜２次側における抗体濃度／培養容器内における抗体濃度×１００として算出した。

各日のブリーディングは以下のプロトコールに従って行った。

＜ブリーディングのプロトコール＞
表２及び表３において「特定微粒子個数密度による」と記載されている実施例及び比較例については、当日のブリーディング前の特定微粒子の個数密度をＮｄ、前日のブリーディング後の特定微粒子の個数密度を目標個数密度Ｎｄ’として、ブリーディング量を（Ｎｄ−Ｎｄ’）／Ｎｄ×１Ｌと設定した。ただし、Ｎｄ’の上限値は９．５×１０^８個／ｍＬとした。
表２及び表３において「一定量」と記載されている実施例及び比較例については、各日のブリーディング量を０．２０Ｌで一定とした。
表２及び表３において「細胞濃度による」と記載されている比較例については、ブリーディング前の細胞濃度をＮｃ、設定生細胞濃度をＮｃ’としてブリーディング量を（Ｎｃ−Ｎｃ’）／Ｎｃ×１Ｌとした。

上記の実験においては、細胞懸濁液抜出濾過ポンプとして、ダイアフラム式往復ＡＴＦポンプ（商品名ＡＴＦ２、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製）を用いた。
特定微粒子の個数密度の定量は、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社の商品名Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ４ｅおよび商品名Ｖｉ−Ｃｅｌｌ ＸＲを用いて、粒子サイズ８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下の全粒子数から、粒子サイズ８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下の生細胞数を減算することにより行った。
抗体濃度の定量には液体高速クロマトグラフ（商品名Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、株式会社島津製作所製）を用いた。分離膜２次側の透過液をそのままロードした。カラムとして、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＯＲＯＳ ５０Ａ 内径４．６ｍｍ×５０ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ株式会社製）を用いた。また溶離液として、２０ｍＭのリン酸バッファー＋３００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）および２０ｍＭのリン酸バッファー＋３００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ２．８）を用い、グラジエント溶出法により測定した。
培養液の液温における界面張力は、自動表面張力計（商品名ＣＢＶＰ−Ｚ、協和界面化学社製）を用いてプレート法により測定した。

また、上記の実験において用いた細胞は抗体を生産するＣＨＯ細胞であり、培養容器中の細胞懸濁液の液量Ｖｃは１．０Ｌであり、培養容器中における培養液（細胞懸濁液）の液面高さＨｃは０．０８８ｍであった。また、分離膜として、中空糸型ＭＦ膜であるＲｅｐｌｉｇｅｎ社の孔径（Ｄｐ）０．２μｍのＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）フィルタＦ２ＲＦ０２ＰＥＳを用いた。この分離膜の濾過面積は０．１３ｍ^２であり、中空糸径Ｄｆは１．０×１０^−３ｍであり、１次側流路体積Ｖｆは、３３ｃｍ^３であった。撹拌翼の翼径Ｄｉは８５×１０^−３ｍであり、動力係数Ｎｐは１．０であった。培養容器中の培養液、つまり細胞懸濁液の密度ρは１０００ｋｇ／ｍ^３であり、界面張力σは５．１×１０^−２Ｎ／ｍであった。上記の実験におけるＳ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２）の値は９．８×１０^８個／ｍＬとなる。

培養の継続日数の間における抗体透過率の測定値のうち最小の値を用いて、以下の評価基準により評価した。
Ａ：最小の抗体透過率が８５％以上
Ｂ：最小の抗体透過率が７５％以上８５％未満
Ｃ：最小の抗体透過率が６５％以上７５％未満
Ｄ：最小の抗体透過率が５５％以上６５％未満
Ｅ：最小の抗体透過率が５５％未満

以上の実施例及び比較例により得られた結果を、以下の表２及び表３に示す。培養の継続日数の間における特定微粒子の個数密度の測定値のうちの最小値を最小個数密度として、最大値を最大個数密度として表２及び表３中に示した。
また、培養の継続日数の間における生細胞濃度の測定値のうちの最大値を最大細胞濃度として表２及び表３中に示した。
いずれの実施例及び比較例でも、特定微粒子の最小個数密度は最大細胞濃度よりも大きい値であるため、式（１）における左側の不等式であるＮｃ≦Ｎｄは満足されている。
式（１）における右側の不等式であるＮｄ≦Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２）が培養及びタンジェンシャルフィルトレーション方式による濾過が継続して行われた１８日間の期間中に常に満たされていたかどうかは、特定微粒子の最大個数密度と、Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２）の値とを比較することで判定できる。

培養の継続日数の間におけるブリーディング量のうちの最小値を最小ブリーディング量として、最大値を最大ブリーディング量として表２及び表３中に示した。ブリーディングのプロトコールが「一定量」の場合は、ブリーディング量は毎回同じであるため、最小ブリーディング量と最大ブリーディング量の値は同じとなっている。

表２及び表３において、培養の継続日数は日を単位として表し、最大細胞濃度は１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬを単位として表し、特定微粒子の最小個数密度及び最大個数密度は１０^８個／ｍＬを単位として表し、最小ブリーディング量及び最大ブリーディング量はＬを単位として表し、抜出高さはｍを単位として表し、撹拌翼の回転数はｓ^−１を単位として表し、撹拌動力はＷ／ｍ^３を単位として表し、スパージャーの孔径はμｍを単位として表し、通気ガス体積は１０^−４ｍＬを単位として表し、ガス通気量はｍＬ／ｍｉｎを単位として表し、通気ガス個数はｓ^−１・Ｌ^−１を単位として表し、抗体透過率は％を単位として表す。

表２及び表３に示されるとおり、式（１）を満たしている実施例１〜実施例１２においては、抗体透過率は１８日間の培養期間を通じて６５％以上と良好であった。一方、培養期間の途中で式（１）の範囲外となった比較例１〜比較例６においては、抗体透過率の最小値は５５％未満と低かった。
このことから、式（１）を満たす状態を維持することによって、生産物の透過率を高く維持できることが分かる。

また、実施例１の結果と実施例４の結果との比較から、ブリーディング工程が、特定微粒子の個数密度Ｎｄを測定すること、及びＮｄが式（１）を満たすようにブリーディング量を調整することを含む場合に、生産物透過率の低下がより効果的に抑制されることが分かる。
一方、細胞濃度を一定にするようにブリーディングを行った場合には、比較例４〜比較例６に示されるように生産物透過率の低下を抑えることができないことが分かる。
実施例４〜実施例６の比較、及び実施例１と実施例７との比較から、Ｈｂ／Ｈｃ比が上記に記載の好ましい範囲内である場合に、生産物透過率の低下がより効果的に抑制されることが分かる。
実施例８及び実施例９の比較、及び実施例１と実施例１０との比較から、回転翼の撹拌動力Ｐｖが１０Ｗ／ｍ^３以上１５０Ｗ／ｍ^３以下の範囲内である場合に、生産物透過率の低下がより効果的に抑制されることが分かる。
実施例１、実施例１１及び実施例１２の比較から、通気ガス個数Ｎｇが上記に記載の好ましい範囲内である場合に、生産物透過率の低下がより効果的に抑制されることが分かる。

図７には、実施例１、実施例６及び実施例１２並びに比較例４及び比較例６における培養日数と粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下となる生細胞以外の微粒子個数密度Ｎｄとの関係を示した。
図７から分かるように、実施例１、実施例６及び実施例１２においては、特定微粒子の個数密度は低く維持されていたが、比較例４及び比較例６においては、培養期間中に特定微粒子個数密度が高い値となった。

図８には、実施例１、実施例６及び実施例１２並びに比較例４及び比較例６における培養日数とブリーディング量との関係を示した。
比較例４及び比較例６においては、細胞濃度に応じたブリーディング量の調整を行ったが、日毎のブリーディング量は実施例１、実施例６及び実施例１２における日毎のブリーディング量とは大きく異なっていた。
このように、細胞濃度に応じたブリーディング量の調整は、本開示に係る式（１）を維持するためのブリーディング量の制御とは大きく異なる。

図９には、実施例１、実施例６及び実施例１２並びに比較例４及び比較例６における培養日数と分離膜を通しての抗体透過率との関係を示した。
図９から分かるように、実施例１、実施例６及び実施例１２においては、抗体透過率の低下は効果的に抑制されていたが、比較例４及び比較例６においては、抗体透過率は培養期間中に大きく低下した。

（符号の説明）
１０：培養容器、１１：撹拌翼、２０：フィルタ部、２０ａ：流出／流入口、２０ｂ：流出／流入口、２０ｃ：排出口、２１：容器、２２：供給側、２３：透過側、２４：分離膜、３０ａ：流入口、３０ｂ：流出口、４１：流路、５１〜５４：流路、６０〜６２：圧力計、１００：細胞培養装置、ＰＵ１〜ＰＵ４：ポンプ、Ｖ：ピンチバルブ、Ｈｂ：抜き出し位置の高さ、Ｄｆ：中空糸径、Ｌ：中空糸の長さ、Ｓ：濾過面積、Ｖｆ：分離膜１次側流路体積、Ｄｐ：分離膜孔径、Ｄｓ：スパージャーの孔直径、Ｖｇ：単一ガスの体積。

２０１８年３月１９日に出願された日本国特許出願２０１８−０５１２６１の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (13)

1. 培養容器中に収容された細胞懸濁液中に含まれる、生産物を生産する細胞を培養する工程と、
   前記培養容器から前記細胞懸濁液を抜き出して、分離膜を用いて、前記細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、前記細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有し前記生産物を含む透過液とにタンジェンシャルフィルトレーション方式で分離する分離処理工程と、
   前記戻り液を前記培養容器に戻す工程と、
   前記培養容器内に新鮮培地を供給する工程と、
   前記生産物を回収する工程と、
   を含み、
   前記細胞懸濁液中のｃｅｌｌｓ／ｍＬを単位として表される生細胞濃度をＮｃ、前記分離膜のｍを単位として表される孔径をＤｐ、前記分離膜のｍ^２を単位として表される濾過面積をＳ、ｃｍ^３を単位として表される分離膜１次側流路体積をＶｆとしたときに、前記細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度Ｎｄが以下の式（１）を満たす、生産物の製造方法。
   Ｎｃ≦Ｎｄ≦Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２） 式（１）
2. 前記式（１）を満たす培養の継続日数が１０日以上である、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記式（１）を満たす培養の継続日数が１０日以上４０日以下である、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。
4. 前記生細胞濃度Ｎｃが以下の式（２）を満たす、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の製造方法。
   ２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ≦Ｎｃ≦２０×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ 式（２）
5. 前記培養容器から前記細胞懸濁液を抜き出し、抜き出した量と同量の新鮮培地を前記培養容器内に添加するブリーディング工程をさらに含み、前記ブリーディング工程は、前記細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個数密度Ｎｄを測定すること、及びＮｄが前記式（１）を満たすようにブリーディング量を調整することを含む、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の製造方法。
6. 前記細胞懸濁液の１日あたりのブリーディング回数Ｎｂが１回以上であり、且つ前記培養容器中の前記細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃ、Ｎｄの個／ｍＬを単位として表される目標値をＮｄ’、Ｎｂ以下の任意の自然数ｎについてｎ回目のブリーディング前の前記細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度をＮｄｎとしたときに、Ｌを単位として表されるｎ回目のブリーディング量Ｖｂｎが以下の式（３）及び式（４）を満たす、請求項５に記載の製造方法。
   Ｖｂｎ＝Ｖｃ×（Ｎｄｎ−Ｎｄ’）／Ｎｄｎ 式（３）
   Ｎｃ≦Ｎｄ’≦Ｓ／（３２×π×Ｖｆ×Ｄｐ^２） 式（４）
7. 前記細胞懸濁液の１日あたりのブリーディング回数Ｎｂが１回以上であり、且つ前記培養容器中の前記細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃ、Ｎｄの個／ｍＬを単位として表される目標値をＮｄ’、Ｎｂ以下の任意の自然数ｎについてｎ回目のブリーディング前の前記細胞懸濁液中における粒子サイズが８Ｄｐ以上３０Ｄｐ以下である生細胞以外の微粒子の個／ｍＬを単位として表される個数密度をＮｄｎとしたときに、Ｌを単位として表されるｎ回目のブリーディング量Ｖｂｎが以下の式（３）及び式（５）を満たす、請求項５又は請求項６に記載の製造方法。
   Ｖｂｎ＝Ｖｃ×（Ｎｄｎ−Ｎｄ’）／Ｎｄｎ 式（３）
   ２×１０^７個／ｍＬ≦Ｎｄ’≦２×１０^９個／ｍＬ 式（５）
8. 前記生産物を生産する細胞を培養する工程は、前記培養容器中の前記細胞懸濁液を撹拌翼により撹拌することを含み、
   前記撹拌翼の動力係数をＮｐ、前記撹拌翼のｍを単位として表される翼径をＤｉ、前記撹拌翼のｓ^−１を単位として表される回転数をＲｏ、前記細胞懸濁液のｋｇ／ｍ^３を単位として表される密度をρ、前記培養容器中の前記細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃとしたときに、以下の式（６）にて定義される前記撹拌翼のＷ／ｍ^３を単位として表される撹拌動力Ｐｖが１０Ｗ／ｍ^３以上１５０Ｗ／ｍ^３以下の範囲内において撹拌を行い、且つ前記培養容器の底面を基準として前記細胞懸濁液のｍを単位として表される液面高さをＨｃとしたときのブリーディング抜き出し位置のｍを単位として表される高さＨｂが１／２×Ｈｃ以下である、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の製造方法。
   Ｐｖ＝Ｎｐ×ρ×Ｒｏ^３×Ｄｉ^５／（Ｖｃ×１０^−３） 式（６）
9. 前記生産物を生産する細胞を培養する工程は、前記細胞懸濁液にスパージャーによりガス通気することを含み、
   前記細胞懸濁液のＮ／ｍを単位として表される界面張力をσ、前記スパージャーのμｍを単位として表される孔直径をＤｓ、前記スパージャーから発生する単一ガスのｍＬを単位として表される体積をＶｇ、前記スパージャーのｍＬ／分を単位として表されるガス通気流量をＱ、前記培養容器中の前記細胞懸濁液のＬを単位として表される体積をＶｃ、前記細胞懸濁液のｋｇ／ｍ^３を単位として表される密度をρ、ｍ／ｓ^２を単位として表される重力加速度をｇとしたときに、以下の式（７）及び式（８）によりに定義されｓ^−１・Ｌ^−１を単位とする単位容量及び単位時間当たりの通気ガス個数Ｎｇが以下の式（９）を満たす、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の製造方法。
   Ｎｇ＝Ｑ／（Ｖｇ×Ｖｃ×６０） 式（７）
   Ｖｇ＝π×Ｄｓ×σ／（ρ×ｇ） 式（８）
   １００ｓ^−１・Ｌ^−１≦Ｎｇ≦５０００ｓ^−１・Ｌ^−１ 式（９）
10. 前記細胞懸濁液の界面張力σ及び前記スパージャーの孔直径Ｄｓがそれぞれ以下の式（１０）及び式（１１）を満たす、請求項９に記載の製造方法。
    １０ｍＮ／ｍ≦σ≦１００ｍＮ／ｍ 式（１０）
    ０．１μｍ≦Ｄｓ≦２００μｍ 式（１１）
11. 前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の製造方法。
12. 前記分離膜の孔径Ｄｐが０．１μｍ以上１μｍ以下であり、
    前記生細胞濃度が最大または設定生細胞濃度に達した後の培養期間中常に、Ｎｄが以下の式（１２）を満たす、請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の製造方法。
    ２×１０^７≦Ｎｄ≦２×１０^９ 式（１２）
13. 前記細胞懸濁液に含まれる前記生産物の濃度に対する、前記透過液に含まれる前記生産物の濃度の比として算出される、分離膜を通しての前記生産物の透過率が５５％以上である、請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の製造方法。

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