JP6530171B2 - 培養産生物の回収方法 - Google Patents
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Description
本発明は、培養産生物を産生する細胞の培養において、培養液に含まれる培養産生物を回収する方法に関する。
細胞培養技術は、成長ホルモン、エリスロポエチンなど各種のバイオ医薬品の製造には欠かせない技術であり、近年の医療の進歩に大きく貢献している。
これら有用物質の産生を目的とした、工業的な細胞の培養法は、大きく分けて、付着培養法と、懸濁培養法（浮遊培養法）の２つの方式に分類されるが、スケールアップの容易さ、大スケールでの制御の容易さなどから、懸濁培養法が主流となっている。
これら有用物質の産生を目的とした、工業的な細胞の培養法は、大きく分けて、付着培養法と、懸濁培養法（浮遊培養法）の２つの方式に分類されるが、スケールアップの容易さ、大スケールでの制御の容易さなどから、懸濁培養法が主流となっている。
懸濁培養によって細胞を培養する方法においては、例えば、スピナーフラスコなどの培養槽中に調整された撹拌機能を設け、撹拌機能として、マグネティックスターラー又は機械的に駆動されるシャフト上の羽根車などを用いた培養法が提案されている。しかし、この培養法においては、一定量の栄養分の中で培養されるため細胞の生長増殖は比較的低い密度で停止する。このような細胞の懸濁培養法において、懸濁液中の細胞と、古い培養液及び産生された培養産生物とを長期にわたって効率よく分離し、古い培養液及び培養産生物を培養槽外へ取り出すことで、培養槽内の細胞の生育環境を長期間最適条件下に維持し続ける方法が検討されている。
上述の分離に中空糸膜を使用し、長期にわたり分離を行う、すなわち使用による膜の汚染を防ぐ手段として、例えば、特許文献１には、培養液の流動方法を新鮮培地の供給時と培養液の排出時とで逆転させる方法が記載されている。また、近年ではＡＴＦ（alternating tangential flow）と呼称される交互流濾過という方法を用いることで膜の汚染を押さえつつ長時間、高密度の細胞培養を行うことが可能となり、生産性を高める有用な方法となりつつある。
生産性の向上は代替品のないバイオ医薬品製剤のコストダウン、製剤使用の拡大、医療費の削減につながり、医療の進歩に与える影響は計り知れない。
上述の分離に中空糸膜を使用し、長期にわたり分離を行う、すなわち使用による膜の汚染を防ぐ手段として、例えば、特許文献１には、培養液の流動方法を新鮮培地の供給時と培養液の排出時とで逆転させる方法が記載されている。また、近年ではＡＴＦ（alternating tangential flow）と呼称される交互流濾過という方法を用いることで膜の汚染を押さえつつ長時間、高密度の細胞培養を行うことが可能となり、生産性を高める有用な方法となりつつある。
生産性の向上は代替品のないバイオ医薬品製剤のコストダウン、製剤使用の拡大、医療費の削減につながり、医療の進歩に与える影響は計り知れない。
培養と組み合わせて濾過を行うシステム全体について、種々の工夫、改良が示されている。例えば、特許文献２〜４には交互流濾過を実現するためのシステムが開示されている。また、特許文献５には濾過を行う濾過膜についてその素材、構造、孔径及び濾過圧に関する知見が示されているものの、この用途に適した濾過膜に関してはまだ改良の余地がある。
上記のこれまでの交互流濾過システムに用いられている濾過膜は、使用を続けるにつれ、目的物（細胞が産生した有用物質）の膜透過性が低下することが明らかになった。結果として、産生物の回収率が低下するばかりでなく、凝集体などの産生物に由来する不純物の増加を引き起こすことがある。産生物の回収率の低下は製造コストの高騰、医療費の高騰につながり、凝集体などの不純物の増加は、例えば、中和抗体の生成を引き起こすなど、製剤として用いたときに患者が引き起こす副作用の原因となりうる。いずれも医療上の由々しき問題である。
このような背景のもと、本発明は、培養産生物を産生する細胞の培養において、より生産性の高い培養方法及び培養産生物の回収方法を提供することを課題とする。本発明は、また、交互流濾過に適した濾過膜を使用した濾過方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、培養産生物を産生する細胞の培養液の交互流濾過においては、培養液側の膜表面に緻密層を有しない濾過膜及び培養液側表面の平均孔径が特定の範囲の濾過膜を交互流濾過に用いると、より生産性の高い培養を行うことができることを見いだした。このような濾過膜を、培養産生物を産生する細胞の培養における交互流濾過において使用することで、産生物の透過性を長期間維持し、産生物由来の不純物生成を低減することが可能である。この結果、培養産生物を産生する細胞について、より生産性の高い培養を行うことが可能となる。
すなわち、本発明は、以下の方法に関する。
［１］
培養産生物を産生する細胞の培養において、培養液に含まれる培養産生物を回収する方法であって、
Ｂ．前記培養液を濾過膜に送液する工程、
Ｃ．前記培養液の流れを、前記濾過膜表面に平行な方向に往復運動させるように変化させつつ濾過して透過液を得る交互流濾過工程、
Ｄ．前記濾過膜を透過せずに残った残培養液を返液する工程、及び
Ｇ．前記透過液から培養産生物を回収する工程、
を含み、
前記Ｂ工程に用いる濾過膜として、培養液側表面の平均孔径が２０μｍ以上１００μｍ以下の多孔膜を用いる、培養産生物の回収方法。
［２］
培養産生物を産生する細胞の培養において、培養液に含まれる培養産生物を回収する方法であって、
Ｂ．前記培養液を濾過膜に送液する工程、
Ｃ．前記培養液の流れを、前記濾過膜表面に平行な方向に往復運動させるように変化させつつ濾過して透過液を得る交互流濾過工程、
Ｄ．前記濾過膜を透過せずに残った残培養液を返液する工程、及び
Ｇ．前記透過液から培養産生物を回収する工程、
を含み、
前記Ｂ工程に用いる濾過膜として、培養液側表面の直径２０μｍ未満となる孔の割合が培養液側表面の孔全体の５０％以下である多孔膜を用いる、培養産生物の回収方法。
［３］
前記濾過膜が、培養液側表面の平均孔径が透過液側表面の平均孔径より大きい多孔膜である、［１］又は［２］に記載の培養産生物の回収方法。
［４］
前記濾過膜が中空糸膜である、［１］〜［３］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［５］
前記濾過膜の最小孔径が０．１μｍ以上１μｍ以下である、［１］〜［４］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［６］
前記濾過膜が、疎水性高分子と、ポリビニルピロリドンのブレンド物から構成される多孔質中空糸膜である、［１］〜［５］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［７］
前記濾過膜が、管壁を膜厚方向に３等分して３つの領域に分割したときに、前記濾過膜の透過液側表面である外側面を含む外周領域のポリビニルピロリドンの含有割合が、前記濾過膜の培養液側表面である内側面を含む内周領域のポリビニルピロリドンの含有割合より大きい中空糸膜である、［６］に記載の培養産生物の回収方法。
［８］
前記疎水性高分子が、ポリスルホンである、［６］又は［７］に記載の培養産生物の回収方法。
［９］
前記Ｂ工程の前に、
Ａ．培養液中で、培養産生物を産生する細胞を培養して培養産生物を産生する工程、
を含む、［１］〜［８］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１０］
前記Ｂ〜Ｄ工程の何れかと同時又は前記Ｂ〜Ｄ工程の何れかの前もしくは後に、
Ｅ．新しい培養液を連続的及び／又は間欠的に供給する工程
を含む、［１］〜［９］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１１］
前記Ｄ工程の後に、
Ｆ．前記残培養液を排出する工程
を含む、［１］〜［１０］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１２］
前記Ａ工程が、培養槽に貯留された培養液中で行われる、［１］〜［１１］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１３］
前記Ｃ工程が、筒状容器内に収納された濾過膜において行われる、［１］〜［１２］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１４］
培養１０日後の培養産生物の濾過膜透過率が、培養３日後の培養産生物の濾過膜透過率の７０％以上である、［１］〜［１３］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１５］
培養１０日後の培養液中の凝集体比率が、培養２日後の培養液中の凝集体比率の１５０％未満である、［１］〜［１４］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１６］
培養１０日後の透過液中の凝集体比率が、培養２日後の透過液中の凝集体比率の１５０％未満である、［１］〜［１５］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１７］
前記培養産生物が、生理活性物質である、［１］〜［１６］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１８］
前記培養産生物が、タンパク質、ウイルス、エクソソーム及び核酸からなる群から選択される、［１］〜［１７］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１９］
前記培養産生物が、免疫グロブリンである、［１］〜［１８］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［２０］
前記培養が、連続培養である、［１］〜［１９］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１］
培養産生物を産生する細胞の培養において、培養液に含まれる培養産生物を回収する方法であって、
Ｂ．前記培養液を濾過膜に送液する工程、
Ｃ．前記培養液の流れを、前記濾過膜表面に平行な方向に往復運動させるように変化させつつ濾過して透過液を得る交互流濾過工程、
Ｄ．前記濾過膜を透過せずに残った残培養液を返液する工程、及び
Ｇ．前記透過液から培養産生物を回収する工程、
を含み、
前記Ｂ工程に用いる濾過膜として、培養液側表面の平均孔径が２０μｍ以上１００μｍ以下の多孔膜を用いる、培養産生物の回収方法。
［２］
培養産生物を産生する細胞の培養において、培養液に含まれる培養産生物を回収する方法であって、
Ｂ．前記培養液を濾過膜に送液する工程、
Ｃ．前記培養液の流れを、前記濾過膜表面に平行な方向に往復運動させるように変化させつつ濾過して透過液を得る交互流濾過工程、
Ｄ．前記濾過膜を透過せずに残った残培養液を返液する工程、及び
Ｇ．前記透過液から培養産生物を回収する工程、
を含み、
前記Ｂ工程に用いる濾過膜として、培養液側表面の直径２０μｍ未満となる孔の割合が培養液側表面の孔全体の５０％以下である多孔膜を用いる、培養産生物の回収方法。
［３］
前記濾過膜が、培養液側表面の平均孔径が透過液側表面の平均孔径より大きい多孔膜である、［１］又は［２］に記載の培養産生物の回収方法。
［４］
前記濾過膜が中空糸膜である、［１］〜［３］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［５］
前記濾過膜の最小孔径が０．１μｍ以上１μｍ以下である、［１］〜［４］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［６］
前記濾過膜が、疎水性高分子と、ポリビニルピロリドンのブレンド物から構成される多孔質中空糸膜である、［１］〜［５］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［７］
前記濾過膜が、管壁を膜厚方向に３等分して３つの領域に分割したときに、前記濾過膜の透過液側表面である外側面を含む外周領域のポリビニルピロリドンの含有割合が、前記濾過膜の培養液側表面である内側面を含む内周領域のポリビニルピロリドンの含有割合より大きい中空糸膜である、［６］に記載の培養産生物の回収方法。
［８］
前記疎水性高分子が、ポリスルホンである、［６］又は［７］に記載の培養産生物の回収方法。
［９］
前記Ｂ工程の前に、
Ａ．培養液中で、培養産生物を産生する細胞を培養して培養産生物を産生する工程、
を含む、［１］〜［８］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１０］
前記Ｂ〜Ｄ工程の何れかと同時又は前記Ｂ〜Ｄ工程の何れかの前もしくは後に、
Ｅ．新しい培養液を連続的及び／又は間欠的に供給する工程
を含む、［１］〜［９］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１１］
前記Ｄ工程の後に、
Ｆ．前記残培養液を排出する工程
を含む、［１］〜［１０］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１２］
前記Ａ工程が、培養槽に貯留された培養液中で行われる、［１］〜［１１］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１３］
前記Ｃ工程が、筒状容器内に収納された濾過膜において行われる、［１］〜［１２］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１４］
培養１０日後の培養産生物の濾過膜透過率が、培養３日後の培養産生物の濾過膜透過率の７０％以上である、［１］〜［１３］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１５］
培養１０日後の培養液中の凝集体比率が、培養２日後の培養液中の凝集体比率の１５０％未満である、［１］〜［１４］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１６］
培養１０日後の透過液中の凝集体比率が、培養２日後の透過液中の凝集体比率の１５０％未満である、［１］〜［１５］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１７］
前記培養産生物が、生理活性物質である、［１］〜［１６］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１８］
前記培養産生物が、タンパク質、ウイルス、エクソソーム及び核酸からなる群から選択される、［１］〜［１７］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［１９］
前記培養産生物が、免疫グロブリンである、［１］〜［１８］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
［２０］
前記培養が、連続培養である、［１］〜［１９］の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
本発明によれば、培養産生物を産生する細胞の培養において、より生産性の高い培養及び培養産生物の回収を行うことができる。
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
本実施形態は、培養産生物を産生する細胞の培養において、培養液に含まれる培養産生物を回収する方法である。
本実施形態において、細胞が産生する培養産生物は、細胞培養によって細胞が産生するものであれば特に限定されないが、例として、生理活性物質が挙げられ、より具体的には、タンパク質、ウイルス、エクソソーム、核酸（miRNAなど）などが挙げられる。特に、医薬品として利用される有用物であることが好ましく、具体例としては、ホルモン、サイトカイン、成長因子、酵素、血漿タンパク、エクソソーム、ウイルス様粒子、免疫グロブリン（抗体）などが挙げられる。これら有用物は、有用物を産生する細胞を培養することにより得ることができ、好適には、有用物を産生する細胞により生合成され、培養液中に放出される。
本実施形態において、培養産生物を産生する細胞とは、所望の培養産生物を、細胞内のタンパク質合成反応を利用して生産する細胞をいい、具体的には、大腸菌、ＣＨＯ細胞等などが挙げられる。例えばＡＴＣＣに供託された以下の細胞株などを用いることができる（ＣＲＬ１２４４４株、ＣＲＬ１２４４５株、ＣＲＬ１０７６２株）。そのような培養産生物産生能を有するよう改変した細胞であってもよい。上記細胞を培養して培養産生物を産生する条件及び培地組成などは培養産生物を産生することができる方法であれば特に限定されない。
本実施形態において、培養は、細胞が培養産生物を産生する方法であれば限定されないが、スケールアップの容易さ、大スケールでの制御の容易さなどの観点から、懸濁培養が好ましい。また、培養は、どのような方式で行われるものであってもよく、例えば、連続培養、フェドバッチ（流加）培養、バッチ（回分）培養等の方式が挙げられる。ここで、攪拌機能を追加するため、スピナーフラスコなどを設けてもよい。また、撹拌機能として、マグネティックスターラー又はシャフト上の羽根車などを用いてもよい。
本実施形態において、培養は、より培養産生物の生産性を高める観点から、連続培養であることが好ましい。連続培養とは、培養産生物を効率よく産生するために、新しい培養液を供給しつつ古い培養液を排出しながら細胞を培養する方法である。特に、効率よく産生するためには、培養産生物産生細胞の培養において、新しい培養液を培養槽内に供給しつつ、古い培養液を、培養槽外に排出し、培養槽内の培養産生物産生細胞の成育環境を最適条件下に維持しながら、長期で高密度培養を行うことが好ましい（例えば、特開昭６１−２５７１８１号参照）。
ここで、培養産生物を産生する細胞の培養時の最適条件として、例えば、培養槽内の培養液のグルコース濃度を適切に制御することが挙げられる。例えば、培養槽内から一定量の培養液を取り出して、グルコース濃度を測定し、新しい培養液の供給量や、古い培養液の排出量を調整して、培養槽内の培養液のグルコース濃度を制御することができる。また、培養時の最適条件として、培養液中の乳酸などの代謝産物量を適切に制御することが挙げられる。この場合も同様に、培養槽内から一定量の培養液を取り出して、乳酸などの代謝産物量を測定し、上記のように制御することができる。
本実施形態における培養産生物の回収方法は、例えば、以下の工程を含む。
Ａ．培養液中で、培養産生物を産生する細胞を培養して培養産生物を産生する工程、
Ｂ．前記培養液を濾過膜に送液する工程、
Ｃ．前記培養液の流れを、前記濾過膜表面に平行な方向に往復運動させるように変化させつつ濾過して透過液を得る交互流濾過工程、
Ｄ．前記濾過膜を透過せずに残った残培養液を返液する工程、及び
Ｇ．前記透過液から培養産生物を回収する工程。
なお、本実施形態の培養産生物の回収方法において、上記の各工程は、必ずしも順番通りに行われる必要はなく、適宜培養槽内の培養産生物の産生細胞の成育環境を最適条件下に維持しながら、長期で高密度の培養を行えるように各工程を行うことができる。例えば、Ａ工程を継続的に行いつつ、Ｂ〜Ｄ及びＧ工程を進めることができる。
Ａ．培養液中で、培養産生物を産生する細胞を培養して培養産生物を産生する工程、
Ｂ．前記培養液を濾過膜に送液する工程、
Ｃ．前記培養液の流れを、前記濾過膜表面に平行な方向に往復運動させるように変化させつつ濾過して透過液を得る交互流濾過工程、
Ｄ．前記濾過膜を透過せずに残った残培養液を返液する工程、及び
Ｇ．前記透過液から培養産生物を回収する工程。
なお、本実施形態の培養産生物の回収方法において、上記の各工程は、必ずしも順番通りに行われる必要はなく、適宜培養槽内の培養産生物の産生細胞の成育環境を最適条件下に維持しながら、長期で高密度の培養を行えるように各工程を行うことができる。例えば、Ａ工程を継続的に行いつつ、Ｂ〜Ｄ及びＧ工程を進めることができる。
また、本実施形態の培養産生物の回収方法は、上記の工程以外の工程が含まれていてもよい。例えば、Ｂ〜Ｄ工程の何れかと同時又はＢ〜Ｄ工程の何れかの前もしくは後に、
Ｅ．新しい培養液を連続的及び／又は間欠的に供給する工程、
が含まれていてもよい。さらに、Ｄ工程の後に、
Ｆ．濾過されずに残った残培養液を排出する工程
が含まれていてもよい。
Ｅ．新しい培養液を連続的及び／又は間欠的に供給する工程、
が含まれていてもよい。さらに、Ｄ工程の後に、
Ｆ．濾過されずに残った残培養液を排出する工程
が含まれていてもよい。
本実施形態の培養産生物の回収方法は、濾過膜を備える濾過装置と、培養槽とを用いて実施することができ、培養槽には、濾過膜へ培養液を送液する流出口及び濾過膜を透過せずに残った残培養液を返液する流入口を設けることができる。これらの流出口及び流入口は、同じであっても異なっていてもよい。さらに、培養槽には、培養槽内の培養液をサンプリングする流出口、新鮮培地を供給する流入口、残培養液を系外に排出する排出口を設けることができる。また、テストに用いるための装置等として、濾過膜を通過した透過液を培養槽に戻す流入口を設けてもよい。
また、上記の濾過装置には、培養槽からの培養液を濾過膜に送液する流入口及び濾過膜を通過せずに残った残培養液を培養槽に返液する流出口を設けることができる。これらの流出口及び流入口は、同じであっても異なっていてもよい。濾過膜を透過せずに残った残培養液は、培養液中で、培養産生物を産生する細胞を培養して培養産生物を産生する工程（Ａ工程）又は培養液を濾過膜に送液する工程（Ｂ工程）に導入する培養液（培養槽）に
返液してもよい。さらに、濾過装置には、濾過膜内を交互流濾過により透過した、培養液と産生された培養産生物とを含む透過液の流出口及び濾過膜を濾過せずに残った残培養液を系外に排出する流出口を設けることができる。
培養槽と、濾過装置とは、必要に応じて送液手段により適宜接続される。例えば、細胞を連続培養する場合、培養槽から濾過膜へ培養液を送液する流出口と、この流出口とは異なる、濾過膜を透過せずに残った残培養液を培養槽へ返液する流入口とにより、培養槽と濾過装置とを接続することができる。連続培養を行うために、モニタリングするための圧力計、重量計、各種ポンプ（ダイヤフラムポンプ等）なども適宜設けられる。また、濾過装置は、交互流濾過に適していることから、筒状容器であることが好ましい。
また、上記の濾過装置には、培養槽からの培養液を濾過膜に送液する流入口及び濾過膜を通過せずに残った残培養液を培養槽に返液する流出口を設けることができる。これらの流出口及び流入口は、同じであっても異なっていてもよい。濾過膜を透過せずに残った残培養液は、培養液中で、培養産生物を産生する細胞を培養して培養産生物を産生する工程（Ａ工程）又は培養液を濾過膜に送液する工程（Ｂ工程）に導入する培養液（培養槽）に
返液してもよい。さらに、濾過装置には、濾過膜内を交互流濾過により透過した、培養液と産生された培養産生物とを含む透過液の流出口及び濾過膜を濾過せずに残った残培養液を系外に排出する流出口を設けることができる。
培養槽と、濾過装置とは、必要に応じて送液手段により適宜接続される。例えば、細胞を連続培養する場合、培養槽から濾過膜へ培養液を送液する流出口と、この流出口とは異なる、濾過膜を透過せずに残った残培養液を培養槽へ返液する流入口とにより、培養槽と濾過装置とを接続することができる。連続培養を行うために、モニタリングするための圧力計、重量計、各種ポンプ（ダイヤフラムポンプ等）なども適宜設けられる。また、濾過装置は、交互流濾過に適していることから、筒状容器であることが好ましい。
濾過後の透過液からの培養産生物の回収は、各タンパク質の種類に応じて当業者に公知の方法を用いて行うことができる。例えば、透過液に含まれる培養産生物を、そのまま溶液として回収してもよいし、遠心、濃縮、精製等を適宜行って回収してもよい。
本実施形態においては、培養産生物を産生する細胞の培養において、培養産生物の生産性の高い培養を行うために、培養液の流れを、濾過膜表面に平行な方向に往復運動させるように変化させつつ濾過する交互流濾過により、培養液の濾過を行う。交互流濾過は、交互流濾過を行う装置、例えばＲｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のＡＴＦ−２と、濾過膜を有する濾過モジュールとを組み合わせて行うことができる。
本実施形態の方法は、培養産生物を産生する細胞の培養において、すなわち、培養産生等の産生細胞の培養を継続しながら濾過をする際に好適に用いられる方法であるが、培養を、例えば、予め培養槽に貯留された培養液中で一定期間行い、所望の量のタンパク質が産生された後に行ってもよい。その際、濾過を行う間、培養を継続して行っていてもよい。
その場合、本実施形態の培養産生物の回収方法は、上記Ｂ〜Ｄ工程を含む。
また、このとき、上記Ｅ工程を含めることができ、Ｅ工程において供給する新鮮な培養液の量を減量することにより、濾過を終了させることができる。
その場合、本実施形態の培養産生物の回収方法は、上記Ｂ〜Ｄ工程を含む。
また、このとき、上記Ｅ工程を含めることができ、Ｅ工程において供給する新鮮な培養液の量を減量することにより、濾過を終了させることができる。
本実施形態においては、培養産生物の生産性を高めるという観点から、濾過膜として、培養液側表面に緻密層を実質的に有しない多孔膜を用いることが好ましい。具体的には、後述の実施例に記載の内側面孔径の測定方法にならい、重複せず、特定の場所に偏らない膜表面上の領域１０カ所程度について１００個以上の孔を顕微鏡で観察し、得られた顕微鏡写真における細孔を円形近似処理し、その面積から１００個以上の孔の直径を求める。このとき、直径が２０μｍ未満となる孔の割合から緻密層の有無を確認することができる。緻密層を有しない多孔膜を用いるという観点から、培養液側表面の直径が２０μｍ未満となる孔の割合が培養液側表面の孔全体の５０％以下であることが好ましく、４０％以下であることがより好ましく、３０％以下であることがさらに好ましく、２０％以下であることがさらにより好ましく、１０％以下であることが特に好ましい。
本実施形態においては、培養産生物の生産性を高めるという観点から、濾過膜として、培養液側表面の平均孔径が２０μｍ以上１００μｍ以下の多孔膜を用いることが好ましい。濾過膜の平均孔径は、例えば、後述の実施例に記載の方法を用いて確認することができる。交互流濾過工程中に濾過膜の培養液側表面の膜孔に対して疎水性物質等の保持と除去が常に繰り返される。このことにより、ある特定物質の蓄積による高濃度層の生成が防がれ、この高濃度層による浸透性の低下に起因するその特定物質、すなわち、ここでは目的タンパク質の透過率の低下を防ぐことができる。例えば、濾過膜の培養液側表面の平均孔径が２０μｍ以上であることにより、膜面への特定物質の堆積による膜孔の閉塞を防止することができ、１００μｍ以下であることにより、濾過膜の強度を適正な範囲とすることができる。培養液側表面の平均孔径が２０μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましく、３０μｍ以上６０μｍ以下であることがより好ましい。
また、多孔膜の形状は、中空糸膜であることが好ましい。多孔質中空糸膜によれば、低圧での濾過が可能であり、培養産生物産生細胞へのダメージが少ないため、連続培養等における濾過工程に好適である。特に、濾過の経過によって膜が閉塞する過程で、タンパク質の透過率が低下しにくく、長期間タンパク質透過率を維持できる多孔質中空糸膜を用いることで、高い生産性を実現できる。
本実施形態においては、濾過膜は、疎水性高分子と、親水性高分子のブレンド物から構成されているものであることが好ましい。特に、親水性高分子が、ポリビニルピロリドンであることが好ましい。濾過膜は、疎水性高分子と、親水性高分子のポリビニルピロリドンのブレンド物から管壁が構成されている多孔質中空糸膜であることが好ましい。多孔質中空糸膜に、疎水性高分子を使用することで、適度な機械的強度を持たせることができ、連続培養等のような長期使用にも耐える耐久性を持たせることができるため好適である。また、親水性高分子であるポリビニルピロリドンを適正量含有させたブレンド物から管壁が構成されていることにより、破砕した細胞、抗体等の疎水性物質粒子の吸着による膜汚染や、各種医薬品の精製工程において培養産生物の回収率の低下を防止することができる。
濾過膜のポリビニルピロリドン含有量は、多孔質中空糸膜の総質量を基準としたとき、０．２質量％以上３質量％以下であることが好ましい。０．２質量％以上であることにより、疎水性物質等の吸着による汚染による膜孔内の閉塞を防止することができ、３質量％以下であることにより、機械的強度を保つことができ、親水性高分子の膨潤による膜孔の閉塞を防止し濾過抵抗が大きくなるのを防ぐことができる。
濾過膜は、管壁を膜厚方向に３等分して３つの領域に分割したときに、透過液側表面である外側面を含む外周領域のポリビニルピロリドンの含有割合が、培養液側表面である内側面を含む内周領域のポリビニルピロリドンの含有割合より大きいものを用いることが好ましい。これは、濾過工程中、内周領域においては膜孔より小さい疎水性物質等の粒子を保持することでデプス濾過の効果を発揮することができ、一方外周領域においては疎水性物質の粒子の吸着による膜孔への閉塞を防止することができるためである。
本実施形態において、培養産生物の生産性を高めるという観点から、濾過膜は、培養液側表面の平均孔径が透過液側側面の平均孔径より大きい多孔質中空糸膜であることが好ましい。これは、培養液側表面の孔では疎水性物質等を膜孔内部に保持してデプス濾過の効果を果たし、透過液側表面では濾過時の疎水性物質等の分画効果を果たすためである。
濾過膜に含まれるポリビニルピロリドンは、多孔質中空糸膜の製造に好適な溶液粘度とすることができる観点で、重量平均分子量が４０００００以上８０００００以下のものであることが好ましい。
濾過膜は、孔径２０μｍ以上の孔を、少なくとも５０％以上有するものであることが好ましく、６０％以上有するものであることがより好ましく、７０％以上有するものであることがさらに好ましく、８０％以上有するものであることが特に好ましい。連続培養等に使用する濾過膜は長期間での使用と高い透過処理量が必要とされる。孔径５０μｍ以上の孔が５０％以上であることにより、膜内部の除去物を保持可能であり、デプス濾過の効果を十分に得ることができる。
濾過膜は、最小孔径が０．１μｍ以上１μｍ未満である多孔膜であることが好ましく、中空糸膜であることが好ましい。また、透過液側表面側に、孔径０．１μｍ以上１μｍ未満の層を有することが好ましく、透過液側表面の孔径が０．１μｍ以上１μｍ未満であることが好ましい。上記孔径が０．１μｍ以上であることにより、濾過抵抗や濾過に要する圧力の上昇による細胞に対するダメージを防止することができる。孔径が１μｍ以下であることにより、十分な分画性を得ることができる。最小孔径が０．２μｍ以上０．８μｍ未満であることがより好ましく、０．３μｍ以上０．６μｍ未満であることが更に好ましい。
濾過膜は、管壁の膜厚が３００μｍ以上１０００μｍ以下の多孔質中空糸膜であることが好ましく、３５０μｍ以上８００μｍ以下であることがより好ましい。膜厚は、例えば、後述の実施例に記載の方法により測定することができる。膜厚が３００μｍ以上であることにより、膜内部の除去物を保持可能であり、デプス濾過の効果を十分に得ることができる。また、適当な濾過速度を維持することができる。膜厚が１０００μｍ以下であることにより、モジュールあたりの有効な断面積を維持し、濾過性能を優れたものとすることができる。
濾過膜は、下記の式（Ｉ）を満たすものであることが好ましい。
Ｃout／Ｃin≧２ （Ｉ）
［式（Ｉ）中、Ｃoutはポリビニルピロリドンの前記外周領域における含有割合を示し、Ｃinはポリビニルピロリドンの前記内周領域における含有割合を示す。］
親水性高分子がこのような分布を示す多孔質中空糸膜は、内周領域における、デプス濾過の効果と、外周領域における、除去物の吸着による膜孔の閉塞防止効果とに一層優れる。
Ｃout／Ｃin≧２ （Ｉ）
［式（Ｉ）中、Ｃoutはポリビニルピロリドンの前記外周領域における含有割合を示し、Ｃinはポリビニルピロリドンの前記内周領域における含有割合を示す。］
親水性高分子がこのような分布を示す多孔質中空糸膜は、内周領域における、デプス濾過の効果と、外周領域における、除去物の吸着による膜孔の閉塞防止効果とに一層優れる。
濾過膜は、内径が１０００μｍ以上２０００μｍ以下の多孔質中空糸膜であることが好ましい。連続培養等においては培養液が高密度の細胞懸濁液となるが、内径が１０００μｍ以上であることにより、中空糸の入り口が凝集した懸濁物質によって閉塞することを防止することができ、また、内径が２０００μｍ以下であることにより、モジュールあたりの有効な断面積を維持し、濾過性能を優れたものとすることができる。
本実施形態において、濾過膜が疎水性高分子を含む場合、疎水性高分子は、ポリスルホンを含むものが好ましい。この疎水性高分子であれば、多孔質中空糸膜が温度変化や圧力変化に対する強度に一層優れ、高い濾過性能を発現することができる。
本実施の形態において、上記Ｂ〜Ｄ工程を最適な条件で行うことによって、高い効率で培養産生物を回収することでき、また、培養液中の凝集体比率の増加を長期間低く維持することができる。
例えば、培養槽内の培養液の細胞密度が１０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上２０００×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下の培養液を濾過膜に送液して、Ｂ工程を実施することが好ましい。１０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であると、細胞密度が低く目的とする培養産生物の産生量が少量である場合があり、一方、細胞密度が２０００×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であると、細胞密度が高く培養液中の栄養成分が不足するため、速やかに培地交換を実施する必要があり得る。
また、Ｂ工程における培養液の送液と、Ｄ工程における残培養液の返液との時間的な間隔は、３秒以上２６秒以下に設定することが好ましい。この送液と返液とは、典型的にはポンプ（ダイヤフラムポンプ等）を用いて行われるが、３秒以下であると、装置の作動下限値等の制限により、ポンプによる送液の安定供給ができない場合があり、２６秒以上であると、培養液中の細胞が中空糸膜内に滞留する時間が長くなるため、細胞へのダメージが引き起こされる場合がある。
また、Ｂ工程における培養液の送液と、Ｄ工程における残培養液の返液の際の流量は、２Ｌ／分、ｍ2以上４０Ｌ／分、ｍ2以下に設定することが好ましい。２Ｌ／分、ｍ2以下であると、培養液中の細胞が中空糸膜内に滞留する時間が長くなるため細胞へのダメージが引き起こされる場合があり、４０Ｌ／分、ｍ2以上のときは、ポンプによる送液の安定供給ができない場合がある。
また、連続培養によって培養を行う場合、培養液を循環させる際の流速は、２Ｌ／分、ｍ2以上４０Ｌ／分、ｍ2以下に設定することが好ましい。２Ｌ／分、ｍ2以下であると、培養液中の細胞が中空糸膜内に滞留する時間が長くなるため、細胞へのダメージが引き起こされる場合があり、４０Ｌ／分、ｍ2以上のときは、ポンプによる送液の安定供給ができない場合がある。
また、Ｅ工程における培養液の供給は、連続培養によって培養を行う場合、１０Ｌ／日、ｍ2以上２００Ｌ／日、ｍ2以下で培養液を供給することが好ましい。１０Ｌ／日、ｍ2以下では細胞に十分な栄養が供給されない場合があり、２００Ｌ／日、ｍ2以上のときは、培養産物濃度が十分に高まらない場合がある。
連続培養等を行う場合の、培養槽に保持されている培養液量と、濾過膜の面積比である、培養液量／濾過膜面積比は５Ｌ／ｍ2〜２００Ｌ／ｍ2であることが望ましい。５Ｌ／ｍ2以下では膜面積に対して液量が少なく、循環などに支障をきたす場合があり、２００Ｌ／ｍ2以上では膜面積に対して液量が多く、閉塞が起こりやすくなる場合がある。
本実施形態の一態様においては、培養を継続しても、培養産生物の濾過膜透過率が低下しにくく、より生産性の高い培養（好ましくは連続培養）を行うことができる。例えば、培養１０日後の培養産生物の濾過膜透過率が、培養３日後の培養産生物の濾過膜透過率の７０％以上であり得る。また、例えば、培養産生物が免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である場合、培養１０日後の濾過膜のＩｇＧ透過率は、培養３日後の濾過膜のＩｇＧ透過率の７０％以上であり得る。７５％以上が好ましく、８０％がより好ましく、８５％以上がさらに好ましく、９０％以上、９５％以上及び９８％以上が特に好ましい。
培養産生物の濾過膜透過率は、例えば後述の実施例に記載の方法を用いて測定することができる。好ましい態様において、培養液の細胞密度が１０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上２０００×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、培養液の送液する際の流量が２Ｌ／分、ｍ2以上４０Ｌ／分、ｍ2以下である場合、例えば、細胞の種類、細胞数、培養液組成、連続培養時の流速等の条件の１以上について、後述の実施例１に記載の条件で連続培養を行った場合に、培養１０日後の濾過膜のＩｇＧ透過率が、培養３日後の濾過膜のＩｇＧ透過率の７０％以上となる。
培養産生物の濾過膜透過率は、例えば後述の実施例に記載の方法を用いて測定することができる。好ましい態様において、培養液の細胞密度が１０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上２０００×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、培養液の送液する際の流量が２Ｌ／分、ｍ2以上４０Ｌ／分、ｍ2以下である場合、例えば、細胞の種類、細胞数、培養液組成、連続培養時の流速等の条件の１以上について、後述の実施例１に記載の条件で連続培養を行った場合に、培養１０日後の濾過膜のＩｇＧ透過率が、培養３日後の濾過膜のＩｇＧ透過率の７０％以上となる。
本実施形態の一態様においては、培養を継続しても培養液中及び／又は透過液中の培養産生物（例えばＩｇＧ等）の凝集体比率が低く、より生産性の高い培養（好ましくは連続培養）を行うことができる。例えば、培養１０日後の培養液中の凝集体比率が、培養２日後の培養液中の凝集体比率の１５０％未満であり得、培養１０日後の透過液中の凝集体比率が、培養２日後の透過液中の凝集体比率の１５０％未満であり得る。好ましい態様において、培養液の細胞密度が１０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上２０００×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、培養液の送液する際の流量が２Ｌ／分、ｍ2以上４０Ｌ／分、ｍ2以下である場合、例えば、細胞の種類、細胞数、培養液組成、連続培養時の流速等の条件の１以上について、後述の実施例１に記載の条件で連続培養を行った場合に、上記の凝集体比率となる。
本実施形態において、上記のような濾過膜の一例示として、下記の実施例で用いられる濾過膜などがある。また、本実施形態においては、国際公開第２０１０／０３５７９３号公報に記載される濾過膜を用いることもできる。各測定方法も、国際公開２０１０／０３５７９３号公報に準じて測定することができる。
以下、本実施形態を実施例及び比較例に基づいてより具体的に説明するが、本実施形態は以下の実施例のみに限定されるものではない。なお、本実施形態に用いられる測定方法は以下のとおりである。
（１）内側面孔径の測定、並びに、最小孔径層の位置及び緻密層の有無の確認
凍結乾燥した多孔質中空糸膜の内側面を、電子顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＶＥ−９８００）を用いて１視野において１０個以上の孔が観測可能な倍率で観察した。得られた顕微鏡写真における細孔１０個を円形近似処理し、その面積から求めた直径の平均を内側面孔径とした。凍結乾燥した多孔質中空糸膜の断面を内側面側から外側面側へ向かって連続して顕微鏡観察し、断面孔径が最小になる層（最小孔径層）の位置を確認した。
また、多孔質中空糸膜の最内面の構造を顕微鏡観察し、内側面孔径から緻密層の有無を確認した。具体的には、上述の、１視野において細孔１０個の観察を行い、重複せず特定の場所に偏らない膜表面上の領域１０ヶ所程度の視野において１００個以上の孔について行い、直径が２０μｍ未満となる孔の割合が５０％を超える場合に、緻密層が有ると判断した。直径が２０μｍ未満となる孔の割合が５０％以下である場合に、緻密層が無いと判断した。
凍結乾燥した多孔質中空糸膜の内側面を、電子顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＶＥ−９８００）を用いて１視野において１０個以上の孔が観測可能な倍率で観察した。得られた顕微鏡写真における細孔１０個を円形近似処理し、その面積から求めた直径の平均を内側面孔径とした。凍結乾燥した多孔質中空糸膜の断面を内側面側から外側面側へ向かって連続して顕微鏡観察し、断面孔径が最小になる層（最小孔径層）の位置を確認した。
また、多孔質中空糸膜の最内面の構造を顕微鏡観察し、内側面孔径から緻密層の有無を確認した。具体的には、上述の、１視野において細孔１０個の観察を行い、重複せず特定の場所に偏らない膜表面上の領域１０ヶ所程度の視野において１００個以上の孔について行い、直径が２０μｍ未満となる孔の割合が５０％を超える場合に、緻密層が有ると判断した。直径が２０μｍ未満となる孔の割合が５０％以下である場合に、緻密層が無いと判断した。
（２）最小孔径層の孔径決定法
ポリスチレンラテックス粒子（ＪＳＲ株式会社製、ＳＩＺＥ ＳＴＡＮＤＡＲＤ ＰＡＲＴＩＣＬＥＳ）を、０．５質量％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業株式会社製）に、粒子濃度が０．０１質量％になるように分散させ、ラテックス粒子分散液を調整した。
多孔質中空糸膜を用いてラテックス粒子分散液の濾過を行い、濾過前後のラテックス粒子の濃度変化を測定した。この測定を、０．１μｍから約０．１μｍ刻みでラテックス粒子径を変えながら行いラテックス粒子の阻止曲線を作成した。この阻止曲線から、９８％透過阻止可能な粒子径を読み取り、その径を最小孔径層の孔径（阻止孔径）とした。
「（１）最小孔径層の位置の確認」により、外周領域に最小孔径層があることが確認できたとき、「（２）最小孔径層の孔径決定法」により決定される最小孔径層の孔径（阻止孔径）は、外周領域の阻止孔径である。
ポリスチレンラテックス粒子（ＪＳＲ株式会社製、ＳＩＺＥ ＳＴＡＮＤＡＲＤ ＰＡＲＴＩＣＬＥＳ）を、０．５質量％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業株式会社製）に、粒子濃度が０．０１質量％になるように分散させ、ラテックス粒子分散液を調整した。
多孔質中空糸膜を用いてラテックス粒子分散液の濾過を行い、濾過前後のラテックス粒子の濃度変化を測定した。この測定を、０．１μｍから約０．１μｍ刻みでラテックス粒子径を変えながら行いラテックス粒子の阻止曲線を作成した。この阻止曲線から、９８％透過阻止可能な粒子径を読み取り、その径を最小孔径層の孔径（阻止孔径）とした。
「（１）最小孔径層の位置の確認」により、外周領域に最小孔径層があることが確認できたとき、「（２）最小孔径層の孔径決定法」により決定される最小孔径層の孔径（阻止孔径）は、外周領域の阻止孔径である。
（３）多孔質中空糸膜の内径、外径及び膜厚の測定
多孔質中空糸膜を円管状に薄くきりそれを光学顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＶＨ６１００）で観察し、多孔質中空糸膜の内径（μｍ）、外径（μｍ）を測定した。得られた内径、外径から下記の式（ＩＩ）を用いて膜厚を算出した。
膜厚（μｍ）＝（外径−内径）／２ （ＩＩ）
多孔質中空糸膜を円管状に薄くきりそれを光学顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＶＨ６１００）で観察し、多孔質中空糸膜の内径（μｍ）、外径（μｍ）を測定した。得られた内径、外径から下記の式（ＩＩ）を用いて膜厚を算出した。
膜厚（μｍ）＝（外径−内径）／２ （ＩＩ）
（４）タンパク質濃度及び透過率の測定
連続培養時の濾過工程後の透過液及び培養槽内の培養液のタンパク質濃度をＥＬＩＳＡ法で定量分析を行った。
多孔質中空糸膜のタンパク質透過率については下記の式（ＩＩＩ）を用いて算出した。
タンパク質透過率Ｘ＝（透過液のタンパク質濃度）／（透過液をサンプリングした際の培養槽内の培養液のタンパク質濃度）×１００ （ＩＩＩ）
連続培養時の濾過工程後の透過液及び培養槽内の培養液のタンパク質濃度をＥＬＩＳＡ法で定量分析を行った。
多孔質中空糸膜のタンパク質透過率については下記の式（ＩＩＩ）を用いて算出した。
タンパク質透過率Ｘ＝（透過液のタンパク質濃度）／（透過液をサンプリングした際の培養槽内の培養液のタンパク質濃度）×１００ （ＩＩＩ）
（５）培養槽内の総細胞密度及び細胞生存率の測定
連続培養中の培養槽の培養液をサンプリングして、細胞数自動計測装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製 ＣＹＴＯＲＥＣＯＮ）を使用して総細胞密度及び細胞生存率を測定した。
連続培養中の培養槽の培養液をサンプリングして、細胞数自動計測装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製 ＣＹＴＯＲＥＣＯＮ）を使用して総細胞密度及び細胞生存率を測定した。
（６）培養液及び濾過液中のＩｇＧ凝集体比率の測定
培養液又は濾過液からのＩｇＧの精製には市販のアフィニティクロマトグラフィ担体カラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いた。抗体の吸着及び溶出条件は、製品に付属の説明書に従った。抗体を担体カラムから溶出する際の溶液の水素イオン指数は、ｐＨ３．０であった。回収された溶出液の水素イオン指数は、１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いる滴定により、ｐＨ５．０とした。
得られた抗体標品の抗体凝集体比率の測定には高速液体サイズ排除クロマトグラフィのシステムを利用した。すなわち、リザーバタンク（移動相、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸、０．２ｍｏｌ／Ｌアルギニン、ｐＨ６．８）、送液ポンプ（送液線速１．６８ｃｍ／ｍｉｎ）、サンプルループ（容量１００μＬ）、カラム（室温）、検出器（紫外線、波長２８０ｎｍ）、ドレンの順に接続した該システムを用いて抗体標品をロードした後、検出器から検出された吸光度から、抗体標品に含有される凝集体の比率を定量した。内径（直径）７．８ｍｍ、ベッド高さ３００ｍｍの東ソーＴＳＫＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを用いた。典型的には、溶出時間１６分迄に２量体以上の凝集体ピーク（ピークＡ）が検出され、溶出時間１６分乃至１８分に単量体ピーク（ピークＢ）が検出される。これらのピークの面積から、下記（ＩＶ）式を用いて抗体凝集体比率を算出した。
培養液又は濾過液からのＩｇＧの精製には市販のアフィニティクロマトグラフィ担体カラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いた。抗体の吸着及び溶出条件は、製品に付属の説明書に従った。抗体を担体カラムから溶出する際の溶液の水素イオン指数は、ｐＨ３．０であった。回収された溶出液の水素イオン指数は、１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いる滴定により、ｐＨ５．０とした。
得られた抗体標品の抗体凝集体比率の測定には高速液体サイズ排除クロマトグラフィのシステムを利用した。すなわち、リザーバタンク（移動相、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸、０．２ｍｏｌ／Ｌアルギニン、ｐＨ６．８）、送液ポンプ（送液線速１．６８ｃｍ／ｍｉｎ）、サンプルループ（容量１００μＬ）、カラム（室温）、検出器（紫外線、波長２８０ｎｍ）、ドレンの順に接続した該システムを用いて抗体標品をロードした後、検出器から検出された吸光度から、抗体標品に含有される凝集体の比率を定量した。内径（直径）７．８ｍｍ、ベッド高さ３００ｍｍの東ソーＴＳＫＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを用いた。典型的には、溶出時間１６分迄に２量体以上の凝集体ピーク（ピークＡ）が検出され、溶出時間１６分乃至１８分に単量体ピーク（ピークＢ）が検出される。これらのピークの面積から、下記（ＩＶ）式を用いて抗体凝集体比率を算出した。
凝集体比率（％）＝１００×（ピークＡの面積）／（ピークＡの面積＋ピークＢの面積） （ＩＶ）
（実施例１）
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社 ＣＤ ｏｐｔｉ ＣＨＯ ＡＧＴ ｗｉｔｈｏｕｔ ２ＭＥ）で培養して、ＣＨＯ細胞懸濁液を得た。
あらかじめ１２Ｌ容量の細胞培養槽、細胞培養液中の細胞と使用済み培地を分離する膜として多孔質中空糸膜モジュール（旭化成メディカル社製、ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ ＭＦ−ＳＬに内蔵されている中空糸膜を用いて作製したミニモジュール、膜面積０．０８５ｍ2）、該膜を装填した連続培養用の交互流濾過用システム（ＡＴＦ−２、Refine Technology製）、未使用の培地を培養槽に供給する培地タンクのすべてを接続してオートクレーブ滅菌した。なお培養槽には培養槽から多孔質中空糸膜へ培養液を送液する流出口、培養槽内の培養液をサンプリングする流出口、新鮮培地を供給する流入口を設けた。
４．５Ｌの新鮮無血清培地にヒト免疫グロブリンＧ（日本血液製剤機構製 献血ヴェノグロブリンＩＨ５％静注２．５ｇ／５０ｍＬ）を培養液に対して０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加して模擬培養液として培養槽に送入し、さらに５×Ｅ５ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＣＨＯ細胞懸濁液を１Ｌ送入し培養を開始した。その後、総細胞数が１．５×Ｅ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに増殖したことを確認した後に、細胞培養液を一部抜きだして培養槽内の液量を４Ｌに調整した後、交互流濾過用システムを起動して培養液の濾過及びヒト免疫グロブリンＧを培養液に対して０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加した未使用の培地を模擬培養液として培養槽へ供給する連続培養を開始した。
交互流濾過用システムのダイアフラムポンプにより培養槽から多孔質中空糸膜への送液を行い、濾過を行った。送液量はPermeate量の２５０倍となるように０．５〜１．２Ｌ／分（６〜１４Ｌ／分、ｍ2）に設定した。培地交換率は連続培養スタート時には１総培養液量／日として培養槽内の総細胞密度の増加に合わせて０．７５〜１．７５総培養液量／日の範囲内（＝約３５〜約８２Ｌ／日、ｍ2）で培地交換率を上げた。多孔質中空糸膜の透過液流出口にはポンプを設置し未使用培地の供給量と同じ一定速度で透過液を抜き出し、またその透過液量を随時測定できるように重量計も設置した。
１日１回培養槽及び透過液をサンプリングして総細胞密度、細胞生存率、タンパク濃度を測定し、タンパク濃度からタンパク質透過率を計算した。また透過液のタンパク濃度、透過液重量、使用している多孔質中空糸膜の膜面積からｍ2換算した累積産生タンパク量を計算した。結果を表１及び図１に示す。
培養日数１０日目の総細胞密度は５.３０×Ｅ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで細胞生存率は７６．４７％、タンパク質透過率は８２．１％、累積産生タンパク量は２３４．２ｇ/ｍ2であった。
以下に示す比較例１〜３に対して細胞生存率、タンパク透過率及び累積産生タンパク量は高く、本方法の有用性が示された。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社 ＣＤ ｏｐｔｉ ＣＨＯ ＡＧＴ ｗｉｔｈｏｕｔ ２ＭＥ）で培養して、ＣＨＯ細胞懸濁液を得た。
あらかじめ１２Ｌ容量の細胞培養槽、細胞培養液中の細胞と使用済み培地を分離する膜として多孔質中空糸膜モジュール（旭化成メディカル社製、ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ ＭＦ−ＳＬに内蔵されている中空糸膜を用いて作製したミニモジュール、膜面積０．０８５ｍ2）、該膜を装填した連続培養用の交互流濾過用システム（ＡＴＦ−２、Refine Technology製）、未使用の培地を培養槽に供給する培地タンクのすべてを接続してオートクレーブ滅菌した。なお培養槽には培養槽から多孔質中空糸膜へ培養液を送液する流出口、培養槽内の培養液をサンプリングする流出口、新鮮培地を供給する流入口を設けた。
４．５Ｌの新鮮無血清培地にヒト免疫グロブリンＧ（日本血液製剤機構製 献血ヴェノグロブリンＩＨ５％静注２．５ｇ／５０ｍＬ）を培養液に対して０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加して模擬培養液として培養槽に送入し、さらに５×Ｅ５ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＣＨＯ細胞懸濁液を１Ｌ送入し培養を開始した。その後、総細胞数が１．５×Ｅ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに増殖したことを確認した後に、細胞培養液を一部抜きだして培養槽内の液量を４Ｌに調整した後、交互流濾過用システムを起動して培養液の濾過及びヒト免疫グロブリンＧを培養液に対して０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加した未使用の培地を模擬培養液として培養槽へ供給する連続培養を開始した。
交互流濾過用システムのダイアフラムポンプにより培養槽から多孔質中空糸膜への送液を行い、濾過を行った。送液量はPermeate量の２５０倍となるように０．５〜１．２Ｌ／分（６〜１４Ｌ／分、ｍ2）に設定した。培地交換率は連続培養スタート時には１総培養液量／日として培養槽内の総細胞密度の増加に合わせて０．７５〜１．７５総培養液量／日の範囲内（＝約３５〜約８２Ｌ／日、ｍ2）で培地交換率を上げた。多孔質中空糸膜の透過液流出口にはポンプを設置し未使用培地の供給量と同じ一定速度で透過液を抜き出し、またその透過液量を随時測定できるように重量計も設置した。
１日１回培養槽及び透過液をサンプリングして総細胞密度、細胞生存率、タンパク濃度を測定し、タンパク濃度からタンパク質透過率を計算した。また透過液のタンパク濃度、透過液重量、使用している多孔質中空糸膜の膜面積からｍ2換算した累積産生タンパク量を計算した。結果を表１及び図１に示す。
培養日数１０日目の総細胞密度は５.３０×Ｅ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで細胞生存率は７６．４７％、タンパク質透過率は８２．１％、累積産生タンパク量は２３４．２ｇ/ｍ2であった。
以下に示す比較例１〜３に対して細胞生存率、タンパク透過率及び累積産生タンパク量は高く、本方法の有用性が示された。
（比較例１）
あらかじめ１２Ｌ容量の細胞培養槽、細胞培養液中の細胞と使用済み培地を分離する膜として多孔質中空糸膜モジュール（旭化成メディカル社製、ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ ＭＦ−ＳＬに内蔵されている中空糸膜を用いて作製したミニモジュール、膜面積０．０８５ｍ2）、未使用の培地を培養槽に供給する培地タンクのすべてを接続してオートクレーブ滅菌した。なお培養槽には培養槽から多孔質中空糸膜へ培養液を送液する流出口、多孔質中空糸膜内を通過して培養槽に戻る流入口、培養槽内の培養液をサンプリングする流出口、新鮮培地を供給する流入口を設けた。
４．５Ｌの新鮮無血清培地にヒト免疫グロブリンＧを培養液に対して０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加して模擬培養液として培養槽に送入し、さらに５×Ｅ５ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＣＨＯ細胞懸濁液を１Ｌ送入し培養を開始した。
その後、総細胞数が１．５×Ｅ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに増殖したことを確認した後に、細胞培養液を一部抜きだして培養槽内の液量を４Ｌに調整した後、濾過を開始した。濾過はペリスタックポンプにより培養槽から多孔質中空糸膜への送液を行い、タンジェンシャルフロー濾過を行った。送液量はずり速度２９００ｓ-1となるように設定して連続培養を行った。ヒト免疫グロブリンＧを培養液に対して０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加した未使用の培地を模擬培養液として１〜１．７５総培養液量／日の範囲内で培養槽へ供給し、多孔質中空糸膜の透過液流出口にはポンプを設置し未使用培地の供給量と同じ一定速度で透過液を抜き出し、またその透過液量を随時測定できるように重量計も設置した。
実施例１と同様にサンプリングを行い、各種測定を行った結果を表１に示す。培養日数１０日間目の総細胞密度は４．３２×Ｅ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで細胞生存率は７５％、タンパク質透過率は６８％、累積産生タンパク量は２１３．５ｇ/ｍ2であった。
あらかじめ１２Ｌ容量の細胞培養槽、細胞培養液中の細胞と使用済み培地を分離する膜として多孔質中空糸膜モジュール（旭化成メディカル社製、ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ ＭＦ−ＳＬに内蔵されている中空糸膜を用いて作製したミニモジュール、膜面積０．０８５ｍ2）、未使用の培地を培養槽に供給する培地タンクのすべてを接続してオートクレーブ滅菌した。なお培養槽には培養槽から多孔質中空糸膜へ培養液を送液する流出口、多孔質中空糸膜内を通過して培養槽に戻る流入口、培養槽内の培養液をサンプリングする流出口、新鮮培地を供給する流入口を設けた。
４．５Ｌの新鮮無血清培地にヒト免疫グロブリンＧを培養液に対して０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加して模擬培養液として培養槽に送入し、さらに５×Ｅ５ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＣＨＯ細胞懸濁液を１Ｌ送入し培養を開始した。
その後、総細胞数が１．５×Ｅ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに増殖したことを確認した後に、細胞培養液を一部抜きだして培養槽内の液量を４Ｌに調整した後、濾過を開始した。濾過はペリスタックポンプにより培養槽から多孔質中空糸膜への送液を行い、タンジェンシャルフロー濾過を行った。送液量はずり速度２９００ｓ-1となるように設定して連続培養を行った。ヒト免疫グロブリンＧを培養液に対して０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加した未使用の培地を模擬培養液として１〜１．７５総培養液量／日の範囲内で培養槽へ供給し、多孔質中空糸膜の透過液流出口にはポンプを設置し未使用培地の供給量と同じ一定速度で透過液を抜き出し、またその透過液量を随時測定できるように重量計も設置した。
実施例１と同様にサンプリングを行い、各種測定を行った結果を表１に示す。培養日数１０日間目の総細胞密度は４．３２×Ｅ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで細胞生存率は７５％、タンパク質透過率は６８％、累積産生タンパク量は２１３．５ｇ/ｍ2であった。
（比較例２）
多孔質中空糸膜として、Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製 ＭＦホロファイバーモジュール（阻止孔径０．２μｍ、膜面積０．１３ｍ2）を使用し、液量を膜面積換算で実施例１と同じになるように調整した以外は、実施例１と同様にして交互流濾過用システムを用いた連続培養を行った。
実施例１と同様にサンプリングを行い、各種測定を行った結果を表１に示す。培養日数１０日間目の総細胞密度は４．３９×Ｅ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで細胞生存率は７３％、タンパク質透過率は４１％、累積産生タンパク量は１６６．１ｇ/ｍ2であった。
多孔質中空糸膜として、Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製 ＭＦホロファイバーモジュール（阻止孔径０．２μｍ、膜面積０．１３ｍ2）を使用し、液量を膜面積換算で実施例１と同じになるように調整した以外は、実施例１と同様にして交互流濾過用システムを用いた連続培養を行った。
実施例１と同様にサンプリングを行い、各種測定を行った結果を表１に示す。培養日数１０日間目の総細胞密度は４．３９×Ｅ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで細胞生存率は７３％、タンパク質透過率は４１％、累積産生タンパク量は１６６．１ｇ/ｍ2であった。
（比較例３）
多孔質中空糸膜として、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社製Ｍｉｄｉｃｒｏｓｓ Ｘ３２Ｅ−３０１−０２Ｎ（阻止孔径０．２μｍ、膜面積０．００６５ｍ2）を使用し、液量を膜面積換算で実施例１と同じになるように調整した以外は、比較例１と同様にして連続培養を行った。
実施例１と同様にサンプリングを行い、各種測定を行った結果を表１に示す。培養日数１０日間目の総細胞密度は３．７３×Ｅ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで細胞生存率は６８％、タンパク質透過率は３８％、累積産生タンパク量は１５７．６ｇ/ｍ2であった。
多孔質中空糸膜として、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社製Ｍｉｄｉｃｒｏｓｓ Ｘ３２Ｅ−３０１−０２Ｎ（阻止孔径０．２μｍ、膜面積０．００６５ｍ2）を使用し、液量を膜面積換算で実施例１と同じになるように調整した以外は、比較例１と同様にして連続培養を行った。
実施例１と同様にサンプリングを行い、各種測定を行った結果を表１に示す。培養日数１０日間目の総細胞密度は３．７３×Ｅ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで細胞生存率は６８％、タンパク質透過率は３８％、累積産生タンパク量は１５７．６ｇ/ｍ2であった。
なお、実施例１及び比較例１で用いた中空糸膜は：
ポリスルホンとポリビニルピロリドンのブレンド物から構成された中空糸膜であり；
ポリビニルピロリドン含有量は、多孔質中空糸膜の総質量を基準としたとき、１．２質量％であり；
外側面（透過液側）を含む外周領域のポリビニルピロリドンの含有割合が、内側面（培養液側）を含む内周領域のポリビニルピロリドンの含有割合より大きく；
濾過膜に含まれるポリビニルピロリドンの重量平均分子量が４４万のグレードであり；
孔径２０μｍ以上の孔を、９０％有し；
Ｃout／Ｃin［Ｃoutはポリビニルピロリドンの前記外周領域における含有割合を示し、Ｃinはポリビニルピロリドンの前記内周領域における含有割合を示す］の値が約２．７であった。
比較例２及び３で用いた中空糸膜は、ポリエーテルスルホン製の中空糸膜であった。
ポリスルホンとポリビニルピロリドンのブレンド物から構成された中空糸膜であり；
ポリビニルピロリドン含有量は、多孔質中空糸膜の総質量を基準としたとき、１．２質量％であり；
外側面（透過液側）を含む外周領域のポリビニルピロリドンの含有割合が、内側面（培養液側）を含む内周領域のポリビニルピロリドンの含有割合より大きく；
濾過膜に含まれるポリビニルピロリドンの重量平均分子量が４４万のグレードであり；
孔径２０μｍ以上の孔を、９０％有し；
Ｃout／Ｃin［Ｃoutはポリビニルピロリドンの前記外周領域における含有割合を示し、Ｃinはポリビニルピロリドンの前記内周領域における含有割合を示す］の値が約２．７であった。
比較例２及び３で用いた中空糸膜は、ポリエーテルスルホン製の中空糸膜であった。
さらに、前記実施例１並びに比較例２及び３における、培養液及び透過液中の産生物凝集体比率を比較した結果を以下に示す。
培養初期（ｄａｙ２）ではいずれの膜モジュールを用いた場合でも培養液中及び濾過液中の凝集体比率に差は認められないが、培養後期（ｄａｙ１０）においては実施例１（ＢｉｏＯｐｔｏｍａｌ ＭＦ−ＳＬ使用）でのみ凝集体比率の増加が抑えられていた。以上より、培養継続時の不純物比率の増加を抑制するという本方法の有用性が示された。
培養初期（ｄａｙ２）ではいずれの膜モジュールを用いた場合でも培養液中及び濾過液中の凝集体比率に差は認められないが、培養後期（ｄａｙ１０）においては実施例１（ＢｉｏＯｐｔｏｍａｌ ＭＦ−ＳＬ使用）でのみ凝集体比率の増加が抑えられていた。以上より、培養継続時の不純物比率の増加を抑制するという本方法の有用性が示された。
本発明は、培養産生物を産生する細胞の培養において、より生産性の高い培養方法及び培養産生物の回収方法を提供することができるという産業上の利用可能性を有する。本発明は、バイオ医薬等の分野において有用である。
Claims (21)
- 培養産生物を産生する細胞の培養において、培養液に含まれる培養産生物を回収する方法であって、
Ｂ．前記培養液を濾過膜に送液する工程、
Ｃ．前記培養液の流れを、前記濾過膜表面に平行な方向に往復運動させるように変化させつつ濾過して透過液を得る交互流濾過工程、
Ｄ．前記濾過膜を透過せずに残った残培養液を返液する工程、及び
Ｇ．前記透過液から培養産生物を回収する工程、
を含み、
前記Ｂ工程に用いる濾過膜として、培養液側表面の平均孔径が２０μｍ以上１００μｍ以下の多孔膜を用い、
前記培養産生物が免疫グロブリンであり、
前記細胞が免疫グロブリン産生能を有するよう改変したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、培養産生物の回収方法。 - 培養産生物を産生する細胞の培養において、培養液に含まれる培養産生物を回収する方法であって、
Ｂ．前記培養液を濾過膜に送液する工程、
Ｃ．前記培養液の流れを、前記濾過膜表面に平行な方向に往復運動させるように変化させつつ濾過して透過液を得る交互流濾過工程、
Ｄ．前記濾過膜を透過せずに残った残培養液を返液する工程、及び
Ｇ．前記透過液から培養産生物を回収する工程、
を含み、
前記Ｂ工程に用いる濾過膜として、培養液側表面の直径２０μｍ未満となる孔の割合が培養液側表面の孔全体の５０％以下である多孔膜を用い、
前記培養産生物が免疫グロブリンであり、
前記細胞が免疫グロブリン産生能を有するよう改変したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、培養産生物の回収方法。 - 前記濾過膜が、培養液側表面の平均孔径が透過液側表面の平均孔径より大きい多孔膜である、請求項１又は２に記載の培養産生物の回収方法。
- 前記濾過膜が中空糸膜である、請求項１〜３の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
- 前記濾過膜の最小孔径が０．１μｍ以上１μｍ以下である、請求項１〜４の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
- 前記濾過膜が、疎水性高分子と、ポリビニルピロリドンのブレンド物から構成される多孔質中空糸膜である、請求項１〜５の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
- 前記濾過膜が、管壁を膜厚方向に３等分して３つの領域に分割したときに、前記濾過膜の透過液側表面である外側面を含む外周領域のポリビニルピロリドンの含有割合が、前記濾過膜の培養液側表面である内側面を含む内周領域のポリビニルピロリドンの含有割合より大きい中空糸膜である、請求項６に記載の培養産生物の回収方法。
- 前記疎水性高分子が、ポリスルホンである、請求項６又は７に記載の培養産生物の回収方法。
- 前記Ｂ工程の前に、
Ａ．培養液中で、培養産生物を産生する細胞を培養して培養産生物を産生する工程、
を含む、請求項１〜８の何れかに記載の培養産生物の回収方法。 - 前記Ｂ〜Ｄ工程の何れかと同時又は前記Ｂ〜Ｄ工程の何れかの前もしくは後に、
Ｅ．新しい培養液を連続的及び／又は間欠的に供給する工程
を含む、請求項１〜９の何れかに記載の培養産生物の回収方法。 - 前記Ｄ工程の後に、
Ｆ．前記残培養液を排出する工程
を含む、請求項１〜１０の何れかに記載の培養産生物の回収方法。 - 前記Ａ工程が、培養槽に貯留された培養液中で行われる、請求項９〜１１の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
- 前記Ｃ工程が、筒状容器内に収納された濾過膜において行われる、請求項１〜１２の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
- 培養１０日後の培養産生物の濾過膜透過率が、培養３日後の培養産生物の濾過膜透過率の７０％以上である、請求項１〜１３の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
- 培養１０日後の培養液中の凝集体比率が、培養２日後の培養液中の凝集体比率の１５０％未満である、請求項１〜１４の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
- 培養１０日後の透過液中の凝集体比率が、培養２日後の透過液中の凝集体比率の１５０％未満である、請求項１〜１５の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
- 培養液の細胞密度が１０×１０ 5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上２０００×１０ 5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、培養液を送液する際の流量が２Ｌ／分、ｍ 2 以上４０Ｌ／分、ｍ 2 以下であり、培養１０日後の培養産生物の濾過膜透過率が、培養３日後の培養産生物の濾過膜透過率の７０％以上である、請求項１４に記載の培養産生物の回収方法。
- 培養液の細胞密度が１０×１０ 5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上２０００×１０ 5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、培養液を送液する際の流量が２Ｌ／分、ｍ 2 以上４０Ｌ／分、ｍ 2 以下であり、培養１０日後の培養液中の凝集体比率が、培養２日後の培養液中の凝集体比率の１５０％未満である、請求項１５に記載の培養産生物の回収方法。
- 培養液の細胞密度が１０×１０ 5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上２０００×１０ 5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、培養液を送液する際の流量が２Ｌ／分、ｍ 2 以上４０Ｌ／分、ｍ 2 以下であり、培養１０日後の透過液中の凝集体比率が、培養２日後の透過液中の凝集体比率の１５０％未満である、請求項１６に記載の培養産生物の回収方法。
- 前記培養が連続培養である、請求項１〜１９の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
- 培養産生物である免疫グロブリンの凝集体増加が抑制される、請求項１〜２０の何れかに記載の培養産生物の回収方法。
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