CN116948947A - 一种外泌体的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种外泌体的分离纯化方法。该分离纯化方法包括：(1)外泌体供体细胞培养液经过深层过滤和除菌过滤得到外泌体供体细胞培养上清液；(2)采用切向流过滤浓缩外泌体供体细胞培养上清液，得到浓缩液；(3)将浓缩液与全能核酸酶孵育后微滤得到粗提溶液；(4)将粗提溶液依次通过第一层析柱和第二层析柱进行层析分离，得到纯化后的外泌体溶液，其中，第一层析柱为采用具有分子筛功能、离子交换功能和疏水功能中的至少两种功能的多功能填料的填料柱，第二层析柱为阴离子交换膜层析柱。相比已有技术，本发明方法不仅外泌体纯度和质量有进一步提升，而且能够真正适用于工业化水平外泌体分离纯化。

Description

一种外泌体的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及一种外泌体的分离纯化方法。
背景技术
细胞外囊泡是由古细菌、细菌和真核生物的大多数细胞分泌的微小膜泡。细胞外囊泡作为纳米级别的双层封闭膜结构，包含脂质、RNA、代谢物、生长因子和细胞因子等成分，调节复杂的细胞通讯，以维持正常生理或引发严重的疾病进展。根据其生物发生机制，细胞外囊泡通常分为三种亚型：外泌体、微囊泡和凋亡小体，其中外泌体生物发生和分泌的机制是细胞质膜向内出芽并随后形成多囊泡体，多囊泡体与细胞质膜融合，分泌到胞外，形成直径在30～200nm的膜性囊泡。
外泌体可以被应用于许多领域，包括疾病诊断、疾病治疗、药物递送等。外泌体含有特点的蛋白质和RNA，可以用于早期诊断和预后评估。外泌体可以促进细胞再生和修复，可用于肝、肾等器官的再生治疗。外泌体还可以用于治疗心血管疾病、神经系统疾病、免疫系统疾病等。外泌体具有较小的体积和良好的穿透力，可以穿过血脑屏障和其他组织屏障，实现有效的药物递送。外泌体具有较好的稳定性和生物相容性，可避免外源性递送系统的不良反应和毒性。
外泌体的提取技术主要包括差速/超速离心法、超滤法、密度梯度离心法、化学沉淀法、尺寸排阻法、免疫捕获法、流场-流分馏技术、微流法等。差速/超速离心法是基于密度和粒径的顺序分离，根据样品中外泌体、蛋白质、细胞碎片、细胞以及细胞器等物质沉降速度的差异，通过不同的离心力和离心时间，将外泌体上清液分离。差速/超速离心法的缺点是耗时长，设备成本高，外泌体可能会因高速离心而受损。超滤法是基于粒径分离，操作简单易放大，但易导致外泌体丢失，产量很低。化学沉淀法通过聚乙二醇(PEG)等，改变外泌体溶解度和分散性，使溶解性较低的组分从溶液中析出，其缺点是缺乏特异性、选择性，外泌体纯度低。尺寸排阻法是根据外泌体粒径大小利用色谱柱进行分离提取，重力流保留了外泌体的完整结构和生物活性，但是单独使用时耗时长，难以规模放大。免疫捕获法是基于使用特异性外泌体标记物的外泌体捕获，其缺点是试剂成本高，收率低，使用受限。流场-流分馏技术基于粒径分离，缺点是样本量低，难以扩大规模。微流法基于免疫亲和、粒径和密度分离技术，缺点是样品处理量较低。密度梯度离心法利用外泌体与其他溶质的密度差异而实现分离，是目前外泌体提取的“金标准”，但是密度梯度有样品处理量小、耗时长以及难放大等特点。
对于最终应用于临床领域的外泌体，不仅需要保证外泌体的生物活性，还需要符合生物制剂安全性标准，宿主蛋白质、DNA、病毒和内毒素等必须减少到安全水平。完整外泌体为典型的茶杯状囊泡，从电镜观察外泌体溶液，应呈现明显的茶托状或杯状结构，边缘清晰且有一圈略微更明亮的亮圈，边缘清晰且不团聚。专利CN115354031A公开了一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，然而，其实际上并没有实现纯化的目的，其所公开的电镜图并未显示具有典型“茶杯”结构的外泌体存在，而且从背景可见存在较大量杂质。而工业化外泌体分离纯化需要考虑工艺的可放大性，但更重要的还是保证外泌体纯度和生物活性，因此，该专利方法不能真正适于工业上规模化纯化外泌体。
发明内容
本发明所解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种真正适用于工业上规模化纯化外泌体的方法。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种外泌体的分离纯化方法，其包括以下步骤：
(1)外泌体供体细胞培养液经过深层过滤和除菌过滤得到外泌体供体细胞培养上清液；
(2)采用切向流过滤浓缩所述外泌体供体细胞培养上清液，得到浓缩液；
(3)将所述浓缩液与全能核酸酶孵育后微滤得到粗提溶液；
(4)将所述粗提溶液依次通过第一层析柱和第二层析柱进行层析分离，得到纯化后的外泌体溶液，
其中，第一层析柱为填料柱，且所采用的填料为多功能填料，所述多功能填料具有分子筛功能、离子交换功能和疏水功能中的至少两种功能，所述第二层析柱为阴离子交换膜层析柱。
优选地，步骤(1)中，所述细胞培养液的活细胞密度大于10×106cells/mL且细胞活力大于80％。
优选地，所述细胞培养液采用的培养基为无血清培养基。
根据一些优选实施方式，步骤(1)中，所述深层过滤载量为40～60L/m2，过滤流速为80～120LMH。
根据一些优选实施方式，步骤(1)中，所述除菌过滤采用膜孔径为0.2μm～0.25μm的除菌过滤器。
根据一些具体且优选地实施方式，步骤(1)中，所述深层过滤采用MD0HC054H1密理博深层过滤膜包。
根据一些具体且优选地实施方式，步骤(1)中，所述除菌过滤采用5441307H5G-00除菌过滤器。
优选地，步骤(2)中，所述的切向流过滤采用截留分子量为100kDa～750kDa的中空纤维柱，例如100kDa、150kDa、200kDa、250kDa、300kDa、350kDa、400kDa、450kDa、500kDa、550kDa、600kDa、650kDa、700kDa、750kDa。
进一步优选地，步骤(2)中，所述的切向流过滤采用截留分子量为400kDa～600kDa的中空纤维柱。
优选地，步骤(2)中，所述浓缩的倍速为5～15倍，例如5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍。
优选地，步骤(2)中，控制所述切向流过滤的跨膜压力为1.5～3psi，载量为40～60L/m2。
根据一些具体且优选地实施方式，步骤(3)中，将所述浓缩液与MgCl2溶液和全能核酸酶溶液混合得到孵育体系，控制所述孵育体系中MgCl2的浓度为0.5～2mM，全能核酸酶的浓度为10～30U/mL。
根据一些优选实施方式，步骤(3)中，控制所述孵育的温度为25～37℃，控制所述孵育的时间为3～16h。
进一步优选地，步骤(3)中，控制所述孵育的温度为35～37℃，控制所述孵育的时间为3～5h。
根据一些优选实施方式，步骤(3)中，所述微滤采用膜孔径为0.2μm～0.25μm滤器。
优选地，所述多功能填料具有分子筛功能、离子交换功能和疏水三种功能。
根据一些具体且优选地实施方式，所述多功能填料为Capto Core 700和/或CaptoCore 400。
根据一些具体且优选地实施方式，所述阴离子交换膜层析柱为Q膜层析柱或Pall Mustang Q XT膜层析柱。
优选地，步骤(4)中，通过所述第一层析柱进行的层析分离包括依次对所述填料柱进行平衡、上样和淋洗，收集淋洗液用于下一步层析。具体地，在紫外信号上升时开始收集，紫外信号平稳后停止收集。
根据一些具体实施方式，通过第一层析柱进行层析分离时，所述平衡和淋洗分别采用含100～200mM氯化钠的pH为7.2～7.8的缓冲液。
进一步优选地，所述缓冲液为Tris缓冲液。
优选地，步骤(4)中，通过所述第二层析柱进行的层析分离包括依次对所述阴离子交换膜层析柱进行预平衡、上样、平衡、淋洗和洗脱，收集洗脱液得到所述纯化后的外泌体溶液。
根据一些优选实施方式，通过第二层析柱进行层析分离时，所述平衡采用含100～200mM氯化钠的pH为6.8～7.2的缓冲液，所述淋洗和洗脱分别采用含300～700mM氯化钠的pH为6.8～7.2的缓冲液，其中洗脱所用的缓冲液中氯化钠浓度大于所述淋洗用的缓冲液体中的氯化钠浓度。
进一步优选地，通过第二层析柱进行层析分离时，所述淋洗包括具有第一浓度的氯化钠的所述缓冲液进行淋洗，之后用具有第二浓度的氯化钠的所述缓冲液进行淋洗，所述第二浓度高于所述第一浓度且二者的差值大于80mM。更优选地，所述第二浓度高于所述第一浓度且二者的差值为100～300mM。更优选地，所述缓冲液为Tris缓冲液。
根据本发明，所述外泌体供体细胞没有特别限制。在一些实施方式中，所述外泌体供体细胞为人胚胎肾细胞。
本发明还提供一种外泌体溶液，所述外泌体溶液由上述分离纯化方法制备得到。
本发明还提供上述外泌体溶液在生物医药或药物递送系统中的应用。
进一步地，上述外泌体溶液的具体应用包括但不限于用于制备用于治疗的药物、制备用于诊断的试剂，以及用于制备药物递送系统等。
本发明中，“药物递送系统”指递送药物活性成分至期望的身体部位和/或使治疗剂适时释放的制剂。本申请中，乳源外泌体可递送的药物活性成分包括小分子药物或生物治疗剂，所述的生物治疗剂不天然存在于乳源外泌体中，所述的生物治疗剂选自肽、蛋白质、多糖或核酸，所述的核酸选自单链或双链DNA、iRNA、siRNA、shRNA、mRNA、非编码RNA(ncRNA)、反义RNA、LNA、吗啉代寡核苷酸或其类似物或缀合物。
由于采用上述技术方案，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明方法通过工艺整体设计，特别是采用特定的两步层析相结合，实现了高纯且外泌体膜结构完整的外泌体的高效生产，相比已有技术，不仅外泌体纯度和质量有进一步提升，而且能够真正适用于工业化水平外泌体分离纯化。
附图说明
图1为实施例和对比例制备的HEK293细胞外泌体分离纯化液的透射电镜图；
图2为实施例和对比例制备的HEK293细胞外泌体分离纯化液中的颗粒粒径分布图；
图3为实施例和对比例制备的HEK293细胞外泌体分离纯化液的外泌体GFP阳性率检测图；
图4为实施例和对比例制备的HEK293细胞外泌体分离纯化液的外泌体破膜率检测图。
具体实施方式
虽然目前被认为是细胞培养液外泌体分离纯化“金标准”的密度梯度离心法相比现有其他工艺能够获得更高纯度的外泌体溶液，但其存在样品处理量小、耗时长以及难放大等问题，基本无法实现GMP级别大规模生产。部分其他工艺虽然相比密度梯度离心法放大难度降低，但很难达到与密度梯度离心法相当的外泌体纯度。即现有细胞培养外泌体分离纯化方法无法在保证外泌体纯度和产量的同时，实现工业化大规模分离纯化。本发明旨在解决前述问题。
本发明通过对工艺进行整体设计，将深层过滤、切向流过滤、多功能填料层析分离、膜层析分离有机结合，不仅获得了结构完整、纯度高的高质量外泌体(外泌体质量超越密度梯度离心法)，而且单位体积上清液外泌体产量高，且易于放大，真正适用于细胞外泌体工业化制备。
具体地，本发明先采用流过滤将外泌体供体细胞培养上清液浓缩5～15倍，提高后期分离纯化效果。优选采用截留分子量为100kDa～750kDa的中空纤维柱进行切向流过滤，尤其优选400kDa～600kDa的中空纤维柱，降低浓缩操作时的外泌体损失。随后使用全能核酸酶结合微滤去除浓缩液中核酸分子得到粗提溶液。接着粗提溶液先过装填有多功能层析填料的层析柱，收集含外泌体的淋洗液，然后将淋洗液过阴离子交换层析膜层析柱，收集洗脱液，即为纯化后的外泌体溶液。其中多功能层析填料优选同时具有分子筛功能、离子交换功能和疏水功能三种功能，分离得到的外泌体质量最好，而若将多功能层析填料替换为其他单功能填料，例如常规的凝胶填料，即便其他操作均与本发明相同，最终分离得到的外泌体质量明显降低。
下面结合具体的实施案例对本发明的技术方案进一步描述，但本发明不只限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
本发明中，如无特殊说明，使用的仪器、原料和试剂均可通过市售获得。
实施例1
本实施例提供一种HEK293细胞外泌体的分离纯化方法，包括如下步骤：
(1)制备Expi293细胞培养上清液：培养基为abs9430外泌体专用无血清培养基(名称：HEK293 MaxD。厂家：迈邦)，在反应器培养条件(37℃，pH 7.0，溶解氧50％，转速90rpm)下，培养Expi293细胞至活细胞密度大于10×106cells/mL且细胞活力大于80％，细胞培养液经深层过滤得到Expi293细胞培养上清液。深层过滤为将细胞培养液先经MD0HC054H1密理博深层过滤膜包(默克)过滤，载量50L/m2，过滤流速100LMH，再经0.22μm 5441307H5G-00除菌过滤器(赛多利斯)过滤。
(2)Expi293细胞培养上清液浓缩：通过切向流过滤浓缩系统将Expi293细胞培养上清液浓缩10倍得到浓缩液，切向流浓缩系统采用500kDa中空纤维柱，PBS洗滤7～10倍，跨膜压力(TMP)：2psi，载量50L/m2。
(3)浓缩液核酸酶处理：向浓缩液中加入MgCl2溶液(终浓度1mM)和全能核酸酶(终浓度20U/mL)，37℃水浴3h，然后经过0.22μm滤器过滤，得到粗提溶液。
(4)第一步层析：粗提溶液为第一步层析上样样本，操作步骤如下：
装填：使用填料体积浓度为50％的Capto Core 700层析填料悬液进行装填，柱高保持在10～40cm。
平衡：使用缓冲液(20mM Tris、150mM NaCl，pH为7.5)平衡10CV，保留时间5～10min。
上样：上样体积10％CV，保留时间5～10min。
淋洗：使用缓冲液(20mM Tris、150mM NaCl，pH为7.5)冲洗，保留时间5～10min，紫外信号上升时开始收集，平稳后停止收集。
再生：使用1M NaCl溶液冲洗3CV，保留时间5～10min。
在位清洗(CIP)：使用1M NaOH溶液冲洗3CV，保留时间5～10min。
(5)第二步层析：第一步层析收集的溶液为第二步层析上样样本，操作步骤如下：
预平衡：使用缓冲液(20mM Tris、150mM NaCl，pH为7.0)平衡Q膜层析柱15CV，保留时间1～5min。
上样：上样载量5E12 Particles/mL，保留时间1～5min。
平衡：使用缓冲液(20mM Tris，150mM NaCl pH为7.0)平衡直至紫外信号平稳，保留时间5～10min。
淋洗：使用缓冲液(20mM Tris，400mM NaCl，pH为7.0)冲洗3CV，保留时间5～10min。
淋洗：使用缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，pH7.0)冲洗3CV，保留时间5～10min。
洗脱：使用缓冲液(20mM Tris，600mM NaCl，pH7.0)冲洗，紫外信号上升开始收集，紫外信号平稳后停止收集，保留时间5～10min。收集的洗脱液即为HEK293细胞外泌体分离纯化液。
再生：使用1M NaCl溶液冲洗3CV，保留时间5～10min。
在位清洗(CIP)：使用1M NaOH溶液冲洗3CV，保留时间5～10min。
实施例2
本实施例提供一种HEK293细胞外泌体的分离纯化方法，其基本同实施例1，不同的是，将步骤(2)中，切向流浓缩系统采用100kDa中空纤维柱。
对比例1
本实施例提供一种HEK293细胞外泌体的分离纯化方法，其基本同实施例1，不同的是，将步骤(4)和步骤(5)的顺序调换，即粗提溶液先经Q膜层析柱层析分离，再经装填Capto Core 700的层析柱层析分离。
对比例2
本对比例提供一种HEK293细胞外泌体的分离纯化方法，其基本同实施例1，不同的是，省略步骤(5)，粗提溶液经装填Capto Core 700的层析柱层析分离时收集的溶液即为HEK293细胞外泌体分离纯化液。
对比例3
本对比例提供一种HEK293细胞外泌体的分离纯化方法，其基本同实施例1，不同的是，省略步骤(4)，粗提溶液经Q膜层析柱层析分离时收集的洗脱液即为HEK293细胞外泌体分离纯化液。
对比例4
本对比例提供一种HEK293细胞外泌体的分离纯化方法，包括如下步骤：
(1)制备Expi293细胞培养上清液：基本同实施例1步骤(1)，不同的是，细胞培养液于4℃、1200rpm离心5min，取上清液于4℃、8000rpm离心20min，取上清液过0.45μm滤膜，收集滤液，即为Expi293细胞培养上清液。
(2)Expi293细胞培养上清液浓缩：同实施例1步骤(2)。
(3)浓缩液核酸酶处理：同实施例1步骤(3)，得到粗提溶液。
(4)Capto Core 700复合模式层析：同实施例1步骤(4)，粗提溶液经装填CaptoCore700的层析柱层析分离时收集的溶液即为HEK293细胞外泌体分离纯化液。
对比例5
本对比例提供一种HEK293细胞外泌体的分离纯化方法，包括如下步骤：
(1)制备Expi293细胞培养上清液：同实施例1步骤(1)。
(2)Expi293细胞培养上清液浓缩：基本同实施例1步骤(2)，不同的是，切向流浓缩系统采用100kDa中空纤维柱。
(3)浓缩液核酸酶处理：同实施例1步骤(3)，得到粗提溶液。
(4)密度梯度分离纯化：将4.5mL的粗提溶液与9.0mL的60％碘克沙醇溶液混合成40％的碘克沙醇底层液，转移至直立的离心管中，约占离心体系的40％。在40％的碘克沙醇底层液上方依次逐步添加6mL的30％碘克沙醇稀释液、6mL的20％碘克沙醇稀释液、6mL的10％碘克沙醇稀释液，最后以5mL的1×PBS封在最上层液面上方，完成密度梯度离心体系的制备。以4℃、150000g离心16h，将外泌体与其它成分分离。将迁移至10％碘克沙醇稀释液和20％碘克沙醇稀释液之间的HEK293细胞外泌体梯度层小心抽取出来，体积约为1mL，即为HEK293细胞外泌体分离纯化液。
外泌体鉴定实验
通过不同检测指标对所提取的外泌体进行鉴定，包括通过透射电子显微镜(TEM)观察外泌体的形貌；通过纳米颗粒跟踪技术(NTA)对HEK293细胞外泌体分离纯化液中颗粒粒径分布及颗粒浓度；通过纳米流式(NanoFCM)分析外泌体GFP的阳性率并对比破膜率分析外泌体纯度，阳性率和破膜率越高说明外泌体纯度越高。综合各项测试结果能够更准确的评价外泌体纯度，同时能够推算出外泌体产量高低。
通过透射电子显微镜(TEM)观察各实施例和各对比例最终获得的HEK293细胞外泌体分离纯化液中外泌体形貌以及背景杂质。各实施例和对比例的分离纯化液中均能够观察到膜结构完整、大小符合预期、呈“杯盘”结构的典型囊泡。图1显示，实施例1、实施例2和对比例5的HEK293细胞外泌体分离纯化液背景杂质较少，其中实施例1的背景杂质最少。
通过纳米颗粒跟踪技术(NTA)对各实施例和各对比例最终获得的HEK293细胞外泌体分离纯化液中的颗粒粒径进行分析。粒径分布见图2，主峰粒径、平均粒径见表1。
表1
案例 实施例1 实施例2 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5
主峰粒径 102.9 98 114.8 122.7 130.8 126.3 116.5
平均粒径 112.8 107.2 123.8 134.2 142.0 139.7 126.7
结果表明：各实施例和对比例的平均粒径均符合外泌体粒径，其中实施例1、实施例2制备的HEK293细胞外泌体分离纯化液中颗粒粒径分布较窄，均一性优于对比例。
通过纳米流式(NanoFCM)检测各实施例和对比例的HEK293细胞外泌体分离纯化液中外泌体GFP阳性率。采用绿色荧光染料标记外泌体样本，然后进行纳米流式检测，统计荧光外泌体比例，即为GFP阳性率，可反应样本中外泌体的纯度。图3展示了各实施例和对比例的HEK293细胞外泌体分离纯化液中外泌体染色后荧光外泌体比例，统计结果见表2。
表2
结果显示，各实施例中外泌体GFP阳性率明显高于各对比例，其中实施例1的外泌体GFP阳性率最高，达到54.0％。
通过纳米流式(NanoFCM)检测各实施例和对比例的HEK293细胞外泌体分离纯化液中外泌体破膜率。破膜处理方法为：将HEK293细胞外泌体分离纯化液稀释至仪器检测范围内浓度后与10％的TritonX-100溶液按照体积比为9：1混合，冰上孵育1h后，直接上NanoFCM检测。图4展示了各实施例和对比例的HEK293细胞外泌体分离纯化液的外泌体破膜前后颗粒粒径分布，破膜率统计结果见表3。
表3
Triton-100具有破膜功能，可对有膜颗粒如外泌体进行裂解，而对无膜颗粒无影响，通过Triton-100裂解后便可检测样品中有膜颗粒占比，是外泌体纯度的另一种反映。外泌体破膜率越高，说明破膜处理前的HEK293细胞外泌体分离纯化液中外泌体的数量占分离纯化液中颗粒总数的比例越高。
综合以上结果，实施例1和实施例2的HEK293细胞外泌体分离纯化液的外泌体纯度高于各对比例。
根据纳米颗粒跟踪技术(NTA)检测HEK293细胞外泌体分离纯化液中颗粒浓度，计算实施例和部分对比例的方法能够从每毫升Expi293细胞培养上清液中分离提取的颗粒数。
表4
每毫升Expi293细胞培养上清液中分离提取的颗粒数＝每毫升HEK293细胞外泌体分离纯化液中颗粒数量×HEK293细胞外泌体分离纯化液体积/Expi293细胞培养上清液体积。
结合上述纯度分析和表4可知，实施例所得外泌体溶液中外泌体纯度更高且每毫升Expi293细胞培养上清液中分离的总颗粒数高，因此外泌体产量高，综合来看，实施例1的外泌体质量最好，实施例1和实施例2采用层析分离方法，能够实现GMP级别大规模生产外泌体。对比例1-3的方法，虽可以放大生产，但对比例1的外泌体纯度相较实施例1较低。对比例2和对比例3制备的外泌体纯度相比实施例1明显降低。对比例4的分离纯化液的外泌体纯度虽然保持了与实施例1近似的效果，但每毫升Expi293细胞培养上清液中分离的颗粒数相对较低，即外泌体产量不高。对比例5所制备的外泌体纯度低于实施例，且相比层析分离技术，密度梯度分离方法样品处理量小、耗时长、难放大，不适合大规模生产。
以上对本发明做了详尽的描述，目的在于让本领域内的技术人员了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施例，凡根据本发明的精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种外泌体的分离纯化方法，其特征在于：所述的分离纯化方法包括以下步骤：
(1)外泌体供体细胞培养液经过深层过滤和除菌过滤得到外泌体供体细胞培养上清液；
(2)采用切向流过滤浓缩所述外泌体供体细胞培养上清液，得到浓缩液；
(3)将所述浓缩液与全能核酸酶孵育后微滤得到粗提溶液；
(4)将所述粗提溶液依次通过第一层析柱和第二层析柱进行层析分离，得到纯化后的外泌体溶液，
其中，第一层析柱为填料柱，且所采用的填料为多功能填料，所述多功能填料具有分子筛功能、离子交换功能和疏水功能中的至少两种功能，所述第二层析柱为阴离子交换膜层析柱。
2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)中，所述细胞培养液的活细胞密度大于10×106cells/mL且细胞活力大于80％；和/或，所述细胞培养液采用的培养基为无血清培养基。
3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)中，所述深层过滤载量为40～60L/m2，过滤流速为80～120LMH；和/或，所述深层过滤采用MD0HC054H1密理博深层过滤膜包；和/或，所述除菌过滤采用膜孔径为0.2μm～0.25μm的除菌过滤器。
4.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的切向流过滤采用截留分子量为100kDa～750kDa的中空纤维柱；和/或，所述浓缩的倍速为5～15倍；和/或，控制所述切向流过滤的跨膜压力为1.5～3psi，载量为40～60L/m2。
5.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤(3)中，将所述浓缩液与MgCl2溶液和全能核酸酶溶液混合得到孵育体系，控制所述孵育体系中MgCl2的浓度为0.5～2mM，全能核酸酶的浓度为10～30U/mL；和/或，控制所述孵育的温度为25～37℃，控制所述孵育的时间为3～16h；和/或，所述微滤采用膜孔径为0.2μm～0.25μm滤器。
6.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：所述多功能填料具有分子筛功能、离子交换功能和疏水三种功能。
7.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：所述多功能填料为Capto Core700和/或Capto Core 400；和/或，所述阴离子交换膜层析柱为Q膜层析柱或Pall Mustang Q XT膜层析柱。
8.根据权利要求1至7中任一项权利要求所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤(4)中，通过所述第一层析柱进行的层析分离包括依次对所述填料柱进行平衡、上样和淋洗，收集淋洗液用于下一步层析；和/或，通过所述第二层析柱进行的层析分离包括依次对所述阴离子交换膜层析柱进行预平衡、上样、平衡、淋洗和洗脱，收集洗脱液得到所述纯化后的外泌体溶液。
9.根据权利要求8所述的分离纯化方法，其特征在于：通过所述第一层析柱进行层析分离时，所述平衡和淋洗分别采用含100～200mM氯化钠的pH为7.2～7.8的缓冲液；和/或，通过第二层析柱进行层析分离时，所述平衡采用含100～200mM氯化钠的pH为6.8～7.2的缓冲液，所述淋洗和洗脱分别采用含300～700mM氯化钠的pH为6.8～7.2的缓冲液，其中洗脱所用的缓冲液中氯化钠浓度大于所述淋洗用的缓冲液体中的氯化钠浓度。
10.根据权利要求9所述的分离纯化方法，其特征在于：通过第二层析柱进行层析分离时，所述淋洗包括具有第一浓度的氯化钠的所述缓冲液进行淋洗，之后用具有第二浓度的氯化钠的所述缓冲液进行淋洗，所述第二浓度高于所述第一浓度且二者的差值大于80mM。
11.根据权利要求10所述的分离纯化方法，其特征在于：通过第二层析柱进行层析分离时，所述第一浓度为350～450mM，所述第二浓度为450～550mM，所述洗脱用的缓冲液中氯化钠浓度为550～650mM。
12.一种外泌体溶液，其特征在于，所述外泌体溶液由权利要求1至11中任一项所述的分离纯化方法制备得到。
13.如权利要求12所述的外泌体溶液在生物医药或药物递送系统中的应用。
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