CN112048462B - 一种基于阴离子多聚物修饰基质的细胞外囊泡分离富集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种简易、低成本和通用性好的细胞外囊泡分离富集方法,其核心是通过静电相互作用实现对培养基、血浆、血清、尿液、唾液、乳液、胸腔积液和脑脊液等样本类型中细胞外囊泡的分离富集。该方法的实现方式为利用阴离子聚合物修饰基质材料在酸性条件下实现对细胞外囊泡的捕获,而在中性或者碱性条件下实现对前一步捕获细胞外囊泡的洗脱,最终达到分离富集细胞外囊泡的目的。该方法相较于现有细胞外囊泡分离富集方法具有分离过程简易、成本低、通用性好和与下游检测兼容性强的优点。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断及靶向载药领域,具体涉及一种细胞外囊泡分离富集方法。
背景技术
细胞外囊泡是一类由细胞分泌到细胞外空间的由磷脂双分子膜包裹的颗粒物,其直径在30nm~2000nm之间。其作为一种细胞间通讯载体广泛地分布于人体体液如血液、尿液、胸腔积液、唾液、腹水、乳液、鼻涕和脑脊液等当中2,3。有大量的研究证明,细胞外囊泡携带有各种蛋白、脂质、DNA、mRNA、microRNA和non-coding RNA等效应物分子,其通过这些效应物分子与邻近细胞及远端细胞实现信息的沟通和物质的交换1,4-6。近年来,越来越多的研究证实,细胞外囊泡在肿瘤发生发展中发挥非常重要作用,其既可以参与通过重构细胞外基质增进肿瘤细胞的侵染能力,又可以通过刺激内皮细胞促进周围血管的形成,还可以通过抑制免疫细胞而逃逸免疫细胞的杀伤7,8。David Lyden等人甚至发现胰腺导管腺癌分泌的细胞外囊泡能够在远端肝脏处诱发形成预转移灶9。另外有研究证明,细胞外囊泡有靶向载药的潜力和低的免疫排异反应的特点,其被认为是一种具有价值的靶向给药载体。随着对细胞外囊泡研究的一步步加深,人们越来越意识到细胞外囊泡在肿瘤诊断和靶向载药领域丰富的内涵和巨大的价值10,11。然而目前主流的细胞外囊泡分离方法复杂、纯度低、成本高和效率低等不足严重地阻碍了其在临床当中的推广和在学术研究中的拓展12。因此,临床实践和学术研究呼唤一种操作简单、通用性强、效率高和成本低的细胞外囊泡的分离富集技术。细胞外囊囊泡的亚型众多,如何有效地分类分离细胞外囊泡是细胞外囊泡研究的另外一大瓶颈。
目前,用于细胞外囊泡分离富集的方法主要有超速离心法、超微过滤法和免疫亲和捕获法等三大类。超速离心法被广泛应用到细胞外囊泡的分离当中,但是分离过程需要大型的超速离心机,大量杂蛋白和核酸被不可避免的共分离进而导致分离得到的细胞外囊泡纯度低,细胞外囊泡大小和密度的差异容易导致一些密度较低粒径较小的细胞外囊泡被丢弃,以及过高的离心力导致细胞外囊泡不可避免地损伤等一系列问题13。超微过滤法虽然能够分离得到纯度较高的细胞外囊泡,对设备的要求也相对简单,但是由于堵塞问题导致样品的捕获容量较小,又容易因剪切力导致细胞外囊泡不可避免的损伤,以及容易粘附在滤膜上进而导致分离效率降低13。免疫亲和捕获的方式具有分离效率高和特异性强的优势,但是有试剂成本高、捕获容量小和通用性差的不足。本发明涉及一种细胞外囊泡的非免疫的亲和分离方法,基于静电相互作用,依赖于修饰了阴离子多聚物基质,具有操作简单、成本低廉、通用性强和与下游检测兼容性强的特点。
文献引用:
(1)S,E.L.A.;Mager,I.;Breakefield,X.O.;Wood,M.J.Nat Rev Drug Discov2013,12,347-357.
(2)Asea,A.;Jean-Pierre,C.;Kaur,P.;Rao,P.;Linhares,I.M.;Skupski,D.;Witkin,S.S.J Reprod Immunol 2008,79,12-17.
(3)Lasser,C.;Alikhani,V.S.;Ekstrom,K.;Eldh,M.;Paredes,P.T.;Bossios,A.;Sjostrand,M.;Gabrielsson,S.;Lotvall,J.;Valadi,H.J Transl Med 2011,9.
(4)Gutierrez-Vazquez,C.;Villarroya-Beltri,C.;Mittelbrunn,M.;Sanchez-Madrid,F.Immunol Rev 2013,251,125-142.
(5)Meldolesi,J.Curr Biol 2018,28,R435-R444.
(6)Robbins,P.D.;Morelli,A.E.Nat Rev Immunol 2014,14,195-208.
(7)Xu,R.;Rai,A.;Chen,M.;Suwakulsiri,W.;Greening,D.W.;Simpson,R.J.NatRev Clin Oncol 2018.
(8)Becker,A.;Thakur,B.K.;Weiss,J.M.;Kim,H.S.;Peinado,H.;Lyden,D.Cancer Cell 2016,30,836-848.
(9)Costa-Silva,B.;Aiello,N.M.;Ocean,A.J.;Singh,S.;Zhang,H.Y.;Thakur,B.K.;Becker,A.;Hoshino,A.;Mark,M.T.;Molina,H.;Xiang,J.;Zhang,T.;Theilen,T.M.;Garcia-Santos,G.;Williams,C.;Ararso,Y.;Huang,Y.J.;Rodrigues,G.;Shen,T.L.;Labori,K.J.,et al.Nat Cell Biol 2015,17,816-+.
(10)Tkach,M.;Thery,C.Cell 2016,164,1226-1232.
(11)van den Boorn,J.G.;Schlee,M.;Coch,C.;Hartmann,G.Nat Biotechnol2011,29,325-326.
(12)Tkach,M.;Thery,C.Cell 2016,164,1226-1232.
(13)Li,P.;Kaslan,M.;Lee,S.H.;Yao,J.;Gao,Z.Q.Theranostics 2017,7,789-804.
发明内容
本发明的目的是提供一种基于静电相互作用的细胞外囊泡分离富集方法。该方法适用于培养基、血浆、血清、尿液、唾液、乳液、胸腔积液和脑脊液等样本类型中细胞外囊泡的分离。该方法具有分离过程简单、成本低廉和通用性强的优点。除此之外,该方法还能实现对于细胞外囊泡的分类分离。
为了克服目前细胞外囊泡分离方法的不足,实现上述技术目标,本发明采取了如下技术方案:
一种细胞外囊泡的分离富集方法,其核心在于利用细胞外囊泡表面电荷与阴离子多聚物修饰基质表面电荷之间的静电相互作用实现对培养基、血浆、血清、尿液、唾液、乳液、胸腔积液和脑脊液等样本中细胞外囊泡的分离和富集。
具体实现方式包括下述步骤:1)调整含细胞外囊泡的样本溶液的pH值为酸性,使得细胞外囊泡表面带有更多的正电荷,利用细胞外囊泡表面的正电荷与阴离子多聚物修饰基质表面的负电荷之间的静电吸附,实现对样品中的细胞外囊泡的捕获;2)采用中性或偏碱性的洗脱液,使得细胞外囊泡的表面带更多的负电荷,利用细胞外囊泡表面的负电荷与阴离子多聚物修饰基质表面的负电荷之间的静电排斥作用,将捕获到的细胞外囊泡从所述阴离子多聚物修饰基质表面洗脱下来,最终达到细胞外囊泡分离富集目的。
本发明还可进一步实现对不同类型细胞外囊泡的分类分离,其实现方式包括下述步骤:小幅度地调整捕获缓冲溶液的pH值,在不同的酸性pH值条件下捕获细胞外囊泡,经过洗脱,最终能够分离富集得到不同类型的细胞外囊泡;所述pH值的调整梯度为0.5。
本发明中捕获细胞外囊泡所需的酸性条件的实现方式如下:将样本溶液与捕获缓冲液按一定比例混合,致使样品溶液的pH发生改变,所述捕获缓冲溶液pH在3.5~6.5之间(如pH 3.8、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5),其可以是乙酸盐缓冲溶液或者MES缓冲溶液)。
进一步的,为了抑制细胞外囊泡中蛋白在酸性条件下的变性,所述捕获缓冲溶液中还包含有一定量的甜菜碱,其在捕获缓冲液中的浓度在100mM到2M之间。
更进一步的,为了提高细胞外囊泡的分离效率,所述捕获缓冲溶液中还包含有一定量的EDTA,其在捕获缓冲溶液中的浓度在10mM到200mM之间。
本发明细胞外囊泡的洗脱所需的中性或者碱性条件由洗脱缓冲溶液提供,所述洗脱缓冲溶液pH值在6.8~10.0之间,其可以是PBS、Tris-HCl缓冲溶液和NH4Ac溶液。
本发明中所述阴离子多聚物修饰基质中的阴离子多聚物包含海藻酸钠、硫酸软骨素、羧甲基葡聚糖、羧甲基琼脂糖、羧甲基纤维素和肝素等。
所述基质材料为阴离子多聚物提供必要的支撑,所述基质材料选自下述至少一种:玻璃纤维、磁珠、滤纸、玻璃珠和凝胶微球。
本发明中所述阴离子多聚物修饰基质可参照现有技术公开的方法进行制备。
本发明中基于阴离子多聚物修饰基底的细胞外囊泡的分离富集及分类分离方法,其辅助装置有三种类型:
磁珠型,以阴离子多聚物修饰磁珠作为分离介质,通过吹打或者旋转混匀的方式实现修饰磁珠与样品、清洗液和洗脱液的混匀,通过磁力实现修饰磁珠与样品溶液、清洗液和洗脱液的分离,经过样品中细胞外囊泡的捕获、清洗和洗脱三个步骤,即可实现样品中细胞外囊泡的分离富集。
离心柱型,通过离心力为试剂依次流过修饰基底材料提供动力,其关键结构是低端夹持有阴离子多聚物修饰基底材料的离心柱,通过离心即可实现细胞外囊泡的捕获、清洗和洗脱操作,最终实现样品中细胞外囊泡的分离富集。
芯片型,由蠕动泵、注射泵或气泵等为试剂流过滤纸提供动力,芯片的关键结构为固定有阴离子多聚物修饰基底的捕获腔室,在泵的驱动下完成对细胞外囊泡的捕获、清洗和洗脱,最终实现样品中细胞外囊泡的分离富集。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
该方法与现有技术相比,分离过程简单不需要大型的超速离心机,可实现对样品中细胞外囊泡的分类分离,可选择性的富集外泌体,分离产物纯度高,游离DNA污染少,与下游PCR检测的兼容性强,可直接加入到PCR体系中做扩增检测。
附图说明
图1为细胞外囊泡分离的机理图。
图2为经阴离子多聚物修饰滤纸分离细胞外囊泡的表征;A)经阴离子多聚物修饰滤纸分离细胞外囊泡透射电镜图;B)SDS-PAGE电泳图(M:标记物,1:海藻酸修饰玻璃纤维,2:硫酸软骨素修饰玻璃纤维,3:肝素修饰玻璃纤维);C)DNA琼脂糖凝胶电泳图(M:标记物,1:肝素修饰玻璃纤维,2:海藻酸修饰玻璃纤维,3:超速离心)。
图3为不同pH条件下经阴离子多聚物修饰滤纸分离细胞外囊泡的粒径分布。
图4为基于阴离子多聚物修饰基质的细胞外囊泡分离方法的辅助装置的结构示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明,但本发明并不局限于此,凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1.海藻酸钠修饰玻璃纤维用于细胞培养基中细胞外囊泡的分离
海藻酸钠修饰玻璃纤维离心柱的制作,采用化学修饰的方式将海藻酸钠固定到玻璃纤维表面。首先是玻璃纤维表面的活化,采用浓硫酸(98%)和双氧水按体积比7:3的比例混合液作为活化试剂。将滤纸放入一个经过反复清洗的玻璃器皿当中,将滤纸放入皿底,加入浓硫酸,然后在晃动的条件下按比例加入双氧水,室温条件反应30min,用去离子水充分清洗后烘干。将经过活化的玻璃纤维加入到质量分数1%的APTES溶液中,室温条件反应30min,去离子水充分清洗三遍,在80℃烘干2h以上。将海藻酸钠(10mg/ml)与EDC(0.8mg/ml)按体积比1:1混合,将处理过的玻璃纤维加入到海藻酸钠混合溶液当中,室温条件下反应2h,用去离子水充分清洗三次。将经过海藻酸钠处理的玻璃纤维在37℃过夜烘干,烘干后放入干燥塔中保存。需要使用前,将海藻酸钠修饰玻璃纤维切成合适的大小,嵌入到离心柱中即可用于培养基、血浆、血清等当中细胞外囊泡的分离。
细胞培养基的收集以及细胞及其碎片的去除。采用两步离心法实现分离,具体步骤如下:1、收集细胞培养基到15ml离心管中。2、预冷低速离心机,温度设置为4℃,待温度稳定后,放入离心管,800g离心5分钟,吸取上清血浆,转移至置于冰盒上的15ml离心管中,标记相应的样品编号;②预冷高速离心机,温度设置为4℃,待温度稳定后,放入15ml离心管,10,000g离心30分钟,吸取上清得到血浆,分装至置于冰盒上的15ml离心管中,标记样品编号,放入-80℃冰箱中长期保存直至细胞外囊泡的提取。
细胞外囊泡的分离,首先准备好海藻酸钠修饰玻璃纤维离心柱、捕获缓冲液(50mMEDTA、0.5%HAc和62.5mM LiAc,pH为4.5)和洗脱缓冲液(200mM Tris-HCL缓冲溶液,pH为8.0)。预冷低速离心机,温度设置为4℃,待温度稳定后,将前面一步分离得到培养基(通过离心处理的细胞培养基悬液)(2ml)与捕获缓冲液等体积混匀,静置30min后。将其加入到离心柱当中,200g离心10min。然后,加入500μl上述捕获缓冲液,静置1min,500g离心10min。取出离心管,将上清液丢弃,待温度升至室温之后,加入洗脱缓冲溶液(80μl),500g离心5min,12000g再次离心5min。吸取经过洗脱下来的溶液,分装至置于冰盒上的1ml EP管中,标记样品编号,放入-80℃冰箱中长期保存。
实施例2.肝素修饰玻璃纤维用于血浆中细胞外囊泡的分离
肝素修饰玻璃纤维离心柱的制作,采用化学修饰的方式将肝素固定到玻璃纤维表面。首先是玻璃纤维表面的活化,采用浓硫酸(98%)和双氧水按体积比7:3的比例混合液作为活化试剂。将滤纸放入一个经过反复清洗的玻璃器皿当中,将滤纸放入皿底,加入浓硫酸,然后在晃动的条件下按比例加入双氧水,室温条件反应30min,用去离子水充分清洗后烘干。将经过活化的玻璃纤维加入到1%的APTES溶液中,室温条件反应30min,去离子水充分清洗三遍,在80℃烘干2h以上。将肝素(10mg/ml)与EDC(0.8mg/ml)按体积比1:1混合,将处理过的玻璃纤维加入到肝素混合溶液当中,室温条件下反应2h,用去离子水充分清洗三次。将经过肝素处理的玻璃纤维在37℃过夜烘干,烘干后放入干燥塔中保存。需要使用前,将修饰玻璃纤维切成合适的大小,嵌入到离心柱中即可用于培养基、血浆、血清等当中细胞外囊泡的分离。
血液中血浆的分离,其同样采用两步离心法实现血浆的分离,具体步骤如下:①预冷低速离心机,温度设置为4℃,待温度稳定后,放入采血管,1600g离心15分钟,吸取上清血浆,转移至置于冰盒上的2.0ml EP管中,标记相应的样品编号;②预冷高速离心机,温度设置为4℃,待温度稳定后,放入2.0ml EP管,10,000g离心30分钟,吸取上清得到血浆,分装至置于冰盒上的2.0ml EP管中,标记样品编号,放入-80℃冰箱中长期保存直至细胞外囊泡的提取。
细胞外囊泡的分离,首先准备肝素修饰玻璃纤维离心柱、捕获缓冲液)(捕获缓冲溶液组成为2M甜菜碱、50mM EDTA、0.5%HAc和62.5mM LiAc,pH为5)和洗脱缓冲液(洗脱液为50mM Tris-HCL缓冲溶液,pH为9.0)。预冷低速离心机,温度设置为4℃,待温度稳定后,将前面一步分离得到血浆(2mL)与捕获缓冲液等体积混匀,静置30min后。将其加入到离心柱当中,8000g离心10min。然后,加入500μl捕获缓冲液,静置1min,8000g离心10min。取出离心管,待温度升至室温之后,加入洗脱缓冲溶液(100μl),静置5min之后,12000g再次离心3min。吸取经过洗脱下来的溶液,分装至置于冰盒上的1ml EP管中,标记样品编号,放入-80℃冰箱中长期保存。
实施例3.肝素修饰磁珠用于尿液中细胞细胞外囊泡的分离
肝素修饰磁珠的制作,采用化学修饰的方式将肝素固定到磁珠表面。首先是磁珠表面的活化,采用浓硫酸(98%)和双氧水按体积比7:3的比例混合液作为活化试剂。将磁珠放入一个经过反复清洗的玻璃器皿当中,将滤纸放入皿底,加入浓硫酸,然后在晃动的条件下按比例加入双氧水,室温条件反应30min,用去离子水充分清洗后烘干。将经过活化的磁珠加入到1%的APTES溶液中,室温条件反应30min,去离子水充分清洗三遍,在80℃烘干2h以上。将肝素(10mg/ml)与EDC(0.8mg/ml)按体积比1:1混合,将处理过的磁珠加入到肝素混合溶液当中,室温条件下反应2h,用去离子水充分清洗三次。将经过肝素处理的磁珠在37℃条件下过夜烘干,烘干后将修饰磁珠放置如玻璃瓶中,置于干燥塔中保存。
尿液中杂质的去除,其采用一步离心法实现尿液中杂质的去除,具体步骤如下:50ml尿液中加入1ml 200mM DTT溶液,直接用0.22μm的滤膜过滤,将过滤得到的溶液分装至置于冰盒上的15ml离心管中,标记样品编号,放入-80℃冰箱中长期保存直至细胞外囊泡的提取。
细胞外囊泡的分离,首先准备肝素修饰的磁珠、捕获缓冲液(捕获缓冲溶液组成为2M甜菜碱、50mM EDTA、0.5%HAc和62.5mM LiAc,pH为4.5)和洗脱缓冲液(洗脱液为200mMNH4Ac缓冲溶液,pH为7)。将前面一步分离得到尿液与捕获缓冲液等体积混匀,静置30min后。将肝素修饰磁珠加入到尿液捕获缓冲液混合液中,旋转混匀仪上混匀30min,磁铁吸附磁珠,将上清液丢弃,加入2mL捕获缓冲溶液,轻轻将磁珠悬浮后再次用磁铁将磁珠分离,弃掉上清,加入1ml洗脱缓冲液,将磁珠悬浮后静置10min,磁铁分离磁珠,收集上清,分装至置于冰盒上的1ml EP管中,标记样品编号,放入-80℃冰箱中长期保存。
实施例4.海藻酸钠修饰玻璃纤维用于血浆中细胞微囊泡的分类分离
海藻酸钠修饰玻璃纤维离心柱的制作,采用化学修饰的方式将海藻酸钠固定到玻璃纤维表面。首先是玻璃纤维表面的活化,采用浓硫酸(98%)和双氧水按体积比7:3的比例混合液作为活化试剂。将滤纸放入一个经过反复清洗的玻璃器皿当中,将滤纸放入皿底,加入浓硫酸,然后在晃动的条件下按比例加入双氧水,室温条件反应30min,用去离子水充分清洗后烘干。将经过活化的玻璃纤维加入到质量分数1%的APTES溶液中,室温条件反应30min,去离子水充分清洗三遍,在80℃烘干2h以上。将海藻酸钠(10mg/ml)与EDC(0.8mg/ml)按体积比1:1混合,将处理过的玻璃纤维加入到海藻酸钠混合溶液当中,室温条件下反应2h,用去离子水充分清洗三次。将经过海藻酸钠处理的玻璃纤维在37℃过夜烘干,烘干后放入干燥塔中保存。需要使用前,将海藻酸钠修饰玻璃纤维切成合适的大小,嵌入到离心柱中即可用于培养基、血浆、血清等当中细胞外囊泡的分离。
血液中血浆的分离,其同样采用两步离心法实现血浆的分离,具体步骤如下:①预冷低速离心机,温度设置为4℃,待温度稳定后,放入采血管,1600g离心15分钟,吸取上清血浆,转移至置于冰盒上的2.0ml EP管中,标记相应的样品编号;②预冷高速离心机,温度设置为4℃,待温度稳定后,放入2.0ml EP管,10,000g离心30分钟,吸取上清得到血浆,分装至置于冰盒上的2.0ml EP管中,标记样品编号,放入-80℃冰箱中长期保存直至细胞外囊泡的提取。
细胞外囊泡的分离,首先准备好海藻酸钠修饰玻璃纤维离心柱、捕获缓冲液(捕获缓冲溶液组成为2M甜菜碱、50mM EDTA、0.5%HAc和62.5mM LiAc,pH分别为5.0和5.5)和洗脱缓冲液(洗脱液为50mM Tris-HCL缓冲溶液,pH为9.0)。预冷低速离心机,温度设置为4℃,待温度稳定后,将前面一步分离得到血浆(1mL)与捕获缓冲液等体积混匀,静置30min后。将其加入到离心柱当中,8000g离心10min。然后,加入500μl捕获缓冲液,静置1min,8000g离心10min。取出离心管,待温度升至室温之后,加入洗脱缓冲溶液(100μl),静置5min之后,12000g再次离心3min。吸取经过洗脱下来的溶液,分装至置于冰盒上的1ml EP管中,标记样品编号,放入-80℃冰箱中长期保存。在pH为5.0和5.5两个pH条件下分离得到不同类型的细胞外囊泡,pH为5.0时,分离得到的是外泌体,pH为5.5时分离得到的细胞外囊泡中含有大量的免疫相关的蛋白。
Claims (7)
1.一种细胞外囊泡的分离富集方法,其特征在于:利用细胞外囊泡表面电荷与阴离子多聚物修饰基质表面电荷之间的静电相互作用实现对含细胞外囊泡的样本溶液中细胞外囊泡的分离和富集;
所述方法具体包括下述步骤:1)调整所述含细胞外囊泡的样本溶液的pH值为酸性,利用细胞外囊泡表面的正电荷与阴离子多聚物修饰基质表面的负电荷之间的静电吸附,实现对样本溶液中细胞外囊泡的捕获;2)采用中性或偏碱性的洗脱液,利用细胞外囊泡表面的负电荷与阴离子多聚物修饰基质表面的负电荷之间的静电排斥作用,将捕获到的细胞外囊泡从所述阴离子多聚物修饰基质表面洗脱下来,最终达到细胞外囊泡分离富集目的;
捕获细胞外囊泡所需的酸性条件的实现方式如下:将样本溶液与捕获缓冲液混合,致使样品溶液的pH值发生改变,所述捕获缓冲溶液pH在3.5~6.5之间,包括乙酸盐缓冲溶液;
所述中性或偏碱性的洗脱液的pH值在6.8~10.0之间,包括PBS、Tris-HCl缓冲溶液和NH4Ac溶液;
所述阴离子多聚物修饰基质中的阴离子多聚物包含下述至少一种:海藻酸钠、硫酸软骨素、羧甲基葡聚糖、羧甲基琼脂糖、羧甲基纤维素和肝素。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述方法能实现对细胞外囊泡的分类分离,具体包括下述步骤:在所述步骤1)中小幅度地调整捕获缓冲溶液的pH值,在不同的酸性pH值条件下捕获细胞外囊泡,经过洗脱,最终能够分离富集得到不同类型的细胞外囊泡;所述pH值的调整梯度为0.5。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述样本溶液选自下述任意一种:培养基、血浆、血清、尿液、唾液、乳液、胸腔积液和脑脊液。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述捕获缓冲溶液中还包含有甜菜碱,其在捕获缓冲液中的浓度在100 mM到2 M之间。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述捕获缓冲溶液中还包含有EDTA,其在捕获缓冲溶液中的浓度在10 mM到200 mM之间。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述基质为阴离子多聚物提供支撑,所述基质的材料选自下述至少一种:玻璃纤维、磁珠、滤纸、玻璃珠和凝胶微球。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其特征在于:所述方法采用的辅助装置包括下述三种类型:
1)磁珠型,以阴离子多聚物修饰磁珠作为分离介质,通过吹打或者旋转混匀的方式实现修饰磁珠与样品、清洗液和洗脱液的混匀,通过磁力实现修饰磁珠与样品溶液、清洗液和洗脱液的分离,经过样品中细胞外囊泡的捕获、清洗和洗脱三个步骤,实现样品中细胞外囊泡的分离富集;
2)离心柱型,通过离心力为试剂依次流过修饰基底材料提供动力,其关键结构是低端夹持有阴离子多聚物修饰基底材料的离心柱,通过离心实现细胞外囊泡的捕获、清洗和洗脱操作,最终实现样品中细胞外囊泡的分离富集;
3)芯片型,由蠕动泵、注射泵或气泵为试剂流过滤纸提供动力,芯片的关键结构为固定有阴离子多聚物修饰基底的捕获腔室,在泵的驱动下完成对细胞外囊泡的捕获、清洗和洗脱,最终实现样品中细胞外囊泡的分离富集。
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