CN112574950A - 一种细胞外泌体的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞外泌体的提取方法，在现有技术的基础上进行改进，将细胞培养后的培养基离心去除杂质，分离出培养上清液，并收集，将澄清的培养液真空冷冰干燥，向干粉中添加70mL缓冲液，有助于细胞融合，能够快速得到纯度较高的培养基，加热后在离心机中进行离心，采用多次离心的方法，分别加入了加等体积的预冷Thris‑饱和酸、5倍体积的预冷的0.1mol/L醋酸鞍甲醇溶液和5倍体积的外泌体提取液、5倍体积的100％乙醇溶液和5倍体积的外泌体提取液，助于细胞离心产物再次融合，在操作时，严格控制离心条件，不需要使用超滤离心等昂贵的提取方法，此离心提取的外泌体沉淀纯度更高，节省提取时间。

Description

一种细胞外泌体的提取方法
技术领域
本发明属于细胞外泌体的提取技术领域，更具体地说，尤其涉及一种细胞外泌体的提取方法。
背景技术
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。想要研究这个分布广泛的小不点可不是一件容易的事情，其中，最为困难的就是从体液或者细胞培养基中分离出高纯度的外泌体。外泌体的分离提取方法主要有：超速离心、免疫磁珠、超滤法、沉淀或试剂盒等方法。这些方法具体如下：
1、超速离心法(差速离心法)：超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行:即细胞培养上清液在300g，10min离心，沉淀，取细胞上清液；2000g离心10min去除死细胞沉淀，取上清液；再接着1000g，30min分离，沉淀，去除细胞碎片沉淀物，获得的上清在＞10000g，70min分离条件下，获得的沉淀为外泌体沉淀和其他干扰蛋白质，最后将这些沉淀再次用PBS洗涤，在＞100000g离心70min，沉淀即可得到外泌体。超速离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定(可能与转子类型有关)，纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。
2、密度梯度离心：该方法是将样本和不同蔗糖密度材料混合在一起离心。在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，以致使样品中的不同组分沉降到各自的等密度区，形成一种区带进而分离的方法。如实验中常用蔗糖密度梯度离心法是预先将两种浓度蔗糖溶液(如2.5M和0.25M)配成连续梯度体系置于超速离心管中，样本铺在蔗糖溶液上，100000g离心16h，外泌体会沉降到等密度区(1.10～1.18g/ml)。用此种方法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，产量少。在干细胞来源的外泌体提取相关专利未见报道。
3、超滤离心：由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法。
申请号为201710447410.4的中国专利公开了干细胞外泌体的分离方法，他们通过联合运用不同大小的浓缩管可以快速收集干细胞外泌体。即：通过对无菌的外泌体分别采用10KD超滤管进行4℃，3500～4500g离心35～45min后，将获得的浓缩液，再次将用新的10KD超滤管在常温条件下再次离心，条件为150000g，8～12min,收集浓缩液；最后则常温条件下(15～30℃)进一步采用900～1100g离心1.5～2.5min，收集管中获得的液体则为含高浓度干细胞外泌体的溶液。他们表明，他们提供的分离法法离心时间比超速离心时间短，可有效减少外泌体的机械损伤，更好的保留外泌体的活性。
4、磁珠免疫法：外泌体表面有其特异性标记物(如CD63、CD9蛋白)，用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。
5、PEG-base沉淀法：聚乙二醇(PEG)可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早先应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。利用PEG沉淀外泌体存在不少问题：比如纯度和回收率低，杂蛋白较多(假阳性)，颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外泌体等，因此发表文章时易受质疑。
6、试剂盒提取：近几年来，市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，有的是通过特殊设计的过滤器过滤掉杂质成分，有的则采用空间排阻色谱法(SEC)进行分离纯化，也有的则利用化合物沉淀将法外泌体沉淀出来。
虽然这些方法各有其特点，但是磁珠免疫法、PEG-base沉淀法和试剂盒提取方法仅适用小样本的外泌体提取，并不适用于大规模外泌体的收集。而蔗糖梯度离心的方法又相对费时，超滤离心需要不断更换滤膜。另外，这些方案均未针对各类样品进行特异性外泌体的分离优化，因此，如何发明一种能够提取出纯度较高的细胞外泌体方法来改善这些问题，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种细胞外泌体的提取方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明提供的一种细胞外泌体的提取方法，具体包括如下提取步骤：
S1：将细胞培养后的培养基离心去除杂质，分离出培养上清液，并收集；
S2：将澄清的培养液真空冷冰干燥，向干粉中添加70mL缓冲液，环境温度在65℃，加热10min；
S3：加热后在离心机中进行离心，参数为20000g，离心时间20min，并转移上清液；
S4：向下层沉淀中添加等体积的预冷Thris-饱和酸，室温下充分混合，并进行再次离心，回收下层沉淀物；
S5：向沉淀中添加5倍体积的预冷的0.1mol/L醋酸鞍甲醇溶液和5倍体积的外泌体提取液，重悬后置于-5℃冰箱中静置20min，在离心机中进行离心，参数为20000g，离心时间20min，并转移上清液；
S6：重复步骤S5操作三次，然后向沉淀中添加5倍体积的100％乙醇溶液和5倍体积的外泌体提取液，重悬后置于-5℃冰箱中静置30min，在离心机中进行离心，参数为20000g，离心时间20min，并转移上清液；
S7：将得到的外泌体沉淀加入PBS，用过滤膜过滤，得到需要的细胞外泌体；
S8：样品保存。
作为本技术方案的进一步优化，本发明一种细胞外泌体的提取方法，所述步骤S1中，采用动物腿骨组织，将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净，在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼，反复用PBS缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液，骨髓细胞悬液分离纯化后，将造血干细胞培养，培养于1ml无血清培养液中。
作为本技术方案的进一步优化，本发明一种细胞外泌体的提取方法，所述步骤S1中的无血清培养液中加入细胞因子，置于24孔培养板中，于5％CO2，37℃饱和湿度的CO2孵育箱中，每7天半量换液1次，3周后培养孔底铺满了基质细胞，得到培养基。
作为本技术方案的进一步优化，本发明一种细胞外泌体的提取方法，所述步骤S2中所述缓冲液由100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，2％SDS，1％2-疏基乙醇，5mmol/LEGTA，10mmol/LEDTA混合制成。
作为本技术方案的进一步优化，本发明一种细胞外泌体的提取方法，所述步骤S4中预冷的Thris-饱和酸pH8.O，室温充分混合时间为15min，离心环境温度在35-49℃，参数为20000g，离心时间20min。
作为本技术方案的进一步优化，本发明一种细胞外泌体的提取方法，所述步骤S7中所述过滤膜孔径为0.1um，中加入的PBS为200-240ul无菌PBS。
作为本技术方案的进一步优化，本发明一种细胞外泌体的提取方法，所述步骤S8中样品置-80℃环境下保存。
本发明的技术效果和优点：本发明一种细胞外泌体的提取方法，在现有技术的基础上进行改进，将细胞培养后的培养基离心去除杂质，分离出培养上清液，并收集，将澄清的培养液真空冷冰干燥，向干粉中添加70mL缓冲液，有助于细胞融合，能够快速得到纯度较高的培养基，加热后在离心机中进行离心，采用多次离心的方法，分别加入了加等体积的预冷Thris-饱和酸、5倍体积的预冷的0.1mol/L醋酸鞍甲醇溶液和5倍体积的外泌体提取液、5倍体积的100％乙醇溶液和5倍体积的外泌体提取液，助于细胞离心产物再次融合，在操作时，严格控制离心条件，不需要使用超滤离心等昂贵的提取方法，此离心提取的外泌体沉淀纯度更高，节省提取时间。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种细胞外泌体的提取方法，具体包括如下提取步骤：
S1：将细胞培养后的培养基离心去除杂质，分离出培养上清液，并收集，其中，该步骤S1中，采用动物腿骨组织，将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净，在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼，反复用PBS缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液，骨髓细胞悬液分离纯化后，将造血干细胞培养，培养于1ml无血清培养液中，所述步骤S1中的无血清培养液中加入细胞因子，置于24孔培养板中，于5％CO2，37℃饱和湿度的CO2孵育箱中，每7天半量换液1次，3周后培养孔底铺满了基质细胞，得到培养基，采用该造血干细胞培养方法，能够快速得到纯度较高的培养基，节省提取时间；
S2：将澄清的培养液真空冷冰干燥，向干粉中添加70mL缓冲液，环境温度在65℃，加热10min，其中，该步骤S2中所述缓冲液由100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，2％SDS，1％2-疏基乙醇，5mmol/LEGTA，10mmol/LEDTA混合制成，通过在澄清的培养液中添加缓冲液，有助于细胞融合；
S3：加热后在离心机中进行离心，参数为20000g，离心时间20min，并转移上清液，此步骤得到第一次离心产物，在操作时，严格控制离心条件；
S4：向下层沉淀中添加等体积的预冷Thris-饱和酸，室温下充分混合，并进行再次离心，回收下层沉淀物其中该步骤S4中预冷的Thris-饱和酸pH8.O，室温充分混合时间为15min，离心环境温度在35-49℃，参数为20000g，离心时间20min，通过加入预冷Thris-饱和酸，有助于细胞离心产物再次融合，此步骤得到第二次离心产物，在操作时，严格控制离心条件；
S5：向沉淀中添加5倍体积的预冷的0.1mol/L醋酸鞍甲醇溶液和5倍体积的外泌体提取液，重悬后置于-5℃冰箱中静置20min，在离心机中进行离心，参数为20000g，离心时间20min，并转移上清液，通过加入预冷醋酸鞍甲醇溶液，有助于细胞离心产物再次融合，此步骤得到第三次离心产物，在操作时，严格控制离心条件；
S6：重复步骤S5操作三次，在操作时，严格控制离心条件，然后向沉淀中添加5倍体积的100％乙醇溶液和5倍体积的外泌体提取液，重悬后置于-5℃冰箱中静置30min，在离心机中进行离心，参数为20000g，离心时间20min，并转移上清液，此步骤得到最终离心产物；
S7：将得到的外泌体沉淀加入PBS，用过滤膜过滤，得到需要的细胞外泌体，不需要使用超滤离心等昂贵的提取方法，此离心提取的外泌体沉淀纯度更高，其中，该步骤S7中所述过滤膜孔径为0.1um，中加入的PBS为200-240ul无菌PBS；
S8：样品保存，其中，该步骤S8中样品置-80℃环境下保存。
综上所述：本发明一种细胞外泌体的提取方法，在现有技术的基础上进行改进，将细胞培养后的培养基离心去除杂质，分离出培养上清液，并收集，将澄清的培养液真空冷冰干燥，向干粉中添加70mL缓冲液，有助于细胞融合，能够快速得到纯度较高的培养基，加热后在离心机中进行离心，采用多次离心的方法，分别加入了加等体积的预冷Thris-饱和酸、5倍体积的预冷的0.1mol/L醋酸鞍甲醇溶液和5倍体积的外泌体提取液、5倍体积的100％乙醇溶液和5倍体积的外泌体提取液，助于细胞离心产物再次融合，在操作时，严格控制离心条件，不需要使用超滤离心等昂贵的提取方法，此离心提取的外泌体沉淀纯度更高，节省提取时间。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种细胞外泌体的提取方法，其特征在于：具体包括如下提取步骤：
S1：将细胞培养后的培养基离心去除杂质，分离出培养上清液，并收集；
S2：将澄清的培养液真空冷冰干燥，向干粉中添加70mL缓冲液，环境温度在65℃，加热10min；
S3：加热后在离心机中进行离心，参数为20000g，离心时间20min，并转移上清液；
S4：向下层沉淀中添加等体积的预冷Thris-饱和酸，室温下充分混合，并进行再次离心，回收下层沉淀物；
S5：向沉淀中添加5倍体积的预冷的0.1mol/L醋酸鞍甲醇溶液和5倍体积的外泌体提取液，重悬后置于-5℃冰箱中静置20min，在离心机中进行离心，参数为20000g，离心时间20min，并转移上清液；
S6：重复步骤S5操作三次，然后向沉淀中添加5倍体积的100％乙醇溶液和5倍体积的外泌体提取液，重悬后置于-5℃冰箱中静置30min，在离心机中进行离心，参数为20000g，离心时间20min，并转移上清液；
S7：将得到的外泌体沉淀加入PBS，用过滤膜过滤，得到需要的细胞外泌体；
S8：样品保存。
2.根据权利要求1所述的一种细胞外泌体的提取方法，其特征在于：所述步骤S1中，采用动物腿骨组织，将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净，在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼，反复用PBS缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液，骨髓细胞悬液分离纯化后，将造血干细胞培养，培养于1ml无血清培养液中。
3.根据权利要求1所述的一种细胞外泌体的提取方法，其特征在于：所述步骤S1中的无血清培养液中加入细胞因子，置于24孔培养板中，于5％CO2，37℃饱和湿度的CO2孵育箱中，每7天半量换液1次，3周后培养孔底铺满了基质细胞，得到培养基。
4.根据权利要求1所述的一种细胞外泌体的提取方法，其特征在于：所述步骤S2中所述缓冲液由100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，2％SDS，1％2-疏基乙醇，5mmol/LEGTA，10mmol/LEDTA混合制成。
5.根据权利要求1所述的一种细胞外泌体的提取方法，其特征在于：所述步骤S4中预冷的Thris-饱和酸pH8.O，室温充分混合时间为15min，离心环境温度在35-49℃，参数为20000g，离心时间20min。
6.根据权利要求1所述的一种细胞外泌体的提取方法，其特征在于：所述步骤S7中所述过滤膜孔径为0.1um，中加入的PBS为200-240ul无菌PBS。
7.根据权利要求1所述的一种细胞外泌体的提取方法，其特征在于：所述步骤S8中样品置-80℃环境下保存。
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