CN112501112A - 一种快速提取组织胞外囊泡的分离富集方法 - Google Patents

一种快速提取组织胞外囊泡的分离富集方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种快速提取组织胞外囊泡的分离富集方法，包括：A、将目标组织用机械法切碎加入组织消化酶进行组织解离，所得组织解离液经过滤得到组织细胞悬液；B、对组织细胞悬液依次进行差速离心、超离、SEC排阻和超滤，进行组织胞外囊泡的富集纯化。本发明提供的组织胞外囊泡分离富集方法极大简化了分离组织胞外囊泡的步骤，节省了富集时间，全程只需要4～5h，所富集的胞外囊泡纯度高、可溶性杂蛋白污染小，实用性更加广泛，使用微量组织样本富集的胞外囊泡即可满足后续NTA、WB、电镜和转录组等分析。

Description

一种快速提取组织胞外囊泡的分离富集方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种快速提取组织胞外囊泡的分离富集方法。
背景技术
胞外囊泡是由不同细胞释放的30～150nm大小的脂质双层膜包被的颗粒。它们可以包裹和传递RNA、蛋白质等分子，作为细胞间通信的信使参与多种生理和病理途径。目前胞外囊泡已成功地从血液、尿液和唾液等体液中分离出来，但是从组织细胞间隙中分离到胞外囊泡的相关研究较少。组织间隙的胞外囊泡提取分离关键环节是剪切、酶解获得细胞悬液，这个过程会造成一定程度细胞结构的破坏，破裂的细胞会释放大量的脂质体、蛋白复合体、DNA、RNA、细胞器或细胞碎片等，与体液相比极大的增加了胞外囊泡纯化难度，而常规的体液胞外囊泡分离方法如标准的超离很难得到高纯度的胞外囊泡。
目前采用的分离组织胞外囊泡技术，例如免疫捕获法利用特异性抗体识别并分离胞外囊泡，特异性高，但是其价格昂贵，容易丢失抗原表达偏低的囊泡，且不适合处理大体积样本；蔗糖密度梯度离心法在消除细胞污染物方面非常有效，但该方法相对冗余耗时，需要技术人员非常熟练密度梯度离心操作过程，不同批次或不同操作人员间提取富集的胞外囊泡存在差异，造成提取的胞外囊泡质量不稳定。国内也有少量关于组织外泌体的研究，CN107523536A公开了一种组织来源外泌体的提取方法，基于酶裂解组织后直接进行外泌体提取，但需要使用PEG过夜沉降，提取外泌体最少需要1.5天，耗时较长，而且提取的外泌体中可能存在大量蛋白杂质；CN111621471A公开了一种软组织胞外囊泡的提取方法，软组织需要另外培养1～96h后再进行胞外囊泡的提取，过程繁琐且耗时长。
因此，亟需建立一种快速提取组织胞外囊泡的分离富集方法。
发明内容
本发明针对现有组织胞外囊泡提取时间长、纯度低、操作繁琐等技术上的缺陷和不足，提供一种基于酶解+差速离心+超速离心+分子排阻+超滤的快速提取组织胞外囊泡的分离富集方法。
为了实现本发明目的，本发明提供一种快速提取组织胞外囊泡的分离富集方法，包括以下步骤：
A、将目标组织用机械法切碎加入组织消化酶进行组织解离，所得组织解离液经过滤得到组织细胞悬液；
B、对所述组织细胞悬液依次进行差速离心、超离、SEC排阻和超滤，进行组织胞外囊泡的富集纯化。
其中，所述组织消化酶为消化酶H、消化酶R和消化酶A的混合酶，购自美天旎生物技术有限公司，货号为130-095-929。组织消化酶具有较强的酶解活性，适用于解离大多数肿瘤组织和多种类型组织。
步骤A包括：
A1、将冷冻的目标组织置于冰预冷的培养皿中，培养皿放置在干冰上；
A2、用刀片在干冰上放置的培养皿中切组织，得到组织切片；
A3、将组织切片转移到含有组织消化酶的离心管中，于35～38℃(优选37℃)孵育，期间振荡使组织完全解离，得到组织解离液；
A4、用50～100μm滤膜过滤上述组织解离液到新的离心管中，得到组织细胞悬液。
优选地，A2中所述组织切片大小为1～2mm3。
A3中所述组织消化酶的用量为1.5～4mL(优选2～3mL)；
A3中于35～38℃水浴孵育10～60min(优选37℃孵育20～40min，但不限于上述孵育时间，具体依组织解离状态而定)，每隔3～8min(优选5min)混合振荡一次。
步骤B包括：
B1、向所述组织细胞悬液中入20～40uL蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物可在胞外囊泡提取过程中有效保护蛋白质，该混合物购自赛默飞生物科技有限公司，货号为78442)，混匀，2～8℃200～1000g离心5～30min，收集上清液；
B2、将B1所得上清液转移到新的离心管中，2～8℃1000～5000g离心5～30min，收集上清液；
B3、将B2所得上清液转移到新的离心管中，2～8℃8000～15000g离心5～30min，收集上清液；
B4、将B3所得上清液用0.22μm滤膜过滤到超离管中，加入预冷的PBS至总体积10～18mL，2～8℃100000～150000g超离1.5～2.5h(优选4℃超离2h)；
B5、将超离管中的沉淀用0.5～2mL PBS溶解，得到初步纯化的组织胞外囊泡悬液；
B6、将上述组织胞外囊泡悬液加入到排阻色谱柱中，待液体流尽，加入2～3mLPBS，与此同时开始收集流出液；
B7、将B6中的流出液转移到超滤管中，4℃3000～5000g离心1～5min，留取截留液200～500uL，即为高纯度胞外囊泡。
优选地，B1中离心条件为：4℃300～600g离心10～20min。
优选地，B2中离心条件为：4℃2000～3000g离心10～20min。
优选地，B3中离心条件为：4℃10000～12000g离心10～20min。
本发明中进行SEC排阻所用排阻色谱柱优选来自北京恩泽康泰生物科技有限公司生产的外泌体纯化试剂盒Exosuper。
本发明中所述目标组织可来自胃癌组织、肝癌组织、脑癌组织、乳腺癌组织、肺癌组织、淋巴结癌组织、动脉粥样硬化组织，以及正常组织如肝组织、脑组织、肾组织、乳腺组织、肺组织、淋巴结组织、腹膜组织、心脏组织等，但不限于上述组织。
本发明提供的快速提取组织胞外囊泡的分离富集方法极大简化了分离组织胞外囊泡的步骤，节省了富集时间，而且所富集的胞外囊泡纯度高、可溶性杂蛋白污染小，实用性更加广泛，尤其是提取富集环节中的分子排阻方法可以避免EVs聚集，能够去除EVs中的可溶性蛋白杂质以获得更多的EVs。
采用本发明的快速提取组织胞外囊泡的分离富集方法，使用微量组织样本富集的胞外囊泡即可满足后续NTA、WB、电镜和转录组等分析。同时，组织外泌体分离富集可用于筛选疾病标志物或进行细胞增殖、凋亡侵袭、转移等后续实验，进一步挖掘疾病的信号通路机制，对疾病的鉴别诊断、预后复发监控、靶向载药治疗等具有重要意义。
附图说明
图1为本发明酶解工艺优化实验相关酶的胞外囊泡粒度分析图。
图2为本发明酶解工艺优化实验相关酶的胞外囊泡阴性蛋白Calnexin的WB结果。
图3为本发明较佳实施例中基于酶解+差速离心+超速离心+分子排阻+超滤分离富集的各种组织来源的胞外囊泡粒度分析图。
图4为本发明较佳实施例中基于酶解+差速离心+超速离心+分子排阻+超滤分离富集的各种组织来源的胞外囊泡透射电镜图。
图5为本发明较佳实施例中基于酶解+差速离心+超速离心+分子排阻+超滤分离富集的小鼠肝脏组织胞外囊泡的WB结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的组织消化酶购自美天旎生物技术有限公司，木瓜蛋白酶购自Worthington-biochemical公司，胶原蛋白酶D和DNase I购自上海罗氏制药有限公司，蛋白酶和磷酸酶抑制剂购自赛默飞生物科技有限公司。
实施例1酶解工艺优化实验
实验初期分别使用木瓜蛋白酶，胶原蛋白酶+DNase I，以及组织消化酶进行小鼠心脏组织的解离，通过实验结果对比选择了最优的组织消化酶，具体如下：
1.木瓜蛋白酶溶解方案：木瓜蛋白酶(Worthington-biochemical，LK003178)的用量为15～30U，所用木瓜蛋白酶液是将木瓜蛋白酶用Earle's平衡盐溶液(EBSS缓冲液)溶解，再添加Hibernate E培养基得到的；其中，Earle's平衡盐溶液与Hibernate E培养基的体积比为1:3，木瓜蛋白酶溶液的用量为3mL左右；木瓜蛋白酶的胞外囊泡粒度分析图如图1a所示，Calnexin蛋白的WB如图2中a所示，小鼠心脏组织的质量和BCA蛋白总量如表1所示。
2.胶原蛋白酶D和DNase I溶解方案：胶原蛋白酶D(上海罗氏制药有限公司，货号为11088858001)和DNase I(上海罗氏制药有限公司，货号为4536282001)用Earle's 平衡盐溶液(EBSS缓冲液)溶解，再添加Hibernate E培养基，Earle's平衡盐溶液与Hibernate E培养基的体积比为1:3，胶原蛋白酶D终浓度为24mg/mL，用量为0.5mL，DNase I终浓度为2000U/mL，用量为0.2mL；胶原蛋白酶D和DNase I的解胞外囊泡粒度分析图如图1b所示，Calnexin蛋白的WB如图2中b所示，小鼠心脏组织的质量和BCA蛋白总量如表1所示。
3.组织消化酶溶解方案：组织消化酶是消化酶H、消化酶R和消化酶A的混合酶，将消化酶H、消化酶R和消化酶A分别按照美天旎生物技术有限公司商品说明书中的方法用DMEM平衡盐溶液溶解，然后将消化酶H、消化酶R和消化酶A的DMEM平衡盐溶液按体积4:2:1的体积比混合。组织消化酶解胞外囊泡粒度分析图如图1c所示，Calnexin蛋白的WB如图2中c所示，小鼠心脏组织的质量和BCA蛋白总量如表1所示。
胞外囊泡的粒径范围为30～150nm，从图1可以明显观察到组织消化酶(图1c)的提取的胞外囊泡的粒径主峰范围在80～150nm之间，胞外囊泡质量较好，而木瓜蛋白酶和胶原蛋白酶D和DNase I(图1a和b)提取胞外囊泡的粒径主峰范围在100～300nm之间，多数为非胞外囊泡，因此胞外囊泡质量相对较差。
图2中Calnexin蛋白为内质网蛋白标志物(鉴定细胞来源蛋白污染程度)，Calnexin含量越少说明细胞来源蛋白污染程度越小，CK为小鼠细胞裂解物，图2中c的Calnexin几乎看不到，因此组织消化酶的细胞来源蛋白污染程度最小。
综上，将组织消化酶用于提取胞外囊泡效果最佳。
实施例2快速提取小鼠心脏组织胞外囊泡的富集方法
小鼠心脏组织胞外囊泡的富集方法，具体步骤如下：
1、用刀片将低温冷冻(-80℃)的组织切成1～2mm3大小；
2、组织切片转移到含有2.5mL组织消化酶解离液的离心管中，其中，组织消化酶的配制同实施例1；
3、将上述混合物放入37℃水浴，每隔5分钟混合一次，解离时间为30min，得到组织解离液，之后用70μm滤膜过滤上述组织解离液到新的离心管中，获得组织细胞悬液；
4、向组织细胞悬液中添加25uL蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物；
5、将步骤4的混合物于4℃300～600g离心10min，收集上清液；
6、将步骤5的上清液转移到新的离心管中，4℃2000～3000g离心10min，收集上清液；
7、将步骤6的上清液转移到新的离心管中，4℃10000～12000g离心10min，收集上清液；
8、将步骤7的上清液使用0.22μm滤膜过滤到超离管中，并补充预冷的PBS到14ml，4℃100000～150000g超离2h；
9、将超离管中的沉淀用1ml PBS溶解，获得初步纯化的组织胞外囊泡悬液；
10、超离所得胞外囊泡悬液加入到排阻柱中，待液体流尽，加入2.5mL PBS，与此同时开始收集流出液；
11、将流出液转移到超滤管中，4℃3000～5000g离心1～5min，整个提取过程共耗时4h，截留液即为高纯度小鼠心脏胞外囊泡。
图3a为小鼠心脏胞外囊泡的NTA结果，粒径浓度1.7×1010(Particles/mL)，粒径主峰134.7nm，主峰所占百分比96.0％(通常外泌体粒径介于30～150nm之间)，与外泌体粒径范围吻合。
图4a为小鼠心脏组织小鼠心脏胞外囊泡的TEM电镜结果，外泌体茶托装结构清晰可见，粒径与NTA结果吻合。
实施例3快速提取小鼠肝脏组织胞外囊泡的富集方法
小鼠肝脏组织胞外囊泡的富集方法，具体步骤如下：
1、用刀片将低温冷冻(-80℃)的组织切成1～2mm3大小；
2、组织切片转移到含有3mL组织消化酶解离液的离心管中，，其中，组织消化酶的配制同实施例1；
3、将上述混合物放入37℃水浴，每隔5分钟混合一次，解离时间为20min，得到组织解离液，之后用70μm滤膜过滤上述组织解离液到新的离心管中，获得组织细胞悬液；
4、向组织细胞悬液中添加30uL蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物；
5、将步骤4的混合物于4℃300～600g离心10min；
6、将步骤5的上清液转移到新的离心管中，4℃2000～3000g离心10min；
7、将步骤6的上清液转移到新的离心管中，4℃10000～12000g离心10min；
8、将步骤7的上清液使用0.22μm滤膜过滤到超离管中，并补充预冷的PBS到12ml，4℃100000～150000g超离2h；
9、将超离管中的沉淀以01ml PBS溶解，获得初步纯化的组织胞外囊泡悬液；
10、超离所得胞外囊泡悬液加入到排阻柱中，待液体流尽，加入2.5mL PBS，与此同时开始收集流出液；
11、将流出液转移到超滤管中，4℃3000～5000g离心1～5min，整个提取过程共耗时3.8h，截留液即为高纯度小鼠肝脏胞外囊泡。
图3b为小鼠肝脏胞外囊泡的NTA结果，粒径浓度5.4×1010(Particles/mL)，粒径主峰116.5nm，主峰所占百分比98.8％(通常外泌体粒径介于30～150nm之间)，与外泌体粒径范围吻合。
图4b为小鼠肝脏组织胞外囊泡的TEM电镜结果，外泌体茶托装结构清晰可见，粒径与NTA结果吻合。
图5为小鼠肝脏组织胞外囊泡的Western Blot(WB)检测结果，通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的外泌体样本进行着色，分析着色的位置和深度获得外泌体的阳性蛋白标志物CD9、TSG101、ALIX、CD63，外泌体阴性蛋白标志物Calnexin特定蛋白质的表达情况信息，图中清晰可见阳性蛋白标志物CD9、ALIX、CD63的表达，TSG101弱表达，阴性蛋白标志物Calnexin无表达。
实施例4快速提取小鼠肾脏组织胞外囊泡的富集方法
小鼠肾脏组织胞外囊泡的富集方法，具体步骤如下：
1、用刀片将低温冷冻(-80℃)的组织切成1～2mm3大小；
2、组织切片转移到含有3mL组织消化酶解离液的离心管中，其中，组织消化酶的配制同实施例1；
3、将上述混合物放入37℃水浴，每隔5分钟混合一次，解离时间为25min，得到组织解离液，之后用70μm滤膜过滤上述组织解离液到新的离心管中，获得组织细胞悬液；
4、向组织细胞悬液中添加30uL蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物；
5、将步骤4的混合物于4℃300～600g离心10min；
6、将步骤5的上清液转移到新的离心管中，4℃2000～3000g离心10min；
7、将步骤6的上清液转移到新的离心管中，4℃10000～12000g离心10min；
8、将步骤7的上清液使用0.22μm滤膜过滤到超离管中，并补充预冷的PBS到10ml，4℃100000～150000g超离2h；
9、将超离管中的沉淀以1ml PBS溶解，获得初步纯化的组织胞外囊泡悬液；
10、超离所得胞外囊泡悬液加入到排阻柱中，待液体流尽，加入2.5mL PBS，与此同时开始收集流出液；
11、将流出液转移到超滤管中，4℃3000～5000g离心1～5min，整个提取过程共耗时4.2h，截留液即为高纯度小鼠肾脏胞外囊泡。
图3c为小鼠肾脏胞外囊泡的NTA结果，粒径浓度3.6×1010(Particles/mL)，粒径主峰119.3nm，主峰所占百分比99.2％(通常外泌体粒径介于30～150nm之间)，与外泌体粒径范围吻合。
图4c为小鼠肾脏组织胞外囊泡的TEM电镜结果，外泌体茶托装结构清晰可见，粒径与NTA结果吻合。
实施例5快速提取人结肠癌组织胞外囊泡的富集方法
人结肠癌组织胞外囊泡的富集方法，具体步骤如下：
1、用刀片将低温冷冻(-80℃)的组织切成1～2mm3大小；
2、组织切片转移到含有2.5mL组织消化酶解离液的离心管中，其中，组织消化酶的配制同实施例1；
3、将上述混合物放入37℃水浴，每隔5分钟混合一次，解离时间为30min，得到组织解离液，之后用70μm滤膜过滤上述组织解离液到新的离心管中，获得组织细胞悬液；
4、向组织细胞悬液中添加25uL蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物；
5、将步骤4的混合物于4℃300～600g离心10min；
6、将步骤5的上清液转移到新的离心管中，4℃2000～3000g离心10min；
7、将步骤6的上清液转移到新的离心管中，4℃10000～12000g离心10min；
8、将步骤7的上清液使用0.22μm滤膜过滤到超离管中，并补充预冷的PBS到12ml，4℃100000～150000g超离2h；
9、将超离管中的沉淀以1ml PBS溶解，获得初步纯化的组织胞外囊泡悬液；
10、超离所得胞外囊泡悬液加入到排阻柱中，待液体流尽，加入2.5mL PBS，与此同时开始收集流出液；
11、将流出液转移到超滤管中，4℃3000～5000g离心1～5min，整个提取过程共耗时4h，截留液即为人结肠癌组织高纯度胞外囊泡。
图3d为人结肠癌胞外囊泡的NTA结果，粒径浓度5.8×1010(Particles/mL)，粒径主峰93.3nm，主峰所占百分比97.7％(通常外泌体粒径介于30～150nm之间)，与外泌体粒径范围吻合。
图4d为人结肠癌组织胞外囊泡的TEM电镜结果，外泌体茶托装结构清晰可见，粒径与NTA结果吻合。
实施例6快速提取人乳腺癌组织胞外囊泡的富集方法
人乳腺癌组织胞外囊泡的富集方法，具体步骤如下：
1、用刀片将低温冷冻(-80℃)的组织切成1～2mm3大小；
2、组织切片转移到含有2.5mL组织消化酶解离液的离心管中，其中，组织消化酶的配制同实施例1；
3、将上述混合物放入37℃水浴，每隔5分钟混合一次，解离时间为20min，得到组织解离液，之后用70μm滤膜过滤上述组织解离液到新的离心管中，获得组织细胞悬液；
4、向组织细胞悬液中添加25uL蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物；
5、将步骤4的混合物于4℃300～600g离心10min；
6、将步骤5的上清液转移到新的离心管中，4℃2000～3000g离心10min；
7、将步骤6的上清液转移到新的离心管中，4℃10000～12000g离心10min；
8、将步骤7的上清液使用0.22μm滤膜过滤到超离管中，并补充预冷的PBS到13ml，4℃100000～150000g超离2h；
9、将超离管中的沉淀以1.5ml PBS溶解，获得初步纯化的组织胞外囊泡悬液；
10、超离所得胞外囊泡悬液加入到排阻柱中，待液体流尽，加入2.5mL PBS，与此同时开始收集流出液；
11、将流出液转移到超滤管中，4℃3000～5000g离心1～5min，整个提取过程共耗时4.5h，截留液即为高纯度人乳腺癌组织胞外囊泡。
图3e为人乳腺癌胞外囊泡的NTA结果，粒径浓度7.8×1010(Particles/mL)，粒径主峰98.7nm，主峰所占百分比98.7％(通常外泌体粒径介于30～150nm之间)，与外泌体粒径范围吻合。
图4e为人乳腺癌组织胞外囊泡的TEM电镜结果，外泌体茶托装结构清晰可见，粒径与NTA结果吻合。
实施例7快速提取动脉粥样硬化组织胞外囊泡的富集方法
动脉粥样硬化组织胞外囊泡的富集方法，具体步骤如下：
1、用刀片将低温冷冻(-80℃)的组织切成1～2mm3大小；
2、组织切片转移到含有3mL组织消化酶解离液的离心管中，其中，组织消化酶的配制同实施例1；
3、将上述混合物放入37℃水浴，每隔5分钟混合一次，解离时间为40min，得到组织解离液，之后用70μm滤膜过滤上述组织解离液到新的离心管中，获得组织细胞悬液；
4、向组织细胞悬液中添加30uL，蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物；
5、将步骤4的混合物于4℃300～600g离心10min；
6、将步骤5的上清液转移到新的离心管中，4℃2000～3000g离心10min；
7、将步骤6的上清液转移到新的离心管中，4℃10000～12000g离心10min；
8、将步骤7的上清液使用0.22μm滤膜过滤到超离管中，并补充预冷的PBS到14ml，4℃100000～150000g超离2h；
9、将超离管中的沉淀以1ml PBS溶解，获得初步纯化的组织胞外囊泡悬液；
10、超离所得胞外囊泡悬液加入到排阻柱中，待液体流尽，加入2.5mL PBS，与此同时开始收集流出液；
11、将流出液转移到超滤管中，4℃3000～5000g离心1～5min，整个提取过程共耗时3.8h，截留液即为高纯度动脉粥样硬化组织胞外囊泡。
图3f为动脉粥样硬化胞外囊泡的NTA结果，粒径浓度1.2×1011(Particles/mL)，粒径主峰92.6nm，主峰所占百分比98.8％(通常外泌体粒径介于30～150nm之间)，与外泌体粒径范围吻合。
图4f为动脉粥样硬化组织胞外囊泡的TEM电镜结果，外泌体茶托装结构清晰可见，粒径与NTA结果吻合。
上述实施例中小鼠心脏、小鼠肝脏、小鼠肾脏、人结肠癌、人乳腺癌、人动脉粥样硬化组织的质量和BCA蛋白总量如表1所示。
表1
组织 质量/g BCA蛋白总量/ug
木瓜蛋白酶解离 0.3 58.6
胶原蛋白酶+DNase I解离 0.3 17.2
单细胞酶Mix解离 0.3 62.8
小鼠心脏 0.31 62.8
小鼠肝脏 0.35 49.7
小鼠肾脏 0.2 17.4
人结肠癌 0.54 32
人乳腺癌 0.4 47
人动脉粥样硬化组织 0.51 49.2
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种快速提取组织胞外囊泡的分离富集方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将目标组织用机械法切碎加入组织消化酶进行组织解离，所得组织解离液经过滤得到组织细胞悬液；
B、对所述组织细胞悬液依次进行差速离心、超离、SEC排阻和超滤，进行组织胞外囊泡的富集纯化；
其中，所述组织消化酶为消化酶H、消化酶R和消化酶A的混合酶；
步骤B包括：
B1、向所述组织细胞悬液中加入20～40uL蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，混匀，2～8℃200～1000g离心5～30min，收集上清液；
B2、将B1所得上清液转移到新的离心管中，2～8℃1000～5000g离心5～30min，收集上清液；
B3、将B2所得上清液转移到新的离心管中，2～8℃8000～15000g离心5～30min，收集上清液；
B4、将B3所得上清液用0.22μm滤膜过滤到超离管中，加入预冷的PBS至总体积10～18mL，2～8℃100000～150000g超离1.5～2.5h；
B5、将超离管中的沉淀用0.5～2mL PBS溶解，得到初步纯化的组织胞外囊泡悬液；
B6、将上述组织胞外囊泡悬液加入到排阻色谱柱中，待液体流尽，加入2～3mL PBS，与此同时开始收集流出液；
B7、将B6中的流出液转移到超滤管中，4℃3000～5000g离心1～5min，留取截留液200～500uL，即为高纯度组织胞外囊泡。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A包括：
A1、将冷冻的目标组织置于冰预冷的培养皿中，培养皿放置在干冰上；
A2、用刀片在干冰上放置的培养皿中切组织，得到组织切片；
A3、将组织切片转移到含有组织消化酶的离心管中，于35～38℃孵育，期间振荡使组织完全解离，得到组织解离液；
A4、用50～100μm滤膜过滤上述组织解离液到新的离心管中，得到组织细胞悬液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，A2中所述组织切片大小为0.5～5mm3。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，A3中所述组织消化酶的用量为1.5～4mL。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，A3中于35～38℃水浴孵育10～60min，每隔3～8min混合振荡一次。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述目标组织来自胃癌组织、肝癌组织、脑癌组织、乳腺癌组织、肺癌组织、淋巴结癌组织、动脉粥样硬化组织、胃组织、肝组织、脑组织、肾组织、乳腺组织、肺组织、淋巴结组织、腹膜组织、心脏组织。
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