CN114958750B - 一种从胰腺癌组织提取外泌体的方法 - Google Patents

Abstract

一种从胰腺癌组织提取外泌体的方法，包括如下步骤：(1)将胰腺癌组织剪切后，进行酶解消化，得到富含组织外泌体的酶解消化液；其中酶解消化的温度为37±0.1℃，在摇床转速为50±1rpm条件下消化30±1min；(2)将酶解消化液通过尺寸排组色谱法提取外泌体。本发明的方法最大程度地维持外泌体的完整性与得率；不依赖于大型仪器设备，在节约时间与经费的同时可获得高纯度的外泌体。

Description

一种从胰腺癌组织提取外泌体的方法

技术领域

本发明涉及肿瘤生物学领域，特别涉及一种从胰腺癌组织提取外泌体的方法。

背景技术

胰腺癌早期发现困难，可手术率低，预后差，整体5年生存率仅为10％，严重威胁人类健康。在过去的几十年里，得益于多种胰腺癌细胞系的建立与广泛体外研究，对胰腺癌的发生与进展有了更加深入的理解和认识，并带来了多种潜在有效的新疗法。然而在小鼠实验及早期临床试验中，大多数潜在有效的新疗法并未展现出与体外实验相同的有效性；究其原因，肿瘤微环境或许是限制胰腺癌治疗效果的重要原因。胰腺癌肿瘤微环境是包括胰腺癌细胞、肿瘤相关成纤维细胞、淋巴细胞、内皮细胞及多种胞外基质在内的集体，多种细胞或非细胞成分之间的分子及物质交流，显著地限制了胰腺癌化疗及免疫治疗效果，并加速了胰腺癌的病程发展。

目前已知的胞间交流的主要物质为胞泌蛋白、脂溶性代谢物质、及细胞外囊泡(外泌体)等。外泌体是一种细胞主动分泌的直径为80～160nm左右的胞外囊泡；由于磷脂双分子层的保护，外泌体内含核酸蛋白等物质可以在肿瘤微环境及机体循环中稳定存在，因此外泌体介导的胞间通讯，近年来逐渐受到科研人员的关注，并开始被被广泛研究。在临床研究中，血清/血浆是进行外泌体分离富集与标志物筛选的常用样本，并且已有大量基于血清/血浆外泌体的临床研究，显示了循环外泌体在疾病诊断、预后中的关键作用；此外，由临床样本测序得到的外泌体分子也为基础研究提供了大量研究课题，产生了很多胞间通讯相关的分子生物学研究结果。但是全身所有细胞均可以向血液循环中释放外泌体，单独提取血液中的外泌体进行分析或许会忽略一些关键的病变相关的外泌体分子；因此直接从病变组织中进行外泌体提取与分析，为外泌体的基础与临床研究提供了新的思路与策略。

目前组织外泌体的提取多集中在脑组织与黑色素瘤组织领域，尚无胰腺癌组织外泌体提取方法的报道。组织外泌体提取全过程包括临床样本取材与保存、组织酶解消化、消化液外泌体提取富集、外泌体形态学及蛋白分子水平验证；目前组织酶解所用消化酶、酶解时间、摇床转速没有准确的定论，且胰腺癌质地较脑组织与黑色素瘤组织更加坚硬与致密，不合适的酶解方法可能会导致组织酶解程度不足，或者外泌体膜破裂影响得率；目前在组织消化之后的外泌体提取方面，多采用差速离心法或试剂盒PEG沉淀法，差速离心法对设备要求高且耗时，PEG沉淀法常会引入酶解消化液中的其他蛋白污染；因此，如何快速从胰腺癌组织中提取并富集高纯度外泌体，依然是亟待解决的难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种从胰腺癌组织提取外泌体的方法，采用胶原酶D与DNA酶进行组织消化，最大程度地维持外泌体的完整性与得率，通过尺寸排阻色谱法进行外泌体收集，获得高纯度的外泌体。

本发明的方法包括如下步骤：

(1)将胰腺癌组织剪切后，进行酶解消化，得到富含组织外泌体的酶解消化液；其中酶解消化的温度为37±0.1℃，在摇床转速为50±1rpm条件下消化30±1min；

(2)将酶解消化液通过尺寸排组色谱法提取外泌体。

上述的步骤(1)中，剪切和酶解消化的方法为：

①在手术台上对胰腺癌组织进行剪切获得剪切样品，放入装有RPMI160培养基的无菌瓶中，作为备用样品；

②将备用样品再次剪切成组织块，放入EP管；

③向EP管加入RPMI1640培养基、胶原酶D储存液和DNA酶储存液；然后将EP管水平放置于摇床，进行酶解消化；

④完成酶解消化后，将EP管进行在2000g条件下离心，离心温度4±0.1℃，离心时间15±1min；所得上清液即为去除组织块的富含组织外泌体的酶解消化液。

上述的步骤①中，剪切样品的质量为0.2±0.01g。

上述的步骤①中，备用样品在30min内置于实验室生物安全柜储存。

上述的步骤②中，组织块尺寸为1±0.2mm³。

上述的步骤②中，EP管规格为2ml；放入EP管是用镊子夹入。

上述的步骤②中，RPMI1640培养基的加入量为1ml；胶原酶D(Collagenase D)储存液的加入量为20μl；DNA酶(DNase1)储存液的加入量为4μl。

上述的步骤③中，胶原酶D储存液的浓度为50～150mg/ml，DNA酶储存液的浓度为10000～30000U/ml。

上述的步骤④中，将上清液转移至规格为1.5ml的第二EP管。

上述的步骤(2)中，尺寸排组色谱法提取外泌体的方法为：

(Ⅰ)将酶解消化液进行在16500g条件下离心，离心温度4±0.1℃，离心时间20±1min，获得二次上清液；

(Ⅱ)将二次上清液经0.22μm滤器过滤后，获得的滤液加入尺寸排阻色谱柱；

(Ⅲ)当滤液完全进入尺寸排阻色谱柱后，加入PBS；其中PBS分成6～8次加入；前1～3次加入PBS后生成的馏分流空，后续5次加入PBS后生成的馏分全部收集，得到外泌体悬液。

上述的步骤(Ⅱ)中，尺寸排阻色谱柱用10ml琼脂糖凝胶CL-6B填充。

上述的步骤(Ⅱ)中，二次上清液的用量为1ml。

上述的步骤(Ⅲ)中，每次PBS的加入量为500μl～1ml。

上述的步骤(Ⅲ)中，外泌体悬液的收集量为每次PBS的加入量的5倍。

上述的步骤(Ⅲ)中，将外泌体悬液加入超滤离心管，在3800g条件下离心，离心温度4±0.1℃，离心时间5±1min，离心至固相为外泌体悬液总量的8～15％，获得的固相为浓缩胰腺癌组织外泌体悬液。

上述的超滤离心管为100KDa/4ml超滤离心管。

上述的浓缩胰腺癌组织外泌体悬液用于后续蛋白及RNA检测。

本发明的方法不同于现有技术多采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等消化组织的方法，采用胶原酶D与DNA酶进行组织消化，最大程度地维持外泌体的完整性与得率；同时，采用琼脂糖凝胶填充色谱分析柱，通过Western Blot检测各馏分中的外泌体Marker，确定外泌体富集馏分，通过尺寸排阻色谱法进行外泌体收集；不依赖于大型仪器设备，在节约时间与经费的同时可获得高纯度的外泌体。

附图说明

图1为本发明的流程示意图；

图2为本发明实施例1中的尺寸排阻色谱柱收集馏分的蛋白浓度-馏分曲线图和外泌体标志性蛋白的western blot图；其中，A为蛋白浓度-馏分曲线图；B为外泌体标志性蛋白的western blot图；

图3为本发明实施例1中的胰腺癌组织外泌体悬液电镜显微图、粒径分布图和外泌体标志性蛋白Western Blot鉴定图；图中，A为胰腺癌组织外泌体悬液电镜显微图；B为胰腺癌组织外泌体悬液粒径分布曲线图；C为外泌体标志性蛋白Western Blot鉴定图；

图4为本发明实施例1和对比例1、2、3的外泌体提取量和提取时间曲线图；图中，A为提取量，B为提取时间。

具体实施方式

本发明实施例中，加入PBS(组织消化液)后生成的馏分中，蛋白浓度在0.4～3微克/毫升的收集，全部收集的馏分作为外泌体悬液。

本发明实施例1中的Collagenase D储存液浓度为100mg/ml，由100mgCollagenase D溶于1mlHEPES缓冲液获得，-20℃分装保存；其中HEPES含有100mM NaCl，5mMKCl，1mM MgCl₂，1.8mM CaCl₂×2H₂O。

本发明实施例1中的DNase1储存液浓度为20000U/ml，由100mg溶于10ml Hank’sbalanced salt solution获得，-20℃分装保存

本发明实施例中的HEPES缓冲液为市购产品。

本发明实施例中的Hank’s balanced salt solution为市购产品。

本发明实施例中的PBS(磷酸缓冲盐溶液)为市购产品。

本发明实施例中的胰腺癌组织外泌体悬液可于-80℃长期保存。

本发明实施例中操作均在生物安全柜内进行，PBS等液体均为0.22μm滤器过滤后使用。

本发明实施例中尺寸排阻色谱柱在使用后可加入一倍柱床体积的PBS进行清洗，清洗后可继续进行下一个样本的外泌体提取，或加入20％乙醇后置于4℃冰箱保存。

实施例1

流程如图1所示；

在手术台上对离体胰腺癌组织进行剪切获得剪切样品，剪切样品的质量为0.2±0.01g；放入装有RPMI160培养基的无菌瓶中，作为备用样品；备用样品在30min内置于实验室生物安全柜储存；

将备用样品再次剪切成组织块，组织块尺寸为1±0.2mm³；放入EP管；EP管规格为2ml；放入EP管是用镊子夹入；

向EP管加入RPMI1640培养基、胶原酶D储存液和DNA酶储存液；RPMI1640培养基的加入量为1ml；胶原酶D储存液的加入量为20μl；DNA酶储存液的加入量为4μl；胶原酶D储存液的浓度为100mg/ml，DNA酶储存液的浓度为20000U/ml；

然后将EP管水平放置于摇床，进行酶解消化；其中酶解消化的温度为37±0.1℃，在摇床转速为50±1rpm条件下消化30±1min；完成酶解消化后，将EP管进行在2000g条件下离心，离心温度4±0.1℃，离心时间15±1min；所得上清液即为去除组织块的富含组织外泌体的酶解消化液；将上清液转移至规格为1.5ml的第二EP管；

将酶解消化液进行在16500g条件下离心，离心温度4±0.1℃，离心时间20±1min，获得二次上清液；

将二次上清液经0.22μm滤器过滤后，获得的滤液加入尺寸排阻色谱柱；其中尺寸排阻色谱柱用10ml琼脂糖凝胶CL-6B填充；二次上清液的用量为1ml；

当滤液完全进入尺寸排阻色谱柱后，加入PBS；其中PBS分成8次加入；各次的馏分分析结果如图2A所示，由图可见第3～7次馏分符合要求，由此确定后续实验时分成7次加入，前2次馏分流空，后续5次加入PBS后生成的馏分全部收集，得到外泌体悬液；

每次PBS的加入量为500μl；外泌体悬液的收集量为2.5ml；将外泌体悬液加入超滤离心管，在3800g条件下离心，离心温度4±0.1℃，离心时间5±1min，离心至固相为外泌体悬液总量的10％，获得的固相为浓缩胰腺癌组织外泌体悬液；

超滤离心管为100KDa/4ml超滤离心管；

浓缩胰腺癌组织外泌体悬液用于后续蛋白及RNA检测；

浓缩胰腺癌组织外泌体悬液电镜显微图、粒径分布图和外泌体标志性蛋白Western Blot鉴定图如图3所示，由图可见外泌体标志性蛋白在本方法所提取的外泌体悬液中更加富集，本方法所得外泌体悬液在蛋白水平质量合格；

外泌体提取量和提取时间曲线如图4所示。

对比例1

方法同实施例1，不同点在于：

酶解阶段采用20U/ml木瓜蛋白酶消化。

对比例2

方法同实施例1，不同点在于：

酶解阶段额外加入了0.2ml/ml的中性蛋白酶和3mmol/L的CaCl₂。

对比例3

方法同实施例1，不同点在于：

酶解消化液提取外泌体阶段采用差速离心法进行。

各对比例的外泌体提取量和提取时间曲线如图4所示；由图可见，(1)胰腺癌组织来源与取样重量和体积相同的前提下，Collagenase D与DNase1酶解消化比木瓜蛋白酶消化可以得到更多的组织外泌体的量；(2)胰腺癌组织来源与取样重量和体积相同的前提下，单纯Collagenase D与DNase1酶解消化比Collagenase D+DNase1+中性蛋白酶+CaCl₂酶解消化可以得到更多的组织外泌体的量，中性蛋白酶可能对于外泌体外膜有破坏和损伤作用；(3)与尺寸排阻色谱法相比，通过差速离心法提取胰腺癌组织外泌体所用时间更长且需要超高速离心机等大型贵重设备。

Claims (3)

1.一种从胰腺癌组织提取外泌体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将胰腺癌组织剪切后，进行酶解消化，得到富含组织外泌体的酶解消化液；其中酶解消化的温度为37±0.1℃，在摇床转速为50±1rpm条件下消化30±1min；

（2）将酶解消化液通过尺寸排组色谱法提取外泌体；

酶解消化的方法为：

①向EP管加入RPMI1640培养基、胶原酶 D储存液和DNA酶1储存液；然后将EP管水平放置于摇床，进行酶解消化；

②完成酶解消化后，将EP管进行在2000g条件下离心，离心温度4±0.1℃，离心时间15±1min；所得上清液即为去除组织块的富含组织外泌体的酶解消化液；

剪切样品的质量为0.2±0.01g；

RPMI1640培养基的加入量为1ml；胶原酶 D（Collagenase D）储存液的加入量为20µl；DNA酶1（DNase1）储存液的加入量为4µl；

胶原酶 D储存液的浓度为50～150mg/ml，DNA酶1储存液的浓度为10000～30000U/ml；

步骤（2）中尺寸排组色谱法提取外泌体的方法为：

（Ⅰ）将酶解消化液进行在16500g条件下离心，离心温度4±0.1℃，离心时间20±1min，获得二次上清液；

（Ⅱ）将二次上清液经0.22µm滤器过滤后，获得的滤液加入尺寸排阻色谱柱；所述尺寸排阻色谱柱用10ml琼脂糖凝胶CL-6B填充；

（Ⅲ）当滤液完全进入尺寸排阻色谱柱后，加入PBS；其中PBS分成6～8次加入；前1～3次加入PBS后生成的馏分流空，后续5次加入PBS后生成的馏分全部收集，得到外泌体悬液；

步骤（Ⅲ）中，每次PBS的加入量为500μl～1ml；外泌体悬液的收集量为每次PBS的加入量的5倍；

步骤（Ⅲ）中，将外泌体悬液加入超滤离心管，在3800g条件下离心，离心温度4±0.1℃，离心时间5±1min，离心至固相为外泌体悬液总量的8～15%，获得的固相为浓缩胰腺癌组织外泌体悬液。

2.根据权利要求1所述的一种从胰腺癌组织提取外泌体的方法，其特征在于，步骤（1）中，剪切的方法为：在手术台上对胰腺癌组织进行剪切获得剪切样品，放入装有RPMI160培养基的无菌瓶中，作为备用样品；将备用样品再次剪切成组织块，放入EP管。

3.根据权利要求2所述的一种从胰腺癌组织提取外泌体的方法，其特征在于，组织块尺寸为1±0.2mm³。