CN105820236A - 一种油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法 - Google Patents

一种油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，包括如下在步骤：(1)将螺旋藻采用反复冻融的方法破壁后收集上层清液得到藻蓝蛋白粗提液，(2)再向粗提液中加入油酸聚乙二醇酯和无机盐，经双水相萃取后分层，(3)取上相置于截留相对分子质量为5000的透析膜中透析20～30小时后得藻蓝蛋白水溶液，再于‑15～‑10℃冷冻干燥8～15小时得藻蓝蛋白粉末，其中油酸聚乙二醇酯中的PEG平均分子量为1000或2000。本发明对藻蓝蛋白的选择性高，分相容易且速度快，分配系数高，用设备常规，操作简便，分离效率高。藻蓝蛋白产品中纯度高，回收率91.2％以上。

Description

一种油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法
技术领域
本发明属于生化分离技术领域，具体涉及一种油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法。
背景技术
藻蓝蛋白(简称PC)为自然界少见的色素蛋白之一，其色彩亮丽(天蓝色)，水溶性良好，富含人类体内所需的八种必需的氨基酸，自身带有荧光，具有抗辐射、抗氧化、抗肿瘤以及无毒副作用等优势，因此在化妆品、食品、染料、医药等领域得到广泛的关注与应用。螺旋藻是一种富含蛋白质、维生素、必需氨基酸、矿物质和必需脂肪酸的丝状微藻，细胞壁有多糖类物质构成，易于消化吸收，PC在螺旋藻中主要以藻胆蛋白体的形式存在，其在螺旋藻中的含量高达10～20％，因此研究螺旋藻中藻蓝蛋白的分离提纯具有重大的医用和经济价值。
藻蓝蛋白传统分离纯化方法包括：(1)破碎细胞，制备藻蓝蛋白粗提液；(2)应用传统的分离技术纯化藻蓝蛋白，如离心、硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析、羟基磷灰石层析等。这些方法耗时、复杂，难以大规模制备藻蓝蛋白。双水相萃取技术近年来愈来愈得到研究者的青睐，其相对传统的分离纯化技术具有提纯效率高、设备常规、操作简便，适于大规模生产等优点，且不存在有机溶剂的残留问题，易于放大和连续操作，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低。双水相萃取是利用组分在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离的萃取技术。双水相萃取中使用的双水相是由两种互不相溶的高分子溶液或者互不相溶的盐溶液和高分子溶液组成。在PC的双水相萃取分离技术中，聚合物/盐系统的分离效果明显优于聚合物/聚合物系统，且聚合物/盐系统的分相时间短，体系成本低。
中国专利CN102993297A将螺旋藻粉悬浊液经细胞破碎后，再经硫酸铵分级盐析得到藻蓝蛋白粗提液1，加入PEG20000-NaCl进一步沉淀出高纯度的藻蓝蛋白粗提物，将粗提物采用磷酸盐缓冲液溶解后得藻蓝蛋白粗提液2，再将粗提液2经PEG20000/Na2SO4双水相体系萃取，萃取后的下相经透析除盐得藻蓝蛋白精提液，再冷冻干燥得藻蓝蛋白成品。该法操作在步骤繁多，所用PEG20000成本较高，不适于工业化生产。王巍杰(双水相萃取藻蓝蛋白的研究，食品工程·技术，2015,92-95)将螺旋藻细胞破碎所得粗提液采用PEG/酒石酸甲钠双水相体系分离纯化藻蓝蛋白，藻蓝蛋白粗提液加入双水相体系后，于漩涡混匀器上混合3min，静置30min，在2000r/min条件下离心1min，加速系统分相，并向体系中加入中性盐KCl增加藻蓝蛋白的分配系数和收率。该方法所采用双水相体系分相困难，分相时间较长，需要采用离心设备加速分相，增加了操作难度和经济成本。因此，开发一种在步骤简单，设备常规，分离效果好，分离效率高的双水相萃取分离藻蓝蛋白方法是亟待解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种双水相体系分相容易且速度快，分配系数高的油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法。
本发明解决技术问题所采用的技术方案为：本发明的一种油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，包括如下在步骤：
(1)反复冻融破壁：将螺旋藻粉加入水中浸泡6～8小时后，于-20℃下冷冻2～5小时后，再于25℃融化，如此反复冻融3～4次破壁，再将所得溶液离心处理，收集上清液即为含藻蓝蛋白的粗提液，通过冷冻使细胞膜的疏水键结构破裂,同时细胞内形成冰晶对细胞壁造成机械破裂，从而使得胞内藻蓝蛋白析出，并溶于水中，再通过离心去除不溶物得到含藻蓝蛋白的粗提液。
(2)双水相萃取：向在步骤(1)所得含藻蓝蛋白的粗提液中加入油酸聚乙二醇酯和无机盐，震荡混合后，静置8～15分钟，收集上相，所述油酸聚乙二醇酯中聚乙二醇PEG的平均分子量为1000或2000。
双水相萃取体系由互不相溶的油酸聚乙二醇酯和无机盐构成，利用藻蓝蛋白在油酸聚乙二醇酯和无机盐中的选择性分配，使其与粗提液中其他杂质分离(多糖和其他蛋白质)，从而达到分离纯化的目的。双水相体系中两相的极性差为分相速度的重要影响因素，低分子量的PEG有利于藻蓝蛋白分配系数的增加，但是双水相系统对藻蓝蛋白的选择性会降低，同时低分子量的PEG与无机盐的极性差较低，因此导致体系分相困难，分相速度较慢；高分子量的PEG虽与无机盐的极性差较高，体系分相速度快，但随着PEG平均分子量的增大，体系粘度增大，成相物质分子间的自由体积减小，空间位阻作用增强，阻碍PC分子进入PEG相。平均分子量为1000或2000的PEG所构成的双水相对藻蓝蛋白的选择性较好，采用油酸酯化改性PEG的部分端羟基，获得部分支化的PEG，使其在具有水溶性的同时，增大与无机盐的极性差，从而加快分相速度，不用离心即可成功分相，降低了操作难度，增加了纯化效率。
(3)成品制备：将在步骤(2)所得上相在截留相对分子质量为5000的透析膜中透析20～30小时后得藻蓝蛋白水溶液，再于-15～-10℃冷冻干燥8～15小时得藻蓝蛋白粉末。
进一步地，在步骤(1)中，螺旋藻粉与水的质量比为1:80～150。
进一步地，在步骤(2)中，无机盐为硫酸铵、硫酸钠或硫酸镁中的任意一种。
更进一步地，，在步骤(2)中，油酸聚乙二醇酯质量为双水相体系总质量的15～20％，无机盐质量为双水相体系总质量的8～12％，含藻蓝蛋白的粗提液的质量为双水相体系总质量的68～77％。不同浓度组成的双水相体系萃取效果不同，油酸聚乙二醇酯浓度过低，分相困难；随着油酸聚乙二醇酯浓度在一定范围内的增加，双水相体系两相差别较大，利于藻蓝蛋白在上相中富集，多糖在下相中富集，但是随着油酸聚乙二醇酯浓度继续增大，更多的杂蛋白进入上相，使上相中藻蓝蛋白的纯度降低。随着无机盐浓度在一定范围内的提高，物质在两相中界面张力增大，有利于藻蓝蛋白在上相富集，多糖在下相富集；当无机盐浓度更大时，上相体积逐渐减小，同时粘度逐渐增大，不利于藻蓝蛋白在上相的富集。
作为优选，在步骤(2)中，油酸聚乙二醇酯的制备方法为：将油酸、聚乙二醇和SO4 2-/ZrO2固体超强酸催化剂混合均匀后，于100～130℃下反应，反应过程中不断除去生成的水，直至反应液呈中性，停止反应，冷却至常温后，过滤，滤液蒸馏去除水分后即得油酸聚乙二醇酯。
进一步地，所述聚乙二醇为聚乙二醇1000或聚乙二醇2000中的任意一种。
进一步地，所述油酸与聚乙二醇的的质量比为1:8～10，所述固体超强酸催化剂的质量为聚乙二醇质量的0.05～0.12％。油酸与PEG的摩尔比决定了PEG的支化程度，支化程度过高则油酸聚乙二醇酯的水溶性下降；支化程度过低则不足以改善双水相体系的分相速度。支化程度要保证油酸聚乙二醇酯的水溶性适宜。
有益效果：本发明对藻蓝蛋白的选择性高，体系分相容易且速度快，分配系数高，用设备常规，操作简便，分离效率高，适合工业化生产。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明选用的油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相体系对藻蓝蛋白的选择性高，体系分相速度快，不需借助离心机等设备即可快速分相，且不需额外加入中性盐以提高藻蓝蛋白回收率。
(2)采用本发明所述方法制得藻蓝蛋白产品中藻蓝蛋白纯度高达(A620/A280)3.68，回收率高达91.2％。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
实施例1
本发明的一种油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，包括如下在步骤：
(1)油酸聚乙二醇酯的制备
将10g油酸、100gPEG1000和0.12gSO4 2-/ZrO2固体超强酸催化剂置于旋转蒸发仪中，混合均匀后，于100℃下反应，并减压分水，PH试纸检测反应液呈中性后，停止反应，冷却至常温后，过滤，滤液蒸馏去除水分后即得油酸聚乙二醇酯105.23g，FT-IR数据分析为3455cm-1(羟基吸收峰)，290cm-12、2859cm-1(甲基、亚甲基吸收峰)，1248cm-1(烯基酯吸收峰)，1050cm-1(伯醇吸收峰)，723cm-1(长链亚甲基吸收峰)，确定所制得物质为油酸聚乙二醇酯，且只有部分端羟基被酯化。
(2)反复冻融破壁
将1g螺旋藻粉加入100g去离子水中浸泡6小时后，于-20℃下冷冻3小时，再于25℃融化，如此反复冻融3次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液即为含藻蓝蛋白的粗提液，测得藻蓝蛋白纯度(A620/A280)为0.78。
(3)双水相萃取
取38.5g含藻蓝蛋白的粗提液、7.5g油酸聚乙二醇酯和4g硫酸铵加入分液漏斗中，震荡混合后，静置10分钟后分相，收集上相，将上相置于截留相对分子质量为5000的透析膜中透析20小时后得藻蓝蛋白水溶液，再于-15℃冷冻干燥10小时得藻蓝蛋白粉末，其中藻蓝蛋白的纯度为3.68，回收率为91.2％。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：本发明的一种油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，包括如下在步骤：
(1)油酸聚乙二醇酯的制备
将10g油酸、80gPEG2000和0.08gSO4 2-/ZrO2固体超强酸催化剂置于旋转蒸发仪中，混合均匀后，于110℃下反应，并减压分水，PH试纸检测反应液呈中性后，停止反应，冷却至常温后，过滤，滤液蒸馏去除水分后即得油酸聚乙二醇酯82.69g。
(2)反复冻融破壁
将1g螺旋藻粉加入80g去离子水中浸泡8小时后，于-15℃下冷冻2小时，再于25℃融化，如此反复冻融4次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液即为含藻蓝蛋白的粗提液，测得藻蓝蛋白纯度(A620/A280)为0.75。
(3)双水相萃取
取36g含藻蓝蛋白的粗提液、9g油酸聚乙二醇酯和5g硫酸钠加入分液漏斗中，震荡混合后，静置8分钟后分相，收集上相，将上相置于截留相对分子质量为5000的透析膜中透析25小时后得藻蓝蛋白水溶液，再于-10℃冷冻干燥8小时得藻蓝蛋白粉末，其中藻蓝蛋白的纯度为3.62，回收率为88.3％。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：本发明的一种油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，包括如下在步骤：
(1)油酸聚乙二醇酯的制备
将10g油酸、90gPEG1000和0.045gSO4 2-/ZrO2固体超强酸催化剂置于旋转蒸发仪中，混合均匀后，于130℃下反应，并减压分水，PH试纸检测反应液呈中性后，停止反应，冷却至常温后，过滤，滤液蒸馏去除水分后即得油酸聚乙二醇酯92.33g。
(2)反复冻融破壁
将1g螺旋藻粉加入150g去离子水中浸泡7小时后，于-18℃下冷冻5小时，再于25℃融化，如此反复冻融3次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液即为含藻蓝蛋白的粗提液，测得藻蓝蛋白纯度(A620/A280)为0.73。
(3)双水相萃取
取34g含藻蓝蛋白的粗提液、10g油酸聚乙二醇酯和6g硫酸镁加入分液漏斗中，震荡混合后，静置15分钟后分相，收集上相，将上相置于截留相对分子质量为5000的透析膜中透析30小时后得藻蓝蛋白水溶液，再于-12℃冷冻干燥15小时得藻蓝蛋白粉末，其中藻蓝蛋白的纯度为3.53，回收率为86.7％。
对比例1
将1g螺旋藻粉加入100g去离子水中浸泡6小时后，于-20℃下冷冻3小时，再于25℃融化，如此反复冻融3次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液即为含藻蓝蛋白的粗提液，测得藻蓝蛋白纯度(A620/A280)为0.78。取38.5g含藻蓝蛋白的粗提液、7.5gPEG1000和4g硫酸铵加入分液漏斗中，震荡混合后，静置1小时后溶液不分层。
对比例2-5
与对比例1的操作方法相同，所用物质比例相同，不同的是PEG平均分子量，所得实验结果见表1：
表1
通过对比对比例1-5和实施例1，可以发现：PEG1000和PEG2000经油酸酯化改性后，更有利于体系分相，且所得藻蓝蛋白的纯度和回收率更高。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，其特征在于包括如下在步骤：
(1)反复冻融破壁：将螺旋藻粉加入水中浸泡6～8小时后，于-20℃下冷冻2～5小时后，再于25℃融化，如此反复冻融3～4次破壁，再将所得溶液离心处理，收集上清液即为含藻蓝蛋白的粗提液；
(2)双水相萃取：向在步骤(1)所得含藻蓝蛋白的粗提液中加入油酸聚乙二醇酯和无机盐，震荡混合后，静置8～15分钟，收集上相；
(3)成品制备：将在步骤(2)所得上相在截留相对分子质量为5000的透析膜中透析20～30小时后得藻蓝蛋白水溶液，再于-15～-10℃冷冻干燥8～15小时得藻蓝蛋白粉末。
2.根据权利要求1所述的油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述螺旋藻粉与水的质量比为1:80～150。
3.根据权利要求1所述的油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述无机盐为硫酸铵、硫酸钠或硫酸镁中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述油酸聚乙二醇酯中的聚乙二醇平均分子量为1000或2000。
5.根据权利要求1或3所述的油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述油酸聚乙二醇酯质量为双水相体系总质量的15～20％，无机盐质量为双水相体系总质量的8～12％，含藻蓝蛋白的粗提液的质量为双水相体系总质量的68～77％。
6.根据权利要求1所述的油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述油酸聚乙二醇酯的制备方法为：将油酸、聚乙二醇和SO4 2-/ZrO2固体超强酸催化剂混合均匀后，于100～130℃下反应，反应过程中不断除去生成的水，直至反应液呈中性，停止反应，冷却至常温后，过滤，滤液蒸馏去除水分后即得油酸聚乙二醇酯。
7.根据权利要求6所述的油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，其特征在于：所述聚乙二醇为聚乙二醇1000或聚乙二醇2000中的任意一种。
8.根据权利要求6所述的油酸聚乙二醇酯/无机盐双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，其特征在于：所述油酸与聚乙二醇的质量比为1:8～10，所述固体超强酸催化剂的质量为聚乙二醇质量的0.05～0.12％。
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