CN106008705A - 一种双水相萃取-超声波联合分离提纯藻蓝蛋白的方法 - Google Patents

一种双水相萃取-超声波联合分离提纯藻蓝蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种双水相萃取‑超声波联合分离提纯藻蓝蛋白的方法，具体操作步骤为：将螺旋藻采用反复冻融的方法破壁后收集上层清液得到藻蓝蛋白粗提液，再采用葡聚糖‑无机盐双水相萃取，并置于超声波中超声15‑30分钟，再静置10‑15分钟，取上相在截留相对分子质量为5000的透析膜中透析12‑20小时后，再经冷冻干燥得藻蓝蛋白粉末。本发明双水相萃取和超声波联合的方法对藻蓝蛋白进行提纯，具有选择性高，体系分相速度快的优点，且操作简便，设备常规，适合工业化生产。本发明所述方法制得藻蓝蛋白粉末中藻蓝蛋白纯度高达(A620/A280)3.78，总收率高达90.6％。

Description

一种双水相萃取-超声波联合分离提纯藻蓝蛋白的方法
技术领域
本发明属于生化分离技术领域，涉及一种藻蓝蛋白的分离提纯方法，尤其涉及一种双水相萃取-超声波联合分离提纯藻蓝蛋白的方法。
背景技术
藻蓝蛋白(简称PC)为自然界少见的色素蛋白之一，其色彩亮丽(天蓝色)，水溶性良好，富含人类体内所需的八种必需的氨基酸，自身带有荧光，具有抗辐射、抗氧化、抗肿瘤以及无毒副作用等优势，因此在化妆品、食品、染料、医药等领域得到广泛的关注与应用。螺旋藻是一种富含蛋白质、维生素、必需氨基酸、矿物质和必需脂肪酸的丝状微藻，细胞壁有多糖类物质构成，易于消化吸收，PC在螺旋藻中主要以藻胆蛋白体的形式存在，其在螺旋藻中的含量高达10～20％，因此研究螺旋藻中藻蓝蛋白的分离提纯具有重大的医用和经济价值。
藻蓝蛋白传统分离纯化方法包括：(1)破碎细胞，制备藻蓝蛋白粗提液；(2)应用传统的分离技术纯化藻蓝蛋白，如离心、硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析、羟基磷灰石层析等。这些方法耗时、复杂，难以大规模制备藻蓝蛋白。双水相萃取技术近年来愈来愈得到研究者的青睐，其相对传统的分离纯化技术具有提纯效率高、设备常规、操作简便，适于大规模生产等优点，且不存在有机溶剂的残留问题，易于放大和连续操作，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低。双水相萃取是利用组分在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离的萃取技术。双水相萃取中使用的双水相是由两种互不相溶的高分子溶液或者互不相溶的盐溶液和高分子溶液组成。在PC的双水相萃取分离技术中，聚合物/盐系统的分离效果明显优于聚合物/聚合物系统，且聚合物/盐系统的分相时间短，体系成本低。
中国专利CN 102993297A将螺旋藻粉悬浊液经细胞破碎后，再经硫酸铵分级盐析得到藻蓝蛋白粗提液1，加入PEG20000-NaCl进一步沉淀出高纯度的藻蓝蛋白粗提物，将粗提物采用磷酸盐缓冲液溶解后得藻蓝蛋白粗提液2，再将粗提液2经PEG20000/Na2SO4双水相体系萃取，萃取后的下相经透析除盐得藻蓝蛋白精提液，再冷冻干燥得藻蓝蛋白成品。该法操作步骤繁多，所用PEG20000成本较高，不适于工业化生产。王巍杰(双水相萃取藻蓝蛋白的研究，食品工程·技术，2015,92-95)将螺旋藻细胞破碎所得粗提液采用PEG/酒石酸甲钠双水相体系分离纯化藻蓝蛋白，藻蓝蛋白粗提液加入双水相体系后，于漩涡混匀器上混合3min，静置30min，在2000r/min条件下离心1min，加速系统分相，并向体系中加入中性盐KCl增加藻蓝蛋白的分配系数和收率。该方法所采用双水相体系分相困难，分相时间较长，需要采用离心设备加速分相，增加了操作难度和经济成本。因此，开发一种步骤简单，设备常规，分离效果好，分离效率高的双水相萃取分离藻蓝蛋白方法是亟待解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种双水相萃取-超声波联合分离提纯藻蓝蛋白的方法，所用设备常规，操作简便，分离效率高，适合工业化生产。
本发明解决技术问题所采用的技术方案为：
一种双水相萃取-超声波联合分离提纯藻蓝蛋白，包括如下步骤：
(1)粗提液制备：将螺旋藻粉加入水中浸泡6～8小时后，于-20℃下冷冻2～5小时后，再于25℃融化，如此反复冻融3～4次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液即为含藻蓝蛋白的粗提液，通过冷冻使细胞膜的疏水键结构破裂,同时细胞内形成冰晶对细胞壁造成机械破裂，从而使得胞内藻蓝蛋白析出，并溶于水中，再通过离心去除不溶物得到含藻蓝蛋白的粗提液。
(2)双水相萃取：向步骤(1)所得向步骤(1)所得含藻蓝蛋白的粗提液中加入葡聚糖和无机盐，震荡混合后，置于超声波中超声15-30分钟，再静置10-15分钟，收集上相。双水相萃取体系由互不相溶的葡聚糖和无机盐构成，利用藻蓝蛋白在葡聚糖和无机盐中的选择性分配，使其与粗提液中其他杂质分离，从而达到分离纯化的目的。然而单纯双水相萃取分相速度较慢，通常需要静置4-6小时后，再在离心作用下才能分相，且所得藻蓝蛋白的纯度不高。本发明在加入双水相萃取液的同时，辅以超声作用，能够加快分子运动，从而加快分相速度，提高体系的分配系数，在短时间内获得藻蓝蛋白含量较高的上相。
(3)成品制备：将步骤(2)所得上相在截留相对分子质量为5000的透析膜中透析12-20小时后得藻蓝蛋白水溶液，再于-15～-10℃冷冻干燥12-20小时得藻蓝蛋白粉末。
作为优选，步骤(1)中所述螺旋藻粉与水的质量比为1:80～120。
作为优选，步骤(2)中无机盐为硫酸铵、硫酸钠或硫酸镁中的一种。
作为优选，步骤(2)中所述葡聚糖质量为双水相体系总质量的18-25％，无机盐质量为双水相体系总质量的12-16％，含藻蓝蛋白的粗提液的质量为双水相体系总质量的59-68％。不同浓度组成的双水相体系萃取效果不同，葡聚糖浓度过低，分相困难；随着葡聚糖浓度在一定范围内的增加，双水相体系两相差别较大，利于藻蓝蛋白在上相中富集，其他水溶性杂质在下相中富集，但是随着葡聚糖浓度继续增大，更多的杂质进入上相，使上相中藻蓝蛋白的纯度降低。随着无机盐浓度在一定范围内的提高，物质在两相中界面张力增大，有利于藻蓝蛋白在上相富集，杂质在下相富集；当无机盐浓度更大时，上相体积逐渐减小，同时粘度逐渐增大，不利于藻蓝蛋白在上相的富集。
本发明的有益效果为：
1、本发明选用双水相萃取和超声波联合的方法对粗体液进行提纯，对藻蓝蛋白的选择性高，体系分相速度快，不需借助离心机等设备即可快速分相。
2、采用本发明所述方法制得藻蓝蛋白粉末中藻蓝蛋白纯度高达(A620/A280)3.78，总收率高达90.6％。
4、本发明所采用的分离纯化方法，操作简便，设备常规，适合工业化生产。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
实施例1
(1)粗提液的制备
将1g螺旋藻粉加入100g去离子水中浸泡6小时后，于-20℃下冷冻3小时，再于25℃融化，如此反复冻融3次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液即为含藻蓝蛋白的粗提液，测得藻蓝蛋白纯度(A620/A280)为0.78。
(2)双水相萃取
取33.5g含藻蓝蛋白的粗提液、9g葡聚糖和7.5g硫酸铵加入锥形瓶中，震荡混合后，置于超声波中超声30分钟，静置10分钟后分相，收集上相，将上相置于截留相对分子质量为5000的透析膜中透析20小时后得藻蓝蛋白水溶液，再于-15℃冷冻干燥12小时得13.2g藻蓝蛋白粉末，其中藻蓝蛋白的纯度为3.65，回收率为88.9％。
实施例2
(1)粗提液的制备
将1g螺旋藻粉加入80g去离子水中浸泡8小时后，于-15℃下冷冻2小时，再于25℃融化，如此反复冻融4次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液即为含藻蓝蛋白的粗提液，测得藻蓝蛋白纯度(A620/A280)为0.75。
(2)双水相萃取
取34g含藻蓝蛋白的粗提液、10g葡聚糖和6g硫酸铵加入锥形瓶中，震荡混合后，置于超声波中超声20分钟，静置12分钟后分相，收集上相，将上相置于截留相对分子质量为5000的透析膜中透析12小时后得藻蓝蛋白水溶液，再于-15℃冷冻干燥15小时得14.6g藻蓝蛋白粉末，其中藻蓝蛋白的纯度为3.78，回收率为90.6％。
实施例3
(1)粗提液的制备
将1g螺旋藻粉加入150g去离子水中浸泡7小时后，于-18℃下冷冻5小时，再于25℃融化，如此反复冻融3次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液即为含藻蓝蛋白的粗提液，测得藻蓝蛋白纯度(A620/A280)为0.73。
(2)双水相萃取
取29.5g含藻蓝蛋白的粗提液、12.5g葡聚糖和8g硫酸镁加入锥形瓶中，震荡混合后，置于超声波中超声10分钟，静置15分钟后分相，收集上相，将上相置于截留相对分子质量为5000的透析膜中透析18小时后得藻蓝蛋白水溶液，再于-15℃冷冻干燥15小时得13.2g藻蓝蛋白粉末，其中藻蓝蛋白的纯度为3.50，回收率为89.3％。
比较例1
(1)粗提液的制备
将1g螺旋藻粉加入80g去离子水中浸泡8小时后，于-15℃下冷冻2小时，再于25℃融化，如此反复冻融4次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液即为含藻蓝蛋白的粗提液，测得藻蓝蛋白纯度(A620/A280)为0.75。
(2)双水相萃取
取34g含藻蓝蛋白的粗提液、10g葡聚糖和6g硫酸铵加入分液漏斗中，震荡混合后，静置15分钟后不分相，继续静置4小时候，需离心才能分相。
通过对比比较例1和实施例2，可以发现，双水相萃取联合超声处理能够加快双水相萃取体系的分相速度，提高产品纯度和收率。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (4)

1.一种双水相萃取-超声波联合分离提纯藻蓝蛋白的方法，其特征在于，所述分离提纯藻蓝蛋白的方法包括如下步骤：
(1)粗提液制备：将螺旋藻粉加入水中浸泡6～8小时后，于-20℃下冷冻2～5小时后，再于25℃融化，如此反复冻融3～4次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液即为含藻蓝蛋白的粗提液；
(2)双水相萃取：向步骤(1)所得含藻蓝蛋白的粗提液中加入葡聚糖和无机盐，震荡混合后，置于超声波中超声15-30分钟，再静置10-15分钟，收集上相；
(3)成品制备：将步骤(2)所得上相在截留相对分子质量为5000的透析膜中透析12-20小时后得藻蓝蛋白水溶液，再于-15～-10℃冷冻干燥12-20小时得藻蓝蛋白粉末。
2.如权利要求1所述分离提纯藻蓝蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中所述螺旋藻粉与水的质量比为1:80～120。
3.如权利要求1所述分离提纯藻蓝蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中所述无机盐为硫酸铵、硫酸钠或硫酸镁中的一种。
4.如权利要求1所述分离提纯藻蓝蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中所述葡聚糖质量为双水相体系总质量的18-25％，无机盐质量为双水相体系总质量的12-16％，含藻蓝蛋白的粗提液的质量为双水相体系总质量的59-68％。
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