CN105925554A - 一种双水相萃取-超声波联合分离提纯木瓜蛋白酶的方法 - Google Patents

一种双水相萃取-超声波联合分离提纯木瓜蛋白酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种双水相萃取‑超声波联合分离提纯木瓜蛋白酶的方法，具体操作步骤为：将木瓜汁采用反复冻融的方法破壁后收集上层清液得到木瓜蛋白酶粗提液，再采用羟甲基纤维素钠‑无机盐双水相萃取，并置于超声波中超声15‑20分钟，再静置8‑15分钟，取上相在截留相对分子质量为5000的透析膜中透析12‑20小时后，再经冷冻干燥得木瓜蛋白酶粉末。本发明双水相萃取和超声波联合的方法对木瓜蛋白酶进行提纯，具有选择性高，体系分相速度快的优点，且操作简便，设备常规，适合工业化生产。本发明所述方法制得木瓜蛋白酶末中木瓜蛋白酶纯度高达97.1％，总收率高达84.2％。

Description

一种双水相萃取-超声波联合分离提纯木瓜蛋白酶的方法
技术领域
本发明属于生化分离技术领域，涉及一种木瓜蛋白酶的分离提纯方法，尤其涉及一种双水相萃取-超声波联合分离提纯木瓜蛋白酶的方法。
背景技术
木瓜蛋白酶广泛存在于番木瓜未成熟果实的乳汁中，它是由212个氨基酸组成的蛋白质单链，具有耐高温、活性强、稳定性好，蛋白质水解能力强等特征，还具有凝乳、解脂和溶菌活力，是能作用于各类蛋白质的纯天然产物。对pH变化和金属离子及去垢剂不敏感，其用途很多，目前已广泛的应用于食品、化工、轻纺工业、医药卫生等各个行业。在肉类加工中，木瓜蛋白酶是最好的肉类嫩化剂，这是因为木瓜蛋白酶与其他蛋白酶相比，其热稳定性较高。将木瓜蛋白酶用于对冷冻贮存过程中啤酒处理，能水解啤酒内蛋白质，部分水解一些已形成的复合物，产生更多的多肽或氨基酸，保证啤酒在冷冻过程中的高清澈度，同时改善啤酒口感及原有多肽和氨基酸的组成和比例，有效地改良啤酒品质。因此，研究、探讨、寻求最佳提取工艺对木瓜蛋白酶的开发、制备和应用具有极其重要的意义。提取木瓜蛋白酶的传统方法有：超滤法、盐析法、有机溶剂法、絮凝法、亲和层析法等。
双水相萃取技术近年来愈来愈得到研究者的青睐，其相对传统的分离纯化技术具有提纯效率高、设备常规、操作简便，适于大规模生产等优点，且不存在有机溶剂的残留问题，易于放大和连续操作，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低。双水相萃取是利用组分在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离的萃取技术。双水相萃取中使用的双水相是由两种互不相溶的高分子溶液或者互不相溶的盐溶液和高分子溶液组成。然而现有的双水相萃取技术需要在体系分相后辅以离心等操作，从而加速系统分相，并向体系中加入中性盐KCl增加目标产物的分配系数和收率增加了操作难度和经济成本。因此，开发一种步骤简单，设备常规，分离效果好，分离效率高的双水相萃取分离葛根素的方法是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种双水相萃取-超声波联合分离提纯木瓜蛋白酶的方法，所用设备常规，操作简便，分离效率高，适合工业化生产。
本发明解决技术问题所采用的技术方案为：
一种高效分离提纯葛根素的方法，包括如下步骤：
(1)粗提液制备：将木瓜乳汁加入水中浸泡4-6小时后，于-20℃下冷冻3-8小时后，再于25℃融化，如此反复冻融3～4次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液即为含木瓜蛋白酶的粗提液，通过冷冻使细胞膜的疏水键结构破裂,同时细胞内形成冰晶对细胞壁造成机械破裂，从而使得胞内木瓜蛋白酶析出，并溶于水中，再通过离心去除不溶物得到含藻蓝蛋白的粗提液。
(2)双水相萃取：向步骤(1)所得含木瓜蛋白酶的粗提液中加入羟甲基纤维素钠和无机盐，震荡混合后，超声15-20分钟，再静置8-15分钟，收集上相。采用羟甲基纤维素钠和无机盐构成双水相萃取体系，替代高聚合物，降低了生产成本。双水相萃取体系由互不相溶的羟甲基纤维素钠和无机盐构成，利用木瓜蛋白酶在羟甲基纤维素钠和无机盐中的选择性分配，使其与粗提液中其他杂质分离，从而达到分离纯化的目的。然而单纯双水相萃取分相速度较慢，通常需要静置4-6小时后，再在离心作用下才能分相，且所得木瓜蛋白酶的纯度不高。本发明在加入双水相萃取液的同时，辅以超声作用，能够加快分子运动，从而加快分相速度，提高体系的分配系数，在短时间内获得木瓜蛋白酶含量较高的上相。
(3)成品制备：将步骤(2)所得上相在截留相对分子质量为5000的透析膜中透析12-20小时后得藻蓝蛋白水溶液，再于-15～-10℃冷冻干燥12-20小时得藻蓝蛋白粉末。
作为优选，步骤(1)中木瓜乳汁与水的质量比为1:50-70。
作为优选，步骤(2)中无机盐为硫酸铵、硫酸钠或硫酸镁中的一种。
作为优选，步骤(2)中所述羟甲基纤维素钠质量为双水相体系总质量的20-25％，无机盐质量为双水相体系总质量的12-16％，含木瓜蛋白酶的粗提液的质量为双水相体系总质量的59-66％。不同浓度组成的双水相体系萃取效果不同，羟甲基纤维素钠浓度过低，分相困难；随着羟甲基纤维素钠浓度在一定范围内的增加，双水相体系两相差别较大，利于木瓜蛋白酶白在上相中富集，其他水溶性杂质在下相中富集，但是随着羟甲基纤维素钠浓度继续增大，更多的杂质进入上相，使上相中木瓜蛋白酶的纯度降低。随着无机盐浓度在一定范围内的提高，物质在两相中界面张力增大，有利于木瓜蛋白酶在上相富集，杂质在下相富集；当无机盐浓度更大时，上相体积逐渐减小，同时粘度逐渐增大，不利于木瓜蛋白酶在上相的富集。
本发明的有益效果为：
1、本发明选用双水相萃取和超声波联合的方法对粗体液进行提纯，对木瓜蛋白酶的选择性高，体系分相速度快，不需借助离心机等设备即可快速分相。
2、采用羟甲基纤维素钠和无机盐构成双水相萃取体系，替代高聚合物，降低了生产成本。
3、本发明所采用的分离纯化方法，操作简便，设备常规，适合工业化生产。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
实施例1
(1)粗提液的制备
将10g木瓜乳汁加入500g去离子水中浸泡6小时后，于-20℃下冷冻3小时，再于25℃融化，如此反复冻融3次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液得17g含木瓜蛋白酶的粗提液，纯度为55.3％，收率为94.2％。
(2)双水相萃取
取6.5g含木瓜蛋白酶的粗提液、2g羟甲基纤维素钠和1.5g硫酸铵加入锥形瓶中，震荡混合后，置于超声波中超声15分钟，静置10分钟后分相，收集上相，将上相置于截留相对分子质量为5000的透析膜中透析20小时后得木瓜蛋白酶水溶液，再于-15℃冷冻干燥12小时得6g木瓜蛋白酶粉末，其中木瓜蛋白酶的纯度为95.6，收率为88.9％，总收率为。
实施例2
(1)粗提液的制备
将10g木瓜乳汁加入600g去离子水中浸泡4小时后，于-20℃下冷冻5小时，再于25℃融化，如此反复冻融3次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液得18.1g含木瓜蛋白酶的粗提液，纯度为51.5％，收率为93.0％。
(2)双水相萃取
取6.6g含木瓜蛋白酶的粗提液、2g羟甲基纤维素钠和1.5g硫酸铵加入锥形瓶中，震荡混合后，置于超声波中超声20分钟，静置8分钟后分相，收集上相，将上相置于截留相对分子质量为5000的透析膜中透析12小时后得木瓜蛋白酶水溶液，再于-15℃冷冻干燥15小时得6.3g木瓜蛋白酶粉末，其中木瓜蛋白酶的纯度为95.2％，收率为90.6％，总收率84.3％。
实施例3
(1)粗提液的制备
将10g木瓜乳汁加入700g去离子水中浸泡5小时后，于-20℃下冷冻8小时，再于25℃融化，如此反复冻融3次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液得16.6g含木瓜蛋白酶的粗提液，纯度为55.0％，收率为91.2％。
(2)双水相萃取
取5.9g含木瓜蛋白酶的粗提液、2.5g羟甲基纤维素钠和1.6g硫酸镁加入锥形瓶中，震荡混合后，置于超声波中超声16分钟，静置13分钟后分相，收集上相，将上相置于截留相对分子质量为5000的透析膜中透析18小时后得木瓜蛋白酶水溶液，再于-15℃冷冻干燥15小时得5.6g木瓜蛋白酶粉末，其中木瓜蛋白酶的纯度为97.1％，收率为92.3％，总收率84.2％。
比较例1
将10g木瓜乳汁加入700g去离子水中浸泡5小时后，于-20℃下冷冻8小时，再于25℃融化，如此反复冻融3次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液得16.6g含木瓜蛋白酶的粗提液，纯度为55.0％，收率为91.2％。
(2)双水相萃取
取5.9g含木瓜蛋白酶的粗提液、2.5g羟甲基纤维素钠和1.6g硫酸镁加入分液漏斗中，震荡混合后，静置20分钟后不分相，继续静置4小时候，需离心才能分相。
通过对比比较例1和实施例3，可以发现，双水相萃取联合超声处理能够加快双水相萃取体系的分相速度，提高产品纯度和收率。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (4)

1.一种双水相萃取-超声波联合分离提纯木瓜蛋白酶的方法，其特征在于，所述分离提纯木瓜蛋白酶的方法包括如下步骤：
(1)粗提液制备：将木瓜乳汁加入水中浸泡4-6小时后，于-20℃下冷冻3-8小时后，再于25℃融化，如此反复冻融3～4次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液即为含木瓜蛋白酶的粗提液；
(2)双水相萃取：向步骤(1)所得含木瓜蛋白酶的粗提液中加入羟甲基纤维素钠和无机盐，震荡混合后，超声15-20分钟，再静置8-15分钟，收集上相；
(3)成品制备：将步骤(2)所得上相在截留相对分子质量为5000的透析膜中透析12-20小时后得木瓜蛋白酶水溶液，再于-15～-10℃冷冻干燥12-20小时得木瓜蛋白酶粉末。
2.如权利要求1所述分离提纯木瓜蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(1)中木瓜乳汁与水的质量比为1:50-70。
3.如权利要求1所述分离提纯木瓜蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(2)中所述无机盐为硫酸铵、硫酸钠或硫酸镁中的一种。
4.如权利要求1所述分离提纯木瓜蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(2)中所述羟甲基纤维素钠质量为双水相体系总质量的20-25％，无机盐质量为双水相体系总质量的12-16％，含木瓜蛋白酶的粗提液的质量为双水相体系总质量的59-66％。
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