CN110117581A - 一种小麦和玉米幼苗单胺氧化酶分离纯化的方法 - Google Patents

一种小麦和玉米幼苗单胺氧化酶分离纯化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种小麦和玉米幼苗单胺氧化酶分离纯化的方法：包括如下步骤，1)幼苗预处理：将小麦和玉米幼苗清洗、浸泡2‑3小时；2)幼苗破碎：将浸泡后的幼苗倒入研磨机中，进行珠磨破碎；3)过滤，渣液分离：将破壁溶液离心处理，滤渣除去，收集上清液，即得粗提取液；4)精滤：得到单胺氧化酶精滤液；5)低温真空干燥：在酶精滤液中加入酶保护剂，置于低温真空干燥机中干燥，干燥时间为20‑35min；6)饱和盐析：过饱和硫酸铵盐析对其进一步分离纯化，去除其他蛋白质和小分子物质，获得单胺氧化酶产品。本发明采取的单胺氧化酶分离纯化方法，流程更加优化，提高了单胺氧化酶的产出量，低温真空干燥有效的保持单胺氧化酶的活性。

Description

一种小麦和玉米幼苗单胺氧化酶分离纯化的方法
技术领域：
本发明涉及一种单胺氧化酶分离纯化的方法，特别涉及一种一种小麦和玉米幼苗单胺氧化酶分离纯化的方法。
背景技术：
单胺氧化酶(MAO)是含有黄素-腺苷-二核苷酸(FAD)的酶，其将生物胺转变为其相应的醛。单胺氧化酶为反映肝纤维化的酶，可分为两类。一类存在于肝、肾等组织的线粒体中，以FAD为辅酶，参与儿茶酚胺的分解代谢。另一类存在于结缔组织，是一种细胞外酶，无FAD而含有磷酸吡哆醛，只对伯胺起作用。血清中MAO和结缔组织中的MAO性质相似，能促进结缔组织的成熟，在胶原形成过程中，参与胶原成熟的最后阶段架桥形成，使胶原和弹性硬蛋白结合。
MAO多见于脊椎动物的各种器官，特别是分泌腺、脑、肝脏，但在无脊椎动物、豆类的芽等植物中也存在。在细胞内存在于线粒体外膜上，是不溶性酶。临床医学上，血清单胺氧化酶的活性高低能反应肝纤维化的程度，是诊断肝硬化的重要指标。而现有技术中对植物幼苗中的MAO的研究比较少，其原因之一是植物幼苗中单胺氧化酶的含量较少，且不易分离出来。
发明内容：
本申请为解决现有技术中植物幼苗单胺氧化酶分离提纯困难的技术问题，提供一种小麦和玉米幼苗单胺氧化酶分离纯化的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种小麦和玉米幼苗单胺氧化酶分离纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)幼苗预处理：将小麦和玉米幼苗清洗、浸泡2-3小时；
2)幼苗破碎：将浸泡后的幼苗倒入研磨机中，进行珠磨破碎；
3)过滤，渣液分离：将破壁溶液离心处理，滤渣除去，收集上清液，即得粗提取液；
4)精滤：得到单胺氧化酶精滤液；
5)低温真空干燥：在酶精滤液中加入酶保护剂，置于低温真空干燥机中干燥，干燥时间为20-35min；
6)饱和盐析：过饱和硫酸铵盐析对其进一步分离纯化，去除其他蛋白质和小分子物质，获得单胺氧化酶产品。
优选的，所述步骤4)的精滤中，包括步骤41)：双水相萃取，向步骤3)中获取的粗提取液中加入羧甲基纤维素钠和无机盐，震荡混合后，超声，静置，分离、收集上层液。
优选的，还包括步骤42)：将收集的上层液通过透析膜透析后，得到单胺氧化酶精滤液。
优选的，所述步骤2)中，加入一定量的研磨剂，进行珠磨破碎，研磨时间为20-30min。
优选的，所述酶保护剂保护剂为DTNB硝基苯甲酸二硫化合物与EDTA、亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠中的两种或三种组合。
优选的，所述步骤5)中，低温真空干燥的温度为-20～-10℃，干燥时间为10-15小时。
更优选的，所述步骤5)中，低温真空干燥的温度为-15℃，干燥时间为30min。
更优选的，所述研磨时间为25min。
本发明的优点：本发明提供一种小麦和玉米幼苗单胺氧化酶分离纯化的方法，从小麦或玉米幼苗中提取单胺氧化酶，对植物幼苗中单胺氧化酶的研究具有重要意义。本发明采取的单胺氧化酶分离纯化方法，流程更加优化，提高了单胺氧化酶的产出量，低温真空干燥有效的保持单胺氧化酶的活性。
附图说明：
附图1为对实施例1中提纯的单胺氧化酶荧光检测活性的检测结果图。
具体实施方式：
为了使本技术领域的人员更好的理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例来对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种小麦和玉米幼苗单胺氧化酶分离纯化的方法：包括如下步骤，
1)幼苗预处理：将小麦和玉米幼苗清洗、浸泡2-3小时；
2)幼苗破碎：将浸泡后的幼苗倒入研磨机中，进行珠磨破碎；
3)过滤，渣液分离：将破壁溶液离心处理，滤渣除去，收集上清液，即得粗提取液；
4)精滤：得到单胺氧化酶精滤液；
5)低温真空干燥：在酶精滤液中加入酶保护剂，置于低温真空干燥机中干燥，干燥时间为20-35min；
6)饱和盐析：过饱和硫酸铵盐析对其进一步分离纯化，去除其他蛋白质和小分子物质，获得单胺氧化酶产品。
具体制备方法为：
1)幼苗预处理：将小麦和玉米幼苗洗净、切段、浸泡在水中2.5小时；
2)幼苗破碎：待幼苗充分吸收水分后，将幼苗倒入研磨机中，加入一定量的例如石英石作为研磨剂进行珠磨破碎，研磨时间25min，研磨剂与幼苗细胞体之间相互摩擦、碰撞，细胞破碎；
3)过滤，渣液分离：将破壁溶液离心处理，将研磨剂和滤渣除去，收集上清液，即得粗提取液；
4)精滤：双水相萃取，向步骤3)中获取的粗提取液中加入羧甲基纤维素钠和无机盐，震荡混合后，超声，静置，分离、收集上层液；将收集的上层液通过透析膜透析后，得到单胺氧化酶精滤液；
5)低温真空干燥：在酶精滤液中加入EDTA与亚硫酸氢钠酶保护剂，置于低温真空干燥机中干燥，低温温度为-15℃，干燥时间为30min；
6)饱和盐析：过饱和硫酸铵盐析对其进一步分离纯化，去除其他蛋白质和小分子物质，获得单胺氧化酶产品。
实施例2
为了检测实施例1中得到的单胺氧化酶的活性，采用荧光检测方法，检测单胺氧化酶的活性。
将待测单胺氧化酶活性的样品溶于1mL EP管中，按照体积比为1:9的比例将样品放入pH约8.4的硼酸缓冲液中，35℃恒温预热后，加入5μl浓度为10mM的香豆素类化合物和2μl的1g/mL BSA反应液进行反应，反应完全，在96孔筛板中用全功能荧光分光光度计检测，获得单胺氧化酶的活性数据。
实验证明，只要存在微量的单胺氧化酶(5～10mmol/L)，就能高效的水解荧光探针，通过全功能微孔板检测系统测定出荧光强度从1000增加到20000，变化的幅度较大，直观地得出单胺氧化酶的活性的变化，如附图1所示，证明通过实施例1中的方法，从小麦和玉米幼苗提纯分离出的单胺氧化酶具有很好的活性。
综上所述，本发明提供一种小麦和玉米幼苗单胺氧化酶分离纯化的方法，从小麦或玉米幼苗中提取单胺氧化酶，对植物幼苗中单胺氧化酶的研究具有重要意义。本发明采取的单胺氧化酶分离纯化方法，流程更加优化，提高了单胺氧化酶的产出量，低温真空干燥有效的保持单胺氧化酶的活性。
应当理解，虽然本说明书是按照各个实施例描述的，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种小麦和玉米幼苗单胺氧化酶分离纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)幼苗预处理：将小麦和玉米幼苗清洗、浸泡2-3小时；
2)幼苗破碎：将浸泡后的幼苗倒入研磨机中，进行珠磨破碎；
3)过滤，渣液分离：将破壁溶液离心处理，滤渣除去，收集上清液，即得粗提取液；
4)精滤：得到单胺氧化酶精滤液；
5)低温真空干燥：在酶精滤液中加入酶保护剂，置于低温真空干燥机中干燥，干燥时间为20-35min；
6)饱和盐析：过饱和硫酸铵盐析对其进一步分离纯化，去除其他蛋白质和小分子物质，获得单胺氧化酶产品。
2.根据权利要求1所述的一种小麦和玉米幼苗单胺氧化酶分离纯化的方法，其特征在于，所述步骤4)的精滤中，包括步骤41)：双水相萃取，向步骤3)中获取的粗提取液中加入羧甲基纤维素钠和无机盐，震荡混合后，超声，静置，分离、收集上层液。
3.根据权利要求2所述的一种小麦和玉米幼苗单胺氧化酶分离纯化的方法，其特征在于，还包括步骤42)：将收集的上层液通过透析膜透析后，得到单胺氧化酶精滤液。
4.根据权利要求1所述的一种小麦和玉米幼苗单胺氧化酶分离纯化的方法，其特征在于，所述步骤2)中，加入一定量的研磨剂，进行珠磨破碎，研磨时间为20-30min。
5.根据权利要求1所述的一种小麦和玉米幼苗单胺氧化酶分离纯化的方法，其特征在于，所述酶保护剂保护剂为DTNB硝基苯甲酸二硫化合物与EDTA、亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠中的两种或三种组合。
6.根据权利要求1所述的一种小麦和玉米幼苗单胺氧化酶分离纯化的方法，其特征在于，所述步骤5)中，低温真空干燥的温度为-20～-10℃，干燥时间为10-15小时。
7.根据权利要求6所述的一种小麦和玉米幼苗单胺氧化酶分离纯化的方法，其特征在于，所述步骤5)中，低温真空干燥的温度为-15℃，干燥时间为30min。
8.根据权利要求4所述的一种小麦和玉米幼苗单胺氧化酶分离纯化的方法，其特征在于，所述研磨时间为25min。
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