CN111575250A - Butelase1酶的提取方法及其环化多肽的环化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分子生物学领域，尤指一种Butelase1酶的提取方法及其环化多肽的环化方法，提取方法包括：1)采集蝶豆花和叶子加入EB1缓冲液，打碎后得混合匀浆；2)将混合匀浆离心后取上清液，并过滤除杂；3)继续加入固体硫酸铵盐，置于室温培育，离心除去沉淀杂蛋白，获得沉淀与上清液；4)往上清液中加入固体硫酸铵盐，置于室温培育，离心弃上清液，获得蛋白质沉淀与上清液；5)采用EB1缓冲液重悬沉淀蛋白质，采用EB2缓冲液过夜透析，获得透析液；6)将透析液离心并弃沉淀，保留上清液；7)取上清液至超滤管中，取截留液进行环化反应；本发明通过提取与环化过程使Butelase 1环化产生抑菌活性，整体操作过程方便高效，易于工业化生产。

Description

Butelase1酶的提取方法及其环化多肽的环化方法

技术领域

本发明涉及一种分子生物学领域，尤指一种Butelase1酶的提取方法及其环化多肽的环化方法。

背景技术

Butelase 1是来源于东南亚药用植物蝶豆花(Clitoria ternatea)的豆荚中一种特异性天冬氨酸/氨酰连接酶，它能高效催化羧基末端为Asx(Asp/Asn)－His－Val三肽序列的线性多肽在分子内或分子间环化。Butelase 1将线性多肽羧基末端的His－Val二肽切割掉后与氨基端相连，形成环状结构，从而提高环化后的多肽抵抗蛋白酶水解、高温变性及耐受极端化学条件的能力，并能够延长多肽半衰期和提高原有的生物活性。Nguyen等用Butelase 1环化26-40个氨基酸的小肽:人类爱帕琳肽、甘丙肽、神经调节素等和大于200个氨基酸残基的重组蛋白:绿色荧光蛋白、白介素－1受体拮抗剂和人类生长激素，研究表明Butelase 1的催化效率Sortase A的20000倍。Butelase 1是已知最快的连接酶，具有很高的催化效率。Circulin B是由31个氨基酸残基组成的首尾相连的环状肽，其结尾只有环化Circulin B具有广谱抗菌活性，在体外和动物体内感染实验中，Circulin B能有效抑制革兰氏阳性菌和阴性菌的生长繁殖，如葡萄球菌和大肠杆菌。

Butelase 1主要存在于植物蝶豆花的豆荚中，目前主要通过工业提取以及基因工程方法来获得。若采用工业的方法从豆荚中提取Butelase 1，首先蝶豆花结豆荚量极少，其提取过程工艺繁琐、成本较高、提取量极低，不易于工业化生产。现有的工业是将从蝶豆花的研磨后的提取物将其通过阴离子交换树脂除去杂质，再利用HPLC进行分离纯化，将分离出的物质使用SFTI肽的线性衍生物(GRCTKISPPICFPNHV)筛选具有连接酶活性的物质。在基因工程方面则是采用大肠杆菌表达系统表达Butelase 1主要形成包涵体，生物活性极低。有研究通过基因工程改造设计成功增加butelase1在上清中的表达量，但所表达出的butelase1为无活性的前体形式，需要采用多重透析的方式使其发生自我剪切，从而便成为有环化活性的butelase1,但工艺复杂，需要摸索多种条件，且价格昂贵，不利于工业化生产。而采用真核表达系统(毕赤酵母表达)表达Butelase1，虽然能很好的修饰Butelase 1，但是表达量极低，限制其实际应用。

Butelase 1是已知最快的连接酶，具有很高的催化效率。目前，具有活性的Butelase 1主要是从植物的豆荚中提取，工艺繁琐、成本高、提取的量极低，不易于工业化生产。另一个方法则是通过基因工程的方法获取，利用大肠杆菌表达系统表达Butelase 1，但是该系统表达的Butelase 1主要以包涵体形式表达，包涵体变复性操作复杂，产物获取量低，并且该表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达的Butelase 1的生物活性较低；而采用真核表达系统(毕赤酵母表达)表达Butelase 1，虽然能很好的修饰Butelase 1，但是表达量极低，因此限制了其广泛地应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明旨在公开一种分子生物学领域，尤指一种Butelase1酶的提取方法及其环化多肽的环化方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种Butelase1酶的提取方法，其特征在于，所述的提取方法包括以下步骤：

1)破碎：采集蝶豆花和叶子，加入EB1缓冲液，每1千克蝶豆花或叶子可配比2L EB1缓冲液，打碎后获得混合匀浆，将混合匀浆储存于离心管中；打碎时采用搅拌机将蝶豆花机械破碎成黏糊状，然后将混合物转移至5OmL的离心管中；

2)过滤：将混合匀浆离心后取上清液为植物提取物，并过滤除杂；具体地，离心时，在温度4℃，离心力9000×g条件下，离心10min；过滤时，用滤纸通过布氏漏斗过滤植物提取物，除去残杂获得过滤后的上清液，取40ul，用于SDS-PAGE鉴定；

3)培育除沉淀：往步骤2)的植物提取物中加入固体硫酸铵盐达到15％饱和度，获得混合物，将混合物室温培育，然后进行离心除去沉淀的杂蛋白，获得沉淀与上清液；具体地，室温培育时间为10min，离心条件为：离心力9000×g，离心时间10min，获得沉淀与上清液后，转移上清液到一个干净的烧杯中，分别取沉淀和上清液各50ul，用于SDS-PAGE鉴定；

4)孵育弃上清：往步骤3)的上清液中加入固体硫酸铵盐达到85％饱和度，获得混合物，将混合物室温培育，然后进行离心弃上清液，获得蛋白质沉淀与上清液；具体地，室温培育时间为20min，离心条件为：离心力9000×g，温度4℃下，离心时间30min，获得沉淀与上清液后，分别取沉淀和上清各50ul，用于SDS-PAGE鉴定；

5)透析：采用EB1缓冲液重新悬浮沉淀的蛋白质，然后采用EB2缓冲液进行过夜透析，透析后获得透析液；具体地，采用1L的EB1缓冲液重悬沉淀的蛋白质，使用截留分子量为10kDa的蛇皮透析袋(SnakeSkin)透析并在20L EB2缓冲液中过夜透析，取40ul透析液，用于SDS-PAGE鉴定；

6)透析后，将透析液离心并弃去析出的沉淀，保留上清液；具体地，离心条件为温度4℃，离心力9000×g，时间为20min，离心后弃沉淀保留上清液，然后分别取沉淀和上清各50ul，用于SDS-PAGE鉴定；

7)取上清液添加至超滤管中，离心后取截留液，进行环化反应；具体地，取上清液，加到10～30KD的超滤管中，在4℃下将透析液在9000×g下离心20min，取截留液，用于后续的环化反应。

优选地，在步骤1)中，所述蝶豆花为新鲜蝶豆花、冷冻蝶豆花或脱水蝶豆花，最优选为新鲜蝶豆花，打碎时，每千克的蝶豆花需加入2L的EB1缓冲液。

优选地，所述提取方法的过程中，离心条件为：转数8000-10000rpm，离心温度为4℃，离心时间为10-15min。

优选地，步骤2)过滤时，采用滤纸通过布氏漏斗以过滤植物提取物，得到上清液。

优选地，在步骤3)、4)中，室温培育时间为5～30min，更优选为10min、20min。

优选地，在步骤5)透析时，采用透析袋进行透析，透析袋为截留分子量1～20kDa的蛇皮透析袋，更优选为10kDa。

本发明提供一种Butelase1酶环化多肽的环化方法，其特征在于，所述的环化方法包括以下步骤：

1)环化前将提取过程中的沉淀或上清液进行Tricine-SDS-PAGE鉴定；

2)首先提供Butelase1酶的提取物，然后使butelase1 CirculinB的羧基端的H-V进行断裂，将CirculinB的N端和C端相连，完成环化反应；

3)通过Tricine-SDS-PAGE以及抑菌试验检测多肽CirculinB是否环化。

本发明的有益效果体现在：本发明提供的提取及环化方法可提取蝶豆花中的活性成分Butelase 1，通过机械法进行破碎、硫酸铵沉淀等步骤进行粗提，提取到大量具有环化活性的Butelase 1，将无抑菌活性的多肽CirculinB在一定条件下进行反应后，使Butelase1环化产生抑菌活性，整体提取过程方便高效，易于工业化生产。

通过本发明的提取方法与环化方法，无需进行复杂的纯化，为大量制备butelase1提供了可行性方法步骤，且采用的方法过程成本低廉，节省资源与成本，同时，所获取具有活性的butelase1后能进一步进行多肽环化反应，butelase 1的环化效率高，只要微摩尔的剂量，即可使多肽环化以及使多肽更加稳定。其中，本发明的提取方法可从蝶豆花中提取到大量具有环化活性的butelase 1，完成提取后，通过环化方法将提取到的butelase 1直接用于多肽CirculinB进行环化反应以及one-pot反应，无需纯化即可实现环化效率高的效果，并获得抑菌活性产品；而本发明通过机械法、化学法、透析等方法能够提取具有活性的butelase 1，提取方法高效无副反应，所用试剂较为廉价、提取成本低，适用于工业化大量生产。

附图说明

图1为butelase 1从蝶豆花中提取的SDS-PAGE图；

图2为butelase 1环化多肽CirculinB的SDS-PAGE图。

图3为多肽CirculinB环化后的抑菌结果图。

具体实施方式

下面结合附图详细说明本发明的具体实施方式：

本发明的Butelase 1是效率高的连接酶，Butelase 1是Asx的C端特异序列，在Asx之后具有两个或更少氨基酸的排序序列。重要的是，在环化或连接的产物中，除了Asx以外，识别序列的任何部分都不会遗留下来，这一特性使butelase 1成为天然线性或环状蛋白质全合成的理想候选物，Butelase 1对受体亲核氨基酸(Pro以外的所有天然氨基酸)表现出非常广泛的特异性，可形成新的Asx–Xaa肽键。用化学的方法，如天然的化学连接或点击化学相比，肽和蛋白质的butelase1结合需要的肽底物没有化学修饰，不需要C端硫酯，叠氮化物肽或N端半胱氨酸允许连接，因此butelase 1成为用于肽和蛋白质工程的优选新工具。本发明通过大程度地改善、优化提取Butelase 1的方法，能够提取出大量具有活性的Butelase 1酶，经过环化和one-pot反应，将多肽CirculinB进行环化，环化后的CirculinB具有抑菌活性。

目前，仅已知几种天然存在的环化酶，包括PATG，PCY1和POPB，但这些环化酶显示出受限的底物特异性，可用于环化5至11个残基的小肽；然而尽管它们不具有先天环化酶功能并且具有其他一些局限性，通过Sortase A的大环化需要较长的反应时间(通常是过夜孵育)和高摩尔当量的酶；此外，Sortase A具有长的识别序列，并且使五肽LPXTG留在修饰的蛋白质中作为附加标签；相反，内含肽是自催化剪接元件，其需要靶蛋白与内含肽结构域的遗传融合，这可能影响蛋白质折叠或溶解性；因此，对于蛋白质工程和药物开发而言，亟需要一种用于肽和蛋白质从头到尾大环化的高效且位点特异性的连接酶。本发明从热带植物蝶豆花(Clitoria ternatea)中获得连接酶，称为butelase 1，蝶豆花被广泛用作观赏植物，饲料或药用植物；Butelase 1是一种天然存在的环化酶，参与了环氧化物的生物合成，该环氧化物是植物环富含半胱氨酸的肽家族，其产量很高

很容易从蝶豆花中提取；Butelase 1在C末端识别三肽基序Asn/Asp(Asx)-His-Val，并通过裂解序列His-Val和将Asx与N末端残基连接以形成一个肽来介导肽主链环化周期。

具体实施过程如下：

一、试剂与材料

Buffer1(EB1缓冲液)：

Buffer2(EB2缓冲液)：即EB1中不加PMSF：

1M磷酸钠 20mL

0.5M EDTA 2mL

β-ME 0.35mL

加水至1L，并调PH至6.0(可25℃保存六个月)

Buffer3(EB3缓冲液)：即EB2+0.2M NaCl：

加水至1L，并调PH至6.0。(可25℃保存六个月)

Buffer4(EB4缓冲液)：

加水至1L，并调PH至6.0(可25℃保存六个月)

以上溶液用于在butelase酶提取的过程中，保护酶不被降解且保持一定活性，避免在提取的过程导致butelase酶的活性破坏。

注：

1M磷酸钠：1M NaH₂PO₄ 877mL

1M Na₂HPO₄ 123mL

混合，调节PH至6.0(可25℃保存六个月)

0.5M EDTA：EDTA(MW＝292) 146g

加800mL的水，用NaOH调PH至8.0，

最后定容至1L。

二、butelase 1的提取

提取方法包括：

1)破碎：采集1KG蝶豆花和叶子，加入2L EB1缓冲液，打碎后获得混合匀浆，将混合匀浆储存于离心管中；打碎时采用搅拌机将蝶豆花机械破碎成黏糊状，然后将混合物转移至5OmL的离心管中；

2)过滤：将混合匀浆离心后取上清液为植物提取物，并过滤除杂；具体地，离心时，在温度4℃，离心力9000×g条件下，离心10min；过滤时，用滤纸通过布氏漏斗过滤植物提取物，除去残杂获得过滤后的上清液，取40ul，用于SDS-PAGE鉴定；

3)培育除沉淀：往步骤2)的植物提取物中加入固体硫酸铵盐达到15％饱和度，获得混合物，将混合物室温培育，然后进行离心除去沉淀的杂蛋白，获得沉淀与上清液；具体地，室温培育时间为10min，离心条件为：离心力9000×g，离心时间10min，获得沉淀与上清液后，转移上清液到一个干净的烧杯中，分别取沉淀和上清液各50ul，用于SDS-PAGE鉴定；

4)孵育弃上清：往步骤3)的上清液中加入固体硫酸铵盐达到85％饱和度，获得混合物，将混合物室温培育，然后进行离心弃上清液，获得蛋白质沉淀与上清液；具体地，室温培育时间为20min，离心条件为：离心力9000×g，温度4℃下，离心时间30min，获得沉淀与上清液后，分别取沉淀和上清各50ul，用于SDS-PAGE鉴定；

5)透析：采用EB1缓冲液重新悬浮沉淀的蛋白质，然后采用EB2缓冲液进行过夜透析，透析后获得透析液；具体地，采用1L的EB1缓冲液重悬沉淀的蛋白质，使用截留分子量为10kDa的蛇皮透析袋(SnakeSkin)透析并在20L EB2缓冲液中过夜透析，取40ul透析液，用于SDS-PAGE鉴定；

6)透析后，将透析液离心并弃去析出的沉淀，保留上清液；具体地，离心条件为温度4℃，离心力9000×g，时间为20min，离心后弃沉淀保留上清液，然后分别取沉淀和上清各50ul，用于SDS-PAGE鉴定；

7)取上清液添加至超滤管中，离心后取截留液，进行环化反应；具体地，取上清液，加到30KD的超滤管中，在4℃下将透析液在9000×g下离心20min，取截留液，用于后续的环化反应。

三、环化反应

环化方法包括：

第一步：多肽CirculinB的N端和C端相连，具体为：提供上述提取的粗提物，使butelase 1CirculinB的羧基端的H-V进行断裂，将CirculinB的N端和C端相连，环化完成；

实验组

空白组

反应条件为：42℃水浴，时间10min。

第二步：one-pot反应(多肽CirB的二硫键的形成)，CirculinB含有5个半胱氨酸，GSH(谷胱甘肽)与CirculinB中的半胱氨酸残基反应形成二硫键。

实验组

空白组

当步骤1完成后，取样保存(对照用)；加入GSH，调pH至7.4，室温下反应24h。

将环化前后的液体进行Tricine-SDS-PAGE鉴定。

四、牛津杯抑菌试验的方法

1、准备一个LB固体平板；

2、在平板上做好标记后，取已经培养好的大肠杆菌K99 50ul滴加到平板上，然后均匀的涂抹开；

3、根据平板上的标记，放上牛津杯，加入相应的环化后缓冲液各200ul；

4、缓慢放到37℃生化培养箱中培养8h；

5、观察结果，并用游标卡尺测量抑菌圈的大小。

五、Tricine-SDS-PAGE鉴定

(1)配制完毕后，拔出梳子，内槽加入阴极缓冲液，外槽加入阳极缓冲液；

(2)按照顺序进行加样，开始电泳，先恒压50V电泳20min，之后将电压调至120V；

(3)进行电泳，当蛋白Marker指示至分离胶的四分之三时即可停止电泳；

(4)将电泳结束后的凝胶取下，加入固定液50mL，放置摇床上，固定时间为20min；

(5)弃去固定液，加入染色液50mL，放置摇床上，染色1h；

(6)弃去染色液，加入脱色液，缓慢振荡脱色1h。重复此步骤2次。

表：Tricine-SDS-PAGE配胶成分体系

图1表示butelase 1从蝶豆花中提取的SDS-PAGE图，其中纵标1-8分别表示：

1：蝶豆花提取物；

2:15％硫酸铵处理的上清；

3:15％硫酸铵处理的沉淀；

4：85％硫酸铵处理的上清；

5：85％硫酸铵处理的上沉淀；

6：取85％硫酸铵处理的上沉淀溶解后进行透析的透析液；

7:30KD的超滤管截留液；

8:30KD的超滤管穿留液。

图2表示butelase 1环化多肽CirculinB的SDS-PAGE图，其中纵标1-M分别表示：

1：CirculinB的环化反应；

2：CirculinB空白环化反应(阴性对照)；

3：CirculinB one-pot反应；

4：CirculinB空白one-pot反应(阴性对照)。

Make：超低分子预染Mark。

图3表示多肽CirculinB环化后的抑菌结果图，其中纵标1-4分别表示：

1：CirculinB空白环化反应(阴性对照)；

2：CirculinB的环化反应；

3：CirculinB空白one-pot反应(阴性对照)；

4：CirculinB one-pot反应。

抑菌结果如下：

样品	1	2	3	4
					抑菌圈(mm)	0	10.58	0	10.97

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明的技术范围作任何限制，本行业的技术人员，在本技术方案的启迪下，可以做出一些变形与修改，凡是依据本发明的技术实质对以上的实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种Butelase1酶的提取方法，其特征在于，所述的提取方法包括以下步骤：

1)破碎：采集蝶豆花和叶子，加入EB1缓冲液，打碎后获得混合匀浆，将混合匀浆储存于离心管中；

2)过滤：将混合匀浆离心后取上清液为植物提取物，并过滤除杂；

3)培育除沉淀：往步骤2)的植物提取物中加入固体硫酸铵盐达到15％饱和度，获得混合物，将混合物室温培育，然后进行离心除去沉淀的杂蛋白，获得沉淀与上清液；

4)孵育弃上清：往步骤3)的上清液中加入固体硫酸铵盐达到85％饱和度，获得混合物，将混合物室温培育，然后进行离心弃上清液，获得蛋白质沉淀与上清液；

5)透析：采用EB1缓冲液重新悬浮沉淀的蛋白质，然后采用EB2缓冲液进行过夜透析，透析后获得透析液；

6)透析后，将透析液离心并弃去析出的沉淀，保留上清液；

7)取上清液添加至超滤管中，离心后取截留液，进行环化反应。

2.根据权利要求1所述的一种Butelase1酶的提取方法，其特征在于，在步骤1)中，所述蝶豆花为新鲜蝶豆花、冷冻蝶豆花或脱水蝶豆花，打碎时，每千克的蝶豆花需加入2L的EB1缓冲液。

3.根据权利要求1所述的一种Butelase1酶的提取方法，其特征在于，所述提取方法的过程中，离心条件为：转数8000-10000rpm，离心温度为4℃，离心时间为10-15min。

4.根据权利要求1所述的一种Butelase1酶的提取方法，其特征在于，步骤2)过滤时，采用滤纸通过布氏漏斗以过滤植物提取物，得到上清液。

5.根据权利要求1所述的一种Butelase1酶的提取方法，其特征在于，在步骤3)、4)中，室温培育时间为5～30min。

6.根据权利要求1所述的一种Butelase1酶的提取方法，其特征在于，在步骤5)透析时，采用透析袋进行透析，透析袋为截留分子量1～20kDa的蛇皮透析袋。

7.一种Butelase1酶环化多肽的环化方法，其特征在于，所述的环化方法包括以下步骤：

1)环化前将提取过程中的沉淀或上清液进行Tricine-SDS-PAGE鉴定；

2)首先提供Butelase1酶的提取物，然后使butelase1 CirculinB的羧基端的H-V进行断裂，将CirculinB的N端和C端相连，完成环化反应；

3)通过Tricine-SDS-PAGE以及抑菌试验检测多肽CirculinB是否环化。

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