CN103709253A

CN103709253A - 一种生物合成制备glp-1及其类似物的方法

Info

Publication number: CN103709253A
Application number: CN201310737044.8A
Authority: CN
Inventors: 白钢; 刘阳; 任丽梅; 侯媛媛; 白芳; 姜民; 高洁
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2014-04-09

Abstract

一种生物合成分离制备胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其类似物(KGLP-1)的新方法。本发明采用基因工程技术，分别构建了表达谷胱甘肽硫转移酶标签(GST)的GST-GLP-1及GST-KGLP-1融合蛋白的基因工程大肠杆菌，并在融合蛋白中创新性的引进了肠激酶酶切位点。经诱导表达的融合蛋白可通过谷胱甘肽亲和层析，肠激酶酶切和超滤获得GLP-1和KGLP-1的纯品。本发明所制备的GLP-1及其类似物能够有效的结合GLP-1受体并产生生物活性。本发明提供了一种制备GLP-1及其类似物的简便快捷的生物合成的方法，该方法具有条件温和、产物分离提取方便、工艺步骤简单等优点，有很好的产业化应用前景。

Description

一种生物合成制备GLP-1及其类似物的方法

技术领域

本发明涉及含有GST标签和GLP-1及其类似物KGLP-1的融合蛋白的克隆表达；利用GST亲和层析、肠激酶酶切和超滤获得GLP-1及其类似物KGLP-1的方法；以及利用该技术在生物合成以及分离制备GLP-1及其类似物多肽KGLP-1方面的应用。

背景技术

类胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一个含有37个氨基酸的胃肠激素，于1983年Bell等在对胰高血糖素原(proglucagon)基因进行序列分析时发现的。GLP-1可以刺激胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌、胃排空和食物摄取，从而引起细胞对葡萄糖的吸收和血清葡萄糖水平的下降。GLP-1被水解成GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)–酰胺，这两者均为促胰岛素剂(insulinotropic agent)。

当前刺激胰岛素释放的药物和胰岛素的实际给药可能会导致低血糖症，而GLP-1能够刺激胰岛素分泌但没有低血糖症的危险，并且临床研究表明GLP-1可能阻止糖尿病伴随的β-细胞功能损伤的恶化进程，因而GLP-1表现出作为非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的治疗方法的巨大潜能。但是，由于DPP-Ⅳ的降解作用和肾清除作用导致GLP-1的半衰期非常短，这种在体内很短的半衰期很大程度上限制了其临床用药的可能。为了提高其体内作用时间，目前主要有两种方法，一种方法是开发DPP-Ⅳ抑制剂，另一种方法是采用多种不同的手段和方法修饰GLP-1化合物的结构从而找到GLP-1的类似物。

目前研究表明，低分子量的多肽一般通过化学合成法制备。最广泛使用的肽合成方法是固相肽合成法(SPPS)，但是由于受保护氨基酸的使用与过量反应物的连续使用相结合，使得该方法相对昂贵。另外，固相多肽合成中每个氨基酸延长都需要充分的洗涤操作，通常掺入一个氨基酸涉及多达数次用NMP、DMF或DCM等这类溶剂的洗涤步骤。当采用SPPS合成多肽如促胰岛素剂、GLP-1类似物、GLP-1的截短类似物和GLP-1的衍生物时，合成期间二级结构的形成常常导致各个合成步骤的效率降低，结果导致以低纯度和收率生产出较大的肽或含有某些氨基酸序列的肽。而且在化学合成小肽的过程中，杂质通常是在最终序列中失去一个或多个氨基酸的缺失肽。这些杂质往往非常难与所需要的肽进行分离，而导致最终产物被其污染。

我们发现了一种新型的GLP-1类似物，其结构特征是在GLP-1的N端前面添加一个赖氨酸(KGLP-1)(一种改构的胰高血糖素样肽-1的类似物和修饰物及其应用，专利号：ZL200810152147.7)，KGLP-1不但显示出天然GLP-1优越的生物学特性(促进胰岛素的分泌和降血糖作用)，而且与天然的GLP-1相比，其对DPP-Ⅳ的稳定性和体内作用时间有明显的提高，可用于糖尿病的治疗和肥胖的辅助治疗。前期研究中的KGLP-1通过化学合成的方法获得，但化学合成方法制备KGLP-1的过程复杂且产量低，只能应用于实验室的前期研究。KGLP-1的规模化制备障碍很大程度上制约了KGLP-1的后期研究开发和应用。目前国内外尚未见大规模获得GLP-1和KGLP-1的生物合成、制备分离方法的报道。

发明内容

本发明的目的是利用生物合成的方法通过基因重组融合表达技术获得携带GST标签的GLP-1及其类似物KGLP-1的融合蛋白，并经GST亲和层析纯化，肠激酶酶切和超滤步骤除去GST标签蛋白，得到GLP-1或KGLP-1的纯品肽。本发明可解决现有技术难以生物合成及分离GLP-1及其类似物KGLP-1的问题，并可实现GLP-1及其类似物KGLP-1大规模发酵生产，其制备工艺简单，分离纯化步骤容易，可降低其生产成本，适合于大规模生产。

本发明首先提供了如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列（依次编码GST标签、肠激酶酶切位点和GLP-1的融合蛋白GST-GLP-1）和如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列（依次编码GST标签、肠激酶酶切位点和KGLP-1的融合蛋白GST-KGLP-1）。

其次，本发明提供了一种表达载体，该载体是含有SEQ ID No.1序列或SEQ ID No.2序列，并可以在大肠杆菌中表达的pET系列载体。以及提供了一种重组菌株，该菌株是用含有SEQ ID No.1序列或SEQ ID No.2序列的表达载体转化的E.Coli BL21菌株。

本发明同时提供了分别分离制备GLP-1或类似物KGLP-1的方法。该方法分别采用基因工程构建SEQ ID No.1或SEQ ID No.2融合蛋白表达系统，分别经GST标签亲和纯化，并利用肠激酶特异性的酶切释放出GLP-1或类似物KGLP-1活性肽以及GST标签蛋白。

所表述的基因工程构建通过如下技术方案实现：通过PCR技术获得GLP-1及KGLP-1的基因序列，经过限制性内切酶酶切、T4连接酶连接到pET系列表达载体上，并将重组质粒通过转化进入大肠杆菌BL21中。通过IPTG诱导，获得GST-GLP-1或GST-KGLP-1融合蛋白的高表达。所表述的利用GST亲和凝胶层析纯化本发明中的融合蛋白的方法，包括以下步骤：细胞裂解、亲和捕获、洗涤、洗脱等步骤（附图1）。具体条件如下：肠激酶用量为1.0至1.5IU/mg融合蛋白；酶切时间为8至24小时；酶切缓冲液为100mMTris-HCl，100mM MgCl₂，10mM DTT，500mM NaCl，pH7.5。进一步利用10kD超滤膜截留GST标签蛋白，获得GLP-1及其类似物KGLP-1活性肽。这种活性肽的生产方法便于大规模制备，并可以应用于其他多肽的制备。

本发明实例中采用HPLC-MS测定KGLP-1的N端氨基酸序列组成，采用高效液相色谱法来测定KGLP-1的含量，采用质谱方法来测定KGLP-1的精确分子量，并采用CHO/GLP-1R/EGFP细胞受体模型，评价重组GLP-1及其类似物的生物活性。

本发明的优点和积极效果：

本发明提供了一种制备GLP-1及其类似物生物合成的新策略，并创新性的引入肠激酶酶切位点，通过酶切能够获得大量的GLP-1及其类似物KGLP-1。制备的重组多肽经HPLC、HPLC-MS及MALDI-TOF鉴定，结果均与化学合成的标准品相一致。通过表达有GLP-1受体的细胞模型分析，制备的重组多肽显示了良好的生物活性。该方法制备工艺简单，原料价格便宜，制备方法能够扩大应用于产业化生产。

附图说明

图1是实施例1-3，GLP-1及其类似物的克隆、表达和纯化流程图；

图2是实施例3，GLP-1的诱导表达纯化效果图，其中，M为蛋白Marker，1为细胞裂解液，2为GST柱的穿柱液，3为GST柱的洗脱液(融合蛋白)，4为肠激酶酶切后的蛋白，5为纯化的重组GLP-1，6为GLP-1标准品；

图3是实施例3，KGLP-1的诱导表达纯化效果图，其中，M为蛋白Marker，1，4为细胞裂解液，2为PBS条件下的GST穿柱液，3为PBS条件下的GST洗脱液(融合蛋白)，5为T₂₀N₁₀₀缓冲液条件下的GST穿柱液，6为T₂₀N₁₀₀缓冲液条件下的GST洗脱液(融合蛋白)，7为肠激酶酶切后的蛋白，8为纯化后的重组KGLP-1，9为KGLP-1标准品；

图4是实施例3，融合蛋白酶切条件的考察，其中，a为酶切时间的考察，M为Marker，1-8为酶切12h，10h，8h，6h，4h，2h，1h，0h的酶切效果图，b为酶切缓冲液的考察，M为Marker，1为阴性对照，2-7为酶切缓冲液分别是SB，H，L，M，T，K的酶切效果图(缓冲液的配方见附表1)；

图5是实施例4，重组KGLP-1的鉴定，其中，a为纯化的重组KGLP-1的HPLC分析图，b为纯化的重组KGLP-1的MALDI-TOF-MS分析图；

图6是实施例5，重组KGLP-1生物活性的鉴定，其中，a为阴性对照，CHO/EGFP/GLP-1R细胞加入空白培养基，b-f为CHO/EGFP/GLP-1R细胞分别加入含10nmol/L的KGLP-1标准品和纯化的重组KGLP-1样品系列稀释（×10²,×10³,×10⁴,×10⁵）培养基中的绿色荧光蛋白的表达情况。

具体实施方式

实施例1、GLP-1与GST标签融合蛋白的表达系统的构建

1、GLP-1小肽基因PCR扩增：

本发明中的GLP-1小肽基因是以SEQ ID No.3作为模板，进行PCR扩增获得的。根据GLP-1的基因序列，设计含有BamHI和XhoI酶切位点的上游和下游引物，

nGLP30-1：CGCGGATCCGACGATGACGATGACAAACACGCC；

GLP3031-2：CCGCTCGAGTCAACGGCCTTTAACGAGCCACGC；

以SEQ ID No.3作为模板，进行PCR扩增的反应条件为：94℃预变性10分钟；94℃1分钟，60℃15秒，72℃15秒，共30个循环；72℃延伸1分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分析产物，在加样泳道出现目标条带。

2、基于大肠杆菌BL21(DE3)Codon plus(E.coli BL21)菌株的GST-GLP-1融合表达系统的构建：

分别采用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切GLP-1基因的PCR扩增产物和带有GST标签的pET-GST-3C载体，采用DNA回收试剂盒回收目的片段，T4连接酶连接后转入E.coli BL21菌株的感受态细胞。选取阳性克隆，抽提质粒。重组质粒经PCR和酶切鉴定，获得含有编码GST-GLP-1融合蛋白基因的重组质粒pGST-GLP-1的E.coli BL21原核表达系统。对上述构建好的SEQ ID No.1蛋白表达系统经序列分析，其结果与NCBI登陆的V01515相一致。

3.GST-GLP-1融合蛋白的表达：

将上步构建的重组菌株接种于5mL含有氨苄青霉素50μg/mL的LB培养基(1%胰蛋白胨，0.5%酵母浸出粉，1%NaCl，pH7.4)培养液中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达0.6时，采用终浓度为0.2mmol/L的IPTG于37℃诱导2小时。离心收集的菌体，采用T₂₀N₁₀₀(pH8.0)缓冲液重悬，超声波破碎处理5分钟，使菌体充分裂解。Tricine-SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的表达情况。如图2所示，重组大肠杆菌pGST-GLP-1经IPTG诱导后有～30kD分子量大小的表达条带，与SEQ ID No.1融合蛋白预期大小相符。

实施例2、KGLP-1与GST标签融合蛋白的表达

1、KGLP-1小肽基因PCR扩增：

本发明中的KGLP-1小肽基因是以pGST-GLP-1质粒作为模板，进行PCR扩增获得的。根据GLP-1的基因序列，设计含有BamHI和XhoI酶切位点的上游和下游引物，前引物在tag后面添加一个天冬氨酸(AAG)，

nKGLP31-1：CGCGGATCCGACGATGACGATGACAAG AAACAC；

KGLP3031-2：CCGCTCGAG TCAACGGCCTTTAACGAGCCACGC；

以pGST-GLP-1质粒作为模板，进行PCR扩增的PCR反应条件为：94℃预变性10分钟；94℃1分钟，60℃15秒，72℃15秒，共30个循环；72℃延伸1分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分析产物，在加样泳道出现目标条带。

2、基于大肠杆菌BL21菌株的GST-KGLP-1融合表达系统的构建：

分别采用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切KGLP-1基因PCR扩增产物和带有GST标签的pET-GST-3C载体，采用DNA回收试剂盒回收目的片段，T4连接酶连接后转入E.coli BL21菌株的感受态细胞。选取阳性克隆，抽提质粒。重组质粒经PCR和双酶切鉴定，获得含有编码GST-KGLP-1融合蛋白基因的重组质粒pGST-KGLP-1的E.coli BL21原核表达系统。对上述构建好的SEQ ID No.2蛋白表达系统经序列分析，其结果与NCBI登陆的V01515的N端添加一个编码赖氨酸的氨基酸序列相一致(即KGLP-1，KGLP-1显示出天然GLP-1优越的生物学特性，而且对DPP-Ⅳ的稳定性和体内作用时间与GLP-1相比有明显的提高)。

3、GST-KGLP-1融合蛋白的表达：

将上步构建的重组菌株接种于5mL含有氨苄青霉素50μg/mL的LB培养液中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达0.6时，采用终浓度为0.2mmol/L的IPTG于37℃诱导2小时。离心收集的菌体，采用T₂₀N₁₀₀(pH8.0)缓冲液重悬，超声波破碎处理5分钟，使菌体充分裂解。如图3所示，重组大肠杆菌pGST-KGLP-1经IPTG诱导后有～30kD分子量大小的表达条带，与GST-KGLP-1融合蛋白预期大小相符。

实施例3、GLP-1、KGLP-1的纯化

1、重组菌株菌液的获得：

将含有pGST-GLP-1和pGST-KGLP-1质粒的重组菌株分别接种于100mL含有氨苄青霉素50μg/mL的LB培养液中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达0.6时，采用终浓度为0.2mmol/L的IPTG于37℃诱导2小时。离心，分别收集上述含有pGST-GLP-1和pGST-KGLP-1质粒的重组菌体，采用SB，H，L，M，T，K不同的缓冲液（配方见表1）重悬后，超声波破碎30分钟，使菌体充分裂解，离心取上清。用0.22μm微孔滤膜过滤，去除细胞碎片及杂质，分别获得GST-GLP-1融合蛋白和GST-KGLP-1融合蛋白上清液。

表1

SB，DTT，BSA是建议缓冲液、二硫苏糖醇和牛血清蛋白的缩写。

2、融合蛋白的纯化：

融合蛋白上清液中分别加入适量GST凝胶，4℃过夜吸附，分别采用上述对应的缓冲液清洗GST凝胶3次，至无蛋白流出后，采用10mM谷胱甘肽洗脱液洗脱，收集洗脱液。经Tricine-SDS-PAGE电泳分析，应用T₂₀N₁₀₀(pH8.0)缓冲液体系，目的蛋白的挂柱效果很好，GLP-1和KGLP-1融合蛋白经纯化纯度分别达到92.21%和96.52%，见图2(泳道3)和图3(泳道6)。

3、重组多肽的获得：

洗脱液经超滤(Millipore,10kD)浓缩，加入肠激酶在37℃温度下酶切12h。经Tricine-SDS-PAGE电泳分析，发现29.3kD的GLP-1融合蛋白被酶解成26kD的GST标签蛋白和3.3kD的GLP-1重组多肽，见图2(泳道4)；而29.4kD的KGLP-1融合蛋白被酶解成26kD的GST标签蛋白和3.4kD的KGLP-1重组多肽，见图3(泳道7)。摸索融合蛋白的肠激酶酶切时间如图4a所示，酶切时间为10h至12h时，融合蛋白的酶切反应达到稳定。摸索融合蛋白的肠激酶酶切最优缓冲液如图4b所示，肠激酶酶切的最适缓冲液为缓冲液M。经过酶切处理过的蛋白溶液经10kD超滤膜(Millipore)分离，收集10kD以下的滤过蛋白溶液。通过Tricine-SDS-PAGE电泳分析，GLP-1重组多肽的纯度达86.45%，KGLP-1重组多肽的纯度达80.34%，见图2(泳道5)和图3(泳道8)。

实施例4、KGLP-1的化学鉴定

1、HPLC-MS鉴定：

KGLP-1样品经过Tricine-SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮蓝染色后，切下目的条带。胶条用胰蛋白酶(Trypsin)过夜酶解。吸出上清，4℃保存，余下胶粒中加入25μL抽提缓冲液(67%的乙腈，5%的甲酸，28%的超纯水)，超声萃取15min，离心，吸出上清，加入到之前的酶解上清液中。如是萃取三次，每次抽提缓冲液量酌减，最后将总上清液超干后用30～40μL进样缓冲液(5%的0.1%甲酸乙腈)溶解，进样。HPLC流动相：A液H₂O(质谱级)，0.1%甲酸(FA)；B液：乙腈(质谱级)，0.1%FA。检索软件：Proteomics Discovery1.2(Thermo)，检索算法：Sequest。结果表明KGLP-1的N端氨基酸序列组成与预计结果相符，序列为KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(KGLP-1)。

2、HPLC鉴定：

初步纯化后的重组KGLP-1经过分子排阻色谱Sephadex G-75的再纯化，采用HPLC方法测定重组KGLP-1的纯度。高效液相色谱采用X Aqua C8柱(4.6mm×250mm，5μm，300

)对KGLP-1的含量进行测定。液相条件为：梯度洗脱0.1%三氟乙酸(TFA)乙腈和0.1TFA的水，程序条件为：0-20min，95-30%A；20-25min，30-0%A；和25-30min，0-95%。总流速为1.0mL/min；检测波长210nm；柱温为25℃。如图5a所示，重组KGLP-1得到良好的分离，经计算重组KGLP-1的纯度达96.67%。

3、MALDI-TOF鉴定：

采用质谱方法来测定重组KGLP-1的精确分子量。将待测溶液滴到MALDI耙板上，加入α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)，待结晶干燥后，进行质谱分析。所用质谱Autoflex-IIILRF200-CID MALDI-TOF，激光器为SMARTBEAM，波长337nm，加速电压19kV，正离子模式线性TOF检测。如图5b重组KGLP-1的分子量为3425.84D，与KGLP-1标准品的分子量一致。

实施例5、KGLP-1纯化样品的活性鉴定

将CHO/EGFP/GLP-1R细胞接种于96孔板，密度为2×10⁴个/孔，用含100mg/L Zeocin的RPMI-1640完全培养液培养48小时后移去培养液，分别加入用RPMI-1640培养液稀释的重组KGLP-1，KGLP-1标准品阳性对照品和RPMI-1640培养液阴性对照，每孔200μL。在37℃，5%CO₂条件下培养8小时后，用倒置荧光显微镜进行观察。如图6所示，CHO/EGFP/GLP-1R细胞在RPMI-1640培养液中(阴性对照)无绿色荧光蛋白的产生，而在含KGLP-1标准品的RPMI-1640培养液中(阳性对照)有绿色荧光蛋白的产生。在含重组KGLP-1的RPMI-1640培养液中有绿色荧光蛋白的产生，且荧光强度存在明显的剂量依赖性，说明诱导表达纯化产生的重组KGLP-1有很好的生物活性。

SEQUENCE LISTING

<110> 南开大学

<120> 一种制备GLP-1及其类似物的方法

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

His Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln

1 5 10 15

Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His

20 25 30

Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu

35 40 45

Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val

50 55 60

Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His

65 70 75 80

Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu

85 90 95

Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr

100 105 110

Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro

115 120 125

Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu

130 135 140

Asn Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu

145 150 155 160

Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys

165 170 175

Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys

180 185 190

Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln

195 200 205

Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Ser Gly Leu

210 215 220

Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Ser Asp Asp Asp Asp Asp Lys His

225 230 235 240

Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln

245 250 255

Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

260 265

<210> 2

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

His Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln

1 5 10 15

Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His

20 25 30

Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu

35 40 45

Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val

50 55 60

Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His

65 70 75 80

Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu

85 90 95

Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr

100 105 110

Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro

115 120 125

Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu

130 135 140

Asn Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu

145 150 155 160

Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys

165 170 175

Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys

180 185 190

Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln

195 200 205

Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Ser Gly Leu

210 215 220

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225 230 235 240

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

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Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

260 265 270

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cacgccgagg gcacctttac aagcgatgtt agtagctact tagaagggca ggccgccaag 60

gaatttatcg cgtggctcgt taaaggccgt 90

Claims

1.一种如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，依次编码GST标签、肠激酶酶切位点和GLP-1的融合蛋白(GST-GLP-1)。

2.一种表达载体，其特征在于含有权利要求1所述的SEQ ID No.1序列，并可以在大肠杆菌中表达的pET系列载体。

3.一种重组菌株，其特征在于是用权利要求2的表达载体转化的E. Coli BL21菌株。

4.一种如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，依次编码GST标签、肠激酶酶切位点和KGLP-1的融合蛋白(GST-KGLP-1)。

5.一种表达载体，其特征在于含有权利要求4所述的SEQ ID No.2序列，并可以在大肠杆菌中表达的pET系列载体。

6.一种重组菌株，其特征在于是用权利要求5的表达载体转化的E. Coli BL21菌株。

7.一种GLP-1及其类似物KGLP-1的分离方法，其特征是利用基因工程技术融合表达权利要求1或4的基因序列的GST-GLP-1或GST-KGLP-1融合蛋白，经GST亲和层析纯化，肠激酶酶切和超滤步骤除去GST标签蛋白，得到GLP-1或KGLP-1的纯品肽。

8.一种纯化权利要求7所述重组GLP-1及其类似物KGLP-1的纯化方法，其特征在于利用肠激酶特异性酶切经GST亲和层析纯化后的权利要求1或4所述的GST-GLP-1或GST-KGLP-1融合蛋白，释放出GLP-1或其类似物KGLP-1活性肽和GST标签蛋白；具体条件如下：肠激酶用量为1.0至1.5 IU/mg GST亲和层析纯化的融合蛋白；酶切时间为8至24小时；酶切缓冲液为100 mM Tris-HCl，100 mM MgCl₂，10 mM DTT，500 mM NaCl，pH 7.5。

9.根据权利要求8所述的纯化方法，其特征在于利用10 kD超滤膜截留上述权利要求8所酶切下来的GST标签蛋白，离心滤过获得GLP-1或其类似物KGLP-1活性肽。

10.一种权利要求7所述GLP-1及其类似物KGLP-1的分离方法在生物合成以及分离制备多肽领域的应用。