CN104328131A - 人核糖核酸酶4蛋白的重组表达和分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种编码基于人核糖核酸酶4的重组蛋白的基因，为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；所述基于人核糖核酸酶4的重组蛋白为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了上述基于人核糖核酸酶4蛋白的重组表达和分离纯化的方法，包括以下步骤：优化RNASE4编码基因的密码子，使其适合于大肠杆菌原核表达；构建RNASE4蛋白原核表达质粒pET-11a-RNASE4；诱导大肠杆菌BL21(DE3/pET-11a-RNASE4)表达重组RNASE4蛋白；分离和纯化重组RNASE4蛋白。该蛋白用于制备治疗神经退行性疾病的辅助药物。

Description

人核糖核酸酶4蛋白的重组表达和分离纯化方法

技术领域

本发明涉及人核糖核酸酶4蛋白的重组表达及其分离纯化的方法，以及其在治疗神经退行性疾病中的应用，属于生物技术和生物制药领域。

背景技术

核糖核酸酶-4(Ribonuclease-4，RNASE4)蛋白最初是从肿瘤细胞培养液中纯化和鉴定的，被称为“肿瘤核糖核酸酶”。成熟的RNASE4蛋白是一个由119个氨基酸残基组成的分泌型单链碱性蛋白质，相对分子量约为13.8kDa。RNASE4蛋白作为核糖核酸酶A超家族的成员，主要通过水解底物RNA参与各种生物学过程。与家族其它成员相同，RNASE4蛋白专一性水解RNA链上的嘧啶核苷酸3'端的5'-磷酯键，进而产生寡核苷酸或核苷酸。RNASE4蛋白保留了该家族共有的结构特性，包括三个酶催化位点(His-12，Lys-40和His-116)、保守序列CKXXNTF(XX为任意氨基酸)和由8个半胱氨酸残基形成的分子内二硫键(Cys25-Cys81,Cys39-Cys92,Cys57-Cys107和Cys64-Cys71)。然而，RNASE4蛋白又具自身的结构特征。与牛胰核糖核酸酶A(RNase A)结构相比较，该酶的C端缺少了核糖核酸酶活性位点Ser-123，并且核酸催化结合结构域中的一些氨基酸残基也被相应的替换，如RNaseA上Pro-42、Val-43和Lys-104分别被RNASE4上Arg-41、Phe-42和Arg-101替换。以上独特的结构导致RNASE4蛋白有别于其它核糖核酸内切酶，即更偏好于水解尿嘧啶核苷酸而非胞嘧啶核苷酸。事实上，体外核苷酸酶切反应显示，RNASE4蛋白水解双核苷酸能力依次为UpA>UpG>UpC>UpU，其水解酵母tRNA产生的寡核苷酸3'端也绝大多数是尿嘧啶核苷酸。此外，RNASE4蛋白是整个核糖核酸酶A超家族中进化最为保守的成员。RNASE4蛋白的一级序列在脊椎动物中的相似度高达90％，远高于家族其它成员。RNASE4蛋白这种高度的物种间保守性和独有的尿嘧啶核苷酸酶切偏好性，提示该酶可能通过其独特的核糖核酸酶活性执行一些基本的生物学功能。

至今，RNASE4蛋白有如下生物学功能：1)RNASE4蛋白可参与宿主防御，是CD8+T细胞响应艾滋病病毒(HIV)X4病毒株感染而释放的两种核糖核酸酶之一，其基本作用机制是降解病毒RNA而抑制X4病毒株的复制；2)RNASE4蛋白可促进血管新生，该活性也依赖于核糖核酸酶活性；3)RNASE4蛋白可诱导小鼠胚胎干细胞分化成为神经细胞，并在应激条件下保护神经细胞的存活，注射重组人类RNASE4蛋白可以显著延缓小鼠的体重下降和神经肌肉功能的衰退。因此，RNASE4蛋白是一种潜在的抗病毒以及治疗神经退行性疾病的药物。

由于人源细胞中天然状态的RNASE4蛋白含量非常低，分离获得大量天然产物十分困难。而多肽合成成本过高，缺乏作为药物生产的应用前景。迄今为止，亦无文献报道过人源RNASE4蛋白原核表达纯化方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种人核糖核酸酶4蛋白的重组表达和分离纯化方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种编码基于人核糖核酸酶4的重组蛋白的基因，为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

所述基于人核糖核酸酶4的重组蛋白为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

备注说明：

SEQ ID NO：2的序列特征如下：长度：375bp，类型：脱氧核苷酸序列，链型：双链，拓扑结构：线性，特征：序列5’端和3’端下划线标注为加入的限制性内切酶BamH I和Nhe I位点，加粗标注的“ATG”为起始密码子、“TAA”为终止密码子。来源：人工合成。

SEQ ID NO：1的序列特征如下：长度：120个氨基酸，类型：氨基酸，链型：单链，拓扑结构：线型，特性：成熟的RNASE4蛋白包含120个氨基酸，分子量为13.8kDa，等电点为10.3；来源：人类。

本发明还同时提供了基于人核糖核酸酶4蛋白的重组表达和分离纯化的方法，包括以下步骤：

1)、优化RNASE4编码基因的密码子，使其适合于大肠杆菌原核表达；

2)、构建RNASE4蛋白原核表达质粒pET-11a-RNASE4；

3)、诱导大肠杆菌BL21(DE3/pET-11a-RNASE4)表达重组RNASE4蛋白；

4)、分离和纯化重组RNASE4蛋白：

包括细菌包涵体获取、蛋白质变性和复性、SP-琼脂糖凝胶离子交换色谱纯化以及C18反相高效液相色谱进一步纯化。

本发明还同时提供了上述基于人核糖核酸酶4的重组蛋白的用途：制备治疗神经退行性疾病的辅助药物。

即，基于人核糖核酸酶4的重组蛋白(RNASE4重组蛋白)具有促进神经细胞分化和减缓神经细胞受损进程作用。

作为本发明的基于人核糖核酸酶4的重组蛋白的用途的改进：神经退行性疾病包括肌萎缩侧索硬化症、帕金森综合症、阿尔茨海默病。

具体而言：

本发明涉及一种重组人核糖核酸酶4(RNASE4，其成熟蛋白质序列如SEQ ID NO.1所示)蛋白的原核表达和分离纯化的技术方案。本发明的具体技术方案如下：优化RNASE4编码基因的密码子，构建RNASE4蛋白原核表达质粒，诱导大肠杆菌BL21(DE3/pET-11a-RNASE4)表达重组RNASE4蛋白，分离和纯化重组RNASE4蛋白。

本发明的基于人核糖核酸酶4的重组蛋白的活性包括核糖核酸酶活性和促血管生成活性。

本发明的基于人核糖核酸酶4的重组蛋白的应用为：在制备治疗神经退行性疾病辅助药物中的应用。即：RNASE4重组蛋白具有促进神经细胞分化和减缓神经细胞受损进程作用，可作为神经退行性疾病(包括肌萎缩侧索硬化症、帕金森综合症、阿尔茨海默病等)辅助药物。

本发明根据人RNASE4基因的编码序列，通过大肠杆菌同义密码子优化，构建原核表达质粒，并且通过上述一系列的分离和纯化过程，最终获得RNASE4重组蛋白。

本发明具有以下三方面的有益效果：

1)本发明方法操作简单，可以降低生产成本；

2)本发明中RNASE4重组蛋白纯度搞到99.9％以上，且密码子优化后得率高，适应于工业化大规模生产；

3)本发明中RNASE4蛋白具有保护神经退行性疾病的效果，可以作为潜在的治疗药物，具有重要的研究和医用价值。

本发明制备而得的重组RNASE4蛋白的使用方法和用量参照RNASE4蛋白。

综上所述，本发明描述了一套原核表达和分离纯化RNASE4重组蛋白的技术方案，通过构建原核表达载体pET11a-hRNASE4，且对RNASE4蛋白的编码密码子进行优化，在大肠杆菌中高效表达重组RNASE4蛋白，进一步，分离和纯化出纯度高达99.9％以上的具有核糖核酸酶活性的重组RNASE4蛋白。本发明为研究RNASE4蛋白的生物学功能以及将其开发成治疗神经退行性疾病新药提供了基本实验材料。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是pET-11a-RNASE4质粒构建图谱；

图2是RNASE4重组蛋白表达效率图；

电泳泳道1表示未经IPTG诱导的细菌裂解液，电泳泳道2表示经IPTG诱导后的细菌裂解液。

图3是C18反相高效液相色谱的色谱图和峰值；

图4是RNASE4重组蛋白质谱鉴定结果；

图5是RNASE4重组蛋白的核糖核酸酶活性检测(tRNA降解实验)图；

图6是RNASE4重组蛋白的核糖核酸酶活性检测(总RNA降解实验)图；

图7是RNASE4重组蛋白促血管生成活性检测(管腔形成实验)图；

图8是RNASE4基因密码子优化对其表达量的影响图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述纯化的RNASE4重组蛋白的应用做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限制本发明的范围。RNASE4蛋白具有核糖核酸酶和促血管生成的活性。为此，本发明还包括RNASE4重组蛋白的生物学活性检测。

实施例1、基于人核糖核酸酶4蛋白的重组表达和分离纯化的方法，依次进行以下步骤：

第一，优化RNASE4编码基因的密码子：

根据《大肠杆菌同义密码子偏好性表》等改造RNASE4的编码基因，最终所得的密码子优化后的序列如SEQ ID NO.2所示。为了方便后续原核表达载体的构建，在合成密码子优化的RNASE4基因同时在该基因的5'-和3'-端分别加入了限制性内切酶BamH I和Nhe I位点(如SEQ ID NO.2中下划线所示)。合成的基因构建于pUC57载体上，便于下一步的原核表达质粒的构建。

第二，构建RNASE4蛋白原核表达质粒：

将合成的RNASE4基因插入原核表达载体pET-11a，具体实验过程如下：利用限制性内切酶BamH I和Nhe I酶切pUC57-RNASE4质粒获取密码子优化后的RNASE4基因片段，于此同时原核表达载体pET-11a用BamH I和Nhe I酶切获得线性化载体；接下来，利用T4DNA连接酶将RNASE4基因片段连接至线性化pET-11a载体上，经细菌转化、单克隆挑取、质粒提取以及测序确定读码框一致后，获得RNASE4原核表达质粒pET-11a-RNASE4。上述质粒构建如图1所示。

第三，诱导大肠杆菌BL21(DE3/pET-11a-RNASE4)表达重组RNASE4蛋白。

将上述构建的原核表达质粒pET-11a-RNASE4转化到表达大肠杆菌BL21(DE3)，具体诱导表达过程如下：扩增培养表达菌后，将菌重新接种于1升新的2xYT培养液(配方：1.6％(w/v)胰蛋白胨，1％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)NaCl，和50mg/ml氨苄青霉素)中，37℃恒温摇菌至OD₆₀₀＝0.6～0.8之间；加入0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)于37℃诱导表达2小时后，于12000rpm离心2分钟，得到含有所述RNASE4重组蛋白的菌体。

备注说明：1.6％(w/v)代表：每1000ml中含有16g。其余类同。

然后，用100ml PBS重悬上述菌体后，取样10μl加入2×SDS凝胶上样缓冲液10μl，于100℃煮沸10分钟；离心(12000rpm离心1分钟)后的上清作为样品，用15％SDS-PAGE分离细菌裂解液(即，作为样品的上清)，用考马斯亮蓝染色分析重组RNASE4蛋白表达情况。上述分析如图2所示，电泳泳道1表示未经IPTG诱导的细菌裂解液，电泳泳道2表示经IPTG诱导后的细菌裂解液。通过图2，我们得出结论：RNASE4重组蛋白诱导表达成功。

第四，分离和纯化重组RNASE4蛋白，该过程主要涉及细菌包涵体获取、蛋白质变性和复性、SP-琼脂糖凝胶离子交换色谱以及C18反相高效液相色谱等步骤；

具体如下：

①细菌包涵体获取：

RNASE4重组蛋白主要以包涵体的形式存在于表达菌体中，IPTG诱导表达后的5g菌体(即，含上述RNASE4重组蛋白的菌体)经100ml PBS洗涤后，重悬于100ml细菌裂解液(配方：50mM Tris-HCl pH 8.0,2mM EDTA,100mM NaCl,1％Triton X-100(v/v),1mg/ml溶菌酶)，于室温放置1小时。利用超声波破碎仪对细菌进行超声破碎(超声方案：宁波新芝超声细胞破碎仪，功率400W，超30秒，间隔30秒，超声5分钟)，细菌悬液于4℃、12000rpm离心20分钟后取沉淀，上述沉淀用100ml包涵体洗涤缓冲液(配方：50mM Tris-HCl,pH 7.5,1％Triton X-100(v/v))在常温下重悬后，搅拌洗涤30分钟，于4℃、12000rpm离心20分钟后，弃去上清液，重复一次洗涤过程(即，重复使用包涵体洗涤缓冲液重悬、洗涤、离心)，最后获得淡黄色透明胶状的包涵体。

②蛋白质变性：

然后，利用强变性剂盐酸胍溶液(配方：7M Guanidine hydrochloride(盐酸胍),0.15Mreduced glutathione(还原型谷胱甘肽),0.1M Tris-HCl,2mM EDTA(乙二胺四乙酸),pH 8.0)在惰性环境下溶解包涵体(用量比为：2g包涵体配用20ml强变形剂盐酸胍溶液)，用磁力搅拌子不断混匀，反应2小时(反应温度为25℃)，再次离心(12000rpm离心10分钟)，收集获得上清用0.45微米滤膜过滤。

经过本步骤，包涵体基本溶解，RNASE4蛋白呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但是其一级结构和共价键并未破坏。

③蛋白质复性

上述收集得到的20ml变性RNASE4蛋白溶液逐滴滴入1L的复性缓冲溶液(0.5ML-Arginine-HCl(L-精氨酸盐酸盐),pH 8.0,0.6mM Oxidized glutathione(氧化型谷胱甘肽))，室温中静置24小时，于4℃、12000rpm离心去除沉淀，并稀释于五倍体积的双蒸水中，得到复性的RNASE4蛋白溶液。

④、SP-琼脂糖凝胶离子交换色谱纯化：

取阳离子交换基质SP-Sepharose装柱，柱体积5.4×20cm，用平衡缓冲溶液(配方：25mMTris-HCl,0.2M NaCl,pH8.0)流洗平衡层析柱，同时调整好紫外蛋白检测仪的量程及记录仪灵敏度。将收集的复性的RNASE4蛋白溶液以3ml/min流速上样。用平衡缓冲溶液平衡缓液冲直至流出液吸光值恢复至基线。用洗脱缓冲液(配方：25mM Tris-HCl,1M NaCl,pH8.0)以1ml/min的流速洗脱RNASE4重组蛋白，收集穿过峰，量体积并测量蛋白质浓度。

④C18反相高效液相色谱进一步纯化：

经过SP-琼脂糖凝胶离子交换色谱纯化后的RNASE4重组蛋白液纯度可以达到85％左右，为了进一步得到高纯度的RNASE4重组蛋白，利用C18反相高效液相色谱进行进一步纯化。安装好反相高效液相色谱仪器(该设备一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成)，配制固定相缓冲液A(配方：0.1％(v/v)TFA(三氟乙酸))和流动相缓冲液B(配方：0.08％(v/v)TFA，异丙醇：乙氰：水为3：2：2的体积比)。C18反相高效液相色谱纯化首先利用60％(体积％)的甲醇冲洗色谱柱，去除色谱柱中残留的杂质，然后按照如下程序进行纯化RNASE4重组蛋白。

C18反相高效液相色谱程序：

C18反相高效液相色谱的色谱图和峰值如图3所示，经上述过程得到的RNASE4重组蛋白的活性将达到99.9％以上。RNASE4重组蛋白溶液经冷冻真空干燥仪冻干(-80℃冻干至恒重)获得RNASE4蛋白粉末，用于后续的检测分析。

本发明利用质谱仪对RNASE4重组蛋白的分子量进行检测和鉴定，分析结果如图4所示，RNASE4重组蛋白在分子量特性上与现有的Biochemistry.1986Nov 18；25(23):7255-64相一致。

将上述实施例1制备而得的RNASE4重组蛋白进行如下活性检测。

实验1.RNASE4重组蛋白的核糖核酸酶活性检测

核糖核酸酶活性主要利用体外生化反应体系检测RNASE4蛋白对tRNA和总RNA的降解能力；

tRNA反应体系为600ng酵母tRNA，0.33M HEPES，0.33M NaCl，pH 7.0和0.1mg/mlRNASE-free BSA，加入不同量的RNASE4重组蛋白后，在37℃反应2小时。然后，加入预冷的3.4％高锰酸冰浴10分钟，用紫外分光光度仪检测260nm的吸收值，分析结果如图5所示。

图5中：BSA、RNASE4和RNASE A分别代表牛血清白蛋白、重组核糖核酸酶4蛋白和重组核糖核酸酶A蛋白。通过图5中BSA、RNASE4、RNASE A的对比，我们能获得以下结论：重组RNASE4蛋白与阳性对照RNASEA具有相似，具有非常强的核糖核酸酶活性，说明重组的蛋白具有生物学活性。

同时，总RNA反应体系为500ng HeLa细胞总RNA，1mM Tris-HCl,pH 7.0，加入10ng的RNASE4重组蛋白，在37℃反应1小时，然后加入2×RNA上样缓冲液，1％甲醛琼脂糖凝胶电泳分离总RNA，观察28S和18S的完整性，分析结果如图6所示。

图6中：control代表未加入重组蛋白的对照，RNASE4代表加入10ng RNASE4重组蛋白的实验组。通过图6，我们能获得以下结论：重组的RNASE4蛋白能够降解总RNA，表明其具有核糖核酸酶活性。

2.RNASE4重组蛋白的促血管生成活性检测

RNASE4蛋白好具有促血管生成活性，而人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的管腔形成能力是评价生长因子促血管生成活性方法之一。该方法如下：BD Matrigel，Growth Factor Reduced(GFR)置于冰浴中，放在4℃融化过夜，同时μ-slide angiogenesis孔板、枪头、离心管等置4℃预冷过夜；然后，取适量的matrigel，混匀，4℃，～12,000g离心2min；用预冷的枪头吸取11μl matrigel，铺于μ-slide孔板的中心，避免产生气泡；将μ-slide孔板在室温放置10min，然后转移至37℃培养箱中放置30min；胰酶消化收集HUVEC并计数，调整细胞数至1～10×10⁴/ml；吸取50μl细胞悬液到1.5ml离心管中，300g离心2min；用无血清培养基洗涤细胞两次，300g离心2min；细胞用50μl配置好的细胞培养液(包含阴性对照组Negativecontrol，促血管生成的阳性对照组Positive control，以及重组蛋白RNASE4实验组)重悬后加入到μ-slide孔板中，于37℃培养箱中培养；5～6小时后可用显微镜进行拍照，随机选取5个视野；图片用Image-Pro Plus 6.0软件进行分析，统计分析管腔形成的长度及分支点等指标。分析结果如图7所示。通过图7，我们获得以下结论：重组的RNASE4蛋白可以促进人脐静脉内皮细胞形成管腔，表明其具有促血管生成的活性。

以上生物学活性检测说明本发明获得的RNASE4重组蛋白具有生物学活性，可用于后续的研究分析。

对比实验：

为了比较密码子优化与否对重组RNASE4蛋白表达的影响，我们利用蛋白质电泳方法比较了RNASE4密码子优化(SEQ ID NO：2所示序列)和密码子未优化(SEQ ID NO：3所示序列)的表达载体在细菌中重组蛋白表达水平以及通过相同分离和纯化过程获得最终重组蛋白量，结果如图8所示。

备注说明：SEQ ID NO：3的序列特征：长度：375bp，类型：脱氧核苷酸序列，链型：双链，拓扑结构：线性，特征：序列5’端和3’端下划线标注为加入的限制性内切酶BamH I和Nhe I位点，加粗标注“ATG”为起始密码子、“TAG”为终止密码子；来源：自然存在。

图8中：泳道1表示密码子未优化表达菌的经IPTG诱导后细菌裂解液中重组RNASE4的表达量；泳道2表示经密码子优化后相同量的细菌裂解液中重组RNASE4的表达量；泳道3表示密码子未优化的最终获得重组RNASE4蛋白量；泳道4表示密码子优化后最终获得重组RNASE4蛋白量，其中最终获得重组蛋白溶于相同的缓冲液后，两者上样体积一致。同时，我们计算了5g相同量的表达菌最终获得重组蛋白的含量，未经密码子优化的表达载体最终获得约2mg的重组RNASE4蛋白，而经密码子优化的表达载体可以获得约10mg的重组蛋白，具有显著的差异。以上结果说明：本发明中经密码子优化后可以显著的提高重组蛋白的表达量。

对比例、已有文献报道分别从肿瘤细胞培养液分离纯化RNASE4蛋白(Biochemistry.1986Nov 18；25(23):7255-64)或者通过化学方法合成RNASE4蛋白(Proc Natl Acad Sci U S A.2012Apr 3；109(14):5411-6)。这些方法存在一定的局限性：第一，从肿瘤细胞培养液中分离纯化RNASE4蛋白的方法存在产量低和成本高的缺点，通常1500L的细胞培养液中才能纯化约几百微克的RNASE4蛋白，相比本发明1L细菌培养可以分离纯化10毫克的重组RNASE4蛋白，相差几个数量级。因此，本方法的方法更适用于大规模工业生产。第二，通过化学方法合成RNASE4蛋白，不仅无法大规模生产RNASE4蛋白，而且该方法为防止脱酰氨基、分子内自连等作用需对其中的氨基酸做相应改变，例如需将第66位天冬氨酸换成丙氨酸，序列的改变可能导致生物学活性的改变。而本方法获得的重组RNASE4蛋白经核糖核酸酶活性和促血管生成活性检测，均具有生物学活性，为下游的应用提供了保证。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江大学

 

<120> 人核糖核酸酶4蛋白的重组表达和分离纯化方法

 

<160> 3

 

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> 人 (Homo sapiens)

 

<400> 1

Met Gln Asp Gly Met Tyr Gln Arg Phe Leu Arg Gln His Val His

1     5     10     15

Pro Glu Glu Thr Gly Gly Ser Asp Arg Tyr Cys Asn Leu Met Met

20     25     30

Gln Arg Arg Lys Met Thr Leu Tyr His Cys Lys Arg Phe Asn Thr

35     40     45

Phe Ile His Glu Asp Ile Trp Asn Ile Arg Ser Ile Cys Ser Thr

50     55     60

Thr Asn Ile Gln Cys Lys Asn Gly Lys Met Asn Cys His Glu Gly

65     70     75

Val Val Lys Val Thr Asp Cys Arg Asp Thr Gly Ser Ser Arg Ala

80     85     90

Pro Asn Cys Arg Tyr Arg Ala Ile Ala Ser Thr Arg Arg Val Val

95     100     105

Ile Ala Cys Glu Gly Asn Pro Gln Val Pro Val His Phe Asp Gly

110     115      120

 

 

<210> 2

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223>  RNASE4密码子优化

 

<400> 2

catatg atgc aggacggtat gtaccaacgt ttcctgcgtc agcatgtaca ccctgaagaa      60

accggtggtt ctgaccgtta ctgtaacctg atgatgcagc gtcgtaagat gacgctgtac      120

cactgtaaac gcttcaacac cttcatccac gaggacatct ggaacatccg cagcatctgc      180

agcactacca acatccagtg caaaaacggc aaaatgaact gccatgaagg cgtggtgaaa      240

gtcaccgatt gccgcgatac cggttcctcc cgtgcaccaa actgtcgtta tcgtgctatt      300

gcgtctactc gtcgcgttgt aattgcctgc gaaggcaatc cgcaggttcc ggttcacttt      360

gatggctaa g gatcc                                            375

 

 

<210> 3

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223>  RNASE4密码子未优化

 

<400> 3

catatg atgc aggatggcat gtaccagcga ttcctgcggc aacacgtgca ccctgaggag      60

acaggtggca gtgatcgcta ctgcaacttg atgatgcaaa gacggaagat gactttgtat       120

cactgcaagc gcttcaacac cttcatccat gaagatatct ggaacattcg tagtatctgc       180

agcaccacca atatccaatg caagaacggc aagatgaact gccatgaggg tgtagtgaag      240

gtcacagatt gcagggacac aggaagttcc agggcaccca actgcagata tcgggccata      300

gcgagcacta gacgtgttgt cattgcctgt gagggtaacc cacaggtgcc tgtgcacttt      360

gacggttag ggatcc                                             375

 

 

Claims (4)

1.编码基于人核糖核酸酶4的重组蛋白的基因，其特征在于：为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

所述基于人核糖核酸酶4的重组蛋白为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1中所述的基于人核糖核酸酶4蛋白的重组表达和分离纯化的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、优化RNASE4编码基因的密码子，使其适合于大肠杆菌原核表达；

2)、构建RNASE4蛋白原核表达质粒pET-11a-RNASE4；

3)、诱导大肠杆菌BL21(DE3/pET-11a-RNASE4)表达重组RNASE4蛋白；

4)、分离和纯化重组RNASE4蛋白：

包括细菌包涵体获取、蛋白质变性和复性、SP-琼脂糖凝胶离子交换色谱纯化以及C18反相高效液相色谱进一步纯化。

3.如权利要求1中所述的基于人核糖核酸酶4的重组蛋白的用途，其特征在于：制备治疗神经退行性疾病的辅助药物。

4.根据权利要求3所述的基于人核糖核酸酶4的重组蛋白的用途，其特征在于：神经退行性疾病包括肌萎缩侧索硬化症、帕金森综合症、阿尔茨海默病。