CN103397038B - 一种人白细胞介素-38的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人白细胞介素-38的生产方法，采用基因工程方法生产，该基因工程方法包括以下步骤：1）合成PCR引物；2）PCR扩增目的基因获得IL-38目的基因片段；3）构建重组载体pET-44-hIL-38；4）将重组载体pET-44-hIL-38转化大肠杆菌，构建重组IL-38工程菌；5）培养构建的重组IL-38工程菌，诱导其表达生产IL-38蛋白。本发明方法能使IL-38高效表达、高效纯化并获得高纯度、高生物活性的IL-38蛋白产品；该工程菌表达的IL-38主要为可溶性成分，纯化后相对的生物学活性较高；用Ni-NAT对表达的IL-38进行纯化即可得到较高纯度的IL-38蛋白。IL-38蛋白的成功制备，为探究IL-38在各种炎症疾病中的作用及机制、信号通路等研究提供了前提，并为开发预治炎症及自身免疫性疾病的新型临床药物奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种人白细胞介素-38的生产方法。
背景技术
白细胞介素-38（interleukin-38，简称IL-38）是最近发现的IL-1家族细胞因子的第10个成员，主要在皮肤和扁桃体的增殖的B细胞中表达。IL-38基因大小为7.8 kb，其中包含5个外显子。IL-38的初始翻译产物是长度为152个氨基酸残基组成的IL-38前体蛋白，其分子质量约为16.9 kDa。序列分析表明，IL-38蛋白与IL-1Ra、IL-36Ra蛋白分别有41%、43%的相似性，但其与IL-1β及其他IL-1家族成员只有14%~30%的同源性。另有研究表明，IL-38蛋白无保守糖基化位点，如在中国仓鼠卵巢细胞中，IL-38重组蛋白无N/O糖基化。IL-38分子的结构具有与其他典型的IL-1家族成员相似的一般特性。IL-38和一些IL-1家族成员(如IL-36Ra、IL-36α、IL-36β、IL-36γ等)一样都缺乏信号肽和caspase-1切割位点。并且IL-38的自然N端结构是未知的。有学者根据IL-1Ra和IL-36Ra的结构，通过PSI-BLAST、Seq Fold分析方法预测IL-38的三维结构，结果显示其结构与IL-1Ra相似，呈β-三叶草结构。人IL-38基因定位于2q13-14.1。IL-38的特异性受体是IL-36R，是IL-36的部分受体拮抗剂。IL-38可抑制Th17细胞产生的IL-17和IL-22等炎症介质，也可抑制IL-36γ诱导产生IL-8，从而抑制炎症反应。与IL-38有类似拮抗作用的IL-1Ra和IL-36Ra分别被证明参与关节炎或牛皮癣等疾病。研究也已证明IL-38的特异性受体是IL-36R，所以IL-38与IL-36介导的相关炎症性疾病可能有密切关联。因此，IL-38可能是作为预治炎症、自身免疫性疾病的一种新型药物，可用于炎性疾病的预防和治疗。但是目前关于IL-38相关报道或生产方法都鲜见报道，更没有相关产品的问世。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种表达效率高的人白细胞介素-38的生产方法。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种人白细胞介素-38的生产方法，采用基因工程方法生产，所述的基因工程方法包括以下步骤：
1）合成PCR引物，并在合成的引物中导入Nde I和Xho I酶切位点，
上游引物为5-GGAATTCCATATGTGTTCCCTCCCCATG-3，
下游引物为5-CCGCTCGAGCCAGCTCTGTTCAAAG-3；
2）PCR扩增目的基因：以pcDNA3.1-hIL-38质粒为模板，用上述合成的PCR引物进行PCR扩增，获得IL-38目的基因片段；
3）构建重组载体：将上述PCR扩增得到的IL-38基因片段行Nde I、Xho I双酶切后电泳回收，与经同样的双酶切法进行酶切后的pET-44载体质粒的回收大片段经T4 DNA连接酶定向连接，构建原核表达重组载体pET-44-hIL-38；
4）转化：将重组载体pET-44-hIL-38转化大肠杆菌，经测序检测正确后即为构建的重组IL-38工程菌；
5）培养：培养构建的重组IL-38工程菌，诱导其表达生产IL-38蛋白。
优选地，步骤5）中，用IPTG诱导重组IL-38工程菌表达生产IL-38。
优选地，步骤5）中，所述的IL-38工程菌的培养基为LB液体培养基或LB固体培养基。
优选地，步骤2）中，所述的PCR扩增的反应条件为①98℃预变性5min或95℃预变性10min；②98℃变性10s或95℃变性30s；③58℃退火15s；④72℃延伸1min，②-④共30个循环；⑤72℃充分延伸10min。
与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明人白细胞介素-38的生产方法，采用基因工程技术，根据需求构建得到IL-38重组工程菌，能使IL-38高效表达、高效纯化并获得高纯度、高生物活性的IL-38蛋白产品；该工程菌表达的IL-38主要为可溶性成分，纯化后相对的生物学活性较高；由于表达的蛋白C端带有6个His-Tags，用Ni-NAT进行纯化即可得到较高纯度的IL-38蛋白。IL-38蛋白的成功制备，为探究IL-38在各种炎症疾病中的作用及机制、信号通路等研究提供了前提，并为开发预治炎症及自身免疫性疾病的新型临床药物奠定了基础。
附图说明
图1为重组质粒pET-44-hIL-38的构建图谱；
图2为重组质粒pET-44-hIL-38的测序结果；
图3为IL-38表达量的SDS-PAGE分析图谱；
图4为可溶性分析及纯化后IL-38的SDS-PAGE分析图谱。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例的人白细胞介素-38的生产方法包括以下步骤：
1）合成PCR引物：根据GenBank中人白细胞介素IL-38 cDNA基因序列设计并合成一对PCR引物，并在合成的引物中导入Nde I和Xho I酶切位点，方便后期构建，
上游引物为5-GGAATTCCATATGTGTTCCCTCCCCATG-3（下划线处为Nde I酶切位点），下游引物为5-CCGCTCGAGCCAGCTCTGTTCAAAG-3（下划线处为Xho I酶切位点）；
2）PCR扩增目的基因：以pcDNA3.1-hIL-38质粒为模板，用上述合成引物进行PCR扩增，获得IL-38目的基因片段。PCR扩增反应条件为：①98℃预变性5min或95℃预变性10min；②98℃变性10s或95℃变性30s；③58℃退火15s；④72℃延伸1min，②-④共30个循环；⑤72℃充分延伸10min。1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。上述pcDNA3.1-hIL-38质粒的获得详情可见文章：袁仙丽，徐玉莲，高雪明，李燕，李明才，王亚清，高巧艳. 人白细胞介素-38基因的克隆及序列分析. 生物技术, 2013, 23(2)：1-4；
3）PCR产物与pET-44载体连接：将上述PCR方法扩增的IL-38基因行Nde I、Xho I双酶切后电泳回收，与用同样的双酶切法进行酶切后的pET-44载体质粒的回收大片段经T4 DNA连接酶定向连接，构建原核表达重组载体pET-44-hIL-38。重组载体pET-44-hIL-38的构建图谱如图1所示；
4)连接产物转化大肠杆菌、培养：将上述重组载体pET-44-hIL-38转化感受态受体菌BL21(DE3)，将转化产物涂布于含Amp的LB琼脂平板培养基上37℃培养约16h。次日挑取培养皿上单菌落，并用菌落PCR鉴定阳性重组子。挑取阳性菌落接种于含有Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养12~16h，提取重组质粒，进行酶切验证。最后，选择酶切和PCR鉴定均为阳性重组质粒pET-44-hIL-38进行序列测定。测序鉴定正确的菌体即为IL-38重组工程菌。测序结果如图2所示；
5）IPTG诱导IL-38蛋白表达：将IL-38重组工程菌接种于5mL含Amp的LB培养基中，37℃、200r/min震荡培养过夜。次日，以1:50比例扩大培养，37℃、200r/min震荡培养1.5~2h，至OD600达到0.4~0.6时，取1mL菌液收集菌体作为阴性对照，加入终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导，取诱导时间为1h、2h、3h、4h、5h、6h、20h各1mL菌液收集菌体。将上述收集的样品作SDS-PAGE分析，发现6 h为最适诱导时间。SDS-PAGE分析结果如图3所示，图3中，M为蛋白标准分子量，1为未诱导细菌总蛋白，2~7分别为诱导1h、2h、3h、4h、5h、6h后细菌总蛋白，8为诱导20h后细菌总蛋白，9为IL-37阳性对照细菌总蛋白；
6）蛋白可溶性分析：用上述诱导方法收集菌液1mL/tube，共2管，另取1管未诱导菌液为阴性对照。将上述3管样品分别用30 μL PBS重悬，分别加0.2μL的10mg/mL溶菌酶，37℃水浴孵育15min，加0.5μL的10% SDS室温放置15~30min，使菌体充分裂解，再加0.2μL核酸酶使溶液变得不粘稠。取诱导样品管1管12000r/min离心20min，将上清液移至另一1.5mL EP管，沉淀用30μL PBS重悬。上述4管处理的样品分别加10μL的4倍蛋白质样品上样缓冲液混匀，煮沸5min。进行SDS-PAGE分析。结果显示，目的蛋白IL-38大部分处于上清中，即为可溶性蛋白。如图4所示，图4中，M为蛋白标准分子量，1为未诱导细菌总蛋白，2为诱导6 h后细菌总蛋白，3为破菌后细菌沉淀总蛋白，4为破菌后上清总蛋白，5为纯化后的IL-38；
7）IL-38的分离纯化：采用上述裂解法获取大体积的菌体裂解液上清（如300mL菌液），按Ni-NAT纯化说明书进行纯化，可获得纯度在95%以上的IL-38蛋白。纯化后的蛋白SDS-PAGE分析结果如图4所示。
Claims (3)
1.一种人白细胞介素-38的生产方法，其特征在于采用基因工程方法生产，所述的基因工程方法包括以下步骤：
1)合成PCR引物，并在合成的引物中导入Nde I和Xho I酶切位点，
上游引物为5-GGAATTCCATATGTGTTCCCTCCCCATG-3，
下游引物为5-CCGCTCGAGCCAGCTCTGTTCAAAG-3；
2)PCR扩增目的基因：以pcDNA3.1-hIL-38质粒为模板，用上述合成的PCR引物进行PCR扩增，获得IL-38目的基因片段；所述的PCR扩增的反应条件为①98℃预变性5min或95℃预变性10min；②98℃变性10s或95℃变性30s；③58℃退火15s；④72℃延伸1min，②-④共30个循环；⑤72℃充分延伸10min；
3)构建重组载体：将上述PCR扩增得到的IL-38基因片段行Nde I、Xho I双酶切后电泳回收，与经同样的双酶切法进行酶切后的pET-44载体质粒的回收大片段经T4DNA连接酶定向连接，构建原核表达重组载体pET-44-hIL-38；
4)转化：将重组载体pET-44-hIL-38转化大肠杆菌，经测序检测正确后即为构建的重组IL-38工程菌；
5)培养：培养构建的重组IL-38工程菌，诱导其表达生产IL-38蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种人白细胞介素-38的生产方法，其特征在于步骤5)中，用IPTG诱导重组IL-38工程菌表达生产IL-38。
3.根据权利要求1所述的一种人白细胞介素-38的生产方法，其特征在于步骤5)中，所述的IL-38工程菌的培养基为LB液体培养基或LB固体培养基。
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| 人白细胞介素-10在大肠杆菌中的高效可溶性表达及一步纯化;李明才等;《汕头大学医学院学报》;20060930;第19卷(第03期);正文第1.3-1.5节 * |
| 人白细胞介素-38基因的克隆及序列分析;袁仙丽等;《生物技术》;20130415;第23卷(第2期);正文第1.1.2、1.2和2.2节 * |
| 重组人IL-29的原核表达、纯化及活性分析;李明才等;《第四军医大学学报》;20061215;第27卷(第23期);第2131-2134页 * |
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