CN101892241B - 一种草鱼白细胞介素1β基因和蛋白及其重组表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种草鱼白细胞介素1β基因和蛋白及其重组表达方法。本发明提供了草鱼白细胞介素1β基因和基因编码的草鱼白细胞介素1β蛋白。草鱼白细胞介素1β基因的重组表达方法，利用同源克隆技术克隆得到草鱼白细胞介素1β基因的cDNA全序列，利用草鱼白细胞介素1β基因的成熟肽序列构建原核表达载体，筛选出一种用于高效表达草鱼白细胞介素1β基因的重组表达体系；其具体步骤为：步骤1.基因克隆；步骤2.重组表达载体的构建与筛选；步骤3.重组蛋白的表达及表达产物的分离纯化。本发明的有益效果：通过本发明的技术方案可以工业化生产重组草鱼白细胞介素1β，重组草鱼白细胞介素1β可用于鱼类免疫机制的理论研究。

Description

一种草鱼白细胞介素1β基因和蛋白及其重组表达方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种草鱼白细胞介素1β基因的重组表达和纯化技术。

背景技术

细胞因子是由多种细胞产生的一类非抗体非补体能调节细胞生长分化，调节免疫功能，参与炎症发生及创伤愈合的激素样(微量而高效)可溶性小分子多肽类物质。白细胞介素1β(IL-1β，Interleukin-1β)是白细胞介素1细胞因子家族的成员之一，除IL-1β外该家族还包括白细胞介素-1α、白细胞介素-1受体拮抗物(IL-1Ra)和白细胞介素-18以及新发现的一些成员。白细胞介素-1β是一种重要的炎症介质和免疫因子，在机体的免疫应答中发挥着广泛的调节作用，如激活T细胞、B细胞和自然杀伤细胞的活性，刺激巨噬细胞分泌细胞因子和前列腺素等炎症介质，此外还可充当神经系统和免疫系统间的传导信号，以监视生理失调和病原入侵。作为潜在的炎症介质和共刺激信号分子，白细胞介素-1β可以促进前列腺素(PG)的合成和诱导发热，提高巨噬细胞的吞噬活性，并可调节其它细胞因子的表达。在哺乳动物中白细胞介素-1β的前体肽没有生物学活性，需经过白细胞介素-1β转换酶(ICE)酶切后成为有活性的成熟肽。在鱼类中白细胞介素-1β的前体肽同样需要酶切后才能成为有活性的成熟肽，但是在鱼类白细胞介素-1β氨基酸序列中却没有发现ICE的酶切位点。自从利用同源克隆的方法从虹鳟中克隆出IL-1β基因的全长cDNA序列开始，白细胞介素-1β基因在鱼类中的研究开始受到重视。在鱼类白细胞介素-1β的研究中发现，白细胞介素-1β也具有明显的免疫学活性，可以活化淋巴细胞，提高头肾白细胞的吞噬、趋化活性，促进免疫相关基因的转录，提高抗体滴度，并且具有免疫佐剂的功能。

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，俗称有：鲩、油鲩、草鲩、白鲩、草鱼、草根(东北)、混子、黑青鱼等。英文名：Grass carp。因其生长迅速，饲料来源广，是中国淡水养殖的四大家鱼之一，具有重要的经济价值。但草鱼抗病力和成活率较低，易患出血病、烂鳃病、赤皮病和肠炎病等。各种病害频繁爆发，已成为草鱼养殖业可持续健康发展的主要瓶颈。而各类兽药、抗生素盲目无序的频繁使用，不仅没有明显起到预防与治疗病害的作用，而且，这些药物的大量使用严重破坏了自然生态环境，药品的残留还直接威胁到人类的健康，因此，从草鱼本身的免疫防御因子入手研究其抗病机制和制定新的疾病防治措施，成为人们迫切需要解决的问题。由于白细胞介素-1β在鱼类炎症反应中具有广泛生物学活性及其在免疫调控中的重要性，必将使其在草鱼病害防治中非常重要的作用。

发明内容

本发明的目的是为了提供草鱼白细胞介素1β基因的重组表达方法，为草鱼白细胞介素1β蛋白的产业化应用提供可能。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

草鱼白细胞介素1β基因，其特征在于，该基因的碱基序列是序列表中的SEQ ID No.1。

基因编码的草鱼白细胞介素1β蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列是序列表中的SEQ ID No.2。

草鱼白细胞介素1β基因的重组表达方法，其特征在于，利用同源克隆技术克隆得到草鱼白细胞介素1β基因的cDNA全序列，利用草鱼白细胞介素1β基因的成熟肽序列构建原核表达载体，筛选出一种用于高效表达草鱼白细胞介素1β基因的重组表达体系，通过诱导表达和纯化从而获得有活性的重组草鱼白细胞介素1β蛋白；其具体步骤为：

步骤1基因克隆：利用同源克隆技术从草鱼头肾组织中克隆得到草鱼白细胞介素1β基因的cDNA部分序列，再由RACE技术进一步得到草鱼白细胞介素1β的cDNA全序列；

步骤2重组表达载体的构建与筛选：根据草鱼白细胞介素1β基因的成熟肽序列，利用一对特异性引物rILF 5’-CCG GAA TTC TCT TAC TAT AAG ACC AGCAAG ACC-3’和rILR 5’-CCG CTC GAG ATC ACT TGT TCT CCA GTG TGA AG-3’在成熟肽序列的两端引入EcoRI和XhoI两个不同的限制性内切酶位点，将该成熟肽序列亚克隆到pET30a(+)表达载体上，完成原核表达载体的构建；将构建得到的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，进行筛选鉴定后，将获得的阳性克隆作为工程菌株；

步骤3重组蛋白的表达及表达产物的分离纯化：将筛选所得的工程菌株，以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)为诱导剂进行诱导表达；诱导表达完成后，菌液经超声裂解并离心得到融合表达的裂解液，用含6×His单克隆抗体或镍离子的亲和柱进行亲和层析，再以凝胶层析纯化，获得有活性的重组草鱼白细胞介素1β蛋白。

本发明的有益效果：通过本发明的技术方案可以工业化生产重组草鱼白细胞介素1β，重组草鱼白细胞介素1β可用于鱼类免疫机制的理论研究，也可用于制作饲料添加剂、疫苗的免疫增强剂以及病害防治药物以及其它医药产品。

附图说明

图1是重组草鱼白细胞介素1β的SDS-PAGE和用抗His标签抗体进行的蛋白免疫印迹图。

图2草鱼IL-1β重组蛋白活性鉴定结果。

具体实施方式

下面，结合附图和具体实施例对本发明做详细的说明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本实施例中，一种草鱼白细胞介素1β基因的重组表达方法，利用同源克隆技术克隆得到草鱼白细胞介素1β基因的cDNA全序列，利用草鱼白细胞介素1β的成熟肽的基因序列构建原核表达载体，筛选出一种用于高效表达草鱼白细胞介素1β基因的重组表达体系，通过诱导表达和纯化从而获得具有活性的重组草鱼白细胞介素1β蛋白；其具体步骤为：

步骤1基因克隆：利用同源克隆技术从草鱼头肾组织中克隆得到草鱼白细胞介素1β基因的cDNA部分序列，再由RACE技术进一步得到草鱼白细胞介素1β基因的cDNA全序列；

根据鱼类白细胞介素1β基因同源比较的结果，从保守序列中设计简并引物IL-1bF 5’-CTG ACA GTG C(T/C)G(G/A)CT TTG ATG-3’和IL-1bR 5’-(T/G)CC A(G/T)T CAT CAA AAG CTG TGC-3’。由草鱼头肾组织制备cDNA，从中克隆得到草鱼白细胞介素1β基因的cDNA部分序列。聚合酶链式反应简称PCR(英文全称：Polymerase Chain Reaction)，本步骤的PCR反应体系如下：

草鱼头肾组织cDNA    0.3μL(微升)

5×PCR Buffer       2μL(微升)

25mM MgCL₂          0.8μL(微升)

10mM dNTP           0.2μL(微升)

10μM IL-1bF        0.2μL(微升)

10μM IL-1bR        0.2μL(微升)

5U/l Taq酶          0.1μL(微升)

加水补到总体积为10μL(微升)

本步骤的PCR反应条件：1个循环：94℃3min；30个循环：94℃30s，55℃30s，72℃30s；1个循环：72℃10min，4℃保存。

根据草鱼白细胞介素1β基因的cDNA部分序列设计巢式PCR引物，通过RACE技术进一步得到草鱼白细胞介素1β基因的cDNA全序列，RACE(rapid-amplification ofcDNA ends)技术是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，由于其为现有技术，因此不再详细描述。

本步骤成功进行后，得到一种草鱼白细胞介素1β基因，该基因的碱基序列是序列表中的SEQ ID No.1。

得到草鱼白细胞介素1β基因后，并由该基因翻译得到草鱼白细胞介素1β蛋白，该蛋白的氨基酸序列是序列表中的SEQ ID No.2。

步骤2重组表达载体的构建与筛选：根据草鱼白细胞介素1β的成熟肽的基因序列，利用一对特异性引物rILF 5’-CCG GAA TTC TCT TAC TAT AAG ACCAGC AAG ACC-3’和rILR 5’-CCG CTC GAG ATC ACT TGT TCT CCA GTG TGA AG-3’在成熟肽基因序列的两端引入EcoRI和XhoI两个不同的限制性内切酶位点，将该成熟肽基因序列亚克隆到pET30a(+)表达载体上，完成原核表达载体的构建；将构建得到的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，进行筛选鉴定后，将获得的阳性克隆作为工程菌株；

由于在鱼类白细胞介素1β氨基酸序列中没有发现ICE的酶切位点，在与其它鱼类和哺乳动物白细胞介素-1β成熟肽的氨基酸序列相似性比较后，确定草鱼白细胞介素1β成熟肽氨基酸序列(Ser¹¹¹-Lys²⁷⁰)。根据草鱼白细胞介素1β成熟肽的cDNA基因序列，利用一对特异性引物rILF 5’-CCG GAA TTCTCT TAC TAT AAG ACC AGC AAG ACC-3’和rILR 5’-CCG CTC GAG ATC ACT TGTTCT CCA GTG TGA AG-3’在成熟肽基因序列两端引入EcoRI和XhoI两个不同的限制性内切酶位点，PCR扩增获得具有限制性内切酶位点的草鱼白细胞介素1β成熟肽基因序列，将PCR产物与表达载体pET30a(+)双酶切后，将草鱼白细胞介素1β成熟肽基因序列连接到pET30a(+)上，完成原核系统表达载体的构建，pET30a(+)是购自Novagen公司的商品化原核表达载体，通过公共的商业途径获取。

本步骤的PCR反应体系如下：

草鱼头肾组织cDNA    0.3μL(微升)

5×PCR Buffer       4μL(微升)

25mM MgCL₂          0.6μL(微升)

10mM dNTP           0.4μL(微升)

10μM rILF          0.4μL(微升)

10μM rILR          0.4μL(微升)

5U/μl高保真酶      0.4μL(微升)

加水补到总体积为20μl

本步骤的PCR反应条件：1个循环：98℃30s；5个循环：98℃10s，64℃30s，72℃20s；30个循环：98℃10s，69℃30s，72℃20s；1个循环：72℃10min，4℃保存。

本步骤的限制性内切酶消化体系如下：

DNA                 0.5μg

10×EcoRI Buffer    2μl

100×BSA         0.2μl

EcoRI(NEB)       0.5μl

XhoI(NEB)        0.5μl

加水补到总体积为25μl

将上述限制性内切酶消化体系，于37℃孵育3小时。将PCR酶切产物和质粒酶切产物按摩尔比8∶1混合纯化后连接，连接产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，分别以载体引物和基因特异性引物进行PCR双向筛选。筛选出的阳性克隆，并经序列测定鉴定后所作为工程菌株。

步骤3：重组蛋白的表达及表达产物的分离纯化：将筛选所得的工程菌株，以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)为诱导剂进行诱导表达；诱导表达完成后，菌液经超声裂解并离心得到融合表达的裂解液，用含6×His单克隆抗体或镍离子的亲和柱进行亲和层析，再以凝胶层析纯化，获得有活性的重组草鱼白细胞介素1β蛋白。

将筛选所得的阳性重组菌BL21(DE3)/pET30a-gcIL-1β单菌落，接种到LB培养基中，37℃振荡培养16h。然后按5％比例转接到新鲜LB培养基中，37℃继续培养至OD₆₀₀值为0.6～0.8时，加入1mM IPTG在30℃诱导4h后，超声波(200w，超声3秒，间隔10秒)破菌10分钟，4℃10000rpm离心30分钟取上清。可溶性表达的目的蛋白可占菌体总目的蛋白的30％以上。从而完成诱导表达。

按照上述的蛋白表达条件，扩大培养体积，诱导表达后收集菌体，破碎后离心收集上清，利用GE公司HisTrap HP柱进行亲和层析，用结合缓冲液(20mmol/L Na₂HPO₄，0.5mol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH＝8.0)平衡，将裂解液以0.45μm滤膜过滤后引流到平衡好的柱中，上样完毕后用洗脱缓冲液(20mmol/L Na₂HPO₄，0.5mol/L NaCl，500mmol/L咪唑，pH＝8.0)进行洗涤，收集洗脱峰组分。为进一步纯化并脱盐，利用GE公司Superdex75进行纯化，以缓冲液(20mmol/L Na₂HPO₄，pH＝8.0)洗脱，收集主峰，并经SDS-PAGE及抗His标签抗体进行蛋白免疫印迹鉴定。从而完成蛋白质纯化。如图1所示，图中左侧为重组草鱼白细胞介素1β的SDS-PAGE，图中右侧为用抗His标签抗体进行的蛋白免疫印迹图。M为Mark，1为诱导表达前的工程菌总蛋白，2诱导表达后的工程菌总蛋白，3纯化后的蛋白，由左右两侧的图片可知，经诱导表达后所得的工程菌株大量表达分子量为23KDa(千道尔顿)的重组蛋白，经纯化后得到高纯度的重组草鱼白细胞介素1β蛋白。

经过上述步骤，从而完成草鱼白细胞介素1β基因的重组表达。

进一步的，还可以对获得的重组草鱼白细胞介素1β蛋白进行活性鉴定。分离得到草鱼头肾淋巴细胞，按6×10⁵/孔接种到24孔板中，用含10％小牛血清的RPMI1 640培养液于27℃，5％CO₂浓度下培养过夜。分别加入不同浓度的重组草鱼白细胞介素-1β蛋白刺激4小时后，提取细胞的RNA，利用反转录-实时荧光定量技术，检测草鱼白细胞介素-1β基因在mRNA上的表达(见附图2)。结果表明草鱼白细胞介素1β蛋白能够刺激草鱼头肾淋巴细胞草鱼白细胞介素1β基因的高表达，因而具有明显的生物学活性。如图2所示，Control代表不加入重组草鱼白细胞介素1β(IL-1β)的对照组，与对照组相比随着用于刺激草鱼头肾淋巴细胞的重组草鱼白细胞介素1β蛋白浓度(单位为ng/ml)的增加，草鱼头肾淋巴细胞中草鱼白细胞介素1β基因的表达量(IL-1βexpression relative to β-action)也随之增高。

通过上述实施例获得的重组草鱼白细胞介素1β蛋白具有以下应用前景：

1.重组草鱼白细胞介素1β蛋白用作免疫增强剂。纯化的重组产物与各种疫苗合用，增强疫苗的免疫效价和免疫保护力。如：与鱼的各种菌苗和疫苗合用，增加疫苗对鱼的保护；与各种畜禽疫苗合用，增加疫苗对畜禽产品的保护。

2.重组草鱼白细胞介素1β蛋白用作病害防治药物。在病害发生时，直接使用重组草鱼白细胞介素1β蛋白作为多种防治病害的预防或治疗药物，对鱼类和其它动物病害进行治疗。

3.重组草鱼白细胞介素1β蛋白用于鱼类免疫机制的研究。直接使用重组草鱼白细胞介素1β蛋白或该蛋白制备的的单克隆抗体或多克隆抗体，进行鱼类及其它动物免疫机制的研究。

本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.能够刺激草鱼头肾淋巴细胞草鱼白细胞介素1β基因的高表达的蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列是序列表中的SEQ ID No.2。