CN109942694A - 草鱼Akirin1基因、编码蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种草鱼Akirin1基因、编码蛋白及其应用。本发明首次克隆获得草鱼Akirin1基因，并将该基因构建表达载体和重组大肠杆菌菌株，利用重组大肠杆菌菌种在体外获得大量表达的重组草鱼Akirin1蛋白，该编码蛋白和重组草鱼Akirin1蛋白可以用于制备适合淡水鱼类使用的免疫增强剂。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种草鱼Akirin1基因、编码蛋白及其应用。
背景技术
脾脏作为鱼类的重要免疫器官，也是血细胞发生、抗体产生和粒细胞生成的重要场所，兼有造血与免疫功能。Akirin是近年来发现的在骨骼肌生长发育和免疫反应中具有重要作用的基因。Akirin1在鱼类的脾脏、肝脏、头肾以及肾脏等组织中都有表达，在这些鱼类的免疫器官中表达可能与Akirin1在鱼类中发挥免疫功能有关。Akirin1可以通过NF-κB信号通路调节IL-6和TNFα的基因表达参与免疫调控作用。
草鱼（Ctenopharyngodon idellus）属鲤科（Cyprinidae），草鱼属（Ctenopharyngodon），为典型的草食性鱼类。因其生长迅速，饲料来源广，是中国淡水养殖的四大家鱼之一。草鱼以其肉质细嫩、个体大、肌间刺少而备受消费者喜爱；另外草鱼含有丰富的不饱和脂肪酸及微量元素具有抗衰老、养颜的功效。但草鱼在养殖过程中的“四病”（赤皮病、烂鳃病、肠炎病、出血病）制约着草鱼养殖的发展。长期的生产实践证明，草鱼免疫注射技术是当前能解决草鱼“四病”的一条有效途径。因此，开发草鱼免疫疫苗和免疫增强剂是解决养殖过程中“四病”的关键技术。
发明内容
本发明的目的是提供了一种草鱼Akirin1基因、编码蛋白及其应用。
本发明为实现上述目的采用如下技术方案，一种草鱼Akirin1基因，其特征在于：该草鱼Akirin1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
一种草鱼Akirin1基因编码蛋白，其特征在于：该草鱼Akirin1基因编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
本发明克隆了草鱼的Akirin1基因。克隆的方法是常规的基因克隆方法，利用同源物种的Akirin1基因在草鱼转录组数据库进行搜索，根据比对得到同源性最高的未注释基因片段设计克隆ORF的引物，PCR后把得到目的基因连接到pMD19-T载体为pMD19-T-Akirin1。
本发明构建了含有草鱼Akirin1基因的大肠杆菌表达载体。这个表达载体的构建方法是按照常规方法，利用自己所构建的载体pMD19-T-Akirin1为模板，通过PCR方法合成带有酶切接头的草鱼Akirin1基因，经酶切和分离纯化后接入到已有的载体pET22b的相应酶切位点EcoRI和NotI之间，即构建成所需的含有草鱼Akirin1基因的表达载体pET22b-Akirin1。
本发明还用上述含有草鱼Akirin1基因的表达载体构建了能够高效表达草鱼Akirin1基因的大肠杆菌重组菌株。
本发明的上述能够表达草鱼Akirin1大肠杆菌重组菌株是由含有草鱼Akirin1基因的表达载体pET22b-Akirin1转化大肠杆菌Rosetta(DE3)而得到的重组菌株，该重组菌株命名为pET22b-Akirin1-Rosetta(DE3)。
本发明还提供了利用上述大肠杆菌重组菌株生产重组草鱼Akirin1蛋白的方法。将该重组菌株接种在LB液体培养基中，37℃，200转/分培养至OD600达到0.5-0.8，然后加入IPTG至终浓度为1mM，37℃，200转/分培养4小时后5000g离心10min收集菌体，超声破碎后12000g离心10min收集沉淀，用50mL 包涵体溶解液溶解，经分离纯化得到重组草鱼Akirin1蛋白。
本发明还提供了重组草鱼Akirin1蛋白的脱盐和浓缩的方法，将纯化得到的重组草鱼Akirin1蛋白加入到超滤管中，4℃，6000g离心1-2小时去掉滤出液，然后加入1×PBS进行置换缓冲液，4℃，6000g离心1-2小时去掉滤出液得到脱盐后的重组草鱼Akirin1蛋白。采用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度为2.2mg/mL。
草鱼具有重大的经济价值，采用常规的基因工程技术，可利用本发明的草鱼Akirin1基因重组菌株pET22b-Akirin1-Rosetta(DE3)生产重组草鱼Akirin1蛋白，并可进一步用作制备适合淡水鱼类使用的免疫增强剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明首次克隆获得草鱼Akirin1基因，并将该基因构建表达载体和重组大肠杆菌菌株，再利用重组大肠杆菌菌株在体外获得大量表达的重组草鱼Akirin1蛋白，该重组草鱼Akirin1蛋白可用于制备适合淡水鱼类使用的免疫增强剂。
附图说明
图1是以草鱼脾脏的反转录cDNA为模板进行PCR扩增Akirin1 ORF片段产物的凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1：PCR扩增产物；NC：阴性对照；
图2中A是带酶切位点Akirin1的PCR扩增凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1：PCR扩增产物；NC：阴性对照；B是重组质粒pET22b-Akirin1的酶切鉴定凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1：pET22b-Akirin1未酶切；2：pET22b-Akirin1 EcoRI和NotI双酶切；
图3中A是重组菌株pET22b-Akirin1-Rosetta(DE3)表达产物重组草鱼Akirin1蛋白的SDS-PAGE电泳分析图，其中：M：蛋白Marker；NC：空载体对照；1、2、3、4、5：重组菌株pET22b-Akirin1-Rosetta(DE3)诱导表达0、1、2、3、4小时表达产物；B是重组菌株pET22b-Akirin1-Rosetta(DE3)表达产物重组草鱼Akirin1蛋白纯化产物的SDS-PAGE电泳分析图；其中，M：蛋白Marker；1、2、3、4：纯化后重组草鱼Akirin1蛋白进行SDS-PAGE；C是重组菌株pET22b-Akirin1-Rosetta(DE3)表达产物重组草鱼Akirin1蛋白纯化产物的Western blot鉴定图；其中，M：蛋白Marker；1、2、3、4：纯化后重组草鱼Akirin1蛋白进行Western blot；
图4是重组草鱼Akirin1蛋白对草鱼原代脾脏细胞免疫相关基因的影响，A是TNFα；B是NF-κB，其中“***”表示P＜0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
草鱼Akirin1基因ORF的克隆
根据已报道的尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus），鲤鱼（Cyprinus carpio），斑马鱼（Denio rerio）中所获得的Akirin1序列在草鱼转录组数据库进行搜索，根据比对得到同源性最高的未注释基因片段设计一对克隆Akirin1 ORF的引物，上游引物F-ORF的核苷酸序列为5'ATGGCTTGTGGCGCGACGT3'、下游引物R-ORF的核苷酸序列为5'TCAAGACACATAGCTTGCA3'，以草鱼脾脏RNA反转录后的cDNA为模板做PCR。PCR条件为：94℃3min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 50s，35个循环；72℃ 10min；4℃∞。经过PCR后把得到的产物与pMD19-T载体连接在一起为pMD19-T-Akirin1。PCR反应后的凝胶电泳图见图1所示。
实施例2
带酶切位点的草鱼Akirin1基因合成
根据自己克隆到的草鱼Akirin1基因的序列及限制性内切酶EcoRI和NotI的识别序列以及保护碱基，设计合成一对特异性引物，上游引物F为5'CGGAATTCACATCATCATCATCATCATATGGCTTGTGGCGCGACG3'是在Akirin1基因的成熟肽序列前添加了EcoRI酶切识别位点和6×His标签，下游引物R为 5'ATAGTTTAGCGGCCGCTCAAGACACATAGCTTGC3'是在Akirin1基因成熟肽序列后添加了终止密码子及NotI酶切识别位点。利用自己构建的pMD19-T-Akirin1为模板进行PCR反应，PCR反应条件为：94℃ 3min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 50s，35个循环；72℃ 10min；4℃∞。PCR扩增产物的电泳鉴定图见图2中A所示。
实施例3
含草鱼Akirin1基因的大肠杆菌表达载体pET22b-Akirin1的构建
PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切后，酶切产物用E.Z.N.A.® GelExtraction Kit回收，进行琼脂糖凝胶电泳，分离纯化草鱼Akirin1基因片段；载体质粒pET22b经限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切后分离纯化，与分离纯化草鱼Akirin1基因片段混合，用NEBT4连接酶16℃连接过夜后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌DH5a中，用LB平板筛选具Ampicillin抗性的转化子，以标准方法提取质粒，用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切重组质粒，得到大和小两个片段，大小分别与草鱼Akirin1基因和表达载体pET22b大小相同，证明草鱼Akirin1基因已克隆入大肠杆菌表达载体pET22b中，重组质粒命名为pET22b-Akirin1。酶切分析图分别见图2中B所示。
实施例4
能够高效表达草鱼Akirin1的大肠杆菌重组菌株pET22b-Akirin1-Rosetta(DE3)的构建
制备好的重组质粒pET22b-Akirin1用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，在含Ampicillin的LB平板上37℃进行培养。过夜后长出单克隆，挑取单克隆接种在10mL LB液体培养基中，37℃，200转/分培养14-16小时，按照体积比1:100接种在10mL LB液体培养基中，37℃，200转/分培养至OD600达到0.5-0.8，然后加入IPTG至终浓度为1mM，37℃，200转/分培养0、1、2、3、4小时时分别取1mL，5000g离心10min收集菌体，弃上清，菌体用50µL PBS缓冲液悬浮，加入50µL 2×Loading buffer 混匀，沸水浴10min，进行SDS-PAGE验证，同时取阴性对照按同样方法处理后电泳。阴性对照为空载质粒pET22b转化Rosetta(DE3)后长出的单克隆培养后的菌液，结果见图3中的A。鉴定筛选出能高效表达草鱼Akirin1基因的大肠杆菌重组菌株pET22b-Akirin1-Rosetta(DE3)。
实施例5
利用大肠杆菌基因工程菌pET22b-Akirin1-Rosetta(DE3)生产重组草鱼Akirin1蛋白
挑取大肠杆菌重组菌株pET22b-Akirin1-Rosetta(DE3)单菌落接种在10mL LB液体培养基中，37℃，200转/分培养14-16小时，然后按照体积比1:100的比例接种于500mL LB液体培养基中，37℃，200转/分培养至OD600到0.5-0.8，然后加入IPTG使其终浓度为1mM，37℃，200转/分培养4小时后5000g离心10min收集菌体，超声破碎后12000g离心10min收集超声破碎后12000g离心10min收集沉淀，沉淀用50mL 包涵体溶解液（6M Urea，50mM PB buffer，500mM NaCl，pH7.4）溶解，溶解后上清用GE公司的His-bind Resin进行纯化处理，经分离纯化得到重组草鱼Akirin1蛋白，结果见图3中B所示。
将重组草鱼Akirin1蛋白采用免疫印迹（Western blot）方法进行鉴定。一抗为鼠抗His单克隆抗体（购自上海生工生物工程技术服务有限公司），二抗为羊抗鼠IgG-HRP（购自上海生工生物工程技术服务有限公司）。结果见图3中C所示。
实施例6
重组草鱼Akirin1蛋白的功能研究-对草鱼原代脾脏细胞免疫相关基因的影响
分离草鱼原代脾脏细胞后，用加入含有10wt% FBS的DMEM/F12培养基把细胞浓度调成1.5×106细胞/mL，然后在24孔板中每孔加入1mL，放在28℃的生化培养箱中，培养过夜后，换成500μL的无FBS的DMEM/F12培养基饥饿1小时，然后向处理组中每孔分别加入500μL的DMEM/F12培养基，其中含有分离纯化后的重组草鱼Akirin1蛋白浓度分别为20ng/mL、200ng/mL、2000ng/mL，对照组加入等体积的无血清培养基，在28℃的生化培养箱中培养6h用Trizol（购自ThermoFisher Scientific公司）裂解细胞后完全收取裂解细胞后的裂解液。提取样品中的总RNA并用反转录试剂盒（购自TAKARA公司）对RNA进行反转录。用荧光定量PCR（购自TAKARA公司）试剂盒在LightCycler480 II（罗氏公司）上进行荧光定量PCR反应，以18S rRNA作为内参，计算对照组和处理组之间免疫相关基因的变化情况。结果显示，用纯化后的重组草鱼Akirin1蛋白处理原代脾脏细胞后能够显著的促进免疫相关基因TNFα和NF-κB的基因表达，结果如图4所示。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
序列表
<110> 河南师范大学
河南师范大学
<120> 草鱼Akirin1基因、编码蛋白及其应用
<130> 2019
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 7
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ser Glu Gln Ile Asp Asn Met Ala Cys Gly Ala Thr Leu Lys Arg Ser
1 5 10 15
Met Glu Phe Glu Ala Leu Leu Ser Pro Gln Ser Pro Lys Arg Arg Arg
20 25 30
Cys Asn Pro Leu Pro Gly Thr Pro Thr Thr Pro Ser Pro Gln Arg Cys
35 40 45
Gly Leu Arg Pro Ser Thr Glu Ser Pro Ala His Ser Met Ser Pro Gln
50 55 60
Ser Met Gly Gly Glu His Arg Leu Thr Pro Glu Gln Ile Phe Gln Asn
65 70 75 80
Ile Arg Gln Glu Tyr Ser Arg Tyr Gln Arg Arg Arg Gln Leu Glu Gly
85 90 95
Ala Phe Asn Gln Ser Glu Pro Cys Ser Ser Thr Asp Ile Gln Ser Ser
100 105 110
Ser Pro Ala Leu Thr Ser Pro Ser Ser Pro Thr Gly Ala Ser Ser Leu
115 120 125
Lys Lys Asp Gln Pro Leu Phe Thr Lys Arg Gln Val Gly Tyr Leu Cys
130 135 140
Glu Arg Leu Ile Lys Asp His Glu Glu Lys Ile Arg Glu Glu Tyr Glu
145 150 155 160
Gln Ile Leu Asn Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Glu Ser Phe Val Lys
165 170 175
Phe Thr Gln Asp Gln Ile Met Arg Arg Tyr Gly Ala Arg Pro Ala Ser
180 185 190
Tyr Val Ser
195
<210> 8
<211> 570
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggcttgtg gcgcgacgtt gaagcgatct atggagtttg aggcccttct cagcccgcag 60
tcccccaagc gaaggaggtg caatcctcta ccggggactc cgactactcc ttccccgcag 120
agatgcggtc ttcgcccgtc aacagaaagc ccggcacact cgatgtcgcc ccagtctatg 180
ggtggagaac acaggctaac tccagagcag atcttccaga acattcgtca ggagtacagc 240
cgctaccaga ggcgacggca gttagaaggg gccttcaacc agagtgagcc ctgcagctcc 300
actgatatcc agagctccag tcccgccctc acctccccca gctctcccac aggtgcctca 360
tcattgaaga aggatcagcc actgttcaca ctgaggcagg ttggctattt gtgtgagcgc 420
cttatcaaag atcacgagga gaagatccgt gaagagtatg aacagatact gaacacaaag 480
cttgcagaac aatacgagtc cttcgtgaaa ttcacacagg atcagattat gcgaagatat 540
ggcgccaggc ctgcaagcta tgtgtcttga 570
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atggcttgtg gcgcgacg 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcaagacaca tagcttgca 19
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cggaattcac atcatcatca tcatcatatg gcttgtggcg cgacg 45
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atagtttagc ggccgctcaa gacacatagc ttgc 34
Claims (9)
1.一种草鱼Akirin1基因，其特征在于：该草鱼Akirin1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
2.一种权利要求1所述草鱼Akirin1基因编码蛋白，其特征在于：该草鱼Akirin1编码蛋白的氨基酸序列如如序列表中SEQ ID NO:2所示。
3.一种含有权利要求1所述草鱼Akirin1基因的表达载体，其特征在于：该表达载体为大肠杆菌重组表达载体pMD19-T-Akirin1。
4.一种大肠杆菌重组菌株，其特征在于：该大肠杆菌重组菌株是由权利要求3所述的大肠杆菌重组表达载体pMD19-T-Akirin1转入大肠杆菌Rosetta(DE3)而形成的大肠杆菌重组菌株pET22b-Akirin1-Rosetta(DE3)。
5.一种重组草鱼Akirin1蛋白，其特征在于：该重组草鱼Akirin1蛋白是由权利要求4所述的大肠杆菌重组菌株pET22b-Akirin1-Rosetta(DE3)经过表达得到的产物。
6.一种权利要求5所述的重组草鱼Akirin1蛋白的制备方法，其特征在于具体步骤为：将所述大肠杆菌重组菌株pET22b-Akirin1-Rosetta(DE3)接种在LB液体培养基中，37℃，200转/分培养至OD600达到0.5-0.8，然后加入IPTG至终浓度为1mM，37℃，200转/分培养4小时后5000g离心10min收集菌体，超声破碎后12000g离心10min收集沉淀，用50mL包涵体溶解液溶解，经分离纯化得到重组草鱼Akirin1蛋白。
7.根据权利要求6所述的重组草鱼Akirin1蛋白的制备方法，其特征在于所述大肠杆菌重组菌株pET22b-Akirin1-Rosetta(DE3)的具体制备过程为：
（1）草鱼Akirin1基因ORF的克隆
根据已报道的尼罗罗非鱼，鲤鱼，斑马鱼中所获得的Akirin1序列在草鱼转录组数据库进行搜索，根据比对得到同源性最高的未注释基因片段设计一对克隆Akirin1 ORF的引物，上游引物F-ORF的核苷酸序列为5'ATGGCTTGTGGCGCGACGT3'、下游引物R-ORF的核苷酸序列为5'TCAAGACACATAGCTTGCA3'，以草鱼脾脏RNA反转录后的cDNA为模板做PCR，PCR条件为：94℃ 3min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 50s，35个循环；72℃ 10min；4℃∞，经过PCR后把得到的产物与pMD19-T载体连接在一起为pMD19-T-Akirin1；
（2）带酶切位点的草鱼Akirin1基因合成
根据克隆到的草鱼Akirin1基因的序列及限制性内切酶EcoRI和NotI的识别序列以及保护碱基，设计合成一对特异性引物，上游引物F为5'CGGAATTCACATCATCATCATCATCATATGGCTTGTGGCGCGACG3'是在Akirin1基因的成熟肽序列前添加了EcoRI酶切识别位点和6×His标签，下游引物R为 5'ATAGTTTAGCGGCCGCTCAAGACACATAGCTTGC3'是在Akirin1基因成熟肽序列后添加了终止密码子及NotI酶切识别位点，利用构建的pMD19-T-Akirin1为模板进行PCR反应，PCR反应条件为： 94℃ 3min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 50s，35个循环；72℃10min；4℃∞；
（3）含草鱼Akirin1基因的大肠杆菌表达载体pET22b-Akirin1的构建
PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切后，酶切产物用E.Z.N.A.® GelExtraction Kit回收，进行琼脂糖凝胶电泳，分离纯化草鱼Akirin1基因片段，载体质粒pET22b经限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切后分离纯化，与分离纯化草鱼Akirin1基因片段混合，用NEBT4连接酶16℃连接过夜后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌DH5a中，用LB平板筛选具Ampicillin抗性的转化子，以标准方法提取质粒，用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切重组质粒，得到大和小两个片段，大小分别与草鱼Akirin1基因和表达载体pET22b大小相同，证明草鱼Akirin1基因已克隆入大肠杆菌表达载体pET22b中，重组质粒命名为pET22b-Akirin1；
（4）能高效表达草鱼Akirin1的大肠杆菌重组株pET22b-Akirin1-Rosetta(DE3)的构建
将制备好的重组质粒pET22b-Akirin1用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，在含Ampicillin的LB平板上37℃进行培养，过夜后长出单克隆，挑取单克隆接种在10mL LB液体培养基中，37℃，200转/分培养14-16小时，按照体积比1:100接种在10mL LB液体培养基中，37℃，200转/分培养至OD600达到0.5-0.8，然后加入IPTG至终浓度为1mM，37℃，200转/分培养0、1、2、3、4小时时分别取1mL，5000g离心10min收集菌体，弃上清，菌体用50µL PBS缓冲液悬浮，加入50µL 2×Loading buffer 混匀，沸水浴10min，进行SDS-PAGE验证，鉴定筛选出能高效表达草鱼Akirin1基因的大肠杆菌重组菌株pET22b-Akirin1-Rosetta(DE3)。
8.根据权利要求6所述的重组草鱼Akirin1蛋白的制备方法，其特征在于：纯化得到的重组草鱼Akirin1蛋白进行超滤脱盐和浓缩处理，具体过程为：将纯化得到的重组草鱼Akirin1蛋白加入到超滤管中，4℃，6000g离心1-2小时去掉滤出液，然后加入1×PBS进行置换缓冲液，4℃，6000g离心1-2小时去掉滤出液得到脱盐后的重组草鱼Akirin1蛋白。
9.权利要求2所述的草鱼Akirin1基因编码蛋白或权利要求5所述的重组草鱼Akirin1蛋白在制备适合淡水鱼类使用的免疫增强剂中的应用。
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