CN110982822A

CN110982822A - 一种克氏原螯虾抗脂多糖因子gALF1基因、其编码的gALF1蛋白及其应用

Info

Publication number: CN110982822A
Application number: CN201911184929.3A
Authority: CN
Inventors: 兰江风; 张英豪; 李通; 曹晓彤; 殷成明; 顾泽茂
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-11-27
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2039-11-27
Also published as: CN110982822B

Abstract

本发明首次发现了一种克氏原螯虾抗脂多糖因子gALF1基因，所述gALF1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。本发明利用该基因编码制备了一种gALF1蛋白，所述gALF1蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明还提供了上述基因和蛋白在WSSV病毒感染的免疫和治疗领域的应用。本发明具有有效的抗病毒作用，对WSSV病毒有极强的抑制和杀灭效果，能够有效解决WSSV病毒感染的免疫和治疗问题。

Description

一种克氏原螯虾抗脂多糖因子gALF1基因、其编码的gALF1蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种克氏原螯虾抗脂多糖因子gALF1基因、其编码的gALF1蛋白及其应用。

背景技术

克氏原螯虾又称红螯虾或淡水小龙虾，形似虾而甲壳坚硬；成体长约5.6～11.9厘米。克氏原螯虾是淡水经济虾类，因肉味鲜美广受人们欢迎。因其杂食性、生长速度快、适应能力强而在当地生态环境中形成绝对的竞争优势。其摄食范围包括水草、藻类、水生昆虫、动物尸体等。近年来，克氏原螯虾在我国已经成为重要经济养殖品种，产量巨大。

对虾白斑综合症是由白斑综合症杆状病毒复合体引发的一种综合性病症。白斑综合症杆状病毒复合体主要对虾体的造血组织、结缔组织、前后肠的上皮、血细胞、鳃等系统进行感染破坏。此类病毒复合体的毒力较强，从出现症状到死亡只有3～5天的时间，甚至更短。此病的感染率较高，7天左右可使池中70℅以上的虾得病，甚至死亡。上述疾病对于虾类的养殖而言十分致命，一旦养殖的虾患病，则会造成大面积死亡，而目前对上述疾病没有较好的治疗手段，因此养殖户养殖的虾一旦发病，会造成巨大的经济损失。

抗脂多糖因子作为虾类体液免疫体系中的一种重要抗菌肽，与虾类抵抗病菌或病毒感染的过程密切相关。克氏原螯虾作为一种虾类动物，其体内也存在抗脂多糖因子，用于机体免疫。而克氏原螯虾对环境的适应能力较强，对各种流行性的疾病均有一定的抵抗能力，特别是对虾白斑综合症，克氏原螯虾有较强免疫能力。鉴于此，如果能够对克氏原螯虾的免疫机理进行研究，将能解决对虾白斑综合症的免疫和治疗的问题。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种克氏原螯虾抗脂多糖因子gALF1基因、其编码的gALF1蛋白及其应用，具有有效的抗病毒作用，对白斑综合症杆状病毒有极强的抑制和杀灭效果，能够有效解决对虾白斑综合症的免疫和治疗问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种克氏原螯虾抗脂多糖因子gALF1基因，所述gALF1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

本发明还提供了上述克氏原螯抗脂多糖因子gALF1基因在WSSV病毒感染的免疫和治疗领域的应用。

本发明还提供了上述克氏原螯虾抗脂多糖因子gALF1基因编码的gALF1蛋白，所述gALF1蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明还提供了上述的gALF1蛋白在WSSV病毒感染的免疫和治疗领域的应用。

本发明还提供了上述的gALF1蛋白构建的表达载体，所述表达载体为pGEX-4T-1-gALF1。

本发明还提供了上述的pGEX-4T-1-gALF1表达载体的构建方法，包括以下步骤：

①RNA提取及反转录：

选取克氏原螯虾，抽血解剖取组织样：血淋巴、心、肝、鳃、胃、肠，采用TRIzol法取总RNA，Nano-Drop 300检测RNA纯度及浓度，经琼脂糖凝胶电泳检测通过Bio-Rad凝胶成像仪分析总RNA质量，反转录合成cDNA；

②ALF1全长编码区基因扩增：

设计用于序列扩增的专一性引物，以反转录得到的cDNA为模板作PCR扩增，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收试剂盒回收PCR产物；

③pGEX-4T-1-gALF1表达载体的构建：

将pGEX-4T-1载体和胶回收后的gALF1 PCR产物分别用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，电泳检测并分别胶回收纯化，然后用T4 DNA连接酶将其于恒温水浴锅中连接反应，连接产物转化到大肠杆菌DH5α，进行培养，挑取单菌落以primer-ALF1引物作PCR鉴定，阳性克隆按1％比例扩大培养，扩增后提取质粒。

进一步，所述步骤②中，用于序列扩增的专一性引物的上游引物为Pc-ALF1-EcoRI：5‘(TACTCA GAATTCCAGGTCCTGGAGGGTCTG)3’；

用于序列扩增的专一性引物的下游引物为Pc-ALF1-Xhol I：5‘(TACTCACTCGAGCTACCCATCAAGCCATGCCT)3’。

进一步，所述步骤③后还需要进行GST-gALF1融合蛋白的诱导表达：将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单克隆菌落，于含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，16℃诱导表达过夜，收集菌体；用PBS重悬菌体，4℃，超声波破碎6min，超声破碎后菌液4℃，10000r/min离心20min，分离上清和沉淀；取各10μL，进行SDS-PAGE电泳分析。

进一步，所述GST-gALF1融合蛋白的诱导表达后，还需进行融合蛋白的纯化，收集诱导后菌体超声破碎的沉淀，变复性透析纯化，进行12％的SDS-PAGE电泳。

进一步，所述融合蛋白的纯化方法具体包括以下步骤：

①沉淀使用20mL buffer A(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，pH 8.0)充分悬起，混匀，4℃离心10000rpm 20min，去除上清，重复操作一次；

②对步骤①的沉淀使用20mLbuffer B(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，2M脲，pH8.0)充分悬起，混匀，4℃离心10000rpm 20min，去除上清，重复操作一次；

③对步骤②的沉淀使用20mL buffer C(0.1M Tris-HCl，10mM DTT，8M脲，pH8.0)充分悬起，混匀，置于37℃恒温摇床上以200rpm快速震荡1h，4℃离心10000rpm 10min，保留上清，去除沉淀；

④将步骤③得到的上清装入透析袋中，置于50倍体积透析液(0.1M Tris-HCl，5mMEDTA，5mM Cysteins，pH8.0)中，4℃下透析16h以上；

⑤将步骤④的透析后产物在4℃条件下冷冻离心10000rpm 10min，保留上清，去除沉淀，得到纯化产物。

本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明主要是发现在克氏原螯虾体内的抗脂多糖因子gALF1具有有效的抗病毒作用，特别是对WSSV病毒，有极强的抑制作用，通过实验表明，通过注射gALF1蛋白能明显抑制WSSV在虾体内的复制水平。

附图说明

图1是本发明实施例提供的gALF1的重组蛋白的SDS-PAGE分析图；

图2是本发明实施例分为3组实验后的WSSV复制情况对照图；

图3是本发明实施例分为3组实验后克氏原螯虾存活的对比图。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明提供了一种克氏原螯虾抗脂多糖因子gALF1基因，所述gALF1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

上述克氏原螯虾抗脂多糖因子gALF1基因在WSSV病毒感染的免疫和治疗领域能够有极为广泛的应用。

可以利用上述克氏原螯虾抗脂多糖因子gALF1基因编码，制备一种gALF1蛋白，所述gALF1蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2。其SDS-PAGE分析图见图1。

上述的gALF1蛋白在对虾白斑综合症治疗领域的具有极为广泛的应用。直接注射上述蛋白给虾类，即可让虾类获得对WSSV病毒的免疫能力。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述gALF1蛋白构建的表达载体，所述表达载体为pGEX-4T-1-gALF1。

本发明的另一目的在于提供一种所述表达载体的构建方法，所述表达载体的构建方法包括：

①RNA提取及反转录：

选取三只克氏原螯虾，抽血解剖取组织样:血淋巴、心、肝、鳃、胃、肠，采用TRIzol法取总RNA。Nano-Drop 300检测RNA纯度及浓度，经琼脂糖凝胶电泳检测通过Bio-Rad凝胶成像仪分析总RNA质量；根据反转录说明书操作步骤反转录合成cDNA。

②ALF1全长编码区基因扩增：

设计用于序列扩增的专一性引物。

所述的用于序列扩增的专一性引物的上游引物为Pc-ALF1-EcoR I：5‘(TACTCAGAATTCCAGGTCCTGGAGGGTCTG)3’；

所述的用于序列扩增的专一性引物的下游引物为Pc-ALF1-Xhol I：5‘(TACTCACTCGAGCTACCCATCAAGCCATGCCT)3’。

以反转录得到的cDNA为模板作PCR扩增；建立25μL PCR反应体系，反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，54℃退火30s，72℃延伸35s，35次循环后72℃延伸8min；扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收试剂盒回收PCR产物。

③pGEX-4T-1-gALF1表达载体的构建：

将pGEX-4T-1载体和胶回收后的gALF1 PCR产物分别用EcoRⅠ和XholⅠ双酶切，电泳检测并分别胶回收纯化，然后用T4 DNA连接酶将其于恒温水浴锅16℃连接过夜，连接产物转化到大肠杆菌DH5α，37℃培养2h，在含100μg/mL的氨苄青霉素(Amp)的LB培养基上生长，挑取单菌落以primer-ALF1引物作PCR鉴定，阳性克隆按1％比例扩大培养，扩增后提取质粒，最后送公司测序验证。

进一步，pGEX-4T-1-gALF1表达载体的构建后，还需进行：

GST-gALF1融合蛋白的诱导表达：将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单克隆菌落，于含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，16℃诱导表达过夜，收集菌体；用PBS重悬菌体，4℃，超声波破碎6min，超声破碎后菌液4℃，10000r/min离心20min，分离上清和沉淀；取各10μL，进行SDS-PAGE电泳分析。

进一步，pGEX-4T-1-gALF1表达载体的构建后，还需进行融合蛋白的纯化：

诱导GST-gALF1融合蛋白的表达，收集诱导后菌体超声破碎的沉淀，变复性透析纯化，进行12％的SDS-PAGE电泳。

进一步，融合蛋白的纯化的方法具体包括：

实施例

gALF1蛋白的制备

①RNA提取及反转录：

②ALF1全长编码区基因扩增：

采用上游引物

Pc-ALF1-EcoR I：5‘(TACTCA GAATTCCAGGTCCTGGAGGGTCTG)3’；

下游引物

Pc-ALF1-Xhol I：5‘(TACTCA CTCGAGCTACCCATCAAGCCATGCCT)3’。

③pGEX-4T-1-gALF1表达载体的构建：

将pGEX-4T-1载体和胶回收后的gALF1 PCR产物分别用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，电泳检测并分别胶回收纯化，然后用T4 DNA连接酶将其于恒温水浴锅16℃连接过夜，连接产物转化到大肠杆菌DH5α，37℃培养2h，在含100μg/mL的氨苄青霉素(Amp)的LB培养基上生长，挑取单菌落以primer-ALF1引物作PCR鉴定，阳性克隆按1％比例扩大培养，扩增后提取质粒，最后送公司测序验证。

pGEX-4T-1-gALF1表达载体的构建后，进行GST-gALF1融合蛋白的诱导表达：

将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单克隆菌落，于含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，16℃诱导表达过夜，收集菌体；用PBS重悬菌体，4℃，超声波破碎6min，超声破碎后菌液4℃，10000r/min离心20min，分离上清和沉淀；取各10μL，进行SDS-PAGE电泳分析。

最后进行融合蛋白的纯化：

动物实验：

取本发明实施例制备的gALF1蛋白，标签蛋白。本发明提供的实验分为3组，注射gALF1蛋白组，注射标签蛋白组，空白组。在注射蛋白1h后，3组同时注射WSSV病毒。WSSV病毒感染24h后提取总蛋白，检测WSSV的复制情况。

实验用虾选用克氏原螯虾。

如图2所示，β-Actin作为对照，结果显示，与对照组相比，注射gALF1蛋白能明显抑制WSSV在虾体内的复制水平。

如图3所示，图3是本发明实施例提供的gALF1的重组蛋白通过Pull-dwon的技术调WSSV的病毒蛋白VP19，VP24，VP28，第一至第四个泳道分别为Gill Lysates，GST-ALF1调WSSV的病毒蛋白，GST-Tag调WSSV的病毒蛋白，GST resin，然后检测VP19，VP24，VP28蛋白与gALF1蛋白的结合情况。

图中分别为gALF1组与GST-Tag组，统计两组1-7d克氏原螯虾存活数量对比图显示出在gALF1组的克氏原螯虾的存活数量是明显高于GST-Tag组的，进一步验证了gALF1具有极强的抗WSSV病毒能力的同时也验证了gALF1能够提高克氏原螯虾在感染WSSV后的存活率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种克氏原螯虾i型溶菌酶gALF1基因、其编码的gALF1蛋白及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 1085

<212> DNA

<213> 克氏原螯虾(gALF1)

<400> 3

cacacggtaa ctggcaccca gagcaggcac actagcaaca ctctcctcct gcaggacaac 60

aacaacaaga tgaaccatcg tgtggtagtg agtctggtgg tggtggggct gctggccgcc 120

tccttcaccc cacagtccca cgcccaggtc ctggagggtc tggcagcggc tgtcaccggt 180

aaacttgctg gactgtggcg gaacggtgag gtggagctcc tgggccacta ctgtagctac 240

agcgtgacgc ccacaattcg gcggtggcaa ctgtacttca ggggcaggat gtggtgcccg 300

ggctggacct ccatcagggg ggaagcgatg acgaggagca attcaggagt gcagggagac 360

actacaaggg acttcgtcac taaggccctc aatgccggcc tcatcagtca acaagaagcc 420

caggcatggc ttgagggtag acaccaagac tggccgcaac gagctcacac gctcttgtgc 480

caacccgtcc tcttaaasat aacgtcactt ttggctggta tgcgcactat ggccaaattt 540

agatgtaatt tgaaatgaaa tcgactcgca aaagtgacgt actgttccgt tttctgttta 600

agtcgccggc cctccttgga cagcttagaa gaggaacttt caatttacat ttttcataac 660

gttttgaaac tttatgagaa tttcctgccc gcctaaccta tcagaggacc cttaacttac 720

tgtgttgaaa aaaaaaatcc caaatttatt ttcaatttat tttcattttc aaattacgtc 780

catattcggc catacgggca aacggctaaa agctacgttc tttttaagag gacaggttga 840

gctcgtgcag caccgagctc acacgctctc gtcccacacc caagctcatc gactccgccc 900

acattcagag cgccgcactg taaacactca ccccacatcg gagctctctg ctcgcggcct 960

cactcagctc tctgccctgc tccaggcttc gtctcagctt ctacaacact tcaatcaaac 1020

cgactgctgt aaccaagaca taaataaata cgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080

aaaaa 1085

<210> 2

<211> 353

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

His Thr Val Thr Gly Thr Gln Ser Arg His Thr Ser Asn Thr Leu Leu

1 5 10 15

Leu Gln Asp Asn Asn Asn Lys Met Asn His Arg Val Val Val Ser Leu

20 25 30

Val Val Val Gly Leu Leu Ala Ala Ser Phe Thr Pro Gln Ser His Ala

35 40 45

Gln Val Leu Glu Gly Leu Ala Ala Ala Val Thr Gly Lys Leu Ala Gly

50 55 60

Leu Trp Arg Asn Gly Glu Val Glu Leu Leu Gly His Tyr Cys Ser Tyr

65 70 75 80

Ser Val Thr Pro Thr Ile Arg Arg Trp Gln Leu Tyr Phe Arg Gly Arg

85 90 95

Met Trp Cys Pro Gly Trp Thr Ser Ile Arg Gly Glu Ala Met Thr Arg

100 105 110

Ser Asn Ser Gly Val Gln Gly Asp Thr Thr Arg Asp Phe Val Thr Lys

115 120 125

Ala Leu Asn Ala Gly Leu Ile Ser Gln Gln Glu Ala Gln Ala Trp Leu

130 135 140

Xaa Gly Thr Pro Arg Leu Ala Ala Thr Ser Ser His Ala Leu Val Pro

145 150 155 160

Thr Arg Pro Leu Lys Xaa Asn Val Thr Phe Gly Trp Tyr Ala His Tyr

165 170 175

Gly Gln Ile Met Phe Glu Met Lys Ser Thr Arg Lys Ser Asp Val Leu

180 185 190

Phe Arg Phe Leu Phe Lys Ser Xaa Gly Pro Pro Trp Thr Ala Lys Arg

195 200 205

Asn Phe Gln Phe Thr Phe Phe Ile Thr Phe Asn Phe Met Arg Ile Ser

210 215 220

Cys Pro Pro Asn Leu Ser Glu Asp Pro Leu Thr Val Val Glu Lys Lys

225 230 235 240

Asn Pro Lys Phe Ile Phe Asn Leu Phe Ser Phe Ser Asn Tyr Val His

245 250 255

Ile Arg Pro Tyr Gly Gln Thr Ala Lys Ser Tyr Val Leu Phe Lys Arg

260 265 270

Thr Gly Ala Arg Ala Ala Pro Ser Ser His Ala Leu Val Pro His Pro

275 280 285

Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr Phe Arg Ala Pro His Cys Lys His Ser

290 295 300

Pro His Ile Gly Ala Leu Cys Ser Arg Pro His Ser Ala Leu Cys Pro

305 310 315 320

Ala Pro Gly Phe Val Ser Ala Ser Thr Thr Leu Gln Ser Asn Arg Leu

325 330 335

Leu Pro Arg His Lys Ile Arg Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys

340 345 350

Lys

Claims

1.一种克氏原螯虾抗脂多糖因子gALF1基因，其特征在于：所述抗脂多糖因子gALF1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.如权利要求1所述克氏原螯虾抗脂多糖因子gALF1基因在WSSV病毒感染的免疫和治疗领域的应用。

3.一种权利要求1所述克氏原螯虾抗脂多糖因子gALF1基因编码的gALF1蛋白，其特征在于：所述gALF1蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

4.如权利要求3所述的gALF1蛋白在WSSV病毒感染的免疫和治疗领域的应用。

5.一种权利要求3所述的gALF1蛋白构建的表达载体，其特征在于：所述表达载体为pGEX-4T-1-gALF1。

6.一种权利要求5所述的pGEX-4T-1-gALF1表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

①RNA提取及反转录：

②ALF1全长编码区基因扩增：

③pGEX-4T-1-gALF1表达载体的构建：

将pGEX-4T-1载体和胶回收后的gALF1 PCR产物分别用EcoR Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切，电泳检测并分别胶回收纯化，然后用T4 DNA连接酶将其于恒温水浴锅中连接反应，连接产物转化到大肠杆菌DH5α，进行培养，挑取单菌落以primer-ALF1引物作PCR鉴定，阳性克隆按1％比例扩大培养，扩增后提取质粒。

7.根据权利要求6所述的pGEX-4T-1-gALF1表达载体的构建方法，其特征在于：

所述步骤②中，用于序列扩增的专一性引物的上游引物为Pc-ALF1-EcoR I：5‘(TACTCAGAATTCCAGGTCCTGGAGGGTCTG)3’；

8.根据权利要求6所述的pGEX-4T-1-gALF1表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤③后还需要进行GST-gALF1融合蛋白的诱导表达：将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单克隆菌落，于含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，16℃诱导表达过夜，收集菌体；用PBS重悬菌体，4℃，超声波破碎6min，超声破碎后菌液4℃，10000r/min离心20min，分离上清和沉淀；取各10μL，进行SDS-PAGE电泳分析。

9.根据权利要求8所述的pGEX-4T-1-gALF1表达载体的构建方法，其特征在于：所述GST-gALF1融合蛋白的诱导表达后，还需进行融合蛋白的纯化，收集诱导后菌体超声破碎的沉淀，变复性透析纯化，进行12％的SDS-PAGE电泳。

10.根据权利要求9所述的pGEX-4T-1-gALF1表达载体的构建方法，其特征在于，所述融合蛋白的纯化方法具体包括以下步骤：