CN108251440B

CN108251440B - 缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法和应用

Info

Publication number: CN108251440B
Application number: CN201711363539.3A
Authority: CN
Inventors: 邵铱娜; 李成华; 魏智薪; 张卫卫; 赵雪琳; 蒋丽婷
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2017-12-18
Filing date: 2017-12-18
Publication date: 2021-04-13
Anticipated expiration: 2037-12-18
Also published as: CN108251440A

Abstract

本发明公开了缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌构建方法和应用，特点是缢蛏溶菌酶基因序列如SEQIDNO.1所示；缢蛏溶菌酶基因编码蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；其重组缢蛏溶菌酶基因工程菌构建方法为用分别含有BamHI位点和XhoI位点的引物扩增缢蛏溶菌酶基因编码蛋白的成熟肽序列；将克隆得到的目的基因插入pET28a（+）载体，获得重组质粒pET28a（+）‑Lysozyme；对重组质粒pET28a（+）‑Lysozyme进行诱导表达，获得重组缢蛏溶菌酶基因工程菌，优点是其表达的重组缢蛏溶菌酶基因工程菌对哈维氏弧菌，副溶血弧菌，灿烂弧菌均具有明显的杀菌作用。

Description

缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，尤其是涉及一种缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法和应用。

背景技术

溶菌酶（Lysozyme，EC 3.2.1.17）是一种具有水解粘多糖功能的碱性酶，它能催化细菌细胞壁中粘多糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4糖苷键的水解，进而破坏细菌细胞壁肽聚糖支架、导致内容物逸出，从而引起细菌死亡。溶菌酶作为一种广谱抗菌效应分子，广泛存在于各种微生物、植物、无脊椎动物和脊椎动物中，并在生物机体的免疫防御系统中发挥重要作用。在无脊椎动物组织中分布最为广泛的抗菌蛋白即是溶菌酶，这对只有先天免疫的无脊椎动物而言，溶菌酶的抗菌效应更为重要。在无脊椎动物中，溶菌酶还具有消化酶的作用，其通过分解微生物来获得生长所需的部分碳源和氮源。随着研究的深入，研究者发现溶菌酶除抗菌活性外，还具有许多其它功能，包括抗病毒、抗炎、抗肿瘤活性，以及诱导调节机体其他免疫因子的合成与分泌、协同其它免疫因子进行免疫防御调节作用。

溶菌酶独特的作用机制和广泛的抗菌作用，使其在临床研究及大规模的市场应用上受到了越来越广泛的关注。在医学上，溶菌酶可以作为多种疾病的标志物，通过测定尿液、分泌物、血清或组织中溶菌酶的浓度和活性变化，作为诊断的指标之一。根据溶菌酶能溶菌，但对组织无刺激、无毒性的特性，己广泛应用于食品、医药、化工、生物工程等领域。目前，人们对动物性食品安全的要求越来越高，溶菌酶作为天然、安全的抗菌物质也越来越广泛的应用于畜禽及水产动物饲料中。随着对水产动物免疫抗病机制研究的不断深入，将重组溶菌酶作为绿色制剂应用到水产养殖中有望成为水产动物健康养殖的一条新途径。

缢蛏（Sinonovacula constricta）作为我国四大养殖贝类之一，在水产养殖中占据了重要的经济地位。然而，随着沿海城市经济的发展，海洋污染日益加剧，导致养殖缢蛏病害问题时有发生，尤其是细菌性疾病引发的疾病严重制约了缢蛏的生存和生长。目前在缢蛏养殖中大多使用抗生素进行防治，但抗生素的大量使用导致了“超级细菌”的出现以及抗生素的残留引起的食品安全问题日益突出，人们迫切需要开发新型抗菌剂进行防治。溶菌酶作为一种天然杀菌蛋白，不会导致细菌耐药性问题、而且对人体无毒害作用。因此，构建缢蛏溶菌酶基因表达工程菌，进而产业化制备绿色疾病制剂应用于水产养殖迫在眉睫。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法和应用，其表达的重组缢蛏溶菌酶基因工程菌对哈维氏弧菌，副溶血弧菌，灿烂弧菌均具有明显的杀菌作用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种缢蛏溶菌酶基因，该基因具有SEQIDNO.1所示的cDNA序列。该序列全长768bp，包括423 bp的开放阅读框，编码140个氨基酸，5’非编码区长168 bp，3’非编码区长177bp，具有多聚腺苷酸信号(AATAAA)及序列末端含有典型的polyA尾。

所述的缢蛏溶菌酶基因的克隆方法，具体步骤如下：

a．总RNA提取：取缢蛏鳃组织制备得到RNA提取液；

b．cDNA第一链合成：将RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA；

c．PCR扩增：cDNA 1.0 μL，含Mg²⁺的10×PCR缓冲液2.5 μL，浓度2.5 mM的dNTP 2.0μL，浓度10 μM的Lysozyme上游扩增引物1.0 μL，浓度10 μM的Lysozyme下游扩增引物1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水17.3 μL；扩增条件：94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、60℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；其中Lysozyme上游扩增引物：ATGCTCCTTTACGCTGTGGTCAT，Lysozyme下游扩增引物：CTAATGGACATTAGAACATCCTG；

d. PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50 μg/mL的LB平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行PCR验证，并送至上海生工生物工程有限公司测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒，即缢蛏溶菌酶基因，该基因具有SEQIDNO.1所示的cDNA序列。

2、缢蛏溶菌酶基因编码蛋白，该编码蛋白具有SEQID NO.2所示的氨基酸序列。该蛋白分子量为15.204 KDa，等电点为6.47，其中编码序列的1-18位为信号肽序列，2-24位为跨膜区，19-140位为成熟肽。该编码蛋白的成熟肽具有SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。

3、一种利用上述缢蛏溶菌酶基因编码蛋白构建重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的方法，步骤如下：

（1）设计PCR引物，用分别含有BamHI位点和XhoI位点的引物扩增缢蛏溶菌酶基因编码蛋白的成熟肽序列；

（2）将克隆得到的目的基因插入pET28a（+）载体，获得重组质粒pET28a（+）-Lysozyme；

（3）对重组质粒pET28a（+）- Lysozyme进行诱导表达，获得重组缢蛏溶菌酶基因工程菌。

具体步骤如下：

（1）PCR扩增：取缢蛏鳃组织制备得到RNA提取液，将RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA；然后以合成的cDNA为模板，用分别含有BamHI位点和XhoI位点的引物PCR扩增缢蛏溶菌酶编码蛋白的成熟肽序列，其中含BamH I位点Lysozyme上游扩增引物的基因序列如下所示：GGATCCTTTGCGACCGGCATGGTCTCTCA；

含XhoI 位点Lysozyme下游扩增引物的基因序列如下所示：CTCGAGCTAATGGACATTAGAACATCCTG；

（2）PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌E. coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50 μg/mL的LB平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行PCR验证和测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒；

（3）重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BmHI和Xho I限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收分子量在423 bp的目的条带，与经同样酶切的pET28（a）原核表达载体酶切产物连接，转化E. coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28（a）-Lysozyme重组质粒；

（4）重组蛋白的表达：利用质粒提取试剂盒纯化阳性菌株重组质粒pET28（a）-Lysozyme，转化到表达宿主E. coli rosetta，再接种到卡那霉素浓度为50 μg/mL的LB培养液中，37 ℃、200 r/min振荡培养至菌液OD₆₀₀的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为1 mmol/L，37 ℃诱导表达3-6 h，收集菌液，经12000 r/min离心5min，弃上清液，得到细菌沉淀物即重组缢蛏溶菌酶基因工程菌。

4、上述重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的纯化与复性，具体步骤如下：

（1）菌体裂解与蛋白纯化：将每100 mL细菌沉淀物用10 mL包涵体洗涤液重悬，超声破碎菌体10 min，12000 rpm离心10 min，去上清液，用10 mL包涵体溶解液重悬沉淀，超声破碎10 min至溶液变清，再次15000 rpm离心20 min，取上清液；取1 mL Ni-NTASefinose^TMResin上柱，用无菌水洗2次，再用包涵体溶解液平衡1次，将上清液上柱与之前上柱的Ni²⁺介质混合，于4 ℃混匀1 h，收集流出液重复上柱2次，用杂蛋白洗涤液洗涤介质，每次10 mL，重复洗涤10次；

（2）蛋白复性：结合在Ni²⁺介质上的缢蛏溶菌酶重组蛋白与Ni²⁺介质一起，分别用透析液Buffer 1、透析液Buffer 2、透析液Buffer 3进行透析，每步于4 ℃透析12 h后，去尽液体，用非变性洗脱液进行洗脱，每次加入1 mL非变性洗脱液于4 ℃浸泡10 min，收集洗脱液，重复洗脱5次，然后置于PBS缓冲液中于4 ℃透析6 h，重复透析3次，最后所得溶液即为具有活性的重组缢蛏溶菌酶蛋白。

在步骤（1）中所述溶液的配方为：

所述的包涵体洗涤液配方为：2 M Urea，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1 mMEDTA，0.5% Triton×100，pH=7.9；

所述的包涵体溶解液配方为：8 M Urea，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1% β-巯基乙醇，0.2% Triton×100，30 mM咪唑，pH=7.9；

所述的杂蛋白洗涤液配方为：6 M Urea，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1% β-巯基乙醇，0.1% Triton×100，20 mM咪唑，pH=7.9；

在步骤（2）中所述溶液的配方为：

所述的透析液Buffer 1配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.614 g还原型谷胱甘肽，0.0122 g 氧化型谷胱甘肽，0.1 M咪唑，3 M Urea，50 mL甘油，50 μL 吐温-20，定容于1 L，pH=7.9；

所述的透析液Buffer 2配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.614 g还原型谷胱甘肽，0.0122 g氧化型谷胱甘肽，0.05 M咪唑，1 M Urea，50 mL 甘油，50 μL 吐温-20，定容于1 L，pH=7.9；

所述的透析液Buffer 3配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，50 mL甘油，定容于1L，pH=7.9；

所述的PBS溶液的配方为：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，定容于1 L水中，调pH=7.4。

5、上述重组缢蛏溶菌酶基因工程菌在抗菌活性中的应用。其表达的缢蛏溶菌酶蛋白在制备哈维氏弧菌、副溶血弧菌和灿烂弧菌抑制剂方面的用途。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首先公开了缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白序列及其重组溶菌酶蛋白基因工程菌的构建方法，表达产物经纯化、复性、体外活性检测后发现重组Lysozyme蛋白具有高效的杀灭水产致病菌弧菌属哈维氏弧菌，副溶血弧菌，灿烂弧菌的作用，可以作为绿色抗生素制剂在缢蛏病害防治中发挥作用。

附图说明

图1为缢蛏溶菌酶蛋白诱导后的SDS-PAGE分析，M泳道为蛋白质分子量标准，1为未诱导重组蛋白，2为诱导3 h重组蛋白，3为诱导3 h重组蛋白上清，4为诱导3 h重组蛋白包涵体；

图2为缢蛏溶菌酶蛋白纯化后的SDS-PAGE分析，M泳道为蛋白质分子量标准，1为纯化后重组蛋白；

图3为缢蛏溶菌酶蛋白对哈维氏弧菌的抑制作用效果图，图中1、2、3为重组蛋白质量浓度20 μg/牛津杯、50 μg/牛津杯、100 μg/牛津杯，4为阴性对照组1（无菌2216E培养基），5为阴性对照组（PBS）；

图4为缢蛏溶菌酶蛋白对副溶血弧菌的抑制作用效果图，图中1、2、3为重组蛋白质量浓度20 μg/牛津杯、50 μg/牛津杯、100 μg/牛津杯，4为阴性对照组1（2216E培养基），5为阴性对照组2（PBS）；

图5为缢蛏溶菌酶蛋白对灿烂弧菌的抑制作用效果图，图中1、2、3为重组蛋白质量浓度20 μg/牛津杯、50 μg/牛津杯、100 μg/牛津杯，4为阴性对照组1（2216E培养基），5为阴性对照组2（PBS）。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例一

缢蛏溶菌酶基因克隆与序列分析

（1）通过对缢蛏病原胁迫后鳃组织的高通量转录组测序和表达谱分析，发现了多条编码溶菌酶基因的EST序列，对其中一个EST克隆（>UN088075）进行序列比对分析，证实该EST克隆编码缢蛏溶菌酶基因的全长；

（2）PCR扩增获取缢蛏溶菌酶基因全长序列，具体步骤如下：

a．总RNA提取：取缢蛏鳃组织0.1 g，进行液氮研磨后加入Trizol试剂（购于Takara公司）1.0 mL，震荡混匀，室温放置5 min，再加入0.2 mL氯仿，震荡混匀，室温静置10 min，4℃，12000 g，离心15 min，吸取上清至离心管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5 min后，于4 ℃，12000 rpm，离心10 min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1 mL，于4 ℃，12000 rpm，离心5 min，去上清，沉淀静置5-10 min，加30 μL无RNA酶水，得到RNA提取液；

b．cDNA第一链合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒（Takara）逆转录合成cDNA，具体合成方法依cDNA试剂盒说明书操作；

c．PCR扩增全长引物设计：对上述步骤（1）中所述的全长溶菌酶基因设计特异性引物：Lysozyme上游扩增引物：ATGCTCCTTTACGCTGTGGTCAT，Lysozyme下游扩增引物：CTAATGGACATTAGAACATCCTG；

d．PCR扩增：cDNA 1.0 μL，10×PCR缓冲液（Mg²⁺plus）2.5 μL，浓度2.5 mM的dNTP2.0 μL，浓度10 μM的上游引物Lysozyme F 1.0 μL，浓度10 μM的下游引物Lysozyme R 1.0μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水17.3 μL ；扩增条件：94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；

e. PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒（百泰克）回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD19-T（Takara公司）连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α（Takara公司）后，在含有氨苄浓度为50 μg/mL的LB平板培养基（LB平板培养基配方为胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L）中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行PCR验证，并送至上海生工生物工程有限公司测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒；

最终得到的缢蛏溶菌酶基因cDNA序列如SEQIDNO.1所示，该序列全长768 bp，包括423 bp的开放阅读框，编码140个氨基酸，5’非编码区长168 bp，3’非编码区长177 bp，具有多聚腺苷酸信号(AATAAA)及序列末端含有典型的polyA尾；缢蛏溶菌酶蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，该蛋白分子量为15.204 KDa，等电点为6.47，其中编码序列的1-18位为信号肽序列，2-24位为跨膜区，19-140位为成熟肽，缢蛏溶菌酶成熟肽序列如SEQIDNO.3所示。

具体实施例二

重组缢蛏溶菌酶成熟肽基因工程菌的构建方法与表达

a．总RNA提取：取缢蛏鳃组织0.5 g，进行液氮研磨后加入Trizol试剂（购于Takara公司）1.0 mL，震荡混匀，室温放置5 min，再加入0.2 mL氯仿，震荡混匀，室温静置10 min，4℃，12000 g，离心15 min，吸取上清至离心管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5 min，4 ℃，12000 rpm，离心10 min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1mL， 4 ℃，12000 rpm，离心5 min，去上清，沉淀静置5-10 min，加30 μL无RNA酶水，得到RNA提取液；

b．cDNA合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒（Takara）逆转录合成cDNA，具体合成方法依cDNA试剂盒说明书操作；

c．PCR扩增成熟肽引物设计：本发明选择了pET28a载体上的酶切位点BmH I和Xho I，因此，设计扩增引物时在上游引物中引入了BamH I酶切位点，下游引物中引入了Xho I酶切位点，即如下所示：

含BamH I位点Lysozyme 上游扩增引物：GGATCCTTTGCGACCGGCATGGTCTCTCA；

含XhoI 位点Lysozyme 下游扩增引物：CTCGAGCTAATGGACATTAGAACATCCTG；

d．PCR扩增：cDNA 1.0 μL，10×PCR缓冲液（Mg²⁺plus）2.5 μL，浓度2.5 mM的dNTP2.0 μL，浓度10 μM的上游引物Lysozyme F（BamH I）1.0 μL，浓度10 μM的下游引物Lysozyme R（Xho I） 1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水17.3 μL ；扩增条件：94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；

e．PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒（百泰克）回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD19-T（Takara公司）连接，转化至大肠杆菌E. coli DH5α（Takara公司）后，在含有氨苄浓度为50 μg/mL的LB平板培养基（LB平板培养基配方为胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L）中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行PCR验证和测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒；

f．重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BmHI和Xho I（New England Biolabs，NEB）限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收分子量在423 bp的目的条带，与经同样酶切的pET28（a）原核表达载体酶切产物连接，转化E. coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28（a）-Lysozyme重组质粒；

g．重组蛋白的表达：利用质粒提取试剂盒（Omega公司）纯化阳性菌株重组质粒pET28（a）-Lysozyme，转化到表达宿主E. coli rosetta（康为公司），再接种到卡那霉素浓度为50 μg/mL的LB培养液中，37 ℃、200 r/min振荡培养至菌液OD₆₀₀的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）使其终浓度为1 mmol/L，37 ℃诱导表达3-6 h，收集菌液，经12000 r/min离心5 min，弃上清液，得到细菌沉淀物即重组基因工程菌。SDS-PAGE检测重组基因工程菌诱导蛋白的表达形式（图1）。

具体实施例三

重组蛋白的纯化与复性

a．菌体裂解与蛋白纯化：将每100 mL细菌沉淀物用10 mL包涵体洗涤液重悬，超声破碎菌体10 min（超5 s，停10 s，功率：40%），12000 rpm离心10 min，去上清液，用10 mL包涵体溶解液重悬沉淀，超声破碎10 min（超5 s，停10 s，功率：40%），至溶液变清，再次15000rpm离心20 min，取上清液；取1 mL Ni-NTA Sefinose^TMResin（上海生工，编号：BSP033）上柱，用无菌水洗2次，再用包涵体溶解液平衡1次，将上清液上柱与之前上柱的Ni²⁺介质混合，于4 ℃混匀1 h，收集流出液重复上柱2次，用杂蛋白洗涤液洗涤介质，每次10 mL，重复10次；

在步骤a中，所述溶液的配方为：

包涵体洗涤液配方为：2 M Urea，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1 mM EDTA，0.5%Triton×100，pH=7.9；

包涵体溶解液配方为：8 M Urea，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1% β-巯基乙醇，0.2% Triton×100，30 mM咪唑，pH=7.9；

杂蛋白洗涤液配方为：6 M Urea，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1% β-巯基乙醇，0.1% Triton×100，20 mM咪唑，pH=7.9；

b．蛋白复性：结合在Ni²⁺介质上的蛋白与Ni²⁺介质一起，分别用透析液Buffer 1、透析液Buffer 2、透析液Buffer 3进行透析，每步于4 ℃透析12 h后，去尽液体，用非变性洗脱液进行洗脱，每次加入1 mL非变性洗脱液于4 ℃浸泡10 min，收集洗脱液，重复5次。取少量进行SDS-PAGE电泳鉴定（图2）；

在步骤b中，所述溶液的配方为：

透析液Buffer 1配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.614 g还原型谷胱甘肽，0.0122 g 氧化型谷胱甘肽，0.1 M咪唑，3 M Urea，50 mL甘油，50 μL 吐温-20，定容于1 L，pH=7.9；

透析液Buffer 2配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.614 g还原型谷胱甘肽，0.0122 g氧化型谷胱甘肽，0.05 M咪唑，1 M Urea，50 mL 甘油，50 μL 吐温-20，定容于1L，pH=7.9；

透析液Buffer 3配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，50 mL甘油，定容于1 L，pH=7.9；

c．蛋白透析：将上述步骤b中的蛋白置于PBS缓冲液中于4 ℃透析6 h，重复3次，最后所得溶液即为具有活性的重组缢蛏溶菌酶蛋白。其中PBS溶液的配方为：8g NaCl、0.2gKCl、1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，定容于1 L水中，调pH=7.4。

具体实施例四

缢蛏重组蛋白的抑菌活性分析

（1）将3种受试阴性菌副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），哈维氏弧菌（Vibrio harveyi），灿烂弧菌（Vibrio splendidus）接种于2216E液体培养基（胰蛋白胨5g/L，酵母提取物1 g/L，pH=7.6）于28 ℃，150 r/min培养至OD₆₀₀=0.5，取10 uL菌液涂平板（琼脂12 g/mL）；

（2）将受试阳性菌藤黄微球菌（Micrococcus luteus）接种于营养琼脂液体培养基（胰蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5g/L，pH=7.3 ± 0.1）于35 ℃，150 r/min培养，将菌液与营养琼脂固体培养基（琼脂15 g/L）混合倒平板，菌液浓度1×10⁷cfu/mL；

（3）采用改良琼脂平板扩散法（牛津杯）测定重组溶菌酶蛋白抑菌活性，每种受试菌设置阴性对照组1（无菌培养基）、阴性对照组2（PBS）和重组蛋白实验组，在上述所述平板中放置无菌牛津杯（直径0.8 cm），依次向每个牛津杯中加入不同质量浓度20 μg/牛津杯、50 μg/牛津杯、100 μg/牛津杯具体实施例三构建所得的重组缢蛏溶菌酶基因工程菌以及相等体积阴性对照组1（无菌培养基）、阴性对照组2（PBS），藤黄微球菌实验组于35 ℃培养24 h，其他受试菌实验组于28 ℃培养24 h，结果显示，具体实施例三构建所得的重组缢蛏溶菌酶基因工程菌对3株受试水产病原菌哈维氏弧菌、副溶血弧菌（图3、图4）以及灿烂弧菌（图5）具有较为明显的抑制作用，而对阳性菌藤黄微球菌没有抑菌作用。其中，重组蛋白质量浓度为100 μg/牛津杯对哈维氏弧菌的抑菌直径为2.20 ± 0.13 cm，重组蛋白质量浓度为50 μg/牛津杯对哈维氏弧菌的抑菌直径为1.82 ± 0.11 cm，重组蛋白质量浓度为20 μg/牛津杯对哈维氏弧菌的抑菌直径为1.47 ± 0.14 cm；重组蛋白质量浓度为100 μg/牛津杯对副溶血弧菌的抑菌直径为2.09 ± 0.25 cm，重组蛋白质量浓度为50 μg/牛津杯对副溶血弧菌的抑菌直径为1.27 ± 0.12 cm；重组蛋白质量浓度为20 μg/牛津杯对副溶血弧菌的抑菌直径为0.93 ± 0.02 cm；重组蛋白质量浓度为100 μg/牛津杯对灿烂弧菌的抑菌直径为2.31 ± 0.42 cm，重组蛋白质量浓度为50 μg/牛津杯对灿烂弧菌的抑菌直径为1.20 ± 0.09 cm，重组蛋白质量浓度为20 μg/牛津杯对灿烂弧菌的抑菌圈不显著。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 宁波大学

<120> 缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法和应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 768

<212> DNA

<213> 缢蛏溶菌酶基因全长

<400> 1

CATGTTTTCA GAACTAGACC AAATTCGTTA AGTCGTGATT TGATAAGGCA CGAGTCTGTC 60

TTGCCAAGAG AACTGTGCAA CTGTAGACTA GATAAATGAT GTCGGTCGTA TAAAAGACGG 120

AACGGTGGGC GCATAGACAA CACCATTTTA AACTTTTACA AACTAAACAT GCTCCTTTAC 180

GCTGTGGTCA TAGTGTCAGC GGTTCTTGGT TTGTCGGAAG GATTTGCGAC CGGCATGGTC 240

TCTCAAGCCT GCTTGCAATG CATTTGCATG GCTGAGTCCG GATGTACTAA CCTTCCATGC 300

AAGATGGATG TCGGAAGTTT GTCATGCGGA TACTTCCAGA TCAAACATAA CTATTGGCTG 360

GACTGTGGCT CGATTGGCGG AAGCTGGCAG GCATGCGCTG CTGACAAGAC CTGCGCTTCT 420

CAGTGTGTTC AGAACTACAT GGCGCGATAC GTTAATCACT ACAACTGTCC ACATACATGC 480

GAGGCGTATG CCAGGGAGCA CAACGGCGGA CCGAACGGAT GCCACCACTC AAACACATTG 540

TCATATTGGC ACCATGTGCA GTCCCAGCCA GGATGTTCTA ATGTCCATTA GCCGCCCGAT 600

CATTTCCATA TATTGTATCA TCTTAAATAA AAAACATGTT CATATTTATG GATTTTGACC 660

CAGTCATGAA TTAATCAAAA TGTTGTATTT CTAAATGAGT ATATATTGAC ATAGTAAATG 720

AGATTAAACT TTTCTTTATG CAAGCTGTAT TTTCTCAAAA AAAAAAAA 768

<210> 2

<211> 140

<212> PRT

<213> 缢蛏溶菌酶基因编码蛋白

<400> 2

Met Leu Leu Tyr Ala Val Val Ile Val Ser Ala Val Leu Gly Leu

1 5 10 15

Ser Glu Gly Phe Ala Thr Gly Met Val Ser Gln Ala Cys Leu Gln

20 25 30

Cys Ile Cys Met Ala Glu Ser Gly Cys Thr Asn Leu Pro Cys Lys

35 40 45

Met Asp Val Gly Ser Leu Ser Cys Gly Tyr Phe Gln Ile Lys His

50 55 60

Asn Tyr Trp Leu Asp Cys Gly Ser Ile Gly Gly Ser Trp Gln Ala

65 70 75

Cys Ala Ala Asp Lys Thr Cys Ala Ser Gln Cys Val Gln Asn Tyr

80 85 90

Met Ala Arg Tyr Val Asn His Tyr Asn Cys Pro His Thr Cys Glu

95 100 105

Ala Tyr Ala Arg Glu His Asn Gly Gly Pro Asn Gly Cys His His

110 115 120

Ser Asn Thr Leu Ser Tyr Trp His His Val Gln Ser Gln Pro Gly

125 130 135

Cys Ser Asn Val His

140

<210> 3

<211> 122

<212> PRT

<213> 缢蛏溶菌酶基因编码蛋白的成熟肽

<400> 3

Phe Ala Thr Gly Met Val Ser Gln Ala Cys Leu Gln Cys Ile Cys

1 5 10 15

Met Ala Glu Ser Gly Cys Thr Asn Leu Pro Cys Lys Met Asp Val

20 25 30

Gly Ser Leu Ser Cys Gly Tyr Phe Gln Ile Lys His Asn Tyr Trp

35 40 45

Leu Asp Cys Gly Ser Ile Gly Gly Ser Trp Gln Ala Cys Ala Ala

50 55 60

Asp Lys Thr Cys Ala Ser Gln Cys Val Gln Asn Tyr Met Ala Arg

65 70 75

Tyr Val Asn His Tyr Asn Cys Pro His Thr Cys Glu Ala Tyr Ala

80 85 90

Arg Glu His Asn Gly Gly Pro Asn Gly Cys His His Ser Asn Thr

95 100 105

Leu Ser Tyr Trp His His Val Gln Ser Gln Pro Gly Cys Ser Asn

110 115 120

Val His

122

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Lysozyme上游扩增引物

<400> 4

ATGCTCCTTTACGCTGTGGTCAT 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Lysozyme下游扩增引物

<400> 5

CTAATGGACATTAGAACATCCTG 23

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 含BamH I位点Lysozyme上游扩增引物

<400> 6

GGATCCTTTGCGACCGGCATGGTCTCTCA 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 含Xho I 位点Lysozyme下游扩增引物

<400> 7

CTCGAGCTAATGGACATTAGAACATCCTG 29

Claims

1.一种缢蛏溶菌酶基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO.1所示的cDNA序列。

2.一种权利要求1所述的缢蛏溶菌酶基因的克隆方法，其特征在于具体步骤如下：

a.总RNA提取：取缢蛏鳃组织制备得到RNA提取液；

b.cDNA第一链合成：将RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA；

c.PCR扩增：cDNA 1.0μL，含Mg²⁺的10×PCR缓冲液2.5μL，浓度2.5mM的dNTP 2.0μL，浓度10μM的Lysozyme上游扩增引物1.0μL，浓度10μM的Lysozyme下游扩增引物1.0μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2μL，超纯水17.3μL；扩增条件：94℃5min、94℃30s、60℃30s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min；其中Lysozyme上游扩增引物：

ATGCTCCTTTACGCTGTGGTCAT，Lysozyme下游扩增引物：

CTAATGGACATTAGAACATCCTG；

d.PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50μg/mL的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行PCR验证，并送至上海生工生物工程有限公司测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒，即缢蛏溶菌酶基因，该基因具有SEQ ID NO.1所示的cDNA序列。

3.一种根据权利要求1所述的缢蛏溶菌酶基因编码蛋白，其特征在于：该编码蛋白为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的缢蛏溶菌酶基因编码蛋白，其特征在于：该编码蛋白的成熟肽为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

5.一种利用权利要求4所述的缢蛏溶菌酶基因编码蛋白构建重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的方法，其特征在于步骤如下：

(1)设计PCR引物，用分别含有BamHI位点和XhoI位点的引物扩增缢蛏溶菌酶基因编码蛋白的基因；

(2)将克隆得到的目的基因插入pET28a(+)载体，获得重组质粒pET28a(+)-Lysozyme；

(3)对重组质粒pET28a(+)-Lysozyme进行诱导表达，获得重组缢蛏溶菌酶基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)PCR扩增：取缢蛏鳃组织制备得到RNA提取液，将RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA；然后以合成的cDNA为模板，用分别含有BamHI位点和XhoI位点的引物PCR扩增缢蛏溶菌酶编码蛋白的基因，其中含BamH I位点Lysozyme上游扩增引物的基因序列如下所示：

GGATCCTTTGCGACCGGCATGGTCTCTCA；

含XhoI位点Lysozyme下游扩增引物的基因序列如下所示：

CTCGAGCTAATGGACATTAGAACATCCTG；

(2)PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50μg/mL的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行PCR验证和测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒；

(3)重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BmHI和Xho I限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收分子量在423bp的目的条带，与经同样酶切的pET28(a)原核表达载体酶切产物连接，转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28(a)-Lysozyme重组质粒；

(4)重组蛋白的表达：利用质粒提取试剂盒纯化阳性菌株重组质粒pET28(a)-Lysozyme，转化到表达宿主E.coli rosetta，再接种到卡那霉素浓度为50μg/mL的LB培养液中，37℃、200r/min振荡培养至菌液OD600的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为1mmol/L，37℃诱导表达3-6h，收集菌液，经12000r/min离心5min，弃上清液，得到细菌沉淀物即重组缢蛏溶菌酶基因工程菌。

7.一种根据权利要求6所述的构建方法获得的重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的纯化与复性，其特征在于具体步骤如下：

(1)菌体裂解与蛋白纯化：将每100mL细菌沉淀物用10mL包涵体洗涤液重悬，超声破碎菌体10min，12000rpm离心10min，去上清液，用10mL包涵体溶解液重悬沉淀，超声破碎10min至溶液变清，再次15000rpm离心20min，取上清液；取1mL Ni-NTA Sefinose^TMResin上柱，用无菌水洗2次，再用包涵体溶解液平衡1次，将上清液上柱与之前上柱的Ni²⁺介质混合，于4℃混匀1h，收集流出液重复上柱2次，用杂蛋白洗涤液洗涤介质，每次10mL，重复洗涤10次；

(2)蛋白复性：结合在Ni²⁺介质上的缢蛏溶菌酶重组蛋白与Ni²⁺介质一起，分别用透析液Buffer 1、透析液Buffer 2、透析液Buffer 3进行透析，每步于4℃透析12h后，去尽液体，用非变性洗脱液进行洗脱，每次加入1mL非变性洗脱液于4℃浸泡10min，收集洗脱液，重复洗脱5次，然后置于PBS缓冲液中于4℃透析6h，重复透析3次，最后所得溶液即为具有活性的重组缢蛏溶菌酶蛋白。

8.根据权利要求7所述的重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的纯化与复性，其特征在于在步骤(1)中所述溶液的配方为：

所述的包涵体洗涤液配方为：2M Urea，20mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，0.5％Triton×100，pH＝7.9；

所述的包涵体溶解液配方为：8M Urea，20mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％β-巯基乙醇，0.2％Triton×100，30mM咪唑，pH＝7.9；

所述的杂蛋白洗涤液配方为：6M Urea，20mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％β-巯基乙醇，0.1％Triton×100，20mM咪唑，pH＝7.9；

在步骤(2)中所述溶液的配方为：

所述的透析液Buffer 1配方为：1M Tris-HCl，2.5M NaCl，0.614g还原型谷胱甘肽，0.0122g氧化型谷胱甘肽，0.1M咪唑，3M Urea，50mL甘油，50μL吐温-20，定容于1L，pH＝7.9；

所述的透析液Buffer 2配方为：1M Tris-HCl，2.5M NaCl，0.614g还原型谷胱甘肽，0.0122g氧化型谷胱甘肽，0.05M咪唑，1M Urea，50mL甘油，50μL吐温-20，定容于1L，pH＝7.9；

所述的透析液Buffer 3配方为：1M Tris-HCl，2.5M NaCl，50mL甘油，定容于1L，pH＝7.9；

所述的PBS溶液的配方为：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，定容于1L水中，调pH＝7.4。

9.根据权利要求5-8中任一项所述的重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的应用，其特征在于：其表达的缢蛏溶菌酶蛋白在制备哈维氏弧菌、副溶血弧菌和灿烂弧菌抑制剂方面的用途。