CN109385436B

CN109385436B - 一种拟穴青蟹c-型溶菌酶基因及其用途

Info

Publication number: CN109385436B
Application number: CN201811145954.6A
Authority: CN
Inventors: 郭志勋; 谢佳伟; 冯娟; 程长洪; 马红玲; 苏友禄; 邓益琴
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2018-09-29
Filing date: 2018-09-29
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2038-09-29
Also published as: CN109385436A

Abstract

本发明公开了一种拟穴青蟹C‑型溶菌酶基因，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No：1中所示。所述的拟穴青蟹C‑型溶菌酶基因的编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2中所示。本发明还公开了上述拟穴青蟹C‑型溶菌酶基因的编码蛋白在制备抑制细菌药物方面的用途。

Description

一种拟穴青蟹C-型溶菌酶基因及其用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种拟穴青蟹C-型溶菌酶基因及其应用。

背景技术

我国是水产养殖大国,但巨大的养殖产量也面临着严重的病害威胁，其中细菌性疾病的发病率和死亡率都居高不下。我国对虾养殖区常有发生的红腿病，其病原就是多种弧菌，中国明对虾、长毛对虾、斑节对虾和凡纳滨对虾均可感染，发病率和死亡率有时高达90％。由弧菌、假单胞菌和气单胞菌引起的烂鳃病可发生于几乎所有的养殖对虾，患病虾鳃的呼吸功能严重受损甚至丧失，最后缺氧而死。

溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一类可水解细菌细胞壁中肽聚糖的酶类的总称，其主要作用位点是细胞壁中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键，导致细胞壁破裂，引起细胞内容物逸出而致死细菌。根据溶菌酶的氨基酸序列、化学性质和生物活性不同，动物中将溶菌酶分为c-型溶菌酶、g-型溶菌酶和i-型溶菌酶。C-型溶菌酶广泛分布于各种脊椎动物和无脊椎动物中，溶菌酶是机体重要的非特异性免疫因子之一,参与机体多种免疫反应,能改善和增强巨噬细胞吞噬能力和消化功能，在溶菌过程中形成一个水解体系，破坏和消除侵入体内的异物，从而实现机体的免疫防御。

但目前尚无有人发现本发明中的拟穴青蟹C-型溶菌酶基因及其在抑制细菌方面的应用。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种拟穴青蟹C-型溶菌酶基因及其编码蛋白。

本发明的第二个目的在于提供含有上述拟穴青蟹C-型溶菌酶基因的编码蛋白在制备抑制细菌药物方面的用途。

本发明的上述第一个目的是通过如下技术方案实现的：一种拟穴青蟹C-型溶菌酶基因，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No：1中所示。

本发明中的拟穴青蟹C-型溶菌酶基因SpcLYZ，其全长cDNA序列是849bp，包含94bp的5’非编码区和83bp的3’非编码区，开放阅读框669bp编码223 个氨基酸，预测蛋白分子量为23.7kDa，理论等电点为8.9。

上述的拟穴青蟹C-型溶菌酶基因的编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQID No：2中所示。

氨基酸序列分析显示拟穴青蟹C-型溶菌酶基因SpcLYZ属于c-型溶菌酶，具有Glu50和Asp65两个活性位点，Asp97、Asn102和Asp103三个钙结合位点，1-17氨基酸为信号肽。

本发明通过拟穴青蟹c-型溶菌酶SpcLYZ的基因克隆，首先提取总RNA，并合成cDNA，然后获取SpcLYZ cDNA全长克隆，包括cDNA片段验证、PCR 产物回收纯化、连接、转化、阳性克隆鉴定、RACE技术扩增cDNA全长，获得拟穴青蟹C-型溶菌酶基因的cDNA，再通过穴青蟹c-型溶菌酶SpcLYZ蛋白的表达、纯化、变性和复性，包括构建重组质粒、重组蛋白的诱导表达、SDS-PAGE 重组蛋白表达检测、重组蛋白纯化、重组蛋白的变性和复性、Bradford测定重组蛋白浓度，获得拟穴青蟹C-型溶菌酶基因的编码蛋白。

本发明的上述第二个目的是通过如下技术方案来实现的：上述的拟穴青蟹 C-型溶菌酶基因的编码蛋白在制备抑制细菌药物方面的用途。

本发明通过实验发现，拟穴青蟹C-型溶菌酶基因的编码蛋白对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有抑制作用，尤其是对溶壁微球菌、副溶血弧菌、哈维弧菌和溶藻弧菌具有较强的溶菌活性。

本发明具有以下优点：本发明从拟穴青蟹中获得了其cDNA序列，以及其对应的开放阅读框的核苷酸序列和该核苷酸序列的编码蛋白，该编码蛋白对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有抑制作用，能用于制备抑制细菌的药物方面。

附图说明

图1是具体实施方式中拟穴青蟹c-型溶菌酶基因SpcLYZ编码蛋白的表达 SDS-PAGE，其中M是分子量标准；1是诱导0h的重组质粒，2是诱导4h的重组质粒，3是上清中的重组质粒，4是包涵体中的重组质粒，5-6是超滤浓缩后的上清中重组质粒，7-8是超滤浓缩后包涵体中重组质粒；

图2是具体实施方式中拟穴青蟹c-型溶菌酶基因SpcLYZ编码蛋白复性后 SDS-PAGE，其中M是分子量标准；1-2是复性后重组质粒；

图3是重组蛋白最适pH探索；

图4是重组蛋白最适温度探索；

图5是金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌感染后鳃中SpcLYZ的表达变化；

图6是金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌感染后肝胰腺中SpcLYZ的表达变化。

具体实施方式

下面通过以下具体实施方式对本发明做进一步阐述，但是本发明的内容完全不局限于此。

1.拟穴青蟹c-型溶菌酶SpcLYZ的基因克隆

1.1总RNA提取和cDNA合成

拟穴青蟹(100g±10g)购自广州黄沙市场，取其肝胰腺、鳃和肌肉混合后用天恩泽公司的海洋动物RNA提取试剂盒提取总RNA，用紫外分光光度计测总 RNA总浓度和纯度，并取5μL总RNA用1.5％琼脂糖跑胶确保其完整性；将检测质量合格的总RNA使用Takara公司的逆转录试剂盒逆转录为cDNA，合成的cDNA存放在-20℃冰箱备用。

1.2 SpcLYZ cDNA全长克隆

1.2.1 cDNA片段验证

根据实验室制备的转录组文库中的基因序列，设计引物ySpcLYZ-F(5’-ATGAGGCTCCTGGTGCTCCTGCT-3’)和ySpcLYZ-R(5’-GTAGTTTCTCTGATAGAAG AAG-3’)验证片段正确性。

表1 PCR配制体系

表2 PCR扩增程序

1.2.2 PCR产物回收纯化

使用Omega胶回收试剂盒将正确大小的DNA凝胶回收，得到的回收产物放 -20℃备用。

1.2.3连接

将回收的PCR产物连接到pMD-19T载体上，反应体系如下表3：

表3反应体系

16℃，连接4h。

1.2.4转化

连接产物10μL加入到50μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃水浴热激30s；冰浴2min；加入500μL LB液体培养基；37℃摇床中220r/min，45min；吸取100μL转化后产物涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上；37℃恒温培养箱中培养10h。

1.2.5阳性克隆鉴定

在固体培养基上挑取单个菌落，置于2.0mL离心管中加入1mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中；摇床中37℃，220r/min培养6h。菌液进行PCR鉴定，反应体系如表4所示，PCR扩增程序如表5所示。

表4反应体系

表5 PCR扩增程序

PCR产物取5μL在2.0％琼脂糖凝胶中进行电泳，对出现正确大小的目的条带送测菌液。

1.2.6RACE技术扩增cDNA全长

使用TakaraSMART^TMRACE试剂盒合成5’和3’cDNA模板，用于扩增c-型溶菌酶的基因全长，一扩反应体系如下表6，一扩反应程序如下表7，二扩反应体系如下表8，二扩反应程序如下表9。

表6一扩反应体系

表7一扩反应程序

表8二扩反应体系

表9二扩反应程序

二扩PCR产物中加入6*Loading Buffer，1.5％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，连接，转化，阳性克隆鉴定和送测方法同1.2.1.2.2-1.2.1.2.5。

1.2.7：拟穴青蟹c-型溶菌酶序列信息学分析

拟穴青蟹c-型溶菌酶基因SpcLYZ全长cDNA序列是849bp，其序列表如SEQ ID No：3所示，包含94bp的5’非编码区和83bp的3’非编码区，开放阅读框 669bp编码223个氨基酸，预测蛋白分子量为23.7kDa，理论等电点为8.9。

氨基酸序列分析显示SpcLYZ属于c-型溶菌酶，具有Glu 50和Asp65两个活性位点，Asp97、Asn102和Asp103三个钙结合位点，1-17氨基酸为信号肽。

SpcLYZ cDNA序列和氨基酸序列展示

其中加深字体表示起始密码子(ATG)，以及终止密码子(TGA)，阴影部分表示信号肽，具有下划线的加深字体表示活性位点，具有下划线和阴影的加深字体表示钙结合位点。

2.拟穴青蟹c-型溶菌酶SpcLYZ蛋白的表达、纯化、变性和复性

2.1：构建重组质粒

根据c-型溶菌酶基因ORF序列设计引物用于原核表达。参照2.1.2.1方法得到PCR扩增产物，将回收产物与表达型质粒pEasy-E1连接，连接反应体系如下表10。

表10连接反应体系

25℃，连接20min。

将连接产物转化DH5α，操作步骤同1.2.1.2.4-1.2.1.2.5。将测序正确的菌液用试剂盒提取质粒，再将质粒转化BL21(DE3)表达型感受态细胞，用T7引物进行阳性克隆鉴定。

2.2：重组蛋白的诱导表达

将测序正确的含有重组质粒的菌液接种在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在摇床上培育过夜，诱导温度和时间条件优化后操作步骤为：

(1)将种子液以1：1000比例接种在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中， 37℃，220r/min，过夜培养；

(2)将过夜培养的菌液以1：100的比例接种在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220r/min培养；

(3)当菌液OD600值达到0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷，37℃，200r/min诱导表达；

(4)于4小时停止诱导表达。

2.3：SDS-PAGE重组蛋白表达检测

(1)将收集的菌液样品12000rpm离心3min收集菌体；

(2)弃上清，加入100μL的1*PBS，重悬菌体；

(3)加入20μL的6*Loading Buffer上样缓冲液，混匀后沸水中煮沸10min；

(4)置于冰水中降温待用；

(5)配置浓缩胶和分离胶，如下表11；

表11浓缩胶和分离胶

(6)待胶凝固后，取冷却后的样品10μL注射到样品孔，80V电泳20min；

(7)待样品跑至分离胶处压为一条直线时电压升为130V，大约电泳40min，样品溴酚蓝条带到达分离胶底部时停止电泳；

(8)取出凝胶，加入考马斯亮蓝染色液染色8h，再加入脱色液脱色，期间每2h更换脱色液；

(9)待脱色至背景为透明时，停止脱色。

2.4：重组蛋白纯化

确认蛋白在大肠杆菌中的表达位置：

(1)将含有重组载体的种子液按照1：100的比例加入到200mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在优化的表达条件下诱导表达；

(2)4℃，10000rpm，离心3min收集菌体，加入20mL预冷含有终浓度 40mmol/L的PBS，重悬细菌，冰浴10min，重复操作3次；

(3)4℃，10000rpm，离心3min收集菌体，加入20mL预冷含有终浓度1％ triton-X-100的PBS，重悬细菌，冰浴10min，重复操作3次；

(4)超声破碎大肠杆菌功率100％，工作5s，停5s，进行30min；

(5)4℃，12000rpm，离心30min，收集上清和沉淀，取出部分上清和沉淀 SDS-PAGE电泳分析重组蛋白在上清还是沉淀。

已通过实验证实c-型溶菌酶存在于包涵体中。

重组蛋白在Ni-NTA填料中纯化：

(1)装柱：重悬介质，将适量介质加入层析柱，静置；

(2)平衡：10倍柱体积平衡缓冲液(8M Urea，100mM NaH₂PO₄，10mM Trisbase，pH8.0)平衡层析柱；

(3)上样：加入包涵体蛋白；

(4)洗涤：10倍柱体积平衡缓冲液洗涤层析柱，收集流出液；

(5)洗脱：用50mM、100mM、200mM、300mM、400mM和500mM 浓度咪唑进行梯度洗脱，收集流出液。

2.5：重组蛋白的变性和复性

2.5.1：尿素法变性

将纯化后的包涵体加入到20mL溶解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl,8mol/L尿素，0.5mol/LNaCl，2mmol/Lβ-巯基乙醇，pH＝8.0，0.22μm滤膜过滤)中，溶解后4℃，12000g，离心10min，取上清为包涵体溶液。

2.5.2：稀释复性法

2.5.2.1：透析袋前处理

(1)戴上手套，用剪刀将将透析袋剪成长度为10-20cm的小段；

(2)将剪下的透析袋在含有20g/L NaHCO₃和1mmol/L EDTA(pH＝8.0)的水溶液中煮沸约15min；

(3)待冷却后，用蒸馏水彻底清洗透析袋；

(4)将清洗干净的透析袋放在1mmol/L EDTA(pH＝8.0)水溶液中再次煮沸约15分钟；

(5)冷却后，用蒸馏水清洗透析袋，并将其放在4℃的20％的乙醇溶液中, 必须确保透析袋始终在乙醇溶液以内，注意的是下次取用透析袋时必须戴手套；

待在下次取用时，要先用蒸馏水彻底清洗透析袋。

2.5.2.2：稀释复性

(1)取一定量的包涵体溶解液，加入包涵体复性缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，0.5mol/LNaCl，2mmol/Lp-巯基乙醇，PH＝8.0)，将体系中尿素的浓度稀释到4M，将该反应置于4℃静止8h；

(2)再向体系中添加复性缓冲液将体系中尿素的浓度降至3mol/L，于4℃静止8h；

(3)再添加复性缓冲液将尿素浓度降至2mol/L，置于4℃静止8h。

(4)将该复性液放入用纯水反复冲洗过的透析袋中，封好透析袋两侧，将透析袋放入1L复性缓冲液中，4℃，透析8h；

(5)重复上一步骤；

(6)将透析袋放入PBS中，4℃，透析8h；

(7)重复上一步骤；

(8)透析完成后，将透析袋中的溶液全部转入50mL的带盖离心管内，4 ℃、12000rpm，离心10min，留取上清液，用于SDS-PAGE电泳检测。

2.6：Bradford测定重组蛋白浓度

(1)考马斯亮蓝染色在使用前平衡至室温并温和颠倒混匀，预热分光光度计；

(2)按照下表12，稀释牛血清蛋白(BSA)标准溶液(0.22mg/mL)；

表12稀释牛血清蛋白(BSA)标准溶液

(3)将适当体积的样品加入到1.5mL离心管中，用水补足到100μL；

(4)向各管中加入1.0mL考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置5-10min；

(5)分光光度计测595nm处的吸光值，记录读数，以不含BSA的样品吸光值作为空白对照；

(6)绘制标准曲线，计算样品中蛋白浓度。

将重组质粒转化进入BL21(DE3)，在IPTG浓度为0.5时，重组质粒在27℃诱导4h表达水平较好。产物通过SDS-PAGE分析，在16.7kDa处有明显条带(图 1)。经过纯化复性后的重组蛋白SDS-PAGE分析后同样在相同大小处显示明显条带(图2)。纯化复性后的蛋白测其浓度为0.5mg/mL。

3.拟穴青蟹c-型溶菌酶SpcLYZ重组蛋白最适pH和最适温度的探索

用溶壁微球菌在c-型溶菌酶作用下浊度的变化来检测重组蛋白的最适pH和最适温度。

(1)将溶壁微球菌以三线法在琼脂培养基上划线，28℃，静置培养24h；

(2)挑取单菌落置于营养肉汤培养基中，28℃，220r/min，静置培养24h；

(3)最适pH：将PBS用HCl和NaOH调整pH为4-10，间隔为0.5，用不同pH的PBS将溶壁微球菌稀释至2×105CFU/mL，取90μL重组蛋白加入10μL 调整pH后的菌液，3个平行，室温静置24h，测其OD450值(图3)。

(4)最适温度：用PBS将溶壁微球菌调整浓度至2×105CFU/mL，取90μL 重组蛋白加入10μL调整浓度后的菌液，使用PCR仪控温，3个平行，20℃至60℃，间隔10℃，控温24h，测其OD450值(图4)。

(5)最适pH实验结果：

从图3中可以看出，在pH为6的时候，重组蛋白对溶壁微球菌的溶菌活性最高，pH从4.5到7的范围内，溶菌活性都能在80％以上。

从图4中可以看出，在温度40℃的时候重组蛋白溶菌活性最高，在40至60℃的较高温度中溶菌活性都能保持70％以上。

4.拟穴青蟹c-型溶菌酶抑菌实验

4.1c-型溶菌酶在金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌刺激后表达量变化

细菌感染实验中，分别设置对照组、金黄色葡萄球菌组和副溶血弧菌组，每个采样点设置三组平行。对照组拟穴青蟹注射100μL PBS，金黄色葡萄球菌组拟穴青蟹注射浓度为1.5×10⁷CFU/mL，副溶血弧菌组注射浓度为2×10⁶CFU/mL。分别在0h、3h、6h、12h、24h和48h时间点随机取样，将组织肝胰腺和鳃放置在RNALater中，RNA提取方法和cDNA合成方法同1.1，逆转录时RNA模板用量为1000ng，使用时稀释10倍。

表13实时荧光定量PCR反应体系

表14实时荧光定量PCR反应程序

实验结果运用2^-ΔΔCT进行数据分析，最后用SPSS Statistics Version 22.0进行单因素法显著性分析，结果使用平均值±标准差表示，P<0.05差异显著。

细菌感染实验结果：

通过实时荧光定量PCR测定拟穴青蟹中c-型溶菌酶SpcLYZ在受到金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌刺激后的转录表达水平，选取了两个免疫组织：鳃(图5) 和肝胰腺(图6)。在金黄色葡萄球菌刺激后，鳃和肝胰腺组织中c-型溶菌酶SpcLYZ表达量明显上调；副溶血弧菌刺激后，在鳃中表达量明显上调，肝胰腺中有轻微上调。鳃中，金黄色葡萄球菌刺激后SpcLYZ表达量在3h、6h、12h、 24h和48h分别比对照组高2.3倍，2.8倍，5倍，2.5倍和11.7倍；副溶血弧菌刺激后SpcLYZ表达量在3h、6h、12h、24h和48h分别比对照组高4.4倍，6.6 倍，4.2倍，2.7倍和5.9倍，如图5中所示。

肝胰腺中，金黄色葡萄球菌刺激后c-型溶菌酶SpcLYZ表达量在3h、6h、 12h、24h和48h分别比对照组高2.6倍，8.8倍，16.3倍，3.1倍和53.4倍；副溶血弧菌刺激后c-型溶菌酶SpcLYZ表达量在3h、6h、12h、24h和48h分别比对照组高1.6倍，3.1倍，3.3倍，1.5倍和5.0倍，如图6中所示。

总体来说，c-型溶菌酶SpcLYZ的瞬时表达模式在拟穴青蟹受到细菌攻击后呈上升趋势。

4.2.拟穴青蟹c-型溶菌酶SpcLYZ重组蛋白的应用

将重组蛋白和PBS分别作为实验组和对照组，计数在细菌浓度为相同时两组的细菌菌落数，以此观察重组蛋白的溶菌活性。

(1)将溶壁微球菌、副溶血弧菌、哈维弧菌和溶藻弧菌从冻存管中用涂布棒蘸取，以三线法在琼脂培养基上划线，28℃，静置培养24h；

(2)从琼脂培养基上挑取4种菌的单菌落，置于2mL营养肉汤培养基中， 28℃，220r/min,恒温培养24h；

(3)培养后的细菌用PBS稀释至2*10⁵CFU/mL；

(4)实验组取90μL重组蛋白加入10μL菌液，对照组为90μLPBS加入10μL 菌液，每组实验做3个平行，混匀后涂在营养琼脂培养基上，28℃，静置24h 后计数细菌菌落数，对照组菌落数记为起始CFU，实验组菌落数记为最终CFU。

抑菌实验结果：

从表15数据分析，重组蛋白对溶壁微球菌、副溶血弧菌、哈维弧菌和溶藻弧菌都有较强的溶菌活性，分别为60.38％，79.90％，69.17％，88.86％，证明其无论对革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌都有一定的抑制作用。

表15 SpcLYZ对各细菌的溶菌效果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所

<120> 一种拟穴青蟹C-型溶菌酶基因及其用途

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 669

<212> DNA

<213> 溶菌酶(lysozyme)

<400> 1

atgaggctcc tggtgctcct gctggtgacg tgtgctacac tggtggtagg gaagatattt 60

accaagtgtg aactggcctc tgacctggag aatcgctatg gagtcgcaaa ggaggacgtc 120

aagaaatggg tctgcatcgc ccagtttgag tctaccttca atactgctgc catcaaccac 180

cacaactatg accacagcaa ggacttcggg ctcttccagc tcaacagcag atactggtgt 240

ggtgacaagg gcaagaacgt gtgcaagatg ccatgcacag ctctcctgga cgacgacctg 300

acgaatgatg tgcagtgcat gaagaagatc ataagggaga cggagaagtg gaagggaaag 360

gggacaggac tgtcagcttg ggttgcttac gaaagaaggt gtaagaatat gaacctcgat 420

cagtacatag ctgagagttc gaccaacgcc gatgcctcca acacaatccc cgtcaggcaa 480

gtctctgctg gcaacaatcc accccgtcag gaaaacatac cgggggatta cgtgcctatc 540

ataaataacg cccgtgttcc catcaggcct aaggttatta gtaacatgca tcccccttac 600

atgcgcatcc ccatgcatgg tcctttcatt gcaccaagtc cttaccactt cttctatcag 660

agaaactac 669

<210> 2

<211> 223

<212> PRT

<213> 溶菌酶(lysozyme)

<400> 2

Met Arg Leu Leu Val Leu Leu Leu Val Thr Cys Ala Thr Leu Val Val

1 5 10 15

Gly Lys Ile Phe Thr Lys Cys Glu Leu Ala Ser Asp Leu Glu Asn Arg

20 25 30

Tyr Gly Val Ala Lys Glu Asp Val Lys Lys Trp Val Cys Ile Ala Gln

35 40 45

Phe Glu Ser Thr Phe Asn Thr Ala Ala Ile Asn His His Asn Tyr Asp

50 55 60

His Ser Lys Asp Phe Gly Leu Phe Gln Leu Asn Ser Arg Tyr Trp Cys

65 70 75 80

Gly Asp Lys Gly Lys Asn Val Cys Lys Met Pro Cys Thr Ala Leu Leu

85 90 95

Asp Asp Asp Leu Thr Asn Asp Val Gln Cys Met Lys Lys Ile Ile Arg

100 105 110

Glu Thr Glu Lys Trp Lys Gly Lys Gly Thr Gly Leu Ser Ala Trp Val

115 120 125

Ala Tyr Glu Arg Arg Cys Lys Asn Met Asn Leu Asp Gln Tyr Ile Ala

130 135 140

Glu Ser Ser Thr Asn Ala Asp Ala Ser Asn Thr Ile Pro Val Arg Gln

145 150 155 160

Val Ser Ala Gly Asn Asn Pro Pro Arg Gln Glu Asn Ile Pro Gly Asp

165 170 175

Tyr Val Pro Ile Ile Asn Asn Ala Arg Val Pro Ile Arg Pro Lys Val

180 185 190

Ile Ser Asn Met His Pro Pro Tyr Met Arg Ile Pro Met His Gly Pro

195 200 205

Phe Ile Ala Pro Ser Pro Tyr His Phe Phe Tyr Gln Arg Asn Tyr

210 215 220

<210> 3

<211> 849

<212> DNA

<213> 溶菌酶(lysozyme)

<400> 3

catggggata ggtagccagg gcgcggtgcg gtgtacatct actggcgttc ctctgggtag 60

tggctactga ccggcggctt tttgtgactt cggcaagatg aggctcctgg tgctcctgct 120

ggtgacgtgt gctacactgg tggtagggaa gatatttacc aagtgtgaac tggcctctga 180

cctggagaat cgctatggag tcgcaaagga ggacgtcaag aaatgggtct gcatcgccca 240

gtttgagtct accttcaata ctgctgccat caaccaccac aactatgacc acagcaagga 300

cttcgggctc ttccagctca acagcagata ctggtgtggt gacaagggca agaacgtgtg 360

caagatgcca tgcacagctc tcctggacga cgacctgacg aatgatgtgc agtgcatgaa 420

gaagatcata agggagacgg agaagtggaa gggaaagggg acaggactgt cagcttgggt 480

tgcttacgaa agaaggtgta agaatatgaa cctcgatcag tacatagctg agagttcgac 540

caacgccgat gcctccaaca caatccccgt caggcaagtc tctgctggca acaatccacc 600

ccgtcaggaa aacataccgg gggattacgt gcctatcata aataacgccc gtgttcccat 660

caggcctaag gttattagta acatgcatcc cccttacatg cgcatcccca tgcatggtcc 720

tttcattgca ccaagtcctt accacttctt ctatcagaga aactactgaa aataggtgac 780

aagtggtaag tgtggctgag taaatagact gttaggctac aagtggtaat aaaaaaaaaa 840

aaaaaaaaa 849

Claims

1.拟穴青蟹C-型溶菌酶基因的编码蛋白在制备抑制细菌药物方面的用途，所述拟穴青蟹C-型溶菌酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo：1中所示，所述拟穴青蟹C-型溶菌酶基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2中所示，所述细菌为溶壁微球菌、副溶血弧菌、哈维弧菌和溶藻弧菌。