CN104151414B - 拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin的制备方法与应用，涉及抗菌肽。制备方法：1)拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin表达载体的构建；2)将步骤1)所得的表达载体倒入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获表达产物；3)分离纯化步骤2)所得的表达产物，获得纯化产物融合蛋白scygonadin/SpHyastatin；4)将步骤3)所得的纯化产物融合蛋白scygonadin/SpHyastatin进行肠激酶酶切反应，得酶切反应产物；5)分离纯化步骤4)所得的酶切反应产物，获得重组蛋白，即拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin。所述拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin可在制备细菌生长抑制剂中应用。

Description

拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及抗菌肽，尤其是涉及拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin的制备方法与应用。

背景技术

拟穴青蟹是我国东南沿海的重要海产养殖品种，其具有个体大、肉质好、营养丰富等特点，深受人们喜爱。近年来，随着养殖规模不断扩大、环境污染加重、致病菌大量增生等问题的出现，拟穴青蟹发生了大规模的死亡，使我国海产养殖业遭到了巨大的经济损失。

甲壳动物通过先天免疫系统能够快速有效的抵御外界病原微生物的侵染^[1]。生物体先天免疫系统由细胞免疫和体液免疫组成，而抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是体液免疫的重要组成部分^[2]。已报道的甲壳动物抗菌肽主要包括：penaeidin^[3,4]，Crustin^[5,6,7]，抗脂多糖因子(ALF)^[8,9,10]，以及青蟹性腺特异高表达的抗菌肽Scygonadin^[11]。研究、开发和应用抗菌肽有助于深入了解无脊椎动物免疫防御机制，因其具有高效的抗菌活性和极低的耐药性，可以有效的解决海水养殖生产中由于长期滥用抗生素而产生的细菌耐药性、水产品药物残留和水环境污染等问题。因此，抗菌肽在水产养殖业作为饲料添加剂具有广阔的应用前景。

参考文献如下：

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发明内容

本发明的第一目的在于提供拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin的制备方法。

本发明的第二目的在于提供拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin在制备细菌生长抑制剂中的应用。

所述拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin的制备方法，包括以下步骤：

1)拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin表达载体的构建：分别PCR扩增拟穴青蟹抗菌肽scygonadin基因(Genbank登录号：AY864802)和SpHyastatin基因(Genbank登录号：JX228177)，重叠PCR法获得联合多肽scygonadin/SpHyastatin的目的基因片段，将该片段插入pPIC9K载体中，进而得到pPIC9K-scygonadin/SpHyastatin重组表达载体；

2)将步骤1)所得到的pPIC9K-scygonadin/SpHyastatin重组表达载体倒入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；

3)分离纯化步骤2)所得的表达产物，获得纯化产物融合蛋白scygonadin/SpHyastatin；

4)将步骤3)所得的纯化产物融合蛋白scygonadin/SpHyastatin进行肠激酶酶切反应，得酶切反应产物；

5)分离纯化步骤4)所得的酶切反应产物，获得重组蛋白，即拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin。

在步骤1)中，所述联合多肽scygonadin/SpHyastatin的基因序列为：

所述联合多肽scygonadin/SpHyastatin的氨基酸序列为：

在步骤1)中，所述pPIC9K-scygonadin/SpHyastatin重组表达载体用于表达序列为SEQ ID No.1的拟穴青蟹抗菌肽scygonadin/SpHyastatin融合序列。

在步骤3)中，所述分离纯化的方法可为：先将表达产物进行离心，收集发酵上清液，透析后，再进行亲和层析。

所制备的拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin是一种迄今未见报道的具有抗菌活性的新肽。

所述拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin可在制备细菌生长抑制剂中应用。

所述细菌为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。

所述革兰氏阴性菌如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)；所述革兰氏阳性菌如藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和毕赤酵母。所述细菌生长抑制剂可用于动物饲料添加剂、抗病原微生物新药等。

本发明旨在获得拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin基因工程表达产品，并对其抗菌活性进行鉴定，以期开发抗病原微生物的新药物。本发明根据拟穴青蟹SpHyastatin基因序列特征，获得了联合多肽的毕赤酵母表达重组子pPIC9K-scygonadin/SpHyastatin，通过基因工程表达技术，成功获得具有生物活性的SpHyastatin重组蛋白，验证SpHyastatin具有广谱抗菌活性，为其作为抗病原微生物新药的开发奠定基础。值得关注的是，SpHyastatin对水产致病菌如荧光假单胞菌和嗜水气单胞菌具有明显的抑菌活性，为其作为动物饲料添加剂的开发提供重要依据。此外，之前实验表明，SpHyastatin在毕赤酵母表达系统中无法直接表达，可能与其具有复杂空间结构(6个半胱氨酸可能形成3个二硫键)以及对毕赤酵母具有抑菌活性有关。本发明为获得具有复杂空间结构以及抑制毕赤酵母生长的蛋白提供新的技术手段。

本发明提供了含有拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin的表达载体的构建、表达产物及其制备方法。本发明所述表达载体中插入了用于重组表达序列为SEQ ID No.1的SpHyastatin融合序列，在宿主毕赤酵母中进行诱导表达，获得融合表达产物SpHyastatin。该表达产物可通过C末端的His-Tag亲和层析纯化，纯化的融合产物可用肠激酶将融合蛋白切除，获得单一抗菌肽SpHyastatin。该抗菌肽具有广谱的抗菌活性，对嗜水气单胞菌，荧光假单胞菌，藤黄微球菌等均有显著的抑杀菌作用，在水产养殖业、医药业等将具有重要的应用价值。

附图说明

图1为SpHyastatin PCR电泳图谱。在图1中，M为DNA Marker DL2000，1为SpHyastatin PCR片段。

图2为scygonadin PCR电泳图谱。在图2中，M为DNA Marker DL2000，1为scygonadin PCR片段。

图3为scygonadin/SpHyastatin PCR电泳图谱。在图3中，M为DNA Marker DL2000，1为scygonadin/SpHyastatin PCR片段。

图4为pPIC9K表达载体酶切前后电泳图。在图4中，1为pPIC9K载体酶切前片段，M为DNA Marker DL2000，2为pPIC9K载体酶切后片段。

图5为pPIC9K-scygonadin/SpHyastatin真核表达载体构件图。

图6为SDS-PAGE分析SpHyastatin的表达和纯化情况。在图6中，M为预染蛋白Marker SM0443(Fermentas公司)，1～2分别为甲醇诱导联合多肽scygonadin/SpHyastatin0，24h的蛋白表达产物，3为纯化的联合多肽，4为联合多肽被肠激酶酶切后的样品，5为二次纯化流出的scygonadin蛋白，6为二次纯化获得的目的蛋白SpHyastatin。

具体实施方式

以下通过实施例结合附图详细说明本发明的技术方案。

实施例1重组表达载体pPIC9K-scygonadin/SpHyastatin的构建

1)扩增拟穴青蟹SpHyastatin成熟肽序列

根据pPIC9K载体多克隆位点和拟穴青蟹SpHyastatin基因序列(Genbank登录号：JX228177)，设计扩增SpHyastatin基因的上、下游引物。上游引物5′端加上肠激酶酶切位点，下游引物5′端加上NotⅠ酶切位点，终止密码子和6×His组氨酸标签。

上游引物SpHya-F：

5′-GACGACGACGACAAGTACAACGCGAAGGTTCCGAT-3′；

下游引物SpHya-R：

5′-CATGCGGCCGCTTAATGGTGATGGTGATGATGGCCTTTGTAGGGTACTG-3′。

以拟穴青蟹SpHyastatin cDNA重组pPMD18-T阳性质粒为扩增模板，分别以SpHya-F和SpHya-R为上、下游引物，以La Taq酶(购自TaKaRa公司)扩增目的片段，反应体系为：

混合均匀，PCR反应程序如下：

PCR产物长度为393bp(参见图1)。

2)扩增拟穴青蟹scygonadin成熟肽序列

根据pPIC9K载体多克隆位点和拟穴青蟹scygonadin基因序列(Genbank登录号：AY864802)，设计扩增scygonadin基因的上、下游引物。上游引物5′端加上EcoRⅠ酶切位点，下游引物5′端加上肠激酶酶切位点。

上游引物SCY-F：

5′-GGGGAATTCGGCCAGGCACTCAACAA-3′；

下游引物SCY-R：

5′-CTTGTCGTCGTCGTCACCGGAACCTGGGCCACCGTAAGAAGCAATCCAGT-3′。

以拟穴青蟹scygonadin cDNA重组pPMD18-T阳性质粒为扩增模板，分别以SCY-F和SCY-R为上、下游引物，以La Taq酶(购自TaKaRa公司)扩增目的片段，反应体系和程序如1)中所述。PCR产物长度为330bp(参见图2)。

3)scygonadin/SpHyastatin联合多肽目的片段的获得

以SCY-F和SpHya-R为上、下游引物，将1)和2)的PCR产物稀释100倍作为模板，以LaTaq酶扩增scygonadin/SpHyastatin片段，反应体系如下：

反应程序如1)中所述。反应结束后，将所有反应液进行1.5％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收特异性片段，得到scygonadin/SpHyastatin PCR产物长度为708bp(参见图3)。

4)预连接DNA片段的制备

取1μg回收的scygonadin/SpHyastatin片段，用EcoRⅠ和NotⅠ限制性酶双酶切，37℃孵育3h，酶切反应体系如下表：

反应结束后用Qiagen凝胶回收试剂盒回收除去酶及核苷酸碎片，得到具有EcoRⅠ和NotⅠ的粘性末端的scygonadin/SpHyastatin片段。

5)pPIC9K载体的处理

将真核表达载体pPIC9K转化至E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于含有氨苄霉素(50μg/ml)的LB琼脂平板上，37℃过夜培养。挑取单克隆菌落，接种于20ml含50μg/ml的氨苄霉素的LB液体培养基中，200rpm/min，37℃培养大约8h至对数生长期，离心收集菌体，使用天根质粒提取试剂盒小量提取pPIC9K质粒。

取1μg上述纯化的pPIC9K载体，用EcoRⅠ和NotⅠ限制性酶双酶切，37℃孵育3h，酶切反应体系如下；

反应结束后，用Qiagen PCR产物回收试剂盒除去酶及核苷酸碎片，得到具有EcoRⅠ和NotⅠ的粘性末端的pPIC9K载体。

6)pPIC9K-scygonadin/SpHyastatin载体的构建、转化和鉴定

pPIC9K真核表达载体和scygonadin/SpHyastatin片段经过EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后具有相同的粘性末端，将二者连接，反应体系如下：

16℃孵育过夜；次日，将10μL连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于含有氨苄霉素(50μg/mL)的LB琼脂平板上过夜培养。次日挑取单菌落，以上游引物5′AOXprimer：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′和下游引物3′AOX primer：5′-AGGATGTCAGAATGCCATTTGCC-3′进行菌液PCR，随后将阳性克隆菌送往Invitrogen公司进行DNA核苷酸测序。结果显示，连接正确，核苷酸的开放阅读框(ORF)连续编码，最终成功构建pPIC9K-scygonadin/SpHyastatin融合表达载体(图5)。该真核重组表达载体的特点是采用AOX1启动子，酵母信号肽α-factor因子引导融合蛋白scygonadin/SpHyastatin的分泌表达；scygonadin和SpHyastatin之间插入肠激酶酶切位点便于切除融合蛋白；C端添加6×His-Tag便于亲和层析纯化目的蛋白。

实施例2pPIC9K-scygonadin/SpHyastatin重组质粒在毕赤酵母GS115中的诱导表达

1)pPIC9K-scygonadin/SpHyastatin的线性化

将测序正确的含pPIC9K-scygonadin/SpHyastatin重组质粒的菌株划线培养，挑取单克隆，用天根质粒小提中量试剂盒提取质粒。取3μg质粒由SacⅠ限制性内切酶线性化，反应体系如下：

用Qiagen凝胶回收试剂盒回收线性化后的pPIC9K-scygonadin/SpHyastatin。采用电击法转化将线性化后的质粒转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布于MD平板，28℃培养48h。

2)融合蛋白pPIC9K-scygonadin/SpHyastatin的诱导表达

从MD平板上挑取单克隆菌落，接种于10ml生长培养基(BMGY)中,28℃230rpm/min培养至对数生长期，离心倒掉培养基收集菌体，加入10ml表达培养基(BMGY)，用0.5％甲醇诱导表达0、24和48h，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测融合蛋白的表达情况。

结果显示：pPIC9K-scygonadin/SpHyastatin重组质粒转化的毕赤酵母GS115甲醇诱导24h与诱导前相比，在约25～37kDa位置具有明显的表达蛋白带(图6)。

实施例3亲和层析法纯化scygonadin/SpHyastatin融合蛋白

1)上柱前样品的制备

按照实施例2描述，重组菌株诱导24h后12,000rpm低温离心30min，收集发酵上清液。4℃，用预冷的PBS透析液(50mM磷酸缓冲液+50mM NaCl，pH8.0)透析毕赤酵母诱导表达上清液2～3次，随后12,000rpm低温离心30min，再次收集发酵上清液，经0.45μm滤膜过滤，待上柱纯化。

2)亲和层析纯化scygonadin/SpHyastatin融合蛋白

用镍离子螯合亲和层析柱亲和纯化，层析试剂为：

溶液A：20mM磷酸缓冲液+50mM NaCl+10mM咪唑，pH8.0；

溶液B：20mM磷酸缓冲液+500mM NaCl+1M咪唑，pH8.0；

用5～10个柱体积MilliQ水清洗预装柱(HisTrapTM FF Crude5ml)，5～10个柱体积溶液A平衡HisTrap层析柱，将准备好的毕赤酵母表达上清液全部上柱，流速为2mL/min；用5～10个柱体积的溶液A洗去未结合的杂蛋白；用35％溶液B(含350mM咪唑)洗脱目的蛋白，并收集洗脱组分。

SDS-PAGE电泳结果显示(参见图4)，scygonadin/SpHyastatin融合蛋白表达产物能够特异性的与镍离子螯合亲和层析柱结合，在较高浓度的咪唑溶液竞争洗涤后，融合表达产物被洗脱，纯度较高。将蛋白在磷酸盐缓冲液中透析，最后透析入MilliQ水中。

实施例4融合蛋白的酶切反应及纯化获得SpHyastatin蛋白

1)融合蛋白的酶切反应

取上述纯化的scygonadin/SpHyastatin融合蛋白，用肠激酶进行酶切，16℃孵育14h，取少量酶切反应液进行SDS-PAGE电泳鉴定，可见融合蛋白部分scygonadin和SpHyastatin已经分开，形成大小不同的两条蛋白带(图6)。

2)亲和纯化SpHyastatin蛋白

用镍离子螯合亲和层析柱亲和纯化，亲和纯化方法如实施例3所示。

实施例5SpHyastatin重组蛋白抗菌活性鉴定

蛋白样品过滤除菌后，以BSA为标准品应用Bradford法绘制蛋白浓度标准曲线，根据公式可计算出SpHyastatin重组蛋白的浓度。将蛋白溶液倍比稀释至1.25-20μM。MIC(Minimum Inhibitory Concentration，最小抑菌浓度)的测定在96孔细胞培养板上进行。

(1)菌悬液的准备：取被测细菌和酵母，划线于MH、2216或者YPG平板，培养过夜；调整菌浓度至6×10⁵CFU/ml，酵母则调整至3.3×10⁴spores/ml备用。

(2)每种被测菌按照以下操作设置空白对照组、阴性对照组和待测样品实验组，每组设置2个平行样，每种菌重复3次：

①阳性对照组：加入50μl磷酸钠盐缓冲液和50μl菌悬液；

②空白对照组：加入50μl待测蛋白样品和50μl磷酸钠盐缓冲液；

③样品实验组：加入50μl待测蛋白样品和50μl菌悬液；

(3)细菌最适培养24～48h后，观察MIC结果。抗菌实验结果显示，拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin具有广谱的抗菌活性，能够有效的抑制革兰氏阴性菌如荧光假单胞菌(MIC1.25～2.5μM)和嗜水气单胞菌(MIC1.25～2.5μM)，革兰氏阳性菌如藤黄微球菌(MIC1.25～2.5μM)，以及毕赤酵母(MIC2.5～5μM)的生长。

Claims (1)

1.拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin表达载体的构建：分别PCR扩增拟穴青蟹抗菌肽scygonadin基因和SpHyastatin基因，重叠PCR法获得联合多肽scygonadin/SpHyastatin的目的基因片段，将该片段插入pPIC9K载体中，进而得到pPIC9K-scygonadin/SpHyastatin重组表达载体；所述拟穴青蟹抗菌肽scygonadin基因的Genbank登录号为AY864802，拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin基因的Genbank登录号为JX228177；

所述联合多肽scygonadin/SpHyastatin的基因序列为：

所述联合多肽scygonadin/SpHyastatin的氨基酸序列为：

所述pPIC9K-scygonadin/SpHyastatin重组表达载体用于表达序列为SEQ ID No.1的拟穴青蟹抗菌肽scygonadin/SpHyastatin融合序列；

2)将步骤1)所得到的pPIC9K-scygonadin/SpHyastatin重组表达载体倒入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；

3)分离纯化步骤2)所得的表达产物，获得纯化产物融合蛋白scygonadin/SpHyastatin；

所述分离纯化的方法为：先将表达产物进行离心，收集发酵上清液，透析后，再进行亲和层析；

4)将步骤3)所得的纯化产物融合蛋白scygonadin/SpHyastatin进行肠激酶酶切反应，得酶切反应产物；

5)分离纯化步骤4)所得的酶切反应产物，获得重组蛋白，即拟穴青蟹抗菌肽SpHyastatin。