CN102304516A - 拟穴青蟹阴离子抗菌肽的毕赤酵母表达产物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

拟穴青蟹阴离子抗菌肽的毕赤酵母表达产物及其制备方法，涉及拟穴青蟹抗菌肽的基因工程表达。构建拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin的重组表达载体；将所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；分离纯化所得的表达产物，获得重组蛋白，即拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin。借助基因工程技术，利用pPIC9K毕赤酵母表达载体，表达出具有抗菌活性的拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin，该重组蛋白具有广谱的抗菌活性，抗菌活性与从雄性拟穴青蟹性腺中直接获得的Scygonadin纯品的抗菌结果相似。Scygonadin的基因工程表达产品将在抗病原微生物新药和动物饲料添加剂中应用。

Description

拟穴青蟹阴离子抗菌肽的毕赤酵母表达产物及其制备方法

技术领域

本发明涉及拟穴青蟹抗菌肽的基因工程表达，特别涉及拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin的毕赤酵母表达及其制备方法。

背景技术

拟穴青蟹[Scylla paramamosain(Estampador，1949)]，俗称青蟹，隶属于甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、短尾亚目(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidae)，青蟹属(Scylla)，是我国东南沿海最重要的海洋经济蟹类之一。随着青蟹养殖规模地不断扩大，由细菌、真菌、病毒和寄生虫等因素引起的疾病对蟹类养殖业造成巨大损失。

抗菌肽被认为是鱼虾蟹贝等防御系统的主要成分之一，是生物体先天免疫系统的重要组成分。已预见到抗菌肽在海水养殖鱼类、蟹类、贝类等的疾病防治上将是一种应用前景广阔的抗耐药性细菌药物和饲料免疫添加剂。研究、开发与应用抗菌肽，对解决海水养殖生产中面临的细菌耐药性和鱼类饲料中滥用抗生素造成的水产品药物残留和水环境污染等问题具有重要的科学意义和实际应用价值，并且将会取得显著的经济效益。

自1996年，第一个6.5kDa的富含脯氨酸的蟹类抗菌肽从岸蟹(Carcinus maenas)中分离，到目前为止已经在蟹类发现了多种抗菌肽，如Callinectin，抗脂多糖因子(ALF)([5]ImjongjirakC，Amparyup P，Tassanakajon A，Sittipraneed S.Antilipopolysaccharide factor(ALF)of mud crabScylla paramamosain：molecular cloning，genomic organization and the antimicrobial activity of itssynthetic LPS binding domain[J].Mol Immunol.，2007，44(12)：3195-3203；[6]Imjongjirak C，Amparyup P，Tassanakaj on A.Molecular cloning，genomic organization and antibacterial activityof a second isoform of antilipopolysaccharide factor(ALF)from the mud crab，Scyllaparamamosain[J].Fish Shellfish Immunol.，2011，30(1)：58-66)，Crustin([7]Brockton V，Smith VJ.Crustin expression following bacterial injection and temperature change in the shore crab，Carcinus maenas[J].Dev Comp Immunol.，2008，32(9)：1027-1033；[8]Sperstad S V，Haug T，Paulsen V，Rode T M，Strandskog G，Solem S T，Styrvold O B，

K.Characterization ofcrustins from the hemocytes of the spider crab，Hyas araneus，and the red king crab，Paralithodescamtschaticus[J].Dev Comp Immunol.，2009，33(4)：583-591；[9]Mu C，Zheng P，Zhao J，Wang L，Zhang H，Qiu L，Gai Y，Song L.Molecular characterization and expression of a crustin-like genefrom Chinese mitten crab，Eriocheir sinensis[J].Dev Comp Immunol.，2010，34(7)：734-740)，Scygonadin([10]Huang W S，Wang K J，Yang M，Cai J J，Li S J，Wang G Z.Purification and partcharacterization of a novel antibacterial protein Scygonadin，isolated from the seminal plasma ofmud crab Scylla serrata(

，1775)[J].Exp.Mar.Biol.Ecol.，2006，339：37-42；[11]Wang K J，Huang W S，Yang M，Chen H Y，Bo J，Li S J，Wang G Z，A male-specific expression gene，encodesa novel anionic antimicrobial peptide，scygonadin，in Scylla serrata[J].Mol.Immunol.，2007，44：1961-1968；[12]Xu W F，Qiao K，Huang S P，Peng H，Huang W S，Chen F Y，Zhang N，Wang，GZ，Wang K J.The expression pattern of scygonadin during the ontogenesis of Scylla paramamosainpredicting its potential role in reproductive immunity[J].Dev Comp Immunol.，2011，In press)，arasin([13]

K，Haug T，Sperstad SV，Rekdal O，Indrevoll B，Styrvold OB.Arasin 1，aproline-arginine-rich antimicrobial peptide isolated from the spider crab，Hyas araneus[J].DevComp Immunol.，2008，32(3)：275-285；[14]Imjongjirak C，Amparyup P，Tassanakajon A.Twonovel antimicrobial peptides，arasin-likeSp and GRPSp，from the mud crab Scylla paramamosain，exhibit the activity against some crustacean pathogenic bacteria.Fish Shellfish Immunol.，2011，30(2)：706-712)和GRPSp。其中scygonadin基因是甲壳动物中第1个被鉴定为主要在雄性生殖腺中特异性转录表达的阴离子抗菌肽([15]黄文树.锯缘青蟹一种新的阴离子抗菌肽scygonadin及其基因的分离与鉴定[D].厦门大学博士学位论文，2006)。

本申请人从福建东南部的锯缘青蟹(现修改名为拟穴青蟹)([12]Xu W F，Qiao K，HuangS P，Peng H，Huang W S，Chen F Y，Zhang N，Wang，G Z，Wang K J.The expression pattern ofscygonadin during the ontogenesis of Scylla paramamosain predicting its potential role inreproductive immunity[J].Dev Comp Immunol.，2011，In press；[16]林琪，李少菁，黎中宝，王桂忠.中国东南沿海青蟹属(Scylla)的种类组成[J].水产学报，2007，31(2)：211-219)的精浆中分离纯化了一个分子量约为10.8kDa的抗菌肽，经N端测序，BLAST进行数据库检索，发现与已知抗菌肽的同源性很低，是一种新的抗菌肽，本申请人将其命名为Scygonadin。

发明内容

本发明的目的在于提供拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin的毕赤酵母表达产物及其制备方法。

本发明的另一目的在于提供真核表达的抗菌肽Scygonadin在制备抗病原微生物药物和动物饲料添加剂中的应用。

所述拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin的基因序列为：

ggccaggcac tcaacaaact tatgcctaaa atcgtcagcg ccataattta tatggtcggg    60

caacccaatg caggtgtcac ttttctgggc caccaatgtc tggtggagtc aacgaggcaa    120

ccagacgggt tttacaccgc aaagatgtcg tgtgcttcct ggactcatga taatcctatt    180

gttggggaag gaagaagccg ggttgaactt gaggcgctta aaggttccat cacaaacttt    240

gtccagacag catccaatta caagaagttc accatagatg aggtcgagga ctggattgct    300

tcttac                                                               306

所述拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin的氨基酸序列为：

Gly Gln Ala Leu Asn Lys Leu Met Pro Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile

1               5                   10                  15

Tyr Met Val Gly Gln Pro Asn Ala Gly Val Thr Phe Leu Gly His Gln

            20                  25                  30

Cys Leu Val Glu Ser Thr Arg Gln Pro Asp Gly Phe Tyr Thr Ala Lys

        35                  40                  45

Met Ser Cys Ala Ser Trp Thr His Asp Asn Pro Ile Val Gly Glu Gly

    50                  55                  60

Arg Ser Arg Val Glu Leu Glu Ala Leu Lys Gly Ser Ile Thr Asn Phe

65                  70                  75                  80

Val Gln Thr Ala Ser Asn Tyr Lys Lys Phe Thr Ile Asp Glu Val Glu

                85                  90                  95

Asp Trp Ile Ala Ser Tyr

            100

所述拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin的制备方法包括以下步骤：

1)构建拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin的重组表达载体；

2)将步骤1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；

3)分离纯化步骤2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin。

在步骤1)中，所述表达载体可选用pPIC9K等。

在步骤2)中，所述宿主细胞可为毕赤酵母GS115菌株等。

在步骤3)中，所述分离纯化为先将表达产物进行离心，收集发酵上清液，透析后，再进行亲和层析。

所述真核表达的抗菌肽Scygonadin对革兰氏阳性菌如藤黄微球菌、谷氨酸棒杆菌和金黄色葡萄球菌，对革兰氏阴性菌如嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌都具有明显的抑制生长和杀灭作用，在抗病原微生物新药和动物饲料添加剂的开发中具有潜在应用价值。

黄文树等人用雄性拟穴青蟹性腺通过离子交换柱和反向液相色谱法获得阴离子抗菌肽Scygonadin的纯品，在自然状态下能明显抑杀藤黄微球菌，25μg/mL(～12μM)可杀死90％的藤黄微球菌([10]Huang W S，Wang K J，Yang M，Cai J J，Li S J，Wang G Z.Purification andpart characterization of a novel antibacterial protein Scygonadin，isolated from the seminal plasmaof mud crab Scylla serrata(

1775)[J].Exp.Mar.Biol.Ecol.，2006，339：37-42)。

而本发明通过真核表达纯化的Scygonadin对藤黄微球菌的抗菌结果(MIC 6.25～12.5μM)与从体内直接获得的Scygonadin纯品的抗菌结果相似。且相较于原核表达的Scygonadin抗菌活性([19]Peng H，Yang M，Huang W S，Ding J，Qu H D，Cai J J，Zhang N，Wang K J.Solubleexpression and purification of a crab antimicrobial peptide scygonadin in different expressionplasmids and analysis of its antimicrobial activity.Protein Expres Purif，2010，70：109-115)，真核表达的Scygonadin具有较强的抗菌活性。

本发明借助基因工程技术，利用pPIC9K毕赤酵母表达载体，成功高效的表达出具有抗菌活性的拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin，该重组蛋白具有广谱的抗菌活性，抗菌活性与从雄性拟穴青蟹性腺中直接获得的Scygonadin纯品的抗菌结果相似。Scygonadin的基因工程表达产品将在抗病原微生物新药和动物饲料添加剂中发挥其应用价值。

附图说明

图1为PCR扩增scygonadin目的基因片段。在图1中，M为DNAMarkerDL2000，1为scygonadin基因PCR产物，2为scygonadin的PCR阴性对照，bp为碱基。

图2为pPIC9K载体双酶切前后电泳图谱。在图2中，1为酶切前pPIC9K载体，2为酶切后pPIC9K载体，M为DNAMarker λHindIII。

图3为SDS-PAGE电泳分析pPIC9K-scygonadin重组载体转化毕赤酵母GS115菌株后，Scygonadin(Scy)蛋白的诱导表达。在图3中，M为预染蛋白Marker SM0443(Fermentas公司)，1为空载体pPIC9K转化毕赤酵母后，甲醇诱导24h的表达产物，作为阴性对照，2～8为重组表达载体pPIC9K-scygonadin转化毕赤酵母后，甲醇诱导0h，6h，12h，24h，48h，72h，96h蛋白表达产物。

图4为SDS-PAGE电泳检测目的蛋白Scygonadin表达产物的纯化。在图4中，M为预染蛋白Marker SM0443(Fermentas公司)，1为上柱纯化前蛋白样品，2～5为流出组分，6为40mM咪唑溶液洗脱杂蛋白，7～8为纯化的目的蛋白Scygonadin。

具体实施方式

以下通过实施例结合附图详细说明本发明的技术方案。

实施例1拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin重组表达载体的构建

1)拟穴青蟹scygonadin成熟肽基因的获得

根据pPIC9K载体多克隆位点，设计扩增编码拟穴青蟹抗菌肽scygonadin的成熟肽基因的特异性上游引物F1和下游引物R1。其中在上游引物F1的5′端添加EcoR I酶切位点：

F1：5′GGGGAATTCGGCCAGGCACTCAACAA 3′，下划线表示EcoR I酶切位点。在下游引物R1的5′端添加Not I酶切位点，终止密码子和6×His组氨酸标签：

R1：5′ATGCGGCCGCTCA

GTAAGAAGCAATCCAGT 3′，下划线表示Not I酶切位点，黑体表示终止密码子，方框中为6×His序列。

以拟穴青蟹scygonadin cDNA重组pPMD18-T阳性质粒为扩增模板，分别以F1和R1为上、下游引物，以Ex Taq酶(购自TaKaRa公司)进行PCR，扩增目的基因片段，反应体系为：

混合均匀，在热循环仪上按照以下程序进行PCR反应：

拟穴青蟹scygonadin基因PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec；进行30个循环后，72℃延伸7min。

反应结束后，将所有反应液进行1.5％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收特异性片段，得到拟穴青蟹scygonadin基因PCR产物长度约为320bp(参见图1)。

取2μg上述回收的scygonadin目的基因片段，用EcoR I和Not I限制性酶双酶切，37℃孵育5h，反应结束后，用1.5％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳检测酶切效率；TaKaRa核酸共沉剂回收酶切后的scygonadin目的基因片段。处理后的scygonadin目的基因片段具有EcoRI和Not I的粘性末端。

2)pPIC9K载体的处理

将-80℃保存的带有pPIC9K的DH5α菌株划线于含50μg/mL的氨苄霉素的LB平板上，37℃培养过夜。次日挑取单克隆菌落，接种于5mL含50μg/mL的氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm/min培养8h至对数生长期，离心收集菌体，小量提取pPIC9K质粒。

取1～2μg上述纯化的pPIC9K载体，用EcoR I和Not I限制性酶双酶切，37℃孵育5h，酶切体系如下；反应结束后，用0.8％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳检测酶切效率(参见图2)；载体酶切完全，用TaKaRa的核酸共沉剂回收酶切后的载体。

处理后的pPIC9K载体具有EcoR I和Not I的粘性末端。

3)pPIC9K-scygonadin载体的构建、转化和鉴定

将经过一系列处理后具有EcoR I和Not I的粘性末端的pPIC9K载体与具有相同粘性末端scygonadin的基因片段进行连接，反应体系如下：

16℃孵育过夜；次日，取5μL连接反应液转化至50μL E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于含有氨苄霉素(50μg/mL)的LB琼脂平板上培养过夜。次日挑取单菌落，以F1和R1为上下游引物，菌落PCR法鉴定阳性克隆菌，交由Invitrogen公司进行DNA核苷酸序列测定。结果显示连接正确，核苷酸的开放阅读框(ORF)连续编码，与预期要表达的氨基酸序列相符。

实施例2 pPIC9K-scygonadin重组质粒在毕赤酵母GS115中的诱导表达

1)pPIC9K-scygonadin的线性化

测序正确的含表达载体的菌株划线培养，挑取单克隆摇菌培养，提取质粒后，10～20μg质粒由Sac I限制性内切酶线性化，反应体系如下：

用核酸共沉剂回收线性化后的pPIC9K-scygonadin。再将其用电击法转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，并诱导表达。

2)抗菌肽Scygonadin的诱导表达

以pPIC9K-scygonadin重组质粒转化的毕赤酵母GS115为实验组，挑取单克隆菌株在5ml生长培养基(BMGY)中培养约16～24h至对数生长期，离心收集菌体，转入表达培养基(BMMY)中，用0.5％甲醇诱导表达96h。同时以pPIC9K空质粒转化的毕赤酵母GS115为对照，诱导表达96h。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白的表达。

结果显示：以pPIC9K-scygonadin重组质粒转化的毕赤酵母GS115后，甲醇诱导后与诱导前以及空载体诱导表达相比，在约12kDa位置出现1条蛋白质条带，与表达的目的蛋白Scygonadin分子量相当(参见图3)。且目的蛋白的表达量随着时间的延长表达量增加，在96h表达量最高，通过凝胶扫描计算得知，表达量约为85.9mg/L。

实施例3亲和层析法纯化目的蛋白Scygonadin

1)上柱前样品的制备

重组毕赤酵母诱导表达24h后，离心去沉淀，收集发酵上清液。4℃，用PBS透析液(50mM磷酸缓冲液+50mM NaCl，pH 9.0)透析毕赤酵母诱导表达上清液2～3次，离心，收集上清液，经0.45μm滤膜过滤，待上柱纯化。

2)亲和层析纯化目的蛋白Scygonadin

用镍离子螯合亲和层析柱亲和纯化，层析试剂为：

溶液A：20mM磷酸缓冲液+50mM NaCl+10mM咪唑，pH 8.5；

溶液B：20mM磷酸缓冲液+500mM NaCl+1M咪唑，pH 8.5；

用5～10个柱体积MilliQ水清洗预装柱(HisTrap^TM FF Crude 5m1)，5～10个柱体积溶液A平衡HisTrap层析柱，将过滤后的上清液以2mL/min全部上柱，同时收集流出组分；含40mM咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白；用30％溶液B(含300mM咪唑)洗脱目的蛋白Scygonadin收集洗脱峰，取少量进行SDS-PAGE电泳鉴定(参见图4)。将目的蛋白洗脱液装入处理好的透析带中，在磷酸盐缓冲液中透析，最后透析入超纯水中。

结果显示，分子量大小约12kDa的Scygonadin蛋白能够特异性的与镍离子螯合亲和层析柱结合，在较高浓度的咪唑溶液(300mM)竞争洗涤后，融合表达产物被洗脱，纯度较高，用Bradford法计算纯品的产量约为20mg/L。

3)Scygonadin重组蛋白抗菌活性鉴定

蛋白样品经过0.22μm过滤膜过滤除菌后，应用Bradford法测定BSA标准品得到蛋白浓度标准曲线，根据公式可计算出Scygonadin重组蛋白的浓度。将蛋白溶液倍比稀释至1.6～50μM。

MIC(Minimum Inhibitory Concentration，最小抑菌浓度)的测定参照Bulet等的方法([17]Bulet P，Dimarcq J L，Hetru C，Lagueux M，Charlet M，Hegy G，Van Dorsselaer A，Hoffmann J A.Anovel inducible antibacterial peptide of Drosophila carries an O-glycosylated substitution[J].J BiolChem.，1993，268：14893-14897；[18]Wang K J，Cai J J，Cai L，Qu H D，Yang M，Zhang M.Cloning and expression of a hepcidin gene from a marine fish(Pseudosciaena crocea)and theantimicrobial activity of its synthetic peptide[J].Peptides.，2009，30(4)：638-646)，在96孔细胞培养板上进行。

(1)菌悬液的准备：取被测细菌，划线于营养肉汤平板，培养12～16h；挑取2～3个克隆接种于MH斜面，继续培养12～16h，达到菌的对数生长期；10mM磷酸钠盐缓冲液(pH 7.2)冲洗新鲜制备的MH细菌斜面培养物，菌悬液调整稀释至OD₆₀₀＝0.1，取18μl OD₆₀₀＝0.1的菌悬液加入终体积为1ml的MH稀释培养基(PBS∶MH＝3∶2，V/V)中，该菌悬液为MIC工作浓度。

(2)每种被测菌按照以下操作设置空白对照组、阴性对照组和待测样品实验组，每组设置2个平行样，每种菌重复3次：

①阳性对照组：加入50μL磷酸钠盐缓冲液和50μL菌悬液；

②空白对照组：加入50μL待测蛋白样品和50μL磷酸钠盐缓冲液；

③样品实验组：加入50μL待测蛋白样品和50μL菌悬液；

(3)细菌最适培养24～48h后，观察MIC结果。取MIC终点以上未长菌的培养液，接种于营养肉汤平板上，培养后平板上无菌生长的被测蛋白最低浓度为该蛋白的MBC(MinimumBactericidal Concentration，最低杀菌浓度)。

对9种细菌的抗菌实验结果显示，真核表达的抗菌肽Scygonadin具有广谱的抗菌活性，对革兰氏阳性和阴性菌都具有较好的抑杀菌活性(参见表1)。其中真核表达的Scygonadin对藤黄微球菌、谷氨酸棒杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性和原核表达抗菌肽Scygonadin的结果基本一致(MIC 6.25～30μM)，对嗜水气单胞菌的抗菌活性(MIC 6.25～12.5μM)高于原核表达的Scygonadin(MIC 30-60μM)([19]Peng H，Yang M，Huang W S，Ding J，Qu H D，Cai J J，Zhang N，Wang K J.Soluble expression and purification of a crab antimicrobial peptide scygonadinin different expression plasmids and analysis of its antimicrobial activity.Protein Expres Purif，2010，70：109-115)。

表1Scygonadin真核重组表达产物的抗菌活性

在表1中，CGMCC No.：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心菌种编号；MIC：最小抑菌浓度，用a和b表示，a表示肉眼可见菌体生长的最高浓度，b表示不见菌体生长的最小浓度；MBC：最小杀菌浓度，用c和d表示，c表示菌体可生长的最高浓度，d能够杀死99.9％菌体的最小浓度。

本发明旨在获得拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin的基因工程表达产品，并对其抗菌活性进行鉴定，以期开发抗病原微生物的新药物或作为动物饲料添加剂使用。本发明获得了拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin的毕赤酵母表达重组子pPIC9K-scygonadin，并在毕赤酵母中成功重组表达获得Scygonadin基因工程产品，确认了Scygonadin的广谱性抗菌活性，为其作为抗病原微生物新药物和动物饲料添加剂的开发奠定了基础。

本发明根据拟穴青蟹阴离子抗菌肽scygonadin的cDNA序列特征，构建真核重组表达载体pPIC9K-scygonadin，Sac I线性化后，转化毕赤酵母GS115菌株，诱导表达并纯化获得Scygonadin的重组蛋白，鉴定重组蛋白抗菌活性，研究发现Scygonadin蛋白具有高效抗菌活性：对革兰氏阳性菌如藤黄微球菌、谷氨酸棒杆菌和金黄色葡萄球菌，革兰氏阴性菌如嗜水气单胞菌，荧光假单胞菌等具有明显抑制生长作用和杀菌作用。其中，对水产致病菌嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌具有较强的抗菌活性(MIC 6.25～12.5μM)。

Claims (8)

1.拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin的基因序列为：

ggccaggcac tcaacaaact tatgcctaaa atcgtcagcg ccataattta tatggtcggg    60

caacccaatg caggtgtcac ttttctgggc caccaatgtc tggtggagtc aacgaggcaa    120

ccagacgggt tttacaccgc aaagatgtcg tgtgcttcct ggactcatga taatcctatt    180

gttggggaag gaagaagccg ggttgaactt gaggcgctta aaggttccat cacaaacttt    240

gtccagacag catccaatta caagaagttc accatagatg aggtcgagga ctggattgct    300

tcttac                                                               306。

2.拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin的氨基酸序列为：

Gly Gln Ala Leu Asn Lys Leu Met Pro Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile

1               5               10                      15

Tyr Met Val Gly Gln Pro Asn Ala Gly Val Thr Phe Leu Gly His Gln

            20                  25                      30

Cys Leu Val Glu Ser Thr Arg Gln Pro Asp Gly Phe Tyr Thr Ala Lys

        35                  40                  45

Met Ser Cys Ala Ser Trp Thr His Asp Asn Pro Ile Val Gly Glu Gly

    50                  55                  60

Arg Ser Arg Val Glu Leu Glu Ala Leu Lys Gly Ser Ile Thr Asn Phe

65                  70                  75                  80

Val Gln Thr Ala Ser Asn Tyr Lys Lys Phe Thr Ile Asp Glu Val Glu

                85                  90                  95

Asp Trp Ile Ala Ser Tyr

           100。

3.拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)构建拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin的重组表达载体；

2)将步骤1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；

3)分离纯化步骤2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin。

4.如权利要求3所述的拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述表达载体选用pPIC9K。

5.如权利要求3所述的拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115菌株。

6.如权利要求3所述的拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述分离纯化的方法为先将表达产物进行离心，收集发酵上清液，透析后，再进行亲和层析。

7.真核表达的抗菌肽Scygonadin在制备抗病原微生物药物中的应用。

8.真核表达的抗菌肽Scygonadin在制备动物饲料添加剂中的应用。

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