CN109021112B - 杂合抗菌肽po-ch34及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新型杂合抗菌肽PO‑CH34及其制备方法和应用。本发明通过对猪源抗菌肽PMAP37与鸡源抗菌肽Fowlicidin‑2的氨基酸序列进行空间结构分析的基础上，将抗菌肽PMAP37与抗菌肽Fowlicidin‑2进行拼接，中间加入蛋白Lingker，同时进行部分位点氨基酸突变，获得一种新型杂合抗菌肽PO‑CH34，使其抗菌效力获得显著提高。在此基础上，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成新型杂合抗菌肽PO‑CH34基因，克隆于毕赤酵母中表达，获得新型抗菌肽重组酵母菌株，并将发酵规模放大到发酵罐水平，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后可制成粉剂、液体等抗菌肽制剂用于畜禽疾病的预防和治疗。

Description

杂合抗菌肽PO-CH34及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一种杂合抗菌肽PO‐CH34及其制备方法和应用。
背景技术
随着抗生素的普遍使用，致病菌的抗药性问题越来越引起人们的重视，研究和开发新型抗菌药物成为迫切的课题。近年来，在多种动物中发现的抗菌肽以其独特的抗菌机制、广谱的杀菌作用、高效的抗菌活性以及靶菌株难以产生抗性等优点而倍受关注。
猪源抗菌肽PMAP37(GenBank登录号：L39641.1)由37个氨基酸组成，是AlessandroTOSSI等于1995年首先从猪骨髓细胞分离得到，对多种革兰氏阴性菌、阳性菌均具有抑制作用，是一种具有开发潜力的抗菌肽。鸡源抗菌肽Fowlicidin‐2为Cathelicidins家族的成员之一，其抗菌活性不受生理盐浓度的影响，甚至在高盐浓度下仍然保持着良好的抗菌活性，并且具有LPS中和活性，显示了良好的应用前景。本项目组通过对猪源抗菌肽PMAP37和鸡源抗菌肽Fowlicidin‐2的空间结构分析，进行截短、拼接和部分氨基酸位点替换，获得一种高抑菌能力和抗菌谱广的新型杂合抗菌肽PO‐CH34，用于畜禽疾病的预防和治疗。
发明内容
本发明目的是提供一种杂合抗菌肽PO‐CH34，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种杂合抗菌肽PO‐CH34，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO:1；
本发明的杂合抗菌肽PO‐CH34可用做畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗制剂。
本发明还提供一种杂合抗菌肽PO‐CH34的重组毕赤酵母的制备方法，其制备步骤如下：
1)根据杂合抗菌肽PO‐CH34的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒；
2)将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达杂合抗菌肽PO‐CH34的重组基因工程酵母菌；用该重组基因工程菌高密度发酵表达出杂合抗菌肽PO‐CH34；
3)对重组表达的杂合抗菌肽PO‐CH34进一步浓缩、纯化后，测定效价。稀释分装，即为抗菌肽制剂。
本发明是建立在对猪源抗菌肽PMAP37和鸡源抗菌肽Fowlicidin‐2 的氨基酸序列进行空间结构分析的基础上，将抗菌肽PMAP37的N端18 个氨基酸与抗菌肽Fowlicidin‐2的N端14个氨基酸进行拼接，中间加入蛋白Lingker(GGS)，同时进行杂合抗菌肽的3处氨基酸突变(K3L、 K17L和H23V)，并在C末端添加1个N，从而获得一种新型杂合抗菌肽 PO‐CH34，使其抗菌效力获得显著提高。
具体实施方式
下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。
实施例1杂合抗菌肽PO‐CH34及其基因的获得
1、利用生物软件对猪源抗菌肽PMAP37(GenBank登录号：L39641.1) 和鸡源抗菌肽Fowlicidin‐2(GenBank登录号：ADZ99029)的氨基酸序列进行空间结构分析的基础上，将抗菌肽PMAP37的N端18个氨基酸与抗菌肽Fowlicidin‐2的N端14个氨基酸进行拼接，中间加入蛋白Lingker (GGS)，获得杂合抗菌肽PO‐CH，其氨基酸序列如下：
GLLSRLRDFLSDRGRRLGGGSLVQRGRFGRFLRKI(SEQ ID NO:1)
为了增加杂合抗菌肽PO‐CH的柔性，将杂合抗菌肽中间引入引入蛋白Lingker(GGS)，同时选择肽3、17和23位的亮氨酸(L)、亮氨酸(L)和缬氨酸(V)用碱性的赖氨酸(K)和组氨酸(H)取代，目的是为了降低抗菌肽的疏水性，并进一步在C末端添加了天冬酰胺(N)以保证抗菌肽C末端的酰胺化。最后共完成杂合抗菌肽的3处氨基酸突变(K3L、K17L和H23V)，C末端添加1个N，获得一种新型杂合抗菌肽PO‐CH34，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2、根据获得的新型杂合抗菌肽PO‐CH34的氨基酸序列SEQ ID NO:1，按照毕赤酵母基因密码子偏好性进行重新设计，获得编码新型杂合抗菌肽PO‐CH34的一个核苷酸序列，并在其N端引入Kex2酶切位点。两端引入XhoI和XbaI酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中。
实施例2基因工程杂合抗菌肽PO‐CH34表达载体的构建与工程菌的获得
1、将含抗菌肽基因的载体和酵母表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序。
2、阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。电转化后均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上， 30℃孵育3‐5天。待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。
3、将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mL Zeocin的 YPD培养液中，28℃振摇培养18个小时。取此菌液按4％体积比转接于5ml BMGY培养基中，28℃摇振培养18‐24h左右，OD600值约为 5‐6。培养物直接转接于25ml BMMY培养基中，28℃继续摇振培养。为了维持诱导表达，每隔24h补加100％甲醇使终浓度达1％。48h后，4℃5000r/min离心10min，收集上清，进行抑菌活性测定。能产生抑菌活性的重组酵母菌株即为能产生新型杂合抗菌肽PO‐CH34的阳性菌株。
实施例3发酵、纯化新型杂合抗菌肽PO‐CH34的制备
1、发酵工艺
1)将筛选得到的阳性重组子活化后按1％‐10％接种量接种于三角瓶，28‐30℃，200r/min摇床培养16‐24h后以10％接种量接入10L发酵罐(实装培养基6L)，温度28‐30℃，转速500‐1500r/min，培养基 pH值5.0‐6.0，通气量0.1‐1.0VVM(1L发酵液1min通入的氧气量)，溶氧>20％情况下进行发酵，在培养18‐24h后流加50％甘油4h，待溶氧突然升至100％时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续72h。
2)发酵结束后原罐蒸汽100℃灭菌10‐20min，放料，5000r/min 离心10min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品。
3)新型抗菌肽制剂
抗菌肽半成品经微滤、超滤、喷雾干燥、冻干等生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂。
上述基因工程抗菌肽可做成畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗制剂。
实施例4新型杂合抗菌肽PO‐CH34的最小抑菌浓度测定(MIC)
1、试验菌株
金黄色葡萄球菌(Cowan I)、猪金黄色葡萄球菌肠毒素75‐1、大肠杆菌K12D31、猪大肠杆菌O78、猪大肠杆菌O157‐H71、猪副伤寒沙门氏菌C782、禽致病性大肠杆菌(CVCC1565)和鸡白痢沙门菌(S2)。
2、菌株处理：将菌种复苏，在固体LB培养基中划线，在培养箱中37℃过夜培养。将过夜培养的细菌挑单菌落于含有25ml液体MHB 培养基的三角瓶中，将三角瓶放于摇床37℃培养12‐18h。将培养后的菌液在OD600的条件下测其吸光度值，用MHB培养基调节菌液浓度，使其处于0.6‐0.8之间。之后将菌液稀释成浓度为5×105CFU/mL，依次取90μl加入到96孔板的各孔内。
3、抗菌肽定量后用MHB培养基依次做倍比稀释。将稀释好的抗菌肽各取10μl依次加入到96孔板的各个孔中，此时每个孔的反应体系为100μl。96孔板盖盖后，37℃振荡培养24h后，观察并用酶标仪在600nm处测量并记录实验结果。抗菌肽样品经过二倍稀释后，成一系列浓度，以抑制细菌生长的最小浓度来定义最小抑菌浓度(MIC)。利用菌液和MHB培养基分别用来做阴性和阳性对照，各自代表抑菌率为0和100％。同时分别设立杂合抗菌肽PO‐CH、鸡源抗菌肽Fowlicidin‐2 与猪源抗菌肽PMAP37标准品试验组作为对照，用于观察抗菌肽改造前后的抑菌活性变化。
4、用微量稀释法测定重组新型杂合抗菌肽PO‐CH34对多种细菌的最低抑菌浓度，结果表明新型杂合抗菌肽PO‐CH34与杂合抗菌肽 PO‐CH、鸡源抗菌肽Fowlicidin‐2与猪源抗菌肽PMAP37标准品相比，其对革兰氏阴性菌和阳性菌的抑菌能力更强，且对猪源和鸡源致病菌的交叉保护性更好，更具市场应用价值。
表1：抗菌肽对多种细菌的最低抑菌浓度
实施例5新型杂合抗菌肽PO‐CH34的最低溶血浓度测定(MHC)
抗菌肽对血红细胞的溶血活性是衡量其对真核细胞毒性的最主要方法。本试验目的即是验证新型杂合抗菌肽PO‐CH34是否具有细胞毒性。
1、将重悬于PBS中的8％猪红细胞100μl加入96孔板中，再加入PBS系列稀释的抗菌肽100μl，使各孔中抗菌肽的浓度分别为 100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.12μg/mL、1.56μg/mL和0.78μg/mL。阳性对照孔加入100μl 0.2％Triton X‐100，阴性对照孔加100μl PBS，37℃孵育1h后，3000rpm离心5min后，从各孔吸取100μl上清到另一96孔板中，550nm波长测定OD值，计算溶血百分比＝[(实验孔OD值‐阴性孔OD值)/(阳性孔OD值‐阴性孔OD值)]×100。同时设立鸡源抗菌肽Fowlicidin‐2与猪源抗菌肽 PMAP37标准品作为对照。
2、结果表明：新型杂合抗菌肽PO‐CH34与鸡源抗菌肽Fowlicidin‐2 与猪源抗菌肽PMAP37标准品一样，对猪红细胞基本无溶血活性，是一种安全的抗菌肽。
表2：不同浓度抗菌肽对猪红细胞的溶血百分比(％)
上述的结果表明本发明所获得的新型杂合抗菌肽PO‐CH34具有更好的效果，能够用于商业开发。

Claims (2)

1.一种杂合抗菌肽PO-CH34，其特征在于，所述的杂合抗菌肽PO-CH34的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.权利要求1所述的杂合抗菌肽PO-CH34在制备畜禽饲料添加剂或免疫增强剂中的应用。
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