CN105732790B - 一种鱼源抗菌肽hepcidin突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鱼源抗菌肽hepcidin突变体及其应用。本发明通对鱼源抗菌肽hepcidin的氨基酸序列进行空间结构分析，将其25个氨基酸中的3处氨基酸进行突变，获得一种新型鱼源抗菌肽hepcidin突变体，使其抗菌效力获得显著提高。在此基础上，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成新型鱼源抗菌肽hepcidin突变体基因，克隆于毕赤酵母中表达，获得新型抗菌肽重组酵母菌株，并将发酵规模放大到发酵罐水平，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后可制成粉剂、液体等抗菌肽制剂，用于水产动物饲料添加剂或水产动物疾病的预防和治疗制剂。

Description

一种鱼源抗菌肽hepcidin突变体及其应用

技术领域

本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一种新型鱼源抗菌肽hepcidin突变体及其制备方法和应用。

背景技术

抗菌肽(AMPs)是生物体内持续存在的，基因编码的，核糖体合成的具有广谱抗细菌、抗真菌、抗原生动物或抗病毒的活性多肽，广泛存在于动植物中，是生物免疫系统中非特异性免疫的重要组成部分。大部分的抗菌肽分子量较小(少于100个氨基酸)，带正电荷并具有两亲性结构。抗菌肽具有独特的抗菌机制，广谱抗菌活性，快速杀菌能力，不易产生耐药性，稳定，水溶性好等特点，作为理想的抗生素替代品日益受到人们的重视。

尽管抗菌肽的功能显著，在水产养殖中的应用前景诱人，但天然抗菌肽产量低，抗菌范围狭窄，无法从动物体内大量提取，而化学合成肽价格昂贵，因此通过基因工程技术对天然抗菌肽进行人工改造以获得更优的抗菌肽突变体是当前抗菌肽研究的热点。对天然抗菌肽进行序列修饰包括以下内容：利用生物软件对抗菌肽序列进行结构、空间表位分析，通过人为增加、删除或替代1个或多个残基，截取肽链N端或C端部分序列，连接不同自然来源的抗菌肽片断成为杂合肽等技术手段。近20年来，这种方法已广泛应用于抗菌肽Cecropins、Melittins、Magainins、Temporins等家族的研究中。

鱼源抗菌肽hepcidin是由25个氨基酸残基组成的多肽，是Hiroko Shike等于2002年首先从从杂交斑纹鲈鳃中分离得到的。该多肽含有八个半胱氨酸残基并形成四个链内二硫键，其氨基酸序列与人和哺乳动物的hepcidin具有较高的相似性，对多种革兰氏阴性菌和阳性菌均具有抑制作用，是一种具有开发潜力的抗菌肽。本发明通过碱基替换的方法对鱼源抗菌肽hepcidin进行改造，获得一种新型鱼源抗菌肽突变体，大大提高了其抑菌活性，极具市场开发价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型鱼源抗菌肽突变体，即对鱼源抗菌肽hepcidin(GenBank登录号：AAT01563)的氨基酸序列进行空间结构分析，分别将鱼源抗菌肽hepcidin的25个氨基酸中的3处氨基酸进行突变(M6L、W9G和K15R)，获得一种新型鱼源抗菌肽突变体，使其抗菌效力获得显著提高。

本发明首先提供一种新型鱼源抗菌肽突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

上述蛋白的一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

本发明还提供上述鱼源抗菌肽突变体的制备方法，其制备步骤如下：

1)根据鱼源抗菌肽突变体的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒；

2)将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达鱼源抗菌肽突变体的重组基因工程酵母菌；用该重组基因工程菌高密度发酵表达出鱼源抗菌肽突变体；

3)对重组表达的鱼源抗菌肽突变体进一步浓缩、纯化后获得抗菌肽。

本发明利用基因工程技术构建了能表达一种新型鱼源抗菌肽hepcidin突变体的重组酵母菌株。将重组鱼源抗菌肽hepcidin突变体制备成抗菌肽制剂，其抑菌效价高、抑菌谱广，具有广阔的市场前景和开发价值。

具体实施方式

下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。

实施例1 新型鱼源抗菌肽hepcidin突变体及其基因的获得

1、鱼源抗菌肽hepcidin(GenBank登录号：AAT01563)是由25个氨基酸残基组成的抗菌肽。为了进一步提高其抑菌活性，通过生物软件对鱼源抗菌肽hepcidin的氨基酸序列进行空间结构分析，为了便于抗菌肽hepcidin临近二硫键(¹³C¹⁴C)的形成，进一步提高抗菌肽的抑菌活性，将抗菌肽hepcidin第15位的赖氨酸(K)用极性更强的精氨酸(R)替换。同时为了抗菌肽的结构平衡，将其第6位的蛋氨酸(M)替换为赖氨酸(L)，第9位的色氨酸(W)替换为甘氨酸(G)，最后共完成鱼源抗菌肽hepcidin中3处氨基酸突变(M6L、W9G和K15R)，获得一种新型鱼源抗菌肽hepcidin突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2、根据获得的新型鱼源抗菌肽突变体的氨基酸序列SEQ ID NO:1，按照毕赤酵母基因密码子偏好性进行重新设计，获得编码新型鱼源抗菌肽突变体的核苷酸序列SEQ IDNO:2。并在其N端引入Kex2酶切位点。两端引入XhoI和XbaI酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中。

实施例2 鱼源抗菌肽hepcidin突变体表达载体的构建与工程菌的获得

1、将含抗菌肽基因的载体和酵母表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序。

2、阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。电转化后均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3-5天。待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。

3、将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mL Zeocin的YPD培养液中，28℃振摇培养18个小时。取此菌液按4％体积比转接于5ml BMGY培养基中，28℃摇振培养18-24h左右，OD₆₀₀值约为5-6。培养物直接转接于25ml BMMY培养基中，28℃继续摇振培养。为了维持诱导表达，每隔24h补加100％甲醇使终浓度达1％。48h后，4℃5000r/min离心10min，收集上清，进行抑菌活性测定。能产生抑菌活性的重组酵母菌株即为能产生新型鱼源抗菌肽hepcidin突变体的阳性菌株，命名为HZ株。

实施例3 发酵、纯化新型鱼源抗菌肽hepcidin突变体的制备

1、发酵工艺

1)将筛选得到的阳性重组子活化后按1％-10％接种量接种于三角瓶，28-30℃，200r/min摇床培养16-24h后以5％-20％接种量接入10L发酵罐(实装培养基6L)，温度28-30℃，转速500-1500r/min，培养基pH值5.0-6.0，通气量0.1-1.0VVM(1L发酵液1min通入的氧气量)，溶氧>20％情况下进行发酵，在培养18-24h后流加50％甘油4h，待溶氧突然升至100％时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-72h。

2)发酵结束后原罐蒸汽100℃灭菌10-20min，放料，5000r/min离心10min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品。

3)新型抗菌肽制剂

抗菌肽半成品经微滤、超滤、喷雾干燥、冻干等生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂。

上述基因工程抗菌肽可做成水产动物饲料添加剂或水产动物疾病的预防和治疗制剂。

实施例4 新型鱼源抗菌肽hepcidin突变体的最小抑菌浓度测定(MIC)

1、试验菌株：金黄色葡萄球菌(Cowan I)、鳗弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌。

2、菌株处理：将菌种复苏，在固体培养基上划线，28℃过夜培养。挑单菌落于含有25ml液体培养基的三角瓶中，将三角瓶放于摇床28℃培养12-18h。将培养后的菌液测600nm处的吸光度值，用液体培养基调节菌液浓度，使其处于0.6-0.8之间。之后将菌液稀释成浓度为5×10⁵CFU/mL，依次取90μl加入到96孔板的各孔内。

3、抗菌肽定量后用液体培养基依次做倍比稀释。将稀释好的抗菌肽各取10μl依次加入到96孔板的各个孔中，此时每个孔的反应体系为100μl。96孔板盖盖后，28℃振荡培养24h后，观察并用酶标仪在600nm处测量OD值并记录实验结果。抗菌肽样品经过二倍稀释后，成一系列浓度，以抑制细菌生长的最小浓度来定义最小抑菌浓度(MIC)。利用菌液和液体培养基分别用来做阴性和阳性对照，各自代表抑菌率为0和100％。同时设立鱼源抗菌肽hepcidin标准品(GenBank登录号：AAT01563)试验组作为对照，用于观察抗菌肽改造前后的抑菌活性变化。

4、用微量稀释法测定重组新型鱼源抗菌肽hepcidin突变体对多种水产病害菌的最低抑菌浓度，结果表明改造的新型鱼源抗菌肽hepcidin突变体与鱼源抗菌肽hepcidin标准品相比，对多种水产病害菌，如鳗弧菌、迟缓爱德华氏菌等，抑菌能力均有显著提高。

表1抗菌肽对多种水产致病菌的最低抑菌浓度

Claims (5)

1.一种鱼源抗菌肽hepcidin突变体，其特征在于，所述的鱼源抗菌肽hepcidin突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段用于编码权利要求1所述的鱼源抗菌肽hepcidin突变体。

3.如权利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列为SEQ IDNO:2。

4.权利要求1所述的鱼源抗菌肽hepcidin突变体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包含如下步骤：

1)根据鱼源抗菌肽突变体的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒；

2)将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达鱼源抗菌肽突变体的重组基因工程酵母菌；用该重组基因工程菌高密度发酵表达出鱼源抗菌肽突变体；

3)对重组表达的鱼源抗菌肽突变体进一步浓缩、纯化后获得抗菌肽。

5.权利要求1所述的鱼源抗菌肽hepcidin突变体在制备水产动物饲料添加剂中的应用。