CN109096383B - 一种鱼源抗菌肽parasin I突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种鱼源抗菌肽parasin I突变体及其应用。本发明通过分析鱼源抗菌肽parasin I的氨基酸序列，将原始19个氨基酸中2处氨基酸突变（R5K、R6Q），C末端2个丝氨酸删除，并在C端添加1个天冬酰胺，获得一种鱼源抗菌肽parasin I突变体。将鱼源抗菌肽parasin I突变体基因进行毕赤酵母偏爱密码子优化后人工合成，克隆于毕赤酵母中表达，结果重组表达的新型鱼源抗菌肽parasin I突变体与原始抗菌肽相比抗菌效力获得显著提高。将重组菌株发酵规模放大到发酵罐水平，发酵液进一步纯化后可制成抗菌肽制剂，用于水产动物疾病的预防和治疗。

Description

一种鱼源抗菌肽parasin I突变体及其应用
技术领域
本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一种新型鱼源抗菌肽parasin I突变体及其应用。
背景技术
parasin I是从受伤鲶鱼上层粘液层细胞分泌的粘液中提取的一种广谱抗菌肽，研究证明，它来源于组蛋白H2A N末端的19个氨基酸，分子量为2kD，强力广谱抗菌（对革兰氏阴性菌和阳性菌均有抑制作用），最小抑菌浓度可达到Buforin I的4倍、magainin 2的12倍，且无溶血活性，在水产养殖业中具有良好的应用前景。
利用生物信息学方法对抗菌肽进行改造具有重要的意义，可大大提高天然抗菌肽的抑菌效果。对抗菌肽进行序列修饰包括以下方法：1、利用生物软件对天然抗菌肽进行结构、空间表位分析，通过人为增加、删除或替代1个或多个残基；2、截取肽链N端或C端部分序列；3、连接不同来源的抗菌肽片断成为杂合抗菌肽等技术手段。近20年来，这种方法已广泛应用于Cecropins、Melittins、Magainins、Temporins等抗菌肽家族的研究中。
本发明对抗菌肽parasin I关键位点氨基酸进行替换、删除等改造，获得一种新型鱼源抗菌肽parasin I突变体，有效提高了其抑菌能力，极具市场开发潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型鱼源抗菌肽parasin I突变体，即通过生物软件对鱼源抗菌肽parasin I的空间结构进行分析，分别对其19个氨基酸中的2处氨基酸突变（R5K、R6Q），删除2个丝氨酸，并在C末端添加1个天冬酰胺，获得一种新型鱼源抗菌肽parasin I突变体，抗菌效力得到显著提高。
本发明首先提供一种新型鱼源抗菌肽parasin I突变体，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；
本发明还提供一种新型鱼源抗菌肽parasin I突变体的重组毕赤酵母的制备方法，其制备步骤如下：
1）根据新型鱼源抗菌肽parasin I突变体的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒；
2）将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达鱼源抗菌肽parasin I突变体的重组基因工程酵母菌；用该重组基因工程菌高密度发酵表达出鱼源抗菌肽parasin I突变体；
3）对重组表达的鱼源抗菌肽parasin I突变体进一步浓缩、纯化后稀释分装，即为抗菌肽制剂。
本发明利用基因工程技术构建了能表达一种新型鱼源抗菌肽parasin I突变体的重组酵母菌株。将重组鱼源抗菌肽parasin I突变体制备成抗菌肽制剂，其抑菌效价高、抑菌谱广，具有广阔的市场前景和开发价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。
实施例1 鱼源抗菌肽parasin I突变体的获得
1、鱼源抗菌肽parasin I（KGRGKQGGKVRAKAKTRSS）是由19个氨基酸残基组成的抗菌肽，对细菌有很强的抑菌活性。为了进一步提高其抑菌活性，通过生物软件对鱼源抗菌肽parasin I进行空间结构分析，将第5位的赖氨酸换成碱性更强的精氨酸（R5K），第6位的谷氨酰胺换成精氨酸（R6Q），同时去掉C末端的2个丝氨酸（第18、19位的SS），并进一步在C末端添加了天冬酰胺（N）以保证抗菌肽C末端的酰胺化。最后共完成抗菌肽parasin I的2处氨基酸突变（R5K、R6Q），C末端2个丝氨酸的删除和1个天冬酰胺的添加，获得一种新型鱼源抗菌肽parasin I突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2、根据获得的新型鱼源抗菌肽parasin I突变体的氨基酸序列SEQ ID NO:1，按照毕赤酵母基因密码子偏好性进行重新设计，获得编码新型鱼源抗菌肽parasin I突变体的核苷酸序列，并在其N端引入Kex2酶切位点。两端引入XhoI和XbaI酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中。
实施例2基因工程鱼源抗菌肽parasin I突变体表达载体的构建与工程菌的获得
1、将含抗菌肽基因的载体和酵母表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序。
2、阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。电转化后均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3 -5天。待YPDS平板上的阳性转化子生长较大后，将各转化子依次点种至含Zeocin 200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPDS选择平板上，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。
3、将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mL Zeocin的YPD培养液中，28℃振摇培养18个小时。取此菌液按4%体积比转接于5 ml BMGY培养基中，28℃摇振培养18-24h左右，OD600值约为5-6。培养物直接转接于25 ml BMMY培养基中，28℃ 继续摇振培养。为了维持诱导表达，每隔24h补加100%甲醇使终浓度达1%。48h后，4℃ 5000 r/min离心10min，收集上清，进行抑菌活性测定。能产生抑菌活性的重组酵母菌株即为能产生新型鱼源抗菌肽parasin I突变体的阳性菌株。
实施例3发酵、纯化鱼源抗菌肽parasin I突变体的制备
1、发酵工艺
1）将筛选得到的阳性重组子活化后按1%-10%接种量接种于三角瓶，28-30℃，200r/min摇床培养16-24h后以5%-20%接种量接入10L发酵罐（实装培养基6L）中，温度28-30℃，转速500-1500r/min，培养基pH值5.0-6.0，通气量0.1-1.0VVM（1L发酵液1min通入的氧气量），溶氧>20%情况下进行发酵，在培养18-24h后流加50%甘油4h，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-72h。
2）发酵结束后原罐蒸汽100℃ 灭菌10-20min，放料，5000r/min离心10min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品。
3）新型抗菌肽制剂
抗菌肽半成品经微滤、超滤、喷雾干燥、冻干等生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂。
上述基因工程抗菌肽可做成水产动物饲料添加剂或水产动物疾病的预防和治疗制剂。
实施例4 鱼源抗菌肽parasin I突变体的最小抑菌浓度测定（MIC）
1、试验菌株
金黄色葡萄球菌(Cowan
Figure 495190DEST_PATH_IMAGE001
)、鳗弧菌、副溶血弧菌和迟缓爱德华氏菌。
2、菌株处理：将菌种复苏，在固体培养基中划线，在28℃培养箱中过夜培养。将过夜培养的细菌挑单菌落于含有25mL液体培养基的三角瓶中，将三角瓶放于摇床28℃培养12-18h。将培养后的菌液在600nm 的条件下测其吸光度值，用培养基调节菌液浓度，使其处于0.6-0.8之间。之后将菌液稀释成浓度为5×105CFU/mL，依次取90μL加入到96孔板的各孔内。
3、抗菌肽parasin I突变体定量后用培养基依次做倍比稀释。将稀释好的抗菌肽各取10μL依次加入到96孔板的各个孔中，此时每个孔的反应体系为100μL。96 孔板盖盖后，28℃振荡培养 24h后，观察并用酶标仪测量OD600值并记录实验结果。抗菌肽样品经过二倍稀释后，成一系列浓度，以抑制细菌生长的最小浓度来定义最小抑菌浓度（MIC）。菌液和培养基分别用来做阴性和阳性对照，各自代表抑菌率为0和100%。同时设立鱼源抗菌肽parasin I标准品试验组作为对照，用于观察抗菌肽改造前后的抑菌活性变化。
4、用微量稀释法测定重组新型鱼源抗菌肽parasin I突变体对多种细菌的最低抑菌浓度，结果表明其对水产常见病害菌均有显著的抑制效果，特别是与鱼源抗菌肽parasinI标准品相比，对鳗弧菌、副溶血弧菌和迟缓爱德华氏菌的抑菌能力均得到广泛提高，显示了本发明对鱼源抗菌肽parasin I的氨基酸突变效果显著。
表1 抗菌肽对多种细菌的最低抑菌浓度
Figure 350013DEST_PATH_IMAGE002
实施例5鱼源抗菌肽parasin I突变体的最低溶血浓度测定（MHC）
抗菌肽对血红细胞的溶血活性是衡量其对真核细胞毒性的最主要方法。本试验目的即是验证新型鱼源抗菌肽parasin I突变体是否具有细胞毒性。
1、将重悬于PBS中的8%猪红细胞100 µl加入96孔板中，再加入PBS系列稀释的抗菌肽100µl，使各孔中抗菌肽的浓度分别为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.12μg/mL、1.56μg/mL和0.78μg/mL。阳性对照孔加入100µl 0.2% Triton X-100，阴性对照孔加100µl PBS，37℃孵育1 h后，3000rpm离心5 min后，从各孔吸取100µl上清到另一96孔板中，550nm波长测定OD 值，计算溶血百分比= [ (实验孔OD值-阴性孔OD值)/(阳性孔OD值-阴性孔OD值) ]×100。同时设立鱼源抗菌肽parasin I标准品作为对照。
2、结果表明：鱼源抗菌肽parasin I突变体与鱼源抗菌肽parasin I标准品一样，对猪红细胞基本无溶血活性，是一种安全的抗菌肽。
表2： 不同浓度抗菌肽对猪红细胞的溶血百分比(%)
抗菌肽浓度（μg/mL） 0.78 1.56 3.12 6.25 12.5 25 50 100
鱼源抗菌肽parasin I突变体 0 0 0 0 0 0 0 0
鱼源抗菌肽parasin I标准品 0 0 0 0 0 0 0 0
上述的结果表明本发明所获得的鱼源抗菌肽parasin I突变体具有更好的效果，能够用于商业开发。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种鱼源抗菌肽parasin I突变体及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 1
Lys Gly Arg Gly Arg Arg Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr
1 5 10 15
Arg Asn

Claims (2)

1.一种鱼源抗菌肽parasin I突变体，其特征在于，所述的鱼源抗菌肽parasin I突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.权利要求1所述的鱼源抗菌肽parasin I突变体在制备鱼类饲料添加剂或免疫增强剂中的应用。
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