CN104630259A - 利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白，同时还提供了其基因工程制备方法，本发明进一步提供了该融合蛋白经酶切后对微生物具有较强的抑菌作用，通过基因重组方式以融合蛋白的形式将人溶菌酶和抗菌肽Parasin I基因连接至高效真核表达载体上，进一步在酵母菌中表达，得到具有高活性的抗菌重组蛋白，该重组蛋白可以作为添加剂应用于动物饲料中。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和基因工程领域，具体涉及利用毕赤酵母高效分泌表达重组人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法。
背景技术
人溶菌酶是由130个氨基酸组成的碱性多肽，分子质量为14700。它参与机体的防御机制，有消炎、抗感染、抗肿瘤和免疫调节的作用，具有较高的溶菌活性和热稳定性，临床应用时比其他溶菌酶更安全、无刺激性和副作用。此外，该酶还作为饲料添加剂等大量使用。
通常天然人溶菌酶是从人奶或胎盘中少量提取，制备材料相当有限，远远不能满足市场的需要。近年来人们通过很多方法来获得人溶菌酶，如通过转基因山羊（Maga et al. 2006），转基因猪（Jia Tong et al. 2011），转基因大鼠（Shen Liu et al. 2012；吕爽等人2010），原核和真核表达（夏清风等人2011；Jun Li et al. 2012；Janet R. Kumita et al. 2006）等。
抗菌肽是生物体内天然防御系统的一个重要组成部分，抗菌谱广，对细菌、病毒、真菌、寄生虫及癌细胞均有抑制作用。抗菌肽Parasin I （In Yup Park et al. 1998）是从受伤鲶鱼皮肤黏液液中分离到的一种新型抗菌肽，分子质量为2000，对革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）菌以及真菌均有抑制作用。
抗菌肽可以直接通过水解大量的蛋白从活的生物体中或得，或者是通过化学的方法合成，但这些成本都比较贵。最近很多抗菌肽都通过生物表达系统的方法来获得，如牛lactoferrampin和bovine lactoferricin (Xiang-Shan Tang et al. 2012), 沙蚕perinerin (Qingfeng Zhou et al. 2009), hPAB-β (Zhijin Chen et al. 2011)等。
由于溶菌酶和抗菌肽均为抑菌作用，于是也有学者把这两种蛋白串联起来融合表达，并取得了一定的效果。欧阳萍等（2010）对人溶菌酶和抗菌肽tachyplesins进行了原核融合表达；Xue mei Lu等（2010）对人溶菌酶和抗菌肽cecropin进行了原核融合表达，所表达的融合蛋白都具有较好的抑菌活性。
目前，细菌耐药性问题日益突出，开发新的抗菌制剂迫在眉睫。构建人溶菌酶-抗菌肽Parasin I 融合基因表达质粒，在毕赤酵母中表达融合蛋白，以期获得一种具有更高活性的抗菌和抗病毒重组蛋白，是获得新抗菌制剂的发展趋势。
酵母表达系统具有生长快、操作简单，利于大规模发酵生产等优点，同时真核生物能对表达外源蛋白质进行翻译后修饰，使得表达的蛋白具有生物学活性等的优点。研究发现，毕赤酵母遗传背景清楚，易操作；毕赤酵母与日常生活密切，安全，无毒素，对生物和环境不会构成威胁；可进行蛋白翻译后加工；可进行分泌表达，易于纯化；工艺简单成本较低等特点。目前未见关于毕赤酵母分泌表达溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的报道。
发明内容
鉴于上述不足之处，本发明的目的在于提供一种利用毕赤酵母高效分泌表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，该方法通过毕赤酵母分泌表达获得人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白；并且通过密码子优化提高人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的表达量，表达的人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白经肠激酶切割后具有较强的抑菌活性，同时本方法对抗菌肽取代抗生素的研究具有重要意义。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）提供人溶菌酶和抗菌肽Parasin I的氨基酸序列，以及密码子优化后的重组基因序列hLY-PI；
（2）构建酵母细胞中表达hLY-PI的重组质粒pPICZαA- hLY-PI；
（3）重组质粒pPICZαA-hLY-PI转化毕赤酵母X-33细胞；
（4）筛选高表达转化菌，鉴定；
（5）培养转化菌，获得融合蛋白hLY-PI；
（6）重组融合蛋白hLY-PI的鉴定以及酶学活性分析。
所述步骤（1）中人溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述抗菌肽Parasin I蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
所述步骤（1）中，密码子优化后的hLY-PI基因序列是在SEQ ID NO:1序列的前面加上6个组氨酸，在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的中间加上柔性氨基酸和肠激酶切割位点，如SEQ ID NO:3所示。然后依据毕赤酵母的密码子偏好性进行密码子优化后的重组基因序列hLY-PI，如SEQ ID NO:4所示。
所述步骤（2）中，重组质粒的构建是采用限制性内切酶酶切，再用T4DNA连接酶连接而成。
所述步骤（3）中，重组质粒转化方法是电转化法，采用Bio-rad公司电转化仪预设PIC程序。
所述步骤（4）中，筛选转化菌方法是用荧光定量PCR的方法对高表达转化菌进行筛选、鉴定。
所述步骤（5）中，培养转化菌培养条件为30℃，200 r/min，0.5%的甲醇，3-4天。
所述步骤（5）中，融合蛋白hLY-PI存在于培养酵母菌X-33的菌液上清。
所述步骤（6）中，融合蛋白hLY-PI的鉴定方法是过6×His标签介质，纯化，酶切，进行SDS-PAGE电泳。
所述步骤（6）中，融合蛋白hLY-PI的酶学活性分析是用抑菌实验来检测。
本发明的有益效果在于：1）通过毕赤酵母分泌表达获得融合蛋白hLY-PI；2）密码子优化后，高效表达融合蛋白hLY-PI，表达产物经过肠激酶酶切后具有较强的抑菌活性。3）本发明通过密码子优化，提高了酵母表达体系中融合蛋白hLY-PI的表达量，从而具有大规模发酵，商业化生产抗菌肽的潜力和价值。
附图说明
图1为重组质粒pPICZαA-hLY-PI的构建过程示意图。
图2为hLY-PI基因的PCR产物及酶切电泳图，其中，泳道M为DNA Marker D （2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp），泳道1为hLY-PI的PCR产物，泳道2为pPICZαA-hLY-PI质粒，泳道3为pPICZαA-hLY-PI质粒的双酶切（EcoR-I和Xba I）产物。
图3为pPICZαA-hLY-PI酵母转化子在酵母中的mRNA表达情况图。其中第4、32转化子表达量高，进行甲醇诱导表达。
图4中A为工程菌诱导上清SDS-PAGE电泳图，其中，泳道M为Protein Marker（97.2kDa，66.4kDa，44.3kDa，29.0kDa，20.1kDa，14.3kDa），泳道1为过柱纯化蛋白5ul，泳道2空载上清25ul，泳道3为优化后诱导上清25ul。B为融合蛋白hLY-PI的酶切Tricine-SDS-PAGE电泳图，其中泳道M为Protein Marker（20.1kDa，14.4kDa，7.8kDa，5.8kDa，3.3kDa），泳道1为过柱纯化后的融合蛋白hLY-PI，泳道2为纯化融合蛋白hLY-PI经肠激酶酶切后的产物hLY和PI。
图5为工程菌表达上清纯化后的融合蛋白hLY-PI酶切前后与商品溶菌酶的活性比较检测图。
图6为工程菌表达上清纯化后的融合蛋白hLY-PI酶切后、以及酶切超滤后的hLY以及PI对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC活性检测图。
具体实施方式
下面我们将结合实施例以及图1-图6所示，对本发明作进一步的阐述。但本发明并不局限于此，凡依照本发明公开内容所作出的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例：
实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版) (Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社) ，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中所用毕赤酵母（Pichia pastoris）X-33购自Invitrogen公司。pPICZαA表达载体购自Invitrogen公司。pPICZαA表达载体（Invitrogen公司）为本实验室保存。
1. 人溶菌酶氨基酸序列的获得（SEQ ID NO:1）：
从NCBI网站上搜索人溶菌酶蛋白序列（GenBank Accession No. AAC63078.1）。
2. 抗菌肽Parasin I序列的获得（SEQ ID NO:2）：
根据文献Structure–activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide获得抗菌肽Parasin I的氨基酸序列。
3. 人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的基因序列的获得（SEQ ID NO:2）：
1）分析SEQ ID NO:2，发现其第一个氨基酸对活性的影响非常重要于是在其前面加入肠激酶切割位点DDDK然后再同SEQ ID NO:1连接，为了保证抗菌肽Parasin I的结构不变，在SEQ ID NO:1的后面加上了终止密码子；
2）为了方便纯化在SEQ ID NO:1的前面加上His标签，为了保证SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2在表达过程中各自的结构，在SEQ ID NO:1的后面加上柔性氨基酸GGGG；
3）根据彼此酵母密码子的偏好性（http://www.kazusa.or.jp/codon），对融合蛋白hLY-PI进行密码子优化。同时在前面加入Xho I酶切位点，在后面加入XbaI酶切位点，得到hLY-PI（SEQ ID NO:4）。送公司合成该片段，并将其克隆到载体PUC57上，得hLY-PI-PUC57。
3. 分泌表达型重组质粒pPICZαA-hLY-PI的构建
如图1和图2所示，将hLY-PI-PUC57经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切后回收约500bp左右的产物、表达载体pPICZαA经XhoⅠ和XhaⅠ双酶切后回收大片段，产物经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，T4连接酶，16℃，过夜后进行连接反应后，转化大肠杆菌TOP10菌株。同时设计引物对hLY-PI-F：5'GCTGAATTCCATCATCATCATCATCATA3'（SEQ ID NO:5）和hLY-PI-R：5'TGTTCTAGATTAAGAAGATCTAGTCTTA3'（SEQ ID NO:6）对转化菌落经菌液PCR鉴定后测序验证。
4. 重组质粒pPICZαA-rePPL转化毕赤酵母X-33
(1)制备毕赤酵母X-33感受态细胞
①接种30 μl毕赤酵母X-33冻存甘油菌至3 ml YPD液体培养基中，30℃，200 r/min，过夜震荡活化。
②转接500 μl过夜活化的毕赤酵母X-33菌液到50 ml YPD液体培养基中，30℃，200 r/min，震荡培养至OD600为1.3-1.5左右。
③4℃、1500 g、5 min，离心收集细胞，用50 ml预冷的无菌水轻轻吹吸悬浮细胞。
④4℃、1500 g、5 min，离心，用25 ml预冷的无菌水悬浮细胞。
⑤4℃、1500 g、5 min，离心，用25 ml预冷的1M山梨醇轻轻吹吸悬浮细胞。
⑥4℃、1500 g、5 min，离心，用2 ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞。
⑦4℃、1500 g、5 min，离心，用200 μl预冷的1M山梨醇悬浮细胞，分装到两管2 ml的EP管中，每管100 μl。
(2) 转化pPICZαA-hLY-PI-R质粒到毕赤酵母X-33感受态细胞中
①用SacⅠ限制性内切酶对10 μg pPICZαA-rePPL质粒进行线性化，然后用乙醇沉淀对线性化片段进行回收，并溶于10uL水中。
②把10uL线性化片段加入到100 μl毕赤酵母X-33感受态细胞中，混合均匀，加至预冷的电击杯中，冰上放置5 min。
③根据电击仪推荐的酿酒酵母参数设置，进行电击。
④立即向电击杯中加入1 ml预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，30℃静置1.5h。
⑤全部吸出均匀涂于含有Zeocin的YPDS平板。
⑥置于30℃恒温培养箱中，直至长出单克隆。
(3)菌落PCR反应筛选阳性菌落。从YPDS平板上把单菌落做编号标记，用枪头挑取少量菌体溶于水中，用引物对hLY-PI-F：5'GCTGAATTCCATCATCATCATCATCATA3'（SEQ ID NO:5）和hLY-PI-R：5'TGTTCTAGATTAAGAAGATCTAGTCTTA3'（SEQ ID NO:6）对菌液进行PCR鉴定验证，筛选出阳性菌落，并对阳性菌落进行划线纯化。
(4)高表达转化子的筛选。对筛选的阳性菌落进行甲醇诱导表达，4天后，离心收集菌体，提取RNA，对转化子中的hLY-PI基因进行荧光定量qPCR，筛选表达量高的转化子进行诱导表达。（如图3所示pPICZαA-hLY-PI转化子在酵母中的mRNA表达情况图。其中第4和32转化子表达量高，进行甲醇诱导表达。）
5. 人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白在毕赤酵母工程菌里的表达，具体步骤如下：
(1) 将mRNA高表达的转化子，接种到含10 ml YPD溶液的50 ml三角瓶中，在28 ℃、250 r/min的条件下过夜培养；
(2) 取1 ml YPD过夜培养的菌液接种到含100 ml BMGY溶液的500 ml的三角瓶中，在28 ℃，250 r/min的条件下，培养至OD600=2-6；
(3) 在4 ℃、2 500 r/min 的条件下，离心5 min收集菌体置于100 ml BMMY溶液的500 ml的三角瓶中培养，在28 ℃，250 r/min的条件下进行甲醇诱导表达；每间隔24 h，向培养基中添加0.5-1 ml的甲醇，使其终浓度为0.5-1%。
如图4所示，工程菌诱导上清SDS-PAGE电泳图，其中，泳道M为Protein Marker（97.2kDa，66.4kDa，44.3kDa，29.0kDa，20.1kDa，14.3kDa），泳道1为过柱纯化蛋白5ul，泳道2空载上清25ul，泳道3为优化后诱导上清25ul。
6. 人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的酶学活性检测，结果如图5、图6所示。
(1) 将纯化后的蛋白质，参照Bradford（1976）法测定其浓度。
(2) 用比浊法测定融合蛋白的溶菌酶活性。
①采用肠激酶对融合蛋白进行酶切，具体的酶切体系按照重组肠激酶（北京德奥平生物科技有限公司，NO：DNP1209201）的说明书操作。
②分别对融合蛋白、融合蛋白酶切后的产物、商品溶菌酶进行溶菌酶活性的检测。具体操作步骤按照溶菌酶检测试剂盒（南京建成，NO:A050）的说明书进行。
(3) 对融合蛋白进行MIC活性分析。
①采用肠激酶对融合蛋白进行酶切，具体的酶切体系按照重组肠激酶（北京德奥平生物科技有限公司，NO：DNP1209201）的说明书操作。
②对融合蛋白酶切后的产物进行超滤管超滤（Millipore’s Amicon Ultra-10K device），分别分离出溶菌酶和抗菌肽Parasin I，具体的操作步骤按照其说明书进行。
③用TSB培养基对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌进行培养，培养至其对数生长期时，用10mM的PBS（pH7.4）对其进行洗涤，然后调整其菌体浓度为105CFU/ml。
④分别对融合蛋白酶切后的产物、超滤后的人溶菌酶hLY、抗菌肽Parasin I用PBS进行两倍稀释，然后分别加入50ul于96孔细胞培养板中，再加上50ul稀释好的菌液，放入37℃培养箱中培养2h。
⑤2h后向96孔培养板中加入100ul TSB培养基，放入37℃培养箱中培养16h，然后用酶标仪测定其OD600。
⑥根据其OD600的读数，估算出融合蛋白酶切后的产物、超滤后的人溶菌酶hLY、抗菌肽Parasin I以及它们混合蛋白的MIC，具体见下表1。
表1
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法
<130> 11
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> Catfishes
<400> 1
Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr
1 5 10 15
Arg Ser Ser
<210> 2
<211> 130
<212> PRT
<213> 人
<400> 2
Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly
1 5 10 15
Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala
20 25 30
Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly
35 40 45
Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp
50 55 60
Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His Leu Ser
65 70 75 80
Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala
85 90 95
Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp
100 105 110
Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys
115 120 125
Gly Val
130
<210> 3
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<400> 3
His His His His His His Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg
1 5 10 15
Thr Leu Lys Arg Leu Gly Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala
20 25 30
Asn Trp Met Cys Leu Ala Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala
35 40 45
Thr Asn Tyr Asn Ala Gly Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln
50 55 60
Ile Asn Ser Arg Tyr Trp Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val
65 70 75 80
Asn Ala Cys His Leu Ser Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala
85 90 95
Asp Ala Val Ala Cys Ala Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile
100 105 110
Arg Ala Trp Val Ala Trp Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg
115 120 125
Gln Tyr Val Gln Gly Cys Gly Val Gly Gly Gly Gly Asp Asp Asp Asp
130 135 140
Lys Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Thr Arg Ser Ser
<210> 4
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
catcatcatc atcatcataa ggtttttgaa agatgtgaat tggctagaac tttgaagaga 60
ttgggtatgg atggttacag aggtatttct ttggctaact ggatgtgttt ggctaagtgg 120
gaatctggtt acaacactag agctactaac tacaacgctg gtgatagatc tactgattac 180
ggtatttttc aaattaactc cagatactgg tgtaacgatg gtaagactcc aggtgctgtt 240
aacgcttgtc atttgtcttg ttctgctttg ttgcaagata acattgctga tgctgttgct 300
tgtgctaaga gagttgttag agatccacaa ggtattagag cttgggttgc ttggagaaac 360
agatgtcaaa acagagatgt tagacaatac gttcaaggtt gtggtgttgg tggtggtggt 420
gatgatgatg ataagaaggg tagaggtaag caaggtggta aggttagagc taaggctaag 480
actagatctt cttaa 495
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 5
gctgaattcc atcatcatca tcatcata 28
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 6
tgttctagat taagaagatc tagtctta 28
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 7
cttgggttgc ttggagaaac a 21
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 8
caacaccaca accttgaacg tatt 24
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 9
ccaacgtgtg tttcattgca 20
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 10
atcatgcccc aaatcaa 17 。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法
<130> 11
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> Catfishes
<400> 1
Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr
1 5 10 15
Arg Ser Ser
<210> 2
<211> 130
<212> PRT
<213> 人
<400> 2
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1 5 10 15
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20 25 30
Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly
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Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His Leu Ser
65 70 75 80
Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala
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115 120 125
Gly Val
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<210> 3
<211> 164
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35 40 45
Thr Asn Tyr Asn Ala Gly Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln
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Asn Ala Cys His Leu Ser Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala
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Asp Ala Val Ala Cys Ala Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile
100 105 110
Arg Ala Trp Val Ala Trp Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg
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Gln Tyr Val Gln Gly Cys Gly Val Gly Gly Gly Gly Asp Asp Asp Asp
130 135 140
Lys Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys
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<210> 4
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
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gatgatgatg ataagaaggg tagaggtaag caaggtggta aggttagagc taaggctaag 480
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<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 5
gctgaattcc atcatcatca tcatcata 28
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 6
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<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 7
cttgggttgc ttggagaaac a 21
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 8
caacaccaca accttgaacg tatt 24
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 9
ccaacgtgtg tttcattgca 20
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 10
atcatgcccc aaatcaa 17
Claims (9)
1.一种利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）提供人溶菌酶和抗菌肽Parasin I蛋白的氨基酸序列，以及根据毕赤酵母密码子优化后的重组基因序列hLY-PI；
（2）构建酵母细胞中表达hLY-PI的重组质粒pPICZαA- hLY-PI；
（3）重组质粒pPICZαA-hLY-PI转化毕赤酵母X-33细胞；
（4）鉴定并筛选高表达转化菌株；
（5）培养转化菌，获得人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白；
（6）人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的鉴定及酶学活性分析。
2.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，其特征在于所述步骤（1）中人溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述抗菌肽Parasin I蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，其特征在于所述步骤（1）中根据毕赤酵母密码子优化后的重组基因序列hLY-PI是在SEQ ID NO:1序列的前面加上6个组氨酸，在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的中间加上柔性氨基酸和肠激酶切割位点，如SEQ ID NO:3所示；然后依据毕赤酵母的密码子偏好性进行密码子优化后的重组基因序列hLY-PI，如SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，其特征在于所述步骤（3）中，重组质粒转化方法是电转化法，采用Bio-rad公司电转化仪预设PIC程序。
5.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，其特征在于所述步骤（4）中，筛选转化菌方法是用荧光定量PCR的方法对高表达转化菌进行筛选、鉴定。
6.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，其特征在于所述步骤（5）中，培养转化菌培养条件为30℃，200 r/min，0.5%的甲醇，3-4天。
7.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，其特征在于所述步骤（5）中重组人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白存在于培养酵母菌X-33的菌液上清。
8.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，其特征在于所述步骤（6）中，所述的人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的鉴定方法是过6×His标签介质，纯化，酶切，进行SDS-PAGE电泳。
9.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，其特征在于所述步骤（6）中，所述的人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的酶学活性分析是用抑菌实验来检测。
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