CN115322914B - 一种Ec-cLYZ和MEL基因共表达重组毕赤酵母的构建方法及应用 - Google Patents
一种Ec-cLYZ和MEL基因共表达重组毕赤酵母的构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了共表达石斑鱼c型溶菌酶（Ec‑cLYZ）及蜂毒肽（MEL）重组毕赤酵母菌株的构建方法及抗菌活性。将目的基因Ec‑cLYZ和MEL序列用T2A连接肽连接，克隆至载体pPICZαA，获得高效稳定表达的重组质粒pPICZαA‑Ec‑cLYZ‑MEL；将测序和验证正确的重组质粒用限制性内切酶Sac I单酶切线性化，电转化至毕赤酵母表达菌株GS115内，筛选得到高效表达的Mut+菌株；利用0.5%甲醇诱导表达以及His‑tag蛋白纯化试剂盒纯化；利用溶血性试验评价其的溶血活性；通过测定重组蛋白的抑菌率，牛津杯法测定重组蛋白对实验菌株的抑菌圈直径，评价重组蛋白的抑菌活性。
Description
技术领域
本发明涉及构建表达菌株的方法，具体说，是Ec-cLYZ和MEL基因共表达重组毕赤酵母菌株的构建方法及抑菌活性。
背景技术
抗生素的广泛使用导致细菌耐药性现象日益严重，使抗生素的治疗作用逐渐减弱。细菌耐药性对全球卫生安全和全民医疗覆盖构成了严重的威胁，因此，研发新型抑菌药物显得尤为重要。抗菌肽及溶菌酶因其出色的抗细菌、真菌及病毒活性及不易产生耐药性等优点而得到广泛关注。二者通过作用于细菌细胞壁与细胞膜，破坏菌体结构，导致细菌死亡。其独特的抑菌机制使得抗菌肽与溶菌酶在抑菌的同时不易产生耐药性，且对机体毒害作用较小，不失为一种理想的抗菌药物。
石斑鱼c型溶菌酶（Ec-cLYZ）含有Glu50 和 Asp67 两个保守的氨基酸残基结构，通过水解细胞壁肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸（NAM）和N-乙酰葡糖胺之间的β,1-4糖苷键，在内部渗透压的作用下使细胞胀裂，引起细胞裂解，从而实现杀菌目的。溶菌酶独特的杀菌机制使其能直接溶解革兰氏阳性菌，在分泌型IgA和补体参与下，对革兰氏阴性菌亦有间接抑菌作用。因此，Ec-cLYZ在鱼类抵御外来微生物的侵袭过程中发挥重要作用；
蜂毒肽（MEL）是欧洲蜜蜂毒液的主要成分之一，由两个通过柔性片段连接的α螺旋组成，其结构中极性和非极性氨基酸残基的不均匀分布，使蜂毒肽折叠成α-螺旋构型时形成了两亲结构。蜂毒肽的两亲结构使其具有水溶性，易与带负电荷的细胞膜相结合，诱导细胞膜形成跨膜孔，从而干扰膜功能并导致菌体裂解。因此，MEL具有广泛的抗细菌、抗真菌等活性。
本研究将Ec-cLYZ基因和MEL基因用T-2A连接，构建重组毕赤酵母菌株，以期通过单次诱导表达同时获得抗菌肽与溶菌酶，并利用二者不同的抑菌原理实现协同抑菌作用，同时降低蜂毒肽对细胞的毒性作用，为新型广谱抑菌药物的研发提供理论和试验依据。
发明内容
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种共表达Ec-cLYZ基因和MEL基因的重组毕赤酵母表达菌株，命名为：GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL。
本发明进一步公开了所述共表达Ec-cLYZ基因和MEL基因重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）根据Ec-cLYZ基因序列（Gene bank ID: JQ287658.1），按照毕赤酵母偏好密码子进行优化得到Ec-cLYZ基因SEQ ID NO.7；根据MEL基因序列（Gene bank ID:AY745248.1），按照毕赤酵母偏好密码子进行优化得到MEL基因序列SEQ ID NO.8；利用T2A连接的Ec-cLYZ和MEL基因序列SEQ ID NO.9；
2）所述的Ec-cLYZ基因和MEL基因的PCR扩增包括：以Ec-cLYZ-F SEQ ID NO.1和Ec-cLYZ-R SEQ ID NO.2为引物，扩增Ec-cLYZ基因；以MEL-F SEQ ID NO.3和MEL-R SEQ IDNO.4为引物扩增MEL基因；以Ec-cLYZ-MEL-F SEQ ID NO.5和Ec-cLYZ-MEL-R SEQ ID NO.6为引物扩增Ec-cLYZ-MEL基因；
3）将获得的目的基因克隆至pPICZαA载体，线性化重组穿梭载体后电转化至毕赤酵母表达菌株GS115内，构建了包含上述基因的重组毕赤酵母表达菌株GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL。
本发明公开的Ec-cLYZ和MEL基因的共表达载体构建方法制备重组毕赤酵母菌株，该重组毕赤酵母菌株能够分泌同时抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
本发明同时也公开了Ec-cLYZ和MEL基因的共表达载体构建方法制备的毕赤酵母菌株所表达外源蛋白在抑菌性生物制品方面的应用；试验结果显示：表达的外源蛋白Ec-cLYZ-MEL对大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌 26001、表皮葡萄球菌ATCC 12228、无乳链球菌、停乳链球菌ATCC 9809、多杀性巴氏杆菌和肺炎克雷伯菌均具有良好的抑菌效果，对于金黄色葡萄球菌 26001，Ec-cLYZ-MEL处理组抑菌圈直径显著大于Ec-cLYZ处理组（P<0.05）；对于表皮葡萄球菌ATCC12228和停乳链球菌ATCC9809，Ec-cLYZ-MEL处理组抑菌圈直径极显著大于MEL处理组和Ec-cLYZ处理组（P<0.01）；对于大肠杆菌K88，Ec-cLYZ-MEL处理组抑菌圈直径显著大于Ec-cLYZ处理组（P<0.05）。
Ec-cLYZ基因（Gene bank ID: JQ287658.1）cDNA全长533 bp，编码144个氨基酸残基，主要存在于橙斑石斑鱼的头肾部。Ec-cLYZ在鱼类抵御外来微生物的侵袭过程中发挥重要作用，研究表明，在溶藻弧菌和新加坡石斑鱼虹膜病毒的刺激下，橙斑石斑鱼头肾部的Ec-cLYZ表达量显著上调。MEL的研究起步较早，天然MEL（Gene bank ID: AY745248.1）序列cDNA全长78 bp，编码26个氨基酸残基。由于天然MEL的溶血性，MEL的应用极大受限。赵亚华等人将蜂毒肽的第5位Val突变为Arg，第15位Ala突变为Arg，删除了第16位的Leu，经毕赤酵母表达系统表达后的MEL保留了抗菌活性且溶血性显著降低。改造后的蜂毒肽序列编码25个氨基酸残基，序列为GIGARLKVLTTGLPRISWIKRKRQQ。
天然Ec-cLYZ和MEL的资源有限，大量获取存在很大的困难，人工合成获取方式成本过高，利用基因工程方法低成本、大量获取目的蛋白是目前主要解决途径之一。本试验将目的基因Ec-cLYZ和MEL通过T2A连接在一起，克隆至表达载体pPICZαA中，获得高效稳定表达的重组载体，构建单独表达的目的基因作为对照，利用PCR、双酶切、测序的方法验证目的基因表达是否正确，为后续试验奠定基础。
本发明构建Ec-cLYZ和MEL基因共表达载体方法包括以下步骤：
1）Ec-cLYZ基因片段、MEL基因片段和共表达Ec-cLYZ-MEL基因片段的扩增与克隆；
2）共表达Ec-cLYZ基因和MEL基因真核表达载体的构建；
3）重组蛋白的表达与验证
4）重组蛋白对兔红细胞溶血活性评价；
5）重组载体所表达的蛋白体外抑菌活性评价
具体包括步骤如下：
1）根据Ec-cLYZ基因序列（Gene bank ID: JQ287658.1）按照毕赤酵母偏好密码子进行优化得到Ec-cLYZ基因SEQ ID NO.7；据MEL基因序列（Gene bank ID: AY745248.1）按照毕赤酵母偏好密码子进行优化得到MEL基因序列SEQ ID NO.8；T2A连接的Ec-cLYZ-MEL基因序列SEQ ID NO.9。
2）所述的Ec-cLYZ基因、MEL基因以及Ec-cLYZ-MEL基因的PCR扩增包括：以Ec-cLYZ-F SEQ ID NO.1和Ec-cLYZ-R SEQ ID NO.2为引物，扩增Ec-cLYZ基因；以MEL-F SEQID NO.3和MEL-R SEQ ID NO.4为引物扩增MEL基因；以Ec-cLYZ-MEL-F SEQ ID NO.5和Ec-cLYZ-MEL-R SEQ ID NO.6为引物扩增Ec-cLYZ-MEL基因。
3）将获得的目的基因克隆至pPICZαA载体，线性化重组穿梭载体后电转化至毕赤酵母表达菌株GS115内，构建了包含上述基因的重组毕赤酵母表达菌株GS115/pPICZαA-MEL、GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ、GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL。
上述Ec-cLYZ和MEL基因共表达重组毕赤酵母菌株的构建方法制备的重组毕赤酵母菌株。
上述Ec-cLYZ和MEL基因共表达重组毕赤酵母菌株的构建方法制备的重组毕赤酵母菌株分泌的外源蛋白在防治细菌性疾病生物制品方面的应用。也就是说：以PMD19T-Ec-cLYZ-MEL为模板，通过质粒提取、双酶切、产物的胶回收、与真核表达载体pPICZαA用T4连接酶连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，成功获得重组质粒。经过菌液PCR、双酶切鉴定和测序分析，将鉴定正确的阳性质粒命名为pPICZαA-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ和pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL。将测序正确的重组质粒pPICZαA-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ和pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL经SacⅠ单酶切后电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞内。经0.5%甲醇诱导，收集上清液进行冻干浓缩并用His-tag蛋白纯化试剂盒纯化。通过测定重组毕赤酵母菌株所表达的蛋白对大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌 26001、表皮葡萄球菌ATCC 12228、无乳链球菌、停乳链球菌ATCC 9809、多杀性巴氏杆菌和肺炎克雷伯菌体外抑菌率，评价抑菌效果，检测重组蛋白的溶血活性。
本发明公开的SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.9的基因序列如下：
SEQ ID NO.1
AGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAATTCACATGGGGACATTCAGTCCAGCCTAGA
SEQ ID NO.2
CAATGATGATGATGATGATGGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTG
SEQ ID NO.3
AGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAATTCGGTATTGGTGGT
SEQ ID NO.4
CAATGATGAT GATGATGATGGTCGACTTAATGATGATGATGATGATGTTGTTGT
SEQ ID NO.5
AGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAATTCACTGGGGACATTCAGTCCAGCCTAGA
SEQ ID NO.6
CAATGATGATGATGATGATGGTCGACTTAATGATGATGATGATGATGTTGTTGTCT
SEQ ID NO.7
GAATTCACATGGGGACATTCAGTCCAGCCTAGAGTCCATTATGAGAACTTTGGTTGTTTT
GTTGTTGGTTGCTTTGGCTTCCGCTAAGGTTTACGAAAGATGTGAATGGGCTAGATTGTT
GAAGGCTAACGGTATGGATGGATTTAGAGGAAACTCCTTGGCTGATTGGGTTTGTTTGTC
TCAATGGGAATCAGGATACTCCACTACTGCTACTAACCATAACAGAGATGGTTCTACTGA
TTACGGTATTTTTCAAATTAACTCCAGATGGTGGTGTGAAGATGGTCATACTTCACCTTC
AGTTAACGCTTGTCATATTTCATGTTCCGAATTGTTGACTGATGATGTTTCCAAGGCTAT
TAACTGTGCTAAGAGAGTTGTTAAGGACCCAAACGGAATTAGAGCTTGGGTTGCTTGGAG
ATTGCATTGTGAAGGTAGAGATTTGTCCTCTTACGTTGCTGGATGTGGAGTTCATCATCA
TCATCATCATTAATCAACAAACCAGGGTGCTGTCATCGAAATAAACAGTCTCCCATCAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAGTCGAC
SEQ ID NO.8
GAATTCGGTATTGGTGCTAGATTGAAGGTTTTGACTACTGGATTGCCAAGAATTTCATGG
ATTAAGAGAAAGAGACAACAACATCATCATCATCATCATTAAGTCGAC
SEQ ID NO.9。
GAATTCACATGGGGACATTCAGTCCAGCCTAGAGTCCATTATGAGAACTTTGGTTGTTTT
GTTGTTGGTTGCTTTGGCTTCCGCTAAGGTTTACGAAAGATGTGAATGGGCTAGATTGTT
GAAGGCTAACGGTATGGATGGATTTAGAGGAAACTCCTTGGCTGATTGGGTTTGTTTGTC
TCAATGGGAATCAGGATACTCCACTACTGCTACTAACCATAACAGAGATGGTTCTACTGA
TTACGGTATTTTTCAAATTAACTCCAGATGGTGGTGTGAAGATGGTCATACTTCACCTTC
AGTTAACGCTTGTCATATTTCATGTTCCGAATTGTTGACTGATGATGTTTCCAAGGCTAT
TAACTGTGCTAAGAGAGTTGTTAAGGACCCAAACGGAATTAGAGCTTGGGTTGCTTGGAG
ATTGCATTGTGAAGGTAGAGATTTGTCCTCTTACGTTGCTGGATGTGGAGTTCATCATCA
TCATCATCATGGTTCCGGTGAAGGTAGAGGATCATTGTTGACTTGTGGAGATGTTGAAGA
AAACCCTGGTCCAGGTATTGGTGCTAGATTGAAGGTTTTGACTACTGGATTGCCAAGAAT
TTCATGGATTAAGAGAAAGAGACAACAACATCATCATCATCATCATTAAGTCGAC
本发明公开的Ec-cLYZ和MEL基因共表达重组毕赤酵母菌株的构建方法及抑菌活性与现有技术相比所具有的有益效果是：
Ec-cLYZ对革兰氏阳性菌具有更好的抑菌效果，而MEL对革兰氏阴性菌的抑菌效果更为明显。GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL所表达的重组蛋白Ec-cLYZ-MEL结合二者优势，对大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌 26001、表皮葡萄球菌ATCC 12228、无乳链球菌、停乳链球菌ATCC 9809、肺炎克雷伯菌、多杀性巴氏杆菌均有抑菌活性，相对于MEL组对肺炎克雷伯菌的无抑菌活性和Ec-cLYZ组对多杀性巴氏杆菌无抑菌活性而言，Ec-cLYZ-MEL共表达组抑菌范围更广。同浓度Ec-cLYZ-MEL对大肠杆菌K88、停乳链球菌ATCC 9809、无乳链球菌的抑菌率显著（p＜0.05）高于氨苄西林处理组。Ec-cLYZ-MEL重组蛋白对兔红细胞溶血率在高浓度时仍低于5%。
综合评价：本发明最终构建出一种重组毕赤酵母菌株，能够分泌同时抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的重组蛋白。
附图说明
图1是重组质粒pPICZαA-MEL图谱；
图2是重组质粒pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL图谱；
图3是重组质粒pPICZαA-Ec-cLYZ图谱；
图4是MEL、Ec-cLYZ、Ec-cLYZ-MEL基因片段扩增结果（M： DL2501 DNA Marker；1：MEL基因扩增产物；2： Ec-cLYZ基因扩增产物；3： Ec-cLYZ-MEL基因扩增产物）；
图5是重组质粒pPICZαA-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ、pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL双酶切结果（M: DL2502 DNA 分子质量标准；1: pPICZαA-MEL双酶切产物；2: pPICZαA-Ec-cLYZ双酶切产物；3: pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL双酶切产物）；
图6是重组质粒pPICZαA-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ、pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL单酶切结果（M: DL2502 DNA分子质量标准；1: pPICZαA-MEL单酶切产物；2: pPICZαA-Ec-cLYZ单酶切产物；3: pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL单酶切产物）；
图7是GS115/pPICZαA-MEL、GS115/pPICZαA Ec-cLYZ、GS115/pPICZαA Ec-cLYZ-MEL PCR鉴定结果（M： DL2502 DNA 分子量标准；1： GS115/pPICZαA -MEL扩增产物；2：GS115/pPICZαA Ec-cLYZ扩增产物；3： GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL扩增产物）；
图8是Ec-cLYZ-MEL, Ec-cLYZ及MEL Western-blot鉴定结果（M. 蛋白质 Marker；1. Ec-cLYZ-MEL; 2. Ec-cLYZ; 3. MEL; 4. pPICZαA空载体）；
图9是Ec-cLYZ-MEL 纯化后SDS-PAGE结果（M: protein Marker；1: 蛋白原样；2:穿流液；3-4: 洗涤液；5-8: 洗脱液）；
图10是MEL 纯化后Tricine-SDS-PAGE结果（M: protein Marker；1: 蛋白原样；2:穿流液；3-4: 洗涤液；5-8: 洗脱液）；
图11是Ec-cLYZ 纯化后SDS-PAGE结果（Ec-cLYZ 纯化后SDS-PAGE结果）；
图12是不同浓度重组蛋白溶血活性测定结果；
图13是重组蛋白抑菌率结果（A：MEL抑菌率检测结果; B: Ec-cLYZ抑菌率检测结果; C: Ec-cLYZ- MEL抑菌率检测结果）；
图14是重组蛋白与Amp对测试菌株的抑菌率结果（A: 大肠杆菌K88; B:无乳链球菌; C: 停乳链球菌ATCC 9809）；
图15是重组蛋白对测试菌株的抑菌圈结果（A: 大肠杆菌K88; B: 停乳链球菌ATCC 9809。A1, B1: MEL; A2, B2: Ec-cLYZ; A3, B3: Ec-cLYZ-MEL; A4, B4. PBS）。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例
1 材料与方法
1.1 PICZαA-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ和pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL质粒的构建与鉴定
根据GeneBank中MEL基因标准序列（Gene bank ID: AY745248.1）、Ec-cLYZ基因碱基序列（Gene bank ID: JQ287658.1）和T2A连接的MEL和Ec-cLYZ双基因序列。根据优化和设计后的三种基因序列设计引物针对表达载体pPICZαA和基因序列合成特异性引物。
采用OMEGA质粒小量提取试剂盒，提取重组质粒PMD19T- MEL、PMD19T-Ec-cLYZ、PMD19T-Ec-cLYZ-MEL和载体pPICZαA，-20 ℃保存备用。利用限制性内切酶SalⅠ和EcoRⅠ分别对载体pPICZαA和重组质粒PMD19T- MEL、PMD19T-Ec-cLYZ、PMD19T-Ec-cLYZ-MEL进行双酶切，采用DNA回收试剂盒纯化含有限制性内切酶等杂质的酶切产物，-20℃冻存备用。采用SanPrep柱式胶回试剂盒回收MEL基因、Ec-cLYZ基因、Ec-cLYZ-MEL基因与真核表达载体pPICZαA双酶切的产物，-20℃冻存备用。
制备重组质粒pPICZαA-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ和pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL。连接胶回产物，将双酶切后胶回收获得的MEL基因、Ec-cLYZ基因、Ec-cLYZ-MEL基因与真核表达载体pPICZαA用T4连接酶16℃连接过夜。然后转化大肠杆菌Top10感受态细胞，制得重组质粒pPICZαA-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ和pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL。
扩增目的片段的引物（表1）、双酶切（反应体系见表2）、连接酶（连接体系见表3）
取过夜培养的菌液，分别利用表1中所述引物进行PCR鉴定，利用1.0%的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳，电泳90 V，40 min，凝胶成像分析仪观察DNA电泳条带，检测目的片段。需做3个PCR体系，分别为pPICZαA-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ 和pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL。PCR鉴定结果为阳性的菌液提取其重组质粒，根据引物设计时目的片段上下游引入的限制性内切酶酶切位点，用限制性内切酶SalⅠ和EcoRⅠ对重组质粒进行双酶切鉴定。将菌液PCR和酶切鉴定均为阳性的重组质粒送至公司进行核苷酸序列测定，测序结果与Gene Bank中的标准序列进行BLAST比对。
PCR（反应体系见表4）、双酶切（反应体系见表5）
1.2重组毕赤酵母菌株GS115/pPICZαA-MEL、GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ、GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL的构建与鉴定
利用限制性内切酶SacⅠ对测序正确的重组质粒单酶切，用乙醇沉淀法纯化浓缩单酶切产物，参照毕赤酵母表达手册制备GS115感受态细胞，进行电转，电转参数：2 000 V，25μF，200 Ω。电击后加入浓度为1 mol/L冰预冷的山梨醇溶液1 mL，30 ℃静置孵育1 h，取200 μL涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPDS培养基上，于30 ℃恒温培养箱中倒置培养3~4d，直至出现单个菌落。挑取单菌落接种于5 mL YPDZ培养基内，28 ℃、250 r/min振荡培养18 h，提取酵母基因组DNA，利用通用引物5'AOX1/3'AOX1进行PCR验证。
单酶切（反应体系见表6）、PCR（反应体系见表7）
1.3重组蛋白的表达与纯化
挑取单个毕赤酵母菌株重组转化子于5 mL YPD培养基内，28 ℃、250 r/min振荡培养过夜。用移液枪吸取菌液200 μL接种于20 mL BMGY液体培养基内，按上述条件培养24h。用冰预冷的无菌蒸馏水通过离心换液的方式洗去菌液中的甘油，重复3次，将菌体全部接种于200 mL BMMY液体培养基内。每24 h向培养基中补加甲醇至0.5%。诱导培养结束后，收集上清液，冻干浓缩，用His-tag蛋白纯化试剂盒对上清液进行纯化，用Western-blot检测目的蛋白表达情况，用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测纯化后的蛋白浓度，并计算其在上清液中的表达浓度。
1.4重组蛋白溶血活性检测
通过心脏采血方式采集健康家兔新鲜血液10 mL，制成2%兔红细胞悬液。用生理盐水将重组蛋白稀释至浓度分别为2.35，4.69，9.38，18.75，37.5，75，150 mg/L。将2%兔红细胞悬液与重组蛋白按1∶1体积混匀，每体系最终体积为100 μL。设置10% Triton溶液组为阳性对照，此时红细胞溶血率达100%；设置生理盐水组为阴性对照，每体系重复5次，置37 ℃培养箱中静置孵育4 h，3 000×g离心10 min，将上清液转移至96孔细胞培养板内，每孔80μL，用酶标仪在540 nm波长处测定吸光度值，计算溶血率，试验重复三次。溶血率（%）=（试验组-阴性）/（阳性-阴性）×100%。
1.5重组蛋白体外抑菌活性检测
检测对八种指示菌：大肠杆菌K88（E coli）、金黄色葡萄球菌 26001（S aureus）、表皮葡萄球菌ATCC 12228（S epidermidis）、无乳链球菌（S agalactiae）、停乳链球菌ATCC9809（S dysgalactiae）、肺炎克雷伯菌（K Pneumoniae）、多杀性巴氏杆菌（P multocida）的抑菌活性。取-20℃冻存菌液，划线于对应的琼脂培养基中，37℃过夜培养。向液体培养基中接种单菌落，取新鲜培养基接种过夜菌体，培养至细菌生长达到对数期，调整浓度至0.5麦氏比独标准（菌落数约为108CFU/mL），然后取少量加入1000倍的培养基稀释成105CFU/mL的菌悬液。向96孔板每排的第1个孔内加入100μL纯化后的重组蛋白，其它孔中加入50μL0.2％BSA和0.01％乙酸的稀释液，从第一1个孔中吸出50μL，加入第2个孔内，依次类推，倍比稀释至第10号孔。向96孔板的前11个孔中各加入50μL 105CFU/mL的菌悬液，加完后盖盖振荡1min，使其混匀，然后37℃孵育24h。每排第11个孔只加50μL稀释液和50μL菌液为阳性对照组；每排第12个孔只加50μL稀释液和50mL液体培养基为阴性对照组。首先观察阴性对照组，是否始终清亮，若是则证明试验符合无菌操作要求。试验重复操作三次。采用抑菌率分析计算结果。抑菌率=（阳性-试验组）/（阳性-阴性）×100%。
如上所述方法，用倍比稀释法将重组蛋白与分别稀释，使96孔板内每孔蛋白浓度为150、75、37.5、18.75以及9.38 mg/L，利用同样的方法设置一组氨苄青霉素（Ampicillin,Amp）对照组，将抗生素浓度调整至与重组蛋白浓度一致，测定重组蛋白组抑菌率与Amp组抑菌率。试验重复3次。
利用牛津杯法分别检测重组蛋白对大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌 26001、表皮葡萄球菌ATCC 12228、无乳链球菌、停乳链球菌ATCC 9809、肺炎克雷伯菌、多杀性巴氏杆菌的抑菌活性。分别取200 μL稀释后的菌液涂布于相应的平板培养基上。将灭菌的牛津杯轻轻放置在培养基的表面，用PBS将重组蛋白浓度调整至150 mg/L，向牛津杯中加入重组蛋白200 μL，设置PBS为对照组，置于37 ℃恒温培养箱中培养16 h，用游标卡尺测量其抑菌圈直径，试验重复3次。判断标准：抑菌圈直径≥15 mm，表示细菌对蛋白高度敏感；10 mm≤抑菌圈直径≤15 mm，表示细菌对蛋白中度敏感；6 mm≤抑菌圈直径≤10 mm，表示细菌对蛋白低度敏感，无抑菌圈表示细菌对蛋白不敏感。采用SPSS 22对数据进行统计分析，试验数据以“平均值±标准误”表示。采用配对t检验对结果进行差异性显著分析。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 PICZαA-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ和pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL质粒的构建与鉴定
重组质粒pPICZαA-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ和pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL图谱见图1—3。
利用特异性引物，分别以质粒pPICZαA-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ和pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL为模板，电泳检测菌液PCR产物，分别扩增得到141、602和693 bp的目的条带（含部分载体序列），与预期相符（见图4）。
用限制性内切酶SalⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定，电泳得到3493 bp的pPICZαAvector和96 bp的MEL基因片段，554 bp的Ec-cLYZ基因片段和643 bp的Ec-cLYZ-MEL基因片段，目的条带与预期相符（见图5）。
将测序结果与Gene Bank的标准序列进行BLAST分析比对，结果表明，无碱基突变、增添及缺失。
2.2重组毕赤酵母菌株GS115/pPICZαA-MEL、GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ、GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL的构建与鉴定
利用限制性内切酶Sal I分别对重组质粒pPICZαA-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ和pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL进行单酶切，取4 μL酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示分别得到大小为3589 bp、4044 bp、4136 bp的目的片段，且无其他大小条带，说明酶切完全，结果见图6。
利用引物5′AOX1/3′AOX1分别对重组转化子进行菌液PCR鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测，利用凝胶成像系统观察电泳结果，结果显示分别扩增出大小为633 bp、1088 bp、1180bp的条带，并可见一条约2.2 kb的条带，说明目的基因在整合至宿主染色体时发生了单交换，产生Mut+表型，与预期大小相符，结果见图7。
2.3重组蛋白的表达与纯化
Western blotting结果显示，MEL组、Ec-cLYZ组分别在3.4 kDa、16.6kDa大小处有明显条带，Ec-cLYZ- MEL共表达组在16.6 kDa及3.4 kDa处均有明显条带，空载组在无条带，与预期大小相符，结果见图8。
利用His-tag蛋白纯化试剂盒对冻干浓缩后的上清液进行纯化，并用SDS-PAGE检测分析，SDS-PAGA，纯化后分别得到纯度较高的Ec-cLYZ-MEL的混合物、MEL以及Ec-cLYZ，结果见图9—11。
根据BSA标准品在562 nm处的吸光度值及其浓度作一条标准曲线，并根据标准曲线计算纯化后的蛋白浓度，并计算其在上清中的浓度，上清中MEL、Ec-cLYZ、Ec-cLYZ-MEL蛋白浓度分别为27.31、28.73、35.49 mg/L。
2.4重组蛋白溶血活性检测
重组蛋白MEL处理组在150 mg/L时溶血率达79%，Ec-cLYZ及Ec-cLYZ-MEL在浓度为150 mg/L时溶血率分别为2.9%和2.3%。根据医用溶血判断标准，溶血率低于5%为阴性，无溶血现象。说明重组蛋白Ec-cLYZ及Ec-cLYZ-MEL在浓度不超过150 mg/L时对红细胞无溶血活性，结果见图12。
2.5重组蛋白体外抑菌活性检测
纯化的重组蛋白MEL对大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌 26001、表皮葡萄球菌ATCC12228、无乳链球菌、停乳链球菌ATCC 9809、多杀性巴氏杆菌有抑菌活性。在蛋白浓度为18.75 mg/L时，对无乳链球菌的平均抑菌率达96%；在浓度为150 mg/L时，对大肠杆菌K88的平均抑菌率达97%，对金黄色葡萄球菌的平均抑菌率达93%，对多杀性巴氏杆菌和表皮葡萄球菌也有最大抑菌率，分别为72%和70%；当浓度为75 mg/L时，对停乳链球菌的平均抑菌浓度达84%（见图13A）。
纯化的重组蛋白Ec-cLYZ对大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌 26001、表皮葡萄球菌ATCC 12228、无乳链球菌、停乳链球菌ATCC 9809、肺炎克雷伯菌有抑菌活性。在蛋白浓度为9.38 mg/L时，对无乳链球菌的平均抑菌率达98%；在浓度为150 mg/L时，对大肠杆菌K88的平均抑菌率达97%，对肺炎克雷伯菌的平均抑菌率达90%，对金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、表皮葡萄球菌的平均抑菌率分别为85%、76%、61%（见图13B）。
纯化的共表达Ec-cLYZ和MEL除对二者共同抑制的菌株有抑制作用外，对MEL无抑制作用的肺炎克雷伯菌及Ec-cLYZ无抑制作用的多杀性巴氏杆菌也均具有抑制作用。在浓度为75 mg/L时，对停乳链球菌ATCC 9809的抑菌浓度达93%，较同浓度MEL的抑菌率84%和同浓度Ec-cLYZ的抑菌率69%更高；在浓度为150 mg/L时；对多杀性巴氏杆菌的抑菌率达88%，较同浓度MEL组的72%有所提高。在低浓度时，共表达蛋白Ec-cLYZ-MEL对所测菌株整体抑菌率较MEL组及Ec-cLYZ组均有提高，MEL组对表皮葡萄球菌ATCC 12228和停乳链球菌ATCC9809的抑菌率均低于20%，Ec-cLYZ二者的抑菌率分别为41%和20%，而Ec-cLYZ-MEL对表皮葡萄球菌ATCC 12228和停乳链球菌ATCC 9809的抑菌率分别为60%和57%（见图13C）。
根据上述抑菌率试验结果，重组蛋白MEL、Ec-cLYZ、共表达Ec-cLYZ和MEL对大肠杆菌K88、无乳链球菌、停乳链球菌ATCC 9809的抑菌率差异较大，选取这三种测试菌株进行试验。当浓度为9.38 mg/L时，Amp对大肠杆菌K88抑菌率最高，仅为25%，同浓度下共表达Ec-cLYZ和MEL对大肠杆菌的抑菌率达75%（p＜0.01）；当浓度为75 mg/L时，Amp对大肠杆菌K88、无乳链球菌、停乳链球菌ATCC 9809的抑菌率的抑菌率分别为24.5%、12.41%、19.84%，而此时共表达Ec-cLYZ和MEL对三者的抑菌率分别为90%、92.7%、92.5%，显著高于Amp处理组（p＜0.01）（见图14）。
利用牛津杯法分别检测重组蛋白对大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌 26001、表皮葡萄球菌ATCC 12228、无乳链球菌、停乳链球菌ATCC 9809、肺炎克雷伯菌、多杀性巴氏杆菌的抑菌活性，用游标卡尺测定其抑菌圈直径。统计学分析结果表明：对于金黄色葡萄球菌26001，Ec-cLYZ-MEL处理组抑菌圈直径显著大于Ec-cLYZ处理组（P<0.05）；对于表皮葡萄球菌ATCC12228和停乳链球菌ATCC9809，Ec-cLYZ-MEL处理组抑菌圈直径极显著大于MEL处理组和Ec-cLYZ处理组（P<0.01）；对于大肠杆菌K88，Ec-cLYZ-MEL处理组抑菌圈直径显著大于Ec-cLYZ处理组（P<0.05）。结果见表8。重组蛋白对测试菌株的抑菌圈结果（A：大肠杆菌K88；B：停乳链球菌ATCC 9809见图15。
3 结论
3.1成功构建pPICZαA-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ和pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL重组质粒。
3.2筛选出GS115/pPICZαA-MEL、GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ、GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL阳性毕赤酵母表达株。
3.3成功鉴定并获取纯化后重组蛋白MEL、Ec-cLYZ 、共表达Ec-cLYZ和MEL，浓度分别为27.31、28.73、35.49 mg/L。
3.4共表达Ec-cLYZ和MEL蛋白无溶血活性。
3.5共表达Ec-cLYZ和MEL可协同发挥抑菌作用。
本发明的创新之处在于，首次将MEL与Ec-cLYZ结合起来，利用毕赤酵母表达系统获取重组蛋白，溶菌酶主要作用于细胞壁，影响细胞壁的完整性，对革兰氏阳性菌的抑菌作用更为明显；而抗菌肽主要作用于细胞膜，破坏膜完整性。二者联合使用，由溶菌酶首先破坏细胞壁，随后抗菌肽作用于细胞膜，最终发挥共表达蛋白的协调抑菌作用。
最终验证表明：
本试验构建的重组毕赤酵母菌株所表达的蛋白对实验菌株表现出良好的抑菌活性，为临床预防和治疗细菌性疾病提供了新的治疗思路和实验依据。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
Claims (2)
1.一种共表达石斑鱼c型溶菌酶Ec-cLYZ基因和蜂毒肽MEL基因的重组毕赤酵母表达菌株GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL，所述重组毕赤酵母表达菌株GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL以毕赤酵母GS115为出发菌株并含有Ec-cLYZ-MEL基因，所述Ec-cLYZ-MEL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
2.权利要求1所述共表达石斑鱼c型溶菌酶Ec-cLYZ基因和蜂毒肽MEL基因的重组毕赤酵母表达菌株GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）根据如Gene bank ID: JQ287658.1所示的Ec-cLYZ基因标准序列，按照毕赤酵母密码子偏好进行优化得到Ec-cLYZ基因；根据如Gene bank ID: AY745248.1所示的MEL基因标准序列，按照毕赤酵母密码子偏好进行优化得到MEL基因；利用T2A连接Ec-cLYZ和MEL基因得到Ec-cLYZ-MEL基因，其中，所述Ec-cLYZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述MEL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述Ec-cLYZ-MEL基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；
2）使用Ec-cLYZ-MEL-F和Ec-cLYZ-MEL-R作为引物进行PCR扩增得到Ec-cLYZ-MEL基因，其中，所述Ec-cLYZ-MEL-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述Ec-cLYZ-MEL-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
3）将获得的目的基因克隆至pPICZαA载体，线性化重组穿梭载体后电转化至毕赤酵母GS115内，构建得到包含所述Ec-cLYZ-MEL基因的重组毕赤酵母表达菌株GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101817883A (zh) * | 2010-03-12 | 2010-09-01 | 广东药学院 | 一种家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白及其制备方法和应用 |
| CN104630259A (zh) * | 2015-03-06 | 2015-05-20 | 四川农业大学 | 利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法 |
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| CN112457409A (zh) * | 2020-10-21 | 2021-03-09 | 天津农学院 | 一种TLN-58和hLYZ基因融合蛋白及抗菌活性和应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MX347771B (es) * | 2011-04-12 | 2017-05-12 | Gangagen Inc | Polipeptidos antibacterianos quimericos. |
| US11236314B2 (en) * | 2017-03-30 | 2022-02-01 | Bactoclear Holdings Pte. Ltd | Chimeric lysm polypeptides |
-
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101817883A (zh) * | 2010-03-12 | 2010-09-01 | 广东药学院 | 一种家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白及其制备方法和应用 |
| CN104630259A (zh) * | 2015-03-06 | 2015-05-20 | 四川农业大学 | 利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法 |
| CN112094833A (zh) * | 2020-03-24 | 2020-12-18 | 深圳市康佑生物技术有限公司 | 一种抑菌蛋白及其编码基因、用途和菌株法 |
| CN112457409A (zh) * | 2020-10-21 | 2021-03-09 | 天津农学院 | 一种TLN-58和hLYZ基因融合蛋白及抗菌活性和应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Characterization of bioactive recombinant antimicrobial peptide parasin I fused with human lysozyme expressed in the yeast Pichia pastoris system;Zhao H等;《Enzyme Microb Technol》;第77卷;第61-67页 * |
| Multiple Copies of the Fusion Gene cflyC-mzfDB3 Enhance the Expression of a Hybrid Antimicrobial Peptide in Pichia pastoris;Li W等;《Appl Biochem Microbiol》;第57卷;第189-199页 * |
| 毕赤酵母工程菌株表达人溶菌酶-鲎素融合蛋白发酵条件的优化;高宇;赵红蕾;冯新;刁昱文;刘珊珊;李林溪;顾敬敏;韩文瑜;雷连成;;动物医学进展(第08期);第32-36页 * |
| 融合抗菌肽基因在重组毕赤酵母的表达及体外活性研究;唐健雪;肖永乐;彭俊杰;赵世纪;万小平;高荣;;中国生物工程杂志(第06期);第9-16页 * |
Also Published As
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