CN111004806B - 一种香鱼cd46基因、重组工程菌及其多克隆抗体的制备方法 - Google Patents

一种香鱼cd46基因、重组工程菌及其多克隆抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种香鱼CD46基因、重组工程菌及其多克隆抗体的制备方法，特点是包括香鱼CD46‑1、CD46‑2和CD46‑3基因，cDNA序列相应为SEQID NO.1、SEQID NO.3和SEQID NO.5所示；其重组香鱼CD46基因工程菌的制备方法包括构建重组香鱼CD46蛋白胞外区毕赤酵母表达质粒的步骤；筛选高表达重组工程菌株的步骤；高表达酵母菌株发酵罐培养的步骤；重组香鱼CD46胞外区蛋白纯化，得到重组香鱼CD46基因工程菌的步骤；以及通过兔免疫法制备得到兔抗香鱼CD46蛋白多克隆抗体，优点是能够特异性识别香鱼CD46蛋白异构体。

Description

一种香鱼CD46基因、重组工程菌及其多克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种香鱼CD46基因、重组工程菌及其多克隆抗体的制备方法。
背景技术
膜辅蛋白（membrane cofactor protein, MCP或CD46）就是膜结合性补体调节蛋白（membrane complement regulatory protein, mRCPs）成员之一，作为补体因子Ⅰ的辅因子介导C3b和C4b的裂解，从而抑制补体级联反应，防止补体的过激活带来的自体细胞的损伤。此外，CD46是T细胞的共刺激蛋白，是调节T细胞免疫功能的关键分子。上述作用揭示了CD46在连接先天免疫和适应性免疫方面起着重要作用。新近，研究发现CD46参与染色质组装和基因表达调控；可降低脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）刺激的单核细胞来源的树突状细胞的促炎能力；此外，CD46也是多种病毒和细菌病原体的受体，可能参与病原感染过程。目前，鱼类CD46基因鲜有报道，尤其是香鱼CD46基因还未曾被注释。亦未有关于香鱼CD46毕赤酵母体外表达的任何报道，更无关于香鱼CD46多克隆抗体的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种香鱼CD46基因、重组工程菌及其多克隆抗体的制备方法，该多克隆抗体能够特异性识别香鱼CD46蛋白异构体。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、一种香鱼CD46基因，包括香鱼CD46-1基因，该基因为SEQID NO.1所示的cDNA序列。
所述的香鱼CD46-1基因的编码蛋白为SEQID NO.2所示的氨基酸序列。
2、一种香鱼CD46基因，包括香鱼CD46-2基因，该基因为SEQID NO.3所示的cDNA序列。
所述的香鱼CD46-2基因的编码蛋白为SEQID NO.4所示的氨基酸序列。
3、一种香鱼CD46基因，包括香鱼CD46-3基因，该基因为SEQID NO.5所示的cDNA序列。
所述的香鱼CD46-3基因的编码蛋白为SEQID NO.6所示的氨基酸序列。
4、一种重组香鱼CD46基因工程菌的制备方法，包括以下步骤：
（1）构建重组香鱼CD46蛋白胞外区毕赤酵母表达质粒
根据香鱼CD46-1基因核苷酸序列SEQID NO.1设计可扩增包含4个SCR和STP部分的胞外区的引物rPaCD46sex-F和rPaCD46sex-R，以香鱼外周血单核细胞的cDNA为模板，扩增获得PCR产物，切胶回收产物用限制性内切酶Eco RI 和Kpn I双酶切，再与相同酶切的质粒pPICZαA 用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌 DH5α中，得到重组质粒pPICZα-PaCD46ex；其中PCR引物序列如下：含Not I位点rPaCD46sex-F为 5'-GGCGGCCGCCAAGACTGCACCAGACCCGT-3'，含XbaI位点rPaCD46sex-R为 5'-GTCTAGAAATCCTGTGTTGCTAGGAGCCT-3'；
（2）筛选高表达重组工程菌株
重组表达质粒 pPICZα-PaCD46ex经Sac I酶线性化后，进行电击转化毕赤酵母感受态获得转化子，转化子经博莱霉高抗性筛选及 PCR 鉴定，阳性克隆为重组工程菌X33/pPICZα-PaCD46ex；将重组工程菌培养诱导表达，上清液用SDS-PAGE蛋白电泳检测，筛选得到表达水平为 60mg/L高表达重组工程菌株；
（3）高表达酵母菌株发酵罐培养
将发酵罐中装入发酵基底液后灭菌，之后调节发酵基底液pH至5.0.通过控制转速和溶氧情况监控整个发酵过程，全程保持温度为30℃，接种后先补充甘油，直到菌体湿重达到0.2-0.3g/mL再进行甲醇补料，发酵70小时以后，收集上清培养基；
（4）重组香鱼 CD46胞外区蛋白的纯化
收集步骤（3）发酵罐发酵后得到的上清培养基，经强阳离子交换柱层析，收集第二洗脱峰的洗脱液换液浓缩后，再经HisTrap™ FF标签蛋白层析柱分离纯化，收集最高洗脱峰，蛋白溶液脱盐后真空冷冻干燥，即得到纯度达95%以上的重组香鱼CD46胞外区蛋白，即为重组香鱼CD46基因工程菌。
步骤（3）具体为：将发酵罐中装入发酵基底液后灭菌，之后调节发酵基底液pH至5.0，同时将转速和通气量调至最大标定溶氧电极的100%，标定完成并设置温度为30℃后即可接种进行发酵，发酵过程中确保发酵液中溶氧大于20%；发酵18-24小时后，培养基中初始的甘油即将耗尽，取样测菌体湿重，之后开始添加甘油，通过补料补充甘油补料培养基，维持3-5小时；继续培养2-3小时后甘油消耗，直到菌体湿重达到0.2-0.3g/mL再进行甲醇补料，甲醇补料时初始流速应控制在1 mL/h/L，一旦适应甲醇作为营养源并以甲醇进行代谢后，溶氧趋于稳定，提高甲醇流加速度为原来两倍的流加速率，即2 mL/h/L，之后以此速度维持2小时后提高流加速率至3mL/h/L，直到发酵结束，发酵70小时以后，收集上清培养基，其中所述的发酵基底液配方为氢氧化钾4.13g/L、无水硫酸钙0.93g/L、无水硫酸钾18.2g/L、七水硫酸镁14.9g/L、甘油40 g/L、磷酸2.67vt%。
步骤（4）具体为：将上清培养基用低温高速离心机4℃，13,000 g离心，收集上清，在4 ℃条件下，使用5000NMWL旋转过滤器浓缩并透析在阳离子交换柱平衡缓冲液中，然后上样UNOsphere S阳离子交换柱；以 3.0 mL/min 的流速用含有1M NaCl的PB缓冲液通过线性梯度洗脱，收集得到的样品经电泳检测后合并，具有重组香鱼CD46-1蛋白胞外区的蛋白峰使用超滤离心管浓缩，接着使用HisTrap™ FF色谱柱纯化带His标签的重组香鱼CD46胞外区，将洗脱获得的蛋白通过5 mL Bio-Gel P-6脱盐柱脱盐，最终得到95% 以上的重组蛋白，分装后用冷冻干燥机冻干成粉末，放于-80℃保存待使用。
5、一种香鱼CD46蛋白多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：将纯化得到的权利要求7-9中任一项制备得到的重组香鱼CD46基因工程菌用弗氏佐剂乳化，然后免疫注射雄性新西兰兔；每隔10天免疫注射一次，共需注射四次，第四次免疫10天后，然后进行心脏采血，静置离心后获取上清，即为重组香鱼CD46蛋白多克隆抗血清，用Protein G柱纯化即得兔抗香鱼CD46蛋白多克隆抗体。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明香鱼CD46基因、编码蛋白及其重组工程菌的构建方法和多克隆抗体的制备方法，首次克隆得到香鱼CD46基因，在克隆香鱼CD46基因异构体序列的基础上，首次构建香鱼CD46蛋白毕赤酵母表达载体，并最终制备了兔抗香鱼CD46蛋白多克隆抗体，该抗体能够特异性识别香鱼CD46蛋白异构体，为今后开展香鱼CD46蛋白异构体功能研究奠定了基础。
附图说明
图1为香鱼CD46基因异构体1氨基酸序列比对分析；
图2为香鱼CD46基因异构体和其它物种CD46氨基酸序列的系统发育进化树分析；
图3为香鱼CD46蛋白胞外区核苷酸片段PCR扩增结果；
图4为香鱼CD46蛋白胞外区毕赤酵母表达重组质粒的构建及鉴定；
图5为SDS-PAGE检测重组香鱼CD46蛋白胞外区毕赤酵母表达；M：蛋白marker；1：经甲醇诱导的pPICZαA/X33；2：经甲醇诱导的pPICZαA-rPaCD46ex/X33；3：纯化的重组香鱼CD46蛋白胞外区；
图6为Western blot检测香鱼CD46蛋白抗体特异性。1.阴性对照；2.纯化的重组CD46蛋白胞外区；3.PBMC总蛋白。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
具体实施例一
分析香鱼CD46基因克隆及序列分析
采用RNAiso Plus提取香鱼外周血单核细胞（peripheral blood mononuclearcell， PBMC）总RNA。经DNase I处理后，以Oligo(dT)-adaptor为引物，用AMV逆转录酶合成第一链cDNA。从香鱼头肾来源的单核巨噬细胞转录组中获得香鱼CD46两个异构体，采用开放阅读框序列设计扩增引物PaCD46t-F (5'-ATGCAGTCCCTTGATACATCTCGTT-3') 和PaCD46t-R (5'-CTATAGTGAATCAACAGGAGGACTGC-3')，以上述cDNA为模板，进行PCR扩增并测序验证。获得的香鱼CD46异构体序列采用BLAST search进行同源序列比对分析；分子量和等电点预测采用pI/Mw计算工具；信号肽预测采用SignalP 4.1软件；保守结构域分析采用SMART在线软件；O连接糖基化和N连接糖基化预测均采用在线软件。多序列比对采用ClustalW程序，进化树构建采用MEGA 7.0。从PBMC中克隆获得香鱼CD46基因3种异构体，分别命名为香鱼CD46-1、CD46-2和CD46-3。
香鱼CD46-1基因为SEQID NO.1所示的cDNA序列，其编码蛋白为SEQID NO.2所示的氨基酸序列，香鱼CD46-1编码长度为323个氨基酸的蛋白，分子量为33.8 kDa，等电点为7.21。
香鱼CD46-2基因为SEQID NO.3所示的cDNA序列，其编码蛋白为SEQID NO.4所示的氨基酸序列，香鱼CD46-2编码长度为310个氨基酸的蛋白，分子量为32.2 kDa，等电点为5.55。
香鱼CD46-3基因为SEQID NO.5所示的cDNA序列，其编码蛋白为SEQID NO.6所示的氨基酸序列，香鱼CD46-3编码长度为348个氨基酸的蛋白，分子量为36.3 kDa，等电点为5.55。
三个异构体均为跨膜蛋白，胞外区含有4个短同源重复序列（short consensusrepeats, SCR）和不同的富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸区（Ser, Thr and Pro-richdomain, STP）。如图1所示3个异构体胞外区（extracellular domain）高度相似。如图2所示，香鱼CD46基因3个异构体与其他鱼类的序列形成一簇，再与哺乳动物CD46形成大簇。
上述香鱼PBMC细胞分离的步骤如下：用3.2 %的柠檬酸钠润洗1mL注射器，然后脊髓取健康香鱼血液，迅速混匀防止凝血，3,000rpm，5min离心后去上层血清，每管血液沉淀加入PBS缓冲液补足4 mL，混匀后用6wt%葡聚糖溶液沉淀4小时，取上清大约2mL，用PBS缓冲液清洗（1，500 rpm，5min）后，ficoll密度梯度离心2,000rpm，30min。取中间白膜层，PBS缓冲液再次清洗三次即得到香鱼PBMC细胞。
具体实施例二
重组香鱼CD46基因工程菌的构建方法
1、构建重组香鱼CD46蛋白胞外区毕赤酵母表达质粒
根据香鱼CD46-1基因核苷酸序列SEQID NO.1所示，设计可扩增包含4个SCR和STP部分的胞外区的引物rPaCD46sex-F和rPaCD46sex-R，PCR反应条件按照常规设置进行，以上述PBMC的cDNA为模板，扩增获得胞外区核苷酸序列。将含重组香鱼CD46蛋白胞外区的PCR产物用切胶回收试剂盒回收，回收产物用限制性内切酶Eco RI 和Kpn I双酶切，将酶切后的PCR产物与相同酶切的质粒 pPICZαA 用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌 DH5α中，得到重组质粒 pPICZα-PaCD46ex，重组子经酶切鉴定和测序验证。如图3所示PCR扩增获得重组香鱼胞外区核苷酸序列，为771bp。如图4所示上方条带为酶切后的载体，下方条带为重组香鱼胞外区核苷酸序列，说明结果正确。测序结果已经一步表明插入片段与原序列一致。因此，重组表达质粒的构建完全正确。其中PCR引物序列如下：
含Not I位点rPaCD46sex-F为 5'-GGCGGCCGCCAAGACTGCACCAGACCCGT-3'，
含XbaI位点rPaCD46sex-R为 5'-GTCTAGAAATCCTGTGTTGCTAGGAGCCT-3'。
2、筛选高表达重组工程菌株
取经 SacI酶切线性化的重组表达质粒 pPICZα-PaCD46ex 20μg进行电击转化毕赤酵母感受态获得转化子，转化子经博莱霉 Zeocin 高抗性筛选及 PCR 鉴定，阳性克隆为重组工程菌 X33/pPICZα-PaCD46ex；将获得的博莱霉高抗性重组工程菌株 X33/pPICZα-PaCD46ex接种于BMGY培养基中，培养至OD600达2.0～6.0收集细胞，重悬于BMMY培养基中，0.5%甲醇诱导表达，上清液用SDS-PAGE蛋白电泳检测，筛选表达水平约为 60mg/L 的菌株，得到高表达重组工程菌株。如图5中SDS-PAGE电泳检测结果显示一条40kDa左右大小的清晰条带，与估算的重组蛋白分子量32.5 kDa（27.5kDa香鱼CD46胞外区+5kDa His标签）一致，表明重组香鱼CD46蛋白胞外区重组表达成功。
3、高表达酵母菌株发酵罐培养
配置发酵基底液（氢氧化钾4.13g/L、无水硫酸钙0.93g/L、无水硫酸钾18.2g/L、七水硫酸镁14.9g/L、甘油40 g/L、磷酸2.67%（体积百分比），连同罐体灭菌锅中121℃灭菌40min。发酵罐冷却后需用浓氨水调发酵液pH至5.0，同时将转速和通气量调至最大标定溶氧电极的100%，标定完成并设置温度为30℃后即可接种进行发酵。发酵过程中确保发酵液中溶氧大于20%。一般发酵18-24小时后，培养基中初始的甘油即将耗尽（此时DO上升到100%），取样测菌体湿重，之后开始添加甘油，通过补料补充甘油补料培养基（流量控制在18.15mL/h/L），维持大约4小时；继续培养2-3小时后甘油消耗，直到菌体湿重达到0.2-0.3g/mL再进行甲醇补料，甲醇补料时初始流速应控制在1 mL/h/L，一旦适应甲醇作为营养源并以甲醇进行代谢后，溶氧趋于稳定，此时可提高甲醇流加速度为原来两倍的流加速率，即2 mL/h/L，之后以此速度维持大约2小时后提高流加速率至3mL/h/L，直到发酵结束，发酵70小时以后，收集上清培养基。
4、重组香鱼 CD46胞外区蛋白的纯化
收集发酵罐发酵后得到的上清培养基，经强阳离子交换柱层析，收集第二洗脱峰的洗脱液浓缩后，再经HisTrap™ FF标签蛋白层析柱分离纯化，收集最高洗脱峰。蛋白溶液脱盐后真空冷冻干燥，即得到如图5纯度达95%以上的重组香鱼CD46胞外区蛋白。具体步骤如下：
将上清培养基用低温高速离心机4℃，13,000 g离心，收集上清，在4 ℃条件下，使用5000NMWL旋转过滤器浓缩并透析在阳离子交换柱平衡缓冲液中，然后上样UNOsphere S阳离子交换柱；以 3.0 mL/min 的流速用含有1M NaCl的PB缓冲液通过线性梯度洗脱，收集得到的样品经电泳检测后合并，具有重组香鱼CD46蛋白胞外区（rPaMCPex）的蛋白峰使用50mL超滤离心管浓缩，接着使用HisTrap™ FF色谱柱纯化带His标签的重组香鱼CD46胞外区，将洗脱获得的蛋白通过5 mL Bio-Gel P-6脱盐柱脱盐，最终得到95% 以上的重组蛋白，分装后用冷冻干燥机冻干成粉末，放于-80℃保存待使用。
具体实施例三
1、香鱼CD46蛋白多克隆抗体制备
将具体实施例二纯化得到的重组蛋白用弗氏佐剂乳化，然后免疫注射雄性新西兰兔。每隔10天免疫注射一次，共需注射四次。首次免疫时，用弗氏完全佐剂（1:1）乳化重组蛋白，每只兔子背部皮下多点注射纯化的重组蛋白1 mg。后三次免疫，用弗氏不完全佐剂（1:1）乳化重组蛋白于第10天、20天和30天用同样方法注射重组融合蛋白500μg。第四次免疫10天后，断粮1天，然后进行心脏采血。4℃冰箱静止过夜，用低温离心机4℃，15,000g离心10min，移液枪轻轻吸取上清，即为重组香鱼CD46蛋白多克隆抗血清。用Protein G柱纯化即得兔抗香鱼CD46蛋白多克隆抗体，分装后-20℃保存。
2、重组香鱼CD46蛋白多克隆抗体效价测定
用包被液稀释纯化的重组香鱼CD46蛋白胞外区（浓度为30μg/mL），在96孔酶标板中每孔加入100μL，温度4℃包被过夜；振荡洗涤3次后，酶标板孔中分别加入200μL封闭液，温度37℃封闭1小时；振荡洗涤3次后，将香鱼CD46蛋白多克隆抗体与PBS缓冲液按照体积1:10比例(μL)进行连续的梯度稀释，在酶标板孔中分别加入100μL，设置3个平行，以PBS作为阴性对照组，温度37℃孵育2小时；振荡洗涤3次后，在酶标板孔中分别加入100μL稀释的辣根过氧化物酶标记二抗（1:1000），温度37℃孵育2小时；振荡洗涤3次后，酶标板孔中分别加入100μL配制新鲜底物液，避光，温度37℃孵育20 min；酶标板孔中分别加入50μL终止液，用酶标仪检测450nm波长时各孔的吸光度值，标准为P/N≥2.1；最终经ELISA检测，重组香鱼CD46蛋白多克隆抗体的效价为1:512000，此效价可以满足后续免疫组化实验的需求。
3、重组香鱼CD46蛋白多克隆抗体特异性检测
香鱼PBMC用PBS缓冲液洗涤2次，再用裂解缓冲液裂解细胞提取细胞总蛋白，使用Bradford方法测量总蛋白浓度。然后使用Western blot方法检测目的蛋白。如图6用重组香鱼CD46蛋白多克隆抗体可与重组CD46蛋白特异性结合，同时可检测到PBMC细胞中存在3种异构体。
步骤中Western blot具体如下：
分离香鱼PBMC用PBS洗涤2次，再用裂解缓冲液（20mM HEPES、1.5mM MgCl2、 0.2mMEDTA、100mM NaCl、0.2mM DTT、0.5mM sodium orthovanadate、0.4mM PMSF、1% SDS）裂解细胞提取细胞总蛋白，使用Bradford方法测量总蛋白浓度。将样品（1.阴性对照；2.纯化重组CD46蛋白胞外区；3.PBMC总蛋白）各50μg上样至12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶。100V恒压电泳至指示带完全进入分离胶后，调至电压至120V，继续电泳2小时。PVDF膜经100 %甲醇浸泡15秒活化，将电泳后的凝胶放置于PVDF膜上，然后夹在上下各三层的滤纸中，排除所有气泡。然后将其放置于电极之中，使膜一面朝向正极，接通电源，35-40V恒压转膜3-4小时。转膜结束后，在含10%脱脂牛奶的TBS-T溶液中，37℃封闭1小时。之后在5% BSA的TBS-T溶液稀释的自制香鱼CD46抗血清（1：500稀释）中孵育2小时。将PVDF膜用TBS-T每15 min洗3次。加入山羊抗鼠辣根过氧化物酶标记的IgG（用TBS-T 1：2000稀释，碧云天），37℃孵育1小时。PVDF膜用TBS-T 15 min洗4次，加上ECL，暗室显色。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序 列 表
<110> 宁波大学
<120> 一种香鱼CD46基因、重组工程菌及其多克隆抗体的制备方法
<130>
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 969
<212> DNA
<213> 香鱼CD46-1基因（ATGCAGTCCCTTGATACATCTCGTTGTTGGTTGCTGGCAAGCTGCCTCTGTCTTGCCTCTATGGTTGGCACAGTTCAAGCACAAGACTGCACCAGACCCGTTGGAGGCAACAACACGGTATTGTCACCTGAAGACATTGGAAAGACAGAATTTGTCGATGGATCTTCTGTCACGTTTAAATGTGACATTGGTTATGAACAAACTGGAGGGTCTCGGACCATGACATGCACAAAGGGAGAGTGGAGTACGCCGACAATGACTTGTGAAAGAAAGAATTGTGGCAGTCCTGGAGAAGTACTGAATGGGCAATTTGACCTCAGTGGTGGGACCAAATTTGGTGACACAGTTGTGGCTACATGCAACCTAGGATTCAAACTAATCGGAAGTAATCGACGCCAGTGTATGGATGGGGGGTGGTCTGGCAGAGTACCGATATGCGAAGTGTCAAAATGTGGTCGAGCACCTAACATTGTGAATGGGAGACCATCGTCGAATGCTGAGTCGCATGACTATGGTGCTCCTGTTAGTTACAGCTGTAATTCTGGATTCACATTGTCTGGAAGCAAAACCATAGTCTGCAAAGGGGATGAGGTATTTGAACCAGCTCCGCCTAAATGTATAAAGGTCGAGTGTCCTTATCCTGACGTTTCAAACGCCATAGTGATCGAGGGAGGCTCCGCTCCCTATGAATACCTATCCTTTCTTACATTTGAGTGCAAATCTGGATTTGTAATGACTGGATTACCAAGTATAACATGTGAAATAGAAAGTCAATGGAAACCTTCCCCTCCAGAATGCAAAGCTCCTGGTCCGAAGCCCACTGATAAACCAAAGGCTCCTAGCAACACAGGAGCCATTGTCGGGGGGGTTATTGGTGCACTTGCTCTTGTTGCAGTTGCCATTGGGTGCTTTCTTGCATTCAAAAAAAAGGGTGCAAAGCGCAGCAGTCCTCCTGTTGATTCACTATAG）
<400> 1
<210> 2
<211> 322
<212> PRT
<213> 香鱼CD46-1基因的编码蛋白（MQSLDTSRCWLLASCLCLASMVGTVQAQDCTRPVGGNNTVLSPEDIGKTEFVDGSSVTFKCDIGYEQTGGSRTMTCTKGEWSTPTMTCERKNCGSPGEVLNGQFDLSGGTKFGDTVVATCNLGFKLIGSNRRQCMDGGWSGRVPICEVSKCGRAPNIVNGRPSSNAESHDYGAPVSYSCNSGFTLSGSKTIVCKGDEVFEPAPPKCIKVECPYPDVSNAIVIEGGSAPYEYLSFLTFECKSGFVMTGLPSITCEIESQWKPSPPECKAPGPKPTDKPKAPSNTGAIVGGVIGALALVAVAIGCFLAFKKKGAKRSSPPVDSL）
<400> 2
<210> 3
<211> 920
<212> DNA
<213> 香鱼CD46-2基因（ATGCAGTCCCTTGATACATCTCGTTGTTGGTTGCTGGCAAGCTGCCTCTGTCTTGCCTCTATAGTTGGCACAGTTCAAGCACAAGACTGCACCAGACCCGTTGGAGGCAACAACACGGTATTGTCACCTGAAGACATTGGAAAGACAGAATTTGTCGATGGATCTTCTGTCACGTTTAAATGTGACATTGGTTATGAACAAACTGGAGGGTCTCGGACCATGACATGCACAAAGGGAGAGTGGAGTACGCCGACAATGACTTGTGAAAGAAAGAATTGTGGCAGTCCTGGAGAAGTACTGAATGGGCAATTTGACCTCAGTGGTGGGACCAAATTTGGTGACACAGTTGTGGCTACATGCAACCTAGGATTCAAACTAATCGGAAGTAATCGACGCCAGTGTATGGATGGGGGGTGGTCTGGCAGAGTACCGATATGCGAAGTGTCAAAATGTGGTCGAGCACCTAACATTGTGAATGGGAGACCATCGTCGAATGCTGAGTCGCATGACTATGGTGCTCCTGTTAGTTACAGCTGTAATTCTGGATTCACATTGTCTGGAAGCAAAACCATAGTCTGCAAAGGGGATGAGGTATTTGAACCAGCTCCGCCTAAATGTATAAAGGTCGAGTGTCCTTATCCTGACGTTTCAAACGCCATAGTGATCGAGGGAGGCTCCGCTCCCTATGAATACCTATCCTTTCTTACATTTGAGTGCAAATCTGGATTTGTAATGACTGGATTACCAAGTATAACATGTGAAATAGAAAGTCAATGGAAACCTTCCCCTCCAGAATGCAAAGCTCCTGGTCCGAAGCCCACTGATAAACCAAAGGCTCCTAGCAACACAGGAGCCATTGTCGGGGGGGTTATTGGTGCACTTGTGCAAAGCGCAGCAGTCCTCCTGTTGATTCACTATAG）
<400> 3
<210> 4
<211> 306
<212> PRT
<213> 香鱼CD46-2基因的编码蛋白（MQSLDTSRCWLLASCLCLASIVGTVQAQDCTRPVGGNNTVLSPEDIGKTEFVDGSSVTFKCDIGYEQTGGSRTMTCTKGEWSTPTMTCERKNCGSPGEVLNGQFDLSGGTKFGDTVVATCNLGFKLIGSNRRQCMDGGWSGRVPICEVSKCGRAPNIVNGRPSSNAESHDYGAPVSYSCNSGFTLSGSKTIVCKGDEVFEPAPPKCIKVECPYPDVSNAIVIEGGSAPYEYLSFLTFECKSGFVMTGLPSITCEIESQWKPSPPECKAPGPKPTDKPKAPSNTGAIVGGVIGALVQSAAVLLLIHY）
<400> 4
<210> 5
<211> 1044
<212> DNA
<213> 香鱼CD46-3基因（ATGCAGTCCCTTGATACATCTCGTTGTTGGTTGCTGGCAAGCTGCCTCTGTCTTGCCTCTATGGTTGGCACAGTTCAAGCACAAGACTGCACCAGACCCGTAGGAGGCAACAACACGGTATTGTCACCTGAAGACATTGGAAAGACAGAATTTGTCGATGGATCTTCTGTCACGTTTAAATGTGACATTGGTTATGAACAAACTGGAGGGTCTCGGACCATGACATGCACAAAGGGAGAGTGGAGTACGCCGACAATGACTTGTGAAAGAAAGAATTGTGGCAGTCCTGGAGAAGTACTGAATGGGCAATTTGACCTCAGTGGTGGGACCAAATTTGGTGACACAGTTGTGGCTACATGCAACCCAGGATTCAAACTAATCGGAAGTAATCGACGCCAGTGTATGGATGGGGGGTGGCCTGGCAGAGTGCCGATATGCGAAGTGTCAAAATGTGGTCGAGCACCTAACATTGTGAATGGGAGACCATCGTCGATTGCTGAGTCGCATGACTATGGTGCTCCTGTTAGTTACAGCTGTAATTCTGGATTCACATTGTCTGGAAGCAAAACCATAGTCTGCAAAGGGGATGAGGTATTTGAACCAGCTCCGCCTAAATGTATAAAGGTCGAGTGTCCTTATCCTGACGTTTCAAACGCCATAGTGATCGAGGGAGGCTCCGCTCCCTATGAATACCTATCCTTTCTTACATTTGAGTGCAAATCTGGATTTGTAATGACTGGATTACCAAGTATAACATGTGAAATAGAAAGTCAATGGAAACCTTCCCCTCCAGAATGCAAAGCCCCTTCAACCACAACCAAACCCACTACTACTACTGCTACTACTACTACTACTACAAAGAAACCTACAGACAAAGCTCCTGGTCCGAAGCCCACTGATAAACCAAAGGCTCCTGGCAACACAGGAGCCATTGTCGGGGGGGTTATTGGTGCACTTGCTCTTGTTGCAGTTGCCATTGGGTGCTTTCTTGCATTCAAAAAAAAGGGTGCAAAGCGCAGCAGTCCTCCTGTTGATTCACTATAG）
<400> 5
<210> 6
<211> 347
<212> PRT
<213> 香鱼CD46-3基因的编码蛋白（MQSLDTSRCWLLASCLCLASMVGTVQAQDCTRPVGGNNTVLSPEDIGKTEFVDGSSVTFKCDIGYEQTGGSRTMTCTKGEWSTPTMTCERKNCGSPGEVLNGQFDLSGGTKFGDTVVATCNPGFKLIGSNRRQCMDGGWPGRVPICEVSKCGRAPNIVNGRPSSIAESHDYGAPVSYSCNSGFTLSGSKTIVCKGDEVFEPAPPKCIKVECPYPDVSNAIVIEGGSAPYEYLSFLTFECKSGFVMTGLPSITCEIESQWKPSPPECKAPSTTTKPTTTTATTTTTTKKPTDKAPGPKPTDKPKAPGNTGAIVGGVIGALALVAVAIGCFLAFKKKGAKRSSPPVDSL）
<400> 6
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 含Not I位点rPaCD46sex-F（5'-GGCGGCCGCCAAGACTGCACCAGACCCGT-3'）
<400> 7
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 含Xba I位点rPaCD46sex-R（5'-GTCTAGAAATCCTGTGTTGCTAGGAGCCT-3'）
<400> 8
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> PaCD46t-F（5'-ATGCAGTCCCTTGATACATCTCGTT-3'）
<400> 9
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> PaCD46t-R（5'-CTATAGTGAATCAACAGGAGGACTGC-3'）
<400> 10

Claims (10)

1. 一种香鱼CD46基因，其特征在于所述基因的一种异构体为香鱼CD46-1基因，该基因为SEQ ID NO.1所示的cDNA序列。
2.根据权利要求1所述的一种香鱼CD46基因，其特征在于所述的香鱼CD46-1基因的编码蛋白为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
3.一种香鱼CD46基因，其特征在于所述基因的一种异构体为香鱼CD46-2基因，该基因为SEQ ID NO.3所示的cDNA序列。
4.根据权利要求3所述的一种香鱼CD46基因，其特征在于所述的香鱼CD46-2基因的编码蛋白为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
5.一种香鱼CD46基因，其特征在于所述基因的一种异构体为香鱼CD46-3基因，该基因为SEQ ID NO.5所示的cDNA序列。
6.根据权利要求5所述的一种香鱼CD46基因，其特征在于所述的香鱼CD46-3基因的编码蛋白为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
7.一种重组香鱼CD46基因工程菌的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）构建重组香鱼CD46蛋白胞外区毕赤酵母表达质粒
根据香鱼CD46-1基因核苷酸序列SEQ ID NO.1设计可扩增包含4个SCR和STP部分的胞外区的引物rPaCD46sex-F和rPaCD46sex-R，以香鱼外周血单核细胞的cDNA为模板，扩增获得PCR产物，切胶回收产物用限制性内切酶Eco RI 和Kpn I双酶切，再与相同酶切的质粒pPICZαA 用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌 DH5α中，得到重组质粒pPICZα-PaCD46ex；其中PCR引物序列如下：含Not I位点rPaCD46sex-F为 5'-GGCGGCCGCCAAGACTGCACCAGACCCGT-3'，含XbaI位点rPaCD46sex-R为 5'-GTCTAGAAATCCTGTGTTGCTAGGAGCCT-3'；
（2）筛选高表达重组工程菌株
重组表达质粒 pPICZα-PaCD46ex经Sac I酶线性化后，进行电击转化毕赤酵母感受态获得转化子，转化子经博莱霉高抗性筛选及 PCR 鉴定，阳性克隆为重组工程菌X33/pPICZα-PaCD46ex；将重组工程菌培养诱导表达，上清液用SDS-PAGE蛋白电泳检测，筛选得到表达水平为 60mg/L高表达重组工程菌株；
（3）高表达酵母菌株发酵罐培养
将发酵罐中装入发酵基底液后灭菌，之后调节发酵基底液pH至5.0.通过控制转速和溶氧情况监控整个发酵过程，全程保持温度为30℃，接种后先补充甘油，直到菌体湿重达到0.2-0.3g/mL再进行甲醇补料，发酵70小时以后，收集上清培养基；
（4）重组香鱼 CD46胞外区蛋白的纯化
收集步骤（3）发酵罐发酵后得到的上清培养基，经强阳离子交换柱层析，收集第二洗脱峰的洗脱液换液浓缩后，再经HisTrap™ FF标签蛋白层析柱分离纯化，收集最高洗脱峰，蛋白溶液脱盐后真空冷冻干燥，即得到纯度达95%以上的重组香鱼CD46胞外区蛋白，即为重组香鱼CD46基因工程菌。
8.根据权利要求7所述的一种重组香鱼CD46基因工程菌的制备方法，其特征在于步骤（3）具体为：将发酵罐中装入发酵基底液后灭菌，之后调节发酵基底液pH至5.0，同时将转速和通气量调至最大标定溶氧电极的100%，标定完成并设置温度为30℃后即可接种进行发酵，发酵过程中确保发酵液中溶氧大于20%；发酵18-24小时后，培养基中初始的甘油即将耗尽，取样测菌体湿重，之后开始添加甘油，通过补料补充甘油补料培养基，维持3-5小时；继续培养2-3小时后甘油消耗，直到菌体湿重达到0.2-0.3g/mL再进行甲醇补料，甲醇补料时初始流速应控制在1 mL/h/L，一旦适应甲醇作为营养源并以甲醇进行代谢后，溶氧趋于稳定，提高甲醇流加速度为原来两倍的流加速率，即2 mL/h/L，之后以此速度维持2小时后提高流加速率至3mL/h/L，直到发酵结束，发酵70小时以后，收集上清培养基，其中所述的发酵基底液配方为氢氧化钾4.13g/L、无水硫酸钙0.93g/L、无水硫酸钾18.2g/L、七水硫酸镁14.9g/L、甘油40 g/L、磷酸2.67vt%。
9.根据权利要求7所述的一种重组香鱼CD46基因工程菌的制备方法，其特征在于步骤（4）具体为：将上清培养基用低温高速离心机4℃，13,000 g离心，收集上清，在4 ℃条件下，使用5000NMWL旋转过滤器浓缩并透析在阳离子交换柱平衡缓冲液中，然后上样UNOsphereS阳离子交换柱；以 3.0 mL/min 的流速用含有1M NaCl的PB缓冲液通过线性梯度洗脱，收集得到的样品经电泳检测后合并，具有重组香鱼CD46-1蛋白胞外区的蛋白峰使用超滤离心管浓缩，接着使用HisTrap™ FF色谱柱纯化带His标签的重组香鱼CD46胞外区，将洗脱获得的蛋白通过5 mL Bio-Gel P-6脱盐柱脱盐，最终得到95% 以上的重组蛋白，分装后用冷冻干燥机冻干成粉末，放于-80℃保存待使用。
10.一种香鱼CD46蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将权利要求7-9任一项所述的制备方法纯化得到的重组香鱼CD46蛋白用弗氏佐剂乳化，然后免疫注射雄性新西兰兔；每隔10天免疫注射一次，共需注射四次，第四次免疫10天后，然后进行心脏采血，静置离心后获取上清，即为重组香鱼CD46蛋白多克隆抗血清，用Protein G柱纯化即得兔抗香鱼CD46蛋白多克隆抗体。
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