CN110054687B - 草鱼atg12多克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

草鱼ATG12多克隆抗体制备方法，首先以草鱼肝脏RNA为模板，反转录合成cDNA，再以cDNA为模板通过引物进行PCR扩增回收目的片段，进而构建ATG12/pGEX‑4T‑1原核表达载体；将ATG12/pGEX‑4T‑1原核表达载体转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行处理后超声破碎离心得上清和沉淀，再将沉淀纯化后得纯化后的ATG12融合蛋白；最后将纯化后的ATG12融合蛋白作为抗原与等体积的弗氏完全佐剂进行1：1充分混合乳化，对新西兰纯种大白兔进行免疫后提取其心脏采血，分离血清，得到ATG12多克隆抗体，该抗体具有特异性高、成本低、周期短的优势，为获得可商品化的ATG12抗体奠定基础。

Description

草鱼ATG12多克隆抗体及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种草鱼ATG12多克隆抗体及其制备方法。
背景技术
自噬是大部分真核细胞中普遍存在的一种依赖溶酶体的细胞代谢途径，通过降解细胞内泛素蛋白或受损细胞器，以调节细胞内物质代谢及维持内环境的稳定，在细胞生长、分化、衰老、凋亡中发挥重要作用(Maiuri et al.,2007)。自噬体的形成过程主要涉及两个保守的泛素化结合系统，这两个系统对于自噬体的形成是必需，其中一个泛素化结合系统涉及到ATG12基因，ATG12属于泛素样蛋白家族成员之一，能介导自噬体膜拓展，对自噬的形成至关重要(
Figure GDA0002025573100000011
et al.,2004)，ATG12定位于细胞质和自噬体中，同时介导自噬与凋亡两条通路(Rubinstein et al.,2011)，在自噬过程中ATG12和ATG5的结合是不可逆的，ATG12与ATG5结合后形成ATG12-ATG5偶联蛋白，这个蛋白是参加自噬体形成早期阶段的一个重要蛋白，ATG12-ATG5蛋白主要调控自噬体膜的延伸和包被，在LC3脂质化和定位附着中起关键作用(Dirks-Naylor,2013；Klionsky and Schulman,2014)，ATG12-ATG5蛋白在自噬体形成的上游，在自噬体起始阶段通过与之后的自噬相关蛋白来启动自噬进程。
目前，在人、小鼠、水螅及阿米巴虫已有ATG12基因的报道，但在鱼中尚未有公开相关报道，亦未有关于鱼类ATG12体外表达的任何报道，更无关于鱼类ATG12多克隆抗体的研究。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种草鱼ATG12多克隆抗体及其制备方法，以解决上述背景技术中的缺点。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
草鱼ATG12多克隆抗体，包括草鱼ATG12核苷酸序列与蛋白序列；
草鱼ATG12多克隆抗体制备方法，具体步骤如下：
(一)分析草鱼ATG12基因克隆及序列
1)提取草鱼肝脏总RNA
2)以步骤1)中获得的RNA为模板，反转录合成cDNA；
3)根据步骤2)中草鱼转录组测序获得的cDNA序列，设计一对引物：上游引物ATG12-MF：5＇-ATGTCTGACAACGCAGAA-3＇；下游引物ATG12-MR：5＇-TCATCCCCAGGCCTGGGA-3＇，扩增片段经回收、连接和转化，测序验证后，用Primer Premier 5.0软件设计巢式引物，3＇RACE引物为RC3-1：GTCAATCAGTCATTTGCTCCATCACC；RC3-2：GTGGGTGTGCTTTTTGAGTGTTTTGG，引物的Tm>64℃，3＇RACE PCR分两轮进行，5＇RACE PCR分三轮进行，5＇RACE引物为RC5-1：CCATTTTTTGGTCTTC；RC5-2：GTATCACCGACAGCCT；RC5-3：TCTTTTTCTTCTCATCCGA；而后对所得目的片段回收、连接和转化，将目的片段大小一致的阳性克隆接种于氨苄的LB液体培养液中，37℃培养过夜，吸1ml送测序，再将测序所得的序列进行拼接，再在NCBI进行BLAST，随后再采用Smart程序(http：//smart.embl-heidelberg.de/)对序列的信号肽和蛋白的结构域进行预测，用TMHMM Server v.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMH-MM/)对受体的跨膜结构域进行预测，克隆得到的基因和其它物种相对应氨基酸序列的比对用BioEdit和Clustal Omega(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clust-alo/)进行，系统进化树用MEGA7.0软件进行；
通过以上步骤，克隆得到草鱼ATG12的ORF序列，全长363bp，编码120个氨基酸的多肽，无跨膜结构，进化分析显示：草鱼ATG12与其他鱼类ATG12归为一支；
(二)构建ATG12/pGEX-4T-1原核表达载体
1)根据步骤(一)中获得的草鱼ATG12cDNA序列，设计一对引物：上游引物ATG12-F：5＇-GTTCCGCGTGGATCCCCGGAAATGTCTGACAACGCAGAATCTCCTA-3＇；下游引物ATG12-R：5＇-TCAGTCACGATGCGGCCGCTCTTACCCCCAGGCCTGGGACTT-3＇；以步骤(一)中合成的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物通过胶回收试剂盒对目的片段进行切胶回收；
2)将步骤1)中回收的目的片段与pMD-18T载体按照摩尔比3：1用Solution I连接酶，温度16℃、连接30min，连接产物转化大肠杆菌，而后筛选阳性菌落，进行PCR与双酶切鉴定，对两次鉴定后正确的质粒进行测序，获得ATG12/pMD-18T；
3)将步骤2)中测序正确的ATG12/pMD-18T采用BamH I和EcoR I进行双酶切，切胶纯化回收目的片段，纯化的目的片段与pGEX-4T-1载体以摩尔比3：1用T4 DNA连接酶，温度16℃、连接30min，连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性菌落，进行PCR和酶切鉴定，得ATG12/pGEX-4T-1重组质粒；
(三)ATG12融合蛋白的原核表达
将步骤(二)中重组质粒ATG12/pGEX-4T-1转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，温度37℃、220r/min振荡培养过夜；次日，按照体积1：100的比例接种至100ml新的含有氨苄青霉素培养基中，温度37℃、220r/min至OD600值为0.6-0.8时，按体积1：1000的比例加入总浓度为0.8mmol/L IPTG，温度37℃、220r/min、4h，诱导目的蛋白表达，收集诱导后含有目的蛋白表达的菌液，再在菌液中添加pH7.4、50mmol/L Tris-HCl缓冲液重悬后超声破碎，得超声破碎样品，对超声破碎样品离心得上清和沉淀，将沉淀纯化后得纯化后的ATG12融合蛋白，利用His单抗与纯化后的ATG12融合蛋白进行Western blot杂交鉴定；
(四)制备ATG12多克隆抗体
将纯化后的ATG12融合蛋白作为抗原与等体积的弗氏完全佐剂进行1：1充分混合乳化，在新西兰纯种大白兔双肩周围皮下进行多点注射，注射前取少量正常血清作为阴性对照，每间隔一定时间对新西兰纯种大白兔注射免疫，合计免疫4次后，对新西兰纯种大白兔进行心脏采血，分离血清，得到ATG12多克隆抗体。
在本发明中，步骤(一)的3)中，3＇RACE PCR以SMART cDNA为模板，使用基因特异引物和通用引物UPM进行第一轮扩增，反应条件为：94℃预变性4min，94℃30s，66℃30s，72℃1min，运行7个循环；然后以94℃30s，64℃30s，72℃1min，运行35个循环；72℃延伸10min，而后将第一轮PCR扩增产物稀释100倍后，取1μL用作第二轮扩增反应的模板，使用下游引物和UPM进行第二轮PCR反应，反应条件同上，扩增片段经回收、连接和转化并测序获得ATG12 3＇端序列；5＇RACE PCR分三轮进行，反应条件、步骤与3＇RACE PCR相同，得第二轮PCR产物后，再将第二轮PCR扩增产物稀释100倍后，使用下游引物和UPM进行第三轮PCR反应，反应条件同第一轮，扩增片段经回收、连接和转化并测序获得ATG12 5＇端序列。
在本发明中，步骤(三)中，对超声破碎样品离心的参数为：温度4℃，12000r/min，离心5min。
在本发明中，步骤(三)中，对新西兰纯种大白兔注射免疫的流程为：首次免疫10天后，以相同抗原与等体积的弗氏不完全佐剂1：1充分混合进行第2次免疫，之后每隔7-10天免疫1次，免疫3次后取少许血清检测免疫效果，经4次免疫10天后，对新西兰纯种大白兔进行心脏采血。
有益效果：本发明在克隆草鱼ATG12(gcATG12)基因序列的基础上，首次构建草鱼ATG12的原核表达载体，并最终制备了兔抗ATG12重组蛋白多克隆抗体，该抗体能够特异性识别草鱼ATG12蛋白，前瞻性高，为今后开展ATG12的功能研究奠定了基础。
附图说明
图1为本发明的最佳施例中的草鱼ATG12中间片段的扩增图。
图2为本发明的最佳施例中的草鱼ATG12 3＇RACE PCR扩增片段图。
图3为本发明的最佳施例中的草鱼ATG12 5＇RACE PCR扩增片段图。
图4为本发明的最佳实施例中的草鱼ATG12进化树分析示意图。
图5为本发明的最佳实施例中的草鱼ATG12(1-120aa)PCR产物电泳鉴定示意图。
图6为本发明的最佳实施例中的草鱼ATG12重组表达载体的构建结构图。
图7为本发明的最佳实施例中的草鱼ATG12重组蛋白的可溶性分析示意图。
图8为本发明的最佳实施例中的草鱼ATG12重组蛋白的纯化分析示意图。
图9为本发明的最佳实施例中的草鱼ATG12多克隆抗体特异性检测示意图。
附图标注：
图1中，1.中间扩增片段，2.DL2000Maker；
图2中，1.DL2000Maker；2.中间扩增片段；
图3中，1.DL2000Maker；2.中间扩增片段；
图4中，星号标注的为草鱼ATG12；
图7中，1.pGEX-4T-Atg12空载体诱导表达，2.0.4mg/mL BSA，3.Marker，4.上清，5.上清2(2M尿素溶解包涵体)，6.包涵体2倍稀释(8M尿素溶解包涵体)，7.包涵体5倍稀释(8M尿素溶解包涵体)，8.包涵体10倍稀释(8M尿素溶解包涵体)；
图8中，1.0.4mg/mL BSA，2.Marker，3.包涵体10倍稀释(8M尿素溶解包涵体)，4.包涵体20倍稀释(8M尿素溶解包涵体)，5.包涵体30倍稀释(8M尿素溶解包涵体)；
图9中，1，2，3和4泳道分别为10ng，5ng，1ng，500pg ATG12抗原；抗体稀释比例为1:1000。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
草鱼ATG12多克隆抗体制备方法，具体步骤如下：
(一)分析草鱼ATG12基因克隆及序列
1)提取草鱼肝脏总RNA
(1)从液氮中快速取出冻存的草鱼肝脏，进行液氮研磨，待研磨充分后，加入3mlTRIzol Reagent，待其快融化时，采用1.5ml EP管吸入，每管吸入1ml，置于冰上；
(2)在每管中加入20％氯仿(即1ml TRIzol Reagent加入0.2ml氯仿)，剧烈震荡15s，冰上静置3min可看到分层现象；
(3)温度4℃，12000g离心15min，EP管中液体分为三层，从上到下依次为水层、蛋白质层、有机层，而后吸取上清至新的1.5ml EP管中；
(4)向新的1.5ml EP管中加入0.5ml异丙醇，轻轻倒转EP管，冰上静置10min；
(5)将步骤(4)中的EP管离心，温度4℃，12000g离心10min，弃上清(不要连续倒转)；
(6)在步骤(5)的每管中分别加入1ml 75％乙醇(用DEPC水配制)，同时采用枪头轻轻吹起沉淀；
(7)对步骤(6)中的EP管离心，温度4℃，7500g离心5min，去上清；
(8)重复(6)、(7)步骤一次；
(9)在重复(6)、(7)步骤一次完毕的每个EP管中，分别加入15μl RNase-free水溶解RNA；
(10)采用2％琼脂糖凝胶电泳检测步骤(9)中所得RNA的完整度，通过核酸浓度测定仪测RNA的浓度，A260/A280显示其纯度，剩余RNA样品于-70℃放置待用；
2)合成第一链cDNA
首先从步骤1)中取1μL溶于水的RNA样品，稀释100倍在紫外分光光度计上检测RNA样品的纯度和浓度，再取2μg RNA置于离心管进行DNase I处理，按照下表1添加各组分：
表1去除基因组DNA污染配方表
组分 份数
RNA 2μg
10×DNase I Buffer 2μL
RNase抑制剂(40U/μL,Fermentas) 1μL
DNase I(RNase-free,1U/μL,Fermentas) 2μL
DEPC处理的水 up to 20μL
将进行DNase I处理后的反应液短暂离心，PCR仪上37℃运行30min，然后向置有RNA的离心管加入1μL 25mM EDTA，在65℃处理10min，立即置于冰上或者-80℃冻存；
参照Fermentas公司的RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(用于扩增cDNA中间片段和3′-RACE扩增)和Clontech公司SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(用于5′-RACE扩增)的方法合成cDNA；
并按下表2配制逆转录反应体系：
表2逆转录反应体系表
Figure GDA0002025573100000071
3)扩增ATG12序列
根据草鱼转录组测序获得的cDNA序列，设计简并引物(ATG12-MF和ATG12-MR)验证中间片段如图1所示(简并引物序列详见表3)，经测序验证后，利用Primer Premier 5.0软件设计巢式引物(巢式引物序列详见表3)，巢式引物的Tm>64℃，3＇RACE PCR分两轮进行：以SMART cDNA为模板，使用基因特异引物和通用引物UPM进行第一轮扩增，反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，66℃变性30s，72℃变性1min，运行7个循环；然后以94℃变性30s，64℃变性30s，72℃变性1min，运行35个循环；72℃条件下延伸10min，得第一轮PCR扩增产物，再将第一轮PCR扩增产物稀释100倍后，取1μL用作第二轮扩增反应的模板，使用下游引物和UPM进行第二轮PCR反应，反应条件同第一轮，扩增片段(如图2所示)经回收、连接和转化并测序获得ATG12 3＇端序列；5＇RACE PCR分三轮进行，反应条件、步骤与3＇RACE PCR相同，得第二轮PCR产物后，再将第二轮PCR扩增产物稀释100倍后，使用下游引物和UPM进行第三轮PCR反应，反应条件同第一轮，扩增片段(如图3所示)经回收、连接和转化并测序获得ATG12 5＇端序列；
表3基因克隆引物表
Figure GDA0002025573100000081
表4 PCR扩增反应液的配方表
组分 份数
Taq DNA聚合酶 0.1μL
dNTP 4μL
10×PCR反应缓冲液 5μL
MgCl<sub>2</sub>(25mmol/L) 4μL
正向引物(20mmol/L) 0.5μL
反向引物(20mmol/L) 0.5μL
模板 1μL
水 Up to 20μL
4)胶回收目的片段
对步骤3)中的目的片段PCR产物进行回收和纯化，按照如下步骤：
(1)在紫外灯下照胶，并尽可能迅速切下目的条带放置于新的已称重的1.5mlEP管中；
(2)对置有目的条带的EP管称重，以计算胶体的质量和体积(胶体的体积按照1ml/g计算)；
(3)按照1倍体积的凝胶体积加入Binding Buffer(XP2)并置于60℃水浴锅中孵育直至凝胶全部溶解，在溶解期间间隔2-3min轻轻混匀凝胶溶解液；
(4)将试剂盒中的DNA Mini Column与2ml Collection Tube配套放好；
(5)将步骤(3)中的凝胶溶解液转移至Mini Column中，室温、10000g离心1min；
(6)去除流出液并重复步骤(5)直至所有的凝胶溶解液都经Mini Column底部的滤膜离心过滤；
(7)向Mini Column中加入300μl Binding Buffer(XP2)，室温、13000g离心1min，去流出液；
(8)向Mini Column中加入700μl SPW Wash Buffer，室温、13000g离心1min，去流出液；
(9)重复步骤(8)一次；
(10)对执行完步骤(9)的Mini Column进行离心，室温、13000g离心2min，使空的Mini Column的滤膜尽量脱水；
(11)将步骤(10)中的Mini Column放置于新的1.5ml EP管中，再加入15-30μlElution Buffer于滤膜中央，室温、静置1min后，室温、13000g离心1min洗脱DNA；
(12)将步骤(11)中的1.5ml EP管于-20℃保存；
5)克隆与转化目的片段
(1)将步骤4)中所得目的片段于25℃连接30min，得连接产物；
(2)将连接产物加至50μl DH5α感受态(克隆菌)中，冰浴30min，得载体液；连接的反应体系如表5所示：
表5平末端载体连接试剂盒配方表
Figure GDA0002025573100000091
Figure GDA0002025573100000101
(3)将步骤(2)中反应后的载体液在温度42℃水浴热激90s，冰浴2min；
(4)待步骤(3)处理完毕后，在载体液中加入1ml新鲜LB培养液，温度37℃，200r/min振荡培养90min，得菌液；
(5)对步骤(4)所得菌液进行离心处理，4000g离心5min，去掉800μl上清得一次菌液，将一次菌液重新吹打悬起，并取100μl一次菌液涂布至含氨苄的LB固体培养基上，温度37℃培养过夜；
(6)挑取单克隆于10μl LB培养液中作为模板，通过菌落PCR检测插入的片段大小；
(7)将片段大小一致的阳性克隆接种于5ml含氨苄的LB液体培养液中，温度37℃培养过夜，吸1ml送测序；
6)分析序列
采用Smart程序(http：//smart.embl-heidelberg.de/)对步骤5)克隆的序列中信号肽和蛋白的结构域进行预测，采用TMHMM Server v.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMH-MM/)对受体的跨膜结构域进行预测，克隆得到的各基因与其它物种相对应氨基酸序列的比对用BioEdit和Clustal Omega(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clust-alo/)进行，系统进化树用MEGA 7.0软件进行；
通过以上步骤，克隆得到草鱼ATG12的ORF序列，全长363bp，编码120个氨基酸的多肽，无跨膜结构，进化分析显示：草鱼ATG12与其他鱼类ATG12归为一支(如图4所示)；
(二)草鱼ATG12原核表达及纯化
I)构建ATG12重组表达载体
①设计引物(上游引物ATG12-F：5＇-GTTCCGCGTGGATCCCCGGAAATGTCTGACAACGCAGAATCTCCTA-3＇；下游引物ATG12-R：5＇-TCAGTCACGATGCGGCCGCTCTTACCCCCAGGCCTGGGACTT-3＇
)以步骤(一)中所得的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物通过胶回收试剂盒对目的片段进行切胶回收，再将回收的目的片段与pMD-18T载体按照摩尔比3：1使用Solution I连接酶连接，温度16℃、连接30min，而后将连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性菌落，进行PCR和双酶切鉴定，对两次鉴定后正确的质粒进行测序，获得ATG12/pMD-18T和pGEX-4T-1；同时对测序正确的ATG12/pMD-18T和pGEX-4T-1分别采用BamH I和EcoR I进行双酶切，以切胶纯化回收目的片段；再将纯化的目的片段与pGEX-4T-1载体以摩尔比3：1使用T4 DNA连接酶连接，温度16℃、连接30min，而后将连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性菌落，进行PCR和酶切鉴定，得到ATG12/pGEX-4T-1重组质粒复苏转化有pGEX-4T-1表达载体的菌株，挑取单克隆扩大培养，进行质粒抽提，具体步骤如下：
m.室温1000g、1min离心收集步骤(一)克隆与转化目的片段中步骤7)的菌液；
n.向菌体沉淀中加入250μl Solution I，再通过枪头吹打重悬菌体；
o.向菌体中加入250μl SolutionII，轻轻颠倒混匀几次，直至细菌悬液变澄清；
p.再次向菌体加入350μl SolutionIII，轻轻颠倒混匀几次，直至出现白色絮状沉淀；
q.对步骤p)中白色絮状沉淀进行离心，室温、1000g离心10min；
r.尽可能地吸尽步骤q)的上清，并将上清转入于新的Hibind DNA结合柱；
s.对步骤r)中Hibind DNA结合柱进行离心，室温、10000g离心1min，去流出液；
t.向Hibind DNA结合柱中加入500μl Buffer HB进行离心，室温、10000g离心1min，去流出液；
u.向Hibind DNA结合柱中加入700μl Wash Buffer进行离心，室温、10000g离心1min，去流出液；
v.重复步骤u)一次；
w.对执行完步骤v)的Hibind DNA结合柱进行离心，室温、13000g离心2min，使空的Mini Column的滤膜尽量脱水；
x.将执行完步骤w)的Hibind DNA结合柱置于新的1.5ml EP管中，加入15-30μlElution Buffer于滤膜中央，室温、静置1min后，室温13000g离心1min洗脱DNA；
m.将置有Hibind DNA结合柱的1.5ml EP管于-20℃保存；
②双酶切目的片段和表达载体
a.将步骤①)中胶回收的目的片段和提取的表达载体按表6的体系加样；
b.待步骤a)中体系混匀后，瞬时离心，温度37℃、酶切2h；
c.胶回收酶切后的目的片段和表达载体；
表6酶切体系表
组分 份数
ATG12表达片段(pGEX-4T-1载体) 12μL
BamH I 2μL
EcoR I 2μL
酶切缓冲液 4μL
灭菌双蒸水 20μL
③构建重组表达载体
a.将步骤II)双酶切后回收的目的片段和表达载体按表7体系加样；
b.并在温度16℃、用T4连接酶连接过夜；
c.将连接产物转化到表达菌BL21的感受态细胞中；
d.通过菌落PCR法鉴定阳性克隆，并进行测序；
表7重组表达载体的连接体系表
组分 份数
ATG12表达片段 6μL
pGEX-4T-1载体 2μL
10×T4 ligase buffer 1μL
T4连接酶 1μL
II)ATG12重组蛋白表达条件的优化和可溶性分析
i)诱导表达ATG12重组蛋白
a.将步骤I)中测序正确的重组蛋白表达菌株接种至新的含Amp LB液体培养液中生成一次菌液，温度37℃、200r/min振荡培养过夜；
b.将培养过夜的一次菌液按照1∶50比例接种至新鲜的LB培养液中生成二次菌液，温度37℃、200r/min振荡培养至OD600为0.6-0.8；
c.在二次菌液中添加IPTG至终浓度为1mM，温度30℃、200r/min振荡培养6h；
d.从步骤c)的二次菌液中取1ml菌液进行离心，室温、4000r/min离心5min，去掉上清，得二次菌沉物；
e.在二次菌沉物中以100μl双蒸水重悬，按照1∶4的体积比(μl)与5×SDS-PAGELoading Buffer混匀，水浴煮沸5min，制成ATG12重组蛋白样品；
f.将ATG12重组蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，以检测ATG12重组蛋白是否表达，由pGEX-4T-1的表达菌株诱导组作为对照；
ii)优化ATG12重组蛋白表达条件
经反复实验，大量诱导表达的条件为温度37℃、0.8Mm IPTG诱导4h；
iii)重组蛋白可溶性分析
a.采用步骤ii)优化条件，诱导ATG12重组蛋白表达，离心收集菌体；
b.在步骤a)中按原始菌液体积50∶1比例(μl)加入PBS重悬后离心，温度4℃、10000g离心3min，去上清，得菌体悬沉物；
c.在菌体悬沉物中加入等量的Lysis buffer重悬菌体，超声破碎(超声破碎条件为200W，超声5s，间隔8s，超声15min，3个循环)；
d.超声结束后，温度4℃、8000g离心15min，分别收集上清和沉淀；
e.通过SDS-PAGE对步骤d)收集的沉淀进行检测，以检测ATG12重组蛋白的可溶性；
最终SDS-PAGE分析表明，ATG12重组蛋白以可溶性形式存在于包涵体中；
vi)纯化ATG12重组蛋白
(1)将含重组表达载体的E.coli Rosetta菌扩大培养至1000ml，温度37℃、200r/min振荡培养至OD600为0.6～0.8，得一次重组菌液，在重组菌液中添加IPTG至步骤ii)优化的最优终浓度，温度37℃、200r/min培养适当时间，得二次重组菌液；
(2)对二次重组菌液离心，温度4℃、1000g离心1min，收集全部菌体，得三次重组菌液；
(3)在三次重组菌液中加入50ml 0.01mM PBS重悬菌体离心，温度4℃、1000g离心10min，去上清，得四次重组菌液；
(4)在四次重组菌液中加入50ml Lysis buffer重悬菌体，超声破碎，温度4℃、1000g离心10min，收集上清；
(5)通过Wash buffer和含不同浓度咪唑的Elution buffer依次对镍柱进行洗涤并收集流出液，并通过SDS-PAGE检测镍柱洗脱效果；
(6)纯化的蛋白液在PBS中透析过夜后，用超滤离心管进行浓缩，浓缩液-80℃保存；
最终ATG12重组蛋白经镍柱纯化后，得到较纯的单一目的条带；
(三)制备草鱼ATG12多克隆抗体
1)ATG12多克隆抗体制备
(1)将从湖北省实验动物中心购买的两只新西兰雄兔在无菌动物房适应、饲养2周；
(2)取约2mg ATG12重组蛋白，加入PBS至2ml，再加入2ml弗氏完全佐剂，反复推拉共轭注射器使ATG12重组蛋白乳化；
(3)采用无菌注射器吸取已与弗氏完全佐剂乳化的ATG12重组蛋白，对新西兰雄兔分多个位点进行皮下注射(注射位点需先用75％酒精棉消毒)，注射剂量为1ml/只；
(4)两周后，进行加强免疫，以初始免疫一半的ATG12重组蛋白量与等量的弗氏不完全佐剂乳化混匀后，对新西兰雄兔进行皮下注射，加强免疫共3次，每次间隔时间均为2周；
(5)最后一次加强免疫7天后，对免疫新西兰雄兔进行颈动脉采血，室温静置2h，温度4℃、过夜后离心，温度4℃、4000r/min离心30min，吸取上层血清，温度56℃、处理30min以灭活补体，而后采用proteinA柱子进行纯化得ATG12重组蛋白抗原，分装后-20℃保存(首免之前采血作为阴性对照)；
2)ELISA测定多抗效价
(1)用包被液稀释纯化的ATG12重组蛋白抗原至20μg/ml，在96孔酶标板中每孔加入100μl，温度4℃过夜包被；
(2)拍干酶标板孔中的液体，再在酶标板中加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；
(3)在执行完步骤(2)的酶标板孔中分别加入200μl封闭液，室温封闭1h；
(4)弃去酶标板孔中的封闭液，拍干，再在酶标板中加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；
(5)将多克隆抗体与PBS按照体积1∶10比例(μl)进行连续的梯度稀释，在酶标板孔中分别加入100μl，设置3个平行，以PBS作为阴性对照组，温度37℃、孵育2h；
(6)弃去酶标板孔中一抗，拍干，再在酶标板中加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；
(7)在酶标板孔中分别加入100μl稀释的二抗，避光，温度37℃、孵育2h；
(8)弃去酶标板孔中二抗，拍干，再在酶标板中加入200μl洗涤液，振荡洗涤3次，每次3min，弃去，拍干；
(9)配制新鲜底物液，在执行完步骤(8)的酶标板孔中分别加入100μl，避光，温度37℃、孵育20min，生成ATG12多克隆抗体；
(10)再在步骤(9)的酶标板孔中分别加入50μl终止液，用酶标仪检测450nm波长时各孔的吸光度值，标准为P/N≥2.1或P≥N+3D；
最终经ELISA检测，ATG12多克隆抗体的效价为1∶512000，此效价较高，如表8所示，可以满足后续免疫组化实验的需求；
表8草鱼ATG12抗血清的ELISA检测结果
Figure GDA0002025573100000151
Figure GDA0002025573100000161
3)Western blotting检测多抗特异性
A、为检测制备的ATG12多克隆抗体是否能够识别天然蛋白，提取草鱼肝脏的总蛋白进行western blotting实验，草鱼采用MS222进行麻醉后，取其肝脏组织快速置于新的1.5ml EP管中，于液氮中保存，用于进行后续的总蛋白提取，具体步骤如下：
a.1提取草鱼肝脏组织总蛋白
a.11液氮环境下充分研磨草鱼肝脏组织直至成为匀浆状；
a.12向研磨充分的草鱼肝脏组织中加入组织裂解液，冰浴30min(裂解液实验前加入PMSF至终浓度为1mM)，形成裂解样品；
a.13通过超声破碎仪对裂解样品进行超声破碎(程序为超声破碎5是，间隔10s，2次)；
a.14对步骤a.13)破碎的裂解样品离心，温度4℃、14000r/min、离心15min后，吸取上清，-80℃保存；
B、检测多抗的特异性
b.1将步骤A)获得的上清经SDS-PAGE电泳后，通过凝胶按照点样泳道切割成适当大小浸泡在转膜缓冲液中；
b.2将PVDF膜裁剪成与凝胶大小相匹配，浸泡在转膜缓冲液中；
b.3按照黑板(负极)、泡沫垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、泡沫垫、白板(正极)的顺序固定凝胶和PVDF膜(注意排除气泡)组成转印装置；
b.4将转印装置放入转印槽中，加入转膜缓冲液，100V转膜23min；
b.5转膜结束后，取下PVDF膜，加入10％脱脂奶粉，室温封闭1h；
b.6加入适当一抗(即制备的ATG12多克隆抗体)，温度4℃、孵育过夜；
b.7弃去一抗，采用PBST洗涤3次，每次5min；
b.8待步骤b.7)执行完毕后，再加入用10％脱脂奶粉稀释的二抗，室温、孵育1h；
b.9弃去二抗，采用PBST洗涤3次，每次5min；
b.10采用化学发光法进行显示拍照；
通过western blotting检测ATG12多克隆抗体的特异性，该多克隆抗体能特异性的识别重组蛋白(约为45kDa)。
Figure IDA0002025573130000011

Claims (4)

1.草鱼ATG12多克隆抗体制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(一)分析草鱼ATG12基因克隆及序列
1)提取草鱼肝脏总RNA
2)以步骤1)中获得的RNA为模板，反转录合成cDNA；
3)根据步骤2)中草鱼转录组测序获得的cDNA序列，设计一对引物：上游引物ATG12-MF：5＇-ATGTCTGACAACGCAGAA-3＇；下游引物ATG12-MR：5＇-TCATCCCCAGGCCTGGGA-3＇，扩增片段经回收、连接和转化，测序验证后，用Primer Premier5.0软件设计巢式引物，3＇RACE引物为RC3-1：GTCAATCAGTCATTTGCTCCATCACC；RC3-2：GTGGGTGTGCTTTTTGAGTGTTTTGG，引物的Tm>64℃，3＇RACE PCR分两轮进行，5＇RACE PCR分三轮进行，5＇RACE引物为RC5-1：CCATTTTTTGGTCTTC；RC5-2：GTATCACCGACAGCCT；RC5-3：TCTTTTTCTTCTCATCCGA；而后对所得目的片段回收、连接和转化，将目的片段大小一致的阳性克隆接种于氨苄的LB液体培养液中，37℃培养过夜，吸1ml送测序，再将测序所得的序列进行拼接，再在NCBI进行BLAST，得到草鱼ATG12cDNA序列；
(二)构建ATG12/pGEX-4T-1原核表达载体
1)根据步骤(一)中获得的草鱼ATG12cDNA序列，设计一对引物：上游引物ATG12-F：5＇-GTTCCGCGTGGATCCCCGGAAATGTCTGACAACGCAGAATCTCCTA-3＇；下游引物ATG12-R：5＇-TCAGTCACGATGCGGCCGCTCTTACCCCCAGGCCTGGGACTT-3＇；以步骤(一)中合成的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物通过胶回收试剂盒对目的片段进行切胶回收；
2)将步骤1)中回收的目的片段与pMD-18T载体按照摩尔比3：1用Solution I连接酶，温度16℃、连接30min，连接产物转化大肠杆菌，而后筛选阳性菌落，进行PCR与双酶切鉴定，对两次鉴定后正确的质粒进行测序，获得ATG12/pMD-18T；
3)将步骤2)中测序正确的ATG12/pMD-18T采用BamH I和EcoR I进行双酶切，切胶纯化回收目的片段，纯化的目的片段与pGEX-4T-1载体以摩尔比3：1用T4 DNA连接酶，温度16℃、连接30min，连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性菌落，进行PCR和酶切鉴定，得ATG12/pGEX-4T-1重组质粒；
(三)ATG12融合蛋白的原核表达
将步骤(二)中重组质粒ATG12/pGEX-4T-1转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，温度37℃、220r/min振荡培养过夜；次日，按照体积1：100的比例接种至100ml新的含有氨苄青霉素培养基中，温度37℃、220r/min至OD600值为0.6-0.8时，按体积1：1000的比例加入总浓度为0.8mmol/L IPTG，温度37℃、220r/min、4h，诱导目的蛋白表达，收集诱导后含有目的蛋白表达的菌液，再在菌液中添加pH7.4、50mmol/L Tris-HCl缓冲液重悬后超声破碎，得超声破碎样品，对超声破碎样品离心得上清和沉淀，将沉淀纯化后得纯化后的ATG12融合蛋白，利用His单抗与纯化后的ATG12融合蛋白进行Western blot杂交鉴定；
(四)制备ATG12多克隆抗体
将纯化后的ATG12融合蛋白作为抗原与等体积的弗氏完全佐剂进行1：1充分混合乳化，在新西兰纯种大白兔双肩周围皮下进行多点注射，注射前取少量正常血清作为阴性对照，每间隔一定时间对新西兰纯种大白兔注射免疫，合计免疫4次后，对新西兰纯种大白兔进行心脏采血，分离血清，得到ATG12多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的草鱼ATG12多克隆抗体制备方法，其特征在于，步骤(一)的3)中，3＇RACE PCR以SMART cDNA为模板，使用基因特异引物和通用引物UPM进行第一轮扩增，反应条件为：94℃预变性4min，94℃ 30s，66℃ 30s，72℃ 1min，运行7个循环；然后以94℃30s，64℃ 30s，72℃ 1min，运行35个循环；72℃延伸10min，而后将第一轮PCR扩增产物稀释100倍后，取1μL用作第二轮扩增反应的模板，使用下游引物和UPM进行第二轮PCR反应，反应条件同上，扩增片段经回收、连接和转化并测序获得ATG12 3＇端序列；5＇RACE PCR分三轮进行，反应条件、步骤与3＇RACE PCR相同，得第二轮PCR产物后，再将第二轮PCR扩增产物稀释100倍后，使用下游引物和UPM进行第三轮PCR反应，反应条件同第一轮，扩增片段经回收、连接和转化并测序获得ATG12 5＇端序列。
3.根据权利要求1所述的草鱼ATG12多克隆抗体制备方法，其特征在于，步骤(三)中，对超声破碎样品离心的参数为：温度4℃，12000r/min，离心5min。
4.根据权利要求1所述的草鱼ATG12多克隆抗体制备方法，其特征在于，步骤(四)中，对新西兰纯种大白兔注射免疫的流程为：首次免疫10天后，以相同抗原与等体积的弗氏不完全佐剂1：1充分混合进行第2次免疫，之后每隔7-10天免疫1次，免疫3次后取少许血清检测免疫效果，经4次免疫10天后，对新西兰纯种大白兔进行心脏采血。
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