CN111909949B

CN111909949B - 一种球形孢子丝菌hsp70_5重组蛋白的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN111909949B
Application number: CN202010912922.5A
Authority: CN
Inventors: 李珊山; 崔岩; 周俊峰; 尹焕才; 田晶晶
Original assignee: First Hospital Jinlin University
Current assignee: First Hospital Jinlin University
Priority date: 2020-09-03
Filing date: 2020-09-03
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2040-09-03
Also published as: CN111909949A

Abstract

本发明公开了一种球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白的制备方法及其应用，通过提取球形孢子丝菌总RNA，利用反转录PCR获得cDNA，利用特异性引物扩增得到球形孢子丝菌热休克蛋白70(HSP70)异构体5基因全长序列，运用分子生物学方法进行基因片段的体外重组并制备基因片段对应的重组蛋白，将该重组蛋白应用于家兔可制备出相应的抗体，该抗体可用于制备对球形孢子丝菌感染早期快速诊断产品。本发明构建了球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白原核表达体系，通过诱导可以快速大量表达；利用Ni亲和层析柱一步完成纯化，纯化过程简单快捷；免疫动物制备高效价多克隆抗体，所制备的抗体与目的蛋白具有良好的反应特异性。

Description

一种球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及重组蛋白制备领域。更具体地说，本发明涉及一种球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白的制备方法及其应用。

背景技术

孢子丝菌病(sporotrichosis)是由双相型暗色真菌申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii sensu lato，下文简称Ss.)感染引起的最常见的深部真菌病。Ss.在环境中为菌丝相，寄生或腐生于植物或土壤中；而感染机体后，病灶中为酵母相。Ss.感染可形成难以自愈的慢性感染，不仅累及皮肤，也可通过淋巴管途径感染脏器，发生播散的、系统的致命性感染。我国东北三省是该病全球流行最为严重的地区之一。

早期人们认为申克孢子丝菌为单一物种，但随着研究的深入，Marimon等将Ss.确定为6个种的复合体，包括狭义申克孢子丝菌(S.schenckii sensu stricto)、球形孢子丝菌(S.globosa)、巴西孢子丝菌(S.brasilienis)、卢艾里孢子丝菌(S.luriei,formlynamed S.var.luriei)、墨西哥孢子丝菌(S.mexicana)和苍白球孢子丝菌(S.pallida,synonymy S.albicans)，其中，球形孢子丝菌(呈全球性分布)、申克孢子丝菌(主要分布于美国、阿根廷、巴西、秘鲁等美洲国家)和巴西孢子丝菌(主要分布于巴西地区)为常见致病菌。对于我国流行的菌株，绝大多数基因分型研究发现基本上均为球形孢子丝菌。

目前该病的诊断主要依靠皮肤组织病理检查和真菌培养的联合应用。病理检查需经过标本固定、包埋、制片、染色等数个耗时步骤，患者需等待5-7天，方可得到结果，然而如病理切片并未显示星状体、阳性孢子等典型的病理改变，尚无法诊断该病，则需联合真菌培养进行诊断。真菌培养同样需以病变组织为样品，而培养结果需等待7-14天，耗时更长，同时真菌生长受环境影响程度较大，当环境温度、湿度等各方面不适宜时，则不易生长，因此阳性率无法达到我们所需求的理想程度。另外，上述两种方法均为有创检查，术后伤口愈合会遗留疤痕，对于儿童患者及面部感染患者并非理想的检测手段。如上所述，真菌培养和病理诊断均耗时较长，并且医疗机构需具备较高的实验条件和专业的技术人员，在基层医院无法开展，只能凭借医生的临床经验予以治疗。目前的研究表明，孢子丝菌感染人体或动物后，其抗原可刺激机体产生抗体，此种抗原-抗体反应可作为开发体外诊断试剂的依据。

发明内容

针对上述问题，本发明的一个目的是提供一种球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白的制备方法及其应用。本发明旨在通过提取球形孢子丝菌总RNA，利用反转录PCR获得cDNA，利用特异性引物扩增得到球形孢子丝菌热休克蛋白70(HSP70)异构体5基因全长序列，运用分子生物学方法进行基因片段的体外重组并制备基因片段对应的重组蛋白，将该重组蛋白应用于家兔可制备出相应的抗体，该抗体可用于制备对球形孢子丝菌感染早期快速诊断产品。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，本发明提供了一种球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白的制备方法，其包括以下步骤：

S1：人工合成球形孢子丝菌HSP70_5基因序列，并在其中引入Nde I酶切位点、HindIII酶切位点、His标签和终止子；

S2：对S1中人工合成的球形孢子丝菌HSP70_5基因序列进行验证，以判断合成的基因序列是否为预期序列；

S3：将球形孢子丝菌HSP70_5基因序列与pET-30a质粒进行连接反应，构建出表达质粒；

S4：对所述表达质粒进行扩增；

S5：对S4扩增后的质粒进行诱导表达；

S6：对S5诱导表达后的产物进行纯化，得到球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白。

优选的是，所述的球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白的制备方法，其中，S2中对人工合成的球形孢子丝菌HSP70_5基因序列进行验证的方法为：

以pUC57质粒为载体，制得重组质粒pUC57/HSP70_5；

于含有Amp(磷酸腺苷)的LB培养基的琼脂平板挑取含质粒pUC57/HSP70_5的DH5α单菌落，接种于含有Amp的LB液体培养基，在37℃下200rpm培养过夜；按照全式金质粒提取试剂盒的说明书操作提取质粒；加入pH8.0的TE缓冲液溶解沉淀；紫外分光光度计测吸光度A值，计算质粒浓度；对获得的质粒进行双酶切，双酶切体系如下：

30℃酶切3h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用全式金凝胶回收试剂盒回收DNA片段；

根据球形孢子丝菌HSP70_5基因序列设计引物，上游引物为5’-CATATGGTAATAGGGATAGATCTA-3’；下游引物为5’-AAGCTTTCATTAGTGGTGGTGGTG-3’；对DNA片段扩增，扩增后的产物进行测序，确定人工合成的球形孢子丝菌HSP70_5基因序列是否为预期序列。

优选的是，所述的球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白的制备方法，其中，S3中连接反应具体为：

pET-30a质粒经Nde I和Hind III双酶切回收载体片段，随后与球形孢子丝菌HSP70_5基因序列进行连接反应，条件如下：

加水至终体积为25u1，混匀，16℃反应过夜，反应结束加入乙酸钠、冷无水乙醇，-20℃放置60min；离心收集沉淀，用70％的冷乙醇沉淀，真空干燥，TE缓冲液溶解，得到表达质粒。

优选的是，所述的球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白的制备方法，其中，S4中，对所述表达质粒进行扩增，具体为：

从37℃培养20h的LB平板中挑取大肠杆菌E.coli DH5α单个菌落，转入烧瓶中，于37℃，220rpm，震荡培养3h；

随后转至用冰预冷的离心管中，置于冰上直至培养物冷却到0℃；

4℃，4000rpm离心10min，回收细胞；

以冰预冷的CaCl₂重悬沉淀，置于冰上；取上述细胞，加入S3得到的表达质粒，轻搅混匀，冰浴30min；42℃水浴90s，置冰浴上1min；加入LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养45min；取培养液涂布于含100μg/mL青霉素的LB固体培养基，37℃培养；

挑取单个菌落接种于含100μg/mL青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡过夜；提取质粒进行双酶切鉴定，得到重组质粒。

优选的是，所述的球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白的制备方法，其中，S5中，对S4扩增后的质粒进行诱导表达，具体为：

将经过双酶切鉴定的重组质粒转化至大肠杆菌BL21菌株，制得带有重组质粒的宿主菌BL21；

挑取单菌落，接种于含Amp浓度100μg/mL，2×YT液体培养基中，200rpm 37℃培养至OD600为0.6；然后将带有重组质粒的宿主菌BL21，按1％的浓度接种2×YT培养基，Amp浓度100μg/mL；按上述方法扩大培养至1L，37℃振荡培养至菌液的OD600为1.0，接IPTG至终浓度为0.8mM。

优选的是，所述的球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白的制备方法，其中，S6中，对S5诱导表达后的产物进行纯化，具体为：

将诱导表达后的产物离心，收集菌体，按每毫升培养物加入25μL去离子水的比例重悬细胞；

在细胞悬液中加入溶菌酶至终浓度100μg/mL，室温放置15min；

按每毫升培养物25μL的比例加入预冷的2×PBS，随后进行超声破碎，破碎后加入20％Triton X-100至1％终浓度，混匀，放置30min；12000rpm离心10min，取上清；

利用Ni-Sepharose亲和层析柱，分离纯化得到球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白。

一种如上任一项所述的球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白在制备抗体中的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

1、本案构建了球形孢子丝菌HSP70_5蛋白原核表达体系，通过诱导可以快速大量表达；

2、该融合蛋白具有His标签，可利用Ni亲和层析柱一步完成纯化，纯化过程简单快捷；

3、免疫动物制备高效价多克隆抗体，所制备的抗体与目的蛋白具有良好的反应特异性。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为质粒构建示意图。

图2为球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白表达纯化SDS-PAGE电泳结果图。

图3为球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白表达纯化Western blot结果图。

图4为球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白多克隆抗体Western blot检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1

一、目的基因的获取

根据球形孢子丝菌HSP70_5基因序列，委托基因合成公司(金斯瑞)人工合成球形孢子丝菌HSP70_5基因序列，并在其下游引入His标签和终止子；上游、下游分别引入Nde I和Hind III酶切位点(Nde I酶切位点-ATG-Heat shock 70kDa protein 5Sporothrixglobosa pro-His标签-终止子(TAATGA)-Hind III酶切位点)；合成后的重组质粒命名为pUC57/HSP70_5。

对人工合成的球形孢子丝菌HSP70_5基因序列进行验证：

于LB(含Amp 100μg/mL)的琼脂平板挑取含质粒pUC57/HSP70_5的DH5α单菌落，接种于5m LB(Amp 100μg/mL)液体培养基，37℃200rpm培养过夜。按照全式金质粒提取试剂盒的说明书操作提取质粒。加入30μL的TE(pH8.0)溶液溶解沉淀。紫外分光光度计测吸光度A值，计算质粒浓度。对获得的质粒进行双酶切(Nde I和Hind III)，酶切体系如下：

30℃酶切3h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用全式金凝胶回收试剂盒回收DNA片段，备用。

根据球形孢子丝菌HSP70_5基因设计引物，(上游引物5’-CATATGGTAATAGGGATAGATCTA-3’；下游引物5’-AAGCTTTCATTAGTGGTGGTGGTG-3’)，对一部分DNA片段扩增，扩增后的产物进行测序，确定人工合成的基因序列为球形孢子丝菌热休克蛋白70基因片段，后期备用。

二、表达质粒的构建

表达质粒pET-30a(+)经Nde I和Hind III双酶切回收热休克蛋白70基因片段(反应条件同上)，同HSP70_5基因进行连接反应，条件如下：

加水至终体积为25u1，轻弹管底，使之混匀，16℃反应过夜，反应结束加入2.5μL(1/10)体积的3M乙酸钠(pH5.2)，2.5倍体积的冷无水乙醇，-20℃放置60min。离心收集沉淀，用70﹪的冷乙醇沉淀，真空干燥，25μL TE溶解。

三、表达质粒的扩增

从37℃培养20h的LB平板中挑取E.coli DH5α单个菌落，转入到含100mL的1L烧瓶中，于37℃，220rpm，震荡培养3h。转至一个用冰预冷的50mL离心管中，冰上放置10min，至培养物冷却到0℃。4℃，4 000rpm离心10min，回收细胞。以10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，置于冰上。取200μL上述感受态细胞，加入4μL连接产物，轻搅混匀，冰浴30min。42℃水浴90s，迅速置冰浴上1min。加入800μL液体LB培养基，37℃，200rpm振荡培养45min。取200μL培养液涂布于LB固体培养基(含100μg/mL青霉素)，37℃培养。

随机挑取单个菌落接种于3mL LB液体培养基中(含100μg/mL青霉素)，于37℃，200rpm振荡过夜。按照上述方法提取质粒并进行双酶切鉴定。

四、重组菌株的诱导表达

经过双酶切鉴定的质粒转化至大肠杆菌BL21菌株，方法同上。相同条件下以空质粒pET-30a(+)作为对照检测感受态细胞。

从平板上挑取单菌落，接种于含100mL，Amp浓度100μg/mL，2×YT液体培养基中，200rpm 37℃培养至OD600约为0.6左右。然后将带有重组质粒的宿主菌BL21，按1％的浓度接种3mL 2×YT培养基，Amp浓度100μg/mL。按上述方法扩大培养至1L。37℃振荡培养至菌液的OD600为1.0左右，接IPTG至终浓度为0.8mM。

五、表达产物的纯化

将诱导表达后的培养物离心，收集菌体，按每毫升培养物加入25μL去离子水的比例重悬细胞。在细胞悬液中加入溶菌酶至终浓度100μg/mL，室温放置15min。然后按每毫升培养物25μL的比例加入预冷的2×PBS。按破碎体积选择合适的超声波探头，进行超声破碎。破碎后加入20％Triton X-100至1％终浓度，混匀，放置30min。12 000rpm离心10min，取上清。

利用Ni-Sepharose亲和层析柱，分离和纯化目的蛋白，收集洗脱液。通过SDS-PAGE和Western blot方法观察收集的球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白。具体参见图2和图3，图2中，M1:蛋白Marker；泳道1:牛血清白蛋白(5.00μg)；泳道2:球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白(5.00μg)；图3中，M2:蛋白Marker；泳道3:球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白；由图2和图3可知，在70kd附近有单一蛋白条带，表明利用上述该方法可以成功表达HSP70_5重组蛋白，而且获得的蛋白为单一组分。

球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白的序列为：

MVIGIDLGTTYSCVGVMQKGKVEILVNDQGNRITPSYVAFTDDERLVGDAAKNQAASNPENTIFDIKRLIGRKYSEKDVQNDIKHFPYKVVNKDDKPFVRVDVKGSEKTFSPEEVSSMILAKMKEVAEGYLGKKVTHAVVTVPAYFNDNQRQATKDAGIIAGLNVLRIVNEPTAAAIAYGLDKTDGERQIIVYDLGGGTFDVSLLSIDQGVFEVLATAGDTHLGGEDFDQRIINHLAKQFNKKHSVDVTADKKAMGKLKREAEKAKRTLSSQMSTRIEIESFFDGKDLSDTLTRAKFEELNVDLFKKTLKPVEQVLKDAKVSKGEIDDIVLVGGSTRIPKVISLLEEFFGGKKASKGINPDEAVAFGAAVQAGVLSGEEGTDDIVLMDVNPLTLGIETTGGVMTKLIPRNTPIPTRKSQIFSTAADNQPVVLIQVFEGERSMTKDNNILGKFELTGIPPAPRGVPQIEVSFELDANGILKVSAHDKGTGKSESITITNDKGRLTQEEIDRMVAEAEKYAEEDKATRERIEARNGLENYAFSLKNQVNDEDGLGGKISEEDKETIIEAVKEAQEWLDENAATAELEDFEEQKEKLSNVAYPITSKMYSQGGDADEEPLDHDELHHHHHH。

六、动物免疫血清及抗体的获得

将重组表达的球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化后对新西兰兔进行皮下多点注射，再次免疫改用弗氏不完全佐剂；第三次免疫后，每隔一周取耳动脉血测定抗血清效价，当免疫效价不再升高时，颈动脉放血，分离血清。

抗血清一次用50％和33％饱和硫酸铵盐析，再用琼脂糖凝胶Protein A亲和层析，获得高纯度的多克隆抗体，最后用SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定。

七、目的蛋白的免疫原性及抗体效价的测定

利用ELISA法检测抗体效价，首先将目的蛋白溶于PBS(pH7.4)，包被至96孔板，浓度为4μg/ml，每孔100μL，过夜孵育。次日分别加入经倍比稀释的纯化抗体(抗体浓度：1000ng/mL-1.95ng/mL)。未免疫兔血清作为阴性对照。二抗为Anti-Rabbit IgG FcMonoclonal Secondary Antibody。通过HRP显色，实验结束后，测定OD450。表1为ELISA检测球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白多克隆抗体效价结果比对表。由表1可以看出，当抗体稀释倍数达到1:512000时，仍能检测出抗原，表明了HSP70_5重组蛋白的特异性抗体具有较高的效价。

表1

利用Western blot法检测目的蛋白的免疫原性。将目的蛋白分别以终含量为100ng、50ng、10ng的量进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后将纯化后的抗体以1ug/mL浓度进行孵育，以羊抗兔IgG抗体作为二抗。参见图4，图4中，泳道1,4,5：球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白100ng；泳道2：球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白50ng；泳道3：球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白10ng；泳道1-3：纯化后抗体作为一抗；泳道4：未免疫血清；泳道5：PBS空白对照。由图4可知，光密度随着HSP70_5重组蛋白的浓度降低而降低，抗体与HSP70_5重组蛋白具有线性关系，表明HSP70_5重组蛋白具有免疫原性。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

序列表

<110> 吉林大学第一医院

<120> 一种球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白的制备方法及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catatggtaa tagggataga tcta 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagctttcat tagtggtggt ggtg 24

<210> 3

<211> 416

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

mvgdgttysc vgvmkgkvvn dgnrtsyvat ddrvgdaakn aasnntdkrg rkyskdvndk 60

hykvvnkddk vrvdvkgskt svssmakmkv agygkkvtha vvtvayndnr atkdagagnv 120

rvntaaaayg dktdgrvydg ggtdvssdgv vatagdthgg ddrnhaknkk hsvdvtadkk 180

amgkkrakak rtssmstrsd gkdsdttrak nvdkktkvvk dakvskgddv vggstrkvsg 240

gkkaskgnda vagaavagvs ggtddvmdvn tgttggvmtk rnttrkssta adnvvvgrsm 300

tkdnngktga rgvvsdangk vsahdkgtgk ssttndkgrt drmvaakyad katrrarngn 360

yasknvnddg ggksdktavk awdnaatadk ksnvaytskm ysggdaddhd hhhhhh 416

Claims

1.一种球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：人工合成球形孢子丝菌HSP70_5基因序列，并在其中引入Nde I酶切位点、Hind III酶切位点、His标签和终止子；

S4：对所述表达质粒进行扩增；

S5：对S4扩增后的质粒进行诱导表达；

S6：对S5诱导表达后的产物进行纯化，得到球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白；

S2中对人工合成的球形孢子丝菌HSP70_5基因序列进行验证的方法为：

以pUC57质粒为载体，制得重组质粒pUC57/HSP70_5；

于含有Amp的LB培养基的琼脂平板挑取含质粒pUC57/HSP70_5的DH5α单菌落，接种于含有Amp的LB液体培养基，在37℃下200rpm培养过夜；按照全式金质粒提取试剂盒的说明书操作提取质粒；加入pH8.0的TE缓冲液溶解沉淀；紫外分光光度计测吸光度A值，计算质粒浓度；对获得的质粒进行双酶切，双酶切体系如下：

根据球形孢子丝菌HSP70_5基因序列设计引物，上游引物为5’-CATATGGTAATAGGGATAGATCTA-3’；下游引物为5’-AAGCTTTCATTAGTGGTGGTGGTG-3’；对DNA片段扩增，扩增后的产物进行测序，确定人工合成的球形孢子丝菌HSP70_5基因序列是否为预期序列；

所述球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白的序列为：

2.如权利要求1所述的球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白的制备方法，其特征在于，S3中连接反应具体为：

3.如权利要求1所述的球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白的制备方法，其特征在于，S4中，对所述表达质粒进行扩增，具体为：

4℃，4000rpm离心10min，回收细胞；

4.如权利要求3所述的球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白的制备方法，其特征在于，S5中，对S4扩增后的质粒进行诱导表达，具体为：

挑取单菌落，接种于含Amp浓度100μg/mL，2×YT液体培养基中，200rpm37℃培养至OD600为0.6；然后将带有重组质粒的宿主菌BL21，按1％的浓度接种2×YT培养基，Amp浓度100μg/mL；按上述方法扩大培养至1L，37℃振荡培养至菌液的OD600为1.0，接IPTG至终浓度为0.8mM。

5.如权利要求1所述的球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白的制备方法，其特征在于，S6中，对S5诱导表达后的产物进行纯化，具体为：

在细胞悬液中加入溶菌酶至终浓度100μg/mL，室温放置15min；

6.一种如权利要求1-5中任一项所述的球形孢子丝菌HSP70_5重组蛋白在制备抗体中的应用。