CN110951703B

CN110951703B - 一种间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白及其单克隆抗体的制备

Info

Publication number: CN110951703B
Application number: CN201911334841.5A
Authority: CN
Inventors: 胡冉; 刘清泉; 胡祥叶; 吴琼杉; 余铭恩
Original assignee: HANGZHOU XIANZHI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Hangzhou Xinmai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN110951703A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白及其单克隆抗体的制备。本发明所述间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。为增强该重组蛋白在原核细胞中的表达效果，本发明运用一段柔性片段(四个甘氨酸)作为连接短肽，将间日疟原虫乳酸脱氢酶蛋白(LDH)抗原的A优势表位和B优势表位序列串联后三次重复，组成一个重组蛋白。本发明还涉及该重组蛋白单克隆抗体的制备，经过免疫、细胞融合及多轮筛选得到单克隆细胞株，纯化单克隆抗体并分别标记荧光微球，正交实验确定最佳单抗配对组合。用该重组抗原免疫制得的单克隆抗体具有高特异性，可用于疟疾感染的早期诊断。

Description

一种间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白及其单克隆抗体的制备

技术领域：本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白、编码该重组蛋白的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的质粒载体、转化含有上述质粒载体的菌株，以及用上述重组蛋白制备单克隆抗体，并应用于疟疾感染的快速诊断。

背景技术：疟疾(malaria)是因疟原虫寄生人体组织而引起的寄生原虫病。临床上以间歇性发冷、发热、肝脾肿大为主要特征。主要包括间日疟、恶性疟、三日疟和卵形疟。间日疟是疟疾的一种类型，为间日疟原虫(Plasmodium vivax)所引起，分别在热带、亚热带和温带等95个国家传播。其特点为每隔48小时反复发作一次，主要表现为先冷后热，出汗后恢复正常，两次发作期间表现正常。疟疾的死亡率较高，其中绝大多数死亡是由恶性疟原虫和间日疟原虫引起的，有研究表明，间日疟反复发作可以导致患者虚弱且引起急性肾衰竭，严重贫血，脑型疟，肝脏功能衰竭等诸多并发症。也有研究表明一些寄生虫对一些抗疟疾药物产生了耐药性，从而使其治疗更加困难。因此，开发灵敏度高，特异性好的快速诊断试剂对于间日疟的控制和治疗有重要意义。

目前，诊断间日疟方法包括厚，薄血膜染色镜检法直接镜检间日疟原虫，骨髓涂片，QBC法、探针技术、PCR技术和免疫学检测方法等。其中，厚，薄血膜染色镜检法是诊断疟疾的传统方法，该法费时费力，需要专业镜检人员，且有研究证明该法对低原虫血症者易漏诊。骨髓涂片法阳性率明显高于直接镜检，但其影响因素较多，操作困难易误诊。QBC法、探针及PCR技术需要特殊设备和试剂，价格较昂贵且十分费时，难以达到早期诊断的目的。

免疫学检测方法因其操作简便，结果易于判定，适用于大量样本现场快速筛查等特点而得到非常广泛的应用。该方法主要是通过制备间日疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)蛋白的单克隆抗体来实现对疟疾的特异性检测。乳酸脱氢酶(LDH)是一种疟原虫循环抗原，在疟原虫整个红内期均表达，是疟原虫表达最丰富的酶之一。常规用于间日疟原虫蛋白单克隆抗体制备的免疫原是完整蛋白，由于抗原表位氨基酸序列同源性缘故，所制得的单克隆抗体特异性差，可能识别其它蛋白，导致检测结果失真。

发明内容:

有鉴于此，本发明目的是通过优化设计一种间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白并制备其单克隆抗体，用于间日疟特异性识别检测。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

(1)以间日疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)抗原为靶抗原，分析并选择该抗原两个特异性优势表位A和B，序列比较显示所选择的两个抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。(2)为增强所选择优势抗原表位对Balb/c小鼠免疫系统的刺激，运用一段柔性片段(四个甘氨酸)作为连接短肽，将间日疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)抗原A优势表位和B优势表位序列串联后三次重复，组成一个重组蛋白。(3)采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，以利于重组蛋白在大肠杆菌中的表达，从而提高表达量。(4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体pET-28a(+)，构建重组蛋白表达载体。(5)重组蛋白表达载体转化大肠杆菌ER2566感受态细胞，IPTG诱导筛选得到重组蛋白表达菌株。(6)重组蛋白表达菌株大规模培养后，超声破菌并低温离心，收集上清用镍琼脂糖亲和层析柱纯化，透析得间日疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)重组蛋白。(7)纯化后的重组蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经多轮筛选最终得到杂交瘤细胞株。(8)将杂交瘤细胞株分别制备Balb/c小鼠腹水，使用正辛酸-硫酸铵沉淀法及Protein A亲和层析分两步纯化单克隆抗体，并分别标记荧光微球。(9)正交实验筛选显示2A3单抗包被与3E7荧光微球标记配对为检测间日疟最佳组合。

本发明与背景技术相比，一是通过分子生物学技术，实现了间日疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)蛋白两个优势抗原表位的重复及串联表达，增强了目的抗原表位对小鼠免疫系统的刺激，排除了无关序列可能带来的干扰；二是采用大肠杆菌偏爱密码子优化重组蛋白对应的核苷酸序列，大大提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达水平；三是作为免疫原的重组蛋白仅含有间日疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)蛋白特有的优势抗原表位，保证了抗间日疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)蛋白单克隆抗体的高特异性，并筛选得到最佳单抗配对组合，提高检测灵敏度。

具体实施方案:

以下实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入本发明的保护范围内。

实施例1：间日疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)蛋白优势抗原表位选择

以间日疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，兼顾其特异性，选择A优势抗原表位(SEQ ID No:2)和B优势抗原表位(SEQ ID No:3)。序列比较显示所选择的A、B两个优势抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。

实施例2：间日疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)蛋白优势抗原表位串联与序列优化

为加强A、B优势抗原表位对Balb/c小鼠免疫的效果，运用一段柔性片段(四个甘氨酸)作为连接短肽，将间日疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)蛋白的A和B优势抗原表位序列串联后三次重复，组成重组蛋白氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。为提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID No:4所示，在该核苷酸序列上下游分别添加BamHI和EcoRI酶切位点序列，交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成后的目的基因克隆于pMD19-T载体(购自于宝生物工程大连有限公司)中。

实施例3：重组蛋白表达载体构建

运用限制性内切酶BamHI和EcoRI(购自于TaKaRa)将合成的目的基因构建到pET-28a(+)(购自于Novagen)原核表达载体中。以pET-28a(+)为载体，其BamHI和EcoRI双酶切反应体系(20μL，37℃酶切2h)如下：

合成的目的基因的BamHI和EcoRI双酶切反应体系(20μL，37℃酶切2h)如下：

酶切后采用胶回收试剂盒(购自于宁波中鼎生物技术有限公司)进行酶切产物回收，连接体系(5μL)如下：

4℃连接12h，连接产物转化大肠杆菌DH5α，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，37℃恒温倒置培养12h后，于平板上挑选单菌落至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养8h，采用质粒纯化试剂盒(购自于宁波中鼎生物技术有限公司)提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。

实施例4：重组蛋白表达菌株构建

将构建好的重组蛋白表达载体转化E.coli ER2566感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，37℃过夜倒置培养，挑取平板上单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养5h后，加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(终浓度为1.0mmol/L)诱导表达4h后制备蛋白电泳样品。14％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明重组蛋白成功表达，得到重组蛋白表达菌株。

实施例5：重组蛋白诱导表达、纯化与透析

将重组蛋白表达菌株接种至含卡那青霉素(终浓度为50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养至OD600＝0.6，用含终浓度50μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基将该菌按1：100稀释后，分装至细菌培养瓶中，置37℃摇床恒温过夜培养，次日加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1.0mmol/L，继续培养5h。4℃离心收集菌体，用50mM、pH8.0的Tris-HCl悬浮菌体，超声破碎，低温离心收集上清。上清用0.45μm滤膜过滤后用Ni柱纯化，先用20mM咪唑溶液(1.36g咪唑溶解于10mM PBS溶液至终体积为1L)洗涤柱子，再用300mM咪唑溶液(20.4g咪唑溶解于10mM PBS溶液至终体积为1L)洗脱间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测确定为目的蛋白。将纯化后的间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白装入截留分子量为5kDa的透析袋中，pH 7.4 10mM PBS缓冲液透析过夜，次日取出分装，于-20℃保存。

实施例6：杂交瘤细胞株的获得

取4-6周龄雌性Balb/c健康小鼠，用100μg重组蛋白与弗氏完全佐剂完全乳化后，采取皮下多点注射。15天后进行第二次相同剂量与弗氏不完全佐剂混合免疫；30天后取15μg重组蛋白尾静脉加强注射，于注射72h后眼眶取血，并处死小鼠，取其脾脏制备细胞悬液，细胞计数，按1/5于脾细胞的数量取生长状态良好的sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，混和离心后，加入聚乙二醇(PEG-4000)使二者融合。另外，再加入等体积的饲养细胞，混匀后分置于96孔细胞板(200μL/孔)，于5％CO₂培养箱培养。5天后半保留换液，10天后采用酶联免疫吸附法检测96孔细胞板中的杂交瘤细胞培养上清。具体操作如下：

(1)包被：用包被液稀释重组蛋白至终浓度为1μg/mL，100μL/孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司)，4℃过夜后弃去孔内液体，用洗涤液洗涤5次并拍干；

(2)封闭：以150μL/孔加入封闭液，37℃封闭2h，弃孔内液体，洗涤液洗涤5次并拍干；

(3)加样：加待检细胞培养上清及对照血清，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤液洗涤5次并拍干；

(4)加酶标抗体：以100μL/孔加入新鲜稀释的HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育30分钟后，洗涤液洗涤5次并拍干；

(5)加显色液：每孔加显色液A和显色液B各50μL，37℃避光显色10分钟；

(6)终止反应：以50μL/孔加入2M H₂SO₄；

(7)结果判定：在酶标仪上，于450nm处，空白孔校零后读取OD值。以免疫小鼠眼血清作为阳性对照。相关溶液配方如下：

包被液：Na₂CO₃ 1.5g，NaHCO₃ 2.9g，加ddH₂O定容至1000mL(pH9.6)。

封闭液：Na₂HPO₄.12H₂O 2.68g，NaH₂PO4.2H₂O 0.39g，NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加ddH₂O定容至1000mL(pH7.4)。

洗涤液：Na₂HPO₄.12H₂O 2.68g，NaH₂PO₄.2H₂O 0.39g，NaCl 8.5g，Tween-20 0.5mL，加ddH₂O定容至1000mL(pH7.4)。

显色液A：200mg TMB溶于100mL无水乙醇，加ddH₂O定容至1000mL。

显色液B：柠檬酸2.1g，Na₂HPO₄.12H₂O 71g，加ddH₂O定容至1000mL。

使用时：1mL显色液A+1mL显色液B+0.4μL 30％H₂O₂

终止液：2M H₂SO₄，21.7mL浓H₂SO₄加ddH₂O定容至1000mL。

对于检测阳性的杂交瘤细胞克隆，通过有限稀释法进行亚克隆。经过三次亚克隆，筛选得到6株杂交瘤细胞株(1G5、2B6、3E7、2A3、4F5、6B8)。

实施例7：单克隆抗体的大量制备及纯化

取6-8周龄的Balb/c健康小鼠，腹腔注射液体石蜡，500μL/只，4-6天后腹腔注射杂交瘤细胞(约1×10⁶个/只)，7天后，小鼠腹部鼓起，收集腹水，12000rpm离心3min，收集上清，按1：2.5比例加入60mM pH4.5醋酸钠缓冲液，以每毫升腹水上清加入25μL正辛酸的比例，在磁力搅拌器搅拌条件下缓慢加入正辛酸，室温继续搅拌30min后，4℃5000rpm离心30min取上清。将上清在4℃条件下预冷，以1mL体积上清液加入0.227g硫酸铵的比例，缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，室温继续搅拌30min后，5000rpm离心15min，沉淀溶于1/10体积的10mM PBS(pH7.4)缓冲液中，透析至无硫酸铵。将透析后的单抗用Protein A亲和层析柱纯化，洗涤后收集洗脱峰，即得到纯化后的单抗。

实施例8：标记间日疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)蛋白单克隆抗体荧光微球垫的制备

用50mM pH4.5 MES缓冲液将直径210nm的荧光微球(购自南京微测生物科技有限公司)浓度调节至1％，采用碳二亚胺(EDC)和琥珀酰亚胺(NHS)共价偶联的方式将前期筛选得到的6株单克隆抗体标记到荧光微球上，抗体浓度为0.2mg/ml。将制备好的荧光微球使用定量喷膜仪以4μl/cm的量喷涂于荧光微球垫上，25℃真空干燥1～2h，置于干燥环境备用。

实施例9：硝酸纤维素膜(NC膜)的制备

用10mM pH7.4的PBS(磷酸盐缓冲液，其中包含5％蔗糖)分别调节前期筛选得到的6株单克隆抗体(1G5、2B6、3E7、2A3、4F5、6B8)至其浓度为0.4mg/mL，将所得溶液分别喷涂在NC膜上形成检测区(T线)；用10mM pH7.4的PBS(磷酸盐缓冲液，其中包含5％蔗糖)调节羊抗鼠IgG浓度为0.5mg/mL，将所得溶液喷涂在NC膜上形成质控区(C线)。两区的喷膜量均为1μL/cm，两区相隔5mm，37℃烘干过夜，置于室温干燥环境备用。

实施例10：荧光微球免疫层析检测卡的制备

组装试纸条：在PVC底板上依次搭接粘贴：(1)喷涂间日疟原虫乳酸脱氢酶LDH蛋白单克隆抗体(1G5、2B6、3E7、2A3、4F5、6B8)作为检测区和羊抗鼠IgG作为质控区的NC膜；(2)喷涂有荧光微球标记间日疟原虫乳酸脱氢酶LDH蛋白单克隆抗体(1G5、2B6、3E7、2A3、4F5、6B8)的荧光微球垫；(3)样本垫，样本垫为一种经过2％Tween-20处理的玻璃纤维膜；(4)吸水纸，组装完成后剪切成4mm的宽度，装上试剂卡条壳并压紧，即得荧光微球免疫层析检测卡。

实施例11：配对单抗筛选

收集疟疾患者临床血清样本，用10mM pH7.4的无菌PBS缓冲液100倍稀释，100μL/孔上样，室温放置15min后，通过荧光分析仪(购自和迈生物科技股份有限公司)分别读取NC膜上T、C线信号并计算测量值T/(T+C)，详见表1。

表1配对单抗测量值T/(T+C)统计

通过上表可知，2A3单抗包被与3E7荧光微球标记配对检测间日疟为最佳组合。

实施例12：单克隆抗体特异性鉴定

分别收集间日疟、日本血吸虫、恶性疟、弓形虫感染的患者血样，用10mM pH7.4的无菌PBS缓冲液100倍稀释，用2A3单抗包被与3E7荧光微球标记制得的荧光微球免疫层析检测卡来检测其特异性。即各取100μL经PBS稀释的临床血样加至检测卡加样孔中，15min后读取T线信号值，对照组为健康人血液样本。重复三次。结果(表2)表明，仅间日疟临床血清检测为阳性，其他均为阴性。

表2特异性实验结果

注：“++”表示强阳性，“－”表示阴性。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州贤至生物科技有限公司

<120> 一种间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白及其单克隆抗体的制备

<130> 20191219

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 1

Leu Gly Asp Val Val Met Phe Asp Ile Val Lys Gly Gly Gly Gly Val

1 5 10 15

Pro Leu Lys Arg Tyr Ile Thr Val Gly Gly Ile Pro Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Leu Gly Asp Val Val Met Phe Asp Ile Val Lys Gly Gly Gly Gly Val

35 40 45

Pro Leu Lys Arg Tyr Ile Thr Val Gly Gly Ile Pro Gly Gly Gly Gly

50 55 60

Leu Gly Asp Val Val Met Phe Asp Ile Val Lys Gly Gly Gly Gly Val

65 70 75 80

Pro Leu Lys Arg Tyr Ile Thr Val Gly Gly Ile Pro

85 90

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 间日疟原虫（Plasmodium vivax）

<400> 2

Leu Gly Asp Val Val Met Phe Asp Ile Val Lys

1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 间日疟原虫（Plasmodium vivax）

<400> 3

Val Pro Leu Lys Arg Tyr Ile Thr Val Gly Gly Ile Pro

1 5 10

<210> 4

<211> 276

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 4

ctgggcgatg tggtgatgtt tgatattgtg aaaggcggcg gcggcgtgcc gctgaaacgc 60

tatattaccg tgggcggcat tccgggcggc ggcggcctgg gcgatgtggt gatgtttgat 120

attgtgaaag gcggcggcgg cgtgccgctg aaacgctata ttaccgtggg cggcattccg 180

ggcggcggcg gcctgggcga tgtggtgatg tttgatattg tgaaaggcgg cggcggcgtg 240

ccgctgaaac gctatattac cgtgggcggc attccg 276

Claims

1.一种间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白，其特征在于所述间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白的氨基酸序列是运用四个甘氨酸作为连接短肽，将间日疟原虫乳酸脱氢酶蛋白的A优势抗原表位氨基酸序列以及B优势抗原表位氨基酸序列串联后三次重复组成，其中：间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No: 1所示，间日疟原虫乳酸脱氢酶蛋白的A优势抗原表位氨基酸序列如SEQ ID No: 2所示，间日疟原虫乳酸脱氢酶蛋白的B优势抗原表位氨基酸序列如SEQ ID No: 3所示。

2.一种核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列如SEQ ID No: 4所示，可编码权利要求1所述的重组蛋白。

3.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求2所述的核苷酸序列。

4.一种采用权利要求3所述质粒载体转化的菌株。

5.权利要求1所述间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白用于单克隆抗体的制备，其特征在于包含以下步骤：

（a）人工设计并辅以计算机模拟间日疟原虫乳酸脱氢酶抗原的优势表位，化学合成包含BamHI和EcoRI酶切位点的核苷酸序列；

（b）将化学合成产物BamHI和EcoRI双酶切后连接至同样BamHI和EcoRI双酶切的pET-28a (+) 载体中，构建pET28-LDH重组质粒；

（c）重组质粒转化至大肠杆菌中诱导表达，纯化透析即得SEQ ID No: 1所示氨基酸序列的间日疟原虫乳酸脱氢酶重组蛋白；

（d）重组蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经多轮筛选得到杂交瘤细胞株；

（e）纯化单克隆抗体并分别标记荧光微球，正交实验确定最佳单抗配对组合。