CN111349617B - 一种分泌抗Tau或pTau-181/231/396单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分泌抗Tau或pTau‑181/231/396单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，通过获得分泌抗Tau蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，及pTau‑181/231/396磷酸化蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，获得高特异性及高亲和力的针对Tau蛋白及pTau‑181/231/396磷酸化蛋白的单克隆抗体，可通过配对检测血液及脑脊液中的pTau‑181/231/396磷酸化蛋白的含量，应用于检测pTau‑181/231/396磷酸化蛋白含量变化或诊断以pTau‑181/231/396磷酸化蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。

Description

一种分泌抗Tau或pTau-181/231/396单克隆抗体杂交瘤细胞 株及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种分泌抗Tau或pTau-181/231/396单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

阿尔兹海默症（Alzheimer's disease，AD）是一种神经系统退行性疾病，伴有特殊病理和生理变化，是一种获得性、持续性及全面性的认知功能障碍的临床综合症。目前AD的诊断仍依赖于检测量表、MCI、CT等传统手段，这就会出现诊断不及时等情况。

研究表明，Tau蛋白是神经元细胞中众多微管相关蛋白（MAPs）之一，是一种低分子量含磷糖蛋白，它可以与神经轴突内的微管结合，并且具有诱导与促进微管蛋白聚合成微管、防止微管解聚和维持微管功能的稳定的作用。当Tau蛋白发生高度磷酸化、异常糖基化、异常糖化以及泛素蛋白化时，Tau蛋白失去对微管的稳定作用，导致神经纤维退化，从而引起神经功能失调。AD早期神经元纤维缠结（NFT）病理改变较轻，以Tau蛋白糖基化为主，而磷酸化Tau蛋白含量较低，随着AD加重，以Tau蛋白的过度磷酸化为主，因此，AD患者的磷酸化Tau蛋白的含量会显著升高。

目前Tau蛋白Thr181位点、Thr231位点及Ser396磷酸化作为阿尔茨海默症诊疗靶点已有报道，但Tau蛋白Thr181位点、Thr231位点及Ser396位点磷酸化诊断用单克隆抗体还处于空白。

因此，亟需一种分泌抗Tau或pTau-181/231/396单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。

发明内容

为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供一种分泌抗Tau或pTau-181/231/396单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，本发明提供特异性识别Tau蛋白及Thr181磷酸化位点、Thr231磷酸化位点及Ser396磷酸化位点的单克隆抗体及其制备方法，用于以Tau-181/231/396磷酸化蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用，如阿尔茨海默病诊断及治疗。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明的第一目的提供一种分泌抗Tau单克隆抗体杂交瘤细胞株3B6，所述杂交瘤细胞株3B6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C202056。

本发明的第二目的提供一种分泌抗pTau-181单克隆抗体杂交瘤细胞株2A7，所述杂交瘤细胞株2A7保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C202057。

本发明的第三目的提供一种分泌抗pTau-231单克隆抗体杂交瘤细胞株3G8，所述杂交瘤细胞株3G8保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C202058。

本发明的第四目的提供一种分泌抗pTau-396单克隆抗体杂交瘤细胞株1F4，所述杂交瘤细胞株1F4保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C202059。

本发明的第五目的提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株分泌而成。

作为优选，所述单克隆抗体由所述杂交瘤细胞株3B6分泌，所述单克隆抗体能够特异性识别Microtubule-associated protein tau蛋白，该蛋白序列如下：

DDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKD，其序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的第六目的提供一种含有上述单克隆抗体的试剂盒。

作为优选，所述试剂盒包括捕获抗体标记的磁微粒、校准品、洗液、酶标记的检测抗体、发光底物。

本发明的第七目的提供一种单克隆抗体在制备用于检测pTau-181/231/396磷酸化蛋白的试剂中的应用。

作为优选，检测pTau-181磷酸化蛋白的试剂为检测pTau-181磷酸化蛋白含量增加或诊断以pTau-181磷酸化蛋白异常表达为表征的试剂；检测pTau-231磷酸化蛋白的试剂为检测pTau-231磷酸化蛋白含量增加或诊断以pTau-231磷酸化蛋白异常表达为表征的试剂；检测pTau-396磷酸化蛋白的试剂为检测pTau-396磷酸化蛋白含量增加或诊断以pTau-396磷酸化蛋白异常表达为表征的试剂。

作为优选，检测pTau-181磷酸化蛋白的试剂的捕获抗体为杂交瘤细胞株3B6分泌的单克隆抗体，检测抗体为杂交瘤细胞株2A7分泌的单克隆抗体；检测pTau-231磷酸化蛋白的试剂的捕获抗体为杂交瘤细胞株3B6分泌的单克隆抗体，检测抗体为杂交瘤细胞株3G8分泌的单克隆抗体；检测pTau-396磷酸化蛋白的试剂的捕获抗体为杂交瘤细胞株3B6分泌的单克隆抗体，检测抗体为杂交瘤细胞株1F4分泌的单克隆抗体。

本发明的有益效果是：本发明通过获得分泌抗Tau蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，及pTau-181/231/396磷酸化蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，获得高特异性及高亲和力的针对Tau蛋白及pTau-181/231/396磷酸化蛋白的单克隆抗体，可通过配对检测血液及脑脊液中的pTau-181/231/396磷酸化蛋白的含量，应用于制备检测pTau-181/231/396磷酸化蛋白含量变化或诊断以pTau-181/231/396磷酸化蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。

细胞保藏：

本发明提供的杂交瘤细胞株3B6是本发明的发明人自行筛选得到的，保藏日期为2020年4月3日，保藏号为CCTCC NO:C202056，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。

本发明提供的杂交瘤细胞株2A7是本发明的发明人自行筛选得到的，保藏日期为2020年4月3日，保藏号为CCTCC NO:C202057，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。

本发明提供的杂交瘤细胞株3G8是本发明的发明人自行筛选得到的，保藏日期为2020年4月3日，保藏号为CCTCC NO:C202058，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。

本发明提供的杂交瘤细胞株1F4是本发明的发明人自行筛选得到的，保藏日期为2020年4月3日，保藏号为CCTCC NO:C202059，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。

附图说明

图1是本发明实施例一中重组Tau蛋白的鉴定示意图。

图2是本发明实施例五中1G7、2G2、3B6、4B2、4F7和4D8抗体SDS-PAGE电泳结果示意图。

图3是本发明实施例六中1E2、2A7和5G8抗体SDS-PAGE电泳结果示意图。

图4是本发明实施例七中2D3、3G8和3A1抗体SDS-PAGE电泳结果示意图。

图5是本发明实施例八中1F4和2E7抗体SDS-PAGE电泳结果示意图。

图6是本发明实施例十二中3B6抗体识别Tau蛋白的M段示意图。

图7是本发明实施例十三中pTau-181检测体系校准曲线示意图。

图8是本发明实施例十三中脑脊液检测结果的ROC曲线统计示意图。

图9是本发明实施例十三中血清检测结果的ROC曲线统计示意图。

图10是本发明实施例十四中pTau-231检测体系校准曲线示意图。

图11是本发明实施例十四中脑脊液检测结果的ROC曲线统计示意图。

图12是本发明实施例十四中血清检测结果的ROC曲线统计示意图。

图13是本发明实施例十五中pTau-396检测体系校准曲线示意图。

图14是本发明实施例十五中脑脊液检测结果的ROC曲线统计示意图。

图15是本发明实施例十五中血清检测结果的ROC曲线统计示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明中Tau单克隆抗体的制备方法为：1）重组人Tau蛋白表达并纯化，即得免疫抗原；2）利用步骤1)抗原对动物进行免疫，制备筛选获得杂交瘤细胞，将获得的杂交瘤细胞株扩大培养，小鼠腹腔接种得到含有目的单克隆抗体的腹水；3）将步骤2)小鼠腹水单克隆抗体进行纯化和选择，即为人Tau蛋白单克隆抗体。

本发明中抗pTau-181、231、396单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：1）181、231、396磷酸化多肽分别通过戊二醛与Tau截短蛋白进行偶联，即得重组pTau-181、231、396磷酸化蛋白免疫抗原；2）利用步骤1)抗原对动物进行免疫，制备筛选获得杂交瘤细胞，将获得的杂交瘤细胞株扩大培养，小鼠腹腔接种得到含有目的单克隆抗体的腹水；3）将步骤2)小鼠腹水单克隆抗体进行纯化和选择，即为抗pTau-181、231、396单克隆抗体。所述181磷酸化多肽的氨基酸序列为AKTPPAPKT（p）PPSSGEPPK，其序列如SEQ ID NO:2所示，所述181磷酸化多肽的苏氨酸T位点添加有磷酸基团。所述231磷酸化多肽的氨基酸序列PKKVAVVRT(p)PPKSPSSAK，其序列如SEQ ID NO:3所示，所述231磷酸化多肽的苏氨酸T位点添加有磷酸基团。所述396磷酸化多肽的氨基酸序列HGAEIVYKS(p)PVVSGDTSP，其序列如SEQ ID NO:4所示，所述396磷酸化多肽的丝氨酸S位点添加有磷酸基团。所述Tau截短蛋白的序列如SEQ IDNO:8所示。

实施例一：分泌抗Tau单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备。

免疫原制备：依据人Tau序列(Uniport: P10636 )以及编码CDS序列（序列2）信息设计引物，并加入酶切位点，引物序列设计为Tau-F: CGCGGATCCATGGCGGCAGCGATG(添加酶切位点BamHI) ，其序列如SEQ ID NO:5所示，Tau-R: CCCAAGCTTCTAGTGCCCATACTTTTGGAATT(添加酶切位点HindIII) ，其序列如SEQ ID NO:6所示。从脑组织中提取mRNA，逆转录合成cDNA，扩增全长327bp，BamHI与HindIII双酶切PCR产物与pET28a(+)质粒，琼脂糖凝胶胶回收并T4 DNA连接酶连接；随后转化感受态细胞DH5a，37℃孵箱培养过夜，挑取阳性克隆，提取质粒酶切并测序鉴定。挑选正确序列重组质粒pET28a-Tau质粒和pET28a空载体转化感受态BL21(DE3）细胞。pET28a(+)-Tau重组质粒的N端含有6XHis标签，便于后续利用Ni-NTA进行亲和层析纯化，标签蛋白可以增加重组蛋白表达以及免疫原性。

重组Tau蛋白表达：挑取测序正确的阳性克隆BL21菌株进行pET28a(+)-Tau蛋白的小量诱导表达。对诱导表达的条件进行探索，使用BL21作为表达菌，最终选取0.5mM IPTG在37℃条件下诱导4小时作为合适的诱导表达程序，在此条件下pET28a(+)-Tau蛋白有最大量的表达，且蛋白表达以可溶形式存在于菌内。每300ml大量表达的BL21菌液离心后，重悬于1xPBS中，冰浴条件下250w功率超声150次（超声5s，间隔5s)破菌，离心(10000g，4℃，10min)，弃沉淀，上清液用0.45um 滤器过滤。

重组Tau蛋白纯化：重组蛋白利用His标签与Ni-NTA层析柱进行亲和层析纯化。NiHitrap 预装层析柱用平衡缓冲液（20mM Tris，8M Urea,10mM B-ME,5mM咪唑，500mM NaCl,pH8.0）平衡10个柱体积，利用恒流泵1ml/min将含有pET28a(+)-Tau蛋白的上清液加入到层析柱中，顺序用10个柱体积的平衡缓冲液以及含咪唑20mM的清洗缓冲液对层析柱进行清洗，经过探索在150mM 咪唑浓度洗脱缓冲液中（20mM Tris,8M Urea,10mM B-ME,150mM咪唑，500mM NaCl，pH8.0）的条件下，有高纯度的重组蛋白被洗脱下来。最后，在1L pH8.020mM Tris 150mM NaCl，10uM CaCl2 溶液中透析12h。利用PEG6000将透析后的溶液浓缩到合适的浓度，离心，弃沉淀，并将上清分装存于-80℃冰箱。

重组Tau蛋白的鉴定：利用亲和层析纯化得到的蛋白，经SDS-PAGE电泳显示，目的条带的位置符合预期的大小，约为44Kd，纯度达到90%以上（图1）。

杂交瘤细胞融合：利用上述制备的免疫原免疫小鼠，检测小鼠血清效价达到1:10000后用Tau蛋白腹腔加强免疫(50μg/只)，3天后无菌取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞大约按4:1比例混合在 50mL离心管，用培养基洗涤两次后弃上清，然后加入1mL预热50％PEG-1450作用1min后，水浴中缓缓摇动90s，立即缓慢滴加37℃预热的无血清DMEM培养基15mL，37℃水浴5min，然后补加无血清DMEM培养基至40mL，1000rpm/mim离心10min弃上清，加40mL预热HAT 培养基，轻吹打混匀，转移至已铺饲养细胞的96孔培养板中，每孔100μL，置培养箱中培养。鉴定细胞上清，对阳性杂交瘤进行3次克隆筛选，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞6株，分别为1G7、2G2、3B6、4B2、4F7和4D8。

实施例二：分泌抗pTau-181单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备。

免疫原制备：将一定量的Tau截短蛋白和181磷酸化多肽溶解到100μl 磷酸盐缓冲液（0.01M pH=7.2），蛋白：多肽的摩尔比为1：5~10，混匀。在上述100μl混合液中，加入20μl2.5%戊二醛，室温反应2h。偶联反应结束后，将上述反应液放入1L 磷酸盐缓冲液（0.01M pH=7.2）中4℃透析过夜，每隔4小时，换液一次。换用0.05M pH=8.0 Tris-Hcl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。最后对重组pTau-181磷酸化蛋白进行浓度测定，按每只50ug的蛋白量免疫小鼠。

杂交瘤细胞融合：检测小鼠血清效价达到1:10000后用重组pTau-181磷酸化蛋白腹腔加强免疫(30μg)，3天后无菌取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞大约按4:1比例混合在 50mL离心管，用培养基洗涤两次后弃上清，然后加入1mL预热50％PEG-1450作用1min后，水浴中缓缓摇动90s，立即缓慢滴加37℃预热的无血清DMEM培养基15mL，37℃水浴5min，然后补加无血清DMEM培养基至40mL，1000rpm/mim离心10min弃上清，加40mL预热HAT 培养基，轻吹打混匀，转移至已铺饲养细胞的96孔培养板中，每孔100μL，置培养箱中培养。鉴定细胞上清，对阳性杂交瘤进行3次克隆筛选，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞3株，分别为1E2、2A7和5G8。

实施例三：分泌抗pTau-231单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备。

免疫原制备：将一定量的Tau截短蛋白和231磷酸化多肽溶解到100μl 磷酸盐缓冲液（0.01M pH=7.2），蛋白：多肽的摩尔比为1：5~10，混匀。在上述100μl混合液中，加入20μl2.5%戊二醛，室温反应2h。偶联反应结束后，将上述反应液放入1L 磷酸盐缓冲液（0.01M pH=7.2）中4℃透析过夜，每隔4小时，换液一次。换用0.05M pH=8.0 Tris-Hcl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。最后对重组pTau-231磷酸化蛋白进行浓度测定，按每只50ug的蛋白量免疫小鼠。

杂交瘤细胞融合：检测小鼠血清效价达到1:10000后用重组pTau-231磷酸化蛋白(不含佐剂)腹腔加强免疫(30μg)，3天后无菌取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞大约按4:1比例混合在 50mL离心管，用培养基洗涤两次后弃上清，然后加入1mL预热50％PEG-1450作用1min后，水浴中缓缓摇动90s，立即缓慢滴加37℃预热的无血清DMEM培养基15mL，37℃水浴5min，然后补加无血清DMEM培养基至40mL，1000rpm/mim离心10min弃上清，加40mL预热HAT 培养基，轻吹打混匀，转移至已铺饲养细胞的96孔培养板中，每孔100μL，置培养箱中培养。鉴定细胞上清，对阳性杂交瘤进行3次克隆筛选，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞3株，分别为2D3、3G8和3A1。

实施例四：分泌抗pTau-396单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备。

蛋白制备：将一定量的Tau截短蛋白和396磷酸化多肽溶解到100μl 磷酸盐缓冲液（0.01M pH=7.2），蛋白：多肽的摩尔比为1：5~10，混匀。在上述100μl混合液中，加入20μl2.5%戊二醛，室温反应2h。偶联反应结束后，将上述反应液放入1L 磷酸盐缓冲液（0.01M pH=7.2）中4℃透析过夜，每隔4小时，换液一次。换用0.05M pH=8.0 Tris-Hcl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。最后对重组pTau-396磷酸化蛋白进行浓度测定，按每只50ug的蛋白量免疫小鼠。

杂交瘤细胞融合：检测小鼠血清效价达到1:10000后用重组pTau-396磷酸化蛋白(不含佐剂)腹腔加强免疫(30μg)，3天后无菌取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞大约按4:1比例混合在 50mL离心管，用培养基洗涤两次后弃上清，然后加入1mL预热50％PEG-1450作用1min后，水浴中缓缓摇动90s，立即缓慢滴加37℃预热的无血清DMEM培养基15mL，37℃水浴5min，然后补加无血清DMEM培养基至40mL，1000rpm/mim离心10min弃上清，加40mL预热HAT 培养基，轻吹打混匀，转移至已铺饲养细胞的96孔培养板中，每孔100μL，置培养箱中培养。鉴定细胞上清，对阳性杂交瘤进行3次克隆筛选，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞2株，分别为1F4和2E7。

实施例五：Tau单克隆抗体制备、纯化及效价检测。

单抗腹水制备：10-12周BALB/c小鼠腹腔注射免疫抑制剂液体石蜡，0.5mL/只，7d后腹部接种稳定分泌抗体、状态较好的6株杂交瘤细胞，约1-10⁶ /只， 7-10d后，待小鼠腹部膨胀，抽取腹水，收集腹水上清。

抗体纯化：收集的小鼠腹水用0.45μm的滤器过滤，加入终浓度为50％的硫酸铵固体，4℃搅拌均匀后，静置1h，12000rpm收集沉淀，并用50mM PBS溶液重溶沉淀。将得到的粗纯化抗体以1mL/min流速上样到Protein A-Sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mMPBS，pH7.0)清洗，然后用0.1M甘氨酸-盐酸溶液pH2.7洗脱抗体(每个收集管预先加入1M pH 9.0Tris缓冲液中和)，得到目的抗体，并用50mM PBS溶液透析3次。将透析后的抗体进行SDS-PAGE电泳，结果显示，6株抗体在50kD与25kD处有条带，灰度分析纯度均大于90％，1G7、2G2、3B6、4B2、4F7和4D8抗体SDS-PAGE，见图2所示。

单克隆抗体效价检测：以5μg/ml的Tau蛋白的碳酸盐缓冲液(pH 9.5)，100μl体积4℃过夜包被微孔板，梯度稀释各个抗体(1：1000，1：2000，1：4000，1:8000，1:16000，1：32000，1：64000、1:128000、1：256000、1：512000)，加入羊抗鼠IgG-HRP(50ng/ml)，确定纯化后单克隆抗体效价(S/N>2.1)，1G7、2G2、3B6、4B2、4F7和4D8单克隆抗体效价分别为1：128000，1:256000，1：256000，1：512000，1:64000，1:128000。

实施例六：pTau-181单克隆抗体制备、纯化及效价检测。

单抗腹水制备：10-12周BALB/c腹腔注射免疫抑制剂液体石蜡，0.5mL/只，7d后腹部接种稳定分泌抗体、状态较好的3株杂交瘤细胞，约1-10⁶ /只， 7-10d后，待小鼠腹部膨胀，抽取腹水，收集腹水上清。

抗体纯化：收集的小鼠腹水用0.45μm的滤器过滤溶液，加入终浓度为50％的硫酸铵固体，4℃搅拌均匀后，静置1h，12000rpm收集沉淀，并用50mM PBS溶液重溶沉淀。将得到的粗纯化抗体以1mL/min流速上样到Protein A-Sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mMPBS，pH7.0)清洗，然后用0.1M甘氨酸-盐酸溶液pH2.7洗脱抗体(每个收集管预先加入1M pH 9.0Tris缓冲液中和)，得到目的抗体，并用50mM PBS溶液透析3次。将透析后的抗体进行SDS-PAGE电泳，结果显示，3种抗体在50kD与25kD处有条带，灰度分析纯度均大于90％，1E2、2A7和5G8抗体SDS-PAGE，见图3所示。

单克隆抗体效价检测：以5μg/ml的重组pTau-181磷酸化蛋白的碳酸盐缓冲液(pH9.5)，100μl体积4℃过夜包被微孔板，梯度稀释各个抗体(1：1000，1：2000，1：4000，1:8000，1:16000，1：32000，1：64000、1:128000、1：256000、1：512000)，加入羊抗鼠IgG-HRP(50ng/ml)，确定纯化后单克隆抗体效价(S/N>2.1)，1E2、2A7和5G8单克隆抗体效价均为1：64000，1：128000，1：64000。

实施例七：pTau-231单克隆抗体制备、纯化及效价检测。

单抗腹水制备：10-12周BALB/c小鼠腹腔注射免疫抑制剂液体石蜡，0.5mL/只，7d后腹部接种稳定分泌抗体、状态较好的3株杂交瘤细胞，约1-10⁶ /只， 7-10d后，待小鼠腹部膨胀，抽取腹水，收集腹水上清。

抗体纯化：收集的小鼠腹水用0.45μm的滤器过滤溶液，加入终浓度为50％的硫酸铵固体，4℃搅拌均匀后，静置1h，12000rpm收集沉淀，并用50mM PBS溶液重溶沉淀。将得到的粗纯化抗体以1mL/min流速上样到Protein A-Sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mMPBS，pH7.0)清洗，然后用0.1M甘氨酸-盐酸溶液pH2.7洗脱抗体(每个收集管预先加入1M pH 9.0Tris缓冲液中和)，得到目的抗体，并用50mM PBS溶液透析3次。将透析后的抗体进行SDS-PAGE电泳，结果显示，3种抗体在50kD与25kD处有条带，灰度分析纯度均大于90％，2D3、3G8和3A1抗体SDS-PAGE，见图4所示。

单克隆抗体效价检测：以5μg/ml的重组pTau-231磷酸化蛋白的碳酸盐缓冲液(pH9.5)，100μl体积4℃过夜包被微孔板，梯度稀释各个抗体(1：1000，1：2000，1：4000，1:8000，1:16000，1：32000，1：64000、1:128000、1：256000、1：512000)，加入羊抗鼠IgG-HRP(50ng/ml)，确定纯化后单克隆抗体效价(S/N>2.1)，2D3、3G8和3A1单克隆抗体效价分别为1：128000，1：64000，1：64000。

实施例八：pTau-396单克隆抗体制备、纯化及效价检测。

单抗腹水制备：10-12周BALB/c小鼠腹腔注射免疫抑制剂液体石蜡，0.5mL/只，7d后腹部接种稳定分泌抗体、状态较好的2株杂交瘤细胞，约1-10⁶ /只， 7-10d后，待小鼠腹部膨胀，抽取腹水，收集腹水上清。

抗体纯化：收集的小鼠腹水用0.45μm的滤器过滤溶液，加入终浓度为50％的硫酸铵固体，4℃搅拌均匀后，静置1h，12000rpm收集沉淀，并用50mM PBS溶液重溶沉淀。将得到的粗纯化抗体以1mL/min流速上样到Protein A-Sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mMPBS，pH7.0)清洗，然后用0.1M甘氨酸-盐酸溶液pH2.7洗脱抗体(每个收集管预先加入1M pH 9.0Tris缓冲液中和)，得到目的抗体，并用50mM PBS溶液透析3次。将透析后的抗体进行SDS-PAGE电泳，结果显示，2种抗体在50kD与25kD处有条带，灰度分析纯度均大于90％，1F4和2E7抗体SDS-PAGE，见图5所示。

单克隆抗体效价检测：以5μg/ml的重组pTau-396磷酸化蛋白的碳酸盐缓冲液(pH9.5)，100μl体积4℃过夜包被微孔板，梯度稀释各个抗体(1：1000，1：2000，1：4000，1:8000，1:16000，1：32000，1：64000、1:128000，、1：256000、1：512000)，加入羊抗鼠IgG-HRP(50ng/ml)，确定纯化后单克隆抗体效价(S/N>2.1)，1F4和2E7单克隆抗体效价均为1：256000，1：128000。

实施例九： pTau-181单克隆抗体配对验证。

将Tau单克隆抗体1G7、2G2、3B6、4B2、4F7和4D8分别以5μg/ml的浓度包被微孔反应板，加入100μl不同浓度(0-160mg/mL)的重组pTau-181磷酸化蛋白，37℃孵育60min，洗涤后分别加入100μL浓度为100ng/ml的HPR标记的 pTau-181单克隆抗体1E2、2A7和5G8，并于37℃孵育60min，洗涤后加入底物于酶标仪测定其吸光度，结果如表1所示。从结果上看，Tau单克隆抗体3B6与pTau-181单克隆抗体2A7配对更佳，灵敏度和吸光度更高。

表1：pTau-181单克隆抗体配对结果。

实施例十：pTau-231单克隆抗体配对验证。

将Tau单克隆抗体1G7、2G2、3B6、4B2、4F7和4D8分别以5μg/ml的浓度 包被微孔反应板，加入100μl不同浓度(0-160mg/mL)的重组pTau-231磷酸化蛋白，37℃孵育60min，洗涤后分别加入100μL浓度为100ng/ml的HPR标记的 pTau-231单克隆抗体2D3、3G8和3A1，并于37℃孵育60min，洗涤后加入底物于酶标仪测定其吸光度，结果如表2所示。从结果上看，Tau单克隆抗体3B6与pTau-231单克隆抗体3G8配对更佳，灵敏度和吸光度更高。

表2：pTau-231单克隆抗体配对结果。

实施例十一： pTau-396单克隆抗体配对验证。

将Tau单克隆抗体1G7、2G2、3B6、4B2、4F7和4D8分别以5μg/ml的浓度包被微孔反应板，加入100μl不同浓度(0-160mg/mL)的重组pTau-396磷酸化蛋白，37℃孵育60min，洗涤后分别加入100μL浓度为100ng/ml的HPR标记的 pTau-396单克隆抗体1F4和2E7，并于37℃孵育60min，洗涤后加入底物于酶标仪测定其吸光度，结果如表3所示。从结果上看，Tau单克隆抗体3B6与pTau-396单克隆抗体1F4配对更佳，灵敏度和吸光度更高。

表3：pTau-396单克隆抗体配对结果。

实施例十二： Tau单克隆抗体表位鉴定。

重组截断Tau蛋白构建表达：根据Tau蛋白氨基酸序列，设计了N、M、C端的序列以及Tau全长蛋白，连接至表达载体pET28a，并装入表达菌株BL21(DE3)中。在LB培养基中，IPTG1mmol/L 37度条件下过夜诱导Tau截断重组蛋白可溶性表达。原核重组表达经6×His标签亲和纯化，纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，纯度均在90%以上。

Tau-N片段，其序列如SEQ ID NO:7所示：

MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTP。

Tau-M片段，其序列如SEQ ID NO:8所示：

DDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKD。

Tau-C片段，其序列如SEQ ID NO:9所示：

KSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL。

Tau全长，其序列如SEQ ID NO:10所示：

MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL。

蛋白免疫印迹法WB确认抗体识别表位：重组蛋白Tau-N、M、C和Tau全长4种蛋白取5μg 上样，进行15％SDS-PAGE电泳。电泳完成后，150V恒压条件下，蛋白转入0.45pgmPVDF。转膜完成后利用含5％BSA的PBST溶液37℃封闭两小时。用5μg/mL的3B6单克隆抗体溶液37℃孵育1小时。孵育完成后，加入50ng/ml的羊抗鼠IgG-HRP孵育1小时。清洗完成后，加入DAB显色液进行显色。Tau全长蛋白作为阳性对照，Tau-N/M/C片段位置棕色沉淀物质，则表明抗体识别该目的片段。结果显示，3B6抗体识别Tau蛋白的M段，见图6 。

实施例十三：pTau-181磷酸化蛋白的检测体系构建。

校准曲线绘制：首先在固相载体如磁微粒上包被捕获抗体3B6，浓度为5μg/mL，将重组pTau-181磷酸化蛋白用10％BSA溶液稀释为0pg/mL、10pg/mL、20pg/mL、40pg/mL、80pg/mL、160pg/mL，每孔100μL，再加入碱性磷酸酶标记的2A7抗体，浓度100ng/ml，每孔100μL，37℃孵育30min。用PBST清洗3次，化学发光底物加入后，检测发光值。从校准曲线计算出被测样品的pTau-181含量。校准曲线线性范围 0～160pg/mL，图7为pTau-181检测体系校准曲线，其中，Y轴代表RUL值（发光值），X轴代表pTau-181校准品的浓度。

pTau-181检测试剂盒用于阿尔兹海默症诊断:检测30例阿尔兹海默症患者的脑脊液和血清；同时检测30例非AD患者脑脊液和血清。使用pTau-181检测体系检测阿尔兹海默症、非AD患者脑脊液中pTau-181浓度，ROC曲线（图8）统计结果显示，曲线下面积为0.943，以45pg/mL作为检测参考值，pTau-181检测试剂盒特异性为 93.33％（28/30），灵敏度为86.67％（26/30）。检测阿尔兹海默症、非AD患者血清中pTau-181浓度，ROC曲线（图9）统计结果显示，曲线下面积为0.894，以35pg/mL作为检测参考值，pTau-181检测试剂盒特异性为86.67％（26/30），灵敏度为83.33％（25/30）。

实施例十四：pTau-231磷酸化蛋白的检测体系构建。

校准曲线绘制：首先在固相载体如磁微粒上包被捕获抗体3B6，浓度为5μg/mL，将重组pTau-231磷酸化蛋白用10％BSA溶液稀释为0pg/mL、12.5pg/mL、25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL，每孔100μL，再加入碱性磷酸酶标记的3G8抗体，浓度50ng/ml，每孔100μL，37℃孵育30min。用PBST清洗3次，化学发光底物加入后，检测发光值。从校准曲线计算出被测样品的pTau-231含量。校准曲线线性范围 0～200pg/mL，图10为pTau-231检测体系校准曲线，其中，Y轴代表RUL值（发光值），X轴代表pTau-231校准品的浓度。

pTau-231检测试剂盒用于阿尔兹海默症诊断:检测30例阿尔兹海默症患者的脑脊液和血清；同时检测30例非AD患者脑脊液和血清。使用pTau-231检测体系检测阿尔兹海默症、非AD患者脑脊液中pTau-231浓度，ROC曲线（图11）统计结果显示，曲线下面积为0.91，以51pg/mL作为检测参考值，pTau-231检测试剂盒特异性为 96.67％（29/30），灵敏度为90％（27/30）。检测阿尔兹海默症、非AD患者血清中pTau-231浓度，ROC曲线（图12）统计结果显示，曲线下面积为0.853，以42pg/mL作为检测参考值，pTau-231检测试剂盒特异性为 90％（27/30），灵敏度为80％（24/30）。

实施例十五：pTau-396磷酸化蛋白的检测体系构建。

校准曲线绘制：首先在固相载体如磁微粒上包被捕获抗体 3B6，浓度为5μg/mL，将重组pTau-396磷酸化蛋白用10％BSA溶液稀释为0pg/mL、15pg/mL、30pg/mL、60pg/mL、120pg/mL、240pg/mL，每孔100μL，再加入碱性磷酸酶标记的1F4抗体，浓度400ng/ml，每孔100μL，37℃孵育30min。用PBST清洗3次，化学发光底物加入后，检测发光值。从校准曲线计算出被测样品的pTau-396含量。校准曲线线性范围 0～240pg/mL，图13为pTau-396检测体系校准曲线，其中，Y轴代表RUL值（发光值），X轴代表pTau-396校准品的浓度。

pTau-396检测试剂盒用于阿尔兹海默症诊断:检测30例阿尔兹海默症患者的脑脊液和血清；同时检测30例非AD患者脑脊液和血清。使用pTau-396检测体系检测阿尔兹海默症、非AD患者脑脊液中pTau-396浓度，ROC曲线（图14）统计结果显示，曲线下面积为0.896，以64pg/mL作为检测参考值，pTau-396检测试剂盒特异性为 93.33％（28/30），灵敏度为83.33％（25/30）。检测阿尔兹海默症、非AD患者血清中pTau-396浓度，ROC曲线（图15）统计结果显示，曲线下面积为0.835，以42pg/mL作为检测参考值，pTau-396检测试剂盒特异性为80％（24/30），灵敏度为83.33％（25/30）。

综上所述，本发明提供的单克隆抗体可用于样品中pTau-181/231/396蛋白的检测，且特异性强、灵敏度高。4株单克隆抗体特异识别Tau蛋白的不同表位，可通过配对检测脑脊液和血清中pTau-181/231/396含量，应用于检测pTau-181/231/396蛋白过量表达或诊断以pTau-181/231/396蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州仁端生物医药科技有限公司

<120> 一种分泌抗Tau或pTau-181/231/396单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr

1 5 10 15

Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr

20 25 30

Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser

35 40 45

Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly

50 55 60

Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr

65 70 75 80

Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro

85 90 95

Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro

100 105 110

Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn

115 120 125

Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys

130 135 140

Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile

145 150 155 160

Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val

165 170 175

Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His

180 185 190

His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp

195 200 205

Phe Lys Asp

210

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Glu

1 5 10 15

Pro Pro Lys

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Pro Lys Ser Pro Ser

1 5 10 15

Ser Ala Lys

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Pro Val Val Ser Gly Asp

1 5 10 15

Thr Ser Pro

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcggatcca tggcggcagc gatg 24

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccaagcttc tagtgcccat acttttggaa tt 32

<210> 7

<211> 176

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly

1 5 10 15

Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His

20 25 30

Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu

35 40 45

Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser

50 55 60

Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val

65 70 75 80

Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu

85 90 95

Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro

100 105 110

Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val

115 120 125

Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro

145 150 155 160

Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro

165 170 175

<210> 8

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr

1 5 10 15

Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr

20 25 30

Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser

35 40 45

Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly

50 55 60

Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr

65 70 75 80

Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro

85 90 95

Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro

100 105 110

Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn

115 120 125

Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys

130 135 140

Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile

145 150 155 160

Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val

165 170 175

Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His

180 185 190

His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp

195 200 205

Phe Lys Asp

210

<210> 9

<211> 185

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln

20 25 30

Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly

35 40 45

Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser

50 55 60

Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln

65 70 75 80

Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser

85 90 95

Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn

100 105 110

Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala

115 120 125

Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser

130 135 140

Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser

145 150 155 160

Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val

165 170 175

Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu

180 185

<210> 10

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly

1 5 10 15

Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His

20 25 30

Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu

35 40 45

Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser

50 55 60

Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val

65 70 75 80

Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu

85 90 95

Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro

100 105 110

Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val

115 120 125

Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro

145 150 155 160

Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro

165 170 175

Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly

180 185 190

Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser

195 200 205

Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys

210 215 220

Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys

225 230 235 240

Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val

245 250 255

Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly

260 265 270

Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln

275 280 285

Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser

305 310 315 320

Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln

325 330 335

Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser

340 345 350

Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn

355 360 365

Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala

370 375 380

Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser

385 390 395 400

Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser

405 410 415

Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val

420 425 430

Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu

435 440

Claims (4)

1.一种含有单克隆抗体的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体由三组中任意一组杂交瘤细胞株所分泌，第一组杂交瘤细胞株包括杂交瘤细胞株3B6和杂交瘤细胞株2A7，第二组杂交瘤细胞株包括杂交瘤细胞株3B6和杂交瘤细胞株3G8，第三组杂交瘤细胞库包括杂交瘤细胞株3B6和杂交瘤细胞株1F4；所述杂交瘤细胞株3B6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C202056；所述杂交瘤细胞株2A7保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C202057；所述杂交瘤细胞株3G8保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C202058；所述杂交瘤细胞株1F4保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C202059。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有捕获抗体标记的磁微粒、校准品、洗液、酶标记的检测抗体、发光底物；检测pTau-181磷酸化蛋白的试剂的捕获抗体为杂交瘤细胞株3B6分泌的单克隆抗体，检测抗体为杂交瘤细胞株2A7分泌的单克隆抗体；检测pTau-231磷酸化蛋白的试剂的捕获抗体为杂交瘤细胞株3B6分泌的单克隆抗体，检测抗体为杂交瘤细胞株3G8分泌的单克隆抗体；检测pTau-396磷酸化蛋白的试剂的捕获抗体为杂交瘤细胞株3B6分泌的单克隆抗体，检测抗体为杂交瘤细胞株1F4分泌的单克隆抗体；所述杂交瘤细胞株3B6所分泌的单克隆抗体能够特异性识别Microtubule-associatedprotein tau蛋白，该蛋白序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一组单克隆抗体在制备用于检测pTau-181/231/396磷酸化蛋白的试剂中的应用，其特征在于，所述单克隆抗体由三组中任意一组杂交瘤细胞株所分泌，第一组杂交瘤细胞株包括杂交瘤细胞株3B6和杂交瘤细胞株2A7，第二组杂交瘤细胞株包括杂交瘤细胞株3B6和杂交瘤细胞株3G8，第三组杂交瘤细胞库包括杂交瘤细胞株3B6和杂交瘤细胞株1F4；所述杂交瘤细胞株3B6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C202056；所述杂交瘤细胞株2A7保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C202057；所述杂交瘤细胞株3G8保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C202058；所述杂交瘤细胞株1F4保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C202059。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，检测pTau-181磷酸化蛋白的试剂为检测pTau-181磷酸化蛋白含量增加或诊断以pTau-181磷酸化蛋白异常表达为表征的试剂；检测pTau-231磷酸化蛋白的试剂为检测pTau-231磷酸化蛋白含量增加或诊断以pTau-231磷酸化蛋白异常表达为表征的试剂；检测pTau-396磷酸化蛋白的试剂为检测pTau-396磷酸化蛋白含量增加或诊断以pTau-396磷酸化蛋白异常表达为表征的试剂；

检测pTau-181磷酸化蛋白的试剂的捕获抗体为杂交瘤细胞株3B6分泌的单克隆抗体，检测抗体为杂交瘤细胞株2A7分泌的单克隆抗体；检测pTau-231磷酸化蛋白的试剂的捕获抗体为杂交瘤细胞株3B6分泌的单克隆抗体，检测抗体为杂交瘤细胞株3G8分泌的单克隆抗体；检测pTau-396磷酸化蛋白的试剂的捕获抗体为杂交瘤细胞株3B6分泌的单克隆抗体，检测抗体为杂交瘤细胞株1F4分泌的单克隆抗体。

Images