CN114002435A - 三种用于检测人磷酸化Tau蛋白的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫检测领域，具体公开了三种用于检测人磷酸化Tau蛋白的试剂盒及其制备方法，其中公开的三种检测试剂盒是以单克隆抗体3G5为捕获抗体、单克隆抗体4B1为检测抗体，或者是以单克隆抗体4B1为捕获抗体、单克隆抗体3G5为检测抗体，能够检测p‑hTau396,404蛋白。本发明利用单克隆抗体3G5、4B1构建的三种检测试剂盒，分别适用于不同场景的检测，能够快速准确的检测人磷酸化Tau，整合了抗体的特异性和ELISA高灵敏度、免疫纳米磁珠的高效富集及胶体金试纸条方便快捷等特点，具有准确、快速、高效、特异、灵敏的特点，适用于快速、灵敏对阿尔兹海默症的早期诊断，对于患者的及时、准确地指导药物使用具有重要意义。

Description

三种用于检测人磷酸化Tau蛋白的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于免疫检测领域，更具体地，涉及三种用于检测人磷酸化Tau蛋白的试剂盒及其制备方法，分别为：用于检测人磷酸化Tau蛋白的双抗夹心ELISA试剂盒及其制备、人磷酸化Tau蛋白的免疫纳米磁珠试剂盒及其制备、人磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸条及其制备。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，简称AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。截至2020年，中国阿尔茨海默病每年新发患者超过100万例，阿尔茨海默病总患者人数超过1000万例。目前，我国是全球AD患者数量最多的国家，AD患者数居世界第一，占世界AD患者总人口的1/4，而这个数字还在随人口老龄化攀升。根据国际阿尔茨海默病协会的报告显示，每3秒钟，全球就有一位AD患者产生，我国每年平均有30万新发病例。
面对这样一个吞噬记忆的疾病，我们的应对方案却乏善可陈。相比庞大的患病人群，公众认知程度低、患者就诊率低、缺少创新且有效的治疗手段、家庭及社会照护成本高等，成为我国阿尔茨海默病的现状。AD防治是一个世界性难题，首要原因在于难以早期诊断。AD患病的病理特征包括含有淀粉样肽beta的斑块和含有Tau的神经纤维缠结(NFTs)。几十年来，淀粉样蛋白假说一直占据主导地位，基于淀粉样蛋白策略开发的靶向药物从临床结果来看大都不太理想。如今许多研究人员现在开始重新审视Tau蛋白，并且认为是阿尔茨海默症的重要生物学驱动因素。
Tau蛋白是一种微管相关蛋白，主要分布在神经元，其次是在神经胶质细胞。正常情况下，转录后的Tau发生磷酸化修饰而有利于微管的稳定。但过磷酸化的Tau蛋白(p-hTau)丧失了催化微管装配和稳定微管结构的正常生物活性，不仅与正常微管相关蛋白互相竞争，影响微管形成，且促使正常微管相关蛋白与微管分离，使微管崩解，轴突变性，影响神经递质的合成、运输、释放和摄取，造成神经细胞间的物质运输障碍，从而导致神经退行性变。目前，研究人员在tau蛋白上已发现大约有84个磷酸化位点，其中以tau蛋白181、199、231、396、404位点进行磷酸化较为常见。当前，研究较多的磷酸化tau蛋白包括p-hTau181、p-hTau231、p-hTau199，而p-hTau396，p-hTau404作为最早期的磷酸化位点，并且其磷酸化后更容易形成神经纤维缠结对突触的损伤最大，却很少被研究。以过度磷酸化的p-hTau396,404蛋白为核心形成的神经原纤维缠结是AD脑中的重要标志，糖基化与泛素化等与其关系密切。hTau蛋白功能异常改变可能是神经元功能障碍及死亡的必要环节，因而针对p-hTau396,404蛋白的代谢及功能作为靶点对积极预防和治疗AD等神经退行性疾病是非常有益的。当前已报道了多种针对p-hTau181、p-hTau231、p-hTau199的检测方法，较为遗憾的是，现有技术目前还没有检测特异性检测p-hTau396,404蛋白的试剂盒。而p-hTau396,404蛋白作为疾病早期事件，并伴随着疾病进程的加剧，其含量逐渐增加，能够准确的反映疾病的进程，具有重要检测意义。
综上所述，开发高特异性、高灵敏度检测不同形式的检测方法用于研究p-hTau396 ,404与AD疾病之间的潜在关系以及对于阿尔茨海默的早期诊断具有重大意义。
本发明发明人在前研究得到了“用于检测人淀粉样蛋白-β双抗夹心ELISA检测试剂盒”(可参见中国专利申请CN202011227418.8)，尽管其也公开了一种利用单克隆抗体1F12、2C6构建双抗夹心ELISA检测试剂盒，能够检测人淀粉样蛋白-β单体(hAβ1-42)、人淀粉样蛋白-β突变体单体(hAβ1-42Arc)、人淀粉样蛋白-β原纤维(hAβ1-42protofribril)、人淀粉样蛋白-β突变体原纤维(hAβ1-42Arc protofribril)，但不能够实现对p-hTau396,404蛋白的检测。
而本发明发明人在前研究得到了“用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸及其制备”(可参见中国专利文献CN202110067679.6)，尽管其也公开了一种能够检测不同形式人淀粉样蛋白-β(即，人淀粉样蛋白-β单体、人淀粉样蛋白-β寡聚体)的的胶体金免疫层析试纸，但同样存在不能对p-hTau396,404进行检测的问题。
另一方面，本发明发明人所在课题组前期研究得到了分泌人p-Tau396,404蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(中国专利申请号：202110067436.2)向中国国家知识产权局提出了专利申请。本申请请求引用这件中国专利申请的全部内容(即，请求引用于2021年1月19日提交中国国家知识产权局专利局、申请号为202110067436.2、发明名称为“分泌抗丝氨酸磷酸化tau单克隆抗体的杂交瘤细胞株”的中国专利申请的全部内容。
进一步的，虽然该在前研究验证了利用杂交瘤细胞株Hustaumab-3G5、Hustaumab-4B1，能够制备获得特异性识别人源p-Tau 396,404及其聚集体的单克隆抗体，但基于这两种抗体是否具有同一抗原不同的抗原决定簇仍然是未知。具有不同表位的单克隆抗体是实现对p-Tau 396,404蛋白的关键。因此，本发明在前期发明的基础上通过大量实验摸索，单克隆抗体3G5，4B1可能结合的表位。最终通过dot blot方法成功鉴定出单克隆抗体3G5，4B1的表位，鉴定结果表明为一组同一抗原不同的抗原表位的配对抗体。进一步的探索了抗体的配对机制，确定了最佳抗体配对组合，通过一系列的实验优化，建立并制备多种检测p-Tau396,404蛋白的检测方法和试剂盒。
发明内容
针对当前缺乏高特异性、灵敏度p-hTau396,404的检测试剂盒问题，本发明的目的在于提供三种用于检测人磷酸化tau蛋白的试剂盒及其制备方法，利用新发现的单克隆抗体3G5和单克隆抗体4B1的配合作用机制，得到的三种用于检测人磷酸化Tau蛋白的试剂盒，可用来快速定量检测p-hTau396,404含量，具有快速、特异强、灵敏高的特点，适用于快速、灵敏对阿尔兹海默症的早期诊断，对于患者的及时、准确地指导药物使用具有重要意义。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于检测人磷酸化Tau蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，该双抗夹心ELISA检测试剂盒是以单克隆抗体3G5为捕获抗体，单克隆抗体4B1为检测抗体，能够检测p-hTau396,404蛋白，即，人396，404位点丝氨酸磷酸化的Tau蛋白；或者，该双抗夹心ELISA检测试剂盒是以单克隆抗体4B1为捕获抗体，单克隆抗体3G5为检测抗体，能够检测p-hTau396,404蛋白，即，人396，404位点丝氨酸磷酸化的Tau蛋白；
其中，分泌单克隆抗体3G5的杂交瘤细胞株Hustaumab-3G5于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020219；分泌单克隆抗体4B1的杂交瘤细胞株Hustaumab-4B1于2020年11月10保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2020218。
作为本发明的进一步优选，所述检测抗体被辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、生物素或量子点标记。
作为本发明的进一步优选，还以TMB作为显色液。
按照本发明的另一方面，本发明提供了一种用于检测人磷酸化Tau蛋白的免疫纳米磁珠检测试剂盒，其特征在于，该免疫纳米磁珠检测试剂盒包括纳米磁珠包被物、以及用于与所述纳米磁珠包被物配合作用的检测抗体；
所述纳米磁珠包被物为单克隆抗体3G5与纳米磁珠偶联得到的，所述检测抗体为单克隆抗体4B1；或者，所述纳米磁珠包被物为单克隆抗体4B1与纳米磁珠偶联得到的，所述检测抗体为单克隆抗体3G5；
该免疫纳米磁珠检测试剂盒能够检测p-hTau396,404蛋白，即，人396，404位点丝氨酸磷酸化的Tau蛋白，其中，所述纳米磁珠包被物用于富集待测样品中的p-hTau396,404蛋白，并与所述检测抗体形成三明治结构；
其中，分泌单克隆抗体3G5的杂交瘤细胞株Hustaumab-3G5于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020219；分泌单克隆抗体4B1的杂交瘤细胞株Hustaumab-4B1于2020年11月10保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2020218。
作为本发明的进一步优选，所述检测抗体被辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、生物素或量子点标记；
所述纳米磁珠具体为羧基、氨基或N-羟基琥珀酰亚胺修饰的纳米磁珠粒子。
作为本发明的进一步优选，还以TMB作为显色液。
按照本发明的又一方面，本发明提供了一种用于检测人磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸，包括底板，以及重叠设置在该底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，其特征在于，
所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体3G5；所述层析膜上设有一条检测线和一条质控线，所述检测线包被有单克隆抗体4B1，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；该胶体金免疫层析试纸能够检测p-hTau396,404蛋白，即，人396，404位点丝氨酸磷酸化的Tau蛋白；
或者，所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体4B1；所述层析膜上设有一条检测线和一条质控线，所述检测线包被有单克隆抗体3G5，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；该胶体金免疫层析试纸能够检测p-hTau396,404蛋白，即，人396，404位点丝氨酸磷酸化的Tau蛋白；
其中，分泌单克隆抗体3G5的杂交瘤细胞株Hustaumab-3G5于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020219；分泌单克隆抗体4B1的杂交瘤细胞株Hustaumab-4B1于2020年11月10保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2020218。
按照本发明的再一方面，本发明提供了一种用于定量检测人磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试剂盒，其特征在于，包括如上述用于检测人磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸以及与该试纸配合使用的金标免疫分析仪。
按照本发明的最后一方面，本发明提供了制备如上述用于检测人磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸的方法，其特征在于，制备方法包括如下步骤：
制备样品垫步骤：样品垫采用玻璃纤维膜，使用含1wt％BSA、2wt％Sucrose、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液处理玻璃纤维膜1h后，烘干制成样品垫；
制备结合物释放垫步骤：结合物释放垫采用玻璃纤维膜，使用含0.03wt％Tris、2wt％Sucrose、0.2wt％Casein、1wt％BSA、0.1wt％PVP、1wt％NaN3、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液预处理玻璃纤维膜1h后烘干备用；接着，将胶体金标记的单克隆抗体3G5的浓缩液用8mL重悬液溶解均匀的铺于玻璃纤维膜上，37℃干燥24h后，密封备用；
制备层析膜步骤：层析膜采用硝酸纤维素膜，在层析膜上设置一条检测线和一条质控线，其中，所述检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体4B1，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
组装试纸条步骤：将所述样品垫、所述结合物释放垫和所述层析膜依次压覆在底板上，并且在边缘重叠2～3mm；吸水垫压覆在所述层析膜的另一端且边缘重叠2～3mm，即可组装得到用于检测人磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸；
其中，所述胶体金标记的单克隆抗体3G5的浓缩液的制备过程，包括如下步骤：
S1：取10mL烧制完成的胶体金溶液，加入10-30μL 0.1M K2CO3溶液，混匀，在磁力搅拌下分别加入含有100-300μg单克隆抗体3G5的溶液，混匀，静置10-30min；
S2：向所述步骤S1得到的溶液中分别逐滴加入100μL含10-20wt％BSA的溶液，混匀后静置10-30min；接着，4000r/min离心10-30min进行第一次离心，然后将第一次离心得到的上清移到另一离心管中，8000r/min离心10-30min进行第二次离心；接着，再将第二次离心得到的上清移到另一离心管中，12000r/min离心10-30min进行第三次离心，去上清；这三次离心所得的沉淀即为胶体金标记的单克隆抗体3G5的浓缩液；
或者，制备方法包括如下步骤：
制备样品垫步骤：样品垫采用玻璃纤维膜，使用含1wt％BSA、2wt％Sucrose、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液处理玻璃纤维膜1h后，烘干制成样品垫；
制备结合物释放垫步骤：结合物释放垫采用玻璃纤维膜，使用含0.03wt％Tris、2wt％Sucrose、0.2wt％Casein、1wt％BSA、0.1wt％PVP、1wt％NaN3、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液预处理玻璃纤维膜1h后烘干备用；接着，将胶体金标记的单克隆抗体4B1的浓缩液用8mL重悬液溶解均匀的铺于玻璃纤维膜上，37℃干燥24h后，密封备用；
制备层析膜步骤：层析膜采用硝酸纤维素膜，在层析膜上设置一条检测线和一条质控线，其中，所述检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体3G5，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
组装试纸条步骤：将所述样品垫、所述结合物释放垫和所述层析膜依次压覆在底板上，并且在边缘重叠2～3mm；吸水垫压覆在所述层析膜的另一端且边缘重叠2～3mm，即可组装得到用于检测人磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸；
其中，所述胶体金标记的单克隆抗体4B1的浓缩液的制备过程，包括如下步骤：
S1：取10mL烧制完成的胶体金溶液，加入10-30μL 0.1M K2CO3溶液，混匀，在磁力搅拌下分别加入含有100-300μg单克隆抗体4B1的溶液，混匀，静置10-30min；
S2：向所述步骤S1得到的溶液中分别逐滴加入100μL含10-20wt％BSA的溶液，混匀后静置10-30min；接着，4000r/min离心10-30min进行第一次离心，然后将第一次离心得到的上清移到另一离心管中，8000r/min离心10-30min进行第二次离心；接着，再将第二次离心得到的上清移到另一离心管中，12000r/min离心10-30min进行第三次离心，去上清；这三次离心所得的沉淀即为胶体金标记的单克隆抗体4B1的浓缩液。
作为本发明的进一步优选，所述胶体金溶液中的胶体金为氯金酸在柠檬酸钠还原下烧制获得的30-40nm的胶体金颗粒。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，本发明利用前期研究积累所得的抗p-hTau396,404蛋白抗体3G5、抗p-hTau396,404蛋白抗体4B1基于双抗体夹心原理构建了三种不同形式的检测方法用于高特异性、灵敏度的定量检测人p-hTau396,40，以实现对AD疾病的早期检测，填补了当前p-hTau396,404检测试剂盒的空白。
本发明在前期的分泌人p-Tau396,404蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(中国专利申请号：202110067436.2)的基础上，通过大量实验摸索单克隆抗体3G5，4B1可能结合的表位，因为具有不同表位的单克隆抗体是实现对p-Tau396,404蛋白的关键。因此，我们通过对p-hTau396,404肽的截短，通过dot blot的方法鉴定出两株单克隆抗体的抗原决定簇。dot blot结果表明，单克隆抗体3G5特异性识别396位点丝氨酸磷酸化的Tau蛋白，但是不识别非396位点丝氨酸磷酸化的Tau蛋白。单克隆抗体4B1特异性识别396和404位点丝氨酸磷酸化的Tau蛋白，但是不识别非396和404位点丝氨酸磷酸化的Tau蛋白。上述结果表明，筛选得到了两株单克隆抗体是磷酸化位点选择性，且具有不同抗原决定簇。基于这一对抗体，本发明通过两种抗体配对，通过夹心ELISA方法，首次筛选得到特异性检测p-hTau396,404的抗体对，其中以3G5为捕获抗体、4B1为检测抗体效果要优于4B1为捕获抗体、3G5为检测抗体。基于筛选得到的抗体对，本发明还通过一系列的优化得到了高特异性、灵敏度的ELISA检测试剂盒。
此外，本发明对比我们前期的研究成果：一种用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸及其制备(中国专利申请号：202110067679.6)实现同时检测人淀粉样蛋白-β的单体、寡聚体，分泌抗丝氨酸磷酸化tau蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(中国专利申请号：202110067436.2)，本发明进一步的结合阿兹海默病的另一个核心生物标志物磷酸化Tau蛋白，利用新发现的单克隆抗体3G5和单克隆抗体4B1的配合作用机制，建立了检测人磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸，实现短时间、可视化对丝氨酸磷酸化tau蛋白的高灵敏度、特异性的检测。
最后，本发明还通过把新发现的单克隆抗体3G5和单克隆抗体4B1的配合作用机制，应用到磁性纳米粒子上，将单克隆抗体3G5偶联磁性纳米粒子上作为捕获抗体，将单克隆抗体4B1作为检测抗体。建立的磁性纳米粒子检测方法和试剂盒，能够有效的解决血液、脑脊液中396，404位点丝氨酸磷酸化tau蛋白含量低，难于富集导致检测结果不准确的难题。
综上，本发明利用单克隆抗体3G5、4B1构建的三种检测试剂盒，分别适用于不同场景的检测，能够快速准确的检测人磷酸化Tau，整合了抗体的特异性和ELISA高灵敏度、免疫纳米磁珠的高效富集及胶体金试纸条方便快捷等特点，具有准确、快速、高效、特异、灵敏的特点，适用于快速、灵敏对阿尔兹海默症的早期诊断，对于患者的及时、准确地指导药物使用具有重要意义。
附图说明
图1中的A为不同抗体的识别表位图。图1中的B为不同抗体对检测p-hTau396,404的最佳组合图。抗体组合3G5/4B1表示3G5为捕获抗体，4B1为标记抗体(即，加号“/”前的对应捕获抗体，加号“/”后的对应标记抗体；下同)。图1中的B所示柱状标记自左到右依次对应：3G5/4B1、4B1/3G5、3C1/4B1、4B1/3C1、4B1/4C6、4C6/4B1、Control。图1中的C双抗夹心ELISA特异性检测p-hTau396,404的结果图。图1中的D为所建立双抗夹心ELISA检测p-hTau396,404的灵敏度结果图。图1中的E和图1中的F均为所建立双抗夹心ELISA检测p-hTau396,404的标准曲线。其中，图1中的C所示柱状标记自左到右依次对应：p-Tau396,404、DMP、PIP、p-Tau231、np-Tau231、Aβ42、Aβ40、Control；图1中的D所示柱状标记自左到右依次对应p-Tau396,404浓度为：500ng/mL，250ng/mL，125ng/mL，62.5ng/mL，31.3ng/mL，15.6ng/mL，7.8ng/mL，3.9ng/mL，1.95ng/mL，0.977ng/mL，0.488ng/mL，0.244ng/mL，0.122ng/mL；图1中的E示出了p-Tau396 ,404浓度为0～500ng/mL区间所对应的OD450nm值标准曲线，标准曲线是由拟合得到的，拟合所对应的R2＝0.9937；图1中的F示出了p-Tau396,404浓度为0～125ng/mL区间所对应的OD450nm值标准曲线，Y＝0.01361*X+0.2870，拟合所对应的R2＝0.9584。
图2中的A为纳米磁珠偶联抗体的SDS-PAGE结果图；图2中的B为纳米磁珠偶联抗体的ELISA活性检测结果图；图2中的C为纳米磁珠偶联抗体的IP-western blot活性检测结果图；图2中的D为纳米磁珠偶联抗体前后的粒径测量结果图；图2中的E为纳米磁珠偶联抗体前后的电势测量结果图；
图3中的A为所建立的免疫纳米磁珠特异性检测p-hTau396,404的可视化结果图；图3中的B为免疫纳米磁珠特异性检测p-hTau396,404的光谱结果图；图3中的C为所建立免疫纳米磁珠检测p-hTau396,404的灵敏度可视化结果图；图3中的D为所建立免疫纳米磁珠灵敏度的光谱结果图；图3中的E为所建立免疫纳米磁珠的标准曲线图。图3中的E示出了p-Tau396,404浓度为0～100ng/mL区间所对应的OD450nm值标准曲线，Y＝0.258ln(x)+0.7759，拟合所对应的R2＝0.9487。
图4中的A为本发明基于以3G5为金标抗体，4B1为划膜抗体组装的胶体金免疫层析试纸条检测p-hTau396,404蛋白的特异性可视化图；图4中的B为以3G5为金标抗体，4B1为划膜抗体组装的基于胶体金免疫层析试纸条检测p-hTau396,404蛋白的灵敏度可视化图；图4中的C为以3G5为金标抗体，4B1为划膜抗体组装的胶体金免疫层析试纸条检测p-hTau396,404蛋白的特异性灰度值图；图4中的D为以3G5为金标抗体，4B1为划膜抗体组装的胶体金免疫层析试纸条检测p-hTau396,404蛋白的标准曲线；图4中的E为以3G5为金标抗体，4B1为划膜抗体组装的胶体金免疫层析试纸条检测p-hTau396,404蛋白与ELISA检测方法的线性曲线。其中，图4中的A所示出的试纸条自左到右依次对应p-hTau396,404，hAβ42，np-hTau231，p-hTau231，Cis-hTau，Trans-hTau，PBS。图4中的B所示出的试纸条自左到右依次对应1000ng/mL，500ng/mL，250ng/mL，125ng/mL，62.5ng/mL，31.3ng/mL，15.6ng/mL，7.8ng/mL，3.9ng/mL，1.95ng/mL，0.98ng/mL，0.49ng/mL，0.24ng/mL，0.12ng/mL，0.06ng/mL，PBS。图4中的D示出了hp-Tau396 ,404浓度为0～1000ng/mL区间所对应的灰度值标准曲线，拟合所对应的R2＝0.9845(图中插图对应0～500ng/mL浓度区间所对应的灰度值标准曲线，Y＝0.33056*X+0.89852，其中X、Y都是对数，拟合所对应的R2＝0.99248)。图4中的E示出了hp-Tau396,404浓度为0～250ng/mL区间所对应的试纸条(LFIS)检测结果与ELISA检测结果的线性曲线，该曲线为Y＝0.1998*X+8.329，拟合所对应的R2＝0.9698。图4中的F所示出的以4B1为金标抗体，3G5为划膜抗体组装的试纸条自左到右依次对应1000ng/mL，500ng/mL，250ng/mL，125ng/mL，62.5ng/mL，31.3ng/mL，15.6ng/mL，7.8ng/mL，3.9ng/mL，1.95ng/mL，0.98ng/mL，0.49ng/mL，0.24ng/mL，0.12ng/mL，0.06ng/mL。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
为便于下文指代，现将主要缩写的含义解释如下：
人396，404位点磷酸化Tau蛋白(Phosphorylated human Tau protein at 396,404)简写成：p-hTau396,404；
人231位点磷酸化Tau蛋白(Phosphorylated human tau protein at 231)简写成：p-hTau231；
人231位点顺式磷酸化Tau蛋白(Cis phosphorylated human tau protein at231)简写成：Cis-hTau；
人231位点反式磷酸化Tau蛋白(Trans phosphorylated human tau protein at231)简写成：Trans-hTau；
人231位点非磷酸化Tau蛋白(No phosphorylated human tau protein at 231)简写成：np-hTau231；
人淀粉样蛋白-β(human amyloid beta peptide(1-42))，简写成：hAβ42；
人淀粉样蛋白-β(human amyloid beta peptide(1-40))，简写成：hAβ40；
实施例1：筛选检测p-hTau396,404蛋白抗体对
1、单克隆抗体3C1、3G5、4B1、4C6的表位鉴定
1.1、设计不同位置截短的多肽：Tau蛋白第379氨基酸到第385氨基酸(Tau379-385):RENAKAK、Tau蛋白第386氨基酸到第392氨基酸(Tau386-392):TDHGAEI、396位点丝氨酸磷酸化Tau蛋白(p-Tau396):VYK-[Ser(P)]PVVS、404位点丝氨酸磷酸化Tau蛋白(p-Tau404):GDT[Ser(P)]PRHL、非396位点丝氨酸磷酸化Tau蛋白(np-Tau396):VYKSPVVS、非404位点丝氨酸磷酸化Tau蛋白(np-Tau404):GDTSPRHL。所有设计的多肽均由现有多肽合成技术合成。
1.2、Dot blot验证
①包被不同截短的多肽：用CBS缓冲液稀释不同截短的多肽至终浓度为10μg/mL，然后在硝酸纤维素膜上依次滴加20μL，于室温干燥10min。
②封闭：包被完成后，TBS-T洗涤3次后，加入封闭液，于37℃封闭2h；
③加入一抗：封闭完成后，分别加入单克隆抗体3C1、3G5、4B1、4C6，于37℃反应1h。其中，单克隆抗体3G5与4B1是按“分泌抗丝氨酸磷酸化tau单克隆抗体的杂交瘤细胞株”(中国专利申请号为202110067436.2)中记载的制备过程制备筛选得到；单克隆抗体3C1与4C6是按同样的方法同一批次筛选得到，具有相似性质。
④加入酶标二抗：TBS-T洗涤3次后，分别加入HRP标记的山羊抗小鼠的二抗，于37℃反应1h；
⑤显色：反应结束后，TBS-T洗涤3次后，加上显影剂进行成像；
结果：单克隆抗体3C1、3G5、4C6特异性识别p-Tau396，而不识别p-Tau404、np-Tau396、np-Tau404，而4B1特异性识别p-Tau396和p-Tau404，而不识别np-Tau396、np-Tau404，结果如图1中的A所示
2、筛选检测p-hTau396,404蛋白抗体对
①包被捕获抗体：用CBS缓冲液稀释单克隆抗体3C1、3G5、4B1、4C6至终浓度为10μg/mL，然后每孔加入100μL，于4℃包被过夜。
②封闭：包被完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入200μL的封闭液，于37℃封闭2h；
③加入抗原：封闭完成后，每孔用PBS-T洗涤3次，然后每孔加入0.1μg p-hTau396 ,404蛋白，室温孵育2h；弃上清，每孔用PBS-T洗涤3次；
④加入酶标抗体：每孔加入100μL HRP标记的3C1、3G5、4B1、4C6，室温反应1h；
⑤显色：反应结束后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL TMB，于37℃反应15min；
⑥终止：每孔加入50μL 2摩尔H2SO4终止反应，然后在酶标仪上读取OD450；
结果：在12组不同抗体组合中，3G5/4B1组合检测p-hTau396,404效果最好，其结果如图1中的B。
实施例2：双抗夹心ELISA的灵敏度、特异性评价
2.1双抗夹心ELISA的特异性检测
①包被捕获抗体：将3G5抗体用CBS分别稀释至10μg/mL，然后每孔加入100μL的抗体于4℃包被12h；
②封闭：包被完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入200μL的封闭液，于37℃封闭2h；
③加入抗原：分别将加入100μL 0.1mg/mL p-hTau396,404、Cis-hTau、Trans-hTau、p-hTau231、np-hTau231、hAβ42、hAβ40室温孵育2h；弃上清，每孔用PBS-T洗涤3次；
④加入酶标抗体：每孔加入100μL HRP标记的4B1，室温反应1h；
⑤显色：反应结束后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL TMB，于37℃反应15min；
⑥终止：每孔加入50μL 2摩尔H2SO4终止反应，然后在酶标仪上读取OD450；
结果：从双抗夹心ELISA结果可以看出，建立的双抗夹心ELISA能特异的与p-hTau396,404多肽反应，其特异性的检测结果如图1中的C所示；
2.2双抗夹心ELISA的灵敏度
①包被捕获抗体：将3G5抗体用CBS分别稀释至10μg/mL，然后每孔加入100μL的抗体于4℃包被12h；
②封闭：包被完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入200μL的封闭液，于37℃封闭2h；
③加入抗原：每孔加入100μL不同浓度的p-hTau396,404于室温孵育2h。
④加入酶标抗体：每孔加入100μL HRP标记的4B1，室温反应1h；
⑤显色：反应结束后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL TMB，于37℃反应15min；
⑥终止：每孔加入50μL 2摩尔H2SO4终止反应，然后在酶标仪上读取OD450；
结果：双抗夹心ELISA对p-hTau396,404最低检测线分别为122pg/mL结果如图1中的D所示，图1中的E和图1中的F均为双抗夹心ELISA检测p-hTau396,404多肽的标准曲线。
实施例3：构建免疫纳米磁珠检测试剂盒
3.1、免疫纳米磁珠的制备
1)将磁珠混合均匀，取10mg磁珠加入到2mL离心管中，磁性分离去除上清液；
2)加入1mL去离子水，混合均匀，磁性分离区上清液(重复2次)；
3)加入500～1000μL反应缓冲液(100mM MES,pH 5.0)，混合重悬磁珠，磁性分离去除上清液(重复2次)；
4)加入200μL反应缓冲液，混合重悬磁珠；
5)加入500μg 3G5抗体(提前用200μL反应缓冲液溶解)，分别加入100μL 10mg/mL的EDC-HCl和100μL 10mg/mL的NHS室温旋转混合30min；
6)将活化好的抗体加入到预处理的磁珠中室温旋转混合2～6hr；
7)加入1mL PBS-T，混合重悬磁珠，磁性分离去除上清液(重复3～5次)；
8)加入1mL 0.1M Tris-HCl，混合重悬磁珠，磁性分离去除上清液；
9)将上述磁珠分散于PBS，pH 7.4，0.1％BSA，0.02％NaN3长期保存；
结果：单抗3G5成功偶联到纳米磁珠上，并进行活性验证，其SDS-PAGE结果如图2中的A，其ELISA和IP-western blot活性检测结果如图2中的B、图2中的C，其偶联抗体前后的粒径、电势检测结果如图2中的D、图2中的E。
3.2、建立免疫磁珠检测传感器
(a)抗体结合反应：将样本加入到免疫纳米磁珠溶液中，于37℃100转/分钟反应0.5h；然后进行磁性分离，加入1mL的PBS-T重悬后磁性分离(此步骤重复3次)。
(b)加入酶标抗体将步骤(a)中的纳米磁珠-抗体-抗原的复合物中加入100μLHRP-mAb 4B1探针(1:1000)于37℃反应20min；
(c)显色：用PBS-T洗5次后，弃上清，加入100μL TMB避光显色10min；
(d)终止：最后加入50μL 2M H2SO4，在450nm处测其吸光值；
3.3、特异性检测
分别用免疫纳米磁珠捕获含有p-hTau396,404及不含p-hTau396,404，但含有Cis-hTau、Trans-hTau、p-hTau231、np-hTau231、hAβ42、hAβ40的混合物，捕获完成后按照实施例3-3.2进行；
结果：在3G5/4B1组合中，仅p-hTau396,404能被检测出来，反应液体为蓝色并展现出强的光密度曲线，而Cis-hTau、Trans-hTau、p-hTau231、np-hTau231、hAβ42、hAβ40均无明显阳性，反应液体为无色和弱的光密度曲线，其结果如图3中的A，图3中的B所示。
3.4、灵敏度检测
分别用小鼠血液稀释p-hTau396,404至终浓度100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.1ng/mL、1.6ng/mL、0.8ng/mL、0.4ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL。取30μL的纳米磁珠依次加入到上述样本中于37℃100转/分钟反应0.5h；磁性分离后按照实施例3-3.2进行纳米磁珠检测传感器灵敏度测试；
结果：利用纳米磁珠的检测方法，可将模拟血液样本中p-hTau396,404快速准确的检测出来，且检测下限达到50pg/mL，可视化结果如图3中的C、图3中的D；纳米磁珠传感器灵敏度光密度曲线如图3中的E所示。
实施例4：制备检测p-hTau396,404蛋白胶体金免疫层析试纸条
4.1、烧制30-40nm胶体金颗粒
参照Juewen Liu等制备胶体金的方法，制备粒径为30nm的胶体金，具体操作步骤如下：
向彻底洗净的250mL锥形瓶中依次加入99mL去离子水和1mL 1％氯金酸溶液，振荡混匀。用恒温电热搅拌器进行晃荡加热，调整电热搅拌器的电压和转速，并保持不变，加热数分钟后，待溶液开始轻微沸腾，一次性快速加入过滤后的1％柠檬酸三钠溶液1.5mL。继续加热数分钟后，溶液颜色由无色渐渐变为灰色，接着由灰色变黑色，再由黑色变紫色，最后逐渐变成红色。待溶液颜色保持红色不再变化时，保持溶液沸腾状态继续加热20min。然后关闭电热器，继续缓慢晃荡溶液直至冷却至室温。将制备好的胶体金溶液转移至干净无菌的丝口瓶中，封口置于4℃冰箱中避光保存。将制备好的不同粒径的胶体金溶液分别用紫外可见光光谱法和透射电镜法进行检测，所制备出的胶体金颗粒的粒径大小。
4.2、胶体金标记的p-hTau396,404蛋白抗体3G5复合物的制备
①各取10mL烧制完成的胶体金溶液，分别加入20μL 0.1M K2CO3溶液，各自混匀，在磁力搅拌下分别加入200μg的p-hTau396,404蛋白抗体3G5溶液，分别混匀，静置10min；
②对于静置完成后的每个试样溶液，逐滴加入100μL含20％BSA，混匀，静置10min，4000r/min离心10min，上清移到另一管，8000r/min离心10min，上清移到另一管，12000r/min离心10min，去上清，所得的沉淀即胶体金标记的p-hTau396,404抗体3G5复合物的浓缩液。
4.3、组装检测p-hTau396,404蛋白胶体金免疫层析试纸条
4.3.1、制备样品垫：所述样品垫采用玻璃纤维膜，使用含1％BSA、2％Sucrose、0.1％PEG、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液处理玻璃纤维膜1h后，烘干制成样品垫；
4.3.2、制备结合物释放垫:所述结合物释放垫采用玻璃纤维膜，使用含0.03％Tris、2％Sucrose、0.2％Casein、1％BSA、0.1％PVP、1％NaN3、0.1％PEG、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液预处理玻璃纤维膜1h后烘干备用；将所制备的胶体金标记的p-hTau396,404抗体3G5复合物的沉淀用8mL重悬液溶解均匀的铺于玻璃纤维膜上，37℃干燥24h后，密封备用。
4.3.3、制备层析膜：所述层析膜采用硝酸纤维素膜，在层析膜上设置一条检测线和一条质控线，所述检测线包被有1mg/mL的抗p-hTau396,404蛋白单克隆抗体4B1，所述质控线包被有0.5mg/mL的羊抗鼠IgG。
4.3.4、组装试纸条：样品垫、结合物释放垫、层析膜依次压覆在PVC底板上，并且在边缘重叠2～3mm；吸水垫压覆在层析膜的另一端且边缘重叠2～3mm，得到组装的定量检测p-hTau396,404蛋白双抗夹心胶体金免疫层析试纸条。
4.4、检测p-hTau396,404蛋白胶体金免疫层析试纸条的特异性、灵敏度评估
4.4.1、特异性评估
分别制备0.1μg/mL p-hTau396,404、hAβ42蛋白、np-hTau231、p-hTau231、Cis-htau、Trans-htau、PBS，分别取50μL滴加到试纸条上，5min后读取结果，进行特异性评估。
结果：从测试的试纸条的结果可以看出，建立的双抗夹心胶体金试纸条能特异的与p-hTau396,404蛋白反应，其特异性的检测结果如图4中的A和图4中的C所示；
4.4.2、灵敏度评估
制备不同浓度的p-hTau396,404蛋白，浓度从1000ng/mL到0.06ng/mL，分别取50μL滴加到试纸条上，5min后读取结果，进行灵敏度评估。
结果：从测试的试纸条的结果可以看出，建立的双抗夹心胶体金试纸条检测hp-Tau396,404蛋白的最低检测限为60pg/mL，其灵敏度的检测结果如图4中的B所示。建立的标准曲线如图4中的D所示。
4.4.3、准确性评估
制备不同浓度的p-hTau396,404蛋白，分别取50μL进行试纸条测试和ELISA测试。将两种检测的结果进行对比，以评估检测结果的准确性。
结果：从测试的试纸条、ELISA的结果可以看出，建立的两种检测方法检测结果基本相同如图4中的E所示。
上述实施例主要是以胶体金标记的单克隆抗体3G5为例，得到的用于检测人磷酸化tau蛋白的胶体金免疫层析试纸，其结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体3G5；层析膜上设有一条检测线和一条质控线，所述的检测线包被有单克隆抗体4B1，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。除了胶体金标记的单克隆抗体3G5外，胶体金标记的单克隆抗体4B1同样也适用；即，结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体也可以为4B1；层析膜上设有一条检测线和一条质控线，所述的检测线也可以包被有单克隆抗体3G5，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；虽然效果如图4中的F所示，灵敏度为1.95ng/mL，虽逊于胶体金标记的单克隆抗体3G5，但仍能用于检测人磷酸化tau蛋白。
与前期研究“分泌抗丝氨酸磷酸化tau单克隆抗体的杂交瘤细胞株”(中国专利申请号为202110067436.2)相似，本发明中分泌单克隆抗体3G5的杂交瘤细胞株Hustaumab-3G5于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020219；分泌单克隆抗体4B1的杂交瘤细胞株Hustaumab-4B1于2020年11月10保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020218。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测人磷酸化Tau蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，该双抗夹心ELISA检测试剂盒是以单克隆抗体3G5为捕获抗体，单克隆抗体4B1为检测抗体，能够检测p-hTau396,404蛋白，即，人396，404位点丝氨酸磷酸化的Tau蛋白；或者，该双抗夹心ELISA检测试剂盒是以单克隆抗体4B1为捕获抗体，单克隆抗体3G5为检测抗体，能够检测p-hTau396,404蛋白，即，人396，404位点丝氨酸磷酸化的Tau蛋白；
其中，分泌单克隆抗体3G5的杂交瘤细胞株Hustaumab-3G5于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020219；分泌单克隆抗体4B1的杂交瘤细胞株Hustaumab-4B1于2020年11月10保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020218。
2.如权利要求1所述用于检测人磷酸化Tau蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测抗体被辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、生物素或量子点标记。
3.如权利要求1所述用于检测人磷酸化Tau蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，还以TMB作为显色液。
4.一种用于检测人磷酸化Tau蛋白的免疫纳米磁珠检测试剂盒，其特征在于，该免疫纳米磁珠检测试剂盒包括纳米磁珠包被物、以及用于与所述纳米磁珠包被物配合作用的检测抗体；
所述纳米磁珠包被物为单克隆抗体3G5与纳米磁珠偶联得到的，所述检测抗体为单克隆抗体4B1；或者，所述纳米磁珠包被物为单克隆抗体4B1与纳米磁珠偶联得到的，所述检测抗体为单克隆抗体3G5；
该免疫纳米磁珠检测试剂盒能够检测p-hTau396,404蛋白，即，人396，404位点丝氨酸磷酸化的Tau蛋白，其中，所述纳米磁珠包被物用于富集待测样品中的p-hTau396,404蛋白，并与所述检测抗体形成三明治结构；
其中，分泌单克隆抗体3G5的杂交瘤细胞株Hustaumab-3G5于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020219；分泌单克隆抗体4B1的杂交瘤细胞株Hustaumab-4B1于2020年11月10保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020218。
5.如权利要求4所述用于检测人磷酸化Tau蛋白的免疫纳米磁珠检测试剂盒，其特征在于，所述检测抗体被辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、生物素或量子点标记；
所述纳米磁珠具体为羧基、氨基或N-羟基琥珀酰亚胺修饰的纳米磁珠粒子。
6.如权利要求4所述用于检测人磷酸化Tau蛋白的免疫纳米磁珠检测试剂盒，其特征在于，还以TMB作为显色液。
7.一种用于检测人磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸，包括底板，以及重叠设置在该底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，其特征在于，
所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体3G5；所述层析膜上设有一条检测线和一条质控线，所述检测线包被有单克隆抗体4B1，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；该胶体金免疫层析试纸能够检测p-hTau396,404蛋白，即，人396，404位点丝氨酸磷酸化的Tau蛋白；
或者，所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体4B1；所述层析膜上设有一条检测线和一条质控线，所述检测线包被有单克隆抗体3G5，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；该胶体金免疫层析试纸能够检测p-hTau396,404蛋白，即，人396，404位点丝氨酸磷酸化的Tau蛋白；
其中，分泌单克隆抗体3G5的杂交瘤细胞株Hustaumab-3G5于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020219；分泌单克隆抗体4B1的杂交瘤细胞株Hustaumab-4B1于2020年11月10保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020218。
8.一种用于定量检测人磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试剂盒，其特征在于，包括如权利要求7所述用于检测人磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸以及与该试纸配合使用的金标免疫分析仪。
9.制备如权利要求7所述用于检测人磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸的方法，其特征在于，制备方法包括如下步骤：
制备样品垫步骤：样品垫采用玻璃纤维膜，使用含1wt％BSA、2wt％Sucrose、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液处理玻璃纤维膜1h后，烘干制成样品垫；
制备结合物释放垫步骤：结合物释放垫采用玻璃纤维膜，使用含0.03wt％Tris、2wt％Sucrose、0.2wt％Casein、1wt％BSA、0.1wt％PVP、1wt％NaN3、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液预处理玻璃纤维膜1h后烘干备用；接着，将胶体金标记的单克隆抗体3G5的浓缩液用8mL重悬液溶解均匀的铺于玻璃纤维膜上，37℃干燥24h后，密封备用；
制备层析膜步骤：层析膜采用硝酸纤维素膜，在层析膜上设置一条检测线和一条质控线，其中，所述检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体4B1，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
组装试纸条步骤：将所述样品垫、所述结合物释放垫和所述层析膜依次压覆在底板上，并且在边缘重叠2～3mm；吸水垫压覆在所述层析膜的另一端且边缘重叠2～3mm，即可组装得到用于检测人磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸；
其中，所述胶体金标记的单克隆抗体3G5的浓缩液的制备过程，包括如下步骤：
S1：取10mL烧制完成的胶体金溶液，加入10-30μL 0.1M K2CO3溶液，混匀，在磁力搅拌下分别加入含有100-300μg单克隆抗体3G5的溶液，混匀，静置10-30min；
S2：向所述步骤S1得到的溶液中分别逐滴加入100μL含10-20wt％BSA的溶液，混匀后静置10-30min；接着，4000r/min离心10-30min进行第一次离心，然后将第一次离心得到的上清移到另一离心管中，8000r/min离心10-30min进行第二次离心；接着，再将第二次离心得到的上清移到另一离心管中，12000r/min离心10-30min进行第三次离心，去上清；这三次离心所得的沉淀即为胶体金标记的单克隆抗体3G5的浓缩液；
或者，制备方法包括如下步骤：
制备样品垫步骤：样品垫采用玻璃纤维膜，使用含1wt％BSA、2wt％Sucrose、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液处理玻璃纤维膜1h后，烘干制成样品垫；
制备结合物释放垫步骤：结合物释放垫采用玻璃纤维膜，使用含0.03wt％Tris、2wt％Sucrose、0.2wt％Casein、1wt％BSA、0.1wt％PVP、1wt％NaN3、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液预处理玻璃纤维膜1h后烘干备用；接着，将胶体金标记的单克隆抗体4B1的浓缩液用8mL重悬液溶解均匀的铺于玻璃纤维膜上，37℃干燥24h后，密封备用；
制备层析膜步骤：层析膜采用硝酸纤维素膜，在层析膜上设置一条检测线和一条质控线，其中，所述检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体3G5，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
组装试纸条步骤：将所述样品垫、所述结合物释放垫和所述层析膜依次压覆在底板上，并且在边缘重叠2～3mm；吸水垫压覆在所述层析膜的另一端且边缘重叠2～3mm，即可组装得到用于检测人磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸；
其中，所述胶体金标记的单克隆抗体4B1的浓缩液的制备过程，包括如下步骤：
S1：取10mL烧制完成的胶体金溶液，加入10-30μL 0.1M K2CO3溶液，混匀，在磁力搅拌下分别加入含有100-300μg单克隆抗体4B1的溶液，混匀，静置10-30min；
S2：向所述步骤S1得到的溶液中分别逐滴加入100μL含10-20wt％BSA的溶液，混匀后静置10-30min；接着，4000r/min离心10-30min进行第一次离心，然后将第一次离心得到的上清移到另一离心管中，8000r/min离心10-30min进行第二次离心；接着，再将第二次离心得到的上清移到另一离心管中，12000r/min离心10-30min进行第三次离心，去上清；这三次离心所得的沉淀即为胶体金标记的单克隆抗体4B1的浓缩液。
10.如权利要求9所述方法，其特征在于，所述胶体金溶液中的胶体金为氯金酸在柠檬酸钠还原下烧制获得的30-40nm的胶体金颗粒。
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