CN112881708A - 用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸及其制备 - Google Patents

用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸及其制备 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种用于检测人淀粉样蛋白‑β的胶体金免疫层析试纸及其制备，该试纸包括底板，以及重叠设置在该底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体1F12；层析膜上的第一检测线包被有单克隆抗体1F12，第二检测线包被有单克隆抗体2C6，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。本发明通过对试纸的细节组成等进行改进，得到能够检测人淀粉样蛋白‑β的胶体金免疫层析试纸，能够用于检测不同形式人淀粉样蛋白‑β，如人淀粉样蛋白‑β单体、人淀粉样蛋白‑β寡聚体，填补了当前hAβ1‑42蛋白检测领域基于胶体金试纸条实现同时检测hAβ1‑42单体和寡聚体蛋白的空白。

Description

用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸及其制备
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸及其制备，该试纸利用了双抗体夹心检测抗原的原理，能够用于检测不同形式人淀粉样蛋白-β，包括人淀粉样蛋白-β单体(human amyloid beta peptide(1-42)Monomers,hAβ1-42Ms)、人淀粉样蛋白-β寡聚体(human amyloid beta peptide(1-42)Oligomers,hAβ1-42Os)，该试纸及基于该试纸构成的试剂盒能够应用于检测，实现快速、灵敏的检测。
背景技术
阿兹海默病(Alzheimer's disease,AD)，又译为阿尔茨海默病，是一种神经退行性疾病，其特征是淀粉样斑块和神经原纤维缠结的大脑沉积。截至2020年，中国阿尔茨海默病每年新发患者超过100万例，阿尔茨海默病总患者人数接近750万例。随着人口结构步入老龄化，中国阿尔茨海默病患者总数至2029年预计将会超过1000万例，10年复合增长率达到4％。而这一增长在中国城市人口中尤为显著，10年复合增长率将达到6％。
在全球都面临人口老龄化的当下，面对这样一个吞噬记忆的疾病，我们的应对方案却乏善可陈。目前用于阿尔茨海默病治疗的药物均为改善症状的药物，尚无真正的改善疾病的治疗(disease modifying therapy，DMT)来减缓、阻止或逆转AD患者的神经元丢失，毫无疑问，这是目前最迫切的未满足临床需求。作为一种神经退行性的疾病，阿尔茨海默病发病机制复杂且特征不明确，给该方向的基础研究带来了巨大的挑战，尽管如此，基于临床前的早期诊断是极其需要的。
目前，阿尔茨海默病的检测主要有β-淀粉样蛋白的PET成像和基于脑脊液的Aβ检测这两种方法。临床上PET每次检测价格在人民币7千至1万元之间，且设备有限，导致了很多患者未能及时就医，进而失去了最佳治疗时间；而脑脊液的获取需要通过腰椎穿刺，创伤较大，且很难短时间内进行多次取样。基于血液生物标志物的测试方式简单、易用，有利于对病人的筛查，但存在生物标志物浓度低，干扰信号大的缺陷。
本发明发明人所在课题组前期研究得到了分泌人淀粉样蛋白-β单克隆抗体的杂交瘤细胞株(中国专利申请号：202011227808.5)、以及用于检测人淀粉样蛋白-β双抗夹心ELISA检测试剂盒(中国专利申请号：202011227418.8)，分别向中国国家知识产权局提出了专利申请。本申请请求引用这2件中国专利申请的全部内容(即，请求引用于2020年11月06日提交中国国家知识产权局专利局、申请号为202011227808.5、发明名称为“分泌人淀粉样蛋白-β单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用”的中国专利申请的全部内容，以及于2020年11月06日提交中国国家知识产权局专利局、申请号为202011227418.8、发明名称为“用于检测人淀粉样蛋白-β双抗夹心ELISA检测试剂盒”的中国专利申请的全部内容)。
前期研究结果表明外周血中42个氨基酸残基的淀粉样蛋白多肽(human amyloidbeta1-42,hAβ1–42)是AD很好的生物标志物。先前的研究结果表明，脑脊液和外周血中异常减少的可溶性的hAβ1–42与AD疾病进程密切相关。随后的研究结果进一步发现，与淀粉样蛋白斑块负担相比，可溶性hAβ1-42Oligomers(寡聚体)体外和体内均显示出神经毒性和抑制突触的功能，与认知能力下降相关性更大，是AD诊断与治疗很有吸引力的靶标。当前已报道了多种针对hAβ1–42单体及可溶性寡聚体的检测方法，较为遗憾的是，目前仅实现了单靶标的检测且主要基于较为传统的ELISA检测方法。与传统的ELISA检测方法相比基于胶体金试纸条检测方法具有检测时间短通常仅需3-5min，操作简便可随时随地进行，检测成本低等诸多优点。此外，与单个生物标志物的检测方法相比，同时靶向hAβ1–42单体及可溶性寡聚体的多个生物标志物的检测方法能够有效的提高检测的灵敏度、特异性和准确性。但是，目前基于胶体金试纸条法，同时靶向hAβ1–42单体及可溶性寡聚体的两种生物标志物的检测方法还尚未报道。
综上所述，开发高特异性、高灵敏度检测不同形式的人淀粉样蛋白-β，尤其是可溶性hAβ1-42单体和hAβ1-42寡聚体的胶体金试纸条检测方法，对于阿尔茨海默的早期诊断具有重大意义。
发明内容
针对现有技术中hAβ1-42蛋白检测的以上缺陷，本发明的目的在于提供一种用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸及其制备，其中通过对试纸的细节组成等进行改进，得到能够检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸，填补了当前Aβ1-42蛋白检测领域基于胶体金试纸条实现同时检测hAβ1-42单体和寡聚体蛋白的空白；该试纸及利用该试纸构建的试剂盒，能够用于检测不同形式人淀粉样蛋白-β，包括人淀粉样蛋白-β单体(humanamyloid beta peptide(1-42)Monomers,hAβ1-42Ms)、人淀粉样蛋白-β寡聚体(humanamyloid beta peptide(1-42)Oligomers,hAβ1-42Os)，用来快速定量检测hAβ1-42和hAβ1- 42Oligomer含量，具有快速、特异强、灵敏高的特点，适用于快速、灵敏对阿尔兹海默症的早期诊断，对于患者的及时、准确地指导药物使用具有重要意义。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸，包括底板，以及重叠设置在该底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，其特征在于，所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体1F12；所述层析膜上设有两条检测线和一条质控线，记这两条检测线分别为第一检测线和第二检测线，所述第一检测线包被有单克隆抗体1F12，所述第二检测线包被有单克隆抗体2C6，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；
其中，分泌单克隆抗体1F12的杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020131；分泌单克隆抗体2C6的杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020132。
本发明的另一方面，提供了一种用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸，包括底板，以及重叠设置在该底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，其特征在于，所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体2C6；所述层析膜上设有两条检测线和一条质控线，记这两条检测线分别为第一检测线和第二检测线，所述第一检测线包被有单克隆抗体2C6，所述第二检测线包被有单克隆抗体1F12，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；
其中，分泌单克隆抗体1F12的杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020131；分泌单克隆抗体2C6的杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020132。
作为本发明的进一步优选，所述第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，所述第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
或者，所述第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，所述第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体。
作为本发明的进一步优选，所述胶体金标记的单克隆抗体1F12，是按包括如下步骤的制备方法制备得到的：
S1：取10mL烧制完成的胶体金溶液，加入10-30μL 0.1M K2CO3溶液，混匀，在磁力搅拌下加入含有100-300μg单克隆抗体1F12的溶液，混匀，静置10-30min；
S2：向所述步骤S1得到的溶液中逐滴加入100μL含10-20wt％BSA的溶液，混匀后静置10-30min；接着，4000r/min离心10-30min进行第一次离心，然后将第一次离心得到的上清移到另一离心管中，8000r/min离心10-30min进行第二次离心；接着，再将第二次离心得到的上清移到另一离心管中，12000r/min离心10-30min进行第三次离心，去上清；这三次离心所得的沉淀即为胶体金标记的单克隆抗体1F12的浓缩液。
作为本发明的进一步优选，所述胶体金标记的单克隆抗体2C6，是按包括如下步骤的制备方法制备得到的：
S1：取10mL烧制完成的胶体金溶液，加入10-30μL 0.1M K2CO3溶液，混匀，在磁力搅拌下加入含有100-300μg单克隆抗体2C6的溶液，混匀，静置10-30min；
S2：向所述步骤S1得到的溶液中逐滴加入100μL含10-20wt％BSA的溶液，混匀后静置10-30min；接着，4000r/min离心10-30min进行第一次离心，然后将第一次离心得到的上清移到另一离心管中，8000r/min离心10-30min进行第二次离心；接着，再将第二次离心得到的上清移到另一离心管中，12000r/min离心10-30min进行第三次离心，去上清；这三次离心所得的沉淀即为胶体金标记的单克隆抗体2C6的浓缩液。
作为本发明的进一步优选，所述胶体金溶液中的胶体金为氯金酸在柠檬酸钠还原下烧制获得的30-40nm的胶体金颗粒。
作为本发明的进一步优选，所述底板为PVC底板。
按照本发明的又一方面，本发明提供了制备上述用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备样品垫步骤：样品垫采用玻璃纤维膜，使用含1wt％BSA、2wt％Sucrose、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液处理玻璃纤维膜1h后，烘干制成样品垫；
制备结合物释放垫步骤：结合物释放垫采用玻璃纤维膜，使用含0.03wt％Tris、2wt％Sucrose、0.2wt％Casein、1wt％BSA、0.1wt％PVP、1wt％NaN3、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液预处理玻璃纤维膜1h后烘干备用；接着，将胶体金标记的单克隆抗体1F12的浓缩液用8mL重悬液溶解均匀的铺于玻璃纤维膜上，37℃干燥24h后，密封备用；
制备层析膜步骤：层析膜采用硝酸纤维素膜，在层析膜上设置两条检测线和一条质控线，其中，第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
组装试纸条步骤：将所述样品垫、所述结合物释放垫和所述层析膜依次压覆在底板上，并且在边缘重叠2～3mm；吸水垫压覆在所述层析膜的另一端且边缘重叠2～3mm，即可组装得到用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸；
其中，所述胶体金标记的单克隆抗体1F12的浓缩液的制备过程，包括如下步骤：
S1：取10mL烧制完成的胶体金溶液，加入10-30μL 0.1M K2CO3溶液，混匀，在磁力搅拌下加入含有100-300μg单克隆抗体1F12的溶液，混匀，静置10-30min；
S2：向所述步骤S1得到的溶液中逐滴加入100μL含10-20wt％BSA的溶液，混匀后静置10-30min；接着，4000r/min离心10-30min进行第一次离心，然后将第一次离心得到的上清移到另一离心管中，8000r/min离心10-30min进行第二次离心；接着，再将第二次离心得到的上清移到另一离心管中，12000r/min离心10-30min进行第三次离心，去上清；这三次离心所得的沉淀即为胶体金标记的单克隆抗体1F12的浓缩液。
按照本发明的再一方面，本发明提供了制备上述用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备样品垫步骤：样品垫采用玻璃纤维膜，使用含1wt％BSA、2wt％Sucrose、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液处理玻璃纤维膜1h后，烘干制成样品垫；
制备结合物释放垫步骤：结合物释放垫采用玻璃纤维膜，使用含0.03wt％Tris、2wt％Sucrose、0.2wt％Casein、1wt％BSA、0.1wt％PVP、1wt％NaN3、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液预处理玻璃纤维膜1h后烘干备用；接着，将胶体金标记的单克隆抗体2C6的浓缩液用8mL重悬液溶解均匀的铺于玻璃纤维膜上，37℃干燥24h后，密封备用；
制备层析膜步骤：层析膜采用硝酸纤维素膜，在层析膜上设置两条检测线和一条质控线，其中，第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
组装试纸条步骤：将所述样品垫、所述结合物释放垫和所述层析膜依次压覆在底板上，并且在边缘重叠2～3mm；吸水垫压覆在所述层析膜的另一端且边缘重叠2～3mm，即可组装得到用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸；
其中，所述胶体金标记的单克隆抗体2C6的浓缩液的制备过程，包括如下步骤：
S1：取10mL烧制完成的胶体金溶液，加入10-30μL 0.1M K2CO3溶液，混匀，在磁力搅拌下加入含有100-300μg单克隆抗体2C6的溶液，混匀，静置10-30min；
S2：向所述步骤S1得到的溶液中逐滴加入100μL含10-20wt％BSA的溶液，混匀后静置10-30min；接着，4000r/min离心10-30min进行第一次离心，然后将第一次离心得到的上清移到另一离心管中，8000r/min离心10-30min进行第二次离心；接着，再将第二次离心得到的上清移到另一离心管中，12000r/min离心10-30min进行第三次离心，去上清；这三次离心所得的沉淀即为胶体金标记的单克隆抗体2C6的浓缩液。
按照本发明的最后一方面，本发明提供了一种用于定量检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试剂盒，其特征在于，包括上述用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸以及与该试纸配合使用的金标免疫分析仪。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，本发明利用前期研究积累所得的抗hAβ1-42蛋白抗体1F12、抗hAβ1-42蛋白抗体2C6，基于双抗体夹心胶体金显色原理构建胶体金免疫层析试纸，其中，固定于结合物释放垫上的胶体金标记的hAβ1-42蛋白抗体复合物和检测线的抗hAβ1-42蛋白抗体分别识别hAβ1-42蛋白的不同的抗原决定簇，当待测样品中含有hAβ1-42单体和寡聚体蛋白时，首先在结合物释放垫形成hAβ1-42单体/寡聚体蛋白-胶体金-hAβ1-42蛋白抗体1F12复合物，从而与检测线上的抗hAβ1-42蛋白抗体1F12结合，在第一条检测线显色，剩余的hAβ1-42单体/胶体金-hAβ1-42蛋白抗体1F12复合物与检测线上的抗hAβ1-42蛋白抗体2C6结合在第二条检测线显色，质控线会一直显色以保证试纸条有效。当待测样品中不含有hAβ1-42蛋白时，只有质控线会显色。
基于该试纸得到的胶体金免疫层析试剂盒，则是同时基于双抗体夹心胶体金显色以及金标免疫分析仪定量的原理，可实现定性、定量检测；相应的，在检测应用时，可以先将胶体金免疫层析试纸平放，吸取一系列含hAβ1-42蛋白浓度梯度的样品，每个浓度梯度的样品取50μL分别滴加到样品垫上；这些样品经过层析作用与结合物释放垫上的胶体金标记的hAβ1-42蛋白抗体1F12复合物特异性结合；待样品中的hAβ1-42蛋白与胶体金标记的hAβ1-42蛋白抗体复合物进一步经过两条检测线和质控线；静置5-10min；最后通过金标免疫分析仪对检测线的显色强度进行测量，即可对样品中的hAβ1-42蛋白含量进行精确定量。本申请定量检测hAβ1-42蛋白双抗体夹心胶体金免疫层析试剂盒采用胶体金免疫层析试纸条结合金标免疫分析仪，可同时实现对样品中的hAβ1-42单体蛋白、hAβ1-42寡聚体蛋白实现快速定量检测，极大的缩短了检测时间，并可实现大批量样品的快速准确筛查。
与目前的常ELISA检测试剂盒方法相比，具体说来，本发明中的试纸及试剂盒具有以下优势：
(1)本发明采用的双抗夹心胶体金试纸条技术具有操作简便、快速等特点，适合于基层推广应用；此外，检测结果可以通过肉眼直接观察和判定结果，可实现快速判定(例如可仅需5-10min)，无需昂贵的仪器如正电子发射计算机断层显像、核磁共振成像等进行淀粉样蛋白-β的诊断；
(2)本发明的双抗夹心胶体金试纸条技术对比其他检测方法能够实现对不同形式的可溶性的人淀粉样蛋白-β的高灵敏度、高特异性的检测。针对可溶性的hAβ1-42Ms及神经毒性最强的hAβ1-42Os，本发明所建立的双抗夹心胶体金试纸条对hAβ1-42Os检测灵敏度高达154pg，而对hAβ1-42Ms的检测灵敏度可达到310pg；
(3)基于双抗夹心胶体金试纸条的敏感、特异，成本低廉，便于操作等诸多优势，本发明在一定程度上提高了我国阿兹海默综合症的检测能力，为阿兹海默综合征的临床实时快速诊断提供技术基础，对提高我国医疗机构对阿兹海默综合症的病情监控和快速检测水平，以及普及先进技术在基层检验检疫机构的推广应用均具有重要意义。
附图说明
图1中的A为本发明基于胶体金免疫层析试纸条检测hAβ1-42单体蛋白、hAβ1-42、寡聚体蛋白含量示意图；图1中的B为本发明胶体金免疫层析试纸条结果判定图。
图2中的A为本发明烧制40nm胶体金的光谱图；图2中的B为本发明烧制40nm胶体金的透射电镜图；图2中的C为本发明烧制40nm胶体金偶联抗体最佳pH值；图2中的D为本发明烧制40nm胶体金最佳偶联抗体量；图2中的E为本发明烧制40nm胶体金及对应复合物(胶体金偶联抗体1F12、2C6)的粒径测量结果图；图2中的F为本发明烧制40nm胶体金及对应复合物(胶体金偶联抗体1F12、2C6)的电势测量结果图；图2中的G为本发明烧制40nm胶体金偶联抗体1F12、2C6的SDS-PAGE结果图；
图2中的H为本发明复合物(即，本发明烧制40nm胶体金偶联抗体1F12、2C6)的ELISA活性检测图。
图3中的A为本发明基于胶体金免疫层析试纸条检测hAβ1-42单体蛋白、寡聚体蛋白的特异性图，图3中的B为本发明基于胶体金免疫层析试纸条检测hAβ1-42单体蛋白、寡聚体蛋白的灵敏度图。
图4中的A为本发明基于胶体金免疫层析试纸条检测4月龄，14月龄正常C57鼠和AD模型鼠外周血hAβ1-42结果图；图4中的B为本发明基于胶体金免疫层析试纸条检测健康人和AD患者外周血Aβ1-42结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
与前期研究分泌人淀粉样蛋白-β单克隆抗体的杂交瘤细胞株(中国专利申请号：202011227808.5)、以及用于检测人淀粉样蛋白-β双抗夹心ELISA检测试剂盒(中国专利申请号：202011227418.8)相似，本发明中hAβ1-42蛋白抗体1F12是由分泌抗人Aβ1-42蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12所制备，杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12的保藏号为：CCTCC NO：C2020131；hAβ1-42蛋白抗体2C6是由分泌抗人Aβ1-42蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6所制备，杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6的保藏号为：CCTCC NO：C2020132。
实施例1：
如图1中的A所示，本实例提供的同时检测hAβ1-42单体、寡聚体蛋白的双抗夹心胶体金免疫层析试纸条，包括底板、以及重叠设置在PVC底板上的吸水垫1、层析膜2、结合物释放垫5和样品垫6，结合物释放垫上包被有胶体金标记的hAβ1-42蛋白抗体1F12复合物，层析膜上设有两条检测线(Test Line，T)和一条质控线(Control Line，C线)，两条检测线分别包被有抗hAβ1-42蛋白抗体1F12、2C6，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。
层析膜上的检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的抗hAβ1-42蛋白抗体1F12、2C6。层析膜上的质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG。
本试纸条基于双抗体夹心原理实现检测，固定于结合物释放垫上的胶体金标记的hAβ1-42蛋白抗体复合物和检测线的hAβ1-42蛋白抗体分别识别hAβ1-42蛋白的不同的抗原决定簇，当待测样品中含有hAβ1-42单体和寡聚体蛋白时，首先在结合物释放垫形成hAβ1-42单体/寡聚体蛋白蛋白-胶体金-hAβ1-42蛋白抗体1F12复合物，从而与检测线上的抗hAβ1-42蛋白抗体1F12结合，在第一条检测线显色，剩余的hAβ1-42单体/胶体金-hAβ1-42蛋白抗体1F12复合物，从而与检测线上的抗hAβ1-42蛋白抗体2C6结合在第二条检测线显色，质控线会一直显色以保证试纸条有效。当待测样品中不含有hAβ1-42蛋白时，只有质控线会显色。
图1中的B为本申请的快速检测试纸条结果判定图在检测线显色，而质控线会一直显色以保证试纸条有效。当待测样品中不含有hAβ1-42蛋白时，只有质控线会显色。当待测样品中仅含有hAβ1-42多聚体蛋白时，只有第一条质控线会显色。当待测样品中仅含有hAβ1-42单体蛋白时，只有第二条质控线会显色。当待测样品中既含有hAβ1-42单体蛋白，又含有hAβ1-42单体蛋白时，第一、二条质控线会同时显色。
实施例2：一种胶体金标记的hAβ1-42蛋白抗体1F12、2C6复合物的制备方法
2.1、烧制30-40nm胶体金颗粒
参照Juewen Liu等制备胶体金的方法，制备粒径为40nm的胶体金，具体操作步骤如下：
向彻底洗净的250mL锥形瓶中依次加入99mL去离子水和1mL 1％氯金酸溶液，振荡混匀。用恒温电热搅拌器进行晃荡加热，调整电热搅拌器的电压和转速，并保持不变，加热数分钟后，待溶液开始轻微沸腾，一次性快速加入过滤后的1％柠檬酸三钠溶液2mL。继续加热数分钟后，溶液颜色由无色渐渐变为灰色，接着由灰色变黑色，再由黑色变紫色，最后逐渐变成红色。待溶液颜色保持红色不再变化时，保持溶液沸腾状态继续加热20min。然后关闭电热器，继续缓慢晃荡溶液直至冷却至室温。将制备好的胶体金溶液转移至干净无菌的丝口瓶中，封口置于4℃冰箱中避光保存。将制备好的不同粒径的胶体金溶液分别用紫外可见光光谱法和透射电镜法进行检测，所制备出的胶体金颗粒的粒径大小。
2.1、胶体金质量的鉴定
2.1.1、目测法
肉眼直接观察所制备得到的胶体金溶液，观察溶液的颜色和透明度。胶体金颗粒的粒径大小会影响溶液的颜色。目前，最常制备的胶体金颗粒的粒径为40nm，对应的颜色为紫红色。
2.1.2、紫外分光光度法
取适量种胶体金溶液于波长为450-650nm处进行紫外可见分光光度扫描，测定不同粒径的胶体金溶液的最大吸收波长，同时观察最大吸收峰的峰形和峰宽。
2.1.3、透射电镜扫描鉴定法
取一张干净的滤纸铺在培养皿中，将用于透射电镜的铜网正面朝上放置于滤纸上。取25μL制备好的胶体金溶液滴加于铜网上，将培养皿放于通风处，使得铜网慢慢晾干。然后将制备好的铜网置于透射电镜下观察胶体金粒子的大小、形态以及分布的均一性。
结果：目测法观察到烧制的胶体金为紫红色，在528nm处出现最大吸收峰，透射电镜下观察到烧制的金形态均一，大小大约为40nm，其结果如图2中的A，图2中的B所示。
2.2、胶体金颗粒偶联单抗最佳pH值、偶联量
2.2.1、胶体金颗粒偶联单抗最佳pH值
取一系列1.5mL的EP管，分别加入制备好的40nM胶体金溶液1mL。分别加入不同体积的0.1M K2CO3溶液混匀后，每管加入单克隆抗抗12μg，混匀并静置1h，再向每管加入100μL10％NaCl溶液，混匀并静置20min，观察每个EP管中颜色变化。待每个EP管中溶液保持红色的最低pH值确定为胶体金偶联抗体的最适pH值。
结果：胶体金颗粒偶联单抗最佳pH值为9.0，其结果如图2中的C所示。
2.2.2、胶体金颗粒偶联单抗最佳偶联量
取一系列1.5mL的EP管，分别加入制备好的40nm胶体金溶液1mL，用0.1M K2CO3溶液调整pH值，通过精密pH试纸测定每个EP管中均为最佳pH值，然后每个EP管分别加入预处理的单抗2μg、6μg、10μg、10μg、18μg、22μg、26μg、30μg、34μg、38μg，混匀静置1h；再向每管加入100μL 10％NaCl溶液，混匀静置1h，观察每个EP管中溶液颜色变化。待每个溶液保持红色的最低抗体量即为最佳抗体量，然而在实际操作过程中在此抗体量的基础上再增加20％即为胶体金探针的最佳抗体量。
结果：胶体金颗粒偶联单抗最佳偶联量为21.6μg/mL，其结果如图2中的D所示。
2.2.3、胶体金标记的hAβ1-42蛋白抗体1F12、2C6复合物的制备
①各取10mL烧制完成的胶体金溶液，分别加入20μL 0.1M K2CO3溶液，各自混匀，在磁力搅拌下分别加入200μg的hAβ1-42蛋白抗体1F12、2C6溶液，分别混匀，静置10min；
②对于静置完成后的每个试样溶液，逐滴加入100μL含20％BSA，混匀，静置10min，4000r/min离心10min，上清移到另一管，8000r/min离心10min，上清移到另一管，12000r/min离心10min，去上清，所得的沉淀即胶体金标记的hAβ1-42抗体1F12、2C6复合物的浓缩液。
2.2.4、金标抗体的生物学鉴定
2.2.4.1、金标抗体的粒径、电势的测量
将胶体金标记的单抗1F12、2C6混合物，各用1mL的重悬液混匀后进行金标抗体的粒径、电势的测量。
结果：金标抗体1F12、2C6的粒径、电势的值显著大于未标记的金颗粒，表明单抗1F12、2C6已成功偶联到金颗粒上，其结果如图2中的E，图2中的F所示。
2.2.4.2、金标抗体的活性检测
将单抗1F12、2C6成功偶联到金颗粒上并保持抗体原本的生物学活性，是制备胶体金试纸条的前提。我们分别利用SDS-PAGE、ELISA来验证金标抗体1F12、2C6是否具有抗体原本的生物学活性。
SDS-PAGE具体步骤如下：
①配制12％的SDS-PAGE胶；
②取金标记的1F12、2C6抗体，加入上样缓冲液后，煮沸10min；
③将煮沸的样品加入胶孔，按照90v恒压跑1.5h；
④跑胶完成后将胶取下，用染色液染色，脱色后观察蛋白条带；
结果：SDS-PAGE结果表明单抗1F12、2C6已经成功偶联上金颗粒，保持了抗体的典型的特征，其结果如图2中的G所示。
ELISA具体步骤如下：
①包被抗原：用CBS缓冲液稀释Aβ1-42蛋白至终浓度为10μg/mL，然后每孔加入100μL，于4℃包被过夜；
②封闭：包被完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入200μL的封闭液，于37℃封闭2h；
③加入金标抗体：封闭完成后，每孔用PBS-T洗涤3次，然后每孔加入金标抗体，室温孵育2h；弃上清，每孔用PBS-T洗涤3次；
④加入酶标抗体：每孔加入100μL HRP标记的山羊抗小鼠的二抗，室温反应1h；
⑤显色：反应结束后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL TMB，于37℃反应15min；
⑥终止：每孔加入50μL 2M H2SO4终止反应，然后在酶标仪上读取OD450；
结果：ELISA结果表明，单抗1F12、2C6成功偶联到金颗粒上并保持抗体原本的生物学活性，其结果如图2中的H所示。
实施例3：同时检测hAβ1-42单体、寡聚体蛋白双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条的制备方法
3.1、制备样品垫：所述样品垫采用玻璃纤维膜，使用含1％BSA、2％Sucrose、0.1％PEG、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液处理玻璃纤维膜1h后，烘干制成样品垫；
3.2、制备结合物释放垫:所述结合物释放垫采用玻璃纤维膜，使用含0.03％Tris、2％Sucrose、0.2％Casein、1％BSA、0.1％PVP、1％NaN3、0.1％PEG、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液预处理玻璃纤维膜1h后烘干备用；采用实施例2中方法所制备的胶体金标记的hAβ1-42抗体1F12复合物的沉淀用8mL重悬液溶解均匀的铺于玻璃纤维膜上，37℃干燥24h后，密封备用。
3.3、制备层析膜：所述层析膜采用硝酸纤维素膜，在层析膜上设置两条检测线和一条质控线，所述检测线包被有1mg/mL的抗hAβ1-42蛋白单克隆抗体1F12、2C6，所述质控线包被有0.5mg/mL的羊抗鼠IgG。
3.4、组装试纸条：样品垫、结合物释放垫、层析膜依次压覆在PVC底板上，并且在边缘重叠2～3mm；吸水垫压覆在层析膜的另一端且边缘重叠2～3mm，得到组装的定量检测不同形式hAβ1-42蛋白双抗夹心胶体金免疫层析试纸条。
实施例4：同时检测hAβ1-42单体、寡聚体蛋白双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条的特异性、灵敏度评估
4.1、特异性评估
分别制备10μg/mL hAβ1-42单体蛋白、hAβ1-42寡聚体蛋白、hAβ1-40单体蛋白、hAβ1-40寡聚体蛋白、p-Tau396,404、Cis-tau、Trans-tau、BSA、PBS，分别取50μL滴加到试纸条上，5min后读取结果，进行特异性评估。
结果：从测试的试纸条的结果可以看出，建立的双抗夹心胶体金试纸条能特异的与hAβ1-42单体、寡聚体蛋白反应，其特异性的检测结果如图3中的A所示；
4.2、灵敏度评估
制备不同浓度的hAβ1-42单体蛋白、hAβ1-42寡聚体蛋白，浓度从100μg/mL到3.08×10-5μg/mL，分别取50μL滴加到试纸条上，5min后读取结果，进行灵敏度评估。
结果：从测试的试纸条的结果可以看出，建立的双抗夹心胶体金试纸条检测hAβ1-42寡聚体蛋白的最低检测限为154pg，检测hAβ1-42单体蛋白的最低检测限为310pg，其灵敏度的检测结果如图3中的B所示。
实施例5：应用双抗夹心胶体金免疫层析试纸条检测不同月龄正常鼠、APP/PS1鼠血、健康人和AD患者血清
4.1、应用双抗夹心胶体金免疫层析试纸条检测不同月龄正常C57鼠、APP/PS1鼠血清各取4月龄，正常C57鼠3只，APP/PS1鼠4只；14月龄正常C57鼠3只，APP/PS1鼠4只，取其外周血获得血清。各取50μL滴加到试纸条上，5min后读取结果，进行hAβ1-42单体蛋白、寡聚体蛋白检测。
结果：在6只正常C57鼠血清中均未检测出hAβ1-42单体蛋白、寡聚体蛋白；在4月龄APP/PS1转基因小鼠血清中检测出hAβ1-42单体蛋白，而未检测出寡聚体蛋白；在14月龄APP/PS1转基因小鼠血清中检测出hAβ1-42单体蛋白和寡聚体蛋白，但以寡聚体蛋白为主要形式，其检测结果如图4中的A所示。
4.2、应用双抗夹心胶体金免疫层析试纸条检测健康人，AD患者血清各取7位健康人、8位AD患者血清，各取50μL滴加到试纸条上，5min后读取结果，进行hAβ1-42单体蛋白、寡聚体蛋白检测。
结果：在7位健康人血清中检测出较高hAβ1-42单体蛋白而非寡聚体蛋白；在8位AD患者血清中检测出较高hAβ1-42寡聚体蛋白，相反hAβ1-42单体蛋白含量较少，其检测结果如图4中的B所示。
上述实施例主要是以胶体金标记的单克隆抗体1F12为例，得到的用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸，其结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体1F12；层析膜上设有两条检测线和一条质控线，记这两条检测线分别为第一检测线和第二检测线，第一检测线包被有单克隆抗体1F12，第二检测线包被有单克隆抗体2C6，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。除了胶体金标记的单克隆抗体1F12外，胶体金标记的单克隆抗体2C6同样也适用；即，结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体也可以为2C6；层析膜上设有两条检测线和一条质控线，记这两条检测线分别为第一检测线和第二检测线，第一检测线也可以包被有单克隆抗体2C6，第二检测线也可以包被有单克隆抗体1F12，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；虽然效果略逊于胶体金标记的单克隆抗体1F12，但仍能用于检测人淀粉样蛋白-β。
本发明中用于检测人淀粉样蛋白-β胶体金免疫层析试纸，根据实际需求，可以被进一步裁减成目标尺寸的试纸条，以便于使用；另外，该试纸还可以与金标免疫分析仪配合构建用于定量检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试剂盒。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸，包括底板，以及重叠设置在该底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，其特征在于，所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体1F12；所述层析膜上设有两条检测线和一条质控线，记这两条检测线分别为第一检测线和第二检测线，所述第一检测线包被有单克隆抗体1F12，所述第二检测线包被有单克隆抗体2C6，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；
其中，分泌单克隆抗体1F12的杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020131；分泌单克隆抗体2C6的杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2020132。
2.一种用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸，包括底板，以及重叠设置在该底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，其特征在于，所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体2C6；所述层析膜上设有两条检测线和一条质控线，记这两条检测线分别为第一检测线和第二检测线，所述第一检测线包被有单克隆抗体2C6，所述第二检测线包被有单克隆抗体1F12，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；
其中，分泌单克隆抗体1F12的杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020131；分泌单克隆抗体2C6的杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2020132。
3.如权利要求1或2所述用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，所述第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
或者，所述第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，所述第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体。
4.如权利要求1所述用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述胶体金标记的单克隆抗体1F12，是按包括如下步骤的制备方法制备得到的：
S1：取10mL烧制完成的胶体金溶液，加入10-30μL 0.1M K2CO3溶液，混匀，在磁力搅拌下加入含有100-300μg单克隆抗体1F12的溶液，混匀，静置10-30min；
S2：向所述步骤S1得到的溶液中逐滴加入100μL含10-20wt％BSA的溶液，混匀后静置10-30min；接着，4000r/min离心10-30min进行第一次离心，然后将第一次离心得到的上清移到另一离心管中，8000r/min离心10-30min进行第二次离心；接着，再将第二次离心得到的上清移到另一离心管中，12000r/min离心10-30min进行第三次离心，去上清；这三次离心所得的沉淀即为胶体金标记的单克隆抗体1F12的浓缩液。
5.如权利要求2所述用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述胶体金标记的单克隆抗体2C6，是按包括如下步骤的制备方法制备得到的：
S1：取10mL烧制完成的胶体金溶液，加入10-30μL 0.1M K2CO3溶液，混匀，在磁力搅拌下加入含有100-300μg单克隆抗体2C6的溶液，混匀，静置10-30min；
S2：向所述步骤S1得到的溶液中逐滴加入100μL含10-20wt％BSA的溶液，混匀后静置10-30min；接着，4000r/min离心10-30min进行第一次离心，然后将第一次离心得到的上清移到另一离心管中，8000r/min离心10-30min进行第二次离心；接着，再将第二次离心得到的上清移到另一离心管中，12000r/min离心10-30min进行第三次离心，去上清；这三次离心所得的沉淀即为胶体金标记的单克隆抗体2C6的浓缩液。
6.如权利要求4或5所述用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述胶体金溶液中的胶体金为氯金酸在柠檬酸钠还原下烧制获得的30-40nm的胶体金颗粒。
7.如权利要求1或2所述用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述底板为PVC底板。
8.制备如权利要求1、3、4、6、7任意一项所述用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备样品垫步骤：样品垫采用玻璃纤维膜，使用含1wt％BSA、2wt％Sucrose、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液处理玻璃纤维膜1h后，烘干制成样品垫；
制备结合物释放垫步骤：结合物释放垫采用玻璃纤维膜，使用含0.03wt％Tris、2wt％Sucrose、0.2wt％Casein、1wt％BSA、0.1wt％PVP、1wt％NaN3、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液预处理玻璃纤维膜1h后烘干备用；接着，将胶体金标记的单克隆抗体1F12的浓缩液用8mL重悬液溶解均匀的铺于玻璃纤维膜上，37℃干燥24h后，密封备用；
制备层析膜步骤：层析膜采用硝酸纤维素膜，在层析膜上设置两条检测线和一条质控线，其中，第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
组装试纸条步骤：将所述样品垫、所述结合物释放垫和所述层析膜依次压覆在底板上，并且在边缘重叠2～3mm；吸水垫压覆在所述层析膜的另一端且边缘重叠2～3mm，即可组装得到用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸；
其中，所述胶体金标记的单克隆抗体1F12的浓缩液的制备过程，包括如下步骤：
S1：取10mL烧制完成的胶体金溶液，加入10-30μL 0.1M K2CO3溶液，混匀，在磁力搅拌下加入含有100-300μg单克隆抗体1F12的溶液，混匀，静置10-30min；
S2：向所述步骤S1得到的溶液中逐滴加入100μL含10-20wt％BSA的溶液，混匀后静置10-30min；接着，4000r/min离心10-30min进行第一次离心，然后将第一次离心得到的上清移到另一离心管中，8000r/min离心10-30min进行第二次离心；接着，再将第二次离心得到的上清移到另一离心管中，12000r/min离心10-30min进行第三次离心，去上清；这三次离心所得的沉淀即为胶体金标记的单克隆抗体1F12的浓缩液。
9.制备如权利要求2、3、5、6、7任意一项所述用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备样品垫步骤：样品垫采用玻璃纤维膜，使用含1wt％BSA、2wt％Sucrose、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液处理玻璃纤维膜1h后，烘干制成样品垫；
制备结合物释放垫步骤：结合物释放垫采用玻璃纤维膜，使用含0.03wt％Tris、2wt％Sucrose、0.2wt％Casein、1wt％BSA、0.1wt％PVP、1wt％NaN3、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液预处理玻璃纤维膜1h后烘干备用；接着，将胶体金标记的单克隆抗体2C6的浓缩液用8mL重悬液溶解均匀的铺于玻璃纤维膜上，37℃干燥24h后，密封备用；
制备层析膜步骤：层析膜采用硝酸纤维素膜，在层析膜上设置两条检测线和一条质控线，其中，第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
组装试纸条步骤：将所述样品垫、所述结合物释放垫和所述层析膜依次压覆在底板上，并且在边缘重叠2～3mm；吸水垫压覆在所述层析膜的另一端且边缘重叠2～3mm，即可组装得到用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸；
其中，所述胶体金标记的单克隆抗体2C6的浓缩液的制备过程，包括如下步骤：
S1：取10mL烧制完成的胶体金溶液，加入10-30μL 0.1M K2CO3溶液，混匀，在磁力搅拌下加入含有100-300μg单克隆抗体2C6的溶液，混匀，静置10-30min；
S2：向所述步骤S1得到的溶液中逐滴加入100μL含10-20wt％BSA的溶液，混匀后静置10-30min；接着，4000r/min离心10-30min进行第一次离心，然后将第一次离心得到的上清移到另一离心管中，8000r/min离心10-30min进行第二次离心；接着，再将第二次离心得到的上清移到另一离心管中，12000r/min离心10-30min进行第三次离心，去上清；这三次离心所得的沉淀即为胶体金标记的单克隆抗体2C6的浓缩液。
10.一种用于定量检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1－7任意一项所述用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸以及与该试纸配合使用的金标免疫分析仪。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114002436A (zh) * 2021-10-13 2022-02-01 华中科技大学 用于检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法
CN114002435A (zh) * 2021-10-13 2022-02-01 华中科技大学 三种用于检测人磷酸化Tau蛋白的试剂盒及其制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050124016A1 (en) * 2003-08-01 2005-06-09 Enh Research Institute Antibodies specific for toxic amyloid beta protein oligomers
US20090017040A1 (en) * 2007-06-12 2009-01-15 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
WO2010012004A2 (en) * 2008-07-25 2010-01-28 The Regents Of The University Of California Monoclonal antibodies specific for pathological amyoid aggregates common to amyloids formed from proteins of differing sequence
US20110200609A1 (en) * 2002-09-12 2011-08-18 The Regents Of The University Of California Monoclonal antibodies specific for pathological amyloid aggregates common to amyloids formed from proteins of differing sequence
JP2017202977A (ja) * 2016-05-09 2017-11-16 学校法人順天堂 アミロイドβ蛋白質オリゴマー用モノクローナル抗体及びその利用
CN110208539A (zh) * 2019-03-15 2019-09-06 中国农业科学院蜜蜂研究所 抗mrjp4的配对单克隆抗体、检测mrjp4的elisa试剂盒和胶体金免疫试纸
CN111656197A (zh) * 2019-10-15 2020-09-11 湖南乾康科技有限公司 一种检测尿液Aβ淀粉样蛋白的试纸条及方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110200609A1 (en) * 2002-09-12 2011-08-18 The Regents Of The University Of California Monoclonal antibodies specific for pathological amyloid aggregates common to amyloids formed from proteins of differing sequence
US20050124016A1 (en) * 2003-08-01 2005-06-09 Enh Research Institute Antibodies specific for toxic amyloid beta protein oligomers
US20090017040A1 (en) * 2007-06-12 2009-01-15 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
WO2010012004A2 (en) * 2008-07-25 2010-01-28 The Regents Of The University Of California Monoclonal antibodies specific for pathological amyoid aggregates common to amyloids formed from proteins of differing sequence
JP2017202977A (ja) * 2016-05-09 2017-11-16 学校法人順天堂 アミロイドβ蛋白質オリゴマー用モノクローナル抗体及びその利用
CN110208539A (zh) * 2019-03-15 2019-09-06 中国农业科学院蜜蜂研究所 抗mrjp4的配对单克隆抗体、检测mrjp4的elisa试剂盒和胶体金免疫试纸
US20200292547A1 (en) * 2019-03-15 2020-09-17 Institute Of Apicultural Research, Chinese Academy Of Agricultural Sciences Match-paired Monoclonal Antibodies against MRJP4, ELISA Kit and Colloidal Gold Immunoassay Test Strip for Detecting MRJP4
CN111656197A (zh) * 2019-10-15 2020-09-11 湖南乾康科技有限公司 一种检测尿液Aβ淀粉样蛋白的试纸条及方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114002436A (zh) * 2021-10-13 2022-02-01 华中科技大学 用于检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法
CN114002435A (zh) * 2021-10-13 2022-02-01 华中科技大学 三种用于检测人磷酸化Tau蛋白的试剂盒及其制备方法

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