CN106442972A - 超顺磁性纳米颗粒作为标记物在制备pji诊断试纸中的应用 - Google Patents
超顺磁性纳米颗粒作为标记物在制备pji诊断试纸中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106442972A CN106442972A CN201610796819.2A CN201610796819A CN106442972A CN 106442972 A CN106442972 A CN 106442972A CN 201610796819 A CN201610796819 A CN 201610796819A CN 106442972 A CN106442972 A CN 106442972A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pji
- superparamagnetic
- antibody
- reagent paper
- particle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 65
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 60
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 title abstract description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 48
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 48
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 37
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 37
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 37
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 claims description 17
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 claims description 17
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 claims description 17
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 claims description 17
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 claims description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 16
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims description 16
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 claims description 15
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 claims description 15
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 15
- 108010028275 Leukocyte Elastase Proteins 0.000 claims description 14
- 102000016799 Leukocyte elastase Human genes 0.000 claims description 14
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 13
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 claims description 13
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 claims description 13
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 13
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 12
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 5
- 102100033174 Neutrophil elastase Human genes 0.000 claims description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 3
- 108090000155 pancreatic elastase II Proteins 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 claims description 2
- 210000004718 centriole Anatomy 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 18
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 7
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 abstract description 7
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 14
- 108010000849 leukocyte esterase Proteins 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- ZBKIUFWVEIBQRT-UHFFFAOYSA-N gold(1+) Chemical compound [Au+] ZBKIUFWVEIBQRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 4
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 4
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 3
- 102000018568 alpha-Defensin Human genes 0.000 description 3
- 108050007802 alpha-defensin Proteins 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010051335 Lipocalin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102100035405 Neutrophil gelatinase-associated lipocalin Human genes 0.000 description 2
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 2
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 206010060968 Arthritis infective Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 101710180316 Protease 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010061926 Purulence Diseases 0.000 description 1
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000009535 clinical urine test Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010231 histologic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
- G01N33/5434—Magnetic particles using magnetic particle immunoreagent carriers which constitute new materials per se
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明属于关节假体周围感染诊断技术领域，具体提供了超顺磁性纳米颗粒作为标记物在制备PJI诊断试纸中的应用。本发明采用超顺磁性纳米颗粒替代胶体金作为标记物，形成一种新型的磁免疫层析技术。达到的有益效果是：通过本发明的应用所提供的PJI诊断试纸具有高敏感性、高特异性、并且检测时间短、检测方便，定性检测方面：定性检测限可低于20ng/mL，检测时间少于10min；定量检测方面：定量检测限低于10ng/mL，检测时间少于20min。
Description
技术领域
本发明属于关节假体周围感染诊断技术领域，具体涉及一种超顺磁性纳米颗粒作为标记物在制备PJI诊断试纸中的应用。
背景技术
关节假体周围感染(Periprosthetic Joint Infection，PJI)被认为是人工关节置换术后灾难性的并发症。有文献报道，关节置换手术后大约1％～3％的患者会发生PJI。随着PJI发生率的增加，给病人和医疗系统都带来了巨大的经济负担。PJI的及早诊断对于PJI的治疗具有重大意义，然而目前仍没有一种灵敏、准确、快速、简便的方法诊断假体周围感染。
目前较常用的MSIS诊断标准主要是基于临床表现，外周血及关节液的实验室检查，组织病理学检查，但是依旧存在“假阴性”率高且复杂不简便的缺点。由于抽血的易行性，血清学检测是诊断关节假体周围感染的中药筛查手段。除出现与关节腔相通的窦道外，两次培养结果为同一细菌，被认为是诊断PJI的金标准，所以细菌培养结果十分重要。尽管细菌培养十分重要，但细菌培养的阳性率却并不高，且有一定假阳性率。因此关节液的分析及检测也是不可忽略的方面，关节液为脓性提示存在关节假体感染，但这一指标过于主观，临床上很难准确界定。相对客观的指标主要有关节液白细胞计数及分类计数。尽管这两项指标cutoff值的界定各文献略有不同，但多个研究均证实关节液白细胞计数及分类计数对PJI的诊断有较高的准确性[14-16]。关节液C反应蛋白(Synovial CRP)被多项研究证实在PJI的诊断中有很高的敏感性和特异性[17-19]。但与血清CRP相比，关节液CRP并没有显示出更高的诊断效能。此外，对于部分无法获得关节液的部分病例，术中取假体周围组织，进行组织学分析显得十分重要。尽管术中冰冻病理有很高的价值，但也会受到术者取组织部位的经验，病理分析人员的经验，甚至染色方法的影响。
白细胞酯酶(Leukocyte Esterase，LE)早在上世纪80年代就用于尿路感染的诊断。并有文献报道了其良好的敏感性和特异性。Parvizi等人在2011年首先将LE试纸条应用在膝关节假体周围感染中。方法是将1滴关节液滴在尿试纸条“白细胞酯酶(LeukocyteEsterase)”小格上，1分钟后判断颜色变化。文章指出以“++”(试纸变为深紫色)作为诊断标准，敏感性80.6％，特异性100％，阳性预测值100％，阴性预测值93.3％。随后一些学者也陆续证实了LE试纸应用在髋、膝关节PJI诊断中都有着良好的敏感性和特异性。目前的白细胞酯酶试纸是基于酶促反应的颜色变化，主要原理是测试关节液中的白细胞酯酶含量。虽已证明白细胞酯酶有着很好的敏感性与特异性，但白细胞酯酶试纸结果易受风湿免疫性疾病影响，且颜色变化的判读易受血液等因素干扰，在判读过程中存在一定的主观性。
近年来，关节液生物标记物作为诊断PJI的方法越来越引起学者重视，其中α-防御素(α-defensin)即称为继白细胞酯酶后的一个新的研究热点。尽管这些敏感性和特异性高的生物标记物已经渐渐被人们认识和发现，但检测方法依旧主要依赖于酶联免疫反应(ELISA)，主要限于实验室的研究。ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。虽然ELISA在临床诊断检测方面应用广泛，但是一套试ELISA剂盒(96孔板)价格昂贵，约数千元。而PJI并非高发病，各中心目报告的结果均为预先留存关节液标本，集齐一定数量的标本后统一检测，测试周期非常长，且需要经过包被、加样、加酶标抗体、加底物液显色及终止反应这一系列过程繁琐的操作和酶联免疫反应后才能进行结果的判定，因此尚无法直接应用于临床，所以相对于目前临床上所用的LE试纸这种快速、准确、简便的诊断方法，ELISA检测技术并不十分经济快捷。
综上所述，一种应用于PJI诊断的高敏感性、高特异性、检测时间短、检测方便的新型免疫层析技术亟待开发。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种新型免疫层析技术，该新型免疫层析技术中采用超顺磁性纳米颗粒替代传统的胶体金标记物，以提升免疫层析技术的分析能力，最终获得用于PJI诊断的高特异性、高敏感性、检测时间短、检测方便的以超顺磁性纳米颗粒作为标记物的新型PJI诊断试纸。
免疫层析技术始于上世纪80年代，它由于操作简便、检测快速、成本极低等优势而得到迅速发展。传统的免疫层析系统中主要以胶体金作为标记物，检测灵敏度不高，只能定性或半定量，且受复杂基质影响后，易出现假阳性结果。本发明的技术构思是采用超顺磁性颗粒替代胶体金作为标记物以提升免疫层析分析技术的检测能力。
基于以上技术构思，本发明首先提供了超顺磁性纳米颗粒作为标记物在制备PJI诊断试纸中的应用。PJI诊断试纸的具体结构例如检测线和质控线的布置、吸水垫、硝酸纤维膜等的布置皆为行业通用诊断检测试纸的布置方法，本发明中不再进行赘述。
为了提升对PJI诊断的诊断特异性和敏感性，优选方案，所述PJI诊断试纸的生物标记物为超顺磁性纳米颗粒和α-防御素的抗体偶联的复合物。进一步优选，所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为α-防御素的牛血清白蛋白偶联物；所述超顺磁性纳米颗粒和α-防御素的抗体偶联的具体方法为：称取50μg的α-防御素的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，120转/分在37℃条件下摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。得到的超顺磁性纳米颗粒和α-防御素的抗体的偶联复合物可以置于4℃的磁性颗粒保存液中保存备用。
为了提升对PJI诊断的诊断特异性和敏感性，优选方案，所述PJI诊断试纸的生物标记物为超顺磁性纳米颗粒和中心粒细胞弹性蛋白酶-2的抗体偶联的复合物。进一步优选，所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为中心粒细胞弹性蛋白酶-2的牛血清白蛋白偶联物；所述超顺磁性纳米颗粒和中心粒细胞弹性蛋白酶-2的抗体偶联的具体方法为：称取150μg的中心粒细胞弹性蛋白酶-2的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，在37℃条件下以120转/分摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。得到的超顺磁性纳米颗粒和中心粒细胞弹性蛋白酶-2的抗体的偶联复合物可以置于4℃的磁性颗粒保存液中保存备用。
为了提升对PJI诊断的诊断特异性和敏感性，优选方案，所述PJI诊断试纸的生物标记物为超顺磁性纳米颗粒和杀菌/渗透增强蛋白的抗体偶联的复合物。进一步优选，所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为杀菌/渗透增强蛋白的牛血清白蛋白偶联物；所述超顺磁性纳米颗粒和杀菌/渗透增强蛋白的抗体偶联的具体方法为：称取200μg的杀菌/渗透增强蛋白的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，在37℃条件下以120转/分摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。得到的超顺磁性纳米颗粒和杀菌/渗透增强蛋白的抗体的偶联复合物可以置于4℃的磁性颗粒保存液中保存备用。
为了提升对PJI诊断的诊断特异性和敏感性，优选方案，所述PJI诊断试纸的生物标记物为超顺磁性纳米颗粒和乳铁蛋白的抗体偶联的复合物。进一步优选，所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为乳铁蛋白的牛血清白蛋白偶联物；所述超顺磁性纳米颗粒和乳铁蛋白的抗体偶联的具体方法为：称取100μg的乳铁蛋白的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，在37℃条件下以120转/分摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。得到的超顺磁性纳米颗粒和乳铁蛋白的抗体的偶联复合物可以置于4℃的磁性颗粒保存液中保存备用。
为了提升对PJI诊断的诊断特异性和敏感性，优选方案，所述PJI诊断试纸的生物标记物为超顺磁性纳米颗粒和中性粒细胞明胶酶相关载质蛋白的抗体偶联的复合物。进一步优选，所述PJI诊断试纸的生物标记物为超顺磁性纳米颗粒和中性粒细胞明胶酶相关载质蛋白的抗体偶联的复合物。进一步优选，所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为中性粒细胞明胶酶相关载质蛋白的牛血清白蛋白偶联物；所述超顺磁性纳米颗粒和中性粒细胞明胶酶相关载质蛋白的抗体偶联的具体方法为：称取200μg的中性粒细胞明胶酶相关载质蛋白的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，在37℃条件下以120转/分摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。得到的超顺磁性纳米颗粒和中性粒细胞明胶酶相关载质蛋白的抗体的偶联复合物可以置于4℃的磁性颗粒保存液中保存备用。
基于以上论述，本发明的有益效果为：本发明采用超顺纳米磁性颗粒替代传统免疫层析技术中的胶体金作为标记物，得到本发明的新型超顺纳米磁性颗粒免疫层析技术，并同时辅以α-防御素(α-defensin)、中心粒细胞弹性蛋白酶-2(ELA-2)、杀菌/渗透增强蛋白(BPI)、中性粒细胞明胶酶相关载质蛋白(NGAL)和乳铁蛋白(lactoferrin)这五种对于诊断PJI具有高敏感性和高特异性的生物标记物的抗体进行偶联，最终获得对于PJI诊断具有高敏感性和高特异性的的生物标记物检测试纸，以解决PJI准确诊断这一世界难题。以本发明中的超顺纳米磁性颗粒作为标记物的PJI诊断试纸具有以下优点：1、可定性，超顺纳米磁颗粒本身为棕色，可通过裸眼观察，实现定性或半定量检测，诊断简便易行；2、可定量，仪器能直接对超顺磁性颗粒磁信号进行检测，可以实现定量检测；3、灵敏度高，胶体金等基于光学检测原理的分析方法受到检测线和控制线上膜厚度的影响(膜厚度为100μm)，只能检测到膜表面10％的标记物，而磁性检测具有穿透性，能够检测膜上从底部到顶部所有磁珠量，灵敏度得到10倍以上的提高；4、抗干扰能力强，首先待检测样品基质中基本不含有磁性物质，本底干扰和其它干扰非常小，其次，不同于胶体金与抗体通过静电结合，超顺磁性颗粒与抗体通过化学键结合，更稳定牢靠。进一步的深入研究显示，在本发明以超顺纳米磁性颗粒作为标记物的基础上，以前述优选出的5种生物标志物的抗体进行偶联复合，最终制成的PJI诊断试纸的灵敏度比现存的以白细胞酯酶为指标，基于酶促反应的LE试纸更灵敏；本发明的新型免疫层析技术的PJI诊断试纸的定性检测限均低于20ng/mL(胶体金法检测限)，检测时间少于10min；定量检测限低于10ng/mL，检测时间少于20min。
附图说明
图1是本发明中的超顺纳米磁性颗粒作为标记物的新型免疫层析技术的定量诊断原理示意图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步阐释。
如无其他特别说明，本发明中出现的术语皆遵照行业通常理解，本发明中所引用以及未述及但与本发明相关方法及仪器设备皆为行业通用技术方法及仪器设备，本发明中所使用的试剂原料皆为行业普通市售产品。本发明中出现的百分比皆为重量百分比。
实施例：
本实施例提供了超顺磁性纳米颗粒作为标记物在制备PJI诊断试纸中的应用。本实施例中采用超顺磁性纳米颗粒替代现有胶体金免疫层析技术中的胶体金作为标记物。具体的，本实施例提供了一种用于PJI诊断的免疫层析试纸，该免疫层析试纸中使用超顺磁性纳米颗粒作为替代胶体金的标记物。
对本实施例的进一步改进中，先行制备超顺磁性纳米颗粒和α-防御素的抗体偶联复合物，具体制备方法为：称取50μg的α-防御素的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，在37℃条件下以120转/分摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。得到的超顺磁性纳米颗粒和α-防御素的抗体的偶联复合物可以置于4℃的磁性颗粒保存液中保存备用。然后将得到的超顺磁性纳米颗粒和α-防御素的抗体偶联的复合物作为生物标记物应用于所述PJI诊断试纸。更进一步的，所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为α-防御素的牛血清白蛋白偶联物。
另一个对本实施例的进一步改进中，先行制备超顺磁性纳米颗粒和中心粒细胞弹性蛋白酶-2的抗体偶联复合物，具体制备方法为：称取150μg的中心粒细胞弹性蛋白酶-2的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，在37℃条件下以120转/分摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。得到的超顺磁性纳米颗粒和中心粒细胞弹性蛋白酶-2的抗体的偶联复合物可以置于4℃的磁性颗粒保存液中保存备用。然后将得到的超顺磁性纳米颗粒和中心粒细胞弹性蛋白酶-2的抗体偶联复合物作为生物标记物应用于所述PJI诊断试纸。更进一步的，所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为中心粒细胞弹性蛋白酶-2的牛血清白蛋白偶联物。
另一个对本实施例的进一步改进中，先行制备超顺磁性纳米颗粒和杀菌/渗透增强蛋白的抗体偶联复合物，具体制备方法为：称取200μg的杀菌/渗透增强蛋白的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，在37℃条件下以120转/分摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。得到的超顺磁性纳米颗粒和杀菌/渗透增强蛋白的抗体的偶联复合物可以置于4℃的磁性颗粒保存液中保存备用。然后将得到的超顺磁性纳米颗粒和杀菌/渗透增强蛋白的抗体偶联复合物作为生物标记物应用于所述PJI诊断试纸。更进一步的，所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为杀菌/渗透增强蛋白的牛血清白蛋白偶联物。
另一个对本实施例的进一步改进中，先行制备超顺磁性纳米颗粒和乳铁蛋白的抗体偶联复合物，具体制备方法为：称取100μg的乳铁蛋白的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，在37℃条件下以120转/分摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。得到的超顺磁性纳米颗粒和乳铁蛋白的抗体的偶联复合物可以置于4℃的磁性颗粒保存液中保存备用。然后将得到的超顺磁性纳米颗粒和乳铁蛋白的抗体偶联复合物作为生物标记物应用于所述PJI诊断试纸。更进一步的，所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为乳铁蛋白的牛血清白蛋白偶联物。
另一个对本实施例的进一步改进中，先行制备超顺磁性纳米颗粒和中性粒细胞明胶酶相关载质蛋白的抗体偶联复合物，具体制备方法为：称取200μg的中性粒细胞明胶酶相关载质蛋白的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，在37℃条件下以120转/分摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。得到的超顺磁性纳米颗粒和中性粒细胞明胶酶相关载质蛋白的抗体的偶联复合物可以置于4℃的磁性颗粒保存液中保存备用。然后将得到的超顺磁性纳米颗粒和中性粒细胞明胶酶相关载质蛋白的抗体偶联复合物作为生物标记物应用于所述PJI诊断试纸。更进一步的，所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为中性粒细胞明胶酶相关载质蛋白的牛血清白蛋白偶联物。
本实施例中的新型免疫层析技术的定量诊断原理示意图如图1所示，图1中磁标记抗体即为超顺纳米磁性颗粒与α-防御素(α-defensin)、中心粒细胞弹性蛋白酶-2(ELA-2)、杀菌/渗透增强蛋白(BPI)、中性粒细胞明胶酶相关载质蛋白(NGAL)或乳铁蛋白(lactoferrin)的抗体的偶联复合物。图1中质控线处设置的为对应抗原的羊抗鼠抗体，其获取及制备方法皆为行业通用技术，此处不再赘述。图1中质控线和检测线的载体即为硝酸纤维膜。
试验例：
试验目的：前述实施例中所得的PJI诊断试纸在PJI诊断中的灵敏度和特异性研究。
试验对象：解放军总医院骨科随机选取的100例PJI患者。
试验方法：采用前述实施例中所得的PJI诊断试纸对PJI患者的关节液进行诊断检测，并将诊断检测结果与常规PJI诊断确征后的结果进行对比分析。
试验结果分析：本发明的PJI诊断试纸对随机选取的100例PJI患者的关节液的诊断结果：定性检测方面，定性检测限均低于20ng/mL，检测时间少于10min；定量检测方面，定量检测限低于10ng/mL，检测时间少于20min。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其细节上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.超顺磁性纳米颗粒作为标记物在制备PJI诊断试纸中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述PJI诊断试纸的生物标记物为超顺磁性纳米颗粒和α-防御素的抗体偶联的复合物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为α-防御素的牛血清白蛋白偶联物；所述超顺磁性纳米颗粒和α-防御素的抗体偶联的具体方法为：称取50μg的α-防御素的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，在37℃条件下以120转/分摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述PJI诊断试纸的生物标记物为超顺磁性纳米颗粒和中心粒细胞弹性蛋白酶-2的抗体偶联的复合物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为中心粒细胞弹性蛋白酶-2的牛血清白蛋白偶联物；所述超顺磁性纳米颗粒和中心粒细胞弹性蛋白酶-2的抗体偶联的具体方法为：称取150μg的中心粒细胞弹性蛋白酶-2的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，在37℃条件下以120转/分摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述PJI诊断试纸的生物标记物为超顺磁性纳米颗粒和杀菌/渗透增强蛋白的抗体偶联的复合物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为杀菌/渗透增强蛋白的牛血清白蛋白偶联物；所述超顺磁性纳米颗粒和杀菌/渗透增强蛋白的抗体偶联的具体方法为：称取200μg的杀菌/渗透增强蛋白的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，在37℃条件下以120转/分摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述PJI诊断试纸的生物标记物为超顺磁性纳米颗粒和乳铁蛋白的抗体偶联的复合物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为乳铁蛋白的牛血清白蛋白偶联物；所述超顺磁性纳米颗粒和乳铁蛋白的抗体偶联的具体方法为：称取100μg的乳铁蛋白的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，在37℃条件下以120转/分摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述PJI诊断试纸的生物标记物为超顺磁性纳米颗粒和中性粒细胞明胶酶相关载质蛋白的抗体偶联的复合物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610796819.2A CN106442972A (zh) | 2016-08-31 | 2016-08-31 | 超顺磁性纳米颗粒作为标记物在制备pji诊断试纸中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610796819.2A CN106442972A (zh) | 2016-08-31 | 2016-08-31 | 超顺磁性纳米颗粒作为标记物在制备pji诊断试纸中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106442972A true CN106442972A (zh) | 2017-02-22 |
Family
ID=58164519
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610796819.2A Pending CN106442972A (zh) | 2016-08-31 | 2016-08-31 | 超顺磁性纳米颗粒作为标记物在制备pji诊断试纸中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106442972A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108593924A (zh) * | 2018-03-15 | 2018-09-28 | 福建医科大学附属第医院 | 关节液α防御素在人工关节感染的检测及诊断试剂盒中的应用 |
| CN108593923A (zh) * | 2018-03-15 | 2018-09-28 | 福建医科大学附属第医院 | 关节液中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白在人工关节感染的检测及诊断试剂盒中的应用 |
| CZ309354B6 (cs) * | 2017-09-26 | 2022-09-28 | Fakultní Nemocnice V Motole | Způsob stanovení příčiny kloubního onemocnění pomocí detekce hladiny alfa-defenzinu získaného z kloubního výpotku |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001071344A2 (en) * | 2000-03-17 | 2001-09-27 | Quantum Design, Inc. | Immunochromatographic assay method and apparatus |
| CN101762690A (zh) * | 2009-06-24 | 2010-06-30 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 一种定量检测血液中c反应蛋白的磁性免疫层析试纸条及制备方法 |
| WO2016049148A1 (en) * | 2014-09-24 | 2016-03-31 | Wellstat Diagnostics, Llc | Compositions and methods for te diagnosis of lyme disease |
-
2016
- 2016-08-31 CN CN201610796819.2A patent/CN106442972A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001071344A2 (en) * | 2000-03-17 | 2001-09-27 | Quantum Design, Inc. | Immunochromatographic assay method and apparatus |
| CN101762690A (zh) * | 2009-06-24 | 2010-06-30 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 一种定量检测血液中c反应蛋白的磁性免疫层析试纸条及制备方法 |
| WO2016049148A1 (en) * | 2014-09-24 | 2016-03-31 | Wellstat Diagnostics, Llc | Compositions and methods for te diagnosis of lyme disease |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CARL DEIRMENGIAN MD ET AL.: "Diagnosing Periprosthetic Joint Infection", 《CLIN ORTHOP RELAT RES》 * |
| CHRISTINA L. JACOVIDES ET AL.: "Molecular Markers for Diagnosis of Periprosthetic Joint Infection", 《THE JOURNAL OF ARTHROPLASTY》 * |
| DEIRMENGIAN, CARL MD ET AL.: "Combined Measurement of Synovial Fluid α-Defensin and C-Reactive Protein Levels: Highly Accurate for Diagnosing Periprosthetic Joint Infection", 《THE JOURNAL OF BONE AND JOINT SURGERY》 * |
| JAVAD PARVIZI ET AL.: "Diagnosis of Periprosthetic Joint Infection Using Synovial C-Reactive Protein", 《THE JOURNAL OF ARTHROPLASTY》 * |
| MAXIMILIAN F. KASPAREK,ET AL.: "Intraoperative Diagnosis of Periprosthetic Joint Infection Using a Novel Alpha-Defensin Lateral Flow Assay", 《THE JOURNAL OF ARTHROPLASTY》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ309354B6 (cs) * | 2017-09-26 | 2022-09-28 | Fakultní Nemocnice V Motole | Způsob stanovení příčiny kloubního onemocnění pomocí detekce hladiny alfa-defenzinu získaného z kloubního výpotku |
| CN108593924A (zh) * | 2018-03-15 | 2018-09-28 | 福建医科大学附属第医院 | 关节液α防御素在人工关节感染的检测及诊断试剂盒中的应用 |
| CN108593923A (zh) * | 2018-03-15 | 2018-09-28 | 福建医科大学附属第医院 | 关节液中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白在人工关节感染的检测及诊断试剂盒中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104634980B (zh) | 心肌肌钙蛋白i超敏检测试剂盒及超敏检测方法 | |
| CN105588939B (zh) | MPO、H‑FABP和cTnT联合检测装置及制备方法 | |
| CN109596843B (zh) | 一种血清淀粉样蛋白a的测定试剂盒 | |
| AU2010232583B2 (en) | Detection of infectious disease in a human or animal by measuring specific phagocytosis in a thin film sample of their anticoagulated blood | |
| CN202794189U (zh) | C反应蛋白快速全程定量免疫层析检测试剂盒 | |
| CN106442972A (zh) | 超顺磁性纳米颗粒作为标记物在制备pji诊断试纸中的应用 | |
| CN108169486A (zh) | 一种测定鳞状上皮细胞癌抗原含量的试剂盒及其测试方法 | |
| CN101320041B (zh) | 一种快速定量检测c-反应蛋白的胶体金法及其应用 | |
| CN101178403B (zh) | 一种用于检测肝纤维化的液相芯片及其制备方法 | |
| CN106556703A (zh) | 一种慢性肾脏病标志物suPAR检测试剂盒和制备方法 | |
| CN101675340A (zh) | 人类泌尿生殖道支原体感染检测方法及其诊断试剂盒 | |
| CN112881708B (zh) | 用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸及其制备 | |
| CN106198962B (zh) | 用于封闭生物磁珠的方法 | |
| CN107271692B (zh) | 一种标记特异性高亲和力重组抗体的荧光微球及其应用 | |
| CN101320042A (zh) | 抗角蛋白抗体的检测方法及试剂盒 | |
| CN106526166A (zh) | 猪肉中瘦肉精的快速检测 | |
| CN108279310A (zh) | 一种肺炎克雷伯菌的检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN107870244A (zh) | 一种用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体lamp方法 | |
| CN106556705A (zh) | 一种可溶性st2的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN208060540U (zh) | 一种用于脓毒症快速定量检测的多指标胶体金试剂盒 | |
| CN109633163A (zh) | 降钙素原/c反应蛋白二合一检测试剂盒 | |
| CN111735962B (zh) | 新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条 | |
| CN103837677A (zh) | 检测心脏标记物的试纸条及制备方法和检测方法 | |
| CN114636826A (zh) | Cd177+中性粒细胞在制备新生儿坏死性小肠结肠炎检测产品中的应用 | |
| CN107167607A (zh) | 一种基于发光量子点纳米微乳探针检测样品中角质蛋白19片段与癌胚抗原含量的试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20190222 Address after: No. 28 Fuxing Road, Haidian District, Beijing 100089 Applicant after: General Hospital of Chinese PLA Address before: Room 1101, Building No. 2, 25 Taiping Road, Haidian District, Beijing 100089 Applicant before: Chen Jiying |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170222 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |