CN101675340A - 人类泌尿生殖道支原体感染检测方法及其诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于检测由支原体引起的感染、特别是人类泌尿生殖道感染的方法和试剂盒。通过与固定的各种病理状态相关的各种抗原决定簇的混合物进行反应来检测受诊断对象的生物样品中特定抗支原体抗体的存在。
Description
技术领域
本发明涉及对由支原体引起的感染、特别是人类泌尿生殖道感染的检测。本发明提供了用于诊断由大范围的支原体菌株造成的泌尿生殖道感染的试剂盒。
背景技术
支原体是常常在人和动植物中造成隐性感染的独特细菌群。在动物中,它们作为发病和死亡的病原体而臭名昭著。在人类中,许多紊乱与支原体感染相关,一个实例是其准确诊断仍然很难的支原体肺炎或常见性传播感染[见例如,Merck Manual,第17版,(1999)1326页]。在文献中积累了越来越多与支原体发病机理有关的证据,但还没有一般性可用的能显著促进泌尿生殖道支原体疾病的分析的完善测试。WO 07/033171描述了基于与RNA探针的杂交的对样品中支原体存在的可能检测。WO94/03810描述了基于来自患者样品的抗支原体抗体对标准支原体培养物的效果来诊断受试对象中此前支原体感染的方法。EP 278340描述了肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)膜抗原在诊断支原体感染中的应用。可靠快速的诊断测试的缺乏使得很难鉴定作为病因的泌尿生殖道支原体,从而造成低估其在疾病中的作用和因此缺乏诊断和适当的治疗。
特别是,已显示泌尿生殖道支原体参与许多疾病和病理状态,包括妊娠并发症(早产、习惯性流产)、早产儿的发病和死亡、不孕(主要是男性因素)、尿道炎和前列腺炎、反应性关节炎以及近来的类风湿性关节炎。泌尿生殖道支原体在人类疾病的发展中的作用仅在过去十年才出现,并且由于标准化抗原的缺乏而使得很难确定支原体血清特征,而市场上没有可利用的实用测试使其更加复杂。本发明人也已展示了测定抗支原体抗体在诊断感染和预测数种人类病理的风险中的重要性和重大意义[见例如,Horowitz S.等:J.Rheumatol,27(2000)2747-2753]。
尽管各国引入了各种“自制”技术,但目前尚未获得有效且可靠的用于检测临床样品中人类泌尿生殖道支原体的通用诊断测试。如本领域技术人员所知,可利用的技术受到各种缺陷的影响,包括例如有限的灵敏度和有限的特异性(出现假阳性或假阴性结果)。因此,本发明的一个目的是提供用于检测由支原体造成的泌尿生殖道感染的可一般性适用的试剂盒。
本发明的另一个目的是提供用于通过合适的抗原来检测由特定支原体造成的泌尿生殖道感染的方法。
本发明的再一个目的是提供具有更少量的假阳性和/或假阴性结果的用于诊断支原体泌尿生殖道感染的方法和试剂盒。
本发明的又一个目的是提供能区分仅由支原体建群但未发展疾病的人与发展了感染/传染病/感染后病理的人的方法和试剂盒。
本发明的其它目的和优点将随着说明的展开而出现。
发明内容
本发明提供了通过测定取自待诊断患者的生物样品中特定抗支原体抗体的水平来检测泌尿生殖道支原体感染的方法,所述方法包括:i)提供来自多种病理状态的患有支原体泌尿生殖道感染的患者的多种生物标本;ii)从获自患者的所述数个支原体菌株制备全细胞制备物;iii)提供(来自各个种的)多种支原体抗原决定簇以用作患者样品中的特定抗体的检测材料;iv)使所述混合抗原结合至免疫测试表面上;v)使患者生物样品与步骤iv所述表面结合,从而使最终存在于所述样品中的抗支原体抗体结合至所述表面上;和vi)使所述表面与用于检测人类抗体的试剂接触。因而,通过测定相同种的广谱(多种)特定抗体来进行感染的确定。所述免疫测试表面是指用于本领域中的蛋白结合表面,该表面通常包含具有对蛋白的强亲和力且即使在洗涤步骤期间也不将其释放的聚合物;所述聚合物可以包含经修饰的天然材料或合成材料。所述多个人株优选包含各自感染有一种或多种选自由解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum)、微小脲原体(Ureaplasma parvum)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)和生殖支原体(Mycoplasma genitalium)组成的组中的支原体物种的至少6位患者。在本发明的一个优选实施方式中,将通过离心从(各个菌株的)支原体培养物获得的所述支原体细胞浓缩团块超声处理并将来自数个菌株的全细胞超声制备物(以等蛋白量)混合以形成“混合抗原”制备物。至关重要的是每个包含蛋白抗原的混合物获自从患有已知病理(即,尿道炎、妊娠并发症、不孕、关节炎等)的患者分离出的菌株且蛋白抗原获自多种病理,从而提供了疾病中表达的抗原群的最佳可能表现形式。所述免疫测试表面可以包括选自孔板和聚合物片的物品或免疫测试设计领域内已知的其它手段。所述试剂可包含与产生颜色或荧光反应的酶偶联的抗人抗体和酶底物或能使抗体可视化的其它手段。
本发明涉及从患有急性支原体泌尿生殖道感染的多人获得的混合支原体蛋白质类抗原。术语蛋白质类涉及根据本发明获得的包含源自支原体细胞的蛋白成分且通常参与引发人体内抗支原体感染的免疫响应的抗原组合物;所述组合物可以包含可能源自支原体细胞且通常作为脂蛋白出现的其它成分(即脂质)。
本发明涉及源自从患有支原体感染的多位患者分离的多个支原体菌株的混合抗原在检测泌尿生殖道感染中的应用,该应用覆盖了大范围的支原体种和菌株。
本发明提供了一种方法,该方法不仅用于诊断人类患者中与支原体感染相关的泌尿生殖道疾病,而且对所述抗体水平进行定量并比较患者样品中与未患急性支原体疾病的参照者的标准样品中所述抗体的水平。
本发明涉及一般性用于检测由支原体造成的人类泌尿生殖道感染并最终覆盖大范围的菌株和种的新型试剂盒,所述试剂盒包含:i)结合于基质上的混合抗原,所述混合抗原源自从患有急性支原体感染的多人分离的支原体;ii)使人类抗体的存在被可视化的试剂;和iii)使用说明。所述基质可以是包含如硝酸纤维素或合适的聚合物等蛋白结合聚合物的条带,所述条带可能包含用于检测人类抗支原体抗体的存在的片或孔。所述试剂盒可以包含例如各自表征一个样品的多个条带,或用于并行表征多个样品的装置。样品可以包含如血清等体液或其它。所述试剂是免疫测试领域内已知的,并且可以包含抗人抗体与酶和酶底物等的偶联物。
本发明通过提供包括可靠地检测对泌尿生殖道支原体的免疫响应的存在然后对所述患者施用已知有效的抗生素的方法,使得能够在需要用于支原体泌尿生殖道感染的治疗的患者中跟踪这种治疗的成功。所述抗生素可包括但不限于阿奇霉素、四环素、红霉素和克拉霉素。
附图说明
通过下列实施例并参考附图,本发明的上述及其它特征和优点将变得更加显而易见,其中:
图1是显示由两种抗原在血清中确定的抗体水平的图;
图2是显示用两种抗原获得的结果之间的匹配百分比的图;和
图3是展示两种抗原类型的性能差异的图,该图强调了“新”(发明)相对于此前由本发明人进行的自制测试的优越性。
具体实施方式
现已发现,采用获自处在疾病状态的患者的支原体抗原、特别是如果采用来自多位患者的样品的混合物的支原体抗原,可产生优异的泌尿生殖道支原体感染检测用免疫测试。本发明提供了具有惊人可靠性和更少量的假阳性结果的诊断方法。
在第一阶段,开发了用于检测血清和包括例如羊水、滑液、脑液、精液和气管灌洗液等的其它体液中特定抗支原体抗体的水平的ELISA型免疫测试。所述测试设计包括涂布有支原体抗原的微量滴定板,所述支原体抗原在本实验室中从获自国际收藏库(ATCC)的泌尿生殖道支原体参比种进行制备。然后,将血清或任何所述体液与涂布抗原温育,接着用以酶(例如,商购过氧化物酶)标记的抗人IgG检测形成的抗原-抗体复合物。向复合物中添加底物得到有色的产物,并通过光谱确定其强度。在第二阶段,用源自从处于其疾病阶段的患者分离的支原体菌株的特定支原体成分涂布包括板或其它基质(例如,惰性颗粒或试纸条等)在内的所述基本装置。因而,用于涂布的材料代表在疾病中表达且对发病机理负责的那些支原体成分。将患者的血清或其它体液与经涂布的基质温育并使标本中的支原体成分的抗体结合并对其含量(例如,滴度)进行定量。在本实验室(Soroka University Medical Centre,Beer-Sheva,Israel)中有大量人类参比标本可以利用。将测试的发展与参与患者有关的临床细节即病理参数相关,同时包括来自各种疾病和疾病阶段的标本。该方法使得可以评估测试的可靠性、灵敏度、重现性和特异性。此外,对新测试与如培养和PCR等其它分析技术的比较使本发明人确信在使用源自处在急性支原体感染阶段的多位患者的混合抗原制剂时,出现了提供更可靠的结果并具有更少的假阳性值的优异测试。不希望受任何特定理论的限制,本发明人相信源自多个菌株且来自多位急性感染的患者的抗原混合物能更好地区分无症状背景支原体群体与强致病菌株、减少假阳性结果并增加检测严重感染的灵敏度。新测试可以并入本领域已知的其它可利用的免疫测试装置,如在ELISA、凝集测试、吸附或沉淀测试中使用的过程元件等。在开发所述测试时,将患者血液或滑液中抗体的存在与支原体感染相关,并使得能够预测进一步的病理发展(例如,妊娠并发症、反应性关节炎、类风湿性关节炎和尿道炎等)。
本发明因而涉及用于实际检测支原体感染及仅仅建群的可一般性适用的免疫测试。在本发明的一个方面,提供了用于检测患有支原体泌尿生殖道感染的那些患者的方法,所述患者处于发展有机会性支原体建群的更严重疾病的风险中。在本发明的一个重要方面,使得能够治疗数种严重的支原体紊乱,包括检测支原体病原体的存在然后施用抗生素。
在一个非常重要的方面,本发明使得能开发和设计用于泌尿生殖道支原体感染的免疫测试,从而准确地适应某些环境、某些患者群和某些实验室设备的需要。当面向某些待诊断患者群体时,从属于同一群体的人收集用于制备混合抗原的标本。合适的混合抗原可以用于适于可利用设备的任何免疫测试中。
在本发明的一个实施方式中,混合抗原与基质偶联并起着与受测人体样品中存在的抗支原体抗体结合并使其可视化的作用。本领域内已知技术使得能例如通过测定颜色强度来定量和比较抗体水平。在本发明的免疫测试的一个优选应用中,临床实验室收集物建立了带有任何相关的诊断和病历组合的来自患者的一批样品。利用该收集物制备了适合的混合抗原以用于最佳免疫测试中、用于开发和校正所述测试、用于与其它可利用信息和由独立方法提供的实验室测试比较和用于验证所得免疫测试。
在本发明的一个优选实施方式中,使选定混合抗原与一片蛋白结合基质结合并进一步对其提供颜色检测手段,从而快速揭示表征急性和/或慢性泌尿生殖道感染的抗支原体抗体的存在。该片基质可能具有检测条的形状,且所述检测手段可以包含如抗人IgG-酶偶联物和酶底物等人类抗体可视化试剂,同时可以将所述试剂以安瓿或其它方式封装,并制剂以简单导入可视化过程中。伴有颜色标尺和/或使用手册的该片基质与试剂提供了用于检测泌尿生殖道支原体感染的试剂盒。
因而,在市场上没有可利用的一般血清学试剂盒的情况下,本发明提供了优异的用于检测由支原体造成的急性或慢性泌尿生殖道感染的实验室测试和商用试剂盒。新测试显著促进了支原体疾病的分析。除了一般应用外,还提供了用于检测多种泌尿生殖道支原体的试剂盒以用于区分任何期望的菌株和种的组合;基于相同的方法学,可以包括属于例如解脲脲原体、微小脲原体、人型支原体、发酵支原体和生殖支原体的菌株。
市场将得到可靠、简单、快速、容易、廉价且具有很低的假阴性结果和很低的假阳性结果的试剂盒,所述试剂盒符合产科学和妇科学(高危妊娠、遗传学羊水穿刺、体外受精、不育)、新生儿科学(重症监护等)、泌尿学(男性和女性尿路感染)、风湿病学(反应性关节炎和类风湿性关节炎等)、内科学和高危人群STD(性传播疾病)诊治的需要。
在以下实施例中将对本发明进行进一步描述和说明。
实施例
实施例1
从多位患有急性或慢性泌尿生殖道感染的患者取得多个样品。从各个样品培养支原体菌株,通过PCR验证支原体的存在。在含有7.5%FCS(胎牛血清)的10B液体培养基中培养6个样品,在所述样品中已通过PCR证实支原体属于解脲脲原体或微小脲原体。将细胞在27,000×g离心40分钟并用磷酸盐缓冲盐水洗涤2次。将洗涤后的细胞团块在1mM苯甲磺酰氟(蛋白酶抑制剂)的存在下超声处理,并将含有所有细胞成分(即未分级的蛋白、脂蛋白和核酸的混合物)的超声处理物用作支原体抗原。
实施例2
制备来自6个不同脲原体种菌株(3个微小脲原体(Up)和3个解脲脲原体(Uu))的脲原体抗原混合物。如实施例1所述将菌株从患者中分离,并指定为“新”。通过PCR验证所述种的身份。用采用“新”混合抗原的ELISA测试了此前已在本实验室中分析过的来自患有不同疾病的113位患者的血清样品。平行地,采用从以前命名为解脲脲原体血清型3(Up)的微小脲原体ATCC#27815和以前命名为解脲脲原体血清型4(Uu)的解脲脲原体ATCC#27816制备的抗原进行ELISA。将它们各自单独使用,并在此均指定为“旧”。将这些抗原用于测试所述113个血清样品。于是,比较了基于三个不同抗原系统的ELISA测试。
使用了数种血清类型,在本实验室中记录为:a)Up阳性,Uu阳性,b)Up阳性,Uu阴性,c)Up阴性,Uu阳性,d)Up阴性,Uu阴性。在所有这些血清中,在测试中包括的某些血清为:a)高度阳性,b)阳性,c)阴性,d)中间阳性,和e)边界。
如图1中可见,所有“旧”测试为阴性的血清也被“新”测试发现为阴性,反之亦然。相似地,所有“旧”测试为高度阳性的血清也被“新”测试发现为阳性。因而,在87.5%的血清中,两种测试之间完全一致(“旧”测试与“新”测试)。如图2所示。仅1.8%(113位患者中的2位)无法确定测试的终点。而且,10.6%(113位患者中的12位)从阳性(“旧”测试中)转变为阴性(“新”测试中),表明它们此前被记录为假阳性,且“新”制剂可能更加可靠。
在分析此前用“旧”材料给出不一致的结果和/或显示出报道为“中间”结果的边界抗体水平时,观察到“新”材料的另一个优点。如图3中可见,通过使用“新”制剂解决了“有问题”的血清(n=18),83.3%被证实为阳性(18位患者中的15位)而16.7%变为阴性(3/18)。
经证实,用脲原体种(微小脲原体和解脲脲原体)参比菌株进行测试时,本发明的测试比此前所用测试好得多且更加明确可靠。在上述实验中,用“旧”测试和“新”测试分析血清数次(2~4),而“新”材料的结果除2个未定以外均可重复(图2)。采用混合支原体抗原的新免疫测试方法可至少与此前的方法同样有效地检测出特定的抗支原体抗体,且假结果更少。
尽管根据一些具体实施例对本发明进行了描述,但仍可进行许多修改和变化。因此可以理解,在所附权利要求的范围内,本发明可以以除具体描述以外的其它方式来实现。
Claims (14)
1.一种检测取自待诊断患者的生物样品中的泌尿生殖道支原体感染的方法,所述方法包括
i)提供来自多种病理状态的患有支原体泌尿生殖道感染的患者的多种生物标本;
ii)从获自患者的所述数个支原体菌株制备全细胞制备物;
iii)提供(来自各个种的)多种支原体抗原决定簇以用作患者样品中的特定抗体的检测材料;
iv)使所述混合抗原结合至免疫测试表面上;
v)使患者生物样品与步骤iv所述表面结合,从而使最终存在于所述样品中的抗支原体抗体结合至所述表面上;和
vi)使所述表面与用于检测人类抗体的试剂接触;由此检测由来自广谱菌株和种的支原体剂造成的感染。
2.如权利要求1所述的方法,其中,从来自6位患者的至少6个分离物制备所述多种抗原。
3.如权利要求1所述的方法,其中,所述多个人株优选包括各自感染有一种或多种选自由解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum)、微小脲原体(Ureaplasma parvum)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)和生殖支原体(Mycoplasma genitalium)组成的组中的支原体物种的至少6位患者。
4.如权利要求1所述的方法,其中,所述蛋白质类组合物的制备包括通过采用浓缩支原体细胞的培养、洗涤和破裂步骤制备细菌超声处理物。
5.如权利要求1所述的方法,其中,所述免疫测试表面包括选自孔板、聚合物片和试纸条的物品。
6.如权利要求1所述的方法,其中,所述试剂包含与酶和酶底物偶联的抗人抗体。
7.一种混合支原体抗原,所述混合支原体抗原如权利要求1所述获得。
8.一种用于诊断人类患者中与支原体感染相关的泌尿生殖疾病的方法,所述方法包括
i)提供权利要求7所述的混合抗原;
ii)检验来自所述患者的生物样品中抗所述混合抗原的抗体的存在并对所述抗体的水平进行定量;和
iii)比较所述患者样品与未患急性支原体疾病的人的标准样品中所述抗体的水平。
9.一种用于检测由支原体造成的人类泌尿生殖道感染的试剂盒,所述试剂盒包含
i)结合于基质上的权利要求7所述的混合抗原;
ii)使人类抗体的存在被可视化的试剂;和
iii)使用说明。
10.如权利要求7所述的试剂盒,其中,所述基质是包含蛋白结合聚合物的条带。
11.如权利要求7所述的试剂盒,其中,所述基质包含用于检测多个样品中人类抗支原体抗体的存在的片或孔。
12.如权利要求7所述的试剂盒,其中,所述试剂是抗人抗体或酶底物的偶联物。
13.如权利要求7所述的抗原,所述抗原用于检测由大范围的支原体抗原造成的泌尿生殖道感染。
14.一种用于在需要支原体泌尿生殖道感染治疗的患者中跟踪所述治疗的成功的方法,所述方法包括检测所述患者的泌尿生殖道支原体抗体水平的变化。
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