CN111735962B - 新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条 - Google Patents

新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫层析技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条，包括：胶体金吸附垫和抗体承载膜；所述胶体金吸附垫上包被胶体金标记的新型冠状病毒重组抗原和胶体金标记的鼠IgG；所述抗体承载膜上设置有相间隔的检测线T1、检测线T2和质控线C，所述第一检测线包被抗人IgMμ链单抗，所述第二检测线包被抗人IgG抗体，所述质控线包被抗鼠IgG抗体；上述免疫层析试纸条可以同时检测新型冠状病毒IgM和IgG抗体，检测时间短仅为10min，成本低，容易操作，技术性要求低，同时便于现场采集样本(特别是指尖血采集)，适用于现场、即时、快速检测。

Description

新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条
技术领域
本发明涉及免疫层析技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒IgM/IgG 抗体联检免疫层析试纸条、试剂卡、试剂盒以及联检方法。
背景技术
1月12日，世界卫生组织(WHO)将新型冠状病毒命名为“2019 新型冠状病毒”(2019-nCoV)。2月11日，世界卫生组织(WHO)宣布将 新型冠状病毒感染引起的疾病正式命名“COVID-19”。同日，2020年2月 11日，国际病毒分类委员会 (International Committeeon Taxonomy of Viruses，ICTV)宣布新型冠状病毒 的正式名称为严重急性呼吸综合征冠状病毒 2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，简称SARS-CoV-2)。该病毒是一种新型的冠状病毒株，有高度传染性，在无特效药药物治疗下，死 亡率较高，该病毒传播途径主要是通过呼吸道飞沫传播和接触传播等。由 于还没有针对性的特效药，而相关疫苗距离临床应用尚需时间，因此早诊 断、早隔离、切断传播途径是控制疫情蔓延的关键。
针对新型冠状病毒2019-nCoV的检测主要是PCR为基础的病毒核酸检 测，其具有特异性和灵敏度高的优势，然而该检测方法具有如下缺陷：对 技术要求高，容易出现假阴性，标本需要特殊处理，要求具备PCR扩增仪 及凝胶电泳等专业的仪器设备，需专业技术人员操作和判断检测结果，对 新型冠状病毒的检测用时长，无法进行大规模的筛查。
到目前为止，世界各国的新型冠状病毒疫情处于不同阶段，仍有部分 国家确诊病例处于高速增长阶段，而又医护资源非常紧张，需要非专业的 工作人员或志愿者协助进行快速的大规模的筛查。为了便于非专业的基层 工人员对社区进行快速的大规模的筛查，亟需一种更早期、更准确、更快 捷、更有效的检测新型冠状病毒的试纸。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种更早期、更准确、更快 捷、更有效的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条、试剂卡、 试剂盒以及联检方法。
为此，本发明提供了如下的技术方案：
一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条，包括：胶体金 吸附垫和抗体承载膜；所述胶体金吸附垫上包被胶体金标记的新型冠状病 毒重组抗原和胶体金标记的鼠IgG；所述抗体承载膜上设置有相间隔的检测 线T1、检测线T2和质控线C，所述第一检测线包被抗人IgMμ链单抗，所 述第二检测线包被抗人IgG抗体，所述质控线包被抗鼠IgG抗体。
进一步的，所述新型冠状病毒重组抗原的序列如SEQ ID NO.1所示。
一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条的制备方法，包 括如下步骤：
将胶体金标记的新型冠状病毒重组抗原和胶体金标记的鼠IgG包被在 胶体金吸附垫上；
将抗人IgMμ链单抗、抗人IgG抗体和抗鼠IgG抗体分别包被在抗体 承载膜的检测线T1、检测线T1和质控线C上；
将上样垫、胶体金吸附垫、抗体承载膜和吸水垫依次搭接在基片上。
所述的制备方法，在制备抗体承载膜时所述抗人IgG抗体，浓度为0.3～ 0.5mg/ml；
所述抗人IgMμ链单抗，浓度为0.3～0.5mg/ml；
所述抗鼠IgG抗体，浓度为1.5～1.8mg/ml。
一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂卡，包括所述的新 型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条或所述的制备方法制备得到 的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条。
所述的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂卡，包括卡壳， 所述卡壳内部安装有新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条；
所述卡壳包括上盖和壳体；
所述上盖设置有加样孔和视窗；
所述加样孔对应于新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条的 上样垫；
所述视窗对应于新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条的抗 体承载膜。
所述的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂卡，所述上盖上 还设置有稀释孔，所述稀释孔设置在加样孔的远离视窗的一侧。
一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂盒，包括所述的新 型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条、所述的制备方法制备得到 的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条或所述的新型冠状病毒 IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂卡。
所述的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂盒，还包括稀释 液，所述稀释液中包括磷酸盐缓冲液、络蛋白盐和防腐剂。
一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检方法，利用所述的新型冠状病毒 IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条、所述的制备方法制备得到的新型冠状病 毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条或所述的新型冠状病毒IgM/IgG抗体 联检免疫层析试剂卡；在检测时，在检测时，将样本进行稀释；将样本稀 释45-55倍。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸 条，包括：胶体金吸附垫和抗体承载膜；所述胶体金吸附垫上包被胶体金 标记的新型冠状病毒重组抗原和胶体金标记的鼠IgG；所述抗体承载膜上设 置有相间隔的检测线T1、检测线T2和质控线C，所述第一检测线包被抗人 IgMμ链单抗，所述第二检测线包被抗人IgG抗体，所述质控线包被抗鼠IgG 抗体；上述免疫层析试纸条可以同时检测新型冠状病毒IgM和IgG抗体， 检测时间短仅为10min，成本低，容易操作，技术性要求低，同时便于现场 采集样本(特别是指尖血采集)，适用于现场、即时、快速检测。
2.本发明提供的一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条， 新型冠状病毒重组抗原的序列如SEQ ID NO.1所示，所述新型冠状病毒重 组抗原能够特异性结合新型冠状病毒IgM和IgG抗体，具有良好的特异性、 重复性、稳定性和灵敏度。
3.本发明提供的一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂盒， 还包括稀释液，所述稀释液中包括磷酸盐缓冲液、络蛋白盐和防腐剂，通 过设置稀释液，将样本进行稀释的加样方式决定了采样方式比较灵活，即 可将样本收集至稀释液瓶中保存、运输，集中测试，适用于大规模筛查， 有助于非专业的基层工人员对社区进行快速的大规模的筛查。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下 面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普 通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其他的附图。
图1是本发明实施例1新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸 条的示意图；
图2是本发明实施例3中新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试 剂卡一种实施方式的示意图；
图3是本发明实施例3中新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试 剂卡另一种实施方式的示意图。
附图标记：
1-基片，2-上样垫，3-胶体金吸附垫，4-抗体承载膜，5-吸水垫，6-保 护膜，7-卡壳，8-上盖，9-加样孔，10-视窗，11-稀释孔，T1-检测线T1， T2-检测线T2，C-质控线C。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最 佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的 启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发 明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述 的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商 者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中的抗人IgMμ链单抗、抗人IgG抗体、抗鼠IgG抗体、 鼠IgG均为市售产品。新型冠状病毒重组抗原的序列如SEQ ID NO.1所示， 由北京科卫临床诊断试剂有限公司合成。
实施例1
一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条，如图1所示， 在基片1上依次重叠搭接有上样垫2、胶体金吸附垫3、抗体承载膜4和吸 水垫5；
所述胶体金吸附垫3上包被胶体金标记的新型冠状病毒重组抗原和胶 体金标记的鼠IgG；新型冠状病毒重组抗原的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述抗体承载膜4上设置有相间隔的检测线T1、检测线T2和质控线C， 检测线设置在靠近胶体金吸附垫3的一侧，质控线C设置在靠近吸水垫5 的一侧；所述检测线T1包被抗人IgMμ链单抗，所述检测线T2包被抗人 IgG抗体，所述质控线C包被抗鼠IgG抗体。检测线T1、检测线T2以及 检测线T2和质控线C的之间的间距为4-6mm，在本实施例中选择间距为4mm。
进一步的，上样垫2和吸水垫5上均设置有保护膜6。
实施例2
本实施例提供了一种制备实施例1中的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联 检免疫层析试纸条的方法，包括如下步骤：
1.抗体承载膜4的制备：
(1)选择3μm～10μm孔径的硝酸纤维素膜，根据需要将膜分切成宽 度为2.0cm,长度为30.5cm的规格，备用。
(2)用0.1M、pH8.0的Tris-HCL缓冲液配制供检测线包被使用的抗 人IgG单克隆抗体，抗体浓度为(0.3～0.5)mg/ml，本实施例中为0.3mg/ml， 抗人IgMμ链单克隆抗体，抗体浓度为(0.3～0.5)mg/ml，本实施例中为 0.3mg/ml，用质量百分含量0.85％的氯化钠缓冲液配制供质控线包被使用的 抗鼠IgG多克隆抗体，使抗体浓度为(1.5～1.8)mg/ml，本实施例中为 1.5mg/ml。
(3)选择硝酸纤维素膜的抗体包被面并作标记，将需包被的检测线和 质控线的抗体溶液平行均匀的包被在膜片上，且检测线与质控线的间距控 制在距离C—抗人IgG：4.0mm，抗人IgG—抗人IgMμ链：4.0mm，本实 施例中为4.0mm，硝酸纤维素膜在2℃～30℃的恒温条件下干燥备用。
(4)配制封闭处理浸泡液，向配液罐加入实际生产量的纯化水；分别 称量缓冲液、糖份、封闭蛋白和防腐剂，将以上组分直接加入到配液罐中 搅拌，直至完全溶解，加纯化水定容至所需体积，充分搅拌均匀，搅拌时 间不少于10分钟，备用；其中配制的封闭处理浸泡液中含有0.1Mol缓冲 液、质量百分含量为0.5％的糖份、质量百分含量为1％的封闭蛋白、质量 百分含量为0.05％的防腐剂，其中，缓冲液为磷酸盐缓冲液，糖份为蔗糖， 防腐剂为硫柳汞，封闭蛋白为牛血清蛋白。
(5)将包被了检测线和质控线的膜放于处理槽中，加入配好的上述(4) 的封闭处理浸泡液，确保每条膜完全浸没在上述(4)的封闭处理浸泡液中 30分钟，并保证膜不移动、不重叠，30分钟后将膜从处理槽中取出，将上 述(4)的封闭处理浸泡液倒掉；用镊子将膜放在纱布上晾稍干，得到抗体 承载膜4。
(6)贴板干燥：撕去胶板双面胶上切割线中间的白纸，用镊子将封闭 处理后的抗体承载膜4正好放在胶板中央空白位置，且胶板右边与膜右边 平齐，避免在生产过程中的误差，确保显色位置相对准确，贴板时全部顶 质控线一头贴，膜贴在胶板上后，隔着双面胶纸抹平膜面，避免有气泡， 控制室内的温度18～28℃、相对湿度≤40％，并保证干燥间空气能循环流通 且除湿机风不会直接吹到膜面上。干燥时间≥4小时，后备用。
2.胶体金吸附垫的制备
(1)胶体金复溶液的配制：向配液罐加入实际生产量的纯化水；用电 子分析天平称量海藻糖、牛血清白蛋白、柠檬酸三钠、聚乙二醇和NaN3， 直接加入到配液罐中搅拌，搅拌直至完全溶解，加纯化水定容至所需体积， 充分搅拌均匀，搅拌时间大于30分钟，得到的胶体金复溶液中含有质量百 分含量5％的海藻糖、质量百分含量2％的牛血清白蛋白、质量百分含量0.5％ 的柠檬酸三钠、质量百分含量0.05％的聚乙二醇、质量百分含量0.05％的NaN3。
(2)用量筒量取需要标记量的胶体金，按pH7.0-7.3进行调节，即按 体积百分含量为0.50％加入0.2mol/L的碳酸钾溶液，于磁力搅拌器上搅拌 15分钟后，取新型冠状病毒重组抗原，用双蒸水将新型冠状病毒重组抗原 进行稀释，并按1ug/ml标记胶体金(即向新型冠状病毒重组抗原稀释液中 加入胶体金后，新型冠状病毒重组抗原的终浓度为1ug/ml)，将新型冠状病 毒重组抗原加入胶体金中，于磁力搅拌器上搅拌30分钟，加入体积百分含量0.5‰的稳定剂聚乙二醇，搅拌30分钟后离心，收集沉淀，用胶体金复 溶液按体积百分含量3％复溶，于磁力搅拌器上搅拌至混合均匀，得到体积 百分含量3％的胶体金－新型冠状病毒重组抗原结合物复溶液，备用。
(3)用量筒量取需要标记量的胶体金，按pH7.0-7.3进行调节，即按 体积百分含量为0.50％加入0.2mol/L的碳酸钾溶液，于磁力搅拌器上搅拌 15分钟后，取鼠IgG抗体，用双蒸水将鼠IgG抗体进行稀释，并按3ug/ml 标记胶体金，将鼠IgG抗体加入胶体金中，于磁力搅拌器上搅拌30分钟， 加入体积百分含量0.5‰的稳定剂聚乙二醇，搅拌30分钟后离心，收集沉 淀，用胶体金复溶液按体积百分含量3％复溶，于磁力搅拌器上搅拌至混合 均匀，得到体积百分含量3％的胶体金－鼠IgG抗体结合物复溶液，备用。
(4)取上述(2)和(3)中体积百分含量3％的胶体金－新型冠状病 毒重组抗原结合物复溶液和胶体金－鼠IgG抗体结合物复溶液，用胶体金 复溶液按体积百分含量50％进行复溶，于磁力搅拌器上混合均匀，按照 50μl/cm2浇制在准备好的胶体金吸附垫3上，置于干燥室晾干≥4个小时， 干燥室控制温度18-28℃，相对湿度≤40％，保证空气畅通且气流不能直接 吹于胶体金吸附垫3上，将干燥好的胶体金吸附垫3放入到装有干燥剂的 铝箔袋中，密封保存，做好标记胶体金吸附垫3，备用。
注：胶体金为浇制，是因为浇制的胶体金可以自由的裁切宽度，从而 方便调节产品的深浅显色。
3.组装及裁切：
(1)取已粘贴抗体承载膜4的透明基片1半成品，将试纸条胶体金吸 附垫3按0.5cm宽度裁切成0.5cm×30cm的条状后粘贴在靠近检测线一侧的 透明基片1上，并保持与抗体承载膜4呈搭接约1mm，将试纸条吸水垫5 复合在靠近质控线一侧的透明基片1上并与抗体承载膜4搭接约1mm，将 试纸条上样垫2复合在试纸条胶体金吸附垫3远离抗体承载膜4的一端并 与其搭接约1mm，做好标记，备用；
(2)将已组装备用的基片1，切割成条状试纸备用。
实施例3
本实施例提供了一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂卡， 包括实施例1中的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条。
进一步的，如图2所示，还包括卡壳7，所述卡壳7内部安装有实施例 1中的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条。
所述卡壳7包括上盖8和下盖；
所述上盖8设置有加样孔9和视窗10；
所述加样孔9对应于新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条 的上样垫2；
所述视窗10对应于新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条的 抗体承载膜4。
进一步的，如图3所示，所述上盖8上还设置有稀释孔11，所述稀释 孔11设置在加样孔9的远离视窗10的一侧。
实施例4
本实施例提供了一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂盒， 包括实施例1的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条。
进一步的，还包括稀释液，所述稀释液中包括磷酸盐缓冲液、络蛋白 盐和防腐剂。所述稀释液为含0.005-0.015M PBS，络蛋白盐 0.2-4％(w/v)，防腐剂0.02-0.07％(w/v)，pH7.0，所述防腐剂为NaN3或硫柳 汞，在本实施例中，所述稀释液为含0.01M PBS，络蛋白盐0.3％(w/v)，防 腐剂0.05％(w/v)，pH7.0，所述防腐剂为NaN3。
实施例5
本实施例提供了一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂盒， 包括实施例3中的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂卡。
进一步的，还包括稀释液，所述稀释液中包括磷酸盐缓冲液、络蛋白 盐和防腐剂。在本实施例中，所述稀释液为含0.01M PBS，络蛋白盐 0.3％(w/v)，防腐剂0.05％(w/v)，pH7.0，所述防腐剂为NaN3。
实施例6
本实施例提供了一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检方法，包括利用 实施例4中的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂盒，具体包括 如下步骤：
在检测时，将待测样本恢复室温，用定量吸管或移液器吸取10微升样 本，加入到稀释液管中(样本:稀释液＝1：50(v:v))，混合均匀后待用。
将新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条平置于台面上。
用吸管吸取稀释后样本，垂直滴加2滴样本于上样垫2处。10分钟判 读并记录实验结果，15分钟判读结果无效。(强阳性样本检测时，3-5钟可 呈现阳性结果。)
结果判读：
检测IgM阳性样本时，血清(或血浆、或全血)样本中新型冠状病毒 IgM抗体与胶体金标记的冠状病毒重组抗原结合形成复合物，由于层析作 用复合物沿纸条向前移动，经过检测线T1时与预包被的抗人IgMμ链单抗 结合形成“Au-2019-nCoV Ag-2019-nCoV IgM Ab-抗人IgM Ab”复合物， 从而在检测线T1处显示紫红色条带，游离金标鼠IgG则于质控线C处与抗 鼠IgG抗体结合，从而在质控线C处显示紫红色条带。阴性标本则仅在质 控线C处显示紫红色条带。
检测IgG阳性样本时，血清(或血浆、或全血)样本中新型冠状病毒 IgG抗体与胶体金标记的新型冠状病毒抗原结合形成复合物，由于层析作用 复合物沿纸条向前移动，经过检测线T2时与预包被的抗人IgG抗体结合形 成“Au-2019-nCoV Ag-2019-nCoV IgG Ab-抗人IgG Ab”夹心物，从而在 检测线T2处显示紫红色条带，游离金标鼠IgG则于质控线C处与抗鼠IgG 抗体结合，从而在质控线C处显示紫红色条带。阴性标本则仅在质控线C 处显示紫红色条带。
实施例7
本实施例提供了一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检方法，包括利用 实施例5中的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂盒，具体包括 如下步骤：
当试剂卡不具有稀释孔11时(如图2)：
在检测时，将待测样本恢复室温，用定量吸管或移液器吸取10微升样 本，加入到稀释液管中(样本:稀释液＝1：50(v:v))，混合均匀后待用。
将新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂卡平置于台面上。
用吸管吸取稀释后样本，垂直滴加2滴样本于加样孔9处。10分钟从 视窗10处判读并记录实验结果，15分钟判读结果无效。(强阳性样本检测 时，3-5钟可呈现阳性结果。)
当试剂卡具有稀释孔11时(如图3)：
在检测时，将待测样本恢复室温，待用。
将新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂卡平置于台面上。
先用吸管吸取5微升样本垂直滴加于加样孔9处，然后将稀释液垂直 滴加2滴于稀释孔11处。10分钟从视窗10处判读并记录实验结果，15分 钟判读结果无效。(强阳性样本检测时，3-5钟可呈现阳性结果。)
结果判读：
检测IgM阳性样本时，血清(或血浆、或全血)样本中新型冠状病毒 IgM抗体与胶体金标记的冠状病毒重组抗原结合形成复合物，由于层析作 用复合物沿纸条向前移动，经过检测线T1时与预包被的抗人IgMμ链单抗 结合形成“Au-2019-nCoV Ag-2019-nCoV IgM Ab-抗人IgM Ab”复合物， 从而在检测线T1处显示紫红色条带，游离金标鼠IgG则于质控线C处与抗 鼠IgG抗体结合，从而在质控线C处显示紫红色条带。阴性标本则仅在质 控线C处显示紫红色条带。
检测IgG阳性样本时，血清(或血浆、或全血)样本中新型冠状病毒 IgG抗体与胶体金标记的新型冠状病毒抗原结合形成复合物，由于层析作用 复合物沿纸条向前移动，经过检测线T2时与预包被的抗人IgG抗体结合形 成“Au-2019-nCoV Ag-2019-nCoV IgG Ab-抗人IgG Ab”夹心物，从而在 检测线T2处显示紫红色条带，游离金标鼠IgG则于质控线C处与抗鼠IgG 抗体结合，从而在质控线C处显示紫红色条带。阴性标本则仅在质控线C 处显示紫红色条带。
实验例1
一、对本发明实施例5中的试剂盒涉及的性能指标检测
1.概述
本实验是根据《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则(征求意见 稿)》和《2019新型冠状病毒抗原/抗体检测试剂注册技术审评要点》的要 求，对本发明实施例5中的试剂盒涉及的性能指标进行检测，评估其是否 符合设计研究的要求。
2.试剂信息
2.1批号和规格
新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM/IgG抗体联合检测试剂盒(胶体金法) (待测试剂盒)为卡型，包装规格均为10人份/盒、20人份/盒、25人份/ 盒、40人份/盒。产品在生产过程中，将相同工艺制成的半成品试纸条装入 卡壳后再封入铝箔袋中，在10人份/盒、20人份/盒、25人份/盒和40人份 /盒规格中完全相同，并无区别，因此10人份/盒、20人份/盒、25人份/ 盒和40人份/盒包装的产品性能应是一致的。现就20人份/盒卡型产品进行 性能评估。
卡型：规格：20人份/盒；批号：2003015101、2003025101、2003035101。
2.2标准品
表1用于性能评估的参考品
Figure BDA0002530446600000111
3.性能评估过程
3.1外观性状
3.1.1实验要求
实验人员应熟悉检测方法与试剂操作；用待测试剂盒产品检测其外观 性状。
3.1.2实验材料和方法
取出试纸，在自然光下用目测方法观察，试纸卡型是否外观平整，塑 料外壳的配合是否牢固，壳内试纸装配是否平整规则。
3.1.3实验结果
表2：外观性状试验结果
Figure BDA0002530446600000121
3.1.4实验结论
从上表可以看出：外观符合要求。
3.2膜条宽度
3.2.1实验要求
实验人员应熟悉检测方法与试剂操作；用待测试剂盒中试产品检测其 膜条宽度。
3.2.2实验材料和方法
取出试纸，用游标卡尺(精密度0.02mm)测量膜条宽度，重复测量3 个试纸，取平均值。
3.2.3实验结果
表3：膜条宽度试验结果
Figure BDA0002530446600000122
Figure BDA0002530446600000131
3.2.4实验结论
从上表可以看出：膜条宽度符合要求。
3.3移行速度
3.3.1实验要求
实验人员应熟悉检测方法与试剂操作；用待测试剂盒产品检测其移行 速度。
3.3.2实验材料和方法
用游标卡尺(精密度0.02mm)测量视窗反应区下端至反应区上端的长 度，记为(L)，用秒表(精度为0.01s)记录稀释液在L区移行所需时间， 记为(t),计算L/t即为移行速度，重复测量3次，取平均值,同时观察 试纸层析状态、本底情况和质控线的显色.
3.3.3实验结果
表4：移行速度试验结果
Figure BDA0002530446600000132
Figure BDA0002530446600000141
3.3.4实验结论
从上表可以看出：移行速度、质控线显色、层析状态、本底情况均符 合要求。
3.4最低检测限
3.4.1实验要求
实验人员应熟悉检测方法与试剂操作；采用合适的参考品；用待测试 剂盒产品检测其最低检测限。
3.4.2实验材料和方法
用新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM/IgG抗体企业参考品检测，IgG灵敏 度参考品：L1、L2、L3；IgM灵敏度参考品：L4、L5、L6。
3.4.3实验结果
表5：最低检测限试验结果
Figure BDA0002530446600000151
3.4.4实验结论
从上表可以看出(G代指IgG，M代指IgM)：L1、L2为IgG阳性反 应，L3为IgG阴性反应；L4、L5为IgM阳性反应，L6为IgM阴性反应。
3.5参考品符合率
3.5.1实验要求
实验人员应熟悉检测方法与试剂操作；采用合适的参考品；用待测试 剂盒产品检测其参考品符合率。
3.5.2实验材料和方法
阴性参考品符合率：用企业参考品(N1～N15)分别对三批试剂盒进 行检测。
阳性参考品符合率：用企业参考品(P1～P8)分别对三批试剂盒进行 检测。
3.5.3实验结果
表6：参考品符合率试验结果
Figure RE-GDA0002633947870000151
3.5.4实验结论
由表6可以得出(G代指IgG，M代指IgM)：
阴性参考品符合率：用企业参考品(N1～N15)进行检测。
阴性参考品应全部为阴性，阴性符合率(-/-)为15/15。
阳性参考品符合率：用企业参考品(P1～P8)进行检测。
IgG抗体阳性参考品(P1～P3)符合率：IgG没有出现阴性反应，阳性 符合率(+/+)为3/3；
IgM抗体阳性参考品(P4～P6)符合率：IgM没有出现阴性反应，阳 性符合率(+/+)为3/3；
IgG/IgM抗体阳性参考品(P7～P8)符合率：IgG/IgM没有出现阴性反 应，阳性符合率(+/+)为2/2。
3.6精密度
3.6.1实验要求
实验人员应熟悉检测方法与试剂操作；采用合适的参考品；用待测试 剂盒产品检测。
3.6.2实验材料和方法
用企业精密性参考品(CV1、CV2)对三批待测试剂盒分别平行进行 检测10次。
3.6.3实验结果
表7：精密度试验结果
Figure BDA0002530446600000171
3.6.4实验结论
从上表(G代指IgG，M代指IgM)可以看出：各批结果一致，显色均 一，说明待测试剂盒一致性良好。
二、本实验例中新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM/IgG抗体联合检测试剂盒(胶 体金法)企业参考品的配制方法
1、试验目的:
目的是通过临床样本的筛选、验证、标化，以确定新型冠状病毒 (2019-nCoV)IgM/IgG抗体联合检测试剂盒(胶体金法)企业参考品。
2、试验管理:
2.1样本来源：临床合作单位(20份阴性：其中5份特异性抗体，10份阳 性)。
2.2实验材料：
(1)新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM/IgG抗体检测试剂盒(胶体金 法)(英诺特(唐山)生物技术有限公司)；
(2)新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM/IgG抗体联合检测试剂盒(胶体 金法)(本发明实施例5)
(3)A型流感病毒IgM抗体检测试剂盒(胶体金法)(潍坊市康华生物 技术有限公司)
(4)B型流感病毒IgM抗体检测试剂盒(酶免渗滤法)(青岛汉唐生物 科技有限公司)
(5)柯萨奇B组病毒IgM抗体检测试剂盒(胶体金法)(北京新兴四 寰生物技术有限公司)
(6)腺病毒IgM抗体检测试剂盒(胶体金法)(北京新兴四寰生物技 术有限公司)
(7)呼吸道合胞病毒IgM抗体检测试剂盒(胶体金法)(北京新兴四 寰生物技术有限公司)
3、试验设计及方案的描述：
3.1将所收集的临床标本(不能溶血、变质、粘稠及高血脂)，首先进行灭 活处理(56℃水浴灭活处理60分钟)。
3.2稀释：需要稀释时，用正常人样本稀释。
3.3使用第三方试剂盒：英诺特(唐山)生物技术有限公司的新型冠状病毒 (2019-nCoV)IgM/IgG抗体检测试剂盒(胶体金法)对临床样本进行筛选。
3.4对筛选出的阴性参考品进行特异性评价。
3.5对样本进行分类编号，要求：阳性8支用作P1-P8，其中15支阴性 N1-N15(其中N1为甲型(A型)流感病毒IgM抗体阳性，N2为乙型(B型) 流感病毒IgM抗体阳性，N3柯萨奇B组病毒IgM抗体阳性，N4为腺病毒 IgM抗体阳性，N5为呼吸道合胞病毒IgM抗体阳性),最低检出量6支用作 L1-L6，精密性2支用作CV1、CV2。
3.6用南通伊仕生物技术股份有限公司的新型冠状病毒(2019-nCoV) IgM/IgG抗体联合检测试剂盒(胶体金法)对参考品进行验证(共3次)。
3.7分装：50μl/支，CV：500μl/支。
3.8 37℃加速破坏10天后进行稳定性试验，确定参考品的有效期；最后进 行分装入库，-18℃至-25℃冷冻保存。
4、试验结果：
表8：参考品共31支样品，组成如下：
类别 编号 规格
阴性参考品 N1～N15 50μL/支
IgG抗体阳性参考品 P1～P3 50μL/支
IgM抗体阳性参考品 P4～P6 50μL/支
IgG/IgM抗体阳性参考品 P7～P8 50μL/支
IgG灵敏度参考品 L1～L3 50μL/支
IgM灵敏度参考品 L4～L6 50μL/支
精密性参考品 CV1、CV2 500μL/支
备注：阴性参考品中，N1为甲型流感病毒IgM抗体阳性，N2为乙型流感病 毒IgM抗体阳性，N3为柯萨奇B组病毒IgM抗体阳性，N4为腺病毒IgM抗 体阳性，N5为呼吸道合胞病毒IgM抗体阳性。
4.2经过测定，使用阴性样本中的01号作为稀释液稀释阳性样本。
4.3阴性参考品：经过测定，阴性样本中的02、10、08、14、15、03、04、 05、06、07、11、12、13、17、18号作为阴性参考品，分别定义为N1-N15。
4.4 IgG阳性参考品：经过测定，用01号阴性样本进行稀释，23号1∶160 稀释时，作为定义为P1；26号1∶60稀释时，定义为P2；28号1∶20稀 释时，定义为P3。
4.5 IgM阳性参考品：经过测定，用01号阴性样本进行稀释，24号1∶160 稀释时，定义为P4；25号1∶80稀释时，定义为P5；29号1∶30稀释时， 定义为P6。
4.6 IgG/IgM阳性参考品：经过测定，21号和22号阳性样本定义为P7、 P8。
4.7 IgG灵敏度参考品：选IgG阳性P1，用01号阴性样本进行1∶50、1∶ 100、1∶200稀释，分别定义为L1、L2、L3。
4.8 IgM灵敏度参考品：选IgM阳性P4，用01号阴性样本进行1∶40、1∶ 80、1∶160稀释，分别定义为L4、L5、L6。
4.9精密度参考品：经过测定，用L1和L4 1∶1混匀后，定义为CV1；用 L2和L5 1∶1混匀后，定义为CV2。
4.10经37℃加速破坏10天后进行测定，结果基本无变化，故暂定其有效 期为一年(-18℃至-25℃贮存)。
5.质量标准：
5.1最低检测限：
用企业敏感度参考品L1、L2、L3和L4、L5、L6分别进行检测，15分 钟判读结果，要求检测L1、L2为IgG阳性,L3检测为IgG阴性；L4、L5为 IgM检测为阳性,L6检测为IgM阴性。
5.2阳性符合率：
用企业阳性参考品P1-P8共8份，分别进行检测，15分钟判读结果， 要求P1-P3为IgG阳性3/3(+/+)，P4-P6为IgM阳性3/3(+/+)，P7-P8 IgG 和IgM同时为阳性2/2(+/+)。
5.3阴性符合率：
用企业阴性参考品N1-N15共15份，分别进行检测，15分钟判读结果， 要求检测仅为阴性15/15(-/-)。
5.4精密性：
用企业精密性参考品CV共2份，分别平行检测10份，15分钟判读结 果，要求CV1 10份均为阳性，且显色强度一致，要求CV2 10份均为阳性， 且显色强度一致。
6、贮存条件及有效期：
贮存条件：-18℃至-25℃冷冻保存
有效期：暂定一年
7、试验过程：
7.1标本筛选及编号(英诺特(唐山)生物技术有限公司试剂盒检测)
7.1.1临床标本筛选
表9、英诺特试剂初筛实验结果：
检测线 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
G - - - - - - - - - -
M - - - - - - - - - -
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
G - - - - - - - - - -
M - - - - - - - - - -
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
G ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + +
M ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++ +
注：根据英诺特检测试剂的“检测线色度值”判读方法，“+++”、“++”、
“+”、“-”分别表示强阳性、中等强度阳性、弱阳性和阴性。
实验小结：
1、01～20号可作为阴性样本。
2、21～30号可作为阳性样本。
表10：阴性参考品特异性评价
Figure BDA0002530446600000211
Figure BDA0002530446600000221
实验小结：
1、01号作为稀释液稀释阳性样本。
2、02、10、08、14、15、03、04、05、06、07、11、12、13、17、18 号作为阴性参考品，分别定义为N1-N15。
7.1.3阳性参考品
7.1.3.1IgG阳性参考品
表11：选23、26、28号阳性样本，用01号阴性样本进行稀释
Figure BDA0002530446600000222
注：根据英诺特检测试剂的“检测线色度值”判读方法，“+++”、“++”、
“+”、“-”分别表示强阳性、中等强度阳性、弱阳性和阴性。
实验小结：
1、23号1∶160稀释时，定义为P1。
2、26号1∶60稀释时，定义为P2。
3、28号1∶20稀释时，定义为P3。
7.1.3.2 IgM阳性参考品
表12：选24、25、29号阳性样本，用01号阴性样本进行稀释
Figure BDA0002530446600000231
注：根据英诺特检测试剂的“检测线色度值”判读方法，“+++”、“++”、
“+”、“-”分别表示强阳性、中等强度阳性、弱阳性和阴性。
实验小结：
1、24号1∶160稀释时，定义为P4。
2、25号1∶80稀释时，定义为P5。
3、29号1∶30稀释时，定义为P6。
7.1.3.3 IgG/IgM阳性参考品
21号和22号阳性样本定义为P7、P8。
7.1.4灵敏度参考品
7.1.4.1 IgG灵敏度参考品
表13：选IgG阳性P1，用01号阴性样本进行稀释
Figure BDA0002530446600000241
注：根据英诺特检测试剂的“检测线色度值”判读方法，“+++”、“++”、
“+”、“-”分别表示强阳性、中等强度阳性、弱阳性和阴性。
实验小结：
1、1∶50稀释时，定义为L1。
2、1∶100稀释时，定义为L2。
3、1∶200稀释时，定义为L3。
7.1.4.2 IgM灵敏度参考品
表14：选IgM阳性P4，用01号阴性样本进行稀释
Figure BDA0002530446600000242
注：根据英诺特检测试剂的“检测线色度值”判读方法，“+++”、“++”、
“+”、“-”分别表示强阳性、中等强度阳性、弱阳性和阴性。
实验小结：
1、1∶40稀释时，定义为L4。
2、1∶80稀释时，定义为L5。
3、1∶160稀释时，定义为L6。
7.1.5精密度参考品
7.1.5.1选L1和L4 1∶1混匀后，定义为CV1。
7.1.5.2选L2和L5 1∶1混匀后，定义为CV2。
7.2验证(南通伊仕生物技术股份有限公司试剂盒检测)
表15：验证结果
Figure BDA0002530446600000251
Figure BDA0002530446600000261
注：“+”、“-”分别表示阳性和阴性。
实验小结：
本次实验是将配制的参考品进行重复性实验，实验结果如下：
1、阴性参考品检测结果符合要求。
2、阳性参考品检测结果符合要求。
3、最低检出限参考品检测结果符合要求。
4、精密性参考品检测结果符合要求。
7.3参考品稳定性(南通伊仕生物技术股份有限公司试剂盒检测)
表16：稳定性检测结果
Figure BDA0002530446600000262
Figure BDA0002530446600000271
注：“+”、“-”分别表示阳性和阴性。
实验小结：
本次实验是将配制的参考品在37℃放置实验，实验结果如下：
1、阴性参考品检测结果符合要求。
2、阳性参考品检测结果符合要求。
3、最低检出限参考品检测结果符合要求。
4、精密性参考品检测结果符合要求。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方 式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予 以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保 护范围之中。
序列表
<120> 新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条
<130> NTHA202000003
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 1
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr
260

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条，其特征在于，包括：胶体金吸附垫和抗体承载膜；所述胶体金吸附垫上包被胶体金标记的新型冠状病毒重组抗原和胶体金标记的鼠IgG；所述抗体承载膜上设置有相间隔的检测线T1、检测线T2和质控线C，所述检测线T1包被抗人IgMμ链单抗，所述检测线T2包被抗人IgG抗体，所述质控线C包被抗鼠IgG抗体，其中，新型冠状病毒重组抗原的序列仅如SEQ ID NO.1所示。
2.一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将胶体金标记的新型冠状病毒重组抗原和胶体金标记的鼠IgG包被在胶体金吸附垫上，其中，新型冠状病毒重组抗原的序列仅如SEQ ID NO.1所示；
将抗人IgMμ链单抗、抗人IgG抗体和抗鼠IgG抗体分别包被在抗体承载膜的检测线T1、检测线T1和质控线C上；
将上样垫、胶体金吸附垫、抗体承载膜和吸水垫依次搭接在基片上。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在制备抗体承载膜时所述抗人IgG抗体，浓度为0.3～0.5mg/ml；
所述抗人IgMμ链单抗，浓度为0.3～0.5mg/ml；
所述抗鼠IgG抗体，浓度为1.5～1.8mg/ml。
4.一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂卡，其特征在于，包括权利要求1所述的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条或权利要求2或3所述的制备方法制备得到的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条。
5.根据权利要求4所述的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂卡，其特征在于，包括卡壳，所述卡壳内部安装有新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条；
所述卡壳包括上盖和下盖；
所述上盖设置有加样孔和视窗；
所述加样孔对应于新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条的上样垫；所述视窗对应于新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条的抗体承载膜。
6.根据权利要求5所述的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂卡，其特征在于，所述上盖上还设置有稀释孔，所述稀释孔设置在加样孔的远离视窗的一侧。
7.一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条、权利要求2或3所述的制备方法制备得到的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条或权利要求4-6任一项所述的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂卡。
8.根据权利要求7所述的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂盒，其特征在于，还包括稀释液，所述稀释液中包括磷酸盐缓冲液、络蛋白盐和防腐剂。
9.权利要求1所述的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条、权利要求2或3所述的制备方法制备得到的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条或权利要求4-6任一项所述的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂卡在制备用于新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检方法的检测产品中的应用，其中，所述新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检方法包括，利用权利要求1所述的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条、权利要求2或3所述的制备方法制备得到的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试纸条或权利要求4-6任一项所述的新型冠状病毒IgM/IgG抗体联检免疫层析试剂卡；在检测时，将样本进行稀释。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将样本稀释45-55倍。
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