CN116819074A - 一种牛病毒性腹泻病毒抗体的检测试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛病毒性腹泻病毒抗体的检测试纸条及其制备方法和应用，属于抗体检测技术领域。本发明提供一种胶体金的制备方法，其特征在于，将HAuCl4溶液加热至沸腾，随后加入柠檬酸三纳溶液继续煮沸，直至溶液由深褐色变为黑色最后变成酒红色，继续煮沸15～20min，得到稳定的胶体金溶液。本发明制备的胶体金抗体检测试纸条具备良好的稳定性、特异性和敏感性，并于ELISA方法相比检测结果基本相同，符合率为97.7％。
Description
技术领域
本发明涉及抗体检测技术领域，特别是涉及一种牛病毒性腹泻病毒抗体的检测试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
牛病毒性腹泻病(Bovine viral diarrhea，BVD-MD)又称牛粘膜病，是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的世界范围内牛群的传染，该病是引起牛呼吸系统、消化系统和生殖系统疾病相关的重要病原体，对全世界的养牛业造成持续的经济损失。BVDV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，由于BVDV感染普广泛，可持续性感染机体及产生免疫抑制，该病毒可以感染牛、羊和猪等多种家畜和野生动物。BVDV感染可能是无症状或有一些临床症状，如轻微的发烧、食欲缺乏、嗜睡，但在一些动物中也可以产生口腔溃疡和消化道感染，引起呼吸系统和生殖的影响以及免疫抑制，在一些情况下可能呈现出血性腹泻。患牛表现发热、白细胞减少、腹泻、流产、黏膜糜烂溃疡等急性感染症状及小牛先天持续性感染，该病毒还可通过胎盘传播，引发胚胎死亡、流产、免疫耐受、出生缺陷、新生犊牛弱。为此，国内外研究人员建立了诸多诊断和筛查牛群的方法如：PCR、ELISA、间接免疫荧光、LAMP、血清中和实验等。这些方法都有较高的的仪器设备和实验室技术要求，现场应用具有一定缺陷，胶体金技术有效的解决了现场应用的技术局限。
胶体金技术自20世纪末应用于检测领域，利用胶体金表面的负电电荷吸附带有正电物质的原理，把抗原或抗体与胶体金进行标记可在层析的作用下在硝酸纤维素膜中移动并与抗体抗原反应，进而使胶体金颗粒富集于标线处，呈现出清晰显色反应。胶体金试纸条检测的最大的优点就是能够简便、快速的对待测样品做出判断，无需复杂实验操作。为此，本实验将免疫胶体金免疫层析技术与牛病毒性腹泻诊断相结合，开发了一种快速诊断牛病毒性腹泻病毒抗体的胶体金诊断产品，填补了产品的空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛病毒性腹泻病毒抗体的检测试纸条及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种胶体金的制备方法，将HAuCl4溶液加热至沸腾，随后加入柠檬酸三纳溶液继续煮沸，直至溶液由深褐色变为黑色最后变成酒红色，继续煮沸15～20min，得到稳定的胶体金溶液。
优选的是，所述HAuCl4溶液为质量分数为0.01％；所述柠檬酸三纳溶液质量分数为1％；所述HAuCl4溶液与所述柠檬酸三纳溶液的体积比为100:1-2。
优选的是，所述胶体金的平均粒子直径27nm。
本发明还提供所述制备方法制备得到的胶体金。
一种所述胶体金标记的抗原，其特征在于，所述抗原为牛病毒性腹泻病毒全病毒抗原。
一种所述胶体金标记的抗体，其特征在于，所述抗体为一抗His-6C1。
本发明还提供一种检测牛病毒性腹泻病毒抗体的试纸条，所述试纸条包括底板和粘贴在所述底板上且依次搭接的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
其中，所述胶体金结合垫上含有权利要求4所述胶体金标记的牛病毒性腹泻病毒全病毒抗原和权利要求4所述胶体金标记的一抗His-6C1。
优选的是，所述胶体金标记的牛病毒性腹泻病毒全病毒抗原的标记量为200mg/mL；所述胶体金标记的一抗His-6C1的标记量为50μL；所述胶体金标记的牛病毒性腹泻病毒全病毒抗原与所述胶体金标记的一抗His-6C1的比例为1：1；所述胶体金结合垫的喷金范围为喷金量范围在30～35μL/cm。
优选的是，所述硝酸纤维素膜上包括质控线和检测线；所述质控线为用羊抗鼠IgG二抗进行划线，所述检测线为用牛病毒性腹泻病毒全病毒抗原进行划线；所述羊抗鼠IgG二抗浓度为100μg/mL；所述牛病毒性腹泻病毒全病毒抗原浓度为40mg/mL。
优选的是，所述牛病毒性腹泻病毒全病毒抗原的抗原效价为106.0TCID50。
本发明还提供一种检测牛病毒性腹泻病毒抗体的试剂盒，所述试剂盒包括所述的试纸条。
本发明还提供一种检测牛病毒性腹泻病毒抗体的方法，利用所述的试纸条或者所述的试剂盒，对待测牛血清样品进行检测。
本发明公开了以下技术效果：
本发明对柠檬酸和氯金酸的量做了系统的摸索，制备的胶体金抗体检测试纸条具备良好的稳定性、特异性和敏感性，并于ELISA方法相比检测结果基本相同，符合率为97.7％。可进行了大面积推广应用，也为动物疫病胶体金快速诊断制品的研发也提供了可靠的思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为胶体金溶液的制备；其中，A：胶体金溶液的眼观结果；B：胶体金溶液的动态粒度扫描结果；
图2为抗原最适标记量的确定；K2CO3添加量1：0μL；2：0.1μL；3：0.3μL；4：0.5μL；5：0.7μL；6：0.9μL；抗原添加量A：2μL；B：0μL；C：4μL；D：6μL；
图3为质控线(C)划线浓度的筛选；其中，1：二抗50μg/mL；2：二抗100μg/mL；3：二抗150μg/mL；4：二抗200μg/mL；
图4为特异性检测结果；其中，P：BVDV阳性高免血清；1：稀释液；2：健康胎牛血清；3：BCV阳性血清；4：IBRV阳性血清；5：BRSV阳性血清；6：BVDV阳性血清；
图5为敏感性检测结果；其中，N：阴性对照；1～10：BVDV阳性血清从1:2倍比稀释至1:512。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。
实施例1
1.材料与方法
1.1试剂
氯金酸、柠檬酸三钠、蔗糖、碳酸钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、盐酸等均为国药集团化学试剂有限公司的产品。DMEM培养基为Gibco公司的产品。胎牛血清购自全式金生物有限公司。Tris为索莱宝产品。一抗His-6C1、二抗羊抗鼠IgG购自杭州贤至生物科技有限公司。
1.2材料及设备
玻纤、聚酯膜、NC膜、底板、吸水垫等购自上海金标生物有限公司。动态粒度测试仪购自马尔文仪器有限公司。喷金划膜仪、辅料切割机、切条机、压卡机等购自上海金标生物有限公司。
1.3试验动物及病料
牛源高免血清由中国农业科学院特产研究所保存，牛血清样品采集于吉林省不同地区牛群。
1.4胶体金的制备
取1支氯化金溶解于100mL超纯水中，配制成0.01％的HAuCl4溶液并保存于棕色细口瓶中。根据所要烧制胶体金颗粒尺寸取不同量HAuCl4溶液于三角烧瓶中，使用电热炉加热至沸腾，然后迅速加入1.5mL 1％柠檬酸三纳溶液继续煮沸。搅拌沸腾的混合溶液，水溶液在2min～5min内变化迅速由深褐色变为黑色最后变成酒红色，继续煮沸15～20min得到稳定的胶体金溶液。待三角瓶内溶液自然冷却至室温后使用蒸馏水补充至初始体积并常温保存。抽取1mL胶体金溶液通过动态粒度测试仪对其进行品质鉴定。
对制备的胶体金进行色泽、沉淀、漂浮物、澄清度、粒径、吸光度评价。结果显示(见图1)胶体金呈酒红色，澄清、无沉淀和漂浮物，平均粒子直径27nm。
1.5全病毒抗原的制备
从液氮中取出MDBK细胞复苏并连续传2代，当细胞稳定生长且密度达到80％以上时换2％的马血清培养基的维持液。将牛病毒性腹泻病毒NM株毒种加入到维持液中，毒种和维持液混匀后放置5％ CO2、37℃培养箱中培养，连续观察72h并记录细胞病变情况，当细胞出现典型的病变(CPE)时，收获病毒液和细胞，三冻三融裂解细胞，梯度离心除去细胞碎片并测定制备全病毒抗原的效价，分装于冻存管保存在-80℃。
用血清中和法对所制备抗原效价进行测定，经测定，所制备的抗原中和效果良好，效价为106.0TCID50。
1.6抗原最适标记量和最佳PH的确定
取96孔板向每孔中分别加入300μL的胶体金，将纯化的牛病毒性腹泻病毒抗原(浓度校准1mg/mL)用0.1mol/L的Tris-HCl(pH＝7.5)逐级稀释后即含量分别为2、4、6、8、10、12、14mg，分别加入到胶体金中并混匀。混匀后室温静止1h观察结果。在筛选抗原标记量的基础上采用棋盘法对横向的孔加入1M的K2CO3(0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9)对体系的最适PH进行筛选。混匀后室温静止1h观察结果。
通过将棋盘法筛选后初步确定的BVDV抗原量依次分别去标记胶体金，然后分别加入BSA对胶体金进行封闭，试验结果显示，在抗原加入量200mg/mL时，胶体金颜色不在发生变化，表明200mg/mL体系中抗原的加入量是稳定胶体金的临界抗原加入量，为使其保持稳定，抗原最佳标记量选择200mg/mL。
将制备的抗原分别用Tris-HCl(PH7.5)稀释成不同浓度，再逐个加入到每孔胶体金中，通过体系反应可知抗原蛋白的最适标记量为30mg/mL，同时也在棋盘法的孔中发现，加入0.5μL/300μL的K2CO3体系中即在此pH条件下结合在胶体金颗粒表面的抗原蛋白最多(见图2)。
1.7金标抗原和金标抗体的制备
1.7.1金标抗原的制备。使用酸化处理的磁力搅拌器转子和安倍瓶做为搅拌容器并置于磁力搅拌器上，向瓶中加入6mL的胶体金溶液250r/min搅拌。向流动的胶体金中加入80μL的制备抗原和10μL的K2CO3。在磁力搅拌器上均匀搅拌30min，然后向该体系中加入10％的BSA 30μL继续再搅拌30min进行封闭。封闭结束将全部的标记胶体金转移到离心管中4℃10000r离心20min。最后将离心好的上清液小心弃去保留黑紫色流沙状的沉淀，然后使用等比例的复溶液迅速复溶沉淀即为制备好的胶体金标记即金标抗原。
1.7.2.金标抗体的制备。使用酸化处理的磁力搅拌器转子和安倍瓶做为搅拌容器并置于磁力搅拌器上，向瓶中加入6mL的胶体金溶液250r/min搅拌。向流动的胶体金中加入50μL的一抗His-6C1(1mg/ml)和10μL的K2CO3。在磁力搅拌器上均匀搅拌30min，然后向该体系中加入10％的BSA 30μL继续再搅拌30min进行封闭。封闭结束将全部的标记胶体金转移到离心管中4℃10000r离心20min。最后将离心好的上清液小心弃去保留黑紫色流沙状的沉淀，然后使用等比例的复溶液迅速复溶沉淀即为制备好的胶体金标记即金标抗体。
1.8抗体胶体金检测试纸条半成品的制备
1.8.1金标抗原包被量的确定：提前使用预处理液处理金标垫并保存于干燥箱，将反应复溶好的金标抗原(10、20、30、40、50、60μL/cm)通过喷金划膜一体机喷涂于胶体金结合垫上，干燥后备用。
按最适标记量制备的金标抗原以不同的喷金量喷涂于已提前处理干燥的胶体金结合垫上，根据其喷金后的扩散状态及显色情况，确定喷金量范围在30～35μL/cm时，金标抗原在结合垫上扩散均匀，特异性好且敏感性高。
1.8.2质控线(C线)抗体包被量的确定：取出一张干燥无划痕的NC反应膜，将标定好的羊抗鼠IgG二抗(浓度:1mg/mL)分别稀释4倍、6倍、10倍、20倍，分别划膜干燥后组装成试纸条并做好标记，阴阳性标准血清样品检测，根据试验结果选择质控线最佳抗体包被量。
用不同浓度的二抗(羊抗鼠IgG)划线NC时，验证C线显色情况，当确定一抗包被量为100μL/6mL时二抗浓度在50、100、150、200μg/mL按推荐喷涂量，都可显色。显色程度有浅到深，在100和150μg/mL浓度喷涂量时显色最佳，在考虑生产成本的情况下选择100μg/mL为质控线最佳喷膜浓度(见图3)。
1.8.3检测线(T线)抗原包被量的确定：取出一张干燥无划痕的NC反应膜，将纯化的牛病毒性腹泻病毒抗原分别稀释至10、20、30、40、50、60mg/mL，以1μL/cm的量标记于NC膜上，与初步确定好浓度的金标抗原组装制成试纸条，阴阳性标准血清样品进行检测，根据试验结果选择检测线最佳抗原包被量。
当牛病毒性腹泻病毒抗原分别稀释至10、20、30、40、50、60mg/mL，以1μL/cm的量喷划于NC膜上，发现喷划浓度越高所呈现的T线就更明显清晰，通过生产成本考虑选择40mg/mL进行划线，既保证了层析显色也节约了原料，同时可以达到可读判的要求。
1.9抗体胶体金检测试纸条成品的制备
1.9.1试纸条的组装
(1)NC膜组装：取出PVC底板，撕去NC膜组装区域的覆盖纸张，将NC膜紧实的贴合于低板上，过程轻缓保护NC膜表面的不受损伤。
(2)金标结合垫组装：撕去PVC底板金标垫结合部位的双面胶覆盖纸，然后将已处理的5mm宽的金标结合垫平行贴于不干胶上，其上端覆盖住NC膜的下端交合1～2mm。
(3)样品垫组装：揭开PVC底板样品垫部位的双面胶覆盖纸，取出15mm宽的样品垫，样品垫的下端对齐大卡的下端，上端覆盖住金标结合垫的下端交合1～2mm，进行粘贴并压实。
(4)吸水纸组装：揭开PVC底板上端吸水纸部分的双面胶盖纸，取出切割好的20mm宽的吸水纸，吸水纸的一端对齐底板的上端进行粘贴，另一端粘贴覆盖于NC膜上交合1～2mm，完毕后将吸水纸压实。
(5)压板及切条：将切割机的卡槽部位调整为与PVC板子相同宽度，保证板子可顺利通过辊轴并切割。切割机参数设置为3.5mm宽同时切割速度为200条/min，即可调整为自动切割。将切割的试纸条按切割的同一卡板时间顺序、同一方向进行摆放，评判试纸条的切割质量。评判注意于切割后NC膜完好程度、尺寸大小、边缘齐度等，对不符合要求的试纸条集中起来做统一报废处理，使得进入下一道工序的试纸条的良品率为100％，最终将切割好的试纸条放入铝箔袋中备用并做好标记。
1.9.2样品稀释液的制备：稀释液为0.02mol/L的PBS溶液(pH＝7.5)。将配置好的PBS溶液高压灭菌后分装于无菌2mL冻存管中，每管300μL，短期置于常温，长期2～8℃保存。
1.10试纸条测试方法与结果判定
室温下使用样品稀释液对待检血清按照二倍比稀释，取100μL稀释的样品滴在样品垫上5～10min内观察结果。若试纸条上质控线(C线)和检测线(T线)均呈红线则为阳性；质控线(C线)显色而检测线(T线)不显色则为阴性；当质控线(C线)不显色判定为试纸条失效。
1.11试纸条成品性能测试
对组装完成的试纸条成品分别进行物理性状检验、稀释液无菌检验、特异性检验、敏感性检验、稳定性检验以及重复性检验。
(1)将试纸条分别在室温(15～25℃)、4℃和-20℃条件下保存，在第0、1、2、3、6、9、12个月对试纸条进行稳定性试验。随机抽取已分装无菌保存的稀释液，在超净工作台中抽取500μL加入无抗SOC培养基中，在37℃下摇荡培养48h并观察记录。
(2)用该试纸条检测IBRV、BRSV、BCV的阳性血清及健康胎牛血清，用BVDV高免血清作阳性对照，以此检测其特异性。
(3)将BVDV阳性血清(中和效价1:1024)用样品稀释液从1:1开始倍比稀释，按照1.10步骤检测，5～10min内观察结果，由此鉴定试纸条的敏感性。
(4)对随机抽取5份BVDV阳性血清样品和阴性样品，用同一批次的试纸条进行批内重复试验，每份血清设置3个重复；以3个不同批次成品试纸条，进行批间重复试验，设置3批重复。计算批间和批内变异系数，评估试纸条成品的可靠性。
试纸条成品物理性状检验结果：生产出的试纸条稳定性是实际应用的一个重要因素，将试纸条分别在室温(18～25℃)、4℃和-20℃条件下保存，在第0、1、2、3、6、9、12月对试纸条进行稳定性试验，结果，试纸条在室温干燥可稳定保存8个月，4℃可稳定保存6个月，-20℃保存效果不佳。
稀释液无菌检验结果：对随机抽取分装保存的稀释液检验，在超净工作台中抽取500μL稀释液加入无抗SOC培养基中，在37℃下摇荡培养48h并观察发现培养基无浑浊，证明稀释液配制和保存得当可用。
特异性检验结果：用稀释液、BVDV阳性高免血清、健康胎牛血清、BCV阳性血清、IBRV阳性血清、BRSV阳性血清、BVDV阳性病料血清各3份对试纸条进行特异性检测，结果(见图4)只有BVDV阳性高免血清和病料血清显示阳性反应，而与其他四种血清和空白稀释液不发生出线反应。
敏感性检验结果：使用效价明确的BVDV标准阳性血清(中和效价1:1024)与稀释液进行倍比稀释后，实验试纸条在标准血清从1:1到1:64稀释度检测时，质控线(C线)和检测线(T线)均显示红色条带，结果判定为阳性(见图5)，1:32稀释度以后的检测，质控线(C线)显示红色条带，检测线(T线)不显示条带，结果判定为试纸条使用正常，未能判定出阳性。
重复性检验结果：用BVDV高免阳性血清、BVDV阴性血清各5份对试纸条进行重复性检测，每个血清样品重复3次，结果只有BVDV阳性血清显示出线反应，每个血清的三次检测结果重复率100％。
1.12符合性试验
对吉林省多个地区采集的635份肉牛血清样品，用本实验制备的BVDV胶体金抗体检测试纸条与瑞典IDEXX公司检测BVDV抗体的ELISA试剂盒同时检测，结果，IDEXX公司试剂盒检出血清397份阳性、230份阴性血清，8份样品疑似；本研究制备的试纸条检出387份阳性血清和248份阴性血清。试纸条与IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果相同的血清共计387份，因此，两种检测法检测符合率为97.7％，以上结果说明胶体金试纸条的准确性良好，可广泛适用于牛群的感染情况筛查。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种胶体金的制备方法，其特征在于，将HAuCl4溶液加热至沸腾，随后加入柠檬酸三纳溶液继续煮沸，直至溶液由深褐色变为黑色最后变成酒红色，继续煮沸15～20min，得到稳定的胶体金溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述HAuCl4溶液为质量分数为0.01％；所述柠檬酸三纳溶液质量分数为1％；所述HAuCl4溶液与所述柠檬酸三纳溶液的体积比为100:1-2；所述胶体金的平均粒子直径27nm。
3.如权利要求1-2任一项所述制备方法制备得到的胶体金。
4.一种权利要求3所述胶体金标记的抗原，其特征在于，所述抗原为牛病毒性腹泻病毒全病毒抗原。
5.一种权利要求3所述胶体金标记的抗体，其特征在于，所述抗体为一抗His-6C1。
6.一种检测牛病毒性腹泻病毒抗体的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板和粘贴在所述底板上且依次搭接的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
其中，所述胶体金结合垫上含有权利要求4所述胶体金标记的抗原和权利要求5所述胶体金标记的抗体。
7.根据权利要求6所述的试纸条，其特征在于，所述胶体金标记的抗原的标记量为200mg/mL；所述胶体金标记的抗体的标记量为50μL；所述胶体金标记的抗原与所述胶体金标记的抗体的比例为1:1；所述胶体金结合垫的喷金范围为喷金量范围在30～35μL/cm。
8.根据权利要求6所述的试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上包括质控线和检测线；所述质控线为用羊抗鼠IgG二抗进行划线，所述检测线为用牛病毒性腹泻病毒全病毒抗原进行划线；所述羊抗鼠IgG二抗浓度为100μg/mL；所述牛病毒性腹泻病毒全病毒抗原浓度为40mg/mL；所述牛病毒性腹泻病毒全病毒抗原的抗原效价为106.0TCID50。
9.一种检测牛病毒性腹泻病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求6-8任一项所述的试纸条。
10.一种检测牛病毒性腹泻病毒抗体的方法，其特征在于，利用权利要求6-8任一项所述的试纸条或者权利要求9所述的试剂盒，对待测牛血清样品进行检测。
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