CN116948026A - 疟疾病毒结合蛋白及其应用、病毒检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体的说是疟疾病毒结合蛋白及其应用、病毒检测试剂盒。本发明提供的疟疾病毒结合蛋白特异性好、生物活性高、稳定性强、与疟疾病毒亲和力高，能够用于制备检测疟疾病毒的产品。本发明提供的病毒检测试剂盒，具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场快速检测和经济实用等优点，能够在病毒大流行时进行快速筛选，快速、精准、安全的对大量的包括疑似病例、处于潜伏期无症状感染病例以及风险更高的无症状病毒携带者人群进行及时检测，对间接拟解决疟疾核酸检测能力不足、减少潜在传染风险、防止疫情蔓延意义重大。

Description

疟疾病毒结合蛋白及其应用、病毒检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说是疟疾病毒结合蛋白及其应用、病毒检测试剂盒。
背景技术
传染病早期的正确诊断是及时隔离和采取有效治疗的基础，可以有效防止其扩散。传染病的检查包括病源微生物的分离培养、病源微生物抗原的检查、病源微生物的核酸检查。其中病源微生物、病毒的分离培养是传染病的重要检测方法，分离培养的得到传染病的致病菌或者病毒的变异情况及传染病趋势的预测意义重大；分子生物学技术的发展使得核酸检测得到普及，主要是依据每一个生物都有特定的核酸序列以及DNA序列的特点，只要检测出人体内有特定病毒或者病原微生物的基因序列，证明被病原微生物或者病毒感染，根据检测到信号的强弱确定被感染的程度，具有灵敏度高、特异性好得优点，但需要专业的操作人员进行。病原微生物抗原检查是血清学的重要检测手段，对实验室无特殊要求，具有早筛查、早诊断的优势，适合基层社区大规模筛查。
疟疾是疟原虫感染所致的地方性传染病，主要流行于热带和亚热带地区，典型的临床表现为周期性的寒战、发热、大汗等症状，可伴肝脾肿大和贫血等体征。恶性疟发热不规则，病死率较高，间日疟和卵形疟常有复发。感染疟疾的实验室检查包括一般检查和病原学检查，病原学检查主要是通过病毒培养和核酸检测进行，病毒培养需要在三级及以上生物安全实验室进行，核酸检测主要通过对皮疹、疱液、痂皮、口咽鼻咽分泌物进行核算扩增的方法进行鉴定和检测。
上述方法存在检测步骤繁琐、检测周期长的问题，不利于病毒大流行时进行快速筛选，不能快速、精准、安全的对大量的包括疑似病例、处于潜伏期无症状感染病例以及风险更高的无症状病毒携带者人群进行及时检测。解决这一问题，对间接拟解决疟疾核酸检测能力不足、减少潜在传染风险、防止疫情蔓延意义重大。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于，提供了疟疾病毒结合蛋白及其应用、病毒检测试剂盒。
疟疾病毒结合蛋白，选自蛋白a、蛋白b；
所述蛋白a包括氨基酸序列依次如SEQ ID NO.1～3所示的重链互补决定区CDR1-VH、CDR2-VH、CDR3-VH，以及氨基酸序列依次如SEQ ID NO.4～6所示的轻链互补决定区CDR1-VL、CDR2-VL、CDR3-VL；
所述蛋白b包括氨基酸序列依次如SEQ ID NO.7～9所示的重链互补决定区CDR1-VH、CDR2-VH、CDR3-VH，以及氨基酸序列依次如SEQ ID NO.10～12所示的轻链互补决定区CDR1-VL、CDR2-VL、CDR3-VL。
进一步的，所述疟疾病毒结合蛋白为鼠源；
所述蛋白a包括氨基酸序列依次如SEQ ID NO.13～14所示的重链可变区和轻链可变区；
所述蛋白b包括氨基酸序列依次如SEQ ID NO.15～16所示的重链可变区和轻链可变区。
疟疾病毒结合蛋白在制备疟疾病毒检测产品中的应用。
疟疾病毒检测试剂盒，包括壳体、疟疾病毒检测试纸条和检测试管，所述壳体包括可拆卸连接的上盖和下盖，所述下盖内设置有用于放置疟疾病毒检测试纸条的试纸条安装区，所述上盖上开设有观察窗和加样孔，所述疟疾病毒检测试纸条包括底板，所述底板的上部设置有检测垫，所述检测垫的上部两侧分别设置有标记垫和吸样垫，所述标记垫上部设置有上样垫，所述检测垫位于的观察窗的下方，检测垫上设置有质控线和检测线，所述质控线靠近吸样垫设置，所述上样垫位于加样孔的下方，所述标记垫含有所述的疟疾病毒结合蛋白，疟疾病毒结合蛋白标记有标记物，所述检测试管内设置有样品提取液。
进一步的，所述标记物包括胶体金、彩色微球、时间分辨荧光微球或者量子点微球。
进一步的，所述胶体金的颗粒大小为40～100nm，彩色微球、时间分辨荧光微球、量子点微球的颗粒大小均为100～300nm。
进一步的，所述疟疾病毒结合蛋与胶体金的质量比为(0.04～0.32)：1；疟疾病毒结合蛋与彩色微球或时间分辨荧光微球或量子点微球的质量比均为(0.1～0.4)：1。
进一步的，所述检测线包被有1～2mg/mL疟疾病毒结合蛋白，所述质控线包被有1～2mg/mL的羊源IgG多克隆抗体稀释液，所述羊源IgG多克隆抗体稀释液为包含海藻糖的15～25mM的PB缓冲液，每100mL羊源IgG多克隆抗体稀释液包含0.1～0.9g的海藻糖。
进一步的，所述标记垫上的疟疾病毒结合蛋白与检测线上的疟疾病毒结合蛋白互不相同。
进一步的，所述样品提取液包括血液样品提取液或唾液样品提取液或感染部位脓疱液样品提取液；
所述血液样品提取液为45～55mM PB缓冲液，每100mL45～55mM PB缓冲液包含0.4g～0.6gTritonx-100、0.1～0.3g gProclin300、0.4g～0.6g酪蛋白钠、0.8g～1gNaCl；
唾液样品提取液和感染部位脓疱液样品提取液为90～110mM的Tris缓冲液，每100mL 90～110mM的Tris缓冲液包含0.9gNaCl、0.4g～0.6gTritonx-100、0.4g～0.6gTween20，提取液pH为8.5。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的疟疾病毒结合蛋白特异性好、生物活性高、稳定性强、与疟疾病毒亲和力高，能够用于制备检测疟疾病毒的产品。本发明提供的病毒检测试剂盒，具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场快速检测和经济实用等优点，能够在病毒大流行时进行快速筛选，快速、精准、安全的对大量的包括疑似病例、处于潜伏期无症状感染病例以及风险更高的无症状病毒携带者人群进行及时检测，对间接拟解决疟疾核酸检测能力不足、减少潜在传染风险、防止疫情蔓延意义重大。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
图1为本发明的疟疾病毒检测试剂盒的壳体的立体结构示意图；
图2为本发明的疟疾病毒检测试剂盒的上盖的结构示意图；
图3为本发明的疟疾病毒检测试剂盒的下盖的结构示意图；
图4为本发明的疟疾病毒检测试剂盒的疟疾病毒检测试纸条的结构剖视图；
图5为本发明的疟疾病毒检测试剂盒的检测试管的结构剖视图；
图中：1壳体、11上盖、111观察窗、112加样孔、12下盖、2疟疾病毒检测试纸条、21底板、22检测垫、23吸样垫、24标记垫、25上样垫、26质控线、27检测线、3检测试管。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的构架区构成。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐CDR的作用，所述CDR主要负责与抗原的结合。
“构架”或“FR”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为CDR的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
在本发明中，CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH分别指重链可变区的三个高变区，相应的，CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL分别指轻链可变区的三个高变区。
第一方面，本发明提供了疟疾病毒结合蛋白，选自蛋白a、蛋白b；
所述蛋白a包括氨基酸序列依次如SEQ ID NO.1～3所示的重链互补决定区CDR1-VH、CDR2-VH、CDR3-VH，以及氨基酸序列依次如SEQ ID NO.4～6所示的轻链互补决定区CDR1-VL、CDR2-VL、CDR3-VL；
所述蛋白b包括氨基酸序列依次如SEQ ID NO.7～9所示的重链互补决定区CDR1-VH、CDR2-VH、CDR3-VH，以及氨基酸序列依次如SEQ ID NO.10～12所示的轻链互补决定区CDR1-VL、CDR2-VL、CDR3-VL。
SEQ ID NO.1～12所示的氨基酸序列如表1所示。
表1
本发明提供的疟疾病毒结合蛋白特异性好、生物活性高、稳定性强、与疟疾病毒亲和力高，能够用于制备检测疟疾病毒的产品。
在一些优选的实施方式中，所述蛋白a包括氨基酸序列依次如SEQ ID NO.13～14所示的重链可变区和轻链可变区；
所述蛋白b包括氨基酸序列依次如SEQ ID NO.15～16所示的重链可变区和轻链可变区；
优选地，所述疟疾病毒结合蛋白为鼠源。
SEQ ID NO.13～14所示的氨基酸序列如表2所示。
表2
第二方面，本发明提供了所述的疟疾病毒结合蛋白在制备疟疾病毒检测产品中的应用。
第三方面，本发明提供了一种疟疾病毒检测试纸条，包括壳体1、疟疾病毒检测试纸条2和检测试管3，所述壳体1包括可拆卸连接的上盖11和下盖12，所述下盖12内设置有用于放置疟疾病毒检测试纸条2的试纸条安装区121，所述上盖11上开设有观察窗111和加样孔112，所述疟疾病毒检测试纸条2包括底板21，所述底板21的上部设置有检测垫22，所述检测垫22的上部两侧分别设置有标记垫24和吸样垫23，所述标记垫24上部设置有上样垫25，所述检测垫22位于的观察窗111的下方，检测垫22上设置有质控线26和检测线27，所述质控线26靠近吸样垫23设置，所述上样垫25位于加样孔112的下方，所述标记垫24含有疟疾病毒结合蛋白，疟疾病毒结合蛋白标记有标记物，标记物能够通过检测识别标记物所在位置或者浓度，所述检测试管3内设置有样品提取液。
本发明提供的疟疾病毒检测试纸条，具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场快速检测和经济实用等优点，能够在病毒大流行时进行快速筛选，快速、精准、安全的对大量的包括疑似病例、处于潜伏期无症状感染病例以及风险更高的无症状病毒携带者人群进行及时检测，对间接拟解决疟疾核酸检测能力不足、减少潜在传染风险、防止疫情蔓延意义重大。
优选的，所述标记物包括胶体金、彩色微球、时间分辨荧光微球或者量子点微球。
优选地，胶体金的颗粒大小例如可以为，但不限于40nm、60nm、80nm或100nm；
优选地，彩色微球、时间分辨荧光微球和量子点微球的颗粒大小例如可以为，但不限于100nm、150nm、200nm、250nm或300nm；
优选地，疟疾病毒结合蛋耦联胶体金的质量比为：(0.04～0.32)：1；
疟疾病毒结合蛋与彩色微球、时间分辨荧光微球或量子点微球的质量比为：(0.1～0.4)：1。
通过对标记物颗粒大小及用量的调整，使得检测试纸条的灵敏度更高。
在一些优选的实施方式中，所述检测垫22上设置有检测线27和质控线26，所述上盖(11)外部设置有与检测线27和质控线26相对应的字母T和C。
检测线27包被有1～2mg/mL的所述的疟疾病毒结合蛋白；
质控线26包被有1～2mg/mL的羊源IgG多克隆抗体；
优选地，疟疾病毒结合蛋白和羊源IgG多克隆抗体的稀释液为包含海藻糖的15～25mM的PB缓冲液，每100mL的稀释液包含0.1～0.9g的海藻糖。
优选的，所述标记垫24上的疟疾病毒结合蛋白与检测垫22上的疟疾病毒结合蛋白互不相同。
例如，标记垫24上的蛋白为疟疾结合蛋白为a，其中a为疟疾病毒单克隆抗体一，而检测垫22上的蛋白依次为疟疾结合蛋白b，其中b为疟疾病毒单克隆抗体二。
本发明所提供的疟疾病毒检测试纸条2，是根据抗原抗体反应的原理，利用胶体金、彩色微球、时间分辨荧光微球、量子点标记疟疾病毒单克隆抗体后，将标记物固化在玻璃纤维素膜上。在检测垫22上包被疟疾病毒的另一个单克隆抗体，基于抗原抗体反应的原理，在检测时间内可通过肉眼或者配套仪器进行检测的。如果样本中存在疟疾病毒则形成双抗体夹心的结构，形成肉眼可见的条带或者仪器中有光强信号，如果样本中没有疟疾病毒，则在检测垫22上不出现条带或者仪器中没有光强信号。根据信号的有无进行阴、阳性判断或者根据光强信号强度进行病毒载量的预判。
采用本发明提供的疟疾病毒检测试纸条2进行检测，整个过程15-20min便可得到的检测结果，快速高效，有助于医务人员及时获得检测结果，根据结果进行综合判断、及时处置，避免恐慌、减少疫情传播。
第四方面，优选的，所述疟疾病毒检测试剂盒的检测样品包括但不限于血液、唾液、感染部位的脓疱液或结痂；样品可以是收集于试管中的样品，也可以是附着于拭子上的样品。
优选地，所述样品提取液包括血液样品提取液或唾液样品提取液或感染部位脓疱液样品提取液；上述样品提取液可以分别处理唾液、血液、皮肤组织感染部位的囊泡、脓疱液拭子等样品，然后再采用本发明的疟疾病毒检测试剂盒进行检测。
所述血液样品提取液为45～55mM PB缓冲液，每100mL45～55mM PB缓冲液包含0.4g～0.6gTritonx-100、0.1～0.3gProclin300、0.4g～0.6g酪蛋白钠、0.8g～1g NaCl；
唾液样品提取液和感染部位脓疱液样品提取液为90～110mM的Tris缓冲液，每100mL 90～110mM的Tris缓冲液包含0.9gNaCl、0.4g～0.6gTritonx-100、0.4g～0.6gTween20，提取液pH为8.5。
以血清样本为例，血清样本稀释液及加样方式如下：
稀释液的制备：
以100mL为例制备疟疾病毒检测试剂盒血样样本的稀释液：
(1)用天平称取1.79g Na2HPO4、0.78g NaH2PO4、0.5g酪蛋白钠、0.9g NaCl、溶于水中；
(2)用EP管分别称取0.5g Tritonx-100、0.1g Proclin300，用步骤1中的溶液反复清洗EP管，使之完全溶于水中；
(3)用4M NaOH或者HCl调整-pH值至8.0后补齐水至100mL，用100mL的容量瓶进行定容；
试剂盒测试样本加样：
(1)测试血液样本时(包含血浆、血清或者全血)在图1加样孔112中滴加1滴样本(约40-50μL)后，迅速加入上述配制的血样样本稀释液1滴(约40-50μL)进行反应；
(2)15min后根据不同的方法学对结果进行分析。
以唾液、囊泡、脓疱拭子样本为例，唾液、囊泡、脓疱拭子提取液和加样方式如下：
提取液的制备：
以100mL为例制备疟疾病毒检测试剂盒拭子提取液：
(1)称取12.1gTris、8.7gNaCl溶于80mL水中；
(2)用EP管分别称取0.5g Tritonx-100、0.5g吐温20，用步骤1中的溶液反复清洗EP管，使之完全溶于水中；
(3)用4M NaOH或者HCl调整-pH值至8.5后补齐水至100mL，用100mL的容量瓶进行定容；
唾液、囊泡、脓疱拭子样本处理和加样：
(1)样采样拭子进行唾液、囊泡、脓疱拭子样本取样；
(2)将取样后的拭子在提取管中浸入搅动6-8下或者将取样拭子在提取液中浸润1min；
(3)盖上提取管的盖子后在加样孔中滴加2-3滴提取样本混合液(约100μL)；
(4)15min后根据不同的方法学对检测结果进行分析。
以上述提取液对相应样品处理后的检测效果好。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
需要说明的是，如无特殊说明以下实施例中，疟疾病毒结合蛋白和羊源IgG多克隆抗体的稀释液为包含海藻糖的20mM的PB缓冲液，每100mL的稀释液包含0.5g的海藻糖；
血液样品的提取液采用50mM PB缓冲液配制，每100mLPB缓冲液包含：0.5gTritonx-100、0.2g Proclin300、0.5g酪蛋白钠、0.9gNaCl；
唾液样品和感染部位的脓疱液样品的提取液采用100mM的Tris缓冲液配制，每100mLTris缓冲液包含0.9gNaCl、0.5gTritonx-100、0.5gTween 20，提取液pH为8.5。
实施例1
疟疾病毒结合蛋白包括：疟疾病毒单克隆抗体一、疟疾病毒单克隆抗体二，上述结合蛋白可变区序列如表2所示。
按常规方法制备12％SDS-PAGE胶，将上述抗体以5μg上样，用蛋白分子量标准作为参照进行电泳，结果显示6个抗疟疾病毒的单克隆抗体显示出25KD和55KD左右的两条特征性条带，分别为IgG的轻链和重链，特征性条带经扫描后分析抗体含量均在90％以上。
图4中，1：Anti-1；2：Anti-2；其中，Anti-1为抗疟疾病毒单克隆抗体一；Anti-2为抗疟疾病毒单克隆抗体二。
以下实施例中所用的抗体均与实施例1相同。
实施例2
如图1-图5所示，疟疾病毒检测试剂盒，包括壳体1、疟疾病毒检测试纸条2和检测试管3，所述壳体1包括可拆卸连接的上盖11和下盖12，所述下盖12内设置有用于放置疟疾病毒检测试纸条2的试纸条安装区121，所述上盖11上开设有观察窗111和加样孔112，所述疟疾病毒检测试纸条2包括底板21，所述底板21的上部设置有检测垫22，所述检测垫22的上部两侧分别设置有标记垫24和吸样垫23，所述标记垫24上部设置有上样垫25，所述检测垫22位于的观察窗111的下方，检测垫22上设置有质控线26和检测线27，所述质控线26靠近吸样垫23设置，所述上样垫25位于加样孔112的下方，所述标记垫24含有所述的疟疾病毒结合蛋白，疟疾病毒结合蛋白标记有标记物，所述检测试管3内设置有样品提取液。
实施例3
胶体金标记抗体制备疟疾病毒检测试剂盒。
1主要材料
1.1抗体：疟疾病毒结合蛋白为鼠源单克隆抗体，用标记垫24标记和检测线27包被；羊源IgG多克隆抗体用于质控线26包被；
1.2检测垫22采用NC膜；
1.3底板21采用PVC板；
1.4重组抗原的获取：根据数据库NCBI公开的疟疾病毒的数据合成蛋白重组抗原。
2方法
2.1胶体金标记垫24制备：
胶体金标记垫24制备步骤如下：
(1)取1mL粒径为40nm胶体金溶液，用0.2M K2CO3调pH值到8.5；
(2)加入25μg抗疟疾病毒单克隆抗体一，抗体与胶体金颗粒的质量比为：0.1：1，旋转摇床调整到一定转速，室温旋转标记1.5h后加入封闭液20μL；
(3)12000rpm离心15min后弃上清；
(4)加入100μL胶体金复溶液；
(5)上述浓缩液按照1：7比例稀释后喷金后放置在37℃的干燥箱中干燥2h备用；
2.2检测垫22包被：
用含0.5％海藻糖的0.02M PB分别将抗疟疾病毒单克隆抗体二稀释至1.5mg/mL、羊源IgG多克隆抗体稀释到2mg/mL；然后用喷膜仪在检测垫22上进行分别划线检测线27和质控线26，包被完成后将检测垫22在温度37℃烘箱干燥24h备用。
2.3试剂盒的组装：
在干燥室内将已包被的检测垫22放置在底板21的中部粘贴，在检测垫22的检测线27一侧搭接标记垫24(搭标记垫24的1/3)粘贴，在标记垫24另一侧搭接粘贴上样垫25(搭标记垫24的1/5)；在检测垫22的的质控线26一侧搭接吸样垫23(搭吸样垫23的1/10)组装后疟疾病毒检测试纸条2切割成宽度4±0.4mm，装入壳体1内。
2.4检测：
步骤1、将疟疾病毒检测试剂盒和待测样品取出，平衡至室温；
步骤2、打开密封的铝箔袋，将疟疾病毒检测试剂盒取出平放在桌面上；
步骤3、用移液器加在加样孔中加入50μL血清后迅速加入50μL样本稀释液或者将取样拭子插入提取管反复搅动6-7次后取出拭子，将提取管盖子盖紧后滴样3滴；
步骤4、计时器计时，15min判读结果；注意如果加样后，样本1min未侧向层析或者渗滤，可能是由于样本太粘稠，需要对样本用生理盐水进行预处理。
3结果
在侧向层析的作用下，当样本中有疟疾病毒时，检测线27会显色，同时质控线26显色；当样本中没有疟疾病毒时，检测线27不显色，质控线26显色；上样后，质控线26不显色，无论检测线27显不显色，均判定结果无效。
实施例4
时间分辨荧光微球标记抗体制备疟疾病毒检测试剂盒。
1试剂盒制备操作过程:
时间分辨荧光微球表面标记应用本发明方法制备得到的抗疟疾病毒单克隆抗体一，具体实施例如下：
时间分辨荧光微球抗体标记：1mL 1％羧基时间分辨荧光微球，加入9mL MES缓冲液，再加入25μL EDC溶液(10mg/mL)和25μL NHS溶液(10mg/mL)，室温震荡反应30min，离心收集沉淀。加入HEPES复溶液，超声分散均匀后加入1mL1mg/mL抗疟疾病毒单克隆抗体一，室温震荡反应120min，离心收集沉淀。再加入1mL封闭液，室温震荡反应120min。离心收集微球沉淀，用复溶液复溶。
标记垫24制备：标记后的时间分辨荧光微球用微球复溶液稀释，使用喷金划膜仪喷涂荧光垫，喷涂3μL/cm，喷涂间距6mm。喷涂结束后放入37℃低湿度(<30％)烘干2h。
检测垫22上设置有质控线26和检测线27，检测线27使用浓度为1.5mg/mL的抗疟疾病毒单克隆抗体二，质控线26线使用浓度为1mg/mL的羊源IgG多克隆抗体1μL/cm划线，结束后放入37℃低湿度(<30％)烘干24h。
吸样垫23处理：吸样垫23处理液由缓冲盐、缓释剂、助溶剂、封闭剂等组成。具体配方为20mM Tris缓冲液，每100mLTris缓冲液含1gBSA、0.5g吐温20、2g蔗糖。按照每20cm2使用1mL样本处理液处理，处理均匀后放入37℃低湿度(<30％)烘干2h。
疟疾病毒检测试纸条2组装：底板21上设置有检测垫22、吸样垫23、标记垫24、上样垫25，吸样垫23、标记垫24垫各压检测垫22为1～2mm，上样垫25垫压标记垫24为1～2mm。组装后疟疾病毒检测试纸条2切割成宽度4±0.4mm，装入壳体1内。
测试样本制备：合成蛋白重组抗原进行梯度稀释后进行测试。
2疟疾病毒检测试剂盒检测过程
将疟疾病毒检测试纸条2置于干净平坦的台面上，吸取90～100μL处理后的样本滴加于疟疾病毒检测试纸条2的上样垫25中，同时设置PBS对照组。
导入试纸条标准曲线，15min后，使用荧光免疫分析仪扫描检测区得到荧光信号，检测后会显示疟疾病毒抗原对应的浓度值，测定结果如下表3和表4所示。
表3稀释液样本测试结果
表4阳性重组抗原测试结果
实施例5彩色微球标记抗体制备疟疾病毒检测试剂盒
应用3对疟疾病毒单克隆抗体制备疾病毒检测试纸条2，疾病毒检测试纸条2在标记垫24上包被彩色微球标记的抗疟疾病毒单克隆抗体一，检测线27包被抗疟疾病毒单克隆抗体二，利用双抗体夹心法定性检测样本中的疟疾病毒抗原。
1疾病毒检测试纸条2的制备：
1.1彩色微球标记抗体
(1)将100nm粒径的彩色微球用0.1mol/L K2CO3将pH调制8.0；
(2)取1mL上述PH调整好的溶液中加入抗疟疾病毒单克隆抗体一30μg，抗体与彩色微球的质量比：0.3：1，室温反应1h后离心弃上清；取1mL上述pH调整好的溶液中加入鸡IgY5μg，抗体与彩色微球的质量比为0.05：1，室温反应1h后离心弃上清；
(3)加入20％BSA 1mL封闭2h后离心弃上清；
(4)将上述微球用100μL pH8.0的复溶液复溶后，两种微球按照5：1混合，将混合物按15％的比例用复溶液稀释；
1.2标记垫24制备
标记后的彩色微球抗体复合物的稀释液，使用喷金划膜仪喷涂标记垫，喷涂7.5μL/cm，喷涂间距6mm。喷涂结束后放入37℃低湿度(<30％)烘干2h。
1.3上样垫25制备
上样垫25处理液由缓冲盐、缓释剂、助溶剂、封闭剂等组成。具体配方为20mMTris、1％ BSA、0.5％吐温20、2％蔗糖。按照每20cm使用1mL样本处理液处理。处理均匀后放入37℃低湿度(<30％)烘干2h。
1.4质控线26和检测线27的包被
检测线27使用浓度为1.5mg/mL的抗疟疾病毒单克隆抗体二，质控线26使用浓度为2mg/mL的羊抗鸡IgY抗体，1μL/cm划线，结束后放入37℃低湿度(<30％)烘干24h。
1.5疾病毒检测试纸条2组装
底板21上设置有检测垫22、吸样垫23、标记垫24、上样垫25，吸样垫23和标记垫24各压检测垫221～2mm，上样垫25压标记垫24为1～2mm。组装后疾病毒检测试纸条2切割成宽度4±0.4mm，装壳体1，壳体1和干燥剂一同放入铝箔袋塑，贴签装盒即可得到成品试剂盒。
1.6测试样本制备：合成蛋白重组抗原进行梯度稀释后用于测试。
2检测
将疟疾病毒检测试纸条2置于干净平坦的台面上，吸取90～100μL配制的重组抗原的样本滴加于加样孔112，并设置PBS对照组。10min后观察观察窗111，检测线27会显色，同时质控线26显色，则为阳性；检测线27不显色，质控线26显色，则为阴性。检测结果如下：结果显示三对单克隆抗体组装的试纸条测试抗原符合率均为100％；
表5
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.疟疾病毒结合蛋白，其特征在于：选自蛋白a、蛋白b；
所述蛋白a包括氨基酸序列依次如SEQ ID NO.1~3所示的重链互补决定区CDR1-VH、CDR2-VH、CDR3-VH，以及氨基酸序列依次如SEQ ID NO.4~6所示的轻链互补决定区CDR1-VL、CDR2-VL、CDR3-VL；
所述蛋白b包括氨基酸序列依次如SEQ ID NO.7~9所示的重链互补决定区CDR1-VH、CDR2-VH、CDR3-VH，以及氨基酸序列依次如SEQ ID NO.10~12所示的轻链互补决定区CDR1-VL、CDR2-VL、CDR3-VL。
2.根据权利要求1所述的疟疾病毒结合蛋白，其特征在于：所述疟疾病毒结合蛋白为鼠源；
所述蛋白a包括氨基酸序列依次如SEQ ID NO.13~14所示的重链可变区和轻链可变区；
所述蛋白b包括氨基酸序列依次如SEQ ID NO.15~16所示的重链可变区和轻链可变区。
3.根据权利要求1或2所述的疟疾病毒结合蛋白在制备疟疾病毒检测产品中的应用。
4.疟疾病毒检测试剂盒，其特征在于：包括壳体（1）、疟疾病毒检测试纸条（2）和检测试管（3），所述壳体（1）包括可拆卸连接的上盖（11）和下盖（12），所述下盖（12）内设置有用于放置疟疾病毒检测试纸条（2）的试纸条安装区（121），所述上盖（11）上开设有观察窗（111）和加样孔（112），所述疟疾病毒检测试纸条（2）包括底板（21），所述底板（21）的上部设置有检测垫（22），所述检测垫（22）的上部两侧分别设置有标记垫（24）和吸样垫（23），所述标记垫（24）上部设置有上样垫（25），所述检测垫（22）位于的观察窗（111）的下方，检测垫（22）上设置有质控线（26）和检测线（27），所述质控线（26）靠近吸样垫（23）设置，所述上样垫（25）位于加样孔（112）的下方，所述标记垫（24）含有所述的疟疾病毒结合蛋白，疟疾病毒结合蛋白标记有标记物，所述检测试管（3）内设置有样品提取液。
5.根据权利要求4所述的疟疾病毒检测试剂盒，其特征在于：所述标记物包括胶体金、彩色微球、时间分辨荧光微球或者量子点微球。
6.根据权利要求5所述的疟疾病毒检测试剂盒，其特征在于：所述胶体金的颗粒大小为40~100nm，彩色微球、时间分辨荧光微球、量子点微球的颗粒大小均为100~300nm。
7.根据权利要求6所述的疟疾病毒检测试剂盒，其特征在于：所述疟疾病毒结合蛋与胶体金的质量比为（0.04~0.32）：1；疟疾病毒结合蛋与彩色微球或时间分辨荧光微球或量子点微球的质量比均为（0.1~0.4）：1。
8.根据权利要求7所述的疟疾病毒检测试剂盒，其特征在于：所述检测线（27）包被有1~2mg/mL疟疾病毒结合蛋白，所述质控线（26）包被有1~2mg/mL的羊源IgG多克隆抗体稀释液，所述羊源IgG多克隆抗体稀释液为包含海藻糖的15~25mM的PB缓冲液，每100mL羊源IgG多克隆抗体稀释液包含0.1~0.9g的海藻糖。
9.根据权利要求8所述的疟疾病毒检测试剂盒，其特征在于：所述标记垫（24）上的疟疾病毒结合蛋白与检测线（27）上的疟疾病毒结合蛋白互不相同。
10.根据权利要求9所述的疟疾病毒检测试剂盒，其特征在于：所述样品提取液包括血液样品提取液或唾液样品提取液或感染部位脓疱液样品提取液；
所述血液样品提取液为45~55mM PB缓冲液，每100mL45~55mM PB缓冲液包含0.4g~0.6gTritonx-100、0.1~0.3g Proclin300、0.4g~0.6g酪蛋白钠、0.8g~1g NaCl；
唾液样品提取液和感染部位脓疱液样品提取液为90~110mM的Tris缓冲液，每100mL 90~110mM的Tris缓冲液包含0.9gNaCl、0.4g~0.6gTritonx-100、0.4g~0.6g Tween 20，提取液pH为8.5。
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